FR2597883A1

FR2597883A1 - Nouveaux polypeptides activateurs du plasminogene de type tissulaire humain

Info

Publication number: FR2597883A1
Application number: FRHUMAINA
Authority: FR
Inventors: Adair John Hotchkiss; John Vincent O'connor; Michael Walter Spellman
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1986-03-18
Filing date: 1987-03-17
Publication date: 1987-10-30
Anticipated expiration: 2007-03-17
Also published as: NZ219654A; HUT43108A; DE3751842D1; DE3708681C2; DD258999A5; AU602510B2; EP0238304A2; ES2088860T3; EP0238304A3; ATE139569T1; HU202276B; DE3751842T2; FI871175A; FI100802B; FR2597883B1; IL81937A; DK135887D0; DE3708681A1; JP2972812B2; GB2189249A

Abstract

DE NOUVEAUX POLYPEPTIDES DU PLASMINOGENE DE TYPE TISSULAIRE HUMAIN, CARACTERISES PAR LEUR STRUCTURE GLUCIDIQUE MODIFIEE AU NIVEAU DU RESIDU AMINO-ACIDE 117, SONT REVELES. LEUR PREPARATION ET LES TECHNIQUES ANALYTIQUES PERMETTANT DE DETERMINER LEUR FONCTION SONT DECRITES. APPLICATION: PREPARATION DE COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES POUR LE TRAITEMENT DE TROUBLES CARDIO-VASCULAIRES.

Description

La présente invention a pour objet de nouveaux activateurs du plasminogène

de type tissulaire humain, caractérisés en ce qu'ils sont dépourvus de structure glucidique fonctionnelle au niveau du résidu 5 amino-acide 117. Les nouveaux activateurs du plasminogène de type tissulaire humain de la présente invention sont par ailleurs non modifiés, comparativement à ceux présents à l'état naturel, en ce qui concerne la structure glucidique fonctionnelle au niveau des résidus 10 amino-acides 184 et/ou 448. De manière inattendue, les nouveaux activateurs du plasminogène de type tissulaire humain de la présente invention ont conservé pratiquement la totalité de leur activité biologique, comparativement avec la matière existant par ailleurs à l'état

naturel, et possèdent de manière inattendue une demivie in vivo accrue.

L'activateur du plasminogène de type tissulaire humain transforme le plasminogène en plasmine.

La plasmine ainsi produite clive par protéolyse les 20 matrices de fibrine qui forment le squelette ds caillots sanguins.L'activateur du plasminogène de type tissulaire humain intervient ainsi dans la dissolution des caillots sanguins et est par conséquent utile dans le traitement

de divers troubles thrombolytiques.

L'abréviation t-PA pour l'activateur du plasminogène de type tissulaire humain a été adoptée aptrès proposition au XXVIII Meeting of the International Committee on Thrombosis and Hemostatis, Bergame, Italie, 27 Juillet 1982. Telles qu'utilisées dans le présent 30 mémoire, les expressions "activateur du plasminogène de type tissulaire humain", "tPA", "t-PA humain" ou

"activateur du plasminogène tissulaire" désignent l'activateur du plasminogène extrinsèque humain (de type tissulaire) produit, par exemple, par extraction d'une 35 source naturelle et purification [voir Collen et colla-

borateurs, demande de brevet européen N 41766 (publiée le 16 Décembre 1981 sur la base qu'un premier dépôt daté du 11 Juin 1980) et Rijken et collaborateurs, Journal of Biol. Chem. 256, 7035 (1981), incorporées 5 au présent mémoire à titre de référence], et au moyen de systèmes de culture de cellules recombinantes, tels que décrits conjointement avec sa séquence d'aminoacides et ses caractéristiques physiques et biologiques, par exemple dans la demande de brevet européen publiée 10 sous le N 93619 (publiée le 9 Novembre 1983) sur la base d'un premier dépôt daté du 5 Mai 1982), incorporée

au présent mémoire à titre de référence.

Le brevet des Etats-Unis d'Amérique N 4 326 033 concerne l'allongement de la demi-vie 15 de l'urokinase par modification chimique de sa structure glucidique. L'urokinase est immunologiquement distincte de l'activateur du plasminogène de type tissulaire humain. Il n'existe aucune justification, dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N 4 326 033 ou ailleurs, 20 de la considération que ces modifications glucidiques de l'urokinase puissent s'appliquer à d'autres glycoprotéines. Evidemment, par exemple, l'élimination de l'acide sialique de la céruléoplasmine diminue considérablement sa demi-vie; de méme, un traitement identique 25 de la transferrine, une autre glycoprotéine sérique,

ne possède aucun effet notable sur sa demi-vie.

(Sharon, Complex Carbohydrates, Addison-Wesley Publ.

Co., pages 194-196, (1975); voir également Ashwell et collaborateurs, Adv. Enzymology 41, 99 (1974) et 30 Alexander et collaborateurs, Science 226, 1328 (1984).

La demande de brevet international publiée sous le N W084/01786, publiée le 10 Mai 1984 sur la base d'un premier dépôt daté du 28 Octobre 1982 décrit une modification incontrôlée d'activateur de plasmino35 gène du type tissulaire ayant pour résultat une molécule présentant une activité biologique réduite et une demivie prétendument accrue, comparativement au polypeptide non modifié. Le seul exemple comprend le traitement d'un activateur du plasminogène de type tissulaire 5 humain partiellement purifié avec du periodate de sodium,

donnant un produit dont il est indiqué qu'il possède environ 70 à 90 % de l'activité initiale (non modifié).

Il n'existe aucune indication dans le document W084/01786 d'une appréciation de la nature et de la caractérisation 10 des structures glucidiques présentes dans la matière

naturelle et, de manière plus importante, dans la forme modifiée produite. En fait, on sait que le periodate modifie ou rompt, par oxydation, toutes les structures glucidiques sans leur élimination concomitante impor15 tante de leur liaison amino-acide.

Il n'y a également aucune indication dans le document W084/01786 du nombre de ces structures que possède l'activateur du plasminogène de type tissulaire humain, ou bien de sa constitution réelle en 20 glucides, que ce soit pour la version non modifiée ou modifiée. Ainsi, la molécule traitée au periodate a été très certainement modifiée par oxydation de toutes les structures glucidiques sans discrimination, sans

concentration sur un site particulier.

Récemment, il a été indiqué que les vitesses de clearance in vivo de l'activateur du plasminogène de type tissulaire humain glycosylé et déglycolysé n'étaient pas notablement différentes, imposant la conclusion que la vitesse de clearance de l'activateur 30 du plasminogène de type tissulaire humain n'est pas affectée par l'absence de glucides (Larsen et collaborateurs, Proteases in Biological Control and Biotechnology,

UCLA Symposium Park City, Utah, 9-14 Février 1986.

Voir Little et collaborateurs, Biochemistry 23, 6191 35 (1984).

Il a été trouvé à présent que l'activateur du plasminogène de type tissulaire humain possède une structure glucidique particulière au niveau du résidu amino-acide 117 qui est considérablement différente des structures glucidiques au niveau des résidus aminoacides 184 et 448 et que, lorsqu'elle est totalement éliminée (ou bien, mis à part la portion N-acétylglucosamine liée à l'amino-acide Asn), a pour résultat de nouveaux activateurs du plasminogène de type tissulaire io humain ayant conservé pratiquement la totalité de leur activité biologique et possédant une demi-vie in vivo

accrue de manière inattendue.

Ainsi, la présente invention concerne de nouveaux activateurs du plasminogène de type tissulaire is humain dépourvus de structure glucidique fonctionnelle au niveau du résidu amino-acide 117, ayant par ailleurs des structures glucidiques non modifiées du point de vue fonctionnel (au niveau des résidus amino-acides 184 et/ou 448), et ayant conservé pratiquement la tota20 lité de leur activité biologique et possédant une demivie in vivo accrue (comparativement à l'activateur du plasminogène de type tissulaire humain "naturel" ayant une structure glucidique intacte au niveau du

résidu amino-acide 117.

La présente invention concerne en outre des équivalents biologiquement actifs de l'activateur du plasminogène de type tissulaire humain différant par un ou plusieurs amino-acides dans la séquence globale mais ayant le même motif glucidique que les nouveaux 30 activateurs du plasminogène de type tissulaire humain

particuliers. La présente invention concerne de plus les vecteurs recombinants associés, les cultures et les procédés utiles pour la préparation des nouveaux activateurs du plasminogène de type tissulaire humain.

Un tel équivalent d'activateur du plasminogène de type tissulaire humain faisant partie du cadre de la présente invention est un mutant appelé mutant à une seule chaîne dans lequel le site de clivage entre 5 les amino-acides 275 et 276 est détruit par élimination

de la séquence d'amino-acides reconnue par des enzymes protéolytiques. L'élimination de la séquence est effectuée en modifiant des amino-acides particuliers, par exemple par mutagénèse spécifique du site des codons 10 d'ADN fondamentaux suivant le procédé décrit ci-dessous.

D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention ressortiront de la description détaillée qui va suivre, faite en regard des dessins

annexés sur lesquels: La figure 1 représente une électrophorèse

sur gel de polyacrylamide au dodécylsulfate de sodium (EGPA-DSS) colorée au bleu de Comassie d'activateur de plasminogène du type tissulaire humain non traité (voie 1) et traité par l'E.n d o H (voie 2).

La bande de poids moléculaire élevé correspond au tPA à une seule chaîne; les autres bandes principales correspondent au Kringle type I (KI), au Kringle type

II (KII) et à une protéase (P).

La figure 2 représente des digestions par 25 1 a glycosidase de t-PAcarboxyméthylé réduit. Voie 1: -N-glycanase; voie 2: +N-glycanase; voie 3: -Endo H; voie 4 = +Endo H. Identifications des bandes

comme sur la figure 1.

La figure 3 représente une carte de restric30 tion du plasmide de. départ pUCPAàHD.

La figure 4 représente la variation de radio-activité précipitable par l'acide trichloracétique (ATC) au cours du temps pour un activateur du plasminogène de type tissulaire humain témoin (S) et un acti35 vateur du plasminogène de type tissulaire humain qui a été soumis au procédé à 1' E n d o H sans l'enzyme (A) et l'activateur du plasminogène de type tissulaire humain traité avec l' E n d o H (0). Ces résultats

représentent la moyenne +/- l'écart-type (n=5).

La figure 5 représente la variation de la radio-activité précipitable par l'acide trichloracétique (ATC) au cours du temps pour un t-PA humain

témoin (0) et le glutamine 117 t-PA (G).

La figure 6 représente la variation de 10 la radio-activité précipitable par l'acide trichloracétique (ATC) au cours du temps pour un t-PA humain témoin (0) et le glutamine117acide glutamique275t-PA (0).

Description détaillée

A. Généralités Il a été trouvé que la structure glucidique au niveau du résidu amino-acide 117 de l'activateur du plasminogène de type tissulaire humain possède le type de composition suivant: Man Hn Man6 3\ Man22 0 Man--4GlcNAc---_4GlcNAc _.ASN 25 f 3 Man---- 2Han tandis que les structures au niveau des résidus aminoacides 184 et 448 possèdent les types de compositions 30 suivants: Sia2---3Gal--.4GlcNAc--b2Man Frc

6 6

Man--b 4GlcNAc-- 4GlcNAc---ASN Sia2-- 3Gal--*4GlcNAc--*2 t Man

R

Abréviations: Man- mannose; Gal- galactose; Fucfucose; GlcNac- Nacétylglucosamine; Sia- acide sialique; R- H ou Sia2 --3Gal --*4GlcNAc.

Il faut souligner que, bien que les structures ci-dessussoient représentatives des types d'oligosaccharides à liaison au niveau de N trouvés sur l'activateur du plasminogène de type tissulaire humain, la présente invention n'est pas limitée aux structures 20 représentées. Chaque site de glycosylation contient probablement plusieurs structures non identiques, étroitement apparentées., Cela est connu sous le nom de microhétérogénéité et est une caractéristique courante des glycanes de glycoprotéines [voir J. Biol. Chem. 260, 25 4046 (1985)]. Par exemple, le nombre de motifs mannose présents dans des oligosaccharides à teneur élevée en mannose peut varier. Dans des oligosaccharides complexes, la microhétérogénéité peut consister en différences dans le degré de ramification ainsi que dans 30 le nombre de résidus d'acide sialique, de fucose, de galactose et de N-acétylglucosamine. Il est entendu que cette microhétérogénéité entre dans le cadre de

la présente invention.

La structure contenant une teneur élevée 35 en mannose au niveau de l'amino-acide 117 s'est avérée remarquable, non seulement en structure d'après les structures plus complexes au niveau des résidus aminoacides 184 et 448, mais également en ce que son élimination fonctionnelle totale sans modification fonction5 nelle concomitante des structures au niveau des résidus 184 et 448 a eu pour résultat un activateur du plasminogène de type tissulaire humain totalement actif du point de vue biologique, ayant une demi-vie in vivo accrue. L'élimination de la structure glucidique fonctionnelle au niveau du résidu amino-acide 117 signifie une élimination totale, comme lorsque le signal de glycosylation est détruit par mutagénèse dirigée au niveau du site, de la manière décrite ci- dessous, 15 ou bien élimination notable, comme par traitement avec

une endoglycosidase qui peut laisser, par exemple, un résidu Nacétylglucosamine intact lié à l'Asn117. La structure glucidique non modifiée du point de vue fonctionnel au niveau des résidus amino-acides 184 et/ou 20 Z48 signifie la conservation de la ou des structures intactes ou bien de pratiquement la totalité de cette ou de ces structures, de sorte qu'elles sont fonctionnellement équivalentes à la protéine naturelle.

Dans la forme de réalisation préférée, 25 l'élimination de la structure glucidique fonctionnelle au niveau du résidu amino-acide 117 est effectuée par mutagénèse spécifique du site de l'ADN fondamental du signal de glycosylation Asn-X-Ser/Thr, dans lequel X peut être n'importe quel amino-acide. Dans le cas 30 de l'activateur du plasminogène de type tissulaire, la séquence représentant ce signal est Asn117 (Ser118)

Ser119. L'élimination de la structure glucidique fonctionnelle au niveau du résidu amino-acide 117 résulte ainsi, par exemple, d'une mutagénèse des codons corres35 pondant à ces résidus amino-acides, détruisant la fonc-

tionnalité du signal. En particulier, une mutagénèse peut être effectuée sur des codons représentatifs du signal, de sorte qu'il est produit, par exemple, un activateur du plasminogène de type tissulaire humain 5 ayant un résidu amino-acide autre que l'asparagine (Asn) en position 117 et/ou autre que la sérine (Ser) ou la thréonine (Thr) en position 119 ou une proline (Pro) à position 118. Dans les formes de réalisation les plus appréciées, l'asparagine117 est remplacée par la glutamine, eu égard à leur similitude structurale étroite, ou bien la sérine119 est remplacée par la méthionine, en raison d'une séquence analogue dans

la seconde région de Kringle.

La mutagénèse est effectuée par des techni15 ques connues en elles-mêmes, par exemple suivant les procédés passés en revue par Zoller et collaborateurs, Methods in Enzymology 100, 468 (1983). Par exemple, en remplaçant le codon AAC codant pour l'asparagine en position 117 par CAA ou CAG, nécessitant deux rempla20 cements de nucléotides, le produit de l'expression contient de la glutamine en position 117. D'autres

mutations envisagées dans le présent mémoire découlent de l'analyse du code génétique.

Un autre procédé d'élimination de glucide 25 fonctionnel au niveau du résidu amino-acide 117 comprend l'utilisation d'une endoglycosidase, telle que l'Endoglycosidase H qui est capable d'éliminer (pratiquement) la structure glucidique à teneur élevée en mannose au niveau du résidu amino-acide 117 (Asn) sans affecter 30 du point de vue fonctionnel les structures complexes au niveau des résidus amino-acides 184 et 448. De même, ce traitement est effectué par des techniques connues par ellesmêmes, par exemple suivant le procédé de Tarentino et collaborateurs, J. Biol. Chem. 249, 811 35 (1974) et de Trimble et collaborateurs, Anal. Biochem.

141, 515 (1984).

B. Exemples

Exemple 1

Une mutagénèse spécifique d'un site a été utilisée pour construire un vecteur d'expression portant de manière pratique l'ADN codant pour l'activateur du plasminogène de type tissulaire ayant un résidu aminoacide glutamine en position 117, de la manière suivante A. Conception de l'oligonucléotide 10 Un oligonucléotide de 24 unités monomériques ayant la séquence 5'-TGC-ACC-AAC-TGG-C*A*A*-AGC-GCG-3 (Q 117 - 24 unités monçmériques) a été synthétisé par le procédé au phosphotriester de Crea et collaborateurs, Nucleic Acids Research 8, 2331 (1980). Les astéri indiquent le

codon mutant (asn à gln).

B. Construction de la matrice M13 recombinante Le plasmide pUCPA4HD (figure 3) est un dérivé du plasmide désigné sous le nom de pETPFR (désigné par ailleurs sous le nom de pPADHFR-6, décrit dans 20 le document EPO 93619, ci-dessus), avec les modifications suivantes:1) 166 paires de bases d'ADN non traduit en 5' ont été mises en ordre à partir de l'extrémité R' du gêne t-PA, en utilisant l'exonucléase Bal 31; 2) un site Hind III a été ajouté à la nouvelle extrémité 5' du 25 gène t-PA; 3) un polyadaptateur, contenant des sites de reconnaissance EcoRI, Sac I, Sma I, Bam HI, Xba I, Sal I et Pvu II a été ajouté à l'extrémité 5' du promoteur initial SV40 qui conduit l'expression de t-PA; 4) le site Hind III en position 3539 de pETPFR 30 a été détruit par une réaction de comblement de brèche

de Klenow.

Le plasmide pUCPAHD (figure 3) a été digéré avec SmaI, et le fragment d'environ 2,0 kb contenant le gène t-PA passant par le codon N 507 a été isolé 35 par EGPA et séparation du fragment du gène par électro-

élution. Le vecteur M13mp10 (Messing, Methods in Enzymology 101, 20 (1983) a été également digéré avec SmaI, extrait une fois avec du phénol, du chloroforme, précipité avec de l'éthanol et remis en suspension dans 50 mM de tris à pH 8,0, lmM de EDIA (TE). Le

fragment d'environ 2,0 kb provenant de pUCPAAHD a été fixé par ligation dans le M13mp10 coupé par SmaI en utilisant de l'ADN-ligase de phage T4 et l'ADN résultant a été utilisé pour transformer E. coli JM101. Le phage 10 résultant a été isolé et la présence de l'élément d'insertion a été vérifiée et son orientation déterminée par.analyse de restrictionc mjnipréparations de phages.

Un phage recombinant, M13/t-PA-SMA, a été choisi comme

modèle pour une mutagénèse ultérieure.

C. Réaction de mutagénèse L'initiateur de mutagénèse(Q117 24 unités monomériques) a été reconstitué par cyclisation avec un ADN M13/tPA-SMA monocaténaire, et traité avec un fragment de Klenow d'ADN-polymérase de E. coli en présence de dNTPs 20 et d'ADN-ligase de phage T4 pour créer in vitro des

molécules RF hétéroduplex, de la manière décrite par Adelman et collaborateurs, DNA 2, 183 (1983). Ces molécules ont été utilisées pour transformer la souche de E. coli JM101 (ATCC N 33876) et les phages incorpo25 rant la mutation désirée ont été détectés par hybridation sur plaque en utilisant l' initiateur de mutagénèse comme sonde. (Adelman et collaborateurs, DNA 2, 183 (1983).

Un phage mutant a été isolé et appelé M13/t-PA-SMAGLN117.

D. Sous-clonage du mutant GLN117 t-PA dans le plasmide d'expression pUCPAAHD L'ADN bicaténaire de phage M13/t-PA-SMAGLN117 a été digéré avec SmaI, Bg111 et ApaI et le fragment d'environ 1,4 kb a été purifié par EGPA. Ce 35 fragment a été alors utilisé pour remplacer le fragment

correspondant dans pUCPAAHD.

Des plasmides recombinants contenant le fragment de gène t-PA ont été identifiés. Les plasmides M119 et Q117 sont introduits et amplifiés dans des cellules de OHC déficientes en DHFR (Urlab et collabora5 teurs, Proc. Natl. Acad. Sci. 77, 4216 (1980), de la manière suivante: 1) l'ADN du plasmide est introduit dans les cellules par le procédé de précipitation au phosphate de calcium de Graham et collaborateurs, J. Virol. 52, 455 (1973); 2) les colonies apparaissant 10 dans un milieu sélectif [milieu déficient en hypoxanthine, glycine et thymidine (-HGT)] sont essayées indirectement en ce qui concerne l'expression de t-PA par détection de la formation de plasmine, tel1 que déterminé par la digestion de fibrine dans une plaque de gélose 15 contenant de la fibrine et du plasminogène, décrite par Granellia et collaborateurs, J. Exp. Med. 148, 223 (1978); 3) la quantité de t-PA sécrété par cellule est déterminée quantitativement pour cinq des clones les plus fortement positifs en utilisant un essai ELISA; 20 4) le clone sécrétant le taux le plus élevé de t-PA est étalé sur plaque dans du méthotrexate (MTX) de la manière suivante: 2 x 105 cellules sont étalées en plaques de 100 mm contenant 50, 100 ou 250 nM de MTX; 5) cinq clones apparaissant dans le MTX sont extraits 25 -et analysés quantitativement (par ELISA) comme dans l'étape 3) ci-dessus; 6) le clone sécrétant le taux le plus élevé de t-PA est étalé sur plaque dans des concentrations supérieures de MTC comme dans l'étape 4) ci- dessus, puis l'analyse quantitative de cinq clones 30 qui sont apparus est effectuée, et celui produisant

le taux le plus élevé de t-PA est sélectionné.

Le procédé d'amplification et de sélection ci-dessus est répété jusqu'à ce qu'aucun accroissement de production de t-PA ne soitobtenu à partir de la lignée 35 cellulaire résultante, et le mutant de t-PA correspondant est séparé pour l'utilisation.

Exemple 2

Un procédé similaire à celui décrit dans l'exemple 1 a été utilisé pour préparer le mutant Met119 correspondant en utilisant un nucléotide de 24 unités monomériques ayant la séquence 5'-CC-AAC-TGC-AAC-AGC-A*T*G*-GCGTTG-G-3'(M119 24 unités monomériquestpour obtenir le pUCPA4HD.La production du mutant M119 correspondant par expression est effectuée de

la manière décrite ci-dessus dans l'exemple 1.

Exemple 3

Un mutant glutamine117acide glutamique275t-PA Un mtan gltamnel 7a cd guaqe275tP a été préparé de la manière suivante: Le plasmide pUCPAÈHD, préparé de la manière décrite ci-dessus, a été digéré avec Bgl II et Sca I et le fragment d'environ 763 paires de bases, corres15 pondant aux codons 1 à 254 de la séquence d'ADN d'activateur du plasminogène de type tissulaire, a été purifié

sur EGPA-DSS, d'une manière bien connue.

De l'ADN de t-PA humain a été obtenu à

partir des plasmides pPADHFR-6 (appelé églement pETPFR) 20 et pA25E10. La préparation de ces deux plasmides tPA est décrite dans la demande de brevet européen publiée sous le N 093619, mentionnée ci-dessus et incorporée au présent mémoire à titre de référence.

Le plasmide pA25E10 contient des séquences 25 codant pour les 508 derniers amino-acides du gène tPA et 772 paires de bases de la région 3'. Ce plasmide a été digéré avec SacI et BglII, produisant un fragment de 744 paires de bases qui a été isolé par des procédés classiques, de manière décrite précédemment. Ce fragment 30 contient les codons pour les amino-acides 411 à 527 de t-PA et comprend une partie de la région 3' non traduite. Le plasmide pPADHFR-6 contient le gène structural entier de tPA et une partie de la région 35 3' non traduite. Ce plasmide a été digéré avec SacI et BglII, produisant un fragment de 1230 paires de bases qui a été isolé. Ce fragment contient des codons pour les 410 premiers amino-acides de la forme mature

de t-PA.

Ces fragments ont été fixes les uns aux

autres par ligation en utilisant des procédés classiques et ont été digérés avec BglII. Un fraction de 1974 paires de bases contenant des codons pour la équence totale mature de t-PA plus une partie de la 10 région 3' non traduite a été isolée. Un M13mp8 bicaténaire [Messing et collaborateurs, Third Cleveland Symposium on Macromolecules Recombinant DNA, Editeur, A. Walter, Elsevier, Amsterdam (1981), page 1434 a été digéré avec BamHI et reconstitué par cyclisation 15 avec le t-PA digéré par BglII, formant le M13mp8PABglII.

Des cellules de E. coli JM 101 (ATCC N 33876) ont été transformées avec la forme réplicative bicaténaire de M13mp8PABglII. Les formes monocaténaires et bicaténaires (FR) de M13mp8PABglII peuvent être isolées des 20 cellules de E. coli JM101 affectées avec ce phage.

La forme monocaténaire a été utilisée pour la mutag4nèse spécifique d'un site de t-PA.

Le gène structural t-PA humain a été modifié par mutagénése spécifique d'un site afin d'effec25 tuer l'expression de t-PA avec des substitutions d'aminoacides à diverses positions. Un oligonucléotide synthétique a été préparé, comme par le procédé au phosphotriester en phase solide de Crea et collaborateurs, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 75, 5765 (1978) et a été 30 utilisé pour cette mutagénèse spécifique d'un site: Initiateur 2C9 Glu Séquence d'ADN G CCT CAG TTT GAA ATC AAA GGA G Le procédé général de Adelman et collaborateurs, DNA 2, 183 (1983), incorporé dans le présent 35 mémoire à titre de référence, a été utilisé pour produire

un clone de t-PA contenant la séquence mutée de l'initiateur synthétique. Le clone de t-PA mutant M13RF2C9 a été produit par l'utilisation d'un initiateur contenant la mutation pour le seul amino-acide indiqué ci5 dessus.

Dans le plasmide pPADHFR-6 (appelé également pETPFR - voir la demande de brevet européen publiée sous le N 93619 ci-dessus), l'expression du gène structural de t-PA naturel est sous le contrôle du promoteur 10 initial pour l'antigène T de SV40. Ce promoteur contrôle

également l'expression du gène DHFR. Un fragment 1 de vecteur a été obtenu en isolant le grand fragment produit par digestion de pPADHFR-6 avec BglII et BstEII.

Un autre fragment 2 a été obtenu en isolant le fragment 15 de t-PA de 400 paires de bases obtenu par la digestion de pPADHFR-6 avec BglII et BstXI. Un fragment 3 de t-PA de 1141 paires de bases contenant la mutation désirée a été obtenu par digestion d'ADN de FR provenant du clone de t-PA mutant M13RF2C9 avec BstXI et BstEII. 20 Les fragments 1 et 2 ont été fixés par ligation au

fragment 3. Le mélange d'ADN a été utilisé pour transformer E. coli donnant le vecteur d'expression eucaryotique pPADHFR-6 2C9.

Le plasmide pPADHFR-6 2C9, préparé de la 25 manière décrite ci-dessus et dans la demande de brevet européen publiée sous le N 199574, publiée le 29 Octobre 1986, contient une séquence d'ADN codant pour le mutant acide glutamique275 de l'activateur du plasminogène de type tissulaire. Il a été digéré avec Sca I 30 et Apa I et le fragment d'environ 630 paires de bases, correspondant aux codons 254 à 466 de la séquence d'ADN d'activateur du plasminogène de type tissulaire, a

été purifié sur EGPA-DSS d'une manière bien connue.

Les deux fragments BglII-ScaI (pUCPA tHD) 35 et ScaI-ApaI (pPADHFR-6 2C9) ont été fixés par ligation au grand fragment Bgl II (531 paires de bases) - Apa I (1926 paires de bases) provenant de pUCPA HD digéré et le plasmide résultant portant l'ADN de mutant glutamine117acide glutamique275t-PA a été soumis à une mini5 sélection de la manière habituelle. Le plasmide résultant a été introduit et amplifié dans des cellules de OHC déficientes en DHFR, de la manière décrite cidessus, et le mutant de t-PA correspondant a été séparé

pour l'utilisation.

Exemple 4 La séquence d'amino-acides de t-PA comprend 4 sites de glycosylation potentielle à liaison N [AsnX-Ser/Thr; Ann. Rev. Biochem. 41, 673 (1972)]. Il s'agit des résidus asparagine 117, 184, 218 et 448 15 [Nature 301, 214 (1983)]. Cependant, la position 218

s'est révélée non glycosylée dans le t-PA. La position 184 est glycosylée dans le t-PA de type I mais non dans le t-PA de type II [Biochemistry" 23, 3701 (1984)].

La chromatographie de filtration sur gel 20 de rt-PA digéré par la pronase a permis de séparer

deux classes d'oligosaccharides à liaison N (tableau!).

La composition de la matière de poids moléculaire supérieur était compatible avec celle des oligosaccharides de type fucosylé complexes. La matière de poids molécu25 laire inférieur possédait la composition prévue pour un petit oligosaccharide à teneur élevée en mannose

(probablement Man6GlcNac2).

La position de fixation de l'oligosaccharide à teneur élevée en mannose a été déterminée en utilisant 30 des enzymes glycosidiques de spécificités différentes.

Les enzymes utilisés étaient l'endo-5-N-acétylglucosaminidase H (Endo H;Genzyme, Inc.), qui élimine les oligosaccharides à teneur élevée en mannose mais n'a aucun effet sur les oligosaccharides de type complexe, 35 et la peptide-N-glycosidase F (N-glycanase; Genzyme, Inc.), qui élimine à la fois les oligosaccharides à teneur élevée en mannose et de type complexe. Le tPA utilisé pour ces expériences a été transformé en la forme btcaténaire avec de la plasmine, puis a été réduit et carboxyméthylé. L'EGPA-DSS a permis de séparer le rt-PA bicaténaire carboxyméthylé réduit en kringle de type I (glycosylation en positions 117 et 184), en kringle de type II (glycosylation en position 117) et en pro10 téase (glycosylation en position 448). La digestion par la N- glycanase du t-PA provoque la coalescence des bandes de kringle à une position de mobilité légèrement inférieure à celle du kringle de type II et provoque également une mobilité accrue de la protéase (voie 15 2, figure 2). La digestion par l'Endo H de t-PA augmente la mobilité électrophorétique de chaque bande de kringle, mais n'affecte pas la mobilité de la bande de protéase (voie 4, figure 2). Le résultat du traitement par l'Endo H indique que chaque kringle de type I et de 20; type II contient un oligosaccharide à teneur élevée en mannose; celui-ci doit être situé au niveau du résidu 117, qui est la seule position glycosylée dans les kringles de type I et de type II. Le traitement par l'Endo H ne transforme pas le kringle de type I en 25 kringle de type II; par conséquent, le résidu 184,

qui est glycosylé dans le kringle de type I mais non dans le kringle de type II, contient un oligosaccharide complexe. La position 448 doit également contenir une structure complexe, car le traitement par la Nglycanase 30 augmente la mobilité de la portion de protéase du rtPA, tandis que l'Endo H ne possède aucun effet.

TABLEAU

Composition en glucides des fractions oligosaccharidiques provenant du tPA digéré par la a pronase :0 5 Echantillon Fuc Man Gal GlcNac Siab -. ô Type complexeC 1,0 3,0 2,8 4,2 2,4 :7 - Type à teneur élevée en mannose 0, 6 6,2 traces 2,0 0 a "IO aAbréviations: Fuc = fucose, Man = mannose, Gla = galactose GlcNac = N-acétylglucosamine Sia = acide sialique Analyse à l'acide thiobarbiturique c

ramené à 3 mannose.

:15 dramené à 2 GlcNac

Exemple 5

L'endo-5-N-acétylglucosaminidase H (Endo H) a été acheté chez Genzyme, Incorporated. L'EGPADSS a été effectué de la manière décrite par Laemmli, Nature 227, 680 (1970). 0,8 mg d'activateur du plasminogène de type tissulaire humain (préparé de la manière décrite dans la demande de brevet européen N 93619 ci-dessus) (dans 0,2 ml de formulation de tampon comprenant 0,2 M de phosphate d'arginine, à pH 6, contenant 0,01 Z de Tween 80) a été mélangé à de l'Endo H (0,1 unité dans 0,05 ml de phosphate de sodium 25 mM, à pH 6) et à de l'azoture de sodium (0,02 %). L'échantillon a été mis à incuber à 370 pendant 20 heures. Un échantillon témoin d'activateur du plasminogène de type tissulaire humain a été préparé et mis à incuber de la même manière, sauf que la solution d'Endo H a été remplacée par le tampon au phosphate de sodium (0,05 ml de phosphate de sodium mM). Après incubation, les échantillons ont été dilués à un volume total de 0,75 ml avec du tampon de formulation et fortement dialysés dans le même tampon de formulation. Les échantillons ont été filtrés (filtres HV de 0,4 micromètre, Amicon)

et entreposés à 4 degrés.

La déglycosylation a été contrôlée par EGPA-DSS après réduction et carboxyméthylation. Des portions aliquotes de l'activateur du plasminogène de type tissulaire humain préparé (0,05 mg dans 0,01 ml de tampon de formulation) ont été mélangées à du phos10 phate de sodium 25 mM à pH 6 (0,015 ml) et 2 volumes de tampon de Laemmli contenant 20 mM de dithiothréitol

(0,025 ml). On a chauffé les échantillons pendant 5 minutes à 95 degrés et on les a laissé refroidir.

De l'acide iodo-acétique (0,015 ml d'une solution 15 0,67 M dans NH40H 1N) a été ajouté et les échantillons ont été mis à incuber à l'obscurité pendant 3 heures à température ambiante. Les échantillons carboxyméthylés

réduits ont été analysés par EGPA-DSS.

Dans cette analyse, l'activateur du plasmino20 gène de type tissulaire humain bicaténaire témoin non

traité est séparé en trois bandes principales, correspondant au kringle de type I (glycosylation en positions 117 et 184), kringle de type II (glycosylation en position 117) et protéase (voie 1, figure 1). La digestion 25 par l'Endo H d'activateur du plasminogène de type tissulaire humain augmente la mobilité électrophorétique de chaque bande de kringle, mais n'affecte pas la mobilité de la bande de protéase (voie 2, figure 1).

L'activité fibrinolytique de l'activateur 30 du plasminogène de type tissulaire humain traité par

l'Endo H a été déterminée par l'essai in vitro de lyse de caillots de Collen et collaborateurs, J. Clin. Path.

21, 705 (1968). L'activité de l'activateur de plasminogène du type tissulaire humain traité par l'Endo H 35 ne pouvait être distinguée dans cet essai de celle

du témoin non traité.

Les échantillons d'activateurs du plasminogène de type tissulaire humain ont été iodés par le procédé "Iodobead" [Markwell, Anal. Biochem. 125, 427 (1982)] à une activité spécifique approximativement égale à 2 gCi/gg. De l'arginine, 0,2 M, du citrate, 0,1 M, (pH 6,0) et du "Tween 80", 0,01 %, constituaient le tampon utilisé à chaque fois. Tous les échantillons ont été dialysés dans ce tampon avant iodation. Le pH a été ajusté à 8,2 avec du tampon tris de base avant 10 iodation. Le mélange d'iodation a été passé à travers

une colonne de PD-10 (Pharmacia) équilibrée avec du tampon à pH 6,0, les fractions radio-actives provenant du volume des vides ont été rassemblées, l'EGPA-DSS a été effectuée et le gel déshydraté a été autoradio15 graphié. L'autoradiographie des activateurs du plasminogène de type tissulaire humain marqués a montré que plus de 95 % de la radio-activité étaient incorporés à l'activateur du plasminogène de type tissulaire humain.

Chaque activateur du plasminogène de type 20 tissulaire humain marqué a été mélangé à de la matière non marquée dans un rapport 1:200 (marqué:non marqué), en poids/poids) et injecté par voie intraveineuse sous forme d'un bol à des lapins qui possédaient un cathéter artériel dans l'oreille. Chaque lapin a reçu 1 mg/kg 25 d'activateur du plasminogène de type tissulaire humain non marqué et 10 gCi/kg d'activateur du plasminogène de type tissulaire humain marqué. L'activateur du plasminogène de type tissulaire humain non marqué a été utilisé comme support pour la quantité à l'état de trace 30 d'activateur du plasminogène de type tissulaire humain marqué afin de parvenir à des taux thérapeutiques et d'éviter des modifications de la pharmacocinétique pouvant survenir d'une dépendance de la concentration des processus de clearance. Des échantillons en série 35 de sang artériel ont été recueillis en une durée de 26 minutes et placés immédiatement dans des tubes contenant un mélange lyophilisé de Dphe-pro-arg-chlorométhylcétène (PPACK) et d'EDTA aux concentrations finales respectives de 1 vM et 4,8 mM. Les tubes ont été places sur de la glace et le plasma a été séparé. La fraction précipitable par l'acide trichloracétique (ATC) (activateur du plasminogène de type tissulaire humain intact) et la radio-activité totale ont été mesurées dans chaque échantillon de plasma. La quantité d'activateur du 10 plasminogène de type tissulaire humain immunoréactif a été également mesurée par un procédé ELISA en sandwich qui utilisait des anticorps polyclonaux et possédait

une sensibilité efficace d'au moins 30 ng/ml.

Deux types de résultats ont été obtenus 15 à partir des études de clearance in vivo chez des lapins.

L'un est obtenu à partir de l'activateur du plasminogène de type tissulaire humain immunoréactif et doit Otre une mesure de la clearance de la matière non marquée. Le second type de résultat est la radio- activité 20 précipitable par l'ATC, qui représente plus de 95 % de l'activateur du plasminogène de type tissulaire humain intact. Les courbes de concentrations plasmatiques en fonction du temps à partir des comptages d'immunoréactivité et de substances précipitables par l'ATC 25 ont été ajustées aux modèles multi-exponentiels appropriés et les paramètres pharmacocinétiques dérivés

ont été comparés.

Exemple 6

Pharmacocinétique de l'activateur du plasminogène 30 de type tissulaire humain traité par l'Endo H Les profils pharmacocinétiques de l'activateur du plasminogène de type tissulaire humain traité par l'Endo H et de l'activateur du plasminogène de type tissulaire humain témoin et d'un second témoin 35 formé d'activateur du plasminogène de type tissulaire : V:; humain qui a été traité dans les mêmes conditions réactionnelles que l'activateur du plasminogène de type tissulaire humain traité par l'Endo H en l'absence de l'enzyme sont indiqués sur la figure 4. Les profils 5 pratiquement identiques des deux témoins montrent que les manipulations qui étaient nécessaires pour éliminer le sucre simple en position 117 n'ont pas participé à la variation de clearance de l'activateur du plasminogène de type tissulaire humain. L'activateur du plasmi10 nogène de type tissulaire humain traité par l'Endo H est éliminé beaucoup plus lentement. L'analyse des résultats indique qu'il existe une augmentation de la vitesse de clearance en phase alpha en plus d'une augmentation de la concentration extrapolée au temps 15 zéro pour la phase bêta. L'activateur du plasminogène de type tissulaire humain traité par l'Endo H possède une biodisponibilité accrue, telle que mesurée par l'intégrale du produit du temps et de la concentration; cela constitue une mesure relativement non hypothétique 20 de la biodisponibilité qui est délimitée par la surface sous la courbe, augmentée d'un facteur d'environ 2 par le traitement par l'Endo H. Chaque groupe d'essai a reçu une dose d'activateur du plasminogène de type tissulaire humain non 25 marqué servant de support. Dans tous les cas, les profils pharmacocinétiques de l'activateur du plasminogène de type tissulaire humain non marqué n'étaient pas différents pour n'importe quel groupe testé. Cela sert de témoin interne pour vérifier que les lapins qui 30 ont été choisis pour n'importe quel groupe donné ne possédaient pas par hasard des caractéristiques de

clearance inhabituelles.

Pharmacocinétique des mutants Gln117t-PA et Gln117Glu27 t-PA La pharmacocinétique du glutamine117t-PA

et du t-PA humain témoin est représentée sur la figure 5 5.' Le glutamine117t-PA est éliminé beaucoup plus lentement que le témoin.

Un profil similaire est montré par le glutamine117acide glutamique275t-PA, préparé de la manière

décrite dans l'exemple 3, comme le montre la figure 10 6.

Caractéristiques de liaison à la fibrine La liaison à la fibrine est un facteur

extrêmement important qui est probablement lié directement à la spécificité vis-à-vis de la fibrine que pos15 sède in vivo l'activateur du plasminogène de type tissulaire humain. La liaison à la fibrine de l'activateur du plasminogène de type tissulaire humain traité par l'Endo H a été évaluée par deux modes opératoires.

Le premier mode opératoire utilisait la capture d'acti20 vateur du plasminogène de type tissulaire humain par de la fibrine revêtant un puits dans une boîte classique de microtitrage; chaque puits est alors lavé et une solution de plasminogène et d'un substrat chromogène pour la plasmine (S-2251, Kabi) est ajoutée. La 25 couleur qui est engendrée est proportionnelle à la

quantité d'activateur du plasminogène de type tissulaire humain qui est capturée dans l'étape initiale (Angles-Cano, Thrombosis and Haemostasis 54, 171 (1985).

Le second type d'essai de liaison à la fibrine mesure 30 la quantité d'activateur du plasminogène de type tissulaire humain qui est laissée en solution (par ELISA) lorsque de la thrombine est ajoutée à une solution de fibrinogène dépourvue de plasmine et d'activateur du plasminogène de type tissulaire humain (Rijken et 35 collaborateurs, J. Biol. Chem. 257, 2920 (1982). On ne sait pas très bien actuellement quelle analyse prédit de manière adéquate les conséquences in vivo de la liaison de la fibrine à l'activateur du plasminogène de type tissulaire humain altéré. Sur la base des résul5 tats de chaque analyse, on peut conclure que l'activateur du plasminogène de type tissulaire humain traité par l'Endo H possède une spécificité, vis-à-vis de la

fibrine inchangée, sinon améliorée.

De manière similaire, les résultats des 10 essais de liaison à la fibrine du glutamine117acide glutamique275t-PA de l'exemple 3 ont démontré que le glutamine117acide glutamique275t-PA est similaire à l'acide glutamique275t-PA et est supérieur au t-PA témoin en ce qui concerne la stimulation de la fibrine et l'acti15 vité spécifique.

Exemple 7

Les mutants Gln117 et met119 préparés de la 117 119 manière décrite dans les exemples 1 et 2 sont chacun testés en ce qui concerne l'activité fibrinolytique 20 avec des résultats similaires à ceux obtenus avec la matière traitée par l'Endo H, de la manière décrite ci-dessus. Les pharmacocinétiques de chacun sont également similaires à celles de la matière traitée par l'Endo H, comparativement aux activateurs du plasmino25 gène de type tissulaire humain témoins, comme décrit ci-dessus.

Exemple 8

Compositions pharmaceutiques Les composés de la présente invention peu30 vent être formulés suivant des procédés connus pour

la préparation de compositions utiles du point de vue pharmaceutique, l'activateur du plasminogène de type tissulaire humain produit conformément à la présente invention étant mélangé à un support pharmaceutiquement 35 acceptable. Les véhicules convenables et leur formula-

tion, y compris pour d'autres protéines humaines, par exemple la sérumalbumine humaine, sont décrits, par exemple, dans Remington's Pharmaceutical Sciences par E. W. Martin, qui est incorporé au présent mémoire 5 à titre de référence. Ces compositions contiennent une quantité efficace de la protéine conformément à la présente invention, conjointement avec une quantité convenable de véhicule afin de préparer des compositions pharmaceutiquement acceptables convenables pour l'admi10 nistration efficace à l'hâte.

Par exemple, l'activateur du plasminogène de type tissulaire humain conformément à la présente invention peut être administré par voie parentérale à des sujets souffrant de maladies ou de troubles cardio15 vasculaires. Le dosage et la posologie peuvent être semblables à ceux couramment utilisés dans les recherches cliniques concernant d'autres agents cardiovasculaires thrombolytiques, par exemple d'environ 1-2 mg/kg de poids corporel comme dose intraveineuse ou intra20 artérielle en 1,512 heures chez des patients souffrant d'infarctus du myocarde, d'embolie pulmonaire, etc. Comme exemple de forme posologique appropriée, un flacon contenant 50 mg d'activateur du plasminogène de type tissulaire humain, de l'arginine, de 25 l'acide phosphorique et du polysorbate 80 peut être

reconstitué avec 50 ml d'eau stérile pour préparations injectables et mélangé à un volume convenable de chlorure de sodium à 0,9 % pour préparations injectables.

La demi-vie prolongée de l'activateur du 30 plasminogène de type tissulaire humain peut convenir

pour l'injection rapide par voie intraveineuse. Cela supprime le besoin de procédés d'administration complexes et peut augmenter l'opportunité d'utilisation du t-PA dans des établissements possédant un équipement 35 médical limité comme dans les véhicules d'urgence com-

prenant du personnel para-médical. Une demi-vie prolongée de l'activateur du plasminogène de type tissulaire humain peut également permettre des doses initiales inférieures, plus sûres, et peut maintenir des taux de plasmine efficaces du point de vue thrombolytique pendant des durées atteignant 45 minutes ou plus. Une demi-vie supérieure de l'activateur du plasminogène de type tissulaire humain peut également être utile pour une thérapeutique prolongée à faible dose qui 10 peut être nécessaire pour éviter une réocclusion suivant une thrombolyse aiguë couronnée de succès ou pour une thrombolyse prolongée qui peut être nécessaire dans

les cas d'occlusion vasculaire périphérique.

Bien que ce qui précède se réfère aux formes 15 de réalisation particulièrement appréciées, il va de soi que la présente invention n'a été décrite qu'à titre explicatif, mais nullement limitatif, et que de nombreuses modifications peuvent y être apportées

sans sortir de son cadre.

Claims

REVENDICATIONS

1. Activateur du plasminogène de type tissulaire humain, caractérisé en ce que a) il est dépourvu de structure glucidique fonctionnelle au niveau du 5 résidu amino-acide 117, b) il possède par ailleurs

des structures glucidiques non modifiées du point de vue fonctionnel, c) il a conservé pratiquement la totalité de son activité biologique, et d) il a une demivie in vivo accrue.

2. Activateur du plasminogène de type tissulaire humain suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il contient un amino-acide autre que l'asparagine en position 117.

3. Activateur du plasminogène de type tissu15 laire humain suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il contient un amino-acide autre que la sérine

ou la thréonine en position 119.

4. Activateur du plasminogène de type tissulaire humain suivant la revendication 1, caractérisé 20 en ce qu'il contient de la glutamine en position 117.

5. Activateur du plasminogène de type tissulaire humain suivant la revendication 1, caractérisé

en ce qu'il contient de la méthionine en position 119.

6. Activateur du plasminogène de type tissu25 laire humain suivant la revendication 1, caractérisé

en ce qu'il contient de la proline en position 118.

7. Activateur du plasminogène de type tissulaire humain à une seule chaîne, ayant été soumis

à une mutagénèse, suivant la revendication 1.

8. Activateur du plasminogéne de type tissulaire humaih suivant la revendication 7, caractérisé en ce qu'il contient de la glutamine en position 117

et de l'acide glutamique en position 275.

9. Composition pharmaceutique, caractérisée 35 en ce qu'elle comprend l'activateur du plasminogène

de type tissulaire humain suivant la revendication 1, en mélange avec un support pharmaceutiquement acceptable.

10. Procédé de préparation d'activateur 5 du plasminogène de type tissulaire humain ayant conservé pratiquement la totalité de son activité biologique et ayant une demi-vie in vivo accrue, qui consiste à éliminer la structure glucidique fonctionnelle au

niveau du résidu amino-acide 117.

11. Procédé suivant la revendication 10, caractérisé en ce que l'activateur du plasminogène de type tissulaire humain est préparé par expression d'ADN recombinant, codant pour ledit activateur du plasminogène de type tissulaire humain, ayant un codon 15 en position 117 autre qu'un codon codant pour l'aminoacide asparagine ou un codon en position 119 autre qu'un codon codant pour les amino-acides sérine et thréonine.

12. Procédé suivant la revendication 10, 20 caractérisé en ce que l'activateur du plasminogène de type tissulaire humain est préparé par expression d'ADN recombinant, codant pour ledit activateur du plasminogène de type tissulaire humain, ayant un codon

en position 117 codant pour la glutamine.

13. Procédé suivant la revendication 10,

caractérisé en ce que l'activateur du plasminogène de type tissulaire humain est préparé par expression d'ADN recombinant, codant pour ledit activateur du plasminogène de type tissulaire humain, ayant un codon 30 en position 119 codant pour la méthionine.

14. Procédé suivant la revendication 10, caractérisé en ce que l'activateur du plasminogène de type tissulaire humain est préparé par expression d'ADN recombinant, codant pour ledit activateur du 35 plasminogène de type tissulaire humain, ayant un codon en position 117 codant pour la glutamine et un codon

en position 275 codant pour l'acide glutamique.