CZ281836B6

CZ281836B6 - Tkáňový aktivátor plasminogenu, způsob jeho výroby, řetězec DNA, který je kódem pro tkáňový aktivátor, způsob výroby plasmidů a farmaceutický prostředek s fibrinolytickým účinkem

Info

Publication number: CZ281836B6
Application number: CS90558A
Authority: CZ
Inventors: Anne Dr. Stern; Ulrich Dr. Kohnert; Rainer Dr. Rudolph; Stephan Dr. Fischer; Ulrich Dr. Martin
Original assignee: Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date: 1989-02-07
Filing date: 1990-02-06
Publication date: 1997-02-12
Also published as: KR910700336A; SK55890A3; NZ232337A; RU2107094C1; KR970008485B1; CA2025900C; DD291779A5; HUT58813A; NL970008I2; DK0382174T3; IL93280A; JPH03500724A; FI100244B; GR3017099T3; DE59009487D1; JP2559538B2; NL970008I1; HU218092B; ES2031804T3; NO2000002I1

Abstract

Řešení se týká tkáňového akvivátoru plasminogenu t-PA, který není glykosylován a je tvořen určitým řetězcem aminokyselin, který lze vyjádřit vzorcem I. Pro tento řetězec je kodem řetězec DNA, který je možno vyjádřit vzorcem II. Uvedený aktivátor má při použití k rozpuštění krevních sraženin zvláště vhodné vlastnosti a tvoří účinnou složku farmaceutického prostředku s fibrinolytickým účinkem, který je rovněž součástí řešení, stejně jako způsob výroby t-PA, plasmidy s obsahem kodového řetězce pro tuto látku a způsob výroby těchto plasmidů. ŕ

Description

Oblast techniky

Vynález se týká tkáňového aktivátoru plasmogenu t-PA, řetězce DNA, který je kódem pro tento nový derivát, způsobu výroby plasmidů, způsobu výroby uvedeného derivátu a farmaceutických prostředků pro rozpouštění krevních sraženin, které obsahují uvedený derivát.

Dosavadní stav techniky

Vytékající krev obsahuje jako hlavní složku bílkovinné matrice polymerní fibrin. Fibrin je za fyziologických podmínek rozpouštěn fibrinolytickým systémem v reakční kaskádě, jejíž činnost padá v úvahu při srážení krve. Centrální reakcí je aktivace plasminogenu na plasmin, která je ovlivněna například tkáňovým aktivátorem plasminogenu t-PA (tissue type plasminogen activator). Plasmin rozpouští fibrin, který je hlavni složkou bílkovinné matrice při srážení krve. Enzymatická účinnost přirozeného t-PA nebo stejné látky, získané z eukaryotických organismů genetickou technologií, zejména katalytická aktivace plasminogenu na plasmin, je v nepřítomnosti fibrinu nebo štěpných produktů fibrinogenu velmi malá, za přítomnosti těchto bílkovin však může být podstatně zvýšena, a to i více než desetkrát.

Tkáňový aktivátor plasminogenu t-PA je štěpen v krvi přítomnými proteázami na dva řetězce, řetězec A a řetězec B. Oba tyto řetězce zůstávají spojeny cysteinovým můstkem. Stimulovatelnost účinnosti t-PA znamená velkou výhodu oproti jiným známým aktivátorům plasminogenu, jako je například urokináza nebo streptokináza, jak bylo popsáno například v publikacích M. Hoylaerts a další, J. Biol. Chem 257 (1982), 2912 - 2919; W. Nieuwenhuizen a další, Biochem. Biophys. Acta, 755 (1983), 531 - 533.

Mechanismus účinku t-PA in vivo je popsán například v publikaci Korniger a Collen, Thromb. Hámostasis 46 (1981), 561 - 565. Účinnost enzymu, zaměřená na povrch fibrinu, dovoluje užít tuto látku jako prostředek proti patologickým uzávěrům cév, například u srdečního infarktu, jak již bylo prokázáno klinickými pokusy, popsanými v publikacích Collen a další, Circulation 70 (1984), 1012; Circulation 73 (1986), 511.

Nevýhodou použití t-PA je prozatím rychlý pokles koncentrace této látky v krevním plazmě (Clearance). V důsledku toho je zapotřebí užít poměrně velkého množství t-PA k tomu, aby bylo možno dosáhnout in vivo účinného rozpouštění thrombů. Při vyšších dávkách však může dojit k vedlejším účinkům, například ke krvácení V evropském patentovém spisu č. 196 920 je popsán přírodní produkt odbourávání t-PA, který obsahuje ještě oblasti Kringel II a oblast proteázy, N-terminální zakončení tohoto produktu začíná

-1CZ 281836 B6 alaninem v poloze 160, řetězec aminokyselin je uveden v publikaci Pennica a další, Nátuře 301 (1983), 214 - 221.

Clearance tohoto produktu odbourávání není příliš odlišný od téže hodnoty pro přírodní t-PA. Až chemickou modifikací katalytické oblasti připojením blokující skupiny je možno dosáhnout zlepšení.

Vynález si klade za úkol navrhnout takovou změnu t-PA, aby vzniklý derivát měl prodloužený poločas koncentrace v krevní plazmě. Současně by měla být uchována účinnost při rozpouštění thrombů a stimulovátelnost fibrinem.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu t-PA, neglykosylovaný a lin vzorce I tvoří tkáňový aktivátor plasminogenu tvořený následujícím řetězcem aminokyse(M)

SxQGKSSCY?

GNGSAYRGTH

SLTESGASCL

VYTAQKPSAQ

ALGLGKHNYC

CHVLKNHHLT wzycev? ses

TCGLRQYSQ?

101

Q/íuáGGUA

DIASHPKAA

IZAKHSHSPG

SSCWUSAAH

151 cy

LZVILGHTYR

EVZKYIVHKS

FDDDTYDKDZ (I)

201

ALLQLKSDSS

BCAQ2SSWH

TVCLPPADLG

LPDTOECZLS

GYGCHZALS?

251

VHLYrSSRCT

SQHLLXRTTO

SGGPQAXLHD

301

ACQGDSGGPL

VCLNZGaíTL

VGIISVřGLGC

GQKDVPGVYT

KVTNYLDra

351 přičemž na aminoterminálním konci (č. 1 = S) může být řetězec ještě prodloužen pomocí M.

Nyní bylo neočekávané zjištěno, že při vypuštění přebytečných, v nativním t-PA se nacházejících, oblastí nedojde k žádnému ovlivněni thrombolytického účinku a stimulovatelnost fibrinu rovněž zůstává v podstatě stejná. V derivátu podle vynálezu však chybí vazba na fibrin, přesto má derivát thrombolytickou účinnost in vivo ještě o něco vyšší, než je účinnost nativního t-PA. Stejně překvapující je skutečnost, že při podáni thrombolyticky účinného množství tohoto derivátu zůstává systemická fibrinolýza téměř neovlivněna. Ukázalo se tedy, že derivát t-PA podle vynálezu má za fyziologických podmínek typické vlastnosti nativního t-PA, pokud jde o specificitu vzhledem k fibrinu. Tyto výsledky byly získány při farmakologickém sledování tohoto derivátu, jak bude dále uvedeno v příkladu 6. Mimoto

-2CZ 281836 B6 má bílkovinný derivát podle vynálezu velmi vysokou specifickou účinnost, byly popsány specifické účinnosti až 500 až 800 k jednotek /mg .

Předmětem vynálezu je rovněž řetězec DNA, který je kódem pro derivát t-PA a který je možno vyjádřit jako následující řetězec:

CACAGCCTCACCGAGTCGGGTGCCTCCTGCCTCCCGSGGAAXTCCATG.ITCCTGITAGGC

AAGGTTTACACAGCACAGAACCCCAGTGCCCAGGCACTGGGCCTGGGCAAACATAATTAC

TGCCGGAATCCTGATGGGGATGCCAAGCCCTGGTGCCACGTGCTGAAGAACCGCAGGCTG

ACGTGGGAGTACTGTGATGTGCCCTCCTGCTCCACCTGCGGCCTGAGACAGTACAGCCAG

CCTCAGTTTCGCATCAAAGGAGGGCTCTTCGCCGACATCGCCTCCCACCCCTGGCAGGCT

GCCATCTTTGCCAAGCACAGGAGGTCGCCCGGAGAGCGGTTCCTGTGCGGGGGCATACTC

ATCAGCTCCTGCTGGATTCTCTCTGCCGCCCACTGCTTCCAGGAGAGGTTTCCGCCCCAC

CACCTGACGGTGATCTTGGGCAGAACATACCGGGTGGTCCCTGGCGAGGAGGAGCAGAAA

TTTGAAGTCGAAAAATACATTGTCCATAAGGAATTCGATGATGACACTTACGACAATGAC

TCCGGCTAGGGCAAGCATGAGGCCTTGTCTCCTTTCTATTCGGAGCGGCTGAAGGAGGTT

C ATGTC AGAC TGTACCCATCC AGCC GCTGC ACATC AC AAC ATTTACTTAAC AGAACAGT C

ACCGACAACATGCTGTGTGCTGGAGACACTCGGAGCGGCGGGCCCCAGGCAAACTTGCAC

GACGCCTGCCAGGGCGATTCGGGAGGCCCCCTGGTGTGTCTGAACGATGGCCGCATGACT

ACAAAGGTTACCAACGACCTAGACTGGATTCGTGACAACATGCGACCG 1068

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

-3CZ 281836 B6

Řetězec DNA tak jak byl svrchu uveden, je možno použít k expresi derivátu t-PA podle vynálezu v případě, že se uloží do plasmidu pro expresi. Tento plasmid pro expresi představuje další předmět vynálezu, stejně jako plasmid pro expresi, který má poněkud odlišný řetězec DNA, který však je rovněž kódem pro derivát t-PA podle vynálezu. Na základě degenerace genetického kódu jsou k tomuto účelu vhodné i řetězce, které jsou poněkud odchylné od svrchu uvedeného řetězce DNA.

Předmětem vynálezu je rovněž způsob výroby plasmidu pro expresi, který obsahuje řetězec DNA, který je kódem pro bílkovinu t-PA podle vynálezu nebo její derivát, který obsahuje kromě oblasti Kringel II s kódem pro aminokyseliny 176 až 263 řetězce aminokyselin t-PA a oblasti pro proteázu z t-PA ještě další oblasti bílkovin t-PA. Způsob spočívá v tom, že se uvedený řetězec vnese do plasmidu a řízenou mutagenesou se odstraní ty oblasti, které jsou kódem pro aminokyseliny, které se v derivátu t-PA podle vynálezu nenacházejí.

Volba plasmidu, do nějž má být zařazen řetězec DNA, který je kódem pro derivát t-PA podle vynálezu, závisí na cílových buňkách, které mají být později použity pro expresi tohoto derivátu. Vhodné'plasmidy a minimální požadavky, kladené na tyto plasmidy, například počátek replikace nebo místo působení restrikčních enzymů, jsou odborníkům známy. V rámci vynálezu je možno místo plasmidu použít také Cosmid, tj. replikativni formu fágu (lambda, M13) s dvojitým řetězcem a další, odborníkům známé vektory. Postup pro řízenou mutagenesu byl popsán v publikaci Morinaga a další, Biotechnology, 21, (1984), 634 a při provádění způsobu podle vynálezu byl uskutečňován podle této publikace.

Předmětem vynálezu je rovněž způsob výroby derivátu t-PA podle vynálezu tak, že se dosáhne exprese plasmidu podle vynálezu ve vhodné buňce a výsledný produkt se izoluje z živného prostředí, popřípadě po rozrušeni uvedených buněk. K výrobě derivátu t-PA podle vynálezu se s výhodou užívají buňky prokaryotických organismů. Je zvláště výhodné nejprve z rozpustných částí buňky izolovat tak zvaná inkluzní tělíska (nerozpustné agregáty bílkovin), tato inkluzní těliska, která obsahují t-PA, se solubilizují působením guanidinhydrochloridu za redukčních podmínek, pak se vytvoří derivát navázáním GSSG a pak se derivát t-PA renaturuje přidáním L-argininu a GSH. Přesný návod na aktivaci t-PA z inkluzních tělísek je uveden například v evropských patentových spisech č. 219 874 a 241 022. Je však možno užít i jiných postupů k získáni účinných bílkovin z inkluzních tělísek.

Při provádění způsobu podle vynálezu k čištění K2P se postup provádí s výhodou za přítomnosti L-argininu zvláště v koncentraci 10 až 1000 mmol/1.

Výhodným způsobem se oddělení cizorodé bílkoviny provádí afinitní chromatografií na sloupci při použití ETI (Eritrina Trypsin Inhibitor). ETI se fixuje na nosič, například Sepharosu. Čištěni při použití sloupce s ETI má tu výhodu, že na sloupec s tímto materiálem je možno přímo nanést koncentrovaný vzorek, určený k renaturaci, za přítomnosti vysokých koncentrací argininu, například 0,8 mol/1. Shlukování K2P, které je možno provádět při nízkých koncentracích argininu pod 10 mmol/1, tedy není

-4CZ 281836 B6 zapotřebí provést. Zvláště výhodné je čištění K2P sloupcem s obsahem ETI za přítomnosti 0,6 až 0,8 mol/1 argininu. Roztok s obsahem K2P má s výhodou pH vyšší než 7, zvláště 7,5 až 8,6.

Vymývání sloupce s obsahem ETI se provádí při snížení pH, a to jak za přítomnosti, tak v nepřítomnosti argininu za podmínek, umožňujících dobrou rozpustnost K2P. S výhodou se při eluci pH nachází v kyselé oblasti, zvláště v rozmezí 3 až 5,5.

K2P získaný způsobem podle vynálezu má specifickou účinnost t-PA v rozmezí 550 000 ± 200 000 jednotek/mg při čistotě vyšší než 95 %.

Podle vynálezu je možno získat také derivát t-PA, který má podstatně prodloužený poločas v plazmě, vzhledem k tomu, že je možno dosáhnout sníženi clearance. Derivát podle vynálezu při tom neztrácí žádnou ze svých vlastností, vhodných pro jeho použití k thrombolýze. Je tedy vhodný pro podávání u lidí také vzhledem k tomu, že se při jeho použití nevyskytují žádné vedlejší účinky, jako je krvácení, k němuž dochází při použití poměrně vysokých dávek nativního t-PA.

Derivát t-PA podle vynálezu má takovou účinnost, že stačí použít čtvrtinu množství t-PA, jehož by bylo zapotřebí použít k dosažení téhož účinku. Podstatu vynálezu tvoři také farmaceutický prostředek s fibrinolytickým účinkem, a jako svou účinnou složku obsahuje derivát t-PA vzorce I.

Přehled obrázků na výkresech

Na obr. 1 je schematicky znázorněna výroba plasmidu pA27.3.

Na obr. 2 je znázorněno srovnání vazby fibrinu pro derivát t-PA podle vynálezu (křivka 1) s vazbou fibrinu pro nativní t-PA, jehož exprese bylo dosaženo v buňkách CHO (tct-PA/CHO): t-PA s dvojitým řetězcem z buněk CHO, rozštěpený na fyziologickém štěpném místě Arg 275-Ile276, křivka 2; sct-PA/CHO: t-PA s jednoduchým řetězcem z buněk CHO, křivka 3.

Na obr. 3a 4 je znázorněn diagram farmakokinetické účinnosti t-PA pro derivát t-PA podle vynálezu ve srovnáni s běžně dodávaným prostředkem s obsahem t-PA (Actilyse^^R^); na křivce 1 je hodnota pro K2P v dávce 200 000 jednotek, 0,25 mg/kg nitrožilně, čtyři pokusy na zvířatech. Na křivce 2 je výsledek pro prostředek Actilyse^R v dávce 200 000 jednotek/kg nitrožilně, šest pokusných zvířat.

Na obr. 5 je znázorněna závislost thrombolýzy na dávce pro derivát t-PA podle vynálezu a pro Actilyse^R. Je uvedena střední hodnota plus standardní odchylka, jedna kilojednotka = přibližně 1000 mezinárodních jednotek. Na křivce 1 je výsledek pro K2P, na •D křivce 2 je výsledek pro prostředek Actilyse.

Vynález bude osvětlen následujícími příklady.

-5CZ 281836 B6

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Konstrukce plasmidu pA27.3

Výchozí plasmid pREM7685, popsaný v evropském patentovém spisu č. 242 836, má následující složky: tac-promotor, lac-operátorovou oblast s kodonem ATG pro počátek, kódovou oblast pro derivát t-PA FK2P, terminátor transkripce z pKK223-3, gen pro β-laktamázu, gen pro odolnost proti kanamycinu a počátek plasmidu pACYC177, jde o plasmid, který se nachází v buňce v malém počtu kopii. Řetězec derivátu t-PA FK2P se skládá z nukleotidů 190 až 336 (oblast F), 715 až 1809 (oblast K2, proteáza, malý podíl 3'UT) a kodon ATG pro počátek. Polohy nukleotidů jsou uváděny podle publikace Bennica a další, Nátuře 301 (1983) 214 až 221.

K vypuštění oblasti F z konstrukce FK2P plasmidu pREM7685 bylo použito v podstatě postupu podle publikace Morinaga a další, Biotechnology 21 (1984), 634. Ke tvorbě heteroduplexního útvaru byly z pREM7685 izolovány dva fragmenty. Fragment A: pREM7685 byl rozštěpen restrikčním enzymem EcoRI. Štěpné produkty byly odděleny elektroforézou na gelu a největší fragment EcoRI byl izolován. Fragment B: plasmid pREM7685 byl linearizován restrikčním enzymem Xhol. Linearizovaný plasmid byl po elektroforéze na gelu získán s vysokou čistotou. Pro mutagenesu byl synteticky vyroben následující oligonukleotid:

5' TG TCT TAC CAA GGA AAC AGT GA 3'

K tvorbě heteroduplexu se smísí fragment A, fragment B vždy v množství 450 fmol a oligonukleotid v množství 75 pmol a směs se inkubuje za přítomnosti 50 mmol/1 chloridu sodného, 10 mmol/1 tris-HCl o pH 7a 10 mmol/1 síranu hořečnatého 3 minuty při teplotě 100 ‘C, pak se směs rychle přenese do ledu. Renaturace DNA se provádí 30 minut při teplotě 60 °C. K syntéze se k heteroduplexu přidají ještě následující složky:

Desoxynukleotidtrifosfáty v množství vždy 0,25 mmol/1, ATP 1 mmol/1, chlorid sodný 100 mmol/1, tris-HCl o pH 7,5 6,5 mmol/1, chlorid hořečnatý 8 mmol/1, β-merkaptoethanol 1 mmol/1, Klenowův fragment DNA-polymerázy z E. coli 0,125 jednotky/μΐ vzorku a T4-ligáza v množství 0,1 jednotky/μΐ vzorku. Syntéza se provádí 4 hodiny při teplotě 16 °C. Pak se směs použije k transformaci buněk E. coli (RM82, DSM 3689) při použiti lac I^-plasmidu a pak se transformanty podrobí selekci přidáním 25 μg/ml kanamycinu k živnému prostředí.

Hybridizací kolonií při použiti svrchu popsané mutagenesy s použitím olegonukleotidu jako sondy bylo možno izolovat ty klony, které obsahovaly plasmid pA27.3. Tento plasmid se odlišuje od výchozího plasmidu pREM7685 mimo jiné tím, že chybí místa působení enzymu pstl a Sspl. Obě tato místa se nachází v oblasti F výchozího plasmidu. Konstrukce plasmidu pA27.3 je schematicky znázorněna na obr. 1.

—6—

Příklad 2

Způsob výroby účinného derivátu t-PA K2P z E. coli.

Rozrušení buněk a příprava inkluzních tělísek (IB)

1,6 kg vlhké buněčné hmoty E. coli DSM 3689, transformovaného plasmidem pA27.3, se uvede do suspenze v 10 litrech roztoku s obsahem 0,1 mol/1 tris-HCl, 20 mmol/1 EDTA při pH 6,5 a teplotě ’C. Pak se přidá 2,5 g lysozymu a směs se inkubuje 30 minut při teplotě 4 °C. Pak se dovrší rozrušení buněk působením zvýšeného tlaku. K materiálu se přidá ještě 5 litrů 0,1 mol/1 tris-HCl, 20 mmol/1 EDTA, 6 % Triton X100 a 1,5 mol/1 chloridu sodného při pH 6,5, načež se směs inkubuje ještě 30 minut při teplotě 4 ”C. Pak se oddělí nerozpustný podíl, tvořený inkluznimi tělísky, odstředěním v Padbergově odstředivce. Peleta se uvede do suspenze v 10 litrech roztoku s obsahem 0,1 mol/1 tris-HCl, 20 mmol/1 EDTA o pH 6,5, inkubace trvá 30 minut při 4 ’C, inkluzní tělíska se pak izolují odstředěním.

Solubilizace inkluzních tělísek

100 g inkluzních tělísek (vlhká hmotnost), se uvede do suspenze ve 450 ml roztoku s obsahem 0,1 mol/1 tris-HCl, 6 mol/1 guanidiniumhydrochloridu, 0,2 mol/1 DTE, 1 mmol/1 EDTA o pH 8,6 a pak se směs míchá dvě a půl hodiny při teplotě 25 °C.

Po nastaveni pH na hodnotu 3 přidáním 25 % kyseliny chlorovodíkové se provádí dialýza proti 10 mmol/1 HC1, užije se 3 x 50 litrů roztoku v době 24 hodin při teplotě 4 ’C.

Derivatizace

Jako předloha se užije pevný guanidiumhydrochlorid, takže po konečném zředěni svrchu uvedeného dialyzátu 10 mmol/1 HC1 je koncentrace guanidiniumhydrochloridu 6 mol/1.

Směs se předem inkubuje 1,5 hodiny při teplotě 25 ’C, pak se přidá oxidovaný glutathion (GSSG) do koncentrace 0,1 mol/1 a tris-HCl do 0,05 mol/1 a pH se upraví roztokem s obsahem mol/1 hydroxidu sodného na hodnotu 9,3. Pak se směs míchá 3,5 hodiny při teplotě 25 “C.

Po úpravě pH na hodnotu 3 přidáním 25 % kyseliny chlorovodíkové se provádí dialýza proti roztoku s obsahem 10 mmol/1 kyseliny chlorovodíkové, v průběhu 48 hodin se užije 3 x 100 litrů roztoku při teplotě 4 ’C. Po ukončeni dialýzy se materiál odstředí a čirý supernatant se dále zpracovává.

Renaturace

Reakční nádoba s objemem 10 litrů se naplní roztokem s obsahem 0,1 mol/1 tris-HCl, 0,8 mol/1 L-argininu, 2 mmol/1 GSH, 1 mmol/1 EDTA při pH 8,5. Renaturace se provádí při teplotě 20 ’C trojnásobným přidáním vždy 100 ml derivátu ve formě disulfidu v časovém odstupu 24 hodin.

-7CZ 281836 B6

Po renaturaci se získá materiál se specifickou účinností 1500 až 10 000 I.U. (mezinárodní jednotky)/mg, stanovení bude uvedeno v příkladu 4b. Jednotka b je jednotka účinnosti podle definice WHO, National Institute of Biological Standards and Control.

Koncentrace renaturované směsi

Renaturační směs je možno koncentrovat při použití hemodialyzátoru.

Příklad 3

Čištění K2P v E. coli

1. Čištění K2P z E. coli afinitní chromatografii na sloupci ETI-sepharosy po předchozí koncentraci

a) Eluce kyselinou citrónovou

Renaturační směs byla zahuštěna pomocí hemodialyzátoru (Asahi AM 300) v poměru 1 : 23 a zásobní roztok byl doplněn na 0,5 mol/1 chloridu sodného. Tento materiál byl pak nanesen na sloupec ETI-sepharosy v rovnovážném stavu s 0,1 mol/1 tris-HCl o pH 7,5 s 0,8 mol/1 argininu a 0,5 mol/1 chloridu sodného. Objem ekvilibračního roztoku byl 50 ml, objem vzorku byl 550 ml, tj. 10ti násobek objemu sloupce/h, sloupec byl promýván ekvilibračním pufrem tak dlouho, až absorpce eluátu při 280 nm byla rovna hodnotě pro pufr. Eluce vázaného materiálu pak byla prováděna při použiti 20 mmol/1 kyseliny citrónové o pH 3,2.

Parametry postupu jsou uvedeny v následující tabulce:

	objem ml	účinnost IU/ml	^cProt. mg/ml	SA^X)	IU/mg
koncentrát	550	57 162	14	4	083
ETI-eluát	90	330 000	0,71	465	000

Vysvětlivka k tabulce:

Specifická účinnost: účinnost při chromogenním testu (příklad 4b) dělená obsahem bílkoviny ve vzorku.

Cprot ~ koncentrace bílkovin

b) Eluce 0,3 mol/1 Arg o pH 4,5

Renaturační směs byla zahuštěna obdobným způsobem jako v příkladu 3.1.a). Na sloupec s objemem 25 ml ETI-Sepharose v rovnovážném stavu s roztokem s obsahem 0,1 mol/1 tris-HCl o pH 7,5, 0,8 mol/1 arg a 0,5 mol/1 chloridu sodného bylo naneseno

800 ml koncentrátu při průtoku 12 objemů sloupce/h a sloupec byl pak promýván ekvilibračním pufrem tak dlouho, až se extinkce

-8CZ 281836 B6 eluátu při 280 nm rovnala hodnotě pro pufr. Vázaný materiál byl pak vymýván roztokem s obsahem 0,3 mol/1 argininu o pH 4,5.

Parametry postupu	jsou uvedeny v následující	tabulce:
	objem	ml	účinnost	^cProt.	SA	IU/mg
			IU/ml	mg/ml
koncentrát	800		20 000	11,3	1	770
ETI-eluát	55		280 000	0,6	550	000
2. Čištění K2P	¹ Z E.	coli	afinitní	chromatografii na	sloupci

ETI-sepharosy bez předchozí koncentrace

Na sloupec ETI-Sepharosy s objemem 10 ml, v rovnovážném stavu v 0,1 mol/1 tris-HCl o pH 7,5, 0,8 mol/1 argininu a 0,5 mol/1 chloridu sodného se nanese 12 litrů směsi a sloupec se tak dlouho promývá ekvilibračním pufrem, až absorpce eluátu má stejnou hodnotu jako pufr. Eluce vázaného materiálu se pak provádí roztokem s obsahem 0,8 mol/1 argininu o pH 5. Parametry postupu jsou uvedeny v následující tabulce:

	objem ml	účinnost IU/ml	^cProt. mg/ml	SA IU/mg	pl )
výchozí směs	12 000	615	0,135	4 556	25
ETI-eluát	42	105 000	0,185	586 000	35

Stimulace fibrinem = účinnost za přítomnosti fibrinu, dělená účinností bez fibrinu.

Příklad 4

Charakterizace čištěného K2P z E. coli

a) Chemická charakterizace bílkovin

- SDS-Page a vysokotlaká kapalinová chromatografie v reverzní fázi

Homogenita čištěného materiálu, získaného afinitní chromátografií na sloupci ETI-Sepharose byla sledována SDS-Page a vysokotlakou kapalinovou chromatografii v reverzní fázi (RP-HPLC). Z poměrně krátké dráhy bylo možno vypočítat pro K2P z prokaryotických organismů molekulovou hmotnost 38 500 ± 2 000 jednotek. Denzitometrické vyhodnoceni prokázalo čistotu vyšší než 95 %.

RP-HPLC je založena na odlišném působení bílkovin a hydrofobni matrice. Postup se využívá jako analytická metoda pro průkaz čistoty materiálu.

-9CZ 281836 B6

Analýza čištěného K2P z E. coli byla prováděna při použití sloupce Nucleosil 300 (Knauer) při použití gradientu kyseliny trifluoroctové a acetonitrilu. Pufr A: 1,2 ml kyseliny trifluoroctové v 1000 ml vody. Pufr B: 300 ml vody, 700 ml acetonitrilu, 1 ml kyseliny trifluoroctové; 0 až 100 %. Souhrnným výsledkem chromatografické analýzy byla čistota produktu vyšší než 95 %.

- N-terminální řetězec aminokyselin

N-terminální řetězec aminokyselin byl stanoven na analyzátoru aminokyselin (ABI 470 Sequenator) se standardním programem. Zjištěný řetězec S1-Y2-Q3-G4-N5-S6-D7-C8-Y9 je zcela v souladu s očekávaným řetězcem, odvozeným od řetězce DNA.

b) Stanovení účinnosti

Stanovení účinnosti K2P z E. coli in vitro bylo prováděno podle návodu, uvedeného v publikaci Zeitschrift fur die gesamte innere Medizin (ZGIMAL) 42 (17) 478 - 486 (1987). Specifická účinnost byla 550 000 ± 200 000 IU/mg. Stimulovatelnost K2P z E. coli fragmenty BrCN fibrinogenu byla v tomto systému vyšší než 25. Jde o účinnost za přítomnosti fragmentu fibrinogenu, dělenou účinností v nepřítomnosti těchto fragmentů.

c) Vazba na fibrin in vitro

Vazba K2P z E. coli na fibrin byla stanovena způsobem podle publikace Higgins D. L. a Vehar G. A. (1987), Biochem. 26. 7786 - 7791.

Z obr. 2 je zřejmé, že K2P z E. coli na rozdíl od t-PA z CHO nebo t-PA z E. coli neváže do větší míry fibrin.

Přiklad 5

Ke zvýšeni výtěžku extrakce byl kódový řetězec pro K2P překlonován ve vyšším počtu kopií. K tomu účelu byl užit plasmid pePa 126.1, popsaný v NSR patentovém spisu č. 3 838 378. Tento plasmid je tvořen v podstatě vektorem pKK223-3 a kódovým řetězcem pro t-PA, jak byly popsány v evropském patentovém spisu č. 242 835.

Do tohoto plasmidu byl nejprve integrován řetězec fd-terminátoru. K tomuto účelu byl plasmid pePa 126.1 linearizován restrikčním enzymem Hind III. Takto rozštěpený plasmid byl podroben elektroforéze na gelu a získán s preparativní čistotou. Plasmid pLBUl, popsaný v publikacích Beck a další, (1978), Nucl. Acids. Res., 5, 4495 - 4503; Gebtz a další, (1981) PNAS 78 (8):4963, byl rozštěpen působením enzymu Hind III a elektroforézou na gelu s následnou eluci byl s preparativní čistotou získán fragment o velikosti 360 bp s obsahem fd-terminátoru. Pak byly navázány linearizovaný plasmid pePa 126.1 a fragment z plasmidu pLBUl po štěpení enzymem Hind III o velikosti 360 bp. Směs, v níž byla provedena vazba, byla kotransformována plasmidem pUBS 500 v E. coli DSM 2102. Plasmid byl popsán v NSR patentovém spisu č. 3 838 378. Ze získaných klonů byly izolovány klony, obsahující

-10CZ 281836 B6 požadovaný plasmid pePa 126 fd, lišící se od výchozího plasmidu pePa 126.1 druhým místem působení restrikčního enzymu Hind III.

Z plasmidu pePa 126 fd byly získány dva fragmenty. Jeden o velikosti 3,4 kb po štěpení enzymy BamHI/PvuI a druhý o velikosti 1,3 kb po štěpeni Pvul/Xmal. Oba tyto fragmenty byly vázány s fragmentem o velikosti 1,3 kb po štěpení enzymy BamHI/Xmal z plasmidu pA27.3 a užity s plasmidem pUBS 500 k transformaci E. coli. Výsledný plasmid byl označen pA27 fd a od plasmidu pePa 126 fd se liší tím, že obsahuje druhý nejmenši fragment EcoRI z pePa 126 fd o velikosti 610 bp, který je v plasmidu pA27 fd zkrácený o přibližně 515 bp.

Příklad 6

Farmakologické zkoušky derivátu t-PA K2P, který byl získán expresí v prokariotických organismech

1. Farmakokinetika K2P u králíků

Derivát K2P byl srovnáván u králíků (Neuseeland) s vlastnostmi prostředku Actilyse^R. Oba prostředky byly podávány infuzi v dávce 200 000 IU/kg, přibližně 30 minut. Vzorky plazmy byly odebírány před infuzi, v jejím průběhu a po jejím ukončení do určité doby. Účinnost t-PA byla měřena spektrofotometricky způsobem podle publikace J. H. Verheijen a další, Thromb. Haemostas. 48, 266, 1982, modifikovaným podle publikace H. Lili, Z. ges. Inn. Med., 42, 478, 1987.

K vypočítání farmakokinetických parametrů bylo užito programu s nelineární regresí, který byl modifikován podle publikace H. Y. Huang, Aero-Astronoutics-Report 64, Rice University, 1 - 30, 1969. Parametry byly vypočítávány jednotlivě s pomocí biexponenciálního farmakokinetického modelu.

K2P má pětkrát delší poločas (tl/2a = 10,3 min., pokles koncentrace v plazmě) než prostředek Actilyse^R (prostředek s obsahem t-PA, Thomae), jak je znázorněno v tabulce 1 a na výkresech 3 a 4. Na konci infuze byla v případě K2P naměřena účinnost t-PA (C^n^) v plazmě 1986 IU/ml, což je hodnota šestkrát vyšší než pro prostředek Actilyse^R. Z objemu (Vc) bylo možno připsat pro K2P potřebu 46,8 ml/kg ve srovnání s objemem 73,7 ml/kg v případě prostředku Actilyse^R. Celkový clearance (Cl_tot) byl pro prostředek Actilyse^R 22,2 ml/min/kg, kdežto v případě K2P-Pro 3,2 ml/min/kg, což znamená snížení na 1/7. Pro použití fibrinolytika k injekčnímu podáni ve větším objemu je zvláště zajímavá tak zvaná plocha pod křivkou (AUC), protože poskytuje srovnání vztahu doby, po kterou zůstává dostatečná plazmatická koncentrace látky. K2P má osmkrát větší AUC velikosti 1064 IU/ml.h než Actilyse^R, pro kterou má uvedená hodnota velikost 133,3 IU/ml.h.

-11CZ 281836 B6

Celkově je možno uvést, že K2P má ve srovnání s komerčně dodávanou rekombinantní bílkovinou t-PA při stejné dávce pětkrát až osmkrát zlepšený farmakokinetický profil.

2. Farmakodynamika K2P u králíka

K průkazu thrombolytické účinnosti bylo použito známého králičího modelu pro thrombózu jugulární žíly, model byl popsán v publikaci D. Collen a další, J. Clin. Invest. 71, 368, 1983. K2P a prostředek Actilyse^R byly zkoumány vždy ve třech dávkách. Obé látky byly podávány 4 hodiny ve formě infuze, načež byla zkoumána rychlost rozpouštění sraženiny, jak je dále uvedeno v tabulce 2 a znázorněno na obr. 5.

Dávka pro rychlost thrombolýzy 50 % (ED₅₀) lag, vypočítaná lineární regresí, byla pro K2P 124 000 IU/kg KG a pro prostředek Actilyse 520 000 IU/kg KG. Je tedy zřejmé, že K2P má čtyřikrát vyšší thrombolytický účinek než prostředek Actilyse.

Při podávání K2P bylo možno dosáhnout v krevní plazmě takové účinnosti typu t-PA, která byla srovnatelná s účinností prostředku Actilyse, avšak při čtyřikrát nižší dávce. S dávkou 800 kU prostředku Actilyse/kg KG srovnatelný účinek bylo možno získat při dávce 200 kU K2P/kg KG při malém vlivu na fibrinogen, plasminogen a a₂-antiplasmin, dávka 800 kU prostředku Actilyse/kg KG je tak vysoká, že typy účinku již nelze rozlišit.

K2P je tedy t-PA-mutein, který má při použití na králičím modelu thrombózy jugulární žíly ve formě čtyřhodinové infuze při současném snížení dávky na 1/4 dávky prostředku Actilyse stejný thrombolytický účinek jako uvedený prostředek. K2P se tedy svým účinkem neodlišuje od účinku uvedeného prostředku, avšak při daleko nižší dávce má týž účinek na srážecí systém.

Tabulka 1

Farmakokinetické parametry údajů o koncentraci t-PA v plazmě v průběhu času podle počítačových údajů o účinnosti t-PA.

prostředek	^tl/2^a	^tl/2^	^Cinf	^VC	C*tot	^AUCextrapol.
(dávka: 200 000 IU/kg bw)	(min)	(min)	(IU/ml)	(ml/kg)	(ml/min/kg)	(IU . h) ml
K2P	10,3	14,9	1986,6	46,8	3,2	1064,4
(n = 4)	± U	+ 4,6	t 762,6	+ 14,7	± 1,1	+ 443,2
□ Actilyse	2,1	10,9	326,6	73,7	22,2	133,3
(n = 6)	t 0,6	i 2,4	ř 118,1	± 19,7	±7,6	i 44,1

-12CZ 281836 B6

Tabulka 2

Thrombolýza, účinnost t-PA v plazmě po 4 hodinách infuze a parametry hemostázy 30 minut po ukončení infuze pro K2P, Actilyse^Ra rozpouštědlo

parametr	K2P 200 kU/kg	K2P 100 kU/kg	K2P 50 kU/kg	rozpouštědla NaCl/Tween	• R Actilyse 800 kU/kg	D Actilyse 400 kU/kg
thrombolýza (i)	79 + 9 n = 3	32 ± 6 n - 5	29 + 1 n = 2	11 i 1 n = 6	54 i 6 n = 7	46 + 3 n = 6
účinnost t-PA v plazmě (IU/ml)	93,7 + 18,2	44 i 3	7 i 0	-	107 + 27	47 + 9
Fibrinogen (i)	74 + 2	90 i 6	86,5 + 6	92 + 3	77 + 6	90 + 3
Plasminogen (¾)	79 + 6	75 + 5	78 ± 11	98 i 10	77 + 4	88 + 4
a^-antiplasmin (í)	70 + 1	70 ± 4	93 ± 4	98 i 8	74 ± 5	87 +' 3

Jde o průměry ± standardní odchylka, kU = 1000 IU, hodnoty jsou udány v %, vztaženo na základní hodnoty.

Příklad 7

Farmakologické vlastnosti K2P z E. coli na psím modelu thrombózy koronární tepny

Aby bylo možno vyšetřit thrombolytický účinek K2P z E. coli na tepenné thromby, byl volen model na zvířeti pro simulaci akutního infarktu myokardu. Jako pokusné zvíře byl zvolen pes. Metoda pro tvorbu thrombu v koronární tepně byla modifikací postupu podle publikace Romson a další, Thromb, Res. 17, 841, 1980. Při otevřeném hrudníku byl u narkotizovaných psů s řízeným dýcháním elektricky podrážděn intenzitou 150 μΑ povrch intimy Rámus circumflexus A. coronaria sinistra (LCX), čímž byla vyvolána thrombóza. Distálně od thrombózy byla předem uložena svorka, aby bylo možno vyloučit experimentální stenózou reaktivní hyperemii. Proximálně od thrombu byla céva opatřena elektromagnetickým průtokoměrem, aby bylo možno měřit reperfúzi.

Na počátku pokusu byla po dobu jedné minuty heparinizovaným psům podávána vždy šesti psům na jednu dávku různá dávka BM 06.022 s rt-PA z eukaryotických organismů (Alteplase, Actilyse, Dr. Karl Thomae GmbH, Biberach NSR), současné bylo podáváno také Placebo. Před injekčním podáním a v určitých časových odstupech po injekčním podání byly odebírány vzorky krevní plazmy, aby bylo možno stanovit účinnost t-PA a koncentraci fibrinogenu, plasminogenu a a₂-antiplasminu a také počet thrombocytů v krvi. Fibrinogen byl stanoven měřením koagulace podle publikace Clauss, Acta haemat. 17, 237, 1957, plasminogen a a₂-antiplasmin byly stanove

-13CZ 281836 B6 ny podle publikace Collen a další, J. Clin. Invest. 71, 368, 1983 spektrofotometričky. Dále byla stanovena na zadní tlapce psa doba krvácení Simplate (Simplate^R I, Organon Teknika, Eppelheim, NSR) při žilním tlaku 40 mm Hg podle publikace J. Surg. Res., 27 , 244, 1979. Statistické srovnání naměřených hodnot s kontrolními hodnotami před injekčním podáním bylo provedeno Wilcoxonovým testem.

Aby bylo možno popsat thrombolytický postup, je udán počet zvířat ve skupině a doba, která uplyne do reperfúze. Z těchto údajů je možno usoudit na průměrnou rychlost reperfúze. Mimoto se měří 2 hodiny po injekčním podání vlhká hmotnost zbývajícího thrombu, aby bylo možno zjistit počet zvířat, u nichž došlo po reperfúzi k opětnému uzávěru tepny. Pomocí semilogaritmické analýzy regresů bylo možno pro každou látku stanovit účinnou dávku pro 50 % rychlost reperfúze (= ED₅₀). Statistické srovnání hmotnosti těchto thrombů bylo provedeno pomocí Wilcoxon-Mann-Whitneyova testu.

Koncentrace t-PA v plazmě byly měřeny fotospektrometricky v podstatě podle publikace Verheijen a další, Thromb. Haemost. 48, 266, 1982 v modifikaci, která byla uvedena v publikaci Lili, Z. gesamte Inn. Med., 42, 478, 1987. K vypočítání farmakokinetických parametrů byl užit program nelineárních regresí, modifikovaných podle publikace Η. Y. Huang, Aero-Astronautics Report 64, Rice University, USA, 1 - 30, 1969. Parametry byly vypočítávány jednotlivě po odečtení bazálních hodnot účinnosti t-PA z naměřených hodnot pomoci biexponenciálního farmakokinetického modelu.

Tímto způsobem byly získány následující výsledky:

1. Farmakodynamika u psa

K2P vede po nitrožilním podání k reperfúzi, která je závislá na dávce. Maximální účinek 100 % je možno dosáhnout po podání 200 kU/kg KG. V případě prostředku Actilyse je k témuž účinku zapotřebí dávky 1600 kU/kg KG. Pro srovnání je hodnota ED_5Q pro K2P 83 kU/kg KG, což je 11,5 x nižší hodnota než pro prostředek Actilyse, jehož hodnota je 961 kU/kg KG. Při podáni placeba nedošlo vůbec k reperfúzi. Hmotnost zbývajícího thrombu při podáni placeba byla 9,6 ±1,6 mg, jde o průměr a standardní odchylku. U obou účinných látek došlo při zvyšování dávky k statisticky významnému snížení hmotnosti zbývajícího thrombu, ve srovnání s kontrolami, jimž bylo podáváno placebo. K reperfúzi došlo v případě K2P v průměru o 25,9 ± 3,5 min, v případě Actilyse byla tato doba 24,2 ± 6,2 min. U většiny psů došlo po reperfúzi k opětnému uzávěru tepny, jak je zřejmé z tabulky 3.

2. Farmakokinetika u psa

Po nitrožilním podání 200 kU/kg K2P nebo Actilyse je možno u narkotizovaného psa prokázat, že rychlá fáze poklesu koncentrace v plazmě, vyjádřená jako Ď^e P^{ro K2P 7/2} ~ ^1,1 minut, tato doba je tedy 4,5krát delší než pro Actilyse, kde je 1,6 ± 0,2 min, jak je zřejmé z tabulky 4. Koncentrace v plazmě

-14CZ 281836 B6 bezprostředně po ukončení injekce je v případě K2P přibližně dvojnásobná ve srovnání s Actilyse. Odstranění K2P z plazmy, tj. clearance (Cl^._ot) trvá u K2P 9krát déle než u Actilyse. V důsledku toho je plocha pod křivkou pro K2P také téměř 9,5krát větší.

3. Specifičnost pro fibrin u psa

Dvě hodiny po injekčním podání K2P bylo možno prokázat malé snížení zbytkové koncentrace fibrinogenu, v závislosti na dávce, a to na 81 ± 10 % u nejvyšší dávky 200 kU/kg KG. Oproti tomu byla koncentrace fibrinogenu po podání nejvyšší dávky Actilyse 1600 kU/kg KG snížena až na 3 ± 0 %, jak je zřejmé z tabulky 5. V případě, že se při semilogaritmické analýze regresu pro závislost vedlejšího účinku na dávce použije snížení koncentrace fibrinogenu a thrombolytická účinnost ED₅₀ se přiřadí ke koncentraci fibrinogenu, získá se pro stejně silnou dávku K2P snížení fibrinogenu na 92,5 %, kdežto v případě Actilyse na 38,6 %. Také v případě plasminogenu a a₂-antiplasminu je možno prokázat dvě hodiny po podání injekce snížení těchto látek v závislosti na dávce, rovněž toto snížení je v případě Actilyse daleko vyjádřenější než v případě K2P. Koncentrace destiček zůstává téměř neovlivněna oběma látkami.

4. Účinek na dobu krvácení u psa

Při podání K2P nitrožilně nedochází ke statisticky významnému prodloužení doby krvácení ve srovnání s kontrolními hodnotami u všech čtyř použitých dávek. Oproti tomu prodlužuje Actilyse v dávkách 1130 a 1600 kU/kg KG statisticky významné dobu krvácení .

5. Celkové shrnutí

Na popsaném psím modelu thrombózy koronárních tepen bylo možno prokázat, že K2P je thrombolytický prostředek, jímž je možno dosáhnout po nitrožilni injekci 100 % reperfúze, aniž by přitom současně došlo k většímu ovlivnění koncentrace fibrinogenu a aniž by byla prodloužena doba krvácení. Ve srovnání s prostředkem Actilyse, který představuje známý stav, je účinnost K2P po nitrožilni injekci ll,5krát vyšší. Při zkoumání farmakokinetického profilu K2P bylo dále prokázáno, že pokles K2P v krevní plazmě je devětkrát pomalejší než pokles koncentrace prostředku Actilyse .

-15CZ 281836 B6

Tabulka 3

Parametry thrombolýzy na psím modelu thrombózy koronárních tepen po nitrožilní injekci, trvající déle než 1 minutu, placeba nebo , R stoupajících dávek Actilyse nebo K2P

látka	dávka (IU/kg KG)	n	reperfúze	doba reperfúze (min)	vlhká hmotnost zbytkového thrombu (mg)	reokluze
placebo	/		6	0/6	/	9,6 + 1,2	/
	1 600	000	5	6/6	28 + 11	2,2 + 0,7	4/6
Actilyse^	1 130	000	6	4/6	14 + 3	4,4 + 0,5	4/4
	800	000	6	2/6	35 + 38	5,5 i 0,4	1/2
	200	000	6	0/6	/	8,8 ± 1,3	/
	200	000	6	6/6	29 ± 6	2,5 ± 0,3	6/6
K2P	140	000	6	4/6	15 + 6	4,4 + 1,4	4/4
	100	000	6	3/6	30 + 14	7,4 ± 1,1	2/3
	50	000	6	2/6	31 ± 4	5,5 + 0,8	2/2

Nanesené hodnoty znamenají průměr ± standardní odchylka.

Tabulka 4

Farmakokinetické parametry, odvozené od počítačových údajů pro koncentraci v plazmě v závislosti na čase u narkotizovaných psů po nitrožilní injekci 200 000 IU/kg KG Actilyse^R nebo K2P

látka	^Τ1/2^σ (min)	^Tl/2^ (min)	^Cinj. (IU/ml)	^Vc (ml/kg)	^C1tot (ml.kg.^.min.'b	^AUCextrapol. (IU.ml^.h)
D Actilyse	1,6	14,6	1674	106,1	41,6	84,1
(n = 6)	0,2	6,5	+ 504	+ 37	t 11,4	+ 23,8
K2P	7,2	15,0	3177	64,7	4,6	803
(n = 6)	± 1,1 (n = 4)	± 4,3	i 817	+ 19,7	± 1,3	250

Hodnoty jsou průměr ± standardní odchylka

V_c = objem středního oddílu, Cl_tot = celkový clearance

AUC__y.L. _n > = plocha pod křivkou, extrapolovaná plocha pod křivkou koncentrace.

-16CZ 281836 B6

Tabulka 5

Faktory srážlivosti a počet thrombocitů 2 hodiny po nitrožilní injekci, trvající déle než 1 minutu, pro placebo nebo stoupající dávky Actilyse^R nebo K2P na psím modelu thrombózy koronární tepny

látka	dávka (IU/kg KG)	n	fybrinogen (*)	plasminogen (i)	o^-antiplasmin (*)	počet destiček (*)
placebo		6	106 - 2	103 (n = 4)	92 + 11 (n = 4)	101 ± 3
	1 600 000	6	3 + 0	46 + 2	19 ± 11	119 i 10
	1 130 000	6	16 i 13	59 + 6	45 + 6	110 t 10
Actilyse^R	800 000	6	86 i 4	87 ± 3	64 + 5	104 i 6
	200 000	6	97 i 3	90 + 3	86 ± 4	109 ± 4
	200 000	6	81 i 10	74 + 8	40 ± 6	106 ± 8
	140 000	6	93 t 1	81 + 1	50 + 7	104 + 5
K2P	100 000	6	92 i 3	88 + 3	77 ± 7	101 ± 3
	50 000	6	95 i 3	90 ± 2	84 ± 12	118 + 11

Hodnoty jsou průměrem ± standardní odchylka.

Údaje jsou uvedeny v procentech výchozí hodnoty před injekcí.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Tkáňový aktivátor plasminogenu t-PA, neglykosylovaný a tvořený následujícím řetězcem aminokyselin vzorce I (M)

SYCSNSZCÍ“ GNGSAYŘGTH slzzsgascl r^ísniLiGK t~aci?sac 51 ALGLG:<??r;C RNÍDGSAKF- c:-r;ii<.'^-’LT ™íc2v?scs 1C1 Qr λ—KGkjA DZASHx*QAA l~.-2C-l-_RSřG zrsiggg:l: 2221212.---.-: lol WZGZZZQKF -.'ZKYZVHKZ r222.22122 201 ALLC”<S2SS RCAQISSWa. 251 ΓΪΞΞ=1ΧΞΑΗ V?.LY?SS3.CT SQHLZjr?.“T DIKLCAGDT?. SGGZCANLHD 3C1 Acqssscsr- vcdidcshtl vcxisvclgc ας:<2ν?σ.ΎΤ icTtrimiz 351

který může být na aminoterminálním konci ještě prodloužen navázáním M.

-17CZ 281836 B6

Řetězec DNA, který je kódovým řetězcem pro derivát t-PA podle nároku 1 s následujícím sledem bází vzorce II k xACCAAGGAAACAGIGAdGv. xAi

CACAGx.

121

AAGwTx . C AC AG cacag aac c c c agt g c o c ac g c actg g g c

131

241

301

361

GCCAxCT

GCCAAGCACAGmAGGTCGx.CCuGACaGCGG' c

x k *uGsj AA x Gk>k« x

CAGCw *ACCu * CGwACw 60 •f·* · —— * — Z· Z·— « —· . Z·/*,— , Xxx-A . XJ A W W *wA*xAWW<«« 120 • íSWUS.V.áCa ..··. · · A<w 130 —· . <· . X /·- — >· · Ζ» z . wAAÚ A.Au W XJ WxAXJXJ w «. W 240 z íCAGACAG í.ACAGCCAG 300 k UCCxaCx-SzW xIjxuwAwWW k 360 kG kGwxjwwwwwAxxAC xC 420

:ac

430

421 kl X. .'.yA — - —

r.u-J Akí A

43*

CAC — Z· »·<·»· . . » f~ „ -UXJ x· xj Au xj AxJ Χ-» .AXJ .A •AA

AwA

W-uA » x^a « jAsA

601 w .w»,ΛΧ»WA WxAw x»A.W x« w · xrf xJ ·

661 υΛ • /·<·—·«*

Aw x- · W >»·»·. Z·*“ *· i· · A <**· ** < W M A W • 'UWAWWWx •‘J

721 'AAGCA-CAGww

Ax . k»wwA.G v x. . u λα u w a w xj i 31

731

Sj.

Xj .Aw •A · xJW *

A-aACA

AC ./·*/·♦ »<·· *“·,*·

AW ASI AAW ·Α W •'x*

3-0

841

ACCGACAACA·C kj · w · xuxz « w xzaCaCa W · W w WaC WW Ww —A

AC^-

XJ >m>A W

9C0

901

GAC tAUMXIXtfUA· « wUWXjAWsj

X^xa W X—A · WxA W ·

961 * . WXJ « ywxí\.A · wA- WAWW * . uuu^ • wsaCACaaCuA

1020

1021

ACAAAGw

1063

3. Způsob výroby tkáňového aktivátoru plasminogenu s řetězcem aminokyselin vzorce I podle nároku 1, vyznačující se tím, že se plasmidem, obsahujícím kódový řetězec vzorce II podle nároku 2 pro tento derivát transformují buňky E. coli a produkt exprese se izoluje ze živného prostředí nebo po rozrušení uvedených produkčních buněk.

4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že se užije plasmid pA27.3. nebo plasmid pA27 fd.

5. Způsob tím, coli.

podle nároku 3 nebo 4, vyznačující se že se jako produkční buňky užijí buňky Escherichia

6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že se ke zvýšení výtěžku účinné bílkoviny oddělí vytvořená inkluzní těliska, která se pak solubilizují působením guanidinhydrochloridu, derivatizují se oxidovaným glutathionem a na

-18CZ 281836 B6 konec se derivát t-PA renaturuje přidáním L-argininu a qlutathionu.

7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že se po renaturaci derivát t-PA v renaturační směsi koncentruje a nakonec se chromatograficky čistí afinitní chromatograf ií.

8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že se provádí v přítomnosti 10 až 1 000 mmol/1 L-argininu.

9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že se chromatografické čištění provádí při použití koncentrátu renaturační směsi, který obsahuje 10 až 1 000 mmol/1, s výhodou 600 až 800 mmol/1 argininu při použití adsorpčního sloupce s obsahem eritrinového inhibitoru trypsinu.

10. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že se koncentrát, určený pro chromatografické čištění, upraví na pH 7,5 až 8,6.

11. Způsob podle nároku 9 nebo 10, vyznačující se tím, že se eluce výsledného produktu provádí při pH v rozmezí 3 až 5,5.

12. Způsob výroby plasmidu, obsahujícího kódový řetězec pro derivát t-PA se sledem bází podle nároku 2, vyznačující se tím, že se řetězec DNA, který je kódovým řetězcem pro bílkovinu t-PA nebo pro její derivát, který kromě oblastí Kringel II s kódem pro aminokyseliny 175 až 263 řetězce aminokyselin t-PA a oblasti pro proteázu z t-PA obsahuje ještě další oblasti bílkoviny t-PA, uloží do plasmidu a řízenou mutagenezí se odstraní ty oblasti, které jsou kódem pro aminokyseliny, nenacházející se v derivátu t-PA podle nároku 1.

13. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že se jako řetězec DNA pro bílkovinu t-PA nebo její derivát užije odpovídající cDNA.

14. Způsob podle nároků 12 nebo 13, vyznačující se tím, že se užije plasmid pA27.3. a plasmid pA27 fd.

15. Farmaceutický prostředek s fibrinolytickým účinkem, vyznačující se tím, že jako svou účinnou složku obsahuje derivát t-PA vzorce I podle nároku 1.