SK55890A3

SK55890A3 - TISSUE ACTIVATOR OF PLASMINOGEN T-PA, METHOD FOR PRODUCING THEì SAME AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION CONTAINING SAME

Info

Publication number: SK55890A3
Application number: SK558-90A
Authority: SK
Inventors: Anne Stern; Ulrich Kohnert; Rainer Rudolph; Stephan Fischer; Ulrich Martin
Original assignee: Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date: 1989-02-07
Filing date: 1990-02-06
Publication date: 1998-05-06
Also published as: SK279029B6; CZ55890A3; LU90025I2; JP2559538B2; LV10302B; CA2025900C; NO2000002I1; ATE126270T1; KR970008485B1; NO306563B1; CA2025900A1; NL970008I2; HK153396A; AU623228B2; GR3017099T3; GR900300140T1; FI100244B; NL970008I1; CZ281836B6; US5223256A

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka tkanivového derivátu plazminogénu t-PA, reťazca DNA, ktorý je kódom pre tento nový derivát, plazmidov na expresiu, ktoré obsahujú í-reťazec DNA, k-t-o-r-ý—je k-ó dom—pire—uvedeným d e r i v át_. spôsobu výroby týchto plazmidov, spôsobu výroby uvedeného derivátu a prostriedkov na rozpúšťanie krvných zrazenín, ktoré obsahujú uvedený derivát.

Doterajší stav techniky

Vytekajúca krv obsahuje ako hlavnú zložku bielkovinovej matrice polymérny fibrín. Fibrín je za fyziologických podmienok rozpúšťaný fibrinolytickým systémom v reakčnej kaskáde, ktorej činnosť .p-raŕchádzra—dctrúv.ahy pri zrážaní krvi. Centrálnou reakciou je aktivácia plazminogénu na plazmín, ktorá je ovplyvňovaná napríklad tkanivovým aktivátorom plazminogénu t-PA (tissue type plasminogen activator). Plazmín rozpúšťa fibrín, ktorý je hlavnou zložkou bielkovinovej matrice pri zrážaní krvi. Enzymatieká účinnosť prirodzeného t-PA alebo rovnakej látky, získanej z eukaryotických organizmov genetickou technológiou, najmä katalytická aktivácia plazminogénu na plazmín je v neprítomnosti fibrínu alebo štiepnych produktov fibrinogénu veľmi malá, za prítomnosti týchto bielkovín však môže byť podstatne zvýšená a to aj viac než desaťkrát.

Tkanivový aktivátor plazminogénu t-PA je štiepený v krvi prítomnými proteázami na dva reťazce, reťazec A a reťazec B. Oba tieto reťazce zostávajú spojené cysteínovým mostíkom. Stimulovateľnosť účinnosti t-PA znamená veľkú výhodu oproti iným aktivátorom plazminogénu, ako je napríklad urokináza alebo streptokináza, ako bolo opísané napríklad v publikáciách M. Hoylaerst a ďalší, J. Biol. Chem. 257 (1982), 2912 až 2919, V. Nieuwenhuizen a ďalší, Biochem.

Biophys. Acta, 755 (1983), 531 až 533.

Mechanizmus účinku t-PA in vivo je opísaný napríklad v publikácii Korniger a Colle, Thromb. Hämostasis 46 (1981) , 561 až 565. Účinnosť enzýmu, zameraná na povrch fibrínu dovoľuje použiť túto látku ako prostriedok proti patologickým uzáverom ciev, napríklad u srdcového infarktu, ako už bolo dokázané klinickými pokusmi, opísanými v publikáciách Collen a ďalší, Circulation 70 (1984), 1012, Circulation 73 (1986), 511.

Nevýhodou použitia t-PA je zatiaľ rýchly pokles koncentrácie tejto látky v krvnej plazme (Clearance), V dôsledku toho je potrebné použiť pomerne velké množstvo t-PA na to, aby bolo možné dosiahnuť in vivo účinné rozpúšťanie trombov. Pri vyšších dávkach však môže dôjsť k vedľajším účinkom, napríklad ku krvácaniu.

V európskom patentovom spise č. 196 920 je opísaný prírodný produkt odbúravania t-PA, ktorý obsahuje ešte oblasti Kringel II a oblasť proteázy, N-terminálne zakončenie tohto produktu začína alanínom v polohe 160, reťazec aminokyselín je uvedený v publikácii Pennica a ďalší, Náture 301 (1983) 214 až 221.

Clearance tohto produktu odbúravania nie je príliš odlišný od tej istej hodnoty pre prírodný t-PA. Až chemickou modifikáciou katalytickej oblasti pripojením blokujúcej skupiny je možné dosiahnuť zlepšenie.

Vynález si kladie za úlohu navrhnúť takú zmenu t-PA, aby vzniknutý derivát mal predĺžený polčas koncentrácie v krvnej plazme. Súčasne by mala byť uchovaná účinnosť pri rozpúšťaní trombov a stimulovateľnosť fibrínom.

Podstata vynálezu

Predmetom vynálezu je teda tkanivový aktivátor plazminogénu t-PA, ktorý nie je glykolyzovaný a je tvorený nasledujúcim reťazcom aminokyselín:

(I) (Μ)

SYQGNSDCYF GNGSAYRGTH SLTESGASCL

ALGLGKHNYC RNPĽGDAKPW CHVLKNRRLT

101 QFRIKGGLFA DIASHPV-QAA IFAKHRRSPG 151 CFQERFPPHH LTVIĹGRTYR WPGEEEQKF 201 ALLQLKSDSS RCAQESSWR TVCLPPADLG

251 FYSERLKEAH VBLYFSSRCT SQHLLNRTVT

301 ACQGDSGGPL VCLNDGRMTL VGIISWGLGC

351 DNMRP

PWNS.'MILIGK VYTAQNPSAQ
WEYCDVPSCS	TCGLRQYSQP
ERFLCGGILI	SSCWILSAAH
EVSCYIVHKE	FDDDTYDNDI
LPDWTECELS	GYGKHEALSP
DNMLCAGDIR	SGGPQANLHD
GQKDVPGVYT	KVTNYLDWIR

pričom na aminoterminálnom konci (č. 1 = S) môže byť reťazec ešte predĺžený pomocou M.

Teraz bolo neočakávane zistené, že pri vypustení prebytočných, v natívnom ΐ-PA sa nachádzajúcich oblastí, nedôjde k žiadnemu ovplyvneniu trombolytického účinku a stimulovateľnosť fibrínu taktiež zostáva v podstate rovnaká. V deriváte podľa vynálezu však chýba väzba na fibrín, ale aj napriek tomu má derivát trombolytickú účinnosť in vivo, ešte o niečo vyššiu než je účinnosť natívneho t-PA. Rovnako prekvapujúca je skutočnosť, že pri podaní trombolyticky účinného množstva tohto derivátu zostáva systemická fibrinolýza takmer neovplyvnená. Ukázalo sa teda, že derivát t-PA podľa vynálezu má za fyziologických podmienok typické vlastnosti natívneho t-PA, pokiaľ ide o špecificitu vzhľadom na fibrín. Tieto * výsledky boli získané pri farmakologickom sledovaní tohto derivátu, ako bude ďalej uvedené v príklade 6. Okrem toho má bielkovinový derivát podľa vynálezu veľmi vysokú špecifickú účinnosť, boli opísané špecifické účinnosti od 500 až do 800 kjednotiek/mg.

Predmetom vynálezu je tiež reťazec DNA, ktorý je kódom pre derivát t-PA a ktorý je možné vyjadriť ako nasledujúci reťazec:

- 4 1 ATGTCTTACCAAGGAAACAGTGACTGCTACTTTGGGAATGGGTCAGCCTACCGTGGCACG 60

CACAGCCTCACCGAGTCGGGTGCCTCCTGCCTCCCGSGSAASSCCATGÄTCCTGATAGGC 120

121 AAGGTTTACACAGCACAGAACCCCAGTGCCCAGGCACTGGGOCTGGGCAAACATAATTAC 180

181 TGCCGGAATCCTGATGGGGATGCCAAGCCCTGGTGCCACGTGCTGAAGAACCGCAGGCTG 240

241 ACGTGGGAGTACTGTGA'EGTGCCCTCCTGCTCCACCTGGGGCCTGAGACAGTACAGCCAG 300

301 CCTCAGTTTCGCATCAAAGGAGGGCTCTTCGCCGACATCGCCTCCCACCCCTGGCAGGCT 360

361 GCCATCTTTGGCAAGCACAGGAGGTCGCCCGGAGAGCGGTTCCTGTGGGGGGGGATACTC 420

421 ATCAGCTCCTGCTGGATTCTCTCTGCCGCCCACTGGTTCCAGGAGAGGTTTCCGCCCCAC 480

481 CACCTGACGGTGATCTTGGGOAGAACATACCGGGTGGTCCCTGGCGAGGAGGAGCAGAAA 540

541 TTTGAAGTCGAAAAATACATTGTCCATAAGGAATTCGATGATGACACTTACGACAATGAC 600

601 ATTGGGCTGOTGCAGCTGAAATCGGATTCGTCCCGCTGTGCCCAGGAGAGOAGOGTGGTC 660

661 CGCACTGTGTGGCTTCCCCCGGOGGACCTGCAGCTGCCGGACTGGACGGAGTGTGAGGTC 720

721 TCCGGCTAGGGCAAGCATGAGGCCTTGTCTCCTTTCTATTCGGAGCGGCTGAAGGAGGTT 780

781 CATGTCAGACTGTACCCATCCAGCCGCTGGACATCACAACATTTACTTAACAGAACAGTC 840

841 ACCGACAACATGCTGTGTGCTGGAGACACTCGGAGCGGCGGGCCCCAGGCAAACTTGCAC 900

901 GACGOCTGCCAGGGCGATTCGGGAGGCCCCCTGGTGTGTCTGAACGATGGCCGCATGACT 960

961 TTGGTGGGCATCATCAGCTGGGGCCTGGGCTGTGGACAGAAGGATGTCCCGGGTGTGTAC 1020

1021 ACAAAGGTTACCAACGACCTAGACTGGATTCGTGACAACATGCGACCG 1068 (II)

Reťazec DNA tak, ako bol vyššie uvedený, je možné použiť na expresiu derivátu t-PA podľa vynálezu v prípade, že sa uloží do plazmidu na expresiu. Tento plazmid na expresiu predstavuje ďalší predmet vynálezu, rovnako ako plazmid na expresiu, ktorý má o niečo odlišný reťazec DNA, ktorý však je tiež kódom pre derivát ΐ-PA podľa vynálezu. Na základe degenerácie genetického kódu sú na tento účel vhodné aj reťazce, ktoré sú trocha odlišné od vyššie uvedeného reťazca DNA.

Plazmid na expresiu s výhodou obsahuje okrem reťazca, ktorý je kódom pre derivát t-PA ešte regulovateľný promótor, napríklad tac, účinný terminátor, napríklad fd, značiacu oblasť, umožňujúcu selekciu, napríklad gén pre β-laktamázu a počiatok replikácie.

Ďalším predmetom vynálezu je plazmid pA27.3. Získanie tohto plazmidu je opísané v príklade 1, plazmid obsahuje reťazec DNA, ktorý je kódom pre derivát t-PA podľa vynálezu.

Predmetom vynálezu je tiež spôsob výroby plazmidu na expresiu, ktorý obsahuje reťazec DNA, ktorý je kódom pre bielkovinu t-PA podľa vynálezu alebo jej derivát, ktorý obsahuje okrem oblasti Kringel II a oblasti pre proteázu ešte ďalšiu bielkovinu t-PA, spôsob spočíva v tom, že sa uvedený reťazec vnesie do plazmidu a riadenou mutagenézou sa odstránia tie oblasti, ktoré sú kódom pre aminokyseliny, ktoré sa v deriváte t-PA podľa vynálezu nachádzajú.

Volba plazmidu, do ktorého má byť zaradený reťazec DNA, ktorý je kódom pre derivát t-PA podľa vynálezu závislý na cieľových bunkách, ktoré majú byť neskoršie použité na expresiu tohto derivátu. Vhodné plazmidy a minimálne požiadavky, kladené na tieto plazmidy, napríklad počiatok replikácie alebo miesto pôsobenia reštrikčných enzýmov sú odborníkom známe. V rámci vynálezu je možné namiesto plazmidu použiť aj Cosmid, ΐ-j- replikatívnu formu fágu (lambda, M13) s dvojitým reťazcom a ďalšie, odborníkom známe vektory. Postup pre riadenú mutagenézu bol opísaný v publikácii Morinaga a ďalší, Biotechnology, 21, (1984), 634 a pri uskutočňovaní spôsobu podľa vynálezu bol uskutočňovaný podľa tejto publikácie .

Predmetom vynálezu je tiež spôsob výroby derivátu t-PA podľa vynálezu tak, že sa dosiahne expresia plazmidu podľa vynálezu vo vhodnej bunke a výsledný produkt sa izoluje zo živného prostredia, prípadne po rozrušení uvedených buniek. Na výrobu derivátu t-PA podľa vynálezu sa s výhodou používajú bunky prokaryotických organizmov. Je zvlášť výhodné, najskôr z rozpustných častí bunky izolovať takzvané inkluzívne telieska (nerozpustné agregáty bielkovín), tieto inkluzívne telieska, ktoré obsahujú t-PA sa solubilizujú pôsobením guanínhydrochloridu za redukčných podmienok, potom sa vytvorí derivát naviazaním GSSG a potom sa derivát t-PA renaturuje pridaním L-arginínu a GSH. Presný návod na aktiváciu t-PA z inkluzívnych teliesok je uvedený napríklad v európskych patentových spisoch č. 219 874 a 241 022. Je však možné použiť aj iné postupy na získanie účinných bielkovín z inkluzívnych teliesok.

Pri uskutočňovaní spôsobu podľa vynálezu na čistenie K2P sa postup uskutočňuje s výhodou za prítomnosti L-arginínu zvlášť v koncentrácii 10 až 1000 mmol/1.

Výhodným spôsobom sa oddelenie cudzorodej bielkoviny uskutočňuje afinitnou chromatografiou na stĺpci za použitia ETI (Eritrina Trypsin Inhibitor). ETI sa fixuje na nosič, napríklad Sepharosu. Čistenie za použitia stĺpca s ETI má tú výhodu, že na stĺpec s týmto materiálom je možné priamo naniesť koncentrovanú vzorku, určenú na renaturáciu, za prítomnosti vysokých koncentrácii arginínu, napríklad 0,8 mol/1. Zhlukovanie K2P,, ktoré je možné uskutočňovať pri nízkych koncentráciách arginínu pod 10 mmol/1, teda nie je potrebné uskutočniť. Zvlášť výhodné je čistenie K2P stĺpcom s obsahom ETI za prítomnosti 0,6 až 0,8 mol/1 arginínu. Roztok s obsahom K2P má s výhodou pH vyššie než 7, zvlášť 7,5 až 8,6.

Vymývanie stĺpca s obsahom ETI sa uskutočňuje pri znížení pH, a to tak za prítomnosti, ako aj neprítomnosti arginínu za podmienok, umožňujúcich dobrú rozpustnosť K2P. S výhodou sa pri elúcii pH nachádza v kyslej oblasti, zvlášť v rozmedzí 3 až 5,5.

K2P získaný spôsobom podľa vynálezu má špecifickú účinnosť t-PA v rozmedzí 550 000 ± 200 000 jednotiek/mg pri čistote vyššej než 95 %.

Podľa vynálezu je možné získať aj derivát t-PA, ktorý má podstatne predĺžený polčas v plazme, vzhľadom na to, že je možné dosiahnuť zníženie clearance. Derivát podľa vynálezu pritom nestráca žiadnu zo svojich vlastností, vhodných na jeho použitie k trombolýze. Je teda vhodný na podávanie u ľudí aj vzhľadom na to, že sa pri jeho použití nevyskytujú žiadne vedľajšie účinky, ako je krvácanie, ku ktorému dochádza pri použití pomerne vysokých dávok natívneho t-PA.

Derivát t-PA podľa vynálezu má takú účinnosť, že stačí použiť štvrtinu množstva t-PA, ktoré by bolo potrebné použiť na dosiahnutie toho istého účinku.

Vynález bude podrobnejšie opísaný v súvislosti s priloženými výkresmi.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Na obr. 1 je schematicky znázornená výroba plazmidu pA27.3.

Na obr. 2 je znázornené porovnanie väzby fibrínu pre derivát t-PA podľa vynálezu (krivka 1) s väzbou fibrínu pre natívny t-PA, ktorého expresia bola dosiahnutá v bunkách CHO (tct-PA/CHO): t-PA s dvojitým reťazcom z buniek CHO, rozštiepený na fyziologickom štiepnom mieste Arg 275-Ile276, krivka 2; sct-PA/CHO: t-PA s jednoduchýn reťazcom z buniek CHO, krivka 3.

Na obrázku 3a 4 je znázornený diagram farmakokinetickej účinnosti t-PA pre derivát t-PA podľa vynálezu v porovnaní s bežne dodávaným prostriedkom s obsahom t-PA (Actilyse^); na krivke 1 je hodnota pre K2P v dávke 200 000 jednotiek, 0,25 mg/kg vnútrožilovo, štyri pokusy na zvieratách.

n

Na krivke 2 je výsledok pre prostriedok Actilyse v dávke 200 000 jednotiek/kg vnútrožilovo, šesť pokusných zvierat.

Na obr. 5 je znázornená závislosť trombolýzy na dávke pre derivát t-PA podľa vynálezu a pre Actilyse^. Je uvedená stredná hodnota plus štandardná odchýlka, jedna kilojednotka = približne 1000 medzinárodných jednotiek. Na krivke 1 je výsledok pre K2P, na krivke 2 je výsledok pre prostriedok n

Actilyse .

Vynález bude vysvetlený nasledujúcimi príkladmi.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Konštrukcia plazmidu pA27.3

Východiskový plazmid pREM7685, opísaný v európskom patentovom spise č. 242 836 má nasledujúce zložky; tac-promótor, lac-operátorovú oblasť s kodónom ATG pre; začiatok, kódovú oblasť pre derivát t-PA FK2P, terminátor transkripcie z pKK223-3, gén pre β-laktamázu, gén pre odolnosť proti kanamycínu a počiatok plazmidu pACYC177, ide o plazmid, ktorý sa nachádza v bunke v malom počte kópií. Reťazec derivátu t-PA FK2P sa skladá z nukleotidov 190 až 336 (oblasť F), 715 až 1809 (oblasť K2, proteáza, malý podiel 3’UT) a kodón ATG pre počiatok. Polohy nukleotidov sú uvádzané podľa publikácie Pennica a ďalší, Náture 301 (1983) 214 až 221.

Na vypustenie oblasti F z konštrukcie FK2P plazmidu pREM7685 bol použitý v podstate postup podľa publikácie Morinaga a ďalší, Biotechnology 21 (1984), 634. Na tvorbu heteroduplexného útvaru boli z pREM7685 izolované dva fragmenty. Fragment A; pREM7685 bol rozštiepený reštrikčným enzýmom EcoRI. Štiepne produkty boli oddelené elektroforézou na géli a najväčší fragment EcoRI bol izolovaný. Fragment B; plazmid pREM7685 bol linearizovaný reštrikčným enzýmom Xhol. Linearizovaný plazmid bol po elektroforéze na géli získaný s vysokou čistotou. Pre mutagenézu bol synteticky vyrobený nasledujúci oligonukleotid;

5’ TG TCT TAC CAA GGA AAC AGT GA 3’

Na tvorbu heteroduplexu sa zmieša fragment A, fragment B vždy v množstve 450 fmol a oligonukleotid v množstve 75 pmol a zmes sa inkubuje za prítomnosti 50 mmol/1 chloridu sodného, 10 mmol/1 tris-HCl s pH 7 a 10 mmol/1 síranu horečnatého 3 minúty pri teplote 100 C, potom sa zmes rýchlo prenesie do ľadu. Renaturácia DNA sa uskutočňuje 30 minút pri teplote 60 ’C. Na syntézu.sa k heteroduplexu pridajú ešte nasledujúce zložky:

Desoxynukleotrifosfáty v množstve vždy 0,25 mmol/1, ATP 1 mmol/1, chlorid sodný 100 mmol/1, tris-HCl s pH 7,56,5 mmol/1 chlorid horečnatý 8 mmol/1, β-merkaptoetanol 1 mmol/1, Klenowov fragment DNA-polymerázy z E. coli 0,125 jednotiek/μΙ vzorky a T4-ligáza v množstve 0,1 jednotky/μΙ vzorky. Syntéza sa uskutočňuje 4 hodiny pri teplote 16 C. Potom sa zmes použije na transformáciu buniek E. coli, (RM82, DSM 3689) pri použití lac l9-plazmidu a potom sa transformanty podrobia selekcii pridaním 25 gg/ml kanamycínu k živnému prostrediu.

Hybridizáciou kolónií pri použití vyššie opísanej mutagenézy za použitia oligonukleotidu ako sondy bolo možné izolovať tie klony, ktoré obsahovali plazmid pA27.3. Tento plazmid sa odlišuje od východiskového plazmidu pREM7685 okrem iného tým, že chýbajú miesta pôsobenia enzýmu pstl a SspI. Obe tieto miesta sa nachádzajú v oblasti F východiskového plazmidu. Konštrukcia plazmidu pA27.3 je schematicky znázornená na obr. 1.

Príklad 2

Spôsob výroby účinného derivátu t-PA K2P z E. coli

Rozrušenie buniek a príprava inkluzívnych teliesok (IB)

1,6 kg vlhkej bunkovej hmoty E. coli DSM 3689, transformovaného plazmidom pA27.3 sa uvedie do suspenzie v 10 litroch roztoku s obsahom 0,1 mol/1 tris-HCl, 20 mmol/1 EDTA pri pH 6,5 a teplote 4 “C. Potom sa pridá 2,5 g lyzozýmu a zmes sa inkubuje 30 minút pri teplote 4 “C. Potom sa dovŕši rozrušenie buniek pôsobením zvýšeného tlaku. K materiálu sa pridá ešte 5 litrov 0,1 mol/1 tris-HCl, 20 mmol/1 EDTA, 6 % Triton X100 a 1,5 mol/1 chloridu sodného pri pH 6,5, potom sa zmes inkubuje ešte 30 minút pri teplote 4 ’C. Potom sa oddelí nerozpustný podiel, tvorený inkluzívnymi telieskami odstredením v Padbergovej odstredivke. Peleta sa uvedie do suspenzie v 10 litroch roztoku s obsahom 0,1 mol/1 tris-HCl, 20 mmol/1 EDTA s pH 6,5, inkubácia trvá 30 minút pri 4 ’C, inkluzívne telieska sa potom izolujú odstredením .

Solubilizácia inkluzívnych teliesok

100 g inkluzívnych teliesok (vlhká hmotnosť), sa uvedie do suspenzie v 450 ml roztoku s obsahom 0,1 mol/1 tris-HCl, 6 mol/1 guanidíniumhydrochloridu, 0,2 mol/1 DTE, 1 mmol/1 EDTA s pH 8,6 a potom sa zmes mieša dve a pol hodiny pri teplote 25 ’C.

Po nastavení pH na hodnotu 3 pridaním 25% kyseliny chlorovodíkovej sa uskutočňuje dialýza proti 10 mmol/1 HC1, použije sa 3 x 50 litrov roztoku v dobe 24 hodín pri teplote ’C.

Derivatizácia

Ako predloha sa použije tuhý guanidíniumhydrochlorid, takže po konečnom zriedení vyššie uvedeného dialyzátu 10 mmol/1 HC1 je koncentrácia guanidíniumhydrochloridu 6 mol/1.

Zmes sa vopred inkubuje 1,5 hodiny pri teplote 25 ’C, potom sa pridá oxidovaný glutatión (GSSG) do koncentrácie 0,1 mol/1 a tris-HCl do 0,05 mol/1 a pH sa upraví roztokom s obsahom 5 mol/1 hydroxidu sodného na hodnotu 9,3. Potom sa zmes mieša 3,5 hodiny pri teplote 25 'C.

Po úprave pH na hodnotu 3 pridaním 25%-nej kyseliny chlorovodíkovej sa uskutočňuje dialýza proti roztoku s obsahom 10 mmol/1 kyseliny chlorovodíkovej, v priebehu 48 hodín sa použije 3 x 100 litrov roztoku pri teplote 4 ’C. Po ukončení dialýzy sa materiál odstredí a číry supernatant sa ďalej spracováva.

Renaturácia

Reakčná nádoba s objemom 10 litrov sa naplní roztokom s obsahom 0,1 mol/1 tris-HCl, 0,8 mol/1 L-arginínu, 2 mmol/1 GSH, 1 mmol/1 EDTA pri pH 8,5. Renaturácia sa uskutočňuje pri teplote 20 °C trojnásobným pridaním vždy 100 ml derivátu vo forme disulfidu v časovom odstupe 24 hodín.

Po renaturácii sa získa materiál so špecifickou účinnosťou 1500 až 10000 I.U. (medzinárodné jednotky)/mg, stanovenie bude uvedené v príklade 4b. Jednotka b je jednotka účinnosti podľa definície VHO, National Inštitúte of Biological Standards and Control.

Koncentrácia renaturovanej zmesi

Renaturačnú zmes je možné koncentrovať za použitia hemodialyzátora.

Príklad 3

Čistenie K2P z E. coli

1. Čistenie K2P z E coli afinitnou chromatografiou na stĺpci ETI- sacharózy po predchádzajúcej koncentrácii

a) Elúcia kyselinou citrónovou

Renaturačná zmes bola zahustená pomocou hemodialyzátora (Asahi AM 300) v pomere 1:23 a zásobný roztok bol doplnený na 0,5 mol/1 chloridu sodného. Tento materiál bol potom nanesený na stĺpec ETI-Sepharosy v rovnovážnom stave s 0,1 mol/1 tris-HC'l s pH 7,5 s 0,8 mol/1 arginínu a 0,5 mol/1 chloridu sodného. Objem ekvilibračného roztoku bol 50 ml, objem vzorky bol 550 ml, t.j. 10-násobok objemu stĺpca/h, stĺpec bol premývaný ekvilibračným pufrom tak dlho, až ab-

sorpcia eluátu	pri 280	nm bola tiež	rovná hodnote	pre pufer
Elúcia viazaného materiálu bola potom uskutočnená	pri použi
tí 20 mmol/1 kyseliny	citrónovej s	pH 3,2.
Parametre	postupu	sú uvedené v	nasleduj ucej	tabuľke:
	obj em	účinnosť	Cprot.	SA¹)
	ml	IU/ml	mg/ml	IU/mg
koncentrát	550	57 162	14	4 083
ETI-eluát	90	330 000	0,71	465 000

Vysvetlivky k tabuľke:

Špecifická účinnosť: účinnosť pri chromogénnom teste (príklad 4b) delená obsahom bielkoviny vo vzorke.

Cp_rot ~ koncentrácia bielkovín

b) Elúcia 0,3 mol/1 Arg s pH 4,5

Renaturačná zmes bola zahustená podobným spôsobom ako v príklade 3.1. a) . Na stĺpec s objemom 25 ml. ETI-Sepharose v rovnovážnom stave s roztokom s obsahom 0,1 mol/1 tris-HCl s pH 7,5, 0,8 mol/1 arginínu a 0,5 mol/1 chloridu sodného bolo nanesených 800 ml koncentrátu pri prietoku 12 objemov stípec/h a stĺpec bol potom premývaný ekvilibračným pufrom tak dlho, až sa extinkcia eluátu pri 280 nm rovnala hodnote pre pufer. Viazaný materiál bol potom vymývaný roztokom s obsahom 0,3 mol/1 arginínu s pH 4,5.

Parametre postúpil sú uvedené v nasledujúcej tabuľke:

objem účinnosť Cp_rot SA ml IU/ml mg/ml IU/mg koncentrát 800 20 000 11,3 1 770

ETI-eluát 55 280 000 0,6 550 000

2. Čistenie K2P z E. co'Li afinitnou chromatografiou na stĺpci ETI- sacharózy bez predchádzajúcej koncentrácie

Na stĺpec ETI-Sepharosy s objemom 10 ml, v rovnovážnom stave v 0,1 mol/1 tris-HCl s pH 7,5, 0,8 mol/1 arginínu a 0,5 mol/1 chloridu sodného sa nanesie 12 litrov zmesi a stĺpec sa tak dlho premýva ekvilibračným pufrom, až absorpcia eluátu má rovnakú hodnotu ako pufer. Elúcia viazaného materiálu sa potom uskutočňuje roztokom s obsahom 0,8 mol/1

arginínu s pH 5	. Parametre postupu sú	uvedené	v nasledujúcej
tabuľke:
	obj em	účinnosť	Cprot.	SA	F¹)
	ml	IU/ml	mg/ml	IU/mg
východisková zmes 12 000	615	0,135	4 556	25
ETI-eluát	42	105 000	0,185	586 000	. 35
Stimulácia	fibrínom =	= účinnosť za	prítomnosti fi	brínu,
delená účinnosťou bez	fibrínu.
Príklad 4
Charakterizácia	čisteného	K2P z E. col	i

a) Chemická charakterizácia bielkovín

- SDS-Page a vysokotlaková kvapalinová chromatografia v.reverznej fáze

Homogenita čisteného materiálu, získaného afinitnou chromatografiou na stĺpci ETI-Sepharose bola sledovaná SDS-Page a vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou v reverznej fáze (RP-HPLC). Z pomerne krátkej dráhy bolo možné vypočítať pre K2P z prokaryotických organizmov molekulovú hmotnosť 38 500 ± 2 000 jednotiek. Denzitometrické vyhodnotenie dokázalo čistotu vyššiu než 95 %.

RP-HPLC je založená ne odlišnom pôsobení bielkovín a hydrofóbnej matrice. Postup sa využíva ako analytická metóda na dôkaz čistoty materiálu.

Analýza čisteného K2P z E. coli bola uskutočnená za použitia stĺpca Nucleosil 300 (Knauer) za použitia gradientu kyseliny trifluóroctovej a acetonitrilu. Pufer A: 1,2 ml kyseliny trifluóroctovej v 1000 ml vody. Pufer B: 300 ml vody, 700 ml acetonitrilu, 1 ml kyseliny trifluóroctovej; 0 až 100 %. Súhrnym výsledkom chromatografickej analýzy bola čistota produktu vyššia než 95 %.

- N-terminálny reťazec aminokyselín

N-terminálny reťazec aminokyselín bol stanovený na analyzátore aminokyselín (ABI 470 Sequenator) so štandardným programom. Zistený reťazec S1-Y2-Q3-G4-N5-S6-D7-C8-Y9 je celkom v súlade s očakávaným reťazcom, odvodeným od reťazca DNA.

b) Stanovenie účinnosti

Stanovenie účinnosti K2P z E. coli in vitro bolo uskutočnené podľa návodu, uvedeného v publikácii Zeitschrift fur die gesamte innere Medizin (ZGIMAL) 42 (17) 478 až 486 (1987). Špecifická účinnosť bola 550 000 ± 200 000 IU/mg. Stimulovateľnosť K2P z E. coli fragmentárni BrCN fibrinogénu bola v tomto systéme vyššia než 25. Ide o účinnosť za prítomnosti fragmentu fibrinogénu, delenú účinnosťou v neprítomnosti týchto fragmentov.

c) Väzba na fibrín in vitro

Väzba K2P z E. coli na fibrín bola stanovená spôsobom podľa publikácie Higgins D. L. a Vehar G. A. (1987) , Biochem, 26, 7786 až 7791.

Z obr. 2 je zrejmé, že K2P z E. coli na rozdiel od t-PA z CHO alebo t-PA z E. coli neviaže do väčšej miery fibrín.

Príklad 5

Na zvýšenie výťažku extrakcie bol kódový reťazec pre K2P preklonovaný vo vyššom počte kópií. Na tento účel bol použitý plazmid pePa 126.1, opísaný v NSR patentovom spise č. 3 838 378. Tento plazmid je tvorený v podstate vektorom pKK223-3 a kódovým reťazcom pre t-PA, ako boli opísané v európskom patentovom spise č. 242 835.

Do tohto plazmidu bol najskôr integrovaný reťazec fd-terminátora. Na tento účel bol plazmid pePa 126.1 linearizovaný reštrikčným enzýmom Hind III. Takto rozštiepený plazmid bol podrobený na géli a získaný s preparatívnou čistotou. Plazmid pLBUl, opísaný v publikáciách Beck a ďalší, (1978), Nucl. Acids. Res., 5, 4495 až 4503, Gebtz a ďalší, (1981) PNAS 78 (8):4963, bol rozštiepený pôsobením enzýmu Hind III a elektroforézou na géli s následnou elúciou bol s preparatívnou čistotou získaný fragment s veľkosťou 360 bp s obsahom fd-terminátora. Potom boli naviazané plazmid pePa 126.1 a fragment z plazmidu pLBUl po štiepení enzýmom Hind III s veľkosťou 360 bp. Zmes, v ktorej bola uskutočnená väzba bola kotransformovaná plazmidom pUBS 500 v E. coli DSM 2102. Plazmid bol opísaný v NSR patentovom spise č. 3 838 378. Zo získaných klonov boli izolované klony, obsahujúce požadovaný plazmid pePa 126 fd, líšiaci sa od východiskového plazmidu pePa 126.1 druhým miestom pôsobenia reštrikčného enzýmu Hind III.

Z plazmidu pePa 126 fd boli získané dva fragmenty. Jeden s veľkosťou 3,4 . kb po štiepení enzýmami BamHI/PvuI a druhý s veľkosťou 1,3 kb po štiepení Pvul/Xmal. Oba tieto fragmenty boli viazané s fragmentom s veľkosťou 1,3 kb po štiepení enzýmami BamHI/Xmal z plazmidu pA27.3 a použité s plazmidom pUBS 500 na transformáciu E. coli. Výsledný plazmid bol označený pA27 fd a od plazmidu pePa 126 fd sa líši tým, že obsahuje druhý najmenší fragment EcoRI z pePa fd s veľkosťou 610 bp, ktorý je v plazmide pA27 fd skrátený o približne 515 bp.

Príklad 6

Farmakologické skúšky derivátu t-PA K2P, ktorý bol získaný expresiou v prokaryotických organizmoch

1. Farmakokinetika K2P u králikov

Derivát K2P bol porovnaný u králikov (Neuseeland) s vlastnostami prostriedku Actilyse . Oba prostriedky boli podávané infúziou v dávke 200 000 IU/kg, približne 30 minút. Vzorky plazmy boli odoberané pred infúziou, v jej priebehu a po jej skončení do určitej doby. Účinnosť t-PA bola meraná spektrofotometricky spôsobom podľa publikácie J. H. Verheijen a ďalší, Thromb. Haemostas. 48, 266, 1982, modifikovaným podľa publikácie H. Lill, Z. ges. Inn. Med., 42, 478, 1987.

Na vypočítanie farmakokinetických parametrov bol použitý program s nelineárnou regresiou, ktorý bol modifikovaný podľa publikácie H. Y. Huang, Aero-Astronautics-Report 64, Rice University, 1 až 30, 1969. Parametre boli vypočítavané jednotlivo s pomocou biexponenciálneho farmakokinetického modelu.

K2P má päťkrát dlhší polčas (t^^cA ⁼ ίθ > 3 min. , pokles koncentrácie v plazme) než prostriedok Actilyse^ (prostriedok s obsahom t-PA, Thomae), ako je znázornené v tabuľke 1 a na výkresoch 3 a 4. Na konci infúzie bola v prípade K2P nameraná účinnosť t-PA (C£_nf) v plazme 1986 IU/ml, čo je hodnota šesťkrát vyššia· než pre prostriedok Actilyse^. Z objemu (V_c) bolo možné pripísať pre K2P potrebu 46,8 ml/kg v porovnaní s objemom· 73,7 ml/kg v prípade Actilyse^·. Celkový clearance (Cl_tot) bol pre prostriedok Actilyse^ 22,2 ml/min/kg, zatiaľ čo v prípade K2P-Pro 3,2 ml/min/kg, čo znamená zníženie na 1/7. Na použitie fibrinolytika na injekčné podávanie vo väčšom objeme je zvlášť zaujímavá takzvaná plocha pod krivkou (AUC), pretože poskytuje porovnanie vzťahu doby, po ktorú zostáva dostatočná plazmatická koncentrácia látky. K2P má osemkrát väčšiu AUC veľkosť 1064

IU/ml.h než Actilyse^R, pre ktorú má uvedená hodnota velkosť

133,3 IU/ml.h.

Celkovo je možné uviesť, že K2P má v porovnaní s komerčne dodávanou rekombinantnou bielkovinou t-PA pri rovnakej dávke päťkrát až osemkrát zlepšený farmakokinetický profil.

2. Farmakodynamika K2P u králika

K dôkazu trombolytickej účinnosti bol použitý známy králičí model pre trombózu jugulárnej žily, model bol opísaný v publikácii D. Collen a ďalší, J. Clin, Invest. 71, n

368, 1983. K2P a prostriedok Actilyse boli skúmané vždy v troch dávkach. Obe látky boli podávané 4 hodiny vo forme infúzie, potom bola skúmaná rýchlosť rozpustenia zrazeniny, ako je uvedené v tabulke 2 a znázornené na obr. 5.

Dávka pre rýchlosť trombózy 50 % (ED^q) lag, vypočítaná lineárnou regresiou bola pre K2P 124 000 IU/kg KG a pre prostriedok Actilyse 520 000 IU/kg KG. Je teda zrejmé, že

K2P má štyrikrát vyšší trombolytický účinok než prostriedok n

Actilyse .

Pri podávaní K2P bolo možné dosiahnuť v krvnej plazme takú účinnosť typu t-PA, ktorá bola porovnateľná s účinnosťou prostriedku Actilyse, avšak pri štyrikrát nižšej dávke. S dávkou 800 kU prostriedku Actilyse/kg KG porovnateľný účinok bolo možné získať pri dávke 200 kU K2P/kg KG pri malom vplyve na fibrinogén, plazminogén a o^-antiplazmín, dávka 800 kU prostriedku Actilyse/kg KG je taká vysoká, že typy účinku už nie je možné rozlíšiť.

K2P je teda t-PA-muteín, ktorý má pri použití na králičom modeli trombózy jugulárnej žily vo forme štvorhodinovej infúzie pri súčasnom znížení dávky na 1/4 dávky prostriedku Actilyse rovnaký trombolytický účinok ako uvedený prostriedok. K2P sa teda svojím účinkom neodlišuje od účinku uvedeného prostriedku, avšak pri ovela nižšej dávke má ten istý účinok na zrážací systém.

rH s-\ O Xi cx · Ó ^x

p	r*H
P	E	*
x	*·\
1)	p	\o
u	H-<	o
x	O	H
<

M	ΓΌ	Ή
	*	*
m	fC
xŕ	m	M*
’t	rH	Ή
Ή

bfl

X

C

P Ή O E P !—I \ CJ H

E

M	rH	M	X
*	*	»	-
m	H	M	tx
	Ή	M	Ή

oo	r-	>	[x
r-	Z'	-
O	\ľ	ΠΊ	Cs
	i—(	r-·	H
	-H		-H

Tabuľka bO X O •'x. t> rp E

>	•H P
<	t/1
P-	0	Λ—\
1	C	T—1
P	Ci	m E
	•H	c \
b	>0	•H p
0	'tí	U w
Ή		V—/
0	0
'tí
P	>
P	0
c	•r-j
u	tí	Y /-x
ϋ	X	N Cl
c	'tí	^x -H
o		H E
x	X	P χ^
	υ
	'>>
[/)	>
	0
	>υ
> o	tí P	Y -x
•χ	Ή	' .d β
tí	>□	Χχ ·Η
X	0	rP E
'tí	(X	P
	tí
υ	ŕ-1
P	X
P	0	XX
u	EX
E		X
tí	tí
P	t/1	bO
tí	tí	04
CX	>0	x^
		x>
	tí	1—1
Ό	x
X	υ	O
υ	x	O
•H	0)	O
P	•H
í)	P	04 O
C	cx	0 O
•H		x o
04	>	<D
0		•P · ·
04	0)	P tí·
tí	E	P 04
E	N <	t/1 >
P	tí cx	0 'tí
tí	rH 1	P x
tx	P P	CX x^

\o	Ό		rH
	r.	*	r·
\o	(N		X
00	Ό	(S	rH
σ\	Γ-	m	rH
H	Η		-H

σ\	x	σ\	v
	't	o	M
Ή	Ή	rH	Ή

m	r-	rH	\o
	»>	*	*
o	Ή	04	O
rH	Ή		Ή

OS

U í/3 ^x

		,—{	x
ex	,11	•H P	II
N	C	0	Cl
		<

Tabuľka

OJ bfl O 44 75 \ >, D H 44 H

F O U O <c pj bO 0 44

7] \

H 44 •H

F O 0 O < 00 f vo

F II vo C Tt

Ov

Ή

F •V m v rn

F F F

O 00 F

Ov 00 00

	F	F M	VO	Tt	vo
-H	II	Ή	Ή	+1	Ή
xt	c	F	F	F	Tt
<5		O F	F	f	F

o u

o

1 >75 'd

'rt

> H

± 1

VO II i

m F

F F

00 F

CÍ

ct

!—I

i—i

ct

N

Ό

u

F

d

m

00

oo

(U

od

0

rt

F

Ov

σν

•H

F

'F

Z

N

'0

<H

0)

d

M

H

θ-

bO

F

43

α)

44

F

N

o

VO

F

Tt

0

•H

\

F

'rt

N

Ct,

Ή

II

F

in

F

C

'd

N

44

-

•H

F

cs

d

F

vo

00

F

Ό

(3

O

m

00

Ο-

σν

0

•rl

V)

43

Ή

't

13

bO

o

44

>υ

VO

in

m

VO

νο

Tt

0

13

34

Ct

0

et

44

F

II

F

44

N

U

d

Í4

O

n)

d

Tt

O

>n

O

E

O

f

Tt

σν

f

F

N

F

rt

0

r—1

ct

ΓΊ

ct

M

-

F

44

00

>

'd

σ\

m

F

<N

vo

F

c

34

F

<

•H

Ct,

44

F

II

F

Ct

E

M

-

1

34

O

'σ\

d

m

Tt

ov

O

F

o

O

F

σν

F

f

F

m

F

Od

Ό

'F

rt

75

>V

'F

0

N

>75

z^

(3

'rt

'd

C

F

ct

'F

•H

7)

N

>

s

>0

O

0

Z~X

z—x

^X

e

d

'31

E

F

s,

<

F

ÍŠ

Ή

0

ct

E

43

rt

1

tí

N

rt

F

D

d

'd)

rt

N

Θ

os

F

N

F

ό

bO

1—f

'>>

n

D

1)

F

X—'

bO

0

Ct

r-f

F

7!

F

75

0

d

•rl

O

1)

>1

d)

0

d

H

F

41

E

F

E

44

d

E

•H

E

tí

E

rt

Ή

rt

E

d

N

M

N

rt

O

F

0

rl

rt

&

rt

1

F

rt

0

rt

F

>0

F

*H

F

M

H

Ct

<

Ct,

F

'd

Ct

U<

Ct

a

Ide o priemery ± štandardná odchýlka, kU = 1000 IU, hodnoty sú udané v %, vztiahnuté na základné hodnoty.

Príklad 7

Farmakologické vlastnosti K2P z E. coli na modeli trombózy koronárnej tepny psa

Aby bolo možné vyšetriť trombolytický účinok K2P z E. coli na tepnové tromby, bol volený model na zvierati na simuláciu akútneho infarktu myokardu. Ako pokusné zviera bol zvolený pes. Metóda na tvorbu trombu v koronárnej tepne bola modifikáciou postupu podľa publikácie Romson a ďalší, Thromb., Res. 17, 841, 1980. Pri otvorenom hrudníku bol u narkotizovaných psov s riadeným dýchaním elektricky podráždený intenzitou 150 μΑ povrch intimy Rámus circumflexus A. coronaria sinistra (LCX), čím bola vyvolaná trombóza. Distálne od trombózy bola vopred uložená svorka, aby bolo možné vylúčiť experimentálnou stenózou reaktívnu hyperémiu. Proximálne od trombu bola cieva vybavená elektromagnetickým prietokomerom, aby bolo možné merať reperfúziu.

Na začiatku pokusu bola po dobu jednej minúty heparinizovaným psom podávaná vždy šiestim psom na jednu dávku rôzna dávka BM 06.022 s rt-PA z eukaryotických organizmov (Alteplase, Actilyse, Dr. Karí Thomae GmbH, Biberaeh, NSR), súčasne bolo podávané aj placebo. Pred injekčným podaním a v určitých časových odstupoch po injekčnom podaní boli’ odoberané vzorky krvnej plazmy, aby bolo možné stanoviť účinnosť t-PA a koncentráciu fibrinogénu, plazminogénu a o^-antiplazmínu a tiež počet trombocytov v krvi. Fibrinogén bol stanovený meraním koagulácie podľa publikácie Clauss, Acta haemat. 17, 237, 1957, plazminogén a a2-antiplazmín boli stanovené podlá publikácie Collen a ďalší, J. Clin. Invest. 71, 368, 1983 spektrofotometricky. Ďalej bola stanovená na zadnej labke psa doba krvácania Simplate (Simplate^ I, Organon Teknika, Eppelheim, NSR) pri žilovom tlaku 40 mm Hg podľa publikácie J. Surg. Res., 27, 244, 1979. Štatistické porovnanie nameraných hodnôt s kontrolnými hodnotami pred injekčným podaním bolo uskutočnené Vilcoxonovým testom.

Aby bolo možné opísať trombolytický postup, je udaný počet zvierat v skupine a doba, ktorá uplynie do reperfúzie. Z týchto údajov je možné usúdiť na priemernú rýchlosť reperfúzie. Okrem toho sa merá 2 hodiny po injekčnom podaní vlhká hmotnosť zvyšného trombu, aby bolo možné zistiť počet zvierat, u ktorých došlo po reperfúzii k opätovnému uzáveru tepny. Pomocou semilogaritmickej analýzy regresov bolo možné pre každú látku stanoviť účinnú dávku pre 50% rýchlosť reperfúzie (=ED^q). Štatistické porovnanie hmotnosti týchto trombov bolo uskutočnené pomocou Vilcoxon-Mann-Vhitneyovho testu.

Koncentrácie t-PA v plazme boli merané fotospektrometricky v podstate podľa publikácie Verheijen a ďalší, Thromb. Haemost. 48, 266, 1982 v modifikácii, ktorá bola uvedená v publikácii Lill, Z. gesamte Inn. Med., 42, 478, 1987. Na vypočítanie farmakokinetických parametrov bol použitý program nelineárnych regresií, modifikovaných podľa publikácie

H. Y. Huang, Aero-Astronautics Report 64, Rice University, USA, 1 až 30, 1969. Parametre boli vypočítané jednotlivo po odčítaní bazálnych hodnôt účinnosti t-PA z nameraných hodnôt pomocou biexponenciálneho farmakokinetického modelu.

Týmto spôsobom boli získané nasledujúce výsledky:

I. Farmakodynamika u psa

K2P vedie po vnútrožilovom podaní k reperfúzii, ktorá je závislá na dávke. Maximálny účinok 100 % je možné dosiahnuť po podaní 200 kU/kg KG. V prípade prostriedku Actilyse je na tento účinok potrebná dávka 1600 kU/kg KG. Na porovnanie je hodnota ED^q pre K2P 83 kU/kg KG, čo je 11,5 x nižšia hodnota než pre prostriedok Actilyse, ktorého hodnota je 961 kU/kg KG. Pri podaní placeba nedošlo vôbec k reperfúzii. Hmotnosť zvyšného trombu pri podaní placeba bola 9,6 ± 1,6 mg, ide o priemer a štandardnú odchýlku. U oboch účinných látok došlo pri zvýšení dávky k štatisticky významnému zníženiu hmotnosti zvyšného trombu, v porovnaní s kontrolami, ktorými bolo podávané placebo. K reperfúzii došlo v prípade

Κ2Ρ v priemere o 25,9 ± 3,5 minút, v prípade Actilyse bola táto podoba 24,2 ± 6,2 minút. U väčšiny psov došlo po reperfúzii k opätovnému uzáveru tepny, ako je zrejmé z tabuľky 3.

2. Farmakokinetika u psa

Po vnútrožilovom podaní 200 kU/kg K2P alebo Actilyse je možné u narkotizovaného psa dokázať, že rýchla fáza poklesu koncentrácie v plazme, vyjadrená ako > j^e P^re K2P 7,2 ± 1,1 minút, táto doba je teda 4,5 krát dlhšia než pre Actilyse, kde je 1,6 ± 0,2 minút, ako je zrejmé z

Koncentrácie v plazme bezprostredne v prípade K2P približne dvojnásobná

Odstránenie K2P z plazmy, t.j. clearance (Cl_tot) trvá u K2P 9 krát dlhšie než u Actilyse. V dôsledku toho je plocha pod krivkou pre K2P tiež takmer 9,5 krát väčšia.

tabuľky 4. po skončení injekcie je v porovnaní s Actilyse.

3. Špecifickosť pre fibrín u psa

Dve hodiny po injekčnom podaní K2P bolo možné dokázať malé zníženie zvyškovej koncentrácie fibrinogénu, v závislosti na dávke, a to na 81 ± 10 % u najvyššej dávky 200 kU/kg KG. Naproti tomu bola koncentrácia fibrinogénu po podaní najvyššej dávky Actilyse 1600 kU/kg KG znížená až na 3 ± 0 %, ako je zrejmé z tabuľky 5. V prípade, že sa pri semilogaritmickej analýze regresu pre závislosť vedľajšieho účinku na dávke použije zníženie koncentrácie fibrinogénu a trombolytická účinnosť ED^q sa priradí ku koncentrácii fibrinogénu, získa sa pre rovnako silnú dávku K2P zníženie fibrinogénu na 92,5 zatiaľ čo v prípade Actilyse na 38,6 %. Tiež v prípade plazminogénu a a₂-antiplazmínu je možné dokázať dve hodiny po podaní injekcie zníženie týchto dávok v závislosti na dávke, taktiež toto zníženie je v prípade Actilyse oveľa vyjadrenejšie než v prípade K2P. Koncentrácia doštičiek zostáva takmer neovplyvnená oboma látkami.

4. Účinok na dobu krvácania u psa

Pri podaní K2P vnútrožilovo nedochádza ku štatisticky významnému predĺženiu doby krvácania v porovnaní s kontrolnými hodnotami, u všetkých štyroch použitých dávok. Oproti tomu predlžuje Actilyse v dávkach 1130 a 1600 kU/kg KG štatisticky významne dobu krvácania.

5. Celkové zhrnutie

Na opísanom psom modeli trombózy koronárnych tepien bolo možné dokázať, že K2P je trombolytický prostriedok, ktorým je možné dosiahnuť po vnútrožilovej injekcii 100% reperfúziu, bez toho, aby pritom súčasne došlo k väčšiemu ovplyvneniu koncentrácie fibrinogénu a bez toho, aby bola predĺžená doba krvácania. V porovnaní s prostriedkom Actilyse, ktorý predstavuje známy stav, je účinnosť K2P po vnútrožilovej injekcii 11,5 krát vyššia. Pri skúmaní farmakokinetického profilu K2P bolo ďalej dokázané, že pokles K2P v krvnej plazme je deväťkrát pomalší než pokles koncentrácie prostriedku Actilyse.

rb

Tabulka

Ó •H

N 'b

1—i

Už

O

U u

so b cp so b· rb (P

Μι \ x \ so b CP CP □

Ud

E

'P	0
l/)	P
0 d	P
P	0
0	Ud
E	'b	00
ud	>	E
	0
'b	už
Už	>Λ
ud
rp	>
>	N

X P b

íb	CP
d	>N	M	1	Z-\
P	0	W	P	d
•b	d		D	•P
d		0	CP	E
0	D	Ud	b
P	P	b	P
o	>z	i—1		b
Už	ud	b	b	•P
	rp		Ud	N
>1	Ό	C4	0	'b
N		b	TJ	Mp
Ό		(/)
Π	•r-)	>>
E	(D	rp
O	0	•P
P	o	P
P	T)	0	b
	b	c	•P
•P	>		N
rP	P	Už	'b
U	P	o	Mp
Ό		>	P
o	-	'b	b
E	•P	Ό	CP
	•P		b
	0	ud	P
E	Už	0
0	o	•P
W	•r-)	0
CP	d	'b
	•P	•I“)
		b	d
b		CP
d	•r->	'b
	0	P
	>	(Λ
>»	0			O
N	rp	0
	•rl	Ud	b
rP	>N	b	Už	M
0	0	rp	>	Už
Ud	P	b	'b
E	P		Ό	dd
0	'b	b		P
P	d	Ud
P	>	0
		b
	o	b
0)	CP	1—1
P		CP
P
(1)	d	b
E	í)	P	b
b	•P	'b	Už
P	CP	d	P
b	0	•P	•b
CP.	P	E	i—1

<P	f'	Ib	st	m	rb		H
r-í	O	O	o	T“í	o	Ή	tH
-H	-H	P	P	P	P	P	P
so	(P	b	V)	00	V)	b^-	'Ť
Os	(P		m	00	CP		P-

rH	CO	b·
P	m	rb	so	\o	rH	^fr
P	Ή	P	i P	-H	Ή	Ή
00		m	Os	m	O	τΗ
(P	rH	rb	(P	rH	m	ω

SOSOSOSOSOSOSOSOSO \\\\\\\\\ osobcboscbpcp

so	so	so	SO	SO	so	so	so
o	o	o	o	o	o	o	o
o	o	o	o	o	o	O	o
o	o	o	o	o	Cd	o	o
o	o	Cd	o	Cd	o	o	o
o	rb	o	o	o	b-	o	tb
so	P	00	(P	CP	P	P

P p

CS b

O 0

Ud	>s
b	t—1
b	•P
b	P	Cu
rH	b	CP
Ož	<	dž

'b d

-o

M

Ó

Ό

C tí

P >7!

•H

P b

E □

Ή

P

CX o

b

C b

E d

d

N >

P o

d n

o b

'b· d

o w 0 d ó d už Z h '>>

Ud

Ό

O

P a · tí u

μ x

ω

O

P <

H

I c

•H

E μ i o &o ť *

U H E

rH	00
*	*·
Tt	m	m	o
00	M	o	V)
	-H	00	M

\o	Tt	P	H
-	*·	*	*
H	ΓΗ	Tt	rH
Tt	H -H		-H

od počítačových úda

tí	M 44 \
tí	P
73 tí	t—I
>tí	O o o
tí	o
tí	o n

tí >

M i—f

E μ e C \ •H P

U H •H *H μ -h _v w tí 0

O 44 N C

H tí \ -H

-Γ-) H g •h c μ > Ή 'tí

N t-)

'tí	tí
	C		>
	tí		0			Z—s
	P	>	H		N	.C
	0		•tí		\	•H
	>		>N		H	ε
	P	ω	0		μ
	0	E	tí
		N	μ
	-	tí	'tí
	tí	rH	c
	tí	a	>
	μ
	tí		o
	E		a	a
	tí	>		O)
	tí		>	P
	tí		0
	a	tí	w	0
		tí	a	P
	'tí	o		tí
	P	'tí	P	i—1
	tí	tí	υ	d
	•tí	μ
	μ	tí	tí	06
	tí	tí	d	tí
	tí	o	>	w
Tt	•H	tí	0	P
	P	o	N	H
tí	0	P	•H	tí
44	P		μ	μ
TH	tí		0	tí	d
tí	E		P	<c	P
P	tí	u	tí		μ
tí	tí	tí	d	o	•d
H	a	a	tí	p	H

tH	>
P		Tt	a
o	rC	\o	rH
H	μ		μ

Tt		r*	r-
>	O	r-	rH
	P	H	00
rH	H	m	Ή

'O	P	o	n
Tt	P	P	Tt
rH		H	•H

P M M H II

HO Γ- H P μ

tí

7)

P r—I •H II μ tí c <

II

P o c P

P a

tí p

u o

H a

'tí p

tí >

o i—I

O a

tí

d	tí
P			μ
H			x
			tí
P
tí			-
P			z
0			3
			0
•d			P
c			>
P			•H
tí	tí		tí
d	r—1		P
P	tí
C	•tí	tí	P
d	P	tí	0
μ	P	tí	a
>73	0	d
		tí	d
-H	0	d	P	tí
	P	tí	o	•rl
tí	'tí	I—1	0	tí
U	C	tí	,—1	'd
E	P		a	tí
U	tí		z	μ
•H	tí	>		C
tí	μ	0	II	tí
a	73	P		o
		rtí	H	d
•tí	E	tí	0	o
7)	tí	tí	a p
	Ό		d
>>	P	II	tí	3
μ	0		μ	0
0		μ	x	P
tí	II	0	tí	>
P		μ	u	•H
0	tí	rH	P	tí
P	>	u	c	P

Tabuľka s* o

•H >0 •H

P >7) z~s

O

-a p

D >0 o

X

C

Ή

E

N d

rH

CX z—\ •H P c

d co

0	u	E	a
X	p	0
	p	7)
		X
>»	d			d
c	P			>j)
•H	Ό	d		bfl
Ό	C	d		O
0	•H			d
x	E	x		•H	ϊ£
		o		E
	P	Pi		N
M				d
		0		P
	>N	p		x
>	tt)	tt)
0	C	P
P		d
>>	1)
0	•P
0	>73	Pi		d
p	p	tt)		'1)
E	P	73		bO
O	P	>>		O
P		P		d	\
P		P		P	ÍS
	•p	P		P
	1)	0		p
P	tt)	<	>>	P
tt)	'd		d	P
>0	•p	>1	x
0	d	Pi	o
X	>	>	P
	P	'd
	P	P	•p	d
d			tt)
	-	1)	d
	P	0	P
‘H	P	'd	>d
P	o	•p	d		o
73	Pi	d	0		w
0	1)	X	P	d
>	•p	'd	0	pí	bO
•P	C	P	Pi	>	Pi
P.	•H	73		'd	\
d			>>	P	X
d			N		P
>N	•p	0	'0
'd	tt)	p	P
P	>	¢)	E
N	O	i—1	0
	i—i	d	P
	P		P
>>	>ÍO	0
P	0	p	•H
0	P	1)	rH	d
P	P	0	1)	Pi
Pi	'd	d	P	P
d	d	i—l	0	'd
x	>	X	E	1—f

rc	o rH	O rH
P	Ή	44
CO		O
O	rH	rH
P	rH	rH

m·

II c

k0	•t	00
Ή	P	P
Χί-	x	P
Ο	o	O
r4	P	P

in	m	rH rH
44	44	44
χί-	rH	oo
ο	O	rH
rH	rH	rH

Ή rH CO

P	rH	P	m	v	P	r·	P-	rH
Ή	-H	P	44	H	+1	•H	•H	-H
(N	C\	P		P	o	O	P	xt
X	rH	v	kO	00	-t	P	P	00

t

II	M	P	n	m	00	rH	m	CO
d	+1	Ή	44	44	Ή	Ή	Ή	Ή
P	P	x	Γ-	O	xť	r4	00	O
o	P	P	ΟΟ	Cs	Γ-	00	00	X

7—1

M	o	rH	xl-	P	rH	rH	P	P
-H	-H	44	44	P	Ή	Ή	•H	Ή
P	P	kO	kO	>	P	ΠΊ	CO	P
O		rH	oo	x	00	Ok	x	x

P	P	P	P	P	P	P	P
o	o	o	o	o	o	o	o
o	o	o	o	o	o	o	o
o	o	o	o	o	o	o	o
o	o	o	o	o	o	o	o
o	P	o	o	o	t	o	P
P	P	00	CO	co	P	P

H rH tt)

0	71
P
tt)	rH
0	•H
d	P	x
P	0	CO
x	<	Pi

d Pi r—I '>! X O Ό O 'd

C

Ό

P d

Ό

C d

P >'J) +1

E

O p

tt)

E

Θ •rl

P

CL, 'Ó (Z) >>

P o

tí

Ό

O

X

Údaje sú uvedené v percentách východiskovej hodnoty pred

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Tkanivový aktivátor plazminogénu t-PA, ktorý nie je glykozylovaný a je tvorený nasledujúcim reťazcom aminokyselín (M)

1 SYQGNSDCYF GNGSAYRGTH SLTESGASCL

51 ALGLGKHNYC RNPDGDAXPW CHVĽKNRRLT

101 QFRKGGLFA DIASHPWQAA IFAXHRRSPG

151 CFQERFPPHH LTVILGRTYR WPGEBEQKF

201 ALLQLKSDSS RCAQESSWR TVCLPPADLG

251 FYSERLKEAH VHLYPSSRCT SQHLLNRTVT

301 ACQGDSGGPL VCLNĽGRMTL VGIISTOLGC

351 DNMRP pričom na aminoterminálnom konci predĺžený pomocou M.

PWNSľMILIGK VYTAQNPSAQ WEYCDVPSCS TCGLRQYSQP ERFLCGGIL1 SSCWILSAAH EVSCYIVHKE FDDDTYDNDI LPDWTECELS GYGKHEALSP DNMLCAGDIR SGGPQANLHD GQKDVPGVYT KYTNYLDWIR

môže byť reťazec
2. Reťazec DNA, ktorý kóduje derivát t-PA podľa nároku 1, a má nasledujúci reťazec:

1 ATGTCTTACCAAGGAAACAGTGACTGCTACTTTGGGAATGGGTCAGCCTACCGTGGCACG 60 60 CACAGCCTCACCGAGTCGGGTGCCTCCTGCCTCCCGTGGAATTCCATGATCCTGáTAGGO 120

121 AAGGTTTACACAGCACAGAACCCCAGTGCCCAGGCACTGGGCCTGGGCAAACATAATTAC 180 181 TGCCGGAATCCTGATGGGGATGCCAAGCCCTGGTGCCACGTGCTGAAGAACCGCAGGCTG 240 241 ACGTGGGAGTACTGTGATGTGCCCTCCTGCTCCACCTGCGGCCTGAGACAGTACAGCCAG 300 301 CCTCAGTTTCGCATCAAAGGAGGGCTCTTCGCCGACATCGOCTCCCACCCCTGGCAGGCT 360 36i GCCATCTTTGCCAAGCACAGGAGGTCGCCCGGAGAGCGGTTCCTGTGCGGGGGCATACTC 420 421 ATCAGCTCCTGCTGGATTCTCTCTGCCGCCCACTGOTTCCAGGAGAGGTTTCCGCCCCAC 480

481 CACCTGACGGTGATCTTGGGCAGAACATACCGGGTGGTCCCTGGCGAGGAGGAGCAGAAA 540

541 TTTGAAGTCGAAAAATACATTGTCCATAAGGAATTCGATGATGACACTTACGACAATGAC 600

60l ATTGCGCTGCTGCAGCTGAAATCGGATTCGTCCCGGTGTGCCCAGGAGAGGAGGGTGGTC 660

661 CGGACTGTGTGGCTTCCCCCGGCGGACCTGCAGGTGGCGGACTGGACGGAGTGTGAGCTC 720

721 TCCGGCTAGGGCAAGGATGAGGGCTTGTCTCCTTTCTATTCGGAGCGGGTGAAGGAGGTT 780 781 CATGTCAGACTGTACCCATCCAGCCGCTGCACATCACAACATTTACTTAACAGAACAGTC 840 841 ACCGACAACATGOTGTGTGOTGGAGACACTCGGAGCGGCGGGGCCCAGGCAAACTTGOAC 900 901 GACGCCTGCCAGGGGGATTCGGGAGGCCCCCTGGTGTGTCTGAACGATGGGCGCATGACT 960 961 TTGGTGGGCATCATCAGCTGGGGCCTGGGCTGTGGACAGAAGGATGTCCCGGGTGTGTAC L020

1021 ACAAAGGTTACCAACGACCTAGACTGGATTCGTGACAACATGGGACCG 1068

CcprtA 'yj
3. plazmid ·. obsahujúci reťazec DNA podľa nároku 2 alebo od tohto reťazca odvodený reťazec, vzniknutý degeneráciou genetického kódu, ktorý je kódom pre bielkovinu podľa nároku 1.
4. Plazmid pA27.3, obsahujúci reťazec DNA podľa nároku 2, konštrukcia ktorého je znázornená na obr. 1.
5. Plazmid pA27 f d., obsahujúci reťazec DNA podľa nároku 2, ktorý je ligovaný do vektora, ktorý je prítomný v hostitelských bunkách ako.vysoko kópiovy a je pripravený podľa príkladu 5.
6. Spôsob výroby plazmidu podľa nároku 3 až 5, vyznačujúci sa tým, že sa reťazec DNA, ktorý kódom pr-e bielkovinu ΐ-PA alebo jej derivát, ktorý okrem oblasti Kringel II a oblasti proteázy obsahuje ešte ďalšie oblasti bielkoviny t-PA zabuduje do plazmidu a riadenou muta29 genézou sa odstránia tie oblasti, ktoré sú kódom pre aminokyseliny, nenachádzajúce sa v deriváte t-PA podľa nároku 1.
7. Spôsob podľa nároku 6, vyznačujúci sa tým, že sa ako reťazec DNA pre bielkovinu t-PA alebo jej derivát použije zodpovedajúca cDNA.
8. Spôsob podľa nároku 6 alebo 7, vyznačuj úci sa t ý m, že sa použije plazmid pA27.3 alebo plazmid pA27 fd.
9. Spôsob výroby derivátu t-PA podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa plazmid podľa nárokov 3 až 5 použije na transformáciu vhodných cieľových buniek a produkt expresie sa izoluje zo živného prostredia alebo po rozrušení uvedených cieľových buniek.
10. Spôsob podľa nároku 9, vyznačujúci sa tým, že sa ako cieľové bunky použijú prokaryotické bunky, s výhodou bunky E. coli.
11. Spôsob podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že sa na zvýšenie výťažku účinnej bielkoviny oddelia vytvorené inkluzívne telieska, ktoré sa potom solubilizujú pôsobením guanidínhydrochloridu, potom sa derivatizujú oxidovaným glutatiónom a nakoniec sa derivát t-PA renaturuje pridaním L-arginínu a GSH.
12. Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že sa po renaturácii K2P v renaturačnej zmesi koncentruje a nakoniec sa uskutočňuje chromatografické čistenie pomocou afinitnej chromatografie.
13. Spôsob podľa nároku 12, vyznačujúci sa t ý m, že sa uskutočňuje za prítomnosti 10 až 1000 mmol/1 L-arginínu.
14. Spôsob podľa nároku 13, vyznačujúci sa tým, že sa chromatografické čistenie uskutočňuje za použitia koncentrátu renaturačnej zmesi, ktorý obsahuje 10 až 1 000 mmol/1, s výhodou 600 až 800 mmol/1 L-arginínu za použitia adsorpčného stĺpca s obsahom ETI.
15. Spôsob podľa nároku 14, vyznačujúci sa tým, že sa koncentrát, určený na chromatografické čistenie upraví na pH 7,5 až 8,6.

U
16. Spôsob podľa nároku 14 alebo 15, vyznačuj ú* c i s a t ý m, že sa elúcia výsledného produktu uskutočňuje pri pH v rozmedzí 3 až 5,5.
17. Farmaceutický prostriedok s fibrinolytickým účinkom, vyznačujúci sa tým, že ako svoju účinnú zložku obsahuje derivát t-PA podľa nároku 1.