TW201306861A - 具有血栓溶解與抗凝血劑特性之蛋白質融合構造 - Google Patents
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Abstract
本發明揭示新穎的雜合蛋白質,其具有胞漿素原活化因子以及包括血塊特異性作用的抗血栓特性兩者,賦予雜合蛋白質非常有利於治療涉及因為血管內在組織損傷致使血纖維蛋白血塊形成而造成心肌梗塞、中風等的循環疾病。本發明亦揭示新穎的蛋白質及獲得該等蛋白質的方法,其藉由以胞漿素或凝血酶依賴型的方式活化胞漿素原而有助於溶解血塊,並且透過內源性凝血路徑抑制凝血酶的活性以及生成。
Description
本發明是有關於包括嵌合融合蛋白質(chimeric fusion proteins)的血栓溶解藥物(thrombolytic drugs),該嵌合融合蛋白質含有血栓溶解蛋白質以及凝血調節素(thrombomodulin)之表皮生長因子樣結構域4、5、6(EGF 4、5、6)。本發明融合蛋白質具有胞漿素原(plasminogen)活化活性、凝血酶抑制活性以及抗凝血蛋白質C路徑活化活性。本發明融合蛋白質在血塊處具有分解血栓(thrombi)以及預防再栓塞(reocclusion)的治療潛力。
儘管血栓(thrombosis)(在血管系統內形成並生成血塊或血栓(thrombus))在出血時是一種急救步驟,但血栓在其他任何時候發生時可能會危及生命。血栓會阻斷血管並阻擋血液供給至器官或其他身體部分。若血栓脫離,可能變成血栓子(embolus)而阻塞與原處相距遙遠的血管。目前在全球開發中國家以及已開發國家中,血栓性疾病(thrombotic disorders)是死亡率的一個主因。雖然胞漿素原活化因子蛋白質藥物(諸如鏈球菌激酶(streptokinase,SK)、葡萄球菌激酶(staphylokinase,SAK)以及組織型胞漿素原活化因子(tPA))對治療血栓性循環疾病來說仍是最為偏好的急救(〞SOS〞)藥物,但相對於急救心臟介入(emergency cardiac interventions)(諸如裝設血管支架以及繞道手術),它們在富裕國家中已逐漸喪失其優勢,因為它們在使用時會有出血的風險,而且經常面臨因為凝血酶(thrombin)活性及/或新生成的凝血酶而在血管損傷同一處又形成血塊的問題。因此,亟需開發更為精巧且更為有效之具有額外特性(諸如血塊特異性與抗血栓特性)的血栓溶解藥物。
血塊形成是一連串複雜反應的最終結果,其中數個生化事件會在損傷處造成癒合或修復(Butenas and Mann 2002)。以起始凝血級聯為基礎,將路徑分成外源性路徑以及內源性路徑,其中外源性路徑是因為接觸組織因子(tissue factor,TF)而被起始,而內源性路徑是因為因子XII(哈格曼因子(Hageman factor))、高分子量激肽原(high molecular weight kininogen,HK)或血管舒素(prekallikrain)而被起始。但是,兩種級聯路徑最終在因子Xa生成之點交會,且之後有共同的凝血酶媒介之血纖維蛋白(fibrin)生成(Cannon and Tracy 1995)。
在脊椎動物中,凝血酶生成是凝血過程的主要步驟。在凝血酶生成過程的期間,少量凝血酶會隨著血纖維蛋白血塊/網絡擴張而併入其中,且這個在經吸收凝血酶中游離的蛋白酶的催化部位能夠增強血塊長成(Liu,Nossel et al. 1979;Vali and Scheraga 1988)。凝血酶與不同受質交互作用且活化數種血塊促進因子,例如(a)其可藉由切割其同源受體(cognate receptors)來活化血小板、(b)造成因子V、VIII與XI的回饋活化、(c)造成轉麩胺酸醯胺基酶、因子XIII活化,以及(d)將血纖維蛋白原(fibrinogen)轉化成血纖維蛋白。在生理條件下,一旦血塊形成且因為股間交聯而穩定時,其會妨礙血管的正常血流而導致動脈與靜脈閉塞。
在動物/人類體內,對抗源自於病理性血栓形成的循環疾病(諸如心肌梗塞),最常見也最被偏好的藥物之一是靜脈內輸注血栓溶解劑(Lijnen and Collen 1988;Collen and Lijnen 1990;Francis and Marder 1991)。可供使用的血栓溶解劑(諸如鏈球菌激酶(SK)、尿激酶(UK)與組織型胞漿素原活化因子(tPA))基本上是透過相同的胞漿素依賴型機制來作用(因為這些都是胞漿素原活化因子),其中它們在胞漿素原的殘基561與562處切割可斷裂肽並且將其轉化成蛋白溶解活化形式,胞漿素。組織型胞漿素原活化因子與尿激酶是專一辨識人類胞漿素原中可斷裂肽鍵的蛋白酶(直接活化因子),而鏈球菌激酶與葡萄球菌激酶(它們是蛋白質〞輔因子〞而非蛋白酶,因此是〞間接〞活化因子)(參見:De Renzo,Boggiano et al. 1967;Buck,Hummel et al. 1968;McClintock and Bell 1971)首先與胞漿素或胞漿素原形成緊密的1:1複合物,而所形成蛋白溶解活化複合物會切割其他〞游離〞胞漿素原分子的可斷裂肽鍵並以指數的方式生成胞漿素((Wohl,Summaria et al. 1978;Castellino and Powell 1981;Wohl,Sinio et al. 1983;Davidson,Higgins et al. 1990所回顧)。在所有現有的血栓破壞物(clot-busters)(亦即胞漿素原活化因子蛋白質藥物)中,鏈球菌激酶表現出最高的血栓溶解力,儘管它(與SAK類似)是源自於細菌而具有會在少數患者體內引起免疫反應的限制。不過,鏈球菌激酶因為相對於tPA與UK的費用較低而被廣泛地用作為負擔得起的血栓溶解劑。
成功的血栓溶解療法有助於維持正常血流並且明顯增進患者存活數目(Verstraete 1990),但是在相同處的早期再栓塞或再血栓仍經常限制血栓溶解藥物的成功施用。數個研究證實,高達30%的患者在血栓溶解療法之後會發生早期再栓塞(Ohman,Califf et al. 1990)。再血栓或早期再栓塞的原因為增加血液凝集力過高的胞漿素活性(Eisenberg,Miletich et al. 1988);提出胞漿素會活化接觸因子(Ewald and Eisenberg 1995)、因子V(Lee and Mann 1989)而且可能還有凝血酶原(prothrombin)(Seitz et al.,1993)。另一個被提出的原因是,在凝血酶溶解之後接觸結合血塊的凝血酶會依次產生更多凝血酶,而結合血纖維蛋白的凝血酶對於抗凝血酶抑制劑相對具有抗性(Hogg and Jackson 1989;Weitz,Hudoba et al. 1990);〞被釋放的〞凝血酶又在附近活化促凝血(procoagulant)活性並且開始活化血小板(Kumar,Beguin et al. 1994;Puri,Kumar et al. 1995),從而促進會導致再血栓的生化事件循環。因此,在損傷處直接並且在其促凝血活性的次要層面上抑制凝血酶會大大地阻撓上述非所欲連續事件。若能夠將這樣一種特性成功地併入同一個分子中作為血栓溶解藥物,那將明確有利於挽救生命。
胞漿素原活化因子是一個蛋白酶家族,其典型催化胞漿素原酵素轉化為胞漿素。TPA(組織胞漿素原活化因子)透過水解單一精胺酸-纈胺酸鍵結以激發胞漿素原酵素轉化成胞漿素。組織型胞漿素原活化因子(亦已知為血纖維蛋白原激酶(fibrinokinase),外源性胞漿素原活化因子,t-PA或TPA)是一種醣蛋白質並且具有大約70,000道耳頓的分子量(MW)(68,000道耳頓)。它是一種絲胺酸蛋白酶,透過水解單一精胺酸-纈胺酸鍵結來催化酵素原胞漿素原酵素轉化成活性酵素胞漿素。t-PA的催化部位是由胺基酸His-322、Asp-371以及Ser-478所構成。在沒有血纖維蛋白存在時,t-PA是一種不良的胞漿素原活化因子。胺基端區域是由數個與其他蛋白質同源的結構域所構成。這些不同的結構域涉及酵素的數種功能,包括結合血纖維蛋白、血纖維蛋白特異性胞漿素原活化、結合內皮細胞受體以及活體內快速廓清。這樣一個含有胺基酸殘基50至87的結構域(結構域E)與人類表皮生長因子同源且似乎涉及血纖維蛋白結合、血纖維蛋白親和性以及活體內廓清。選殖t-PA cDNA並且隨後在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中表現。
組織型胞漿素原活化因子(t-PA)是哺乳動物血纖維蛋白溶解系統的一個組分,負責專一活化與血纖維蛋白血塊相連的胞漿素原(亦即,能夠溶解血塊)。組織型胞漿素原活化因子媒介的血塊溶解顯示,血漿中血纖維肽-A(fibrinopeptide-A)的含量增加是結合血塊之凝血酶的直接標記(Weitz, Leslie et al. 1998)。組織型胞漿素原活化因子以及目前已知的抗凝血酶藥物(諸如肝素與水蛭素)的組合通常用於藥物中,但抗凝血酶僅作用於游離的凝血酶,而結合血塊的凝血酶因為其親和性低而對肝素以及其他抑制劑具有抗性。此外,這些藥物不會影響凝血酶進一步生成的間接促進子(promoters)(例如因子V與因子VIII)。因此,新穎的嵌合蛋白質必須設計成會活化胞漿素原,還會抑制結合血塊的凝血酶以及凝血酶的間接促進子(例如因子V與因子VIII)。
關於血栓溶解後胞漿素活性以及隨後生成凝血酶的研究清楚地暗示,即便已藉由血塊破壞藥物(clot-buster drug)來清除病理性血塊,仍存在著會造成凝血路徑再活化的強力因子。此外,所生成的凝血酶本身是一種強力的凝血路徑活化因子。值得注意的是,凝血酶亦執行抗凝血劑(anti-coagulant)的功能,其為止血系統的〞自限式〞控制機制(〞self-limiting〞 control mechanisms)的一個精練實例,使得整個血管系統不會發生凝血〞失控〞。游離的凝血酶與凝血調節素(一種細胞表面蛋白質)形成1:1高親和性、非共價複合物(Kurosawa,Galvin et al. 1987)。一旦凝血酶-凝血調節素複合物形成,其受質特異性自促凝血模式重新導向為抗凝血模式,藉此活化蛋白質C抗凝血路徑。因此,即使凝血酶可單獨活化蛋白質C,一旦它與凝血調節素複合,會加速蛋白質C活化達近乎1000倍(Esmon and Owen 1981;Owen and Esmon 1981)。
成熟的凝血調節素含有負責不同功能(亦即抑制凝血酶與活化蛋白質C)的結構域,該等結構域位在這個大蛋白質的表皮生長因子樣結構域內。表皮生長因子樣(EGF)結構域5以及6主要負責凝血酶親和性,且EGF 4、5以及6結構域會一同活化蛋白質C(Kurosawa,Stearns et al. 1988;Stearns,Kurosawa et al. 1989)。已知凝血調節素或其單離的EGF結構域4、5以及6會活化以蛋白質C為中心的抗凝血路徑,且亦直接抑制凝血酶的活性,但本身無法溶解血纖維蛋白血塊。就此而言,需要血栓溶解劑。兩種類型的藥劑可在心臟血栓性疾病期間彼此獨立使用,但具有兩種特性的單一藥物(至目前為止尚未獲得證實)的益處是明顯的。
術語〞止血〞意指在血液/血管系統中抗凝血活性與促凝血活性之間的平衡,其中血液組分(尤其是血小板)通常不會與血管內襯異常交互作用。若有損傷或病況,血小板傾向附著,而因此凝血因子開始在損傷處聚集並且被活化,然而在損傷處起始修復的反應會造成血栓,經常會加速血栓危機。
在血管內,凝血以及血塊溶解對於正常止血來說是必要的生理過程。在血管內血塊的形成以及溶解機制於文獻內是已知的,而不同促凝血蛋白質(促進凝血)與抗凝血蛋白質的角色目前亦有充分研究。血塊形成是一連串反應複合的結果,其中凝血酶在起始以及凝血級聯加速時扮演主要角色,結果呈現穩定的血纖維蛋白網形式。
每一種最新血栓溶解/血纖維蛋白溶解療法通常也會合併在血塊溶解期間對於維持促凝血劑與抗凝血劑正常平衡所需的抗血栓藥物(諸如阿斯匹靈、肝素等)。在溶解期間,被短暫釋出的凝血酶開始自我生成循環(self-generation loop)以促進血塊長成;這偶爾會造成平衡改往重新形成血塊或活化促凝血劑/血塊促進子。
血栓溶解劑是藉由在循環系統內活化內源性胞漿素原來溶解病理性血塊。在可供使用且在治療上有效的血栓溶解劑中,鏈球菌激酶表現出最高的血栓溶解效力,但其有時會因為缺乏血塊特異性而在用藥期間造成出血。這個問題與其他血栓溶解劑(tPA與SAK)較不相關,因為它們的血纖維蛋白血塊特異性相對較高,但這些血栓溶解劑的其他缺點在於血纖維蛋白溶解效力較低且在活體內半衰期較短。所有血栓溶解劑基本上具有相同的血栓溶解機制(胞漿素原活化),但有一個共同的問題在於血栓溶解之後,所生成的凝血酶通常會藉由凝血因子Va以及因子VIIIa控制的回饋機制進一步促進凝血酶生成。在血栓溶解過程中,與血塊連結的凝血酶亦被釋放至循環中,其對於內生性(in-built)抗凝血酶與其他外部提供的凝血酶抑制藥物較具有抗性。這個與血塊連結的凝血酶出現在〞原〞損傷的鄰近處,亦有助於鄰近血塊/損傷處生成更多凝血酶,特別是在會造成在臨床上嚴重的早期再栓塞問題的血塊不完全清除之後。
在溶解與活化其他內源性促凝血劑的期間生成凝血酶是止血平衡的一個正常部分。抗凝血酶劑(例如肝素、水蛭素以及化學合成藥物)可以抑制凝血酶並防止凝血酶之後的短暫效用,例如壓抑過度反應的血小板形成過程、抑制血纖維蛋白原轉化成血纖維蛋白與其他血塊促進活性(在血液中誘發血凝過快(hyper-coagulibility))。但值得注意的是,所有這些直接抑制劑作用於短暫生成的凝血酶,而非那些實際上會加速凝血酶生成並在促凝血路徑中扮演關鍵性角色的因子。因此,這些藥物中沒有任何一者能夠如所需要般有效地作用在凝血酶生成與早期再栓塞中扮演主要角色的凝血因子V以及VIII。
已知細胞表面分子凝血調節素與凝血酶以1:1複合並且將其促凝血劑功能導向為強力抗凝血劑(亦即蛋白質C活化因子)。活化的蛋白質C與蛋白質S皆會分解經活化的因子V與因子VIII(Esmon 1989)。
儘管所有可使用的血栓溶解劑的確具有血塊溶解力且其機制在文獻中是充分知曉的,但在血塊溶解期間,殘餘的血塊以及胞漿素會造成凝血酶生成;同時,因為這些藥劑無法使得在血塊溶解期間短暫出現的凝血酶失活,再栓塞成為一個在血栓溶解療法後常見的問題。迄今,沒有可用的抗凝血酶藥物具有組合的血栓溶解特性以及抗凝血酶特性,特別是促凝血活性而使得再血栓主因的〞真正罪犯〞失活。
本發明是有關於設計經改良的血栓溶解藥物,它除了能夠活化胞漿素原以外,亦顯示能夠抑制凝血酶生成。同一個分子中存在這兩種特性在臨床上有極大的潛在益處,因為這有助於在血栓溶解療法之後將早期再栓塞問題減至最低。本發明揭示按策略來設計的嵌合多肽,其中衍生自凝血調節素之具有抗凝血酶特性的結構域/段與不同的血栓溶解蛋白質融合,使得所生成的融合/嵌合多肽同時表現血塊溶解(血栓溶解)特性以及抗凝血酶特性。這些新穎的融合構造能夠以胞漿素及/或凝血酶依賴型的方式活化血栓溶解系統(因為血纖維蛋白血塊富含胞漿素且富含凝血酶,使得該等構造對血塊具有特異性,而游離胞漿素與凝血酶因為諸如a-2抗胞漿素、抗凝血酶等絲胺酸蛋白酶抑制劑(Serpin)而快速地失活,在循環中為短壽命的)。此等構造同時也抑制在血塊溶解期間被釋出之短暫生成的凝血酶,且在使用這些藥劑進行治療期間若發生血栓性疾病(諸如中風、心肌梗塞、深部靜脈栓塞等),就起始內生性(內源性)抗凝血蛋白質C路徑。
不同於目前使用的血栓溶解劑,本發明揭示新穎的血栓溶解構造,其能夠標定凝血級聯的因子Va以及VIIIa(除了能夠活化胞漿素依賴型血栓溶解路徑以外)以及內源性內生性抗凝血蛋白質C路徑;在同一個藥物分子中組合出現數種所欲能力將增進其整體效力,使得它們可以溶解病理性血塊,同時將最有可能危及生命之一的血栓溶解後事件(亦即凝血過程復現)降至最低。
方法是要設計、測試並且評估具有抗凝血酶特性以及血栓溶解特性這兩者的融合蛋白質的創作。〞在功能上〞將EGF 4、5、6成功融合至血栓溶解分子(thrombolytic molecule)中可使血栓溶解分子因為EGF 4、5、6的內源性凝血酶親和性而強力標定至富含凝血酶的血塊。同時,若該融合物除了保有兩種原有〞獨立〞的原有生物活性(亦即,抗凝血酶活性以及胞漿素原活化因子活性)以外,還賦予雜合分子前藥性質,由於其偏好在鄰近血塊處被活化而非全身性的,這將會因為其標靶作用的特性而成為另一個非常有用且有利的性質。
在本發明中,已成功地藉由有效併入同一個分子中而使得數種具有組合血栓溶解特性以及凝血酶抑制力與蛋白質C活化力的雜合蛋白質分子具有功能,俾以大大增進現今可用之血栓溶解藥物的效力且有助於預防再血栓現象,因為所有這些特性併入同一個藥劑/分子中的存在能於不同血栓性病理性症候群的阻塞血纖維蛋白血塊處賦予即時(短暫)且空間(原位)的有利作用。
在本發明中,鏈球菌激酶、組織型胞漿素原活化因子以及葡萄球菌激酶與EGF 4、5、6融合而生成嵌合分子,其具有起始胞漿素依賴型血栓溶解系統以及凝血酶媒介之蛋白質C抗凝血路徑兩種特性。此外,在本發明的某些具體例中,亦實現成功合併血栓溶解、血塊特異性以及抗凝血酶活性,這迄今尚未被報導過。
在不同的融合構造中,可在連接子(lihker)中使用各種偏好的胺基酸殘基來謹慎地設計血栓溶解劑與EGF結構域之間的融合接合,並且引入不同的凝血酶及/或胞漿素可切割位點,可切割位點會因為EGF 4、5、6自嵌合體蛋白溶解釋放且隨後活化血栓溶解組分而在活體外產生不同的時間依賴型胞漿素原活化動力學。於血栓溶解劑與EGF 4、5、6的接合處存在不同的凝血酶可切割位點容許血栓溶解劑與EGF 4、5、6在富含凝血酶之血塊鄰近處因為在附近的酵素(凝血酶或胞漿素)而彼此分離;因此,各結構域在切割之後獨立地執行其功能。再者,在某些融合構造中,在嵌合多肽的重要位置處引入轉麩胺酸醯胺基酶可辨識的交聯序列,使得經活化結構域會因為血液轉麩胺酸醯胺基酶的作用而共價結合至表皮組織中或在表皮組織附近(表皮組織損傷一開始會造成血塊生成)的血塊剩餘物,因此就活化胞漿素原以及抑制凝血酶而言,在血塊已開始溶解許久之後還能持續提供局部效用。這明顯產生藥物的〞療癒〞效用,一種在目前使用的任何血栓溶解蛋白質藥物中所無法達到的特質。
本發明是有關於設計以及製備新穎的血栓溶解融合多肽,其表現出更勝於目前可用形式(亦即,組織型胞漿素原活化因子、SK以及SAK或其衍生物/經修飾形式)的獨特功能優點,因為目前可用形式僅能透過胞漿素原活化來溶解血纖維蛋白血塊而無法避免實質上在血栓溶解療法期間會因為凝血酶生成而造成早期再栓塞問題的血栓溶解後結果。
本發明揭示製造融合構造的方法,該等融合構造具有直接以及間接胞漿素原活化因子與凝血調節素的第4、5與6 EGF結構域融合,該等融合構造不僅保有活化胞漿素原的能力,亦保有直接抑制凝血酶的能力,而且還保有透過由凝血酶媒介之抗凝血路徑活化蛋白質C的能力。關於蛋白質之胺基酸序列的術語〞變異體(variant)〞、〞同源物(homolog)〞、〞衍生物〞、〞片段(fragment)〞或〞類似物(analog)〞包括任何置換、變異、修飾、取代、刪除或添加一(或多)個胺基酸,或提供所生成蛋白質或(多)肽具有與未經修飾之蛋白質活性相同的序列。特別地,術語〞同源物〞涵括在構造及/或功能上的同源性(homology)。就序列同源性而言,相對於未經修飾的蛋白質序列較佳地有至少70%、更佳地至少80%、又更佳地至少85%同源性。相對於未經修飾的蛋白質序列較佳地有至少90%、更佳地至少95%、最佳地至少98%同源性。
一般就本發明的變異體、同源物、衍生物、片段或類似物而言,可做出的胺基酸置換類型應維持胺基酸序列的疏水性/親水性。胺基酸置換可以做出,例如1、2或3至10、20或30個置換,前提是經修飾的序列保有與本發明相同的作用能力。胺基酸置換可包括使用非天然存在的類似物,俾以例如增加在治療上被投與之多肽的血漿半衰期。
可進行守恆性置換,例如下面所示。同一行的胺基酸可彼此置換:
脂族非極性 G A P I L V
極性-未帶電荷 C S T M N Q
極性-帶電荷 D E K R
芳香族 H F W Y
如上所示,本發明蛋白質一般是藉由重組方法(例如本文所述),及/或藉由以使用習於技藝者所熟知之技術的合成方法(諸如固相合成)來製備。
如本文中所用,〞刪除〞定義為一種核苷酸或胺基酸序列的改變,其中一或多個核苷酸或胺基酸殘基分別不存在。
如本文中所用,〞插入〞或〞添加〞為一種核苷酸或胺基酸序列的改變,其相較於天然存在的蛋白質會分別導致添加一或多個核苷酸或胺基酸殘基。
如本文中所用,〞置換〞是因為一或多個核苷酸或胺基酸分別被不同的核苷酸或胺基酸取代。
如本文中所用,術語〞表皮生長因子樣結構域4、5以及6〞或〞EGF 4、5、6〞可以是凝血調節素的EGF 4、5或6結構域的任一者,或可意指凝血調節素的所有三個EGF 4、5以及6結構域如肽或肽片段般共價鍵結在一起。表皮生長因子樣4、5以及6結構域的每一者與表皮生長因子(EGF)蛋白質的一或多個結構域具有同源性。
本發明揭示一種嵌合蛋白質構造,其含有凝血調節素的表皮生長因子樣結構域4、5以及6融合至血栓溶解蛋白質,該血栓溶解蛋白質是選自於由鏈球菌激酶、組織型胞漿素原活化因子、葡萄球菌激酶、尿激酶及其衍生物與類似物所組成之群。
在本發明的一個具體例中揭示一種嵌合蛋白質構造,其中凝血調節素EGF 4、5、6結構域在該血栓溶解蛋白質或其衍生物或類似物的N-端處、C-端處或N-端與C-端兩者處融合至該血栓溶解蛋白質或其衍生物或類似物。
本發明亦揭示設計具有EGF之抗血栓最小必要部分在血栓溶解蛋白質(SK、tPA或SAK)的N-末端編碼部分處與血栓溶解蛋白質融合的遺傳構造,其中轉譯(在所形成的〞嵌合〞ORF中)是從EGF的第4個結構域開始,之後為編碼血栓溶解多肽合成的部分。因此,成熟多肽或經折疊蛋白質不僅具有兩種不同類型的蛋白質,也具有兩種不同的功能。這些帶有血栓溶解蛋白質的構造被命名為EGF N-端融合構造(EGF N-terminal fusion constructs)。
在另一個具體例中,我們確立設計原則以及建構方法,EGF結構域是融合在血栓溶解蛋白質的C-端側,藉由首先融合編碼相關部分(血栓溶解-EGF 4、5、6)的寡核苷酸段而使得轉譯自血栓溶解蛋白質開始並且在EGF的第6結構域終止,之後在表現系統中表現該寡核苷酸雜合段、純化該雜合物並且測試其胞漿素原活化以及凝血酶抑制等。在此,經轉譯的多肽自功能活性血栓溶解蛋白質開始並且在C-末端具有EGF結構域,因此亦具有抗凝血酶能力與蛋白質C活化能力。亦揭示製備功能性多肽的設計,其中嵌合多肽在開始時是失活的,但在以胞漿素或凝血酶蛋白溶解截短(proteolytic truncation)後立即獲得其胞漿素原活化力。
在本發明的另一個具體例中揭示一種血栓溶解蛋白質,其包含具有一或多個胺基酸置換、插入、刪除或截短的鏈球菌激酶,且其中該構造具有胞漿素原活化活性、凝血酶抑制活性以及抗凝血蛋白質C路徑活化能力。
另一個具體例包含製備N-端與C-端融合構造的方法,其中該血栓溶解蛋白質同時在血栓溶解蛋白質的N-端與C-端處含有3個EGF結構域。這些構造是借助表現經由共同的限制位點連結之具有N-端與C-端EGF 4、5、6融合構造的寡核苷酸段並使用已建立的基因選殖方法等來設計。
在又另一個具體例中,揭示在血栓溶解劑(諸如鏈球菌激酶以及組織型胞漿素原活化因子)中設計帶有EGF結構域的蛋白質內融合物。
在另一個具體例中,雜合/融合構造具有組織型胞漿素原活化因子,其中該等EGF 4、5、6結構域取代tPA的丹麥餅構造1結構域(kringle 1 domain)。這個構造表現出良好的胞漿素原活性以及抗凝血酶特性。
另一個具體例揭示EGF結構域的耐氧化形式(oxidation resistant forms),其中在具有血栓溶解劑(SK、tPA與SAK)之N-端、C-端或N-端與C-端(同時)融合構造(前節中所述)中,EGF 4、5、6的甲硫胺酸經由已建立的定點突變法被纈胺酸、丙胺酸或麩胺酸胺基酸殘基所取代。
在本發明的又另一個具體例中揭示凝血調節素EGF 4、5、6結構域,其融合於該鏈球菌激酶的α結構域與β結構域之間或β結構域與γ結構域之間,或鏈球菌激酶衍生物或類似物的α結構域與β結構域之間或β結構域與γ結構域之間,其中該鏈球菌激酶衍生物或類似物含有一或多個突變、添加、插入或截短,且其中該構造活化胞漿素原、抑制凝血酶並活化抗凝血蛋白質C路徑。
在本發明的另一個具體例中揭示一種構造,其中EGF 4、5、6結構域於選自下列的一或多個位置處框架內融合至鏈球菌激酶或鏈球菌激酶衍生物或類似物:鏈球菌激酶N-端、鏈球菌激酶C-端、鏈球菌激酶N-端與C-端或在鏈球菌激酶的結構域間位置。
在本發明的又另一個具體例中揭示一種嵌合蛋白質構造,其中該鏈球菌激酶衍生物橫跨殘基5-383或5-414。
在本發明的又一個具體例中揭示一種嵌合蛋白質構造,其中該鏈球菌激酶衍生物橫跨殘基16-383。
在本發明的又另一個具體例中揭示一種嵌合蛋白質構造,其中EGF 4、5、6結構域框架內融合在選自於下列的一或多個位置處:鏈球菌激酶N-端、鏈球菌激酶C-端、或鏈球菌激酶N-端與C-端兩者,其中EGF 4、5、6結構域的Met 41被纈胺酸、丙胺酸或麩胺酸所取代;或C-端Met 435被纈胺酸、丙胺酸或麩胺酸所取代;或在N-端與C-端融合構造中,Met 41以及Met 435同時獨立地被纈胺酸、丙胺酸或麩胺酸所取代。
在本發明的另一個具體例中揭示一種嵌合蛋白質構造,其進一步包含轉麩胺酸醯胺基酶辨識序列(transglutaminase recognition sequences)。
在本發明的又一個具體例中揭示一種嵌合蛋白質構造,其在EGF 4、5、6結構域與血栓溶解蛋白質或其衍生物或類似物的接合處進一步包含一或多個凝血酶可切割序列(thrombin cleavable sequence)。
在另一個具體例中,該等雜合/融合構造在EGF 4、5、6及其耐氧化形式的接合處含有一個凝血酶可切割位點。
在另一個具體例中,含有EGF 4、5、6結構域的該雜合/融合構造因為在其製備期間甲硫胺酸氧化且之後喪失活性而被突變成具有氧化耐受性。
在本發明的另一個具體例中揭示一種嵌合蛋白質構造,其包含凝血調節素的EGF 4、5、6結構域在組織型胞漿素原活化因子(tPA)衍生物、類似物或片段的N-端處、在tPA衍生物、類似物或片段的C-端處、在tPA衍生物、類似物或片段的兩端處,或在tPA衍生物、類似物或片段內部處融合至tPA衍生物、類似物或片段。
在本發明的又另一個具體例中揭示一種嵌合蛋白質構造,其中該EGF 4、5、6結構域與tPA衍生物、類似物或片段之間的融合物進一步含有一或多個連接子片段。
在本發明的又一個具體例中揭示一種嵌合蛋白質構造,其中該一或多個連接子片段含有一或多個會增進該構造之彈性的胺基酸。
在本發明的又另一個具體例中揭示一種嵌合蛋白質構造,其中該一或多個胺基酸是選自於由下列所構成之群:Gly、Asn、Pro、Ser、Gln、Arg以及Lys。
在本發明的另一個具體例中揭示一種嵌合蛋白質構造,其中該tPA衍生物、類似物或片段含有一或多個突變、添加、插入或截短,且其中該tPA衍生物、類似物或片段會活化胞漿素原、抑制凝血酶並活化抗凝血蛋白質C。
在本發明的又另一個具體例中揭示一種嵌合蛋白質構造,其含有組織型胞漿素原活化因子(tPA)的片段,或其截短或經修飾形式融合至一或多個凝血調節素EGF 4、5、6結構域,使得tPA的EGF結構域被一或多個凝血調節素EGF 4、5、6結構域所取代,且其中該構造具有抗凝血酶活性以及胞漿素原活化活性。
在本發明的又一個具體例中揭示一種嵌合蛋白質構造,其含有組織型胞漿素原活化因子(tPA)的片段,或其截短或經修飾形式融合至一或多個凝血調節素EGF 4、5、6結構域,使得tPA的丹麥餅構造1以及EGF結構域被一或多個凝血調節素EGF 4、5、6結構域所取代,且其中該構造具有抗凝血酶活性以及胞漿素原活化活性。
在本發明的又另一個具體例中揭示一種嵌合蛋白質構造,其中該等tPA EGF結構域以及丹麥餅構造1結構域在該tPA片段的N-端或C-端處被一或多個凝血調節素EGF 4、5、6結構域所取代。
在本發明的另一個具體例中揭示一種嵌合蛋白質構造,其在tPA片段或其截短或經修飾形式與凝血調節素EGF 4、5、6結構域之間進一步包含一或多個連接子片段,該等連接子片段包含會增進構造彈性的胺基酸殘基,使得該構造具有凝血酶抑制力、蛋白質C活化力以及胞漿素原活化力。
在本發明的又另一個具體例中揭示一種嵌合蛋白質構造,其中EGF 4、5、6組分的甲硫胺酸41被丙胺酸、纈胺酸或麩胺酸所取代。
在本發明的又一個具體例中揭示一種嵌合蛋白質構造,其包含框架內融合至葡萄球菌激酶(SAK)的N-末端或C-末端之凝血調節素的EGF 4、5、6結構域。
在本發明的又另一個具體例中揭示一種嵌合蛋白質構造,其中凝血調節素EGF 4、5、6結構域的甲硫胺酸41被丙胺酸、纈胺酸或麩胺酸所取代。
在本發明的另一個具體例中揭示一種嵌合蛋白質構造,其在SAK與EGF 4、5、6結構域區之間進一步包含凝血酶可切割序列。
在本發明的又另一個具體例中揭示一種嵌合蛋白質構造,其進一步包含轉麩胺酸醯胺基酶交聯序列。
在本發明的另一個具體例中揭示一種嵌合蛋白質構造,其中該等構造可溶於水溶液或食鹽水溶液。
在本發明的另一個具體例中,該等重組型嵌合蛋白質是受到嚴密調節之啟動子所調控而由質體表現。
在本發明的一個具體例中,不同的嵌合構造是透過重組型DNA技術在適當宿主(諸如細菌、真菌、酵母菌或動物細胞)中表現。
在本發明的另一個具體例中揭示一種嵌合蛋白質構造,其被分泌至細胞外培養基中。
在另一個具體例中,組織型胞漿素原活化因子以及EGF 4、5、6融合構造在原核生物宿主以及真核生物宿主中表現,由該等宿主收取多肽以獲取呈純化形式之活性離合構造。
在另一個具體例中,各種具有EGF構造之組織型胞漿素原活化因子融合物亦在例如動物細胞株、酵母菌表現系統以及植物細胞的真核生物系統中表現,其中表現匣(expression cassette)被併入宿主基因體中或作為游離基因體(episomal body)存在於細胞質中。被表現的雜合蛋白質也可以依據用於表現的宿主而被醣化或非醣化。
在本發明的另一個具體例中揭示一種在哺乳動物中治療血栓的方法,其包含對該需要治療的哺乳動物投與治療有效量的嵌合蛋白質構造。
在本發明的另一個具體例中揭示一種抑制凝血酶的方法,其包含使用嵌合蛋白質構造。
在本發明的又一個具體例中揭示一種活化蛋白質C的方法,其包含使用嵌合蛋白質構造。
在本發明的又另一個具體例中揭示一種提供抗凝血酶以及胞漿素原活化的方法,其包含使用嵌合蛋白質構造。
在本發明的另一個具體例中揭示一種藥學調配物,其包含藥學有效量的嵌合蛋白質構造。
在本發明的另一個具體例中揭示一種在哺乳動物中溶解血栓的方法,其包含對該需要的哺乳動物投與治療有效量的嵌合蛋白質構造。
在另一個具體例中,針對適當的表現宿主將雜合構造的編碼DNA序列予以最適化。
在另一個具體例中,一核酸序列編碼上述嵌合蛋白質構造。
在另一個具體例中,載體包含核酸序列。
在另一個具體例中,宿主細胞包含載體。
在另一個具體例中,嵌合蛋白質構造是藉由在宿主細胞表現系統中表現編碼該蛋白質的核酸序列來製備。
在另一個具體例中,製備嵌合蛋白質構造的方法是藉由在宿主細胞表現系統中表現編碼該蛋白質的核酸序列。
在另一個具體例中,該方法中的宿主細胞表現系統是一種真核生物表現系統。
在另一個具體例中,該方法中的宿主細胞表現系統是一種細菌表現系統。
在另一個具體例中,該方法中的細菌是大腸桿菌。
在另一個具體例中,該方法中的真核生物表現系統是動物細胞或酵母菌細胞。
在另一個具體例中,該方法中的酵母菌是畢赤巴斯德酵母菌(Pischia pastoris)。
在該方法的另一個具體例中,其中該嵌合蛋白質構造由宿主細胞被分泌至細胞外培養基中。
在另一個具體例中,經純化的構造可作為用於治療具有不同血栓性病況之哺乳動物的治療劑以及醫藥組合物。哺乳動物可以是人類、齧齒動物或經馴養的動物。
在另一個具體例中,經純化的構造作為治療劑在有或沒有其他安定劑以及賦形劑的情況下減緩不同循環疾病。
依據本發明的另一個具體例,經純化的構造被調配成一或多種醫藥組合物。具有經純化構造(不論是一或兩種)的醫藥組合物可以調配成固體形式(亦即在小瓶中冷凍乾燥以便在之後於適當溶液中還原)或液體形式。
在一個特定具體例中,這些具有經純化構造的組合物組成用於血栓溶解療法或治療的套組,其可視情況包括其他組分,諸如:具有用以還原活性成分之溶液的容器、套管、具有生理血漿的滴液袋以供靜脈內施用以及使用指南等。
醫藥組合可以調配成組合形式(亦即,其中所有活性成分合併成一個調配物)並且以組合形式使用,或調配成下列獨立形式(亦即,其中活性成分並未合併(或未全部合併)成一個調配物)並且以下列獨立形式使用:錠劑、膠囊或酏劑以供經口投藥;栓劑以供直腸投藥;無菌溶液、懸浮液以供注射投藥;以及類似者。將視如患者體重、飲食、目前治療以及其他習於醫藥技藝者所認定的因素來量身設計投藥的劑量以及方法,俾以達到最適效力。
就本發明的經純化構造而言(包括用途、方法、醫藥組合物以及產物),通常投與0.1至1000 mg(做為單一劑量或多劑量,以恰如所需為基準)的數量,端視所用經純化構造的效力而定。
較佳具體例涵括為貯存以及之後投藥所製備的醫藥組合物,其含有治療有效量的經純化構造或一種富含經純化構造的組合物,如本文所述配於醫藥上可接受的載劑或稀釋劑中。供治療之用的可接受載劑或稀釋劑在醫藥技藝中為已知的,且例如描述於Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.(A. R. Gennaro edit. 1985)中。
在醫藥組合物中可提供防腐劑、安定劑、染料以及甚至調味劑。舉例而言,可添加苯甲酸鈉、山梨酸以及對羥基苯甲酸的酯類作為防腐劑。此外,可使用抗氧化劑以及懸浮劑。
在活體內組合療法中使用經純化構造或其醫藥組合物或產物時,組合物/產物可以不同方式採不同劑量形式被投與哺乳動物,包括非經口(例如靜脈內、皮下、肌肉內、結腸內、直腸內、鼻內、頰內、穿皮、陰道內或腹膜內)。
如同對於熟悉該技藝者來說清楚的是,被投與的可用活體內劑量以及特定投藥模式將隨著待治療的哺乳動物物種、採用的特定組合物以及使用這些組合物的特定用途而改變。決定有效劑量含量(亦即達到所欲結果必須的劑量含量)將落在習於該技藝者的範圍內。通常建議以低劑量含量施用組合物,增加劑量含量直到達至所欲效用。
一般而言,為了實施本發明方法,有關經純化構造或醫藥組合物的劑量可視所欲效用以及治療適應症而有廣泛範圍。經純化構造的適當劑量通常介於約0.1與1000 mg之間,較佳地介於約10與500 mg之間,更佳地介於約10與150 mg之間,最佳地介於約10與120 mg之間。較佳的是非經口投藥,諸如靜脈內。投藥亦偏好以單一劑量或多劑量的方式,以恰如所需為基準。
可以習知形式如液體溶液或懸浮液、適用溶液或懸浮液之在注射前配於液體中的固體形式,或如乳劑來製備注射劑。
適當的賦形劑為,例如水/食鹽水、右旋糖、甘露醇、乳糖、卵磷脂、白蛋白、麩胺酸鈉、半胱胺酸鹽酸鹽(cysteine hydrochloride)或類似物。此外,若需要的話,可注射醫藥組合物可含有少量無毒輔助物質,諸如濕潤劑、pH緩衝劑以及類似物。若需要的話,可使用吸收促進製劑(例如脂質體)。
關於非經口投藥,可採用與本發明所用相同之配於芝麻油或花生油或水性丙二醇中的醫藥活性劑溶液。若需要的話,水溶液可經適當緩衝(較佳地介於pH 4至pH 9),且液體稀釋劑先提供等滲壓。
舉例而言,NIF以約為7的pH使用於水溶液中。但是,NIF在水溶液低至約pH 4時仍是安定的。偏好的〞夥伴化合物(partner compound)〞tPA(或其變異體)通常以約pH 5使用於水溶液中。這些水溶液適於供靜脈內注射之用。油溶液適於供關節內、肌肉內以及皮下注射之用。所有這些溶液製劑在無菌條件下按照習於該技藝者所熟知的標準醫藥技術可容易完成。
應注意,本發明的醫藥組合物以及產物在還原之前可凍乾以供貯存,而之後使用習於技藝者所熟知的方法投藥。不論是以凍乾物或其他方式貯存,本發明組合的活性組分在凍乾之前或復原之後被混合在一起(供用於稍後共投藥)或個別貯存(供稍後同時、分開或依序投藥)。
在一個特定具體例中,投藥為非經口(例如藉由靜脈內注射)或局部投藥(藉由導管插入法(catheterization))以供在鄰近血塊處原位投藥。
存在於本發明提供之醫藥組合的組合物中的經純化構造數量可在一個廣泛範圍內變化,但永遠落在治療有效量以內。
關於每次使用本發明醫藥組合之組合物的血栓溶解治療步驟的劑量將視許多因素而定,包括患者年齡、病況、待治療之臨床病況的嚴重性、每次投藥以及要投藥之經純化構造的路徑和頻率。
在一個態樣中,本發明是有關於一種如上所述之用於血栓溶解療法的發明醫藥組合或一種套組。
在另一個其他態樣中,本發明亦有關於一種治療方法以及血栓溶解療法,其包括對患者投與治療有效量的一或多種經純化構造。就此,依據本發明的組合物特別適於治療缺血性心臟病及其併發症,和缺血性大腦中風、類風濕性疾病與其他病因為發生發炎反應、組織缺血、血液學與血管微循環因為栓塞而失調的病理學。
本發明揭示組織型胞漿素原活化因子與凝血調節素之EGF 4、5、6結構域以及一個含有6個胺基酸之連接子序列的融合構造。可改變或調整這個連接子序列長度與胺基酸序列次序以使得兩種特性的功能達到最佳。與設計有連接子的構造相較之下,最初設計的構造不具有連接子序列,其蛋白質C活性僅有包含最佳化連接子之不同構造的一小部分(約20-25%)。
在另一個具體例中,本發明揭示透過遺傳工程標準方法來製備編碼非天然融合蛋白質之基因段及其變異體的方法。
此外,蛋白質間融合連接子序列在EGF 4、5、6結構域與胞漿素原活化因子組分間的接合位點處較佳含有3或更多個甘胺酸胺基酸殘基,藉此提供在蛋白質C結合及活化時扮演重要角色之EGF的第4結構域必須之彈性。相同地,當在tPA的N-端區處融合時,連接子正好位在EGF的第6結構域之後而能夠促進凝血酶結合。特別是當EGF 4、5、6被引入組織型胞漿素原活化因子的有序構造/結構域之間時。因此,當兩個夥伴被融合而保有夥伴蛋白質的功能性時,連接子的角色是明確的。
連接子序列是以1個帶正電荷胺基酸(離胺酸或精胺酸)與1個Val殘基這樣一種前後的方式來選定(但是要在2個或3個甘胺酸殘基之前),使得其於溶解期間在極可能形成短暫凝血酶的血塊鄰近處被胞漿素切割,且兩個結構域可以在損傷處獨立執行其工作。
連接子亦含有脯胺酸胺基酸,脯胺酸胺基酸實際上有助於改變EGF 4、5、6結構域的位向,使得它們在結合凝血酶與活化蛋白質C時能達到最佳作業。
在另一個具體例中,所設計的構造連接子長度可以增加或減少,而胺基酸序列可使用天然以及非天然胺基酸予以更換而對活化速率產生影響。
在另一個具體例中,在不影響血纖維蛋白溶解功能與抗血栓功能的情況下,可將凝血酶可切割序列、轉麩胺酸醯胺基酶辨識序列以及其他受血液蛋白酶影響的位點引入連接子中。
在另一個具體例中,本發明揭示不同融合多肽及其較佳變異體的表現與純化方法。
在另一個具體例中,本發明揭示不同的非天然多肽,其顯示血栓溶解劑以及抗凝血酶的合併特性與蛋白質C抗凝血特性。
在另一個具體例中,將EGF 4、5、6的耐氧化形式與組織型胞漿素原活化因子的功能增進變異體(相較於天然tPA(例如DNA SEQ ID 20),其具有突變變異)融合。
在另一個具體例中,將EGF 4、5、6的耐氧化形式與鏈球菌激酶的耐胞漿素形式融合。
在另一個具體例中,將EGF 4、5、6的耐氧化形式與血栓溶解蛋白質融合,其中一或多個半胱胺酸殘基是游離的。
在另一個具體例中,所表現的融合多肽用於治療心血管疾病。
在另一個具體例中,適合的醫藥組合物具有經表現融合多肽以及FDA所核可的化學安定劑(例如甘露醇)、人類血清白蛋白(HSA)等以及助溶劑。
調配成供靜脈內投藥給人類的經表現融合構造可含有FDA所核可的安定劑。
在另一個具體例中,EGF 4、5、6及其變異體可與尿激酶型胞漿素原活化因子融合。
在另一個具體例中,不同的EGF融合構造可使用與SK、tPA以及SAK顯示有75-100%同源性以及相較於其天然蛋白質顯示50-100%胞漿素原活化潛力的彼等蛋白質來製備。
在另一個具體例中,EGF 4、5、6變異體與SK、tPA以及SAK融合,其中EGF 4、5、6變異體相較於經獨立表現的天然EGF 4、5、6結構域表現75-100%同源性/相似性以及50-100%抗凝血酶活性與蛋白質C活性。
EGF 4、5、6結構域序列是人類凝血調節素cDNA之EGF 4、5、6結構域序列的商業客製化合成序列(GeneScript Inc.,USA),供用於在酵母菌畢赤巴斯德酵母菌中的最佳表現。合成基因段以正確順序接合並於細菌質體中選殖。凝血調節素的EGF 4、5、6結構域與血栓溶解劑(例如SAK、SK或tPA)(或其衍生物/突變體)之間的融合構造基本上是藉由合併下列來進行:(a)使用化學法的慣用基因合成法與(b)使用已建立的PCR技術利用特別設計的引子由適當質體中獲得選定基因段(參見實施例中使用的方法,下文),接著藉由分離經PCR生成的基因段並且使用特化PCR法(諸如重疊延伸PCR等)將它們框架內〞融合〞。一般而言,慣用PCR是使用適當的高持續性(processivity)熱安定DNA聚合酶(Fermantas Inc.或Stratagene Inc.的Pfu DNA聚合酶)或高保真度(fidelity)pfu加速(Stratagene Inc.)酵素來完成。雜合DNA構造藉由轉形至適當大腸桿菌菌株XL-Blue而在以T7 RNA聚合酶啟動子為基礎的表現載體pET-23d(用於慣常質體次選殖而不會有伴隨蛋白質表現)以及大腸桿菌菌株BL21(DE3)(用以在有T7 RNA Pol啟動子的情況下表現蛋白質)(得自於Novagen InC.(Madison,WI,USA))中選殖/表現,而且亦受制於甲醇誘導啟動子在具有質體pPIC-9K之框架內α交配因子訊號序列之酵母菌(畢赤巴斯德酵母菌)中表現,而GS115細胞(Invitrogen Life Technologies,California,USA)用於表現。各種限制核酸內切酶、T4 DNA接合酶以及其他DNA修飾酵素是得自於New England Biolabs(Beverly,MA)。寡核苷酸引子是由Biobasic,Inc.,Canada所提供。使用得自於Qiagen GmbH(Germany)的套組自瓊脂糖凝膠純化DNA並且萃取經PCR擴增的產物。使用螢光染料的自動DNA定序是在配設有16毛細管裝置的Applied Biosystems 3130 x1遺傳分析儀上完成。Glu-胞漿素原是得自於Roche Diagnostics GmbH(Penzberg,Germany)或藉由親和性層析法純化自人類血漿(Deutsch and Mertz,1970)。人類蛋白質C、凝血酶、水蛭素是購自於Calbiochem.,USA,而兔的標準凝血調節素以及重組型凝血調節素皆是購自於American Diagnostica Inc.,USA。N-端氣相胺基酸定序是使用Applied Biosystems sequencer(型號491)來進行。尿激酶、EACA、氰基硼氫化鈉(sodium cyanoborohydride)以及L-離胺酸是購自於Sigma Chemical Co.,St. Louis,USA。苯基瓊脂糖6XL以及DEAE Sepharose(Fast-Flow)是購自於GE-Amersham,Uppsala,Sweden,而Ni-NTA珠粒是購自於Qiagen。所有其他試劑是最高分析級。
1. 重組型DNA融合法:各種全都被稱為重組型DNA技術的方法在分子生物學領域中是已知的。數種技術、標準程序及其經修改的形式充分說明於數本參考書中,例如Sambrook et al.,Molecular Cloning: A laboratory Manual(IInd edition,Cold Spring Harbor Press,New York.,1989;McPherson,M. J.,Quirke,P.,and Taylor,G. R.,[Ed.] PCR:A practical approach.,IRL Press,Oxford.,1991)。但在設計融合構造時,需要針對特定應用所引用的公開文獻的不同公開資料加以修改。在本發明中,我們借助Hoetal.,(Ho,Huntet al. 1989)與Mehta and Singh(Mehta and Singh 1999)的已知為重疊延伸PCR法融合兩個基因。針對擴增至高2Kb的小構造,使用pfu DNA聚合酶(Fermentas InC., USA),而針對較長的PCR需要高保真度的聚合酶作用,針對點突變建構,使用pfu加速(Stratagene)來擴增6-7 Kb長的片段擴增與定點突變法(Wang and Malcolm 1999)。
2.限制分解以及接合:限制分解以及接合酵素是得自於New England Biolabs,USA,而Fermantas InC的'快速分解'限制酵素是依據製造商的操作程序來使用。要注意在幾乎所有經Xho I(4鹼基酶(tetra base cutter))與Not I(6鹼基酶)分解之載體與插入物之間進行接合的嵌合融合建構實例中,定向選殖(directional cloning)的機率最高。
3.在E. coli XL 1B勝任細胞中接合混合物的電穿孔以及將含有線性化插入物的載體轉形至pPIC -9K中:反應的接合混合物經電穿孔至XL 1B勝任細胞(Sharma and Schimke 1996)中。依照操作指南由Qiagen的Midi prep套組製備大量DNA。在Midi製備的最後步驟時,以高鹽濃度溶離DNA,在此我們使用pH 5最終濃度為0.3 M的乙酸鈉,並使用70%乙醇來移除過量的鹽(Sambrook et al.,1989),鹽可能會干擾分解反應。按此步驟,我們得到50-60 μg的DNA用於進行線性化步驟(借助Bgl II酵素),並在分解之後再次進行乙酸鈉與乙醇沉澱步驟,而最後將經乾燥的丸粒溶解於7-8 μl經高壓釜處理的無鹽水中,而得到1-3 μg/μl的DNA。在此,7-10 μg的DNA用於轉形至畢赤巴斯德酵母菌的His- GS 115細胞的電勝任細胞中,最後平板培養在最低右旋糖培養基上,其中僅有His+轉形株生長於平板上。以能夠透過與AOX 1啟動子同源性重組而插入多複本所欲基因這樣一個方式來設計質體pPIC-9k(Ramchuran,Mateus et al.,2005)。可以透過細菌康那黴素抗性基因(Tn903)在抗生素濃度逐漸增加的情況下經由監測慶大黴素(genticin)抗性族群來監控多複本標的基因插入。畢赤酵母菌屬本身可以耐受0.25 mg/ml的慶大黴素,但0.5 mg/ml以及4 mg/ml分別顯示有1-2個複本以及7-12個複本插入。慶大黴素抗性與所欲基因的多重插入直接相關。因為基因劑量效應,可推論分泌較高的所欲基因產物對應於較高的插入數目(Norden,Agemark et al. 2011)。
4. 融合構造之包涵體(inclusion body)的表現、分離以及再摺疊:受pET 23-d控制表現數個構造(諸如EGF-SAK以及SAK-EGF),其中嵌合蛋白質以包涵體的形式累積於宿主E. coli B1 21-DE 3細胞中。當形成包涵體時,獲得最大量之經過度表現蛋白質(Misawa and Kumagai 1999;Zhang,Xu et al. 2009)。E. Coli BL21 DE3細胞用來生產嵌合融合蛋白質'IB',其中25 ml之BL21 DE3細胞生長隔夜培養物的LB(Luria Bertani)用作為初始接種源,其被轉移至500 ml LB(第二培養物)培養基。一旦OD600達到0.6-0.8,借助1 mM IPTG誘導蛋白質生產。誘導後,將細胞維持於40℃下的震盪狀態6小時。6小時培育後,藉由在4℃下以6000 rpm離心10分鐘來收取細胞。最後,以50 mM Tris、100 mM NaCl以及1 mM EDTA溶液洗滌所收取之細胞而將培養基組分自細胞塊(cell mass)移除。洗滌後,將細胞懸浮於洗滌溶液中直到最終OD600介於35-40;在這個稀釋度下,使用以探頭為主的音波器以30秒起動與結束的循環對細胞進行音波處理(sonication) 45分鐘。溶解循環完成後,藉由以12,000 rpm離心15分鐘來收取細胞團。以100 mM NaCl、50 mM Tris Cl pH 7.4、1 mM EDTA、0.1% Triton X-100以及2M含脲溶液洗滌所得細胞團2次。將這些IB再懸浮於溶液中並且藉由以12000 rpm離心15分鐘來收取。以100 mM NaCl、50 mM Tris Cl pH 7.4以及1 mM EDTA溶液洗滌所收取細胞團2次,使Triton X-100得以被移除。最後,將細胞團再懸浮於8 M脲(製備於20 mM Tris Cl pH 7.4中)以及1 mM DTT中2小時。此溶液中經溶解的大多數包涵體是藉由以12000 rpm離心20分鐘而與細胞團分離,且最終上清液含有最多的嵌合融合蛋白質。然後對這個蛋白質部分進行再摺疊,其中該蛋白質部分被稀釋成至高0.2 mg/ml並且在下列條件下再折疊:配於50 mM NaCl、50 mM Tris-Cl、2%甘油中的2 M脲、莫耳比為1.5:0.5之氧化與還原麩胱甘肽在4℃下溫和攪拌36小時。此再摺疊步驟完成後,以20 mM Tris Cl pH 7.6以及50 mM脲對混合物進行透析48小時,而經透析的反應混合物藉由使用疏水性與離子交換層析法的串聯層析法來進行純化。透過DTNB反應來監測雙硫鍵形成(Riener,Kada et al. 2002),DTNB是雙硫鍵形成以及再摺疊的一個直接指標。最後,對經純化的蛋白質進行各種活性分析。
5.關於偵測胞漿素原活化的酪蛋白-胞漿素原覆蓋(casein-plasminogen overlay):在融合構造中,於預備層次藉由本方法篩檢胞漿素原活化,其中煮沸配於含有15 mM NaCl以及50 mM Tris以及1%瓊脂糖之水中的5%(w/v)脫脂乳。冷卻後,將約200-400 μg的胞漿素原加入這個混合物中,並且覆蓋於有待篩檢菌落之含安比西林(ampicillin)的LB平板上(Malke and Ferretti 1984)。所有具胞漿素原活化力的融合重組型蛋白質可易於透過培育1-2小時到至高18小時的變化期間後的溶解區域來偵測,因為形成胞漿素會分解酪蛋白,相對於白色背景會產生視覺上易看出的透明區域。
6. 藉由檢驗胞漿素原活化態樣篩選最佳生產選殖株:透過使用慶大黴素抗性標記選定複本數目較高的轉形株(transformants)後,進行最佳生產選殖株的實際篩選。本方法中,在30℃下以2.5 ml的BMGY培養基(1%酵母菌萃取物、2%蛋白腖、1X甘油、無胺基酸的1X酵母菌氮鹼以及100 mM磷酸鉀緩衝劑pH 5.5)中培育初級培養物16-18小時。一旦光學密度(OD600)達到至高3-4單位,我們藉由添加7.5 ml的BMMY培養基(1%酵母菌萃取物、2%蛋白腖、1X甲醇、無胺基酸的1X酵母菌氮鹼以及100 mM磷酸鉀緩衝劑pH 5.5)來誘導培養物。以最終0.5 v/v%甲醇進一步誘導這些培養物5天來進行重組型生產,使得重組型融合蛋白質在受到甲醇誘導的強力啟動子作用下被生產。
7. 酶譜法(zymography):被分泌至細胞外的產物以及具有感興趣之胞漿素原活化力的所欲蛋白質帶(band)是依照本方法來偵測,其中10-12.5%SES-PAGE凝膠是在非還原樣品緩衝液中進行。完成後,藉由在2.5% triton X-100溶液中洗滌來移除過量的十二基硫酸鈉。之後,以50 mM Tris(pH 7.4)沖洗此凝膠2-3次。將經洗滌的凝膠置放於含有脫脂乳瓊脂糖以及胞漿素原的固體表面(瓊脂凝膠)上。培育5-7小時後,產生的溶解區域變得可見,這表示所分析的蛋白質中有胞漿素原活化力。
8. 西方墨點技術:借助西方墨點偵測所欲蛋白質。所有從畢赤巴斯德酵母菌細胞被分泌到細胞外培養基的融合構造是借助以6000 rpm離心被分離,且取出上清液對所欲產物進行鑑別。上清液本身直接取來用於西方墨點,或先藉由5 KDa或10 KDa臨界範圍(cut off range)濃縮器(Amicon)進行濃縮或進行三氯乙酸沉澱、以丙酮洗滌並且加載至10-12.5% SDS聚丙烯醯胺凝膠上。借助含有25 mM tris、175 mM甘胺酸以及20%甲醇的轉移緩衝液(Transfer buffer)將蛋白質轉移至硝基纖維素膜上。以250 mA將凝膠點漬於膜上35分鐘。在4℃下將經點漬的膜浸於10%脫脂乳過夜或在37℃下培育2小時。進一步以含有0.1% tween-20的磷酸鹽緩衝食鹽水洗滌此墨點3次以移除過量脫脂乳。之後,使用一級抗體或多株抗體以建議稀釋度覆蓋墨點1小時並以含有Tween-20的PBS洗滌3次。此外,以接合HRP的二級抗體培育墨點,之後以PBS洗滌3次。最後,藉由添加DAB(二胺基聯苯胺)溶液使墨點顯影。
9. 離胺酸-瓊脂糖層析法:各種帶有EGF 4、5、6的組織型胞漿素原活化因子融合構造含有丹麥餅構造結構域,丹麥餅構造結構域已知與離胺酸殘基的親和性有關(McCance,Menhart et al. 1994;Ye,Rahman et al. 2001)。本方法中,以磷酸鹽緩衝液pH 7.5對自畢赤巴斯德酵母菌發酵所得到的上清液(其具有組織型胞漿素原活化因子融合多肽)進行透析3-4小時,並且以大約0.5 ml/分的緩慢流速加載至預先經磷酸鹽緩衝液平衡的離胺酸-Sepharose管柱(購自於Amersham Biosciences,Uppasala,Sweden)。加載完成後,再次以4-5倍柱床體積(bed volume)的磷酸鹽緩衝液洗滌管柱,而最後以0.3 M ε胺基己酸與100 mM NaCl溶液溶離蛋白質(Qiu,Swartz et al. 1998)。
10.凝血酶親和性層析法:凝血酶偶合是藉由先前所述的操作步驟(Salem,Maruyama et al. 1984)在經溴化氰活化的珠粒上進行。在此,由不同純化步驟所得到的蛋白質最後進行凝血酶親和性層析法,其中管柱經50 mM TrisCl pH 7.4平衡並且以50 mM Tris Cl pH 7.4來進行透析供用於以大約0.5 ml/分的低流速來加載;加載完成後,以相同的緩衝液洗滌管柱。最後,藉由逐漸增加NaCl的梯度來溶離蛋白質(Salem,Maruyama et al. 1984)。測試不同蛋白質溶離份的蛋白質C活化力。
11.疏水性交互作用層析法:依據不同的層析法來進行EGF-SK、EGF-tPA以及EGF-SAK的各種融合基因構造的純化,其中疏水性以及離子交換層析法用做為各種融合多肽的慣常純化法(Goyal,Sahoo et al. 2007)。在疏水性層析法中,平均粒徑為100-300 μM大小直徑的6%經交聯苯基sepharose珠粒用於製備管柱。借助蠕動泵裝填簡易XK16/20管柱(Amersham Biosciences,Uppasala,Sweden),做出約25 ml苯基sepharose柱床並且以4-5倍柱床體積的0.3 M NaCl以及50 mM tris予以平衡,在畢赤巴斯德酵母菌發酵期間一起同時獲得的上清液(含有所欲融合構造)保存在與透析的平衡緩衝液相同的緩衝強度以及鹽組分中。經平衡的上清液以40 ml/小時的流速被加載至裝填管柱內,且在上清液加載完成後,通入4-5倍柱床體積的平衡緩衝液以移除培養基組分與非特異性結合雜質,而最後所欲的融合多肽溶離於水中。經溶離蛋白質進行第二回合的純化(參見下文),並測試胞漿素原活化、凝血酶抑制以及蛋白質C活化分析。
12.DEAE(二乙基胺基乙基)離子交換層析法:在這個層析步驟中,將DEAE SepharoseTM fast flow裝填於XK 16/20管柱(Amersham Biosciences,Uppasala,Sweden)內,且大體上是遵循製造商的操作指南,其中主要來說,20 ml膨脹基質用於裝填。此管柱是以20 mM Tris Cl緩衝液pH 7.4平衡,而由畢赤巴斯德酵母菌所得到的上清液在以20 mM Tris Cl緩衝液pH 7.4充分透析(在不同次中)後被加載至經平衡的管柱內,或在藉由疏水性交互作用層析法(上文)純化後,以其維持在與平衡緩衝液相同離子強度的情況下被加載至個別管柱內。加載完成後,以4-5倍柱床體積的平衡緩衝液洗滌各個管柱,這會有助於移除非特異性或結合鬆散的雜質與多肽。溶離蛋白質是藉由施用梯度逐漸增加的1 M NaCl超過基質的5倍柱床體積而完成。蛋白質量子化是借助布萊德福法(Bradford method)完成(Bradford 1976)並與BSA的標準曲線相比較。最後,經純化蛋白質是使用20 K Da臨界濃縮器(Amicon)予以濃縮並用於各種分析性與功能性測定。
13. EGF-血栓溶解融合構造的胞漿素原活化分析:所有嵌合融合多肽構造含有血栓溶解組分(SK、SAK以及tPA),所以藉由有關胞漿素的發色肽基質釋出顏色來測定這些構造活化胞漿素原的能力。鏈球菌激酶以及所有融合構造的一階段測定是在使用2 μM人類胞漿素原、50 mM Tris、0.05% BSA以及5 mM發色基質的條件下進行,而發色基質的釋放是以時間為函數使用分光光度來監測。然後是非線性迴歸,因此做出吸光值相對於時間平方的圖以及直線方程式。鏈球菌激酶立即開始將胞漿素原轉換成胞漿素且實際上在活化方面沒有顯示延遲的現象,但在一些融合構造中有延遲現象,其延長時間來將胞漿素原活化成胞漿素。這表示,微量胞漿素會在胞漿素原酶原活化成為胞漿素(路徑1)時使得活化複合物變得不活化。這證實當逐步添加微量(奈莫耳)外源性胞漿素會逐漸地降低緩滯時間。在組織型胞漿素原活化因子活化胞漿素原的情況下,採取使用簡易發色肽(H-D-Val-Leu-Lys-pNA;S-2251;購自於Chromogenix Inc.)來偵測因為組織型胞漿素原活化因子作用而形成胞漿素的快速簡易分光光度法(Verheijen,Mullaart et al. 1982)。本方法亦用於在血纖維蛋白存在下評估胞漿素原活化增強以及組織型胞漿素原活化(van Zonneveld,Veerman et al. 1986)。在這個活化分析中,不同純化量的蛋白質數量在有及沒有可溶性血纖維蛋白(購自於American Diagnostics,USA)存在且沒有血纖維蛋白的情況下與所用2 μM胞漿素原、0.05 M Tris Cl pH 7.2、100 mM NaCl、0.05%以及0.5 mM S-2251培育。在405奈米下以1分鐘間隔時間監測吸光值至高2小時。
14. 不同融合構造的凝血時間實驗:為了解有不同嵌合構造存在下對於凝血酶誘導血塊形成的影響,以不同凝血酶濃度製作標準曲線,由該標準曲線得到20秒凝血時間相對於6.6 IU凝血酶。之後將等量凝血酶與濃度逐漸增加的構造一起培育以測量與對照相較之下凝血時間倍增時的濃度(Lougheed,Bowman et al. 1995)。
15. 不同融合/嵌合構造的蛋白質C活化:以劑量依賴型的方式對組織型胞漿素原活化因子、葡萄球菌激酶以及鏈球菌激酶的不同融合構造進行凝血酶媒介的蛋白質C活化分析。此分析中,在有50 mM Tris-Cl、5 mM CaCl2以及0.05% BSA存在下於37℃下將不同量的蛋白質(nM範圍內)與10 nM凝血酶一起培育20分鐘。這段時間後,將0.5 μM蛋白質C加入孔(well)中並且在25℃下培育20分鐘。之後,加入0.5 mM水蛭素以抑制凝血酶並在25℃下繼續培育5分鐘,且接著以0.5 mM的最終濃度加入發色基質,並如先前詳細說明般相對於時間在405 nm下監測有色pNA的釋放(Eisenberg,Miletich et al. 1988;Ewald and Eisenberg 1995;Lougheed,Bowman et al. 1995;Meininger,Hunter et al. 1995;Dahlback and Villoutreix 2005)。
以下實施例是用於說明本發明,因此不應被解釋為囿限本發明之範疇。
(i)表現框架內融合至SK編碼開放閱讀框架(open reading frame,ORF)上游的EGF結構域的雜合基因構造:編碼EGF-SK蛋白質融合物的雙股(ds)DNA段(DNA block)(其中EGF 4、5、6編碼序列框架內融合於SK ORF的N-端編碼側處)是使用引子N_EGF_SKFp 1以及N_EGF_SK Rp 2(參見表1的引子序列)所建構。細菌表現載體pET 23-d_SK的設計與建構已由Nihalani et al.,1998描述。其涉及由類馬鏈球菌(Streptococcus equisimilis)H46A將SK基因選殖至pBR 322中(Pratap et al.,1996),接著次選殖至pET-23d(一種含有噬菌體T7主要殼蛋白質之高效率核糖體結合位點的表現載體)(Studier and Moffatt,1986),且進一步修飾該基因的5’端而將形成二級構造的傾向降至最低。pET-23-d _SK構造所表現的鏈球菌激酶為Met-SK。更多細節描述於美國專利第7,163,817號中。此構造用作為擴增SK基因的模版(DNA SEQ ID 1,而對應蛋白質為SEQ ID113)。
使用對應於序列ID 2的合成基因(DNA多核苷酸)作為模版來選擇性地擴增對應於EGF 4、5、6結構域的雙股多核苷酸段(SEQ ID 2,而對應蛋白質為SEQ ID 111),該多核苷酸段是藉由客製化DNA合成所製備,而且在選殖至pET 23-d(Novagen)載體後藉由自動化DNA定序被證實為序列ID 2。引子N_EGF_SK Fp1在其5'端亦含有1個Xho I限制位點(參見表1的引子詳細說明),使得在PCR後得到之所形成基因段可以錨定至酵母菌表現質體中。引子N_EGF_SK Rp 2在5'端含有序列(除了與EGF 4、5、6的第6結構域末端雜交的核苷酸以外)以及其他與SK基因ORF的5側黏合的核苷酸。PCR循環條件如下:熱起始,在95℃下完全變性5分鐘;在95℃下變性45秒鐘,繼而在45℃下黏合45秒鐘、在72℃下延伸1分鐘,總計28個循環,而最後在72℃下延伸10分鐘以完成擴增任何不完整的PCR產物。為擴增SK基因段,使用引子N_EGF_SK Fp 3(上游)以及引子N_EGF_SK_Rp 4(下游引子)(參見表1的引子詳細說明)。PCR條件如下:PCR條件:熱起始,在95℃下完全變性5分鐘,在95℃下變性45秒鐘,在45℃下黏合45秒鐘,在72℃下延伸3分鐘,總計28個循環,而最後在72℃下延伸10分鐘以完成擴增任何不完整的PCR產物。兩種PCR產物是藉由凝膠萃取純化套組(Qiagen)從瓊脂糖凝膠純化。將這兩種經純化PCR產物進行剪接重疊延伸(Splice Overlap Extension,SOE)PCR(詳情參見上文的"實施例中使用的一般方法"節)以建構連續EGF 4、5、6-SK雜合基因構造,其中EGF 4、5、6編碼序列與SK基因編碼序列框架內融合,而結束為終止密碼子。這個基因段是以純化形式從瓊脂糖凝膠中分離出來,且以Xho I與Not I限制酵素(R.E.酵素)分解並接合至經相同剪切的pET 23-d質體載體(參見圖1A與圖2A)中,其接而轉形至E. coli XL1B(rec A-與end A-)細胞中,儘管質體DNA會在該等細胞中增殖,但不會表現多肽。對這個質體進行桑格二去氧定序法(Sanger's di-deoxy method of sequencing)以評估EGF & SK組分的DNA序列正確地融合(SEQ ID NO4,而對應蛋白質為SEQ ID 112)。在這個構造中,經Xho I與Not I分解的匣(Xho I and NotI digested cassette)是由瓊脂糖凝膠中分離出來並且"錨定"至pPIC-9K中。在這個所形成構造中,上游EGF 4、5、6序列和α分泌訊號序列以及Kex2處理位點是位於框架內,使得雜合基因構造,EGF-4、5、6-SK在併入宿主基因體之後受制於載體中的酒精氧化酶啟動子而在畢赤巴斯德酵母菌(菌株GS115)中表現(Norden,Agemark et al. 2011)。此表現載體所表現的雜合多肽亦有效率地被運送穿過細胞膜(參見下面實施例)而且能夠以純化形式在那裡被分離出來。
(ii)建構SK-EGF 4、5、6編碼基因構造,其中EGF 4、5、6編碼結構域框架內融合於SK編碼基因的下游/C-端編碼端處:藉由使用SK_EGF Fp1(上游)以及SK_EGF Rp2(下游)引子組(參見表1的引子序列),以pET23-d-SK質體作為模版擴增對應於SK的核苷酸序列(DNA SEQ ID 1,而對應蛋白質為SEQ ID 114)(參見〞實施例中使用的一般方法〞)。引子SK_EGF Fp1在其5'端含有1個Xho I限制位點,而SK_EGF Rp2在其5'端含有至高1149 bp的SK序列,之後為三甘胺酸(Gly-Gly-Gly)編碼段,以及轉麩胺酸醯胺基酶辨識編碼序列,而結束為與EGF 4、5、6的第4結構域的5'端編碼重疊的序列。所形成基因段在其5'端含有相同的Xho I限制位點,且下游(3'-端)含有第4結構域的重疊核苷酸序列。在第2次PCR中,使用SK_EGF Fp3以及SK_EGF Rp4(參見表1的引子序列)引子組來擴增作為模版之pET23-d_EGF4,5,6(含有合成的客製化EGF 4、5、6基因)的EGF 4、5、6結構域。引子SK_EGF_Fp3含有SK的下游序列(至高1149 bp),繼而為三甘胺酸密碼子段以及在5'端的轉麩胺酸醯胺基酶辨識位點編碼序列;另一個引子,亦即SK_EGF_Rp4在其5'端含有EGF 4、5、6之第6結構域末端的部份序列以及1個Not I限制位點。PCR後,藉由使用這個引子組而得到的所形成基因段2在其5'端(上游)SK的第1149個bp,繼而為三甘胺酸編碼序列以及轉麩胺酸醯胺基酶辨識編碼序列,而在另一方面,它於其3'端含有1個Not I限制位點以促進選殖至pET-23-d載體中。PCR條件如下:在95℃下完全變性5分鐘,接著進行28個循環:95℃45秒鐘、在45℃下黏合引子45秒鐘,以及72℃1分鐘,最後在72℃下延伸10分鐘以完成任何部分長度的PCR產物。
藉由使用Qiagen凝膠萃取套組從凝膠中純化出兩種PCR段(SK的PCR段,以及編碼EGF 4、5、6與部分重疊序列的PCR段)。將這些經純化的PCR產物進行剪接重疊延伸PCR以建構連續SK_GGG_轉麩胺酸醯胺基酶_EGF4,5,6雜合基因構造,且最後借〞末端〞引子組SK_EGF Fp1以及SK_EGF Rp4(參見表1的引子序列)之助來進行擴增。之後,以Xho I和Not I限制酵素分解最終PCR產物(參見圖1B以及圖2B)。從凝膠純化後,最後將經分解以及純化的PCR段接合至pET23-d(預先同樣以Xho I和Not I分解並且經凝膠純化)。所形成質體命名為pET23-d_SK_GGG_TG_EGF,其在E. coli XL1B(recA-,end A-)細胞中增殖。對這個質體進行桑格二去氧鏈終止法並且評估完整的選殖插入序列(DNA SEQ ID 6,而對應蛋白質為SEQ ID 114)。藉由使用Xho I和Not I酵素從這個質體構造分離出雜合基因構造並且接合至pPIC-9K中,其中上游XhoI位點有助於SK-GGG-TG-EG4,5,6段框架內錨定至表現質體之雜合基因上游的α分泌訊號序列中。這個離合基因構造在併入宿主基因體後受制於酒精氧化酶啟動子而在畢赤巴斯德酵母菌(菌株GS115)中表現,並且藉由功能性篩選挑出胞漿素原活化因子陽性株。
(iii)建構EGF 4、5、6結構域框架內插入鏈球菌激酶編碼基因段的DNA雜合基因:亦設計且使用適當引子(參見表1的引子序列)在轉譯上以框架內的方式完成建構EGF 4、5、6序列散佈於SK序列中的"結構域間SK"-EGF構造以產生雜合基因構造。EGF序列插入編碼SK基因之結構域間彈性段的區域(Wang et al.,1998;Yadav &Sahni,2009),亦即在α結構域與β結構域之間,另一方面,或是在β結構域與γ結構域之間。對此,首先使用引子組IDα.Fp1以及IDα Rp 2(有關序列的詳細內容,請參見表1)擴增編碼SK之α結構域的DNA。引子IDα.Fp1在其5'端含有1個Xho I限制位點,而另一方面,引子IDα Rp 2在其5'端含有EGF之第4結構域的重疊序列。關於這個反應,使用下列PCR條件:熱起始,在95℃下完全變性5分鐘,接著進行28個循環:在95℃下變性45秒鐘、在45℃下黏合45秒鐘,在72℃下延伸1.5分鐘,而最後在72℃下"延伸段"10分鐘以使得任何不完整PCR產物變得完整。亦分別使用引子組ID EGF Fp3以及IDE GF Rp4(關於這些引子序列,參見表1)擴增編碼EGF 4、5、6的DNA段。使用這個引子組會得到編碼EGF 4、5、6序列的DNA段,其中朝向5'端的上游序列與SK之α結構域的下游序列部分重疊,此DNA段的3'端同樣含有與SK β結構域的上游序列重疊的序列。編碼SK之β結構域與γ結構域的第三種PCR段是藉由使用引子組ID βFp5與ID γ Rp6(關於這些引子的序列,參見表1)的PCR而獲得。關於這個反應,使用下列PCR條件:熱起始,在95℃下完全變性5分鐘,接著在95℃下變性45秒鐘、在45℃下黏合45秒鐘,72℃下延伸1.5分鐘,總計28個循環,而最後在72℃下延伸10分鐘以完成擴增任何不完整的PCR產物。ID β Fp5引子是以其5'端與EGF之第6結構域的下游序列同源這樣的方式來設計,而下游引子ID γRp6含有終止密碼子以及1個NotI限制位點。所有三種基因段是借助凝膠純化套組(Qiagen)由瓊脂糖凝膠中純化出來並且進行一鍋式剪接重疊延伸反應以得到單一連續基因產物,其中基因段的順序如下:SKα-EGF 4,5,6-SKβ-SKγ。以莫耳比1:1:1將所有3個節段添加至簡易PCR反應中,其中前10個循環在沒有引子的情況下完成,而接下來的18個循環是藉由加入最終濃度各自為0.6 μM的IDαFp1以及IDγRp6來完成,以進一步擴增3個片段SOE中間物。關於此反應,使用下列PCR條件:熱起始,在95℃下完全變性5分鐘,接著為(在每次循環中)在95℃下變性45秒鐘、在45℃下黏合45秒鐘、在72℃下延伸3分鐘,以及72℃最終延伸10分鐘以完成任何不完整的PCR產物。最終PCR產物經凝膠純化並且以Xho I與Not I限制酵素分解(參見圖1G以及圖2D)。接著,這個雜合基因構造接合至pET 23-d載體並轉形至E. coli XL1B(rec A-與end A-)勝任細胞中,其中DNA可在不表現蛋白質的情況下增殖(因為宿主未提供所需的噬菌體編碼RNA聚合酶),其使用所謂二去氧鏈終止法來進行桑格自動定序(DNA SEQ ID 3,而對應蛋白質為SEQ ID 116)。結果完全確認雜合基因構造。此後,雜合基因匣是藉由使用Xho I與Not I酵素予以分解而自pET-23-d結構域間SK_EGF質體而被分離出來。然後,此匣以與α-分泌訊號序列在框架內的方式接合至pPIC-9K的α-分泌訊號序列上游,並轉形至畢赤巴斯德酵母菌(GS115)中,選殖並藉由功能性篩選,如同在方法節中詳細說明於併入宿主基因體後受制於載體的酒精氧化酶啟動子表現之胞漿素原活化來選定。
(iv)建構雜合SK-EGF基因,其中SK組分的兩側為EGF 4、5、6編碼結構域:亦透過使用pET23-d N_EGF_SK質體構造(見上文,次節i以及ii)來建構另一個構造(其中SK編碼序列的兩側為框架內融合的EGF 4、5、6結構域),並對其進行Xho I與Af1II(pET23-d N_EGF_SK構造中的特有位點)分解,亦給予pET-23-d-SK_EGF構造相同的處理,並透過瓊脂糖凝膠分析兩種分解產物。由N_EGF_SK構造所得的Xho I以及Af1-II片段與SK_EGF分解的較大片段接合,這產生pET23-d載體的N_EGF_SK_EGF(DNA SEQ ID 7,而對應蛋白質為SEQ ID 115)(參見圖1C以及圖2C)。這個質體的表現匣是藉由Xho I與Not I分解而被分離出來(此構造首先如前藉由DNA定序予以評估)並在EGF-SK-EGF雜合匣上游之α-分泌訊號序列的框架內接合至pPIC-9K,且於併入宿主基因體後受制於酒精氧化酶啟動子而在畢赤巴斯德酵母菌中表現,如前依照功能性篩選(見下文)。
(v)建構含有對應於EGF 4、5、6之編碼耐氧化多肽段的序列的N_EGF_SK、SK_EGF以及N_EGF_SK_EGF編碼基因段:在N_EGF_SK、SK_EGF以及N_EGF_SK_EGF多肽中,作為EGF4、5、6結構域一部分的甲硫胺酸殘基分別出現在EGF 4、5、6結構域的第41個胺基酸殘基處,或在SK_EGF的第434個胺基酸殘基處,以及N_EGF_SK_EGF的第41個與第434個胺基酸位置處,已知它們有氧化傾向而會妨礙抗凝血酶活性,尤其是這些結構域的蛋白質C活化功能。因此要考慮的是,在我們設計不同SK-EGF融合物/基因融合段時,我們在基因層次以纈胺酸/丙胺酸/麩胺酸胺基酸殘基來替代這個甲硫胺酸。這個目標是如前透過使用高保真度酵素pfu加速DNA聚合酶(Stratagene),並且使用適當引子於不同模版中引入特定突變(Wang and Malcolm 1999)而實現。為製備這些構造,設計3組引子,其容許在EGF 4、5、6結構域/基因構造段的原有Met殘基位置處分別將纈胺酸、丙胺酸、麩胺酸併入不同構造中。引子對命名如下:
i. M rep V Fp以及M rep V Rp(參見表1的引子序列)
ii. M rep A Fp以及M rep A Rp(參見表1的引子序列)
iii. M rep Q Fp以及M rep Q Rp(參見表1的引子序列)
在下一個步驟中,在使用上述引子組的情況下,使用pET 23-d_N_EGF_SK以及pET 23-d_SK_EGF質體作為模版。關於各組引子的PCR循環方案如下:在95℃下完全變性,接著在95℃下變性45秒鐘、在45℃下黏合45秒鐘、在68℃下延伸7分鐘進行28個循環,並且在72℃下又延伸10分鐘。此反應所得的最終PCR段以切割甲基化DNA並提高轉形後獲得陽性選殖株之機率的Dpn I限制酵素分解。此PCR產物被轉形至E. coli XL1Blue細胞中且在含安比西林的LB瓊脂平板上培養,並在37℃下培育16-18小時。隨機挑出幾個選殖株並在含安比西林的LB培養基中培育成7-10 ml培養物。將質體分離並定序,以評估所欲突變是否存在。藉由採用這個程序,兩個構造中的甲硫胺酸在基因層次被纈胺酸、丙胺酸或麩胺酸胺基酸所取代。這些構造透過標準次選殖程序用於在N_EGF_SK_EGF基因中製造出纈胺酸、丙胺酸以及麩胺酸突變。最後,將這些突變株轉移至pPIC-9K且在畢赤巴斯德酵母菌的GS115菌株中檢驗其表現(參見〞實施例中使用的一般方法〞)。
(ui)建構SK的N-端有5個胺基酸刪除的ΔSK_EGF構造:在此構造中,所涉最終目的是要在SK的N-端區移除5個胺基酸。編碼這5個胺基酸的核苷酸是使用pET 23-d _SK_GGG_TG_EGF(耐氧化,其中EGF 4、5、6段的第41個met被纈胺酸所取代,參見上文)作為模版借助PCR引子ΔSK_EGF Fp 1以及ΔSK_EGF Rp 2被移除。引子Δ SK_EGF Fp1在其5’端含有1個Xho I限制位點以及自第16個鹼基對起的SK重疊序列。ΔSK_FGF Rp 2在其5’端含有EGF 4、5、6的第6結構域序列以及Not I位點。關於這個反應所用的PCR循環如下:在95℃下完全變性5分鐘,接著28個循環:在95℃下變性45秒鐘、在55℃下黏合45秒鐘、在72℃下延伸3分鐘,而最後在72℃下延伸10分鐘以完成擴增任何不完整的PCR產物。最終PCR產物經凝膠溶離並以Xho I與Not I酵素分解,且接合至pET 23-d載體中與定序,以評估完整與正確的開放閱讀框架。最後,ΔSK_EGF(參見圖1D)匣接合於pPIC-9K中並藉由先前所述的標準化程序來檢驗其表現。
(υii)在耐氧化N_EGF_SK以及N_EGF_SK_EGF編碼基因段的接合處框架內引入編碼凝血酶可切割位點的DNA序列:從N_EGF_SK的表現、純化以及胞漿素原活化的動力學分析(其證實胞漿素原活化的延遲特性),不同於自然/未經修飾的SK,這個構造明顯不能直接活化人類胞漿素原,而需要存在有預先形成的胞漿素。因為血塊在活體內富含胞漿素,而胞漿素在一般循環時快速地不活化,這自然地賦予這樣一個構造血塊特異性活化的優點。相同地,血纖維蛋白血塊也富含凝血酶,因此,我們在構造中的適當位點進行突變以使得凝血酶也變成可活化的。為此,我們藉由凝血酶可切割位點對EGF與SK的結構域間接合區進行突變,在胞漿素原活化時會造成凝血酶可切割活化轉換(thrombin cleavable activation switch)。這可以藉由逐步添加少量凝血酶以一階段分析來監測,並(像是先前所述類似的胞漿素-富集實驗)於N-端EGF 4、5、6融合SK構造中在胞漿素原活化方面觀察到逐步減低緩滯現象。在EGF以及SK基因構造的接合處引入因子XI的凝血酶可切割序列。這可以藉由重疊延伸PCR來完成,其中使用含有重疊序列以及凝血酶可切割胺基酸編碼核苷酸的接合引子。在第1個PCR反應中,使用引子N_EGF_TCS Fp 1以及N_EGF_TCS Rp 2(參見表1的引子序列)來擴增EGF 4、5、6結構域。引子N_EGF_TCS Fp 1在其5’端含有1個Xho I限制位點以及EGF的第4結構域序列;另一方面,N_EGF_TCS Rp2含有EGF的第6結構域序列以及凝血酶可切割位點編碼序列以及SK的上游部分。PCR條件如下:在95℃下變性5分鐘,接下來28個循環,在95℃下變性45秒鐘、在50℃下黏合45秒鐘、在72℃下延伸1分鐘以及最後在72℃下延伸10分鐘以完成任何不完整的PCR片段。依據此反應所得PCR段在其5’端含有1個Xho I限制位點,而在3’端含有凝血酶可切割編碼核苷酸序列以及SK的重疊部分。在接下來的PCR反應中使用TCS_SK Fp 3以及SK Rp 4(參見表1的引子序列),其中上游引子(TCS_SK Fp 3)按照5’至3’的順序含有第6結構域序列、EGF 4、5、6的重疊部分、凝血酶可切割編碼核苷酸序列以及SK編碼核苷酸序列,另一方面,SK Rp 4在其5’端含有1個Not I可切割位點。PCR條件如下:在95℃下變性5分鐘,接下來28個循環,在95℃下變性45秒鐘、在50℃下黏合45秒鐘、在72℃下延伸1分鐘以及最後在72℃下延伸10分鐘以完成任何部分長度子片段的合成。所得PCR段在上游含有第6結構域的重疊序列以及凝血酶可切割編碼核苷酸,而下游其應含有1個Not I限制位點。兩個PCR段經凝膠純化並以莫耳比1:1於一鍋反應中混合,且藉由末端引子TCS Fp1以及SK Rp6擴增,其產生所欲的N_EGF_TCS_SK PCR段(參見圖1E)(TCS凝血酶可切割序列),其經凝膠純化並以Xho I和Not I酵素分解,而最後藉由標準程序接合至經相同分解的pET23-d。在次選殖至E. coli XL Blue後,評估這個構造序列的開放閱讀框架。這證實在EGF 4、5、6與SK的接合處於基因中產生具有下列胺基酸序列的因子XI凝血酶可切割位點Ile-Lys-Pro-Arg-Ile-Val-Gly。在這個序列中,凝血酶特異性會在精胺酸與異白胺酸的接合處造成切割,從而在凝血酶作用後會從SK的N-末端移除1個胺基酸,且第2個胺基酸變成纈胺酸(在天然SK中,N-端殘基為Ile-Ala-Gly-)。此後,將N_EGF_TCS_SK匣接合至pPIC-9K中並在畢赤巴斯德酵母菌中進行表現。在經純化構造中,以凝血酶處理後被發現真的有凝血酶切割,而且經N-端蛋白質定序確認。
(viii)在SK的β結構域與γ結構域之接合處以框架內轉譯的方式融合EGF 4、5、6結構域:為此,藉由使用pET23-d_SK作為模版,以引子ID αβ Fp1以及ID αβ Rp2(參見表1的引子序列)來對β結構域進行擴增。引子ID αβ Fp1在其5'端含有Xho I限制位點,另一方面,ID αβ Rp2含有SK之β結構域的下游序列以及EGF 4、5、6之第4結構域的部分重疊序列。由此引子組所得PCR段在上游序列處含有Xho I限制位點,而在下游處含有β結構域的末端序列以及EGF之第4結構域的重疊序列。在下一個步驟中,藉由使用引子組IDE4Fp3以及IDE6Rp4(參見表1的引子序列)分離編碼EGF 4、5、6的PCR段2。引子IDE4Fp3在其5'端含有SK之β結構域的下游序列,而IDE6Rp4在其5'端含有γ結構域上游重疊序列。由這些引子組所得PCR段2在5'端含有下游β結構域的重疊序列而另一端含有γ結構域的上游序列。用於擴增的PCR條件如下:在95℃下完全變性5分鐘,接著進行27個循環:95℃45秒鐘、在45℃下黏合45秒鐘、在72℃下延伸1分鐘以及最後在72℃下延伸10分鐘。在下一個步驟中,藉由使用引子組IDγFp5 & ID γ Rp6(參見表1的引子序列)分離SK的γ結構域。以IDγFp5的5'端含有FGF 4、5、6之第6結構域的同源下游序列的方式設計引子ID γ Fp5,而IDγRp6含有終止密碼子繼而為Not I限制位點。以下列PCR方案用於擴增段3:在95℃下熱起始5分鐘、在95℃下變性45秒鐘、在47℃下黏合45秒鐘以及在72℃下延伸1.5分鐘。總計進行28個循環,且最後在72℃下延伸10分鐘以完成任何不完整的擴增產物。全部所得PCR產物藉由凝膠萃取套組(Qiagen)而被凝膠純化並且藉由A260以分光光度來定量。在最後的PCR反應中,對所有3種基因段進行一鍋內剪接重疊延伸反應,以獲得單一連續基因段,其中所形成構造的順序如下:SKα-SKβ-EGF4,5,6-SKγ,所有3種PCR以莫耳比1:1:1於聚合酶鏈反應中混合,其中在沒有任何引子的情況下進行前10個循環,而接下來18個循環是藉由添加最終濃度為0.6 μM的IDαβFp1 & IDγRp6引子而完成,俾以擴增3種片段中間完整基因段。PCR條件如下:在95℃下熱起始5分鐘、在95℃下變性45秒鐘、在45℃下黏合45秒鐘以及在72℃下延伸3分鐘,總計進行28個循環,其中前10個循環沒有引子,而最終擴增是在72℃下10分鐘而完成。最後所得基因段在其5’端含有Xho I位點而在其3’端含有Not I位點。以Xho I和Not I酵素分解這個基因段並選殖至pET 23-d和pPIC 9K中。在畢赤巴斯德酵母菌中檢驗其表現、純化並鑑別。此基因段在SK的β結構域與γ結構域之間含有EGF 4、5、6結構域(DNA SEQ ID 5,而其對應蛋白質為SEQ ID 129,參見圖1H以及圖2E)。
(ix)在N_EGF_TCS_SK雜合基因段(含有甲硫胺酸耐氧化突變)的N端編碼末端併入轉麩胺酸醯胺基酶辨識序列:為了在EGF-SK構造的EGF 4、5、6胺基酶辨識序列,設計引子TG_N_EGF_Fp 1以及Af1 II Rp2(參見表1的詳細引子序列),其中TG Fp1在其上游區含有1個Xho I限制位點以及編碼血液因子XIII轉麩胺酸醯胺基酶辨識胺基酸序列的核苷酸序列,而引子Af1 II Rp 2含有具Af1 II限制分解位點之區域的核苷酸序列(SK的第165-170個核苷酸含有Af1 II限制位點,其位在這個引子的中心)。我們藉由PCR由這些引子得到含有1個Xho I限制位點、轉麩胺酸醯胺基酶辨識編碼核苷酸以及EGF 4、5、6之第4結構域序列的基因段,其中該基因段的下游部分含有1個Af1 II限制位點。自凝膠萃取此基因段(耐氧化且含凝血酶可切割序列)。以Xho I與Af1 II分解質體pET 23-d N_EGF_TCS_SK以及pET 23-d N_EGF_TCS_SK_EGF。結果產生Xho I以及Af1 II基因段,以及由質體構造而來的較大部分與較小部分。經分解的基因段與該等構造的較大部分接合並轉形至E. coli XL Blue以獲得含有TG_N_EGF_TCS_SK以及TG_N_EGF_TCS_SK_EGF的質體(參見圖1F)。定序這些質體並且評估正確的開放閱讀框架,亦即先前所述在EGF-SK中有轉麩胺酸醯胺基酶編碼序列存在。之後,兩個匣在畢赤巴斯德酵母菌中被接合並檢核這些構造的表現(請參見〞實施例中使用的方法〞)。
實施例1中所述的不同基因段(例如N_EGF-SK、SK-EGF以及N_EGF_SK_EGF)以及另一種類型的結構域間融合構造(例如結構域間EGF_α βSK、結構域間EGF_β γSK、截短的ΔSK_EGF以及N_EGF_SK、SK_EGF與N_EGF_SK_EGF的耐氧化型)併入轉麩胺酸醯胺基酶與凝血酶可切割位點等,且全部選殖到表現載體pPIC_9K並亦在功能上評估關於個別基因融合物序列的預期活性雜合基因產物,接而在進一步鑑定之前由相對大量的培養物中被分離出來。如實施例1中所述,首先藉由酪蛋白覆蓋法按常規來測定畢赤酵母菌屬選殖株的胞漿素原活化力,接而將一些陽性選殖菌株生長於BMGY以及BMMY培養基(BMGY=1%酵母菌萃取物、2%蛋白腖、1X甘油、無胺基酸的1X酵母菌氮鹼以及100 mM磷酸鉀緩衝劑pH 5.5,而BMMY=1%酵母菌萃取物、2%蛋白腖、1X甲醇、無胺基酸的1X酵母菌氮鹼以及100 mM磷酸鉀緩衝劑pH 5.5)上(各培養基10-20株),且接著如先前按照〞方法〞所述以甲醇誘導,而將無細胞上清液用於進行酪蛋白覆蓋分析(供再確認)以及在有肽發色基質存在下的胞漿素原活化(分光光度)分析。然後,被發現到生產相對較高者以1公升水準生長且以一前一後的方式藉由疏水性交互作用(例如苯基-瓊脂糖)與離子交換(DEAE-瓊脂糖)層析法來純化蛋白質(詳細內容描述於節〞實施例中使用的一般方法〞節)。由這兩種純化法所得的雜合SK-EGF多肽依照SDS-PAGE通常為90-95%純。針對胞漿素原活化力測試所有經純化的構造(使用人類胞漿素原的一階段分析)以及凝血酶抑制分析以測定凝血時間,還有針對蛋白質C活化的發色分析(參見〞實施例中使用的方法〞)。儘管SK_EGF以及耐氧化SK_EGF顯示出的PG活化動力學非常近似於SK,但在活化動力學上有額外2-3分鐘的遲滯,在N_EGF_SK以及耐氧化N_EGF_SK、N_EGF_TCS_SK與TG_N_EGF_SK中,遲滯活化非常明顯(20-25分鐘),之後胞漿素原活化動力學與天然SK相似。這暗示著,該等構造延遲PG的初始活化,而在未經修飾的SK中是即時的。然而,一旦SK構造被活化(儘管在遲滯之後),其仍展現出完全胞漿素原活化特性。在雙極性EGF融合蛋白質(亦即N_EGF_SK_EGF、耐氧化N_EGF_SK_EGF、N_EGF_TCS_SK_EGF與其變異體TG_N_EGF_TCS_SK_EGF)中發現到遲滯略大(30-35分鐘)。但如同先前所述,在遲滯停止後,每毫克蛋白質活化胞漿素原的速率(比活性)與未經修飾的SK相似。在N_EGF_SK、N_EGF_SK_EGF及相似類型的構造中,發現遲滯的原因在於酶原自活化機制廢止(Bajaj and Castellino 1977;Boxrud,Verhamme et al. 2004;Aneja,Datt et al. 2009)。這是因為發現到藉由略為添加少量胞漿素(呈奈莫耳的數量)至反應分析中會逐漸減少遲滯而獲得確認。此外,當這些構造預先形成胞漿素複合物而使用於分析中時並沒有遲滯,清楚地暗示會遲滯的融合構造一旦與胞漿素複合,能取代使用SK所觀察到的即時胞漿素原活化機制來活化胞漿素原。類似的胞漿素依賴型活化亦在結構域間α β EGF_SK構造中發現到;但是,其總比活性在活化之後被發現到僅有未經修飾之鏈球菌激酶的40-50%。在其他結構域間構造中,若EGF 4、5、6段是位在SK的β結構域與γ結構域的EGF 4、5、6段是位在SK的β結構域與γ結構域的接合處,那麼經純化蛋白質相較於未經修飾的SK表現出明顯少於5%胞漿素原活性。這清楚地顯示,EGF與SK的任何融合物不會自動地就具有功能,只有在設計正確時才會有活性。這可以透過使用胞漿素原活化、凝血酶抑制等的平板/分光光度分析(易利用根據高通量篩選系統)來篩選而被挑出(當按經驗或按構造假設的特性來設計)。因此,SK的任何設計位點特異性置換、刪除或結構域添加性突變,或鏈球菌激酶的天然變異體可藉由此處採用的方法來獲得類似的SK-EGF蛋白質。
亦測試經純化構造以供使用人類血液因子藉由凝血時間分析來測定凝血酶抑制(參見先前所述的實施例中使用的方法)。所有構造在這些分析中就凝血時間來說明顯表現出顯著增加(約2.5-3倍),超過不具有任何構造或具有天然SK(作為另一對照)的對照分析。此外,在凝血時間方面的增加被發現到在低奈莫耳濃度範圍內是遵循線性劑量依賴型行為,其十分近似於在畢赤酵母菌屬中表現所得之EGF4、5、6結構域觀察到的結果(作為陽性對照)。這些結果證實,具有胞漿素原活化力的EGF融合構造(同樣也具有非常低的活性)亦表現出強烈的凝血酶抑制力。
將融合入編碼tpA(SEQ ID 9,而對應蛋白質為SEQ ID 120)框架內之含編碼EGF 4、5、6序列的DNA段(SEQ ID 2,而對應蛋白質為SEQ ID 111)與另一框架內融合編碼EGF 4、5、6(SEQ ID 8,而對應蛋白質為SEQ ID 111)的DNA段以化學合成與純化,並選殖至pUC19中。經定序以確定其正確性(SEQ ID 8,而對應蛋白質為SEQ ID 111)。這個構造稱為EGF-tpA-EGF(SEQ ID 10,而對應蛋白質為SEQ ID 121)。除了這個基因構造以外,其中EGF 4、5、6結構域基因編碼段在tPA的N-端位點處融合(SEQ ID 11,而對應蛋白質為SEQ ID 122)或在tpA的C-端處融合(SEQ ID 12,而對應蛋白質為SEQ ID 123),其中tPA的N-端位點處(SEQ ID 11,而對應蛋白質為SEQ ID 122)與tpA的C-端處(SEQ ID 12,而對應蛋白質為SEQ ID 123)皆融合了EGF 4、5、6結構域基因編碼段。首先藉由引子tPAFp 1以及tPA Rp2(參見表2的引子序列)擴增tPA編碼序列。此反應所用的PCR條件如下:熱起始,在95℃下完全變性5分鐘、在95℃下變性45秒鐘、在55℃下黏合45秒鐘、在72℃下延伸4分鐘,總計28個循環,而最後在72℃下延伸10分鐘以完成擴增不完整的PCR產物。因此,此反應所用引子tPAFp 1在其5'端含有Xho I限制位點,而tPARp 2含有Not I限制位點。以Xho I和Not I限制酵素分解所得PCR產物並接合至pET 23-d中。此方法所形成的最終構造被命名為pET 23-d tPA(參見圖2F),並且定序以評估tPA開放閱讀框架。為了製備N-端(N_EGF_tPA)以及C-端(tPA_EGF)融合物,進行單一限制分解以及接合方案。為了在單一步驟中做出2種構造,以Xho I和BSrG I切割pET23-d tPA與pUC-19_N_EGF_tPA_EGF,Xho I和BSrG I兩者皆為獨特鹼基酶(cutter);這產生較小片段與較大片段。pUC-19_N_EGF_tPA_EGF分解的較小片段含有N_EGF_tPA序列,其與pET23-d_tPA的較大片段接合,是會產生N_EGF_tPA(DNA SEQ ID 11,而對應蛋白質為SEQ ID 122)構造的步驟。藉由將pUC-19_N_EGF_tPA_EGF的較大片段與pET 23-d_tPA的較小片段接合而建構tPA_EGF(參見圖1J)來製備tPA_EGF(DNA SEQ ID 12,而對應蛋白質為SEQ ID 123)構造。以Xho I和Not I限制酵素分解N_EGF_tPA(參見圖1 K)與tPA_EGF(參見圖2 G),而經分離的插入片段被接合至pPIC-9K中,其構造是位在α分泌訊號序列的框架內。這所有構造於併入宿主基因體之後在載體中受甲醇誘導啟動子作用在畢赤巴斯德酵母菌(GS115)中表現。
(i)建構結構域間EGF 4、5、6-tPA構造:組織型胞漿素原活化因子按下列順序含有不同結構域:N-端肽-手指結構域-EGF樣結構域-丹麥餅構造1-丹麥餅構造2-催化結構域。新的非天然雜合設計是以基因層次來建構,其中tPA的內源性EGF結構域被凝血調節素的EGF 4、5、6結構域所取代。這些構造是藉由先前生產其他雜合基因所用的重疊延伸PCR策略而做出。
(a)建構雜合基因段,其中tPA的內源性egf結構域被人類凝血調節素的EGF 4、5、6結構域所取代:為製備此構造,pET 23-d_tPA(SEQ ID 9,而對應蛋白質為SEQ ID 120)被當作參考,其中內源性egf編碼區是自187 bp起至297 bp。在第1個步驟中,手指結構域編碼DNA是藉由使用下列引子Fin Fp 1以及Fin Rp2(參見表2的引子序列)被分離出來,其中上游引子在其5’端含有1個Xho I限制位點,而另一方面,第2個引子含有手指結構域的下游序列,具有EGF 4、5、6結構域之第4結構域的重疊序列。PCR條件如下:在95℃下完全變性5分鐘,接著進行28個循環:95℃45秒鐘、在48℃下黏合45秒鐘,以及72℃下延伸1分鐘,而最後在72℃下延伸10分鐘。在第2次PCR中擴增EGF 4、5、6結構域段,其中使用EGF Fp 3以及EGF Rp 4(參照表2的引子序列)引子組。引子EGF Fp3含有手指結構域的下游序列以及EGF之第4結構域;另一方面,下游引子EGF Rp 4在其5’末端含有丹麥餅構造1的重疊序列。PCR條件如下:在95℃下完全變性5分鐘,接著進行28個循環:95℃45秒鐘、在48℃下黏合45秒鐘、在72℃下延伸1分鐘,以及最後在72℃下10分鐘完成延伸段。由此引子組所得的基因段在其5’端含有手指結構域序列,而在其3’端含有丹麥餅構造1的重疊序列。在第3次PCR反應中,藉由使用K1 Fp 5以及CD Rp 6(參見表2的引子序列)引子組選擇性擴增編碼丹麥餅構造1至催化結構域結束的序列。引子K1 Fp1在其5’端含有EGF 4、5、6之第6結構域的重疊序列,而引子CD Rp 6在其5’端含有1個終止密碼子與1個Not I限制位點。PCR條件如下:在95℃下完全變性5分鐘,接著進行28個循環,其為:95℃45秒鐘、在48℃下黏合45秒鐘、在72℃下延伸3分鐘,以及最後在72℃下延伸10分鐘以完成所有部分長度片段的合成。此反應中所得基因段在其5'端含有EGF第6結構域重疊序列,而在其3'端亦含有催化結構域編碼序列、終止密碼子與1個Not I位點。所有3種PCR產物經凝膠純化並進行一鍋化SOE以擴增完整的雜合基因構造,其中組配的順序如下:手指結構域-EGF 4、5、6結構域-丹麥餅構造1-丹麥餅構造2以及tPA-催化結構域(參見圖1Q以及圖2J)。這是借助Fin Fp 1以及CD Rp 6引子組(參見表2的引子序列)而完成。最終PCR條件如下:在95℃下完全變性5分鐘,接著進行28個循環:95℃ 45秒鐘、在48℃下黏合45秒鐘、在72℃下延伸4分鐘,以及最後在72℃下延伸(單段) 10分鐘。如前所述,此基因段是藉由凝膠萃取純化且以Xho I與Not I酵素分解,並與經相同分解和純化的pET 23-d載體接合,選殖至E. coli XL Blue中。對一些隨機選殖株的完整插入物/基因段進行桑格定序,並評估EGF 4、5、6結構域正確地框架內併入tPA(DNA SEQ ID 13,而對應蛋白質為SEQ ID 124)。接著,將此基因段如前轉移至pPIC-9K載體、選殖至畢赤巴斯德酵母菌中,並且如"實施例中使用的一般方法"所述般篩選高位準的胞漿素原活化因子活性。
(b)建構結構域間tPA以及EGF雜合基因構造,其中內源性egf和tPA的丹麥餅構造1結構域被人類 凝血調節素的EGF 4、5、6結構域所取代:為製備此構造,分別進行3次不同的PCR,其中所形成基因段在各基因段的末端含有重疊序列,且它們接而以一鍋SOE反應來擴增以製備下列雜合構造:tPA手指結構域-EGF 4、5、6-tPA丹麥餅構造2-tPA催化(絲胺酸蛋白酶)結構域(參見圖1R以及圖2H)。為製備此構造,pET23-d_tPA(SEQ ID 9,而對應蛋白質為SEQ ID 120)被當作模版,其中內源性egf-以及丹麥餅構造1-編碼核苷酸區始自187 bp至564 bp。在第1個步驟中,手指結構域編碼段是藉由使用下列引子被分離:FgFp1以及Fg Rp2(參見表2的引子序列),其中上游引子在其5'端含有1個Xho I限制位點,而另一方面,第2個引子含有手指結構域的下游序列以及EGF 4、5、6結構域之第4結構域的重疊序列。PCR條件如下:在95℃下完全變性5分鐘,接著進行28個循環:95℃45秒鐘、在48℃下黏合45秒鐘、在72℃下延伸1分鐘,以及最後在72℃下10分鐘完成延伸。在第2次PCR中,使用引子EFI Fp 3以及EFI Rp 4(參照表2的引子序列)擴增EGF 4、5、6結構域。引子EFI Fp3含有手指結構域的下游序列以及EGF之第4結構域,而另一方面,下游引子在其5'末端含有丹麥餅構造2的重疊序列。PCR條件如下:在95℃下完全變性5分鐘,接著進行28個循環:95℃45秒鐘、在48℃.下黏合45秒鐘、在72℃下延伸1分鐘,以及最後在72℃下10分鐘完成延伸。由此引子組所得基因段在其5'端含有手指結構域序列,而在其3'端含有丹麥餅構造2的重疊序列。在第3次PCR反應中,藉由使用K2 Fp 5以及K2 CD Rp 6兩個一組的引子對(參見表2的引子序列)擴增自丹麥餅構造2至tPA催化結構域的序列。引子K2 Fp5在其5'端含有EGF4、5、6之第6結構域的重疊序列,而引子K2 CD Rp6在其5'端含有終止密碼子以及Not I限制位點。PCR條件如下:在95℃下完全變性5分鐘的"熱起始",接著進行28個循環:95℃45秒鐘、在48℃下黏合45秒鐘、在72℃下延伸3分鐘,以及最後在72℃下10分鐘完成延伸。此反應中所得基因段在其5'端含有第6結構域重疊序列以及催化結構域編碼序列,然後是終止密碼子,而在其3'端具有1個Not I位點。所有3種PCR產物經凝膠純化並使用Fg Fp 1和K2CD Rp 6引子組(參見表2的引子序列)進行一鍋SOE反應擴增而獲得完整的雜合基因構造,其中不同蛋白質編碼段的組配順序如下(最後在選殖後藉由DNA定序確認):手指結構域-EGF 4、5、6結構域-丹麥餅構造2以及催化結構域(DNA SEQ ID 14,而對應蛋白質為SEQ ID 126)。最終PCR條件如下:在95℃下完全變性5分鐘,接著進行28個循環:95℃45秒鐘、在48℃下黏合45秒鐘,在72℃下延伸4分鐘,以及最後在72℃下10分鐘完成延伸。此基因段是藉由凝膠萃取純化且以Xho I和Not I酵素分解,並與pET 23-d載體接合,選殖至E. coli XL Blue中,其中接而對完整基因段進行定序並評估EGF 4、5、6結構域正確地框架內併入部分截短的tPA基因中。將這個最終雜合基因段轉移至pPIC-9K載體並使用如前所述的標準化程序在畢赤巴斯德酵母菌中檢驗其ORF表現。
(c)建構編碼tPA截短形式的雜合基因段,其中在tPA截短形式之N端-與C-端編碼末端處框架內融合EGF 4、5、6編碼段:借助先前做出的pET-23-d N_EGF_tPA(SEQ ID 11,而對應蛋白質為EQ ID 121)以及pET 23-d_tPA_EGF(SEQ ID 12,而對應蛋白質為SEQ ID 123)作為模版製備這些構造。在這兩種構造中,借助重疊PCR方案移除內源性egf以及丹麥餅構造1結構域。為了從N_EGF_tPA構造移除內源性egf以及tPA的丹麥餅構造1結構域(參見圖1N),設計兩組引子。第1組引子N_EtPAFp 1以及N_EtPA Rp2(參見表2的引子序列)用於擴增EGF 4、5、6結構域以及tPA手指結構域的連續核苷酸序列。在此,上游引子在其5'端含有EGF的第4結構域序列以及Xho I限制位點,而引子N_EtPA Rp2含有tPA丹麥餅構造2的重疊序列。第2對引子,亦即EK2 CD Fp3以及K2CD Rp 4(參見表2的引子序列)用於擴增tPA的丹麥餅構造2與催化結構域。引子EK2 CD Fp 3在其5’端含有手指結構域的下游重疊序列,而另一個引子含有tPA催化結構域的下游序列以及1個Not I限制位點(PCR條件:熱起始,95℃5分鐘,28個循環為:95℃45秒鐘、52℃45秒鐘、72℃2分鐘,以及最後在72℃下延伸10分鐘)。此反應中所形成之基因段在其5’端含有tPA手指結構域重疊序列而在其3’端含有1個Not I限制位點。兩種PCR產物經凝膠純化並借助引子N_EtP A Fp1以及K2 CD Rp4(參見表2的引子序列)引子組進行完整基因段(其中內源性egf以及丹麥餅構造1被刪除)的建構。所形成基因段經純化並以Xho I和Not I限制酵素分解,且接合至pET 23-d載體中、於E. coli中次選殖,並針對將tPA編碼基因段移除egf以及丹麥餅構造1之後的正確框架內接合(DNA SEQ ID 15,而對應蛋白質為SEQ ID 126,圖2I)來進行DNA定序。在藉由對基因段之正確開放閱讀框架進行定序評估後,此匣被接合至pPIC-9K中、如前轉形至畢赤酵母菌屬、篩選活性並檢驗細胞外表現。以類似的方式將構造tPA_EGF的tPA編碼基因段刪除內源性egf以及丹麥餅構造1(參見圖1P與圖2H)。在此,pET 23-d -tPA_EGF質體DNA用作為模版以擴增截短的tPA核苷酸序列。使用引子對Finger Fp1以及Finger Rp2(參見表2的引子序列)擴增手指結構域,其中Finger Fp1引子在其5’端含有1個Xho I限制位點,而另一個引子Finger Rp2含有tPA之手指結構.域的下游序列以及丹麥餅構造2的重疊序列。PCR條件如下:在95℃下完全變性5分鐘,接著進行30個循環:在95℃下變性45秒鐘、在44℃下黏合45秒鐘以及在72℃下延伸1分鐘,最後在72℃下延伸10分鐘作為結束。這產生在其5'端含有tPA手指結構域重疊序列,繼而為1個Xho I限制位點,而在其3'端具有丹麥餅構造2重疊序列的基因段。第2個引子組用於擴增丹麥餅構造2-催化編碼結構域以及EGF 4、5、6結構域。第1個引子K2 CD Fp 3(參見表2的引子序列)含有tPA手指結構域之重疊序列至下游末端以及小部分丹麥餅構造2,另一方面,第2個引子EGF Rp 4(參見表2的引子序列)含有EGF的下游序列以及1個Not I限制位點。PCR條件如下:在95℃下完全變性5分鐘,以及30個循環:在95℃下變性45秒鐘、在44℃下黏合45秒鐘以及在72℃下延伸1分鐘,而最後在72℃下延伸10分鐘。這兩種基因段經凝膠純化並且在引子Finger Fp1與EGF Rp 4(參見表2的引子序列)存在下進行重疊延伸反應,而由此所得PCR產物經凝膠純化且如前接合至E. coli的pet 23-d中(DNA SEQ ID 16,而對應蛋白質為SEQ ID 127),定序評估完整基因段。最後,將此基因段接合至pPIC-9K中並轉形至畢赤巴斯德酵母菌中如前所述篩選表現與功能特性。
(d)將不同突變併入各種含有EGF的組織型胞漿素原活化因子基因構造:在上述各種EGF 4、5、6以及tPA的融合構造中,進行下列胺基酸變換:第115個胺基酸蘇胺酸變換成天冬胺酸(T 115 N)、第129個胺基酸天冬胺酸變換成麩胺酸(N 129 Q),而tPA 308-311的KHRR編碼區置換為四丙胺酸突變延伸(KHRR(308-311) AAAA)(DNA SEQ ID 20,而對應蛋白質為SEQ ID 128)。已知這些突變會賦予所形成的分子額外血纖維蛋白特異性,並且提高tPA的活體內半衰期(Keytt et al.,1994)。為引入這些突變,我們使用定點突變法(參見〞實施例中使用的方法〞)並且亦將這些變換併入耐氧化基因模版(其中EGF 4、5、6結構域的第129個甲硫胺酸置換成纈胺酸/丙胺酸/麩胺酸)。下列引子使用於定點突變中:1. T 115 N Fp以及T115 N Rp(參見表2的引子序列)、2. N129 Q Fp以及N129 Q Rp(參見表2的引子序列)。
在tPA突變KHRR(其中tPA的殘基308-311被四丙胺酸胺基酸殘基所取代)中,使用KHFp 1以及KHRp 2作為末端引子(參見表2的引子序列,在序號37與38)以重疊延伸PCR(參見實施例中使用的方法)來擴增1-933 bp的長段多核苷酸,其中KHFp 1引子含有1個Xho I限制位點以及tPA的上游序列,另一方面,引子KHRp2在其5'端含有四丙胺酸突變。使用下列PCR條件:熱起始,在95℃下完全變性5分鐘,接而在95℃下變性45秒鐘、在45℃下黏合45秒鐘、在72℃下延伸1.5分鐘,總計28個循環,以及最後72℃延伸10分鐘以完成任何不完整PCR產物的擴增。最後,由此法所得基因段在其5'端含有1個XhoI限制位點,而其3'端含有1個四丙胺酸突變。在另一個PCR反應中,KHFp3以及KHRp4(參見表2的引子序列)用於擴增tPA的第918個bp至第1617個bp間的DNA。引子KHFp 3在其5'端含有1個四丙胺酸突變,而第2個引子KHRp 4含有1個XhoI限制位點。下列PCR條件使用於反應中:熱起始,在95℃下完全變性5分鐘,接著在95℃下變性45秒鐘、在45℃下黏合45秒鐘、在72℃下延伸1.5分鐘,總計28個循環,而最後72℃延伸10分鐘以完成任何不完整PCR產物的擴增。所形成基因段在其5'端含有四丙胺酸突變而其3'端含有1個Not I限制位點。兩種PCR產物經凝膠純化並與一般〞重疊〞PCR反應一鍋混合,其中KHFp1以及KHRp 4(參見表2的引子序列)用來擴增整個基因段。最後,將所得基因段轉移至pET 23-d並在評估DNA序列和正確閱讀框架後轉移至pPIC9K,其中藉由標準條件在畢赤酵母菌屬中檢驗雜合多肽表現(請參見〞實施例中使用的方法〞)。
建構SAK_EGF以及EGF_SAK編碼雜合基因段:為建構EGF-SAK融合物,借助引子組N_EGF_SAK Fp1以及N_EGF_SAK Rp2(參見表3的引子序列)分離EGF 4、5、6 PCR段,其中pET 23-d_EGF 4,5,6(SEQ ID 2,而對應蛋白質為SEQ ID 111)用作為模版。在此,N_EGF_SAK Fp1在其5’端含有Xho I限制位點,而N_EGF_SAK Rp 2在其5’端含有SAK核苷酸的重疊序列。PCR條件如下:於第1個循環(熱起始)中在95℃下完全變性5分鐘,接下來進行28個循環:在95℃下變性45秒鐘、在50℃下黏合45秒鐘、在72℃下延伸1分鐘,而最後1個步驟在72℃下10分鐘以完成任何不完整的PCR產物。PCR產物在其5’端含有1個Xho I限制位點,而3’端含有SAK的重疊序列。在第2個步驟中,借助引子組N_EGF_SAK Fp3以及N_EGF_SAK Rp 4擴增SAK PCR段而pGMEX_SAK(SEQ ID 17,而對應蛋白質為SEQ ID 130)構造用作為模版。在此反應中,引子N_EGF_SAK Fp 3含有EGF 4、5、6之第6結構域的下游重疊序列,N_EGF_SAK Rp 4含有終止密碼子繼而為1個Not I限制位點。PCR條件如下:於第1個循環中在95℃下完全變性5分鐘,接下來進行28個循環:在95℃下變性45秒鐘、在50℃下黏合45秒鐘、在72℃下延伸1分鐘,而最後1個步驟在72℃下10分鐘以完成任何不完整的PCR產物。這產生在5'端具有第6 EGF結構域重疊序列以及在3'端具有終止密碼子繼而1個Not I限制位點的基因段。兩種PCR產物經凝膠萃取並借助凝膠純化套組純化且以莫耳比1:1混合至單一SOE PCR反應中,其中N_EGF_SAK upstream Fp 1以及N_EGF_SAK Rp 4 downstream引子用於雜合基因中間物(藉由重疊延伸所得)的擴增。因此,我們獲得一個連續基因片段,其含有N_EGF_SAK(DNA SEQ ID 18,而對應蛋白質為SEQ ID 118)序列。接著,以Xho I與Not I分解此基因段,並轉移至pPIC-9K載體。DNA定序評估EGF_SAK構造中預期的框架內融合(參見圖1T)且沒有任何其他突變。將此構造轉形至畢赤巴斯德酵母菌的GS 115菌株中並且如前於併入宿主基因體後在酒精氧化酶啟動子作用下檢驗表現。
以類似的方式進行SAK_EGF(參見圖1S)構造的建構,其中在SAK的C-末端處融合EGF 4、5、6結構域段。在第1個步驟中,借助SAK_EGF Fp 1以及SAK_EGF Rp 2引子組分離SAK基因段。引子SAK_EGF Fp 1在5'端含有1個Xho I限制位點,另一方面,SAK_EGF Rp 2含有EGF 4、5、6之第4結構域的重疊序列。所形成基因段在其上游序列中含有Xho I位點且在其下游序列中含有重疊第4結構域EGF序列。在第2個步驟中,藉由使用SAK_EGF Fp 3以及SAK_EGF Rp 4引子分離SAK基因段,其中SAK_EGF Fp3含有SAK的重疊序列,而SAK_EGF Rp 4含有終止密碼子與1個Not I限制位點。使用此引子組從PCR分離出的基因段在上游含有SAK重疊序列,且在其下游末端含有終止密碼子以及Not I位點。兩種基因段經瓊脂糖凝膠純化並與SAK_EGF Fp 1以及SAK_EGF Rp 4混合至單一SOE反應中以獲得完整的SAK_EGF(DNA SEQ ID 19,而對應蛋白質為SEQ ID 119)基因段。因此,最終PCR產物生成含有SAK_EGF序列的雜合基因段,其經凝膠純化並以Xho I和Not I限制酵素分解且在正確框架內評估完成定序後轉移至pPIC-9K中。此構造轉形至畢赤巴斯德酵母菌的GS 115菌株中,其中在藉由標準化程序併入基因體後受表現質體pPIC-9K中的酒精氧化酶啟動子作用而表現。完整的SAK_EGF構造框架內併入α分泌訊號序列上游,其有助於將雜合基因產物橫跨細胞膜轉運至培養基中。
N_EGF_SAK以及SAK_EGF的細菌表現上述N_EGF_SAK以及SAK_EGF DNA構造亦受IPTG誘導型1ac啟動子作用而表現。為製備這些構造,pPIC-9K_N_EGF_SAK以及pPIC-9K_SAK_EGF質體用作為模版。
(i)建構N_EGF_SAK基因段的細菌表現匣:首先借助BacFp 1以及BacRp 2引子透過使用pPIC-9K_N_EGF_SAK作為模版來擴增N_EGF_SAK基因段。BacFp1引子在其5'端含有1個Nco I位點,有助於提供基因段起始處所欲AUG密碼子,並且在mRNA中提供起始Met殘基編碼密碼子。引子BacRp2含有1個Xho I限制位點以在轉錄mRNA末端處於ter密碼子前以框架內的方式幫助引入6組胺酸胺基酸編碼核苷酸,該6組胺酸胺基酸編碼核苷酸有助於偵測基因產物及其純化。此基因段經凝膠分離並以Nco I和Xho I限制酵素分解,最後與以T7啟動子為基礎的pET 23-d載體接合並轉形至E. coli中。這兩個獨特位點有助於雜合基因構造插入而受T7 RNA聚合酶啟動子作用(Studier and Moffatt,1986)。將此構造pET23-d_N_EGF_SAK轉形至XL 1B細胞(rec A-和end A-)中,其中對質體進行增殖並定序。然後將此質體轉移至BL21(DE3)細胞(表現宿主),其中藉由IPTG誘導T7 RNA聚合酶並且在細胞內以包涵體的形式表現(關於表現條件、分離包涵體以及再摺疊操作請參見"實施例中使用的方法")。最後,透過層析法獲得呈高度純化形式的再摺疊蛋白質並且進行活性分析。
(ii)建構SAK_EGF基因段供細菌表現:借助SAK_EGF Fp1以及SAK_EGF Rp 2引子製備SAK_EGF構造,其中pPIC-9K_SAK_EGF作為擴增用模版。引子SAK_bac Fp1在其5'端含有1個Nco I限制位點,有助於引入1個AUG密碼子,另一方面,SAK_bac Rp2含有1個Xho I限制位點以在終止密碼子.之前於所欲SAK_EGF基因構造的下游末端處幫助引入6組胺酸胺基酸編碼核苷酸。PCR條件如下:於第1個循環中在95℃下完全變性5分鐘,接下來進行28個循環:在95℃下變性45秒鐘、在50℃下黏合45秒鐘、在72℃下延伸1.5分鐘,而最終步驟72℃10分鐘以完成部分長度PCR產物。所形成基因段在其上游末端含有1個Nco I位點,在其下游末端有Xho I位點,且經由凝膠萃取純化並接合至pET 23-d載體中。將接合產物透過電穿孔轉形至E. coli XL1B(rec A-和end A-)細胞中,並對所形成質體進行定序以評估正確開放閱讀框架。在XL1B細胞中進行質體增殖,但有關表現雜合基因產物的質體被轉形至E. coli BL 21(DE 3)細胞(Novagen Inc.)中。最後,在IPTG存在下表現形成包涵體的蛋白質,如"實施例中使用的方法"中詳述般在氧化及還原麩胱甘肽存在下分離並再摺疊蛋白質,且如上面EGF_SAK構造般進行胞漿素原活化因子與凝血酶抑制活性分析。
(iii)在EGF以及SAK的接合處引入凝血酶可切割序列:在N-端融合構造中於EGF與SAK的接合處引入凝血酶可切割序列。關於此構造,質體pET-23-d的EGF_SAK DNA被當作擴增EGF以及SAK用的模版。設計凝血酶可切割引子。用於EGF擴增時,使用取名為E4 Fp 1以及E6 Rp 2(參見表3的引子序列,序號為13以及14)的引子。E4 Fp 1引子在其5'端具有Xho I限制位點以及EGF 4、5、6結構域之上游序列,另一方面,E6 Rp2在其5'端具有EGF 4、5、6之下游序列以及凝血酶可切割核苷酸序列。下列PCR條件用於擴增:在95℃下完全變性,接下來進行28個循環:95℃45秒鐘、在45℃下黏合45秒鐘、在72℃下延伸1分鐘,在72℃下延伸又10分鐘。由此PCR反應所得基因段在其5'端具有以框架內的方式編碼EGF之第4結構域的序列,而其3'端具有EGF 4、5、6的下游序列以及1個凝血酶可切割序列。在第2個PCR反應中,借助TCS SAK Fp 3以及TCS SAK Rp4(參見表3的引子序列,序號為15、16)擴增SAK基因段。TCS SAK Fp3具有1個凝血酶可切割序列以及SAK核苷酸的上游序列,另一個引子TCS SAK Rp4同樣具有SAK的下游序列以及終止密碼子,繼而為1個Not I限制位點。所形成的經擴增基因段在其5'端含有凝血酶可切割核苷酸序列,而在其3'端有終止密碼子以及Not I位點。下列PCR條件使用於擴增SAK基因段:在95℃下完全變性,接下來進行28個循環如下:在95℃下變性45秒鐘、在45℃下黏合45秒鐘、在72℃下延伸1分鐘,而最後在72℃下延伸又10分鐘。兩種PCR產物經凝膠溶離並進行一般重疊延伸。在下列條件下借助E4 Fp 1以及TCS_SAK Rp 4(參見表3的引子序列,例如表格的序號13以及16)進行擴增EGF_TCS_SAK基因段的PCR反應:在95℃下完全變性,接下來在95℃下變性45秒鐘、在45℃下黏合45秒鐘、在72℃下延伸2分鐘,共28個循環,而最後在72℃下延伸又10分鐘。所得基因段在其5'端具有1個Xho I限制位點而在其3'端有1個Not I位點。以Xho I和Not I酵素分解此PCR產物,並於選殖至pET 23-d中定序正確框架內插入凝血酶可切割序列後接合至pPIC-9K。
表3. 用於製備各種EGF 4、5、6以及SAK融合構造的引子
將經化學合成之EGF以及tPA的不同雜合基因構造(N_EGF_tPA_EGF)、雜合tPA融合構造(其中插入EGF 4、5、6以置換tPA的內源性結構域,亦即egf以及丹麥餅構造1)、tPA以及EGF融合物的內部刪除形式(其中內源性egf以及丹麥餅構造1被刪除且在N-或C-端處融合EGF 4、5、6)以及上述構造的耐氧化變異體大體上如前所述框架內選殖至pPIC-9K載體的α-分泌訊號序列上游。各個構造分別藉由限制核酸內切酶檢驗並藉由DNA定序來確認。所有這些構造分別藉由電穿孔轉移至畢赤巴斯德酵母菌(GS115)(請參見〞實施例中使用的一般方法〞節)。各選殖株在BMGY以及BMMY培養基(BMGY=1%酵母菌萃取物、2%蛋白腖、1X甘油、無胺基酸的1X酵母菌氮鹼以及100 mM磷酸鉀緩衝劑pH 5.5,而BMMY=1%酵母菌萃取物、2%蛋白腖、1X甲醇、無胺基酸的1X酵母菌氮鹼以及100 mM磷酸鉀緩衝劑pH 5.5)上生長5天並藉由使用甲醇來誘導,且藉由酪蛋白覆蓋法測試上清液的胞漿素原活化力(參見〞實施例中使用的方法〞節);除此以外,針對胞漿素原活化在一階段分析中測試各陽性選殖株的上清液。接著,以1公升水準使各陽性選殖株生長,其中各蛋白質中tPA多肽的存在是藉由西方墨點,繼而為離胺酸親和性與離子交換層析法(有關詳細步驟參見〞實施例中使用的方法〞)來確認。由層析法所得之不同融合構造按照SDS-PAGE為92-95%純。對這些經純化蛋白質進行胞漿素原活化分析。各個經純化蛋白質的比活性近似於畢赤酵母菌屬衍生的天然組織型胞漿素原活化因子。但是,刪除手指、egf以及丹麥餅構造1與丹麥餅構造2結構域並且以EGF 4、5、6結構域予以取代的構造顯示出酪蛋白覆蓋法有稍微較淡的溶解區,且一般按照使用胞漿素原以及發色基質的定量微滴定盤分析亦顯示胞漿素原活化因子活性相對較低。此外,於可溶性血纖維蛋白存在下內部刪除構造的活性刺激程度相較於tPA/tPA突變株(其中EGF融合物在tPA的末端處)要低的多。在tPA突變株(含有第115個胺基酸蘇胺酸變換成天冬胺酸(T 115 N)、第129個胺基酸天冬胺酸變換成麩胺酸(N 129 Q)且tPA的KHRR編碼區,亦即殘基308-311被四丙胺酸突變延伸所取代(KHRR(308-311→AAAA,參見上面實例))的情況下,胞漿素原活化因子活性在〞基礎〞活性以及其在可溶性血纖維蛋白存在下的刺激類似於天然者。同時,使用充分明確的凝血酶抑制以及蛋白質C活化-分析(參見〞實施例中使用的方法〞節),此構造表現出最高的凝血酶抑制性質。相對地,如藉由凝血時間分析證實的凝血酶抑制,其中相較於緩衝對照,在有或沒有多至高微莫耳濃度的天然tPA存在的情況下,血纖維蛋白網形成基本上並無改變,添加奈莫耳濃度的不同經純化嵌合構造(包括上面的〞四-ala〞突變體,或EGF 4、5、6併入tPA的不同內部位置或末端)造成凝血時間以劑量依賴型的方式顯著增加。相較於EGF結構域融合於任一末端者,於N_EGF_tPA _EGF構造中在凝血方面觀察到的增加更為明顯。亦在凝血酶媒介的蛋白質C活化分析中觀察到這類型效應,其中N_EGF_tPA_EG所生成的蛋白質C數量通常要比含有單獨EGF 4、5、6結構域的tPA融合構造以及內部融合EGF-tPA構造高出2-4倍。在另一組結果中,針對凝血酶媒介的蛋白質C活化力來比較在EGF部分中帶有甲硫胺酸置換的EGF-tPA融合物的耐氧化形式,以纈胺酸取代甲硫胺酸的耐氧化形式總是表現高出15-20%的蛋白質C活化。
以類似的方式製備葡萄球菌激酶以及EGF融合構造並在畢赤巴斯德酵母菌以及B121 DE3細胞中表現。在文獻中已報導過畢赤巴斯德酵母菌中的葡萄球菌激酶表現及其第26個胺基酸的糖化,其中糖化似乎會妨礙胞漿素原活化功能,但若培養物在含有衣黴素(tunicamycin)的培養基中生長時會得到與天然細菌經純化SAK類似的相同胞漿素原活化型態。要考慮的實情是製備相同的基因段並設計用於細菌以及畢赤酵母菌屬表現。針對SAK-EGF融合物在N-端以及C-端處使用SAK以及EGF融合基因段,最初在E. coli BL 21 DE細胞中進行表現,其中藉由濃度為1 mM的IPTG誘導多肽合成(請參見〞實施例中使用的方法")。最後,以包涵體的形式得到EGF_SAK以及SAK_EGF,其中關於這些多肽的再摺疊條件是經不同比例的氧化與還原麩胱甘肽以及其他溶液條件予以最適化(請參見"實施例中使用的方法");在衣黴素存在的情況下,該等構造一起在畢赤巴斯德酵母菌中表現。最後,純化透過兩種方法所得融合構造並進行胞漿素原活化、凝血酶抑制及蛋白質C活化分析。另一方面,畢赤酵母菌屬衍生的胞漿素原活化以及由E. coli IB所得之再摺疊融合構造基本上是相同的,但在凝血酶抑制以及蛋白質C活化方面,畢赤酵母菌屬衍生的EGF_SAK以及SAK_EGF多肽的活性相較於E. coli衍生的蛋白質僅有多出約2倍。在氧化條件下藉由定量胺基酸分析針對EGF的申硫胺酸氧化(特別是在再折疊期間)進行評估。如上先前實施例中所述,透過定點突變在雜合EGF部分中以纈胺酸取代甲硫胺酸能解決氧化以及活性減低的問題。
本發明具有勝過該技藝中所用抗-凝血血栓溶解劑的優點。過去曾嘗試製備於葡萄球菌激酶的C-端處引入組織型胞漿素原活化因子之丹麥餅構造(Kringle)、含有精胺酸(R)、甘胺酸(G)與天冬胺酸(D)之肽序列,以及水蛭素之抗凝血酶部分的抗凝血酶血栓溶解劑,前提在於這種形式的葡萄球菌激酶有助於透過"RGD肽"抑制血小板、藉由tPA衍生的丹麥餅構造增加血纖維蛋白親和性,而使凝血酶失活的水蛭素部分會透過抑制在早期暫時形成之凝血酶賦予抗-凝血酶特性(Szemraj,Walkowiak et al. 2005)。亦曾努力透過與重組型脂蛋白相關的凝血抑制劑(LACI)作用於抑制組織因子以及因子VII來對抗血栓溶解後的再栓塞問題(Haskel,Torr et al. 1991)。這有助於與組織因子形成不活化的複合物,但無法阻撓短暫且與血塊連結的凝血酶。
但是,在本發明中,設計並評估按策略設計含有兩種類型(早期暫時凝血酶以及促凝血劑生成的蛋白質C路徑)之胞漿素原活化特性以及凝血酶抑制特性的新世代血栓溶解劑。
目前針對心肌梗塞/循環性疾病使用的藥物需要共投與肝素、水蛭素以及其他凝血酶抑制劑,但可供使用/市場上銷售的凝血酶抑制劑標定暫時生成的凝血酶,無法抑制回饋生成的凝血酶。
相對於目前使用的藥物,我們已按策略設計出新型的改良式血栓溶解劑,除了執行其胞漿素原活化特性特異性以外,同時還能執行凝血酶抑制功能並從而於血塊溶解期間在不損及其原有性質(諸如血纖維蛋白增強,如tPA的情況)外還可以協助預防非所欲副作用以及額外的特性(諸如胞漿素-與凝血酶依賴型活化,假若無一者存在於〞母〞分子中)。若在原分子中有非特異性胞漿素原活化(諸如在鏈球菌激酶的情況下),我們設計出表現不同於抗凝血酶特性的血塊特異性的雜合構造。
在本發明中,我們揭示例如鏈球菌激酶、葡萄球菌激酶以及組織型胞漿素原活化因子的血栓溶解劑的非天然嵌合變體,其含有血纖維蛋白溶解以及抗凝血酶的潛力。這些構造的已知"母"分子(包括第二代與第三代經工程化者)可溶解血塊但無法抑制凝血酶的活性,這是再血栓的主要原因。本發明構造不僅溶解血纖維蛋白血塊,還直接抑制凝血酶並透過內源性凝血調節素-催化之抗凝血路徑在凝血酶改變平衡時活化蛋白質C。
依據本發明,在一個具體例中,於設置適當連接子或置換天然結構域間連接子之後,在鏈球菌激酶分子中的不同結構域接合處引入EGF 4、5、6結構域。接著,以胞漿素原活化型態以及凝血酶抑制特性為基礎來篩選不同的活性構造。相同地,設計以各種組合/形式與EGF結構域融合的不同SK突變蛋白質,表現並接而使用簡易分析系統來篩選,在該分析系統中選出在功能上具有所欲特性的存活嵌合體。
當EGF 4、5、6在其N-末端處融合時,於鏈球菌激酶(帶有最高血栓溶解潛力的藥物分子)中觀察到一個有趣且有用的現象,嵌合構造表現出延遲的胞漿素原活化動力學,而且若少量胞漿素存在於反應混合物中時會明顯降低這個延遲活化。這些嵌合構造表現出胞漿素依賴型活化(與未修飾天然鏈球菌激酶對胞漿素原的〞自發性〞酶原活化相反)的意外發現亦使得所形成分子對血塊具有特異性,由於其等起初將會以不活化狀態循環(因為血液中通常沒有游離的胞漿素,因其快速地受抗胞漿素絲胺酸蛋白酶抑制劑(serpin)不活化),但在遇到與血塊連結的胞漿素時,將會因為其胞漿素依賴型機制作用而被活化。這將大大地降低SK的出血風險並除了EGF結構域賦予之功能融合物外,還賦予廣泛使用的藥物其他益處。
依據本發明,其他令人感到興趣的構造一方面是藉由在(α)結構域與(β)結構域的結構域間接合處融合EGF 4、5、6結構域,另一方面是在鏈球菌激酶的(β)結構域與(γ)結構域的結構域間接合處融合EGF 4、5、6結構域而獲得。在這些構造中,我們僅在α結構域與β結構域間的融合EGF發現胞漿素原活化以及抗凝血酶活性。有趣的是,在β結構域與γ結構域之間引入EGF結構域的融合構造無法表現任何胞漿素活性。這些結果暗示,無法事先預測一個給定結構域融合設計是否會容許〞母〞特質共同存在,除非經實驗實際測試。
在N-端EGF-SK融合構造以及EGF結構域與截短SK(殘基5-383)的N-端融合物中觀察到的優點在於其明顯有別於凝血酶不活化作用的胞漿素依賴型活化特性,其對於血塊特異性血栓溶解和凝血酶不活化來說可能是極大的優點。
當EGF 4、5、6結構域與葡萄球菌激酶的N-端與C-端區融合時,觀察到在1:1胞漿素複合物形成期間N-端部分被移除,其可能有助於EGF結構域在溶解期間的獨立功能,亦有助於產生高度的血塊特異性。在C-端EGF融合物中,發現仍附接於SAK。因而在兩種狀況下,發現到在嵌合多肽中成功地整併胞漿素原活化以及抗血栓特性。
包含本發明化合物的組合物可具備前藥形式。本發明化合物的前藥可用於本發明方法中。任何會在活體內轉化而提供本發明化合物的生物學、藥學或治療活性形式的化合物為前藥。前藥的各種實例以及形式在該技藝中為已知的。諸如前驅蛋白質或前驅核酸的生物分子可以是前藥。就其本身而論,可以在H.Bundgaard所編的Design of Prodrugs(Elsevier,1985)、K. Widder等人所編的Methods in Enzymology,Vol. 42,at pp. 309-396、Krosgaard-Larsen和H. Bundgaard所編的教科書Drug Design and Development,H. Bundgaard的第5章"Design and Application of prodrugs,"at pp. 113-191,1991;H. Bundgaard,Advanced Drug Delivery Reviews,Vol. 8,p. 1-38(1992);H. Bundgaard等人,Journal of Pharmaceutical Sciences,Vol. 77,p. 285(1988);以及Nogrady(1985) Medicinal Chemistry A Biochemical Approach,Oxford University Press,New York,pages 388-392)中找到前藥的實例。
已參照各種特定以及較佳具體例與技術說明本發明。但是,應理解只要落在本發明的精神與範疇內可做出各種變化以及修飾。對於該技藝中具有一般技術者而言,本文特定所述以外的組合物、方法、裝置、裝置元件、材料、程序以及技術可如本文廣泛揭示般施用於實施本發明而無須過度實驗。本文所述全部技藝中已知的功能等效組合物、方法、裝置、裝置元件、材料、程序以及技術意欲為本發明所涵括。只要揭示一個範圍,所有次範圍以及個別數值意欲被涵括在內。本發明不受所揭示具體例囿限,包括任何在圖式中顯示或說明書中例示說明者,它們是以例示或說明的方式提供而非限制。本發明的範疇僅受申請專利範圍所限。
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Seq ID 1=SK
Seq ID 2=EGF
Seq Id 3= interdoamin SK_EGF
Between alpha andbeta
Seq ID no 4= N_EGF_SK
SEQ ID NO 5=INTERDOMAIN BETAAND GAMMA
SEQ ID NO 6=SK_EGF
SEQ ID NO7=N_EGF_SK_EGF
SEQ ID NO 8=EGF456 ARTIFICAIL
SEQ ID NO 9=ARTIFICAL SYNTHESIZED TPA
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SEQ ID NO 11=N_EGF_TPA
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SEQ ID NO 13=ID EGF TPA DEL egf
SEQ ID NO 14=ID EGF TPADELegfKl
SEQ ID 15=N_EGF DEL egf k1
SEQ ID NO 16=TPA_EGF DEL egf AND k1
SEQ ID NO 17 =SAK
SEQ ID NO 18=N_EGF_SAK
SEQ ID NO 19=SAK_EGF
SEQ ID No 20=variant of tPA (tenecteplase)
依序明細
<110> COUNCIL OF SCIENTIFIC & INDUSTRIAL RESEARCH
<120> Proteint fusion construct possesing thrombolytic and anticoagulant properties
<130> LLS207
<160> 130
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1245
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<220>
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ARTIFICIALLY SYNTHESIZED
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<220>
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<220>
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<213> Staphylococcus aureus
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第1圖是一個不同框架內基因融合構造的概要代表圖,其中凝血調節素的EGF 4、5、6結構域與編碼鏈球菌激酶、組織型胞漿素原活化因子或葡萄球菌激酶的DNA,以及編碼包括三甘胺酸(GGG)或轉麩胺酸醯胺基酶辨識序列(TG)以促進雜合蛋白質與其他組織或血纖維蛋白血塊的凝血因子XIII催化的共價交聯之結構域間連接子的框架內融合序列,和凝血酶-可可切割序列(TCS)融合。
第1A圖是一個概要設計圖A,表示編碼在SK(鏈球菌激酶)的N-末端處之內融合的EGF 4、5、6的DNA序列。
第1B圖是一個概要設計圖B,表示透過含有彈性增進殘基之適當連接子(例如,三甘胺酸延伸,GGG)在SK的C-末端處的EGF 4、5、6融合物。
第1C圖是一個概要設計圖C,表示同時在SK的N-&C-端處的EGF融合物以及轉麩胺酸醯胺基酶辨識位點/殘基段。
第1D圖是一個概要設計圖D,表示在SK的C-末端處的EGF 4、5、6結構域融合物,其中SK的5個胺基酸被刪除。
第1E圖是一個概要設計圖E,表示同時在SK的N端與C端處的EGF 4、5、6融合物,其中凝血酶辨識以及可切割序列(TCS)存在於EGF以及SK的接合處。
第1F圖是一個概要設計圖F,表示同時在SK的N-端與C端處的EGF 4、5、6融合物,其中凝血酶辨識序列存在於EGF以及SK的接合處,而轉麩胺酸醯胺基酶辨識序列存在於EGF的起始部分(N-末端)。
第1G圖是一個概要設計圖G,表示EGF結構域在SK的α結構域與β結構域接合處的融合物。
第1H圖是一個概要設計圖H,表示EGF結構域如所示在SK的β結構域與γ結構域接合處的融合物。
第1I圖是一個概要設計圖I,表示EGF結構域同時在tPA(組織型胞漿素原活化因子)的N-端與C-端的融合物。在所有的圖式中以及該等術語出現在本說明書中的任何地方,〞egf〞意指tPA的EGF樣結構域,而〞EGF456〞意指凝血調節素的EGF 4、5、6結構域。
第1J圖是一個概要設計圖J,表示EGF 4、5、6結構域在tPA的C-末端處的融合物。
第1K圖是一個概要設計圖K,表示EGF 4、5、6結構域在tPA的N-末端處的融合物。
第1L圖是一個概要設計圖L,表示EGF 4、5、6結構域在tPA(組織型胞漿素原活化因子)的N-端與C-端處的融合物,其中tPA的內源性egf被刪除。
第1M圖是一個概要設計圖M,表示EGF 4、5、6結構域在tPA的N-末端處的融合物,其中tPA的內源性egf被刪除。
第1N圖是一個概要設計圖N,表示EGF 4、5、6結構域在tPA的N-端處的融合物,其中tPA的內源性egf以及丹麥餅構造1被刪除。
第1O圖是一個概要設計圖O,表示EGF在tPA的C-末端處的融合物,其中tPA的內源性egf被刪除。
第1P圖是一個概要設計圖P,表示EGF結構域4、5、6在tPA的C-末端處的融合物,其中tPA的內源性egf以及丹麥餅構造1被刪除。
第1Q圖是一個概要設計圖Q,表示EGF 4、5、6結構域與tPA的融合物,其中tPA的內源性egf被EGF 4、5、6結構域所取代。
第1R圖是一個概要設計圖R,表示EGF與tPA的融合物,其中tPA的內源性egf以及丹麥餅構造1被EGF 4、5、6結構域所取代。
第1S圖是一個概要設計圖S,表示EGF結構域在SAK的C-末端處的融合物。
第1T圖是一個概要設計圖T,表示EGF結構域在SAK的N-末端處的融合物。
第2圖是一個概要設計圖,顯示使用於建構N_EGF_SK融合基因段的PCR、限制分解以及選殖策略。
第2A圖是一個概要設計圖,顯示使用於建構N_EGF_SK融合基因段的PCR、限制分解以及選殖策略。
第2B圖是一個概要設計圖,顯示使用於製備SK_EGF融合基因段的PCR、限制分解以及選殖策略。
第2C圖是一個概要設計圖,顯示使用於製備N_EGF_SK_EGF融合基因段的限制分解以及選殖策略。
第2D圖是一個概要設計圖,顯示使用於製備結構域間SK_EGF(EGF 4、5、6融合於SK的α結構域以及β結構域間)融合基因段的PCR、限制分解以及選殖策略。
第2E圖是一個概要設計圖,顯示使用於製備結構域間SK_EGF(亦即EGF4、5、6融合於SK的β結構域以及γ結構域間)融合基因段的PCR、限制分解以及選殖策略。
第2F圖是一個概要設計圖,顯示使用於製備tPA基因段的PCR、限制分解以及選殖策略。
第2G圖是一個概要設計圖,顯示使用於製備N_EGF_tPA以及tPA_EGF融合基因段的限制分解以及選殖策略。
第2H圖是一個概要設計圖,顯示使用於製備tPA_EGF融合基因段的PCR、限制分解以及選殖策略,其中tPA的內源性egf以及丹麥餅構造1結構域被選擇性地刪除。
第2I圖是一個概要設計圖,顯示使用於製備N_EGF_tPA融合基因段的PCR、限制分解以及選殖策略,其中tPA的內源性egf以及丹麥餅構造1結構域被刪除。
第2J圖是一個概要設計圖,顯示使用於製備tPA_EGF融合基因段的PCR、限制分解以及選殖策略,其中tPA的內源性egf結構域被EGF 4、5、6結構域所取代。
第2K圖是一個概要設計圖,顯示使用於製備tPA_EGF融合基因段的PCR、限制分解以及選殖策略,其中tPA的內源性egf以及丹麥餅構造1結構域被EGF 4、5、6結構域所取代。
第3圖是胞漿素原活化的分光光度掃描圖(吸光值405 nm),顯示N-端融合的EGF 4、5、6以及SK構造的延遲胞漿素原活化,以及在微量胞漿素存在下減少緩滯(詳情參見〞實施例中使用的一般方法〞)。注意天然SK在胞漿素原活化中未顯示任何明顯的遲滯。
第4圖表示如所示不同數量(60-180 nm)的各種融合構造以及對照的增加凝血酶凝血時間分析。
第5圖是在不同SK以及EGF融合構造和所示適當對照存在下的蛋白質C活化圖(詳情參見〞一般方法〞)。
第6圖是不同tPA融合構造(等莫耳:2 nm)以及所示對照的凝血時間分析。
第7圖是在有與沒有可溶性血纖維蛋白存在下各種tPA融合構造以及所示對照的胞漿素原活化。
Claims (46)
- 一種嵌合蛋白質構造,其包含凝血調節素之表皮生長因子樣結構域4、5、6(EGF 4,5,6)融合至選自於由下列所構成之群組的血栓溶解蛋白質:鏈球菌激酶、組織型胞漿素原活化因子、葡萄球菌激酶、尿激酶及其衍生物與類似物。
- 如申請專利範圍第1項的嵌合蛋白質構造,其中該凝血調節素EGF 4、5、6結構域在該血栓溶解蛋白質或其衍生物或類似的N-端、C-端或N-端與C-端兩者處融合至該血栓溶解蛋白質,或其衍生物或類似物。
- 如申請專利範圍第1項的嵌合蛋白質構造,其中該血栓溶解蛋白質包含帶有一或多個胺基酸置換、插入、刪除或截短的鏈球菌激酶,且其中該構造具有胞漿素原活化活性、凝血酶抑制活性以及抗凝血蛋白質C途徑活化活性。
- 如申請專利範圍第1項的嵌合蛋白質構造,其中該凝血調節素EGF 4、5、6結構域融合於該鏈球菌激酶的α結構域與β結構域或β結構域與γ結構域之間,或融合於鏈球菌激酶衍生物或類似物的α結構域與β結構域或β結構域與γ結構域之間,其中該鏈球菌激酶衍生物或類似物包含一或多個突變、添加、插入或截短,且其中該構造活化胞漿素原、抑制凝血酶並且活化抗凝血蛋白質C路徑。
- 如申請專利範圍第2項的嵌合蛋白質構造,其中該等EGF 4、5、6結構域在選自於下列的一或多個位置處框架內融合至鏈球菌激酶,或鏈球菌激酶衍生物或類似物:鏈球菌激酶N-端、鏈球菌激酶C-端、鏈球菌激酶N-和C-端兩者,或在鏈球菌激酶的結構域間位置處。
- 如申請專利範圍第5項的嵌合蛋白質構造,其中該鏈球菌激酶衍生物橫跨殘基5-383或5-414。
- 如申請專利範圍第6項的嵌合蛋白質構造,其中該鏈球菌激酶衍生物橫跨殘基16-383。
- 如申請專利範圍第2項的嵌合蛋白質構造,其中該等EGF 4、5、6結構域在選自於下列的一或多個位置處框架內融合:鏈球菌激酶N-端、鏈球菌激酶C-端、或鏈球菌激酶N-端與C-端,其中該等EGF 4、5、6結構域的Met 41被纈胺酸、丙胺酸或麩胺酸所取代,或C-端Met 435被纈胺酸、丙胺酸或麩胺酸所取代,或在N-端以及C-端融合構造中Met 41與Met 435同時獨立地被纈胺酸、丙胺酸或麩胺酸所取代。
- 如申請專利範圍第1項的嵌合蛋白質構造,其進一步包含轉麩胺酸醯胺基酶辨識序列。
- 如申請專利範圍第1項的嵌合蛋白質構造,其在該EGF 4、5、6結構域與該血栓溶解蛋白質或其衍生物或類似物的接合處進一步包含一或多個凝血酶可切割序列。
- 一種在哺乳動物中治療血栓的方法,其包含對該需要治療的哺乳動物投與治療有效量之如申請專利範圍第1至10項中任一項的嵌合蛋白質構造。
- 一種嵌合蛋白質構造,其包含凝血調節素的EGF 4、5、6結構域在組織型胞漿素原活化因子(tPA)衍生物、類似物或片段的N-端處、在tPA衍生物、類似物或片段的C-端處、在tPA衍生物、類似物或片段的兩端處,或tPA衍生物、類似物或片段內部處融合至該tPA衍生物、類似物或片段。
- 如申請專利範圍第12項的嵌合蛋白質構造,其中該EGF 4、5、6結構域與該tPA衍生物、類似物或片段間的融合物進一步包含一或多個連接子片段。
- 如申請專利範圍第13項的嵌合蛋白質構造,其中該一或多個連接子片段含有一或多個會增進該構造之彈性的胺基酸。
- 如申請專利範圍第12項的嵌合蛋白質構造,其中該tPA衍生物、類似物或片段含有一或多個突變、添加、插入或截短,且其中該tPA衍生物、類似物或片段會活化胞漿素原、抑制凝血酶並活化抗凝血蛋白質C。
- 如申請專利範圍第12項的嵌合蛋白質構造,其包含組織型胞漿素原活化因子(tPA)的片段,或其截短或經修飾形式融合至一或多個凝血調節素EGF 4、5、6結構域,使得tPA的EGF結構域被一或多個凝血調節素EGF 4、5、6結構域所取代,且其中該構造具有抗凝血酶活性以及胞漿素原活化活性。
- 如申請專利範圍第12項的嵌合蛋白質構造,其包含組織型胞漿素原活化因子(tPA)的片段,或其截短或經修飾形式融合至一或多個凝血調節素EGF 4、5、6結構域,使得tPA的丹麥餅構造1以及EGF結構域被一或多個凝血調節素EGF 4、5、6結構域所取代,且其中該構造具有抗凝血酶活性以及胞漿素原活化活性。
- 如申請專利範圍第17項的嵌合蛋白質構造,其中該等tPA EGF結構域以及丹麥餅構造1結構域在該tPA片段的N-端或C-端處被一或多個凝血調節素EGF 4、5、6結構域所取化。
- 如申請專利範圍第17或18項的嵌合蛋白質構造,其在tPA片段或其截短或經修飾形式與凝血調節素EGF 4、5、6結構域之間進一步包含一或多個連接子片段,該等連接子片段包含會增進構造彈性的胺基酸殘基,使得該構造具有凝血酶抑制力、蛋白質C活化力以及胞漿素原活化力。
- 如申請專利範圍第17至19項中任一項的嵌合蛋白質構造,其中EGF 4、5、6組分的甲硫胺酸41被丙胺酸、纈胺酸或麩胺酸所取代。
- 一種嵌合蛋白質構造,其包含框架內融合至葡萄球菌激酶(SAK)的N-末端或C-末端之凝血調節素的EGF 4、5、6結構域。
- 如申請專利範圍第21項的嵌合蛋白質構造,其中凝血調節素EGF 4、5、6結構域的甲硫胺酸41被丙胺酸、纈胺酸或麩胺酸所取代。
- 如申請專利範圍第21或22項的嵌合蛋白質構造,其在SAK與EGF 4、5、6結構域區之間進一步包含凝血酶可切割序列。
- 如申請專利範圍第22至23項中任一項的嵌合蛋白質構造,其進一步包含轉麩胺酸醯胺基酶交聯序列。
- 如申請專利範圍第1至10項或第12至24項中任一項的嵌合蛋白質構造,其中該等構造可溶於水溶液或食鹽水溶液。
- 一種抑制凝血酶的方法,其包含使用如申請專利範圍第1至10項或第12至24項中任一項的嵌合蛋白質構造。
- 一種活化蛋白質C的方法,其包含使用如申請專利範圍第1至10項或第12至24項中任一項的嵌合蛋白質構造。
- 一種提供抗凝血酶以及胞漿素原活化的方法,其包含使用如申請專利範圍第1至10項或第12至24項中任一項的嵌合蛋白質構造。
- 一種藥學調配物,其包含藥學有效量之如申請專利範圍第1至10項或第12至24項中任一項的嵌合蛋白質構造。
- 一種在哺乳動物中溶解血栓的方法,其包含對需要的哺乳動物投與治療有效量之如申請專利範圍第1至10項或第12至24項中任一項的嵌合蛋白質構造。
- 一種如申請專利範圍第1至10項或第12至24項中任一項的嵌合構造,它是藉由在細菌系統中表現而製備。
- 一種如申請專利範圍第1至10項或第12至24項中任一項的嵌合構造,它是藉由在真核生物系統中表現而製備。
- 如申請專利範圍第32項的嵌合構造,其中該真核生物表現系統是選自於由下列所構成的群組:動物細胞、畢赤巴斯德酵母菌(Pischia pastoris)以及真菌。
- 如申請專利範圍第33項的嵌合蛋白質構造,它被分泌至細胞外培養基中。
- 如申請專利範圍第14項的嵌合蛋白質構造,其中該一或多個胺基酸是選自於由下列所構成的群組:Gly、Asn、Pro、Ser、Gln、Arg以及Lys。
- 一種編碼如申請專利範圍第1至10項、第12至25項或第31至35項中任一項的嵌合蛋白質構造的核酸序列。
- 一種包含如申請專利範圍第36項之核酸序列的載體。
- 一種包含如申請專利範圍第37項之載體的宿主細胞。
- 一種如申請專利範圍第1至10項、第12至25項或第31至35項中任一項的嵌合蛋白質構造,它是藉由在宿主細胞表現系統中表現編碼該蛋白質的核酸序列而製備。
- 一種製備如申請專利範圍第1至10項以及第12至25項或第31至35項中任一項的嵌合蛋白質構造的方法,其是藉由在宿主細胞表現系統中表現編碼該蛋白質的核酸序列。
- 如申請專利範圍第40項的方法,其中該宿主細胞表現系統是真核生物表現系統。
- 如申請專利範圍第41項的方法,其中該宿主細胞表現系統是細菌表現系統。
- 如申請專利範圍第42項的方法,其中該細菌是大腸桿菌(E. coli)。
- 如申請專利範圍第41項的方法,其中該真核生物表現系統是動物細胞或酵母菌細胞。
- 如申請專利範圍第44項的方法,其中該酵母菌是畢赤巴斯德酵母菌(Pischia pastoris)。
- 如申請專利範圍第40至45項中任一項的方法,其中該嵌合蛋白質構造由宿主細胞被分泌至細胞外培養基中。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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WO2024060167A1 (zh) * | 2022-09-23 | 2024-03-28 | 庄伟哲 | 靶向整合素αIIbβ3的含组织纤维溶酶原活化剂或其变异体的融合蛋白质及其应用 |
-
2011
- 2011-08-08 TW TW100128223A patent/TW201306861A/zh unknown
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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WO2024060167A1 (zh) * | 2022-09-23 | 2024-03-28 | 庄伟哲 | 靶向整合素αIIbβ3的含组织纤维溶酶原活化剂或其变异体的融合蛋白质及其应用 |
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