JPH02215384A - 組織プラスミノーゲンアクチベーターミユーテイン、その製造方法および該ミユーテインを含有する凝血塊溶解剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、新規の組織プラスミノーデンアクチペータ−
（ｔ−ＰＡ）ミューティン（Ｍｕｔ、ｅｌｎ：突然変異
タンパク質）、その製造方法２よび該ミューティンを含
有する凝血塊溶解剤に関する。

従来の技術 凝固血液は蛋白質マトリックスの主成分としてポリマー
フィブリンを含有している。このフィブリンはグラスミ
ノによって加水分解される。

グラスミノは、グラスミノ−ｒノから所Ｍｆラスミノー
ｒノアクチベーター　例えば組織プラスミノ−）ｆンア
クチペーター（ｔ、１８１ｕｅ−ｔｙｐｅｐｌａｌｉｍ
ｉｎｏｇｅｎ　ａｃ　ｂｉｖａｔ、ｏｒ　＝　ｂ　−Ｐ
　Ａ　）による活性化によって形成される。天然ｔ−Ｐ
Ａまたは珊乳動物の細胞から遺伝子工学的に得られたｔ
−ＰＡの酵素活性（プラスミノーゲンからプラスミンを
生成する触媒的活性化）は、フィブリンまたはフイデリ
７分解生成物（Ｆ８Ｐ　）の不在では極めて小さいが、
これらの賦活体の存在では著しく増大されうる（１０倍
を越える）。

生体内のｂ−ＰＡの作用機構は例えばＫＯｒｎｉｇｅｒ
＆　ｃｏｌｌｅｎ　：　Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｉ（ａｍｏｓ
ｂａｍｌｓ　４６　（１９８１）ｐ５６１〜５６５に記
載されている。フイブリノーゲンによるｔ−ＰＡＯ活性
の賦活は、他の公知の！ラスミノーデンアクチベーター
　例えはウロキナーゼまたはストレプトキナーゼに比べ
ると決定的に有利である〔参照：　Ｚ、Ｂ、Ｍ。

ＨＯｙｌａＪ）ＪＪ等、Ｊ、Ｂｊｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　
２５７　（ｉ　９８２）、ｐ２９１２〜２９１９　；　
Ｗ、Ｎｉｅｕｗｅｎｈｕｉｚｅｎ等、Ｂｌｏｃｈｅｍ、
　Ｂｉｏｐｈｙ日、　ＡｃＬａ　７５５　（１９８５）
、ｐ５６１〜５６６〕。

［１−ＰＡはすでに臨床において血栓の有効な治療剤で
あることが判明しておシ、それ故にｔ、−ＰＡをできる
だけ多量に製造することが試みられている。

なるほど臨床的実験によって、有効な血栓溶解をも九ら
すためには、肝臓に２けるｔ−ＰＡの分解速度が早いの
で、多量の？−ＰＡが必要でおることが判っている。し
かし高い治療用層は例えば出血のようなＭＩＪ作用を招
く。従って、この血栓溶解を改善しかつ全身的フィブリ
ン溶解のような副作用を低減するのが望ましい。また治
療用−の低減も達成されることが要求される。

詳細な研究の結果、？−ＰＡは第１図で示す領域から成
ることが判った。

ヨーロッパ特許出願公開第０２４１２１０号明細書には
、数個のフィブリンフィンガー（Ｆｉｂｒｉｎｆｉｎｇ
ｅｒ）領域を有するｂ−ＰＡミューティンが記載されて
いる。フィブリンフィンガー領域のＤＮＡ配列は制限断
片として単一され、合成リンカ−を介して該タンパク質
の第１番目のアミノ酸の前に置かれた。しかし合成リン
カ−を用いるために天然Ｏフィブリンフィンガー領域と
は異なるアミノ酸配列を生じる。

ヨーロッパ特許出願公開第０２５１６２４号には、合成
さｎた＊−ＰＡｆ伝子およびそれから製造され友ｔ−Ｐ
Ａ−ミューティンが記載されているが、このミューティ
ンは各領域を高々２回含む。こ（Ｄ　ＤＮＡは、新しい
制限断片を配列に導入して個々の領域のクローニングを
容易にするように合成され友。これによってアミノ酸の
位置が特に領域の移行場所で著しく変更され九。つまシ
こ（ＤＬ−ＰＡ−ミューティンの場合にもアミノ酸配列
は天然の該タンパク質の配列とは異なる。

発明が解決しよりとするＳ題 従って本発明は、天然のｔ−ＰＡよシも増大されたフィ
ブリン結合力および賦活性を有しかつ依然として生物学
的ｔ、−Ｆ’Ａのすべての特性を有するｂ−ＰＡ−ミュ
ーティンを製造するという課題を基礎にしている。

課題を解決する丸めの手段 前記課題は、本発明にょシ、ブイゾリンフィンガーおよ
びクリングル（Ｋｒｉｎｇｅｌ）　ｆｆ領域の少なくと
も一つの天然アミノ酸配列を数倍化ちれた杉で有する組
域ノラスミノーデンアクチペーター（ｔ−ＦＡ）ミュー
ティンによって解決される。

天然アミノ酸配列とは、本発明の範囲では、ｐｅｎｎｉ
ｃａ等、Ｎａｔｕｒｅ　５０１．２１４頁（１９８３）
から公知の、個々の領域のアミノ酸配列の意である。数
倍化は天然１．−ＰＡＯＤＮＡ配列Ｏエクンンーイント
ロン範囲に従って行なわれる。従って両領域の少なくと
も一つを数倍化された形で含むが、その配列中に付加的
な他のアミノ酸を有することはなく、またアミノ酸の欠
失していないタンパク質が得られる。数倍化された配列
は好゛ましくは２倍であるが、しばしば６倍または４倍
以上であってもよい・ さらに本発明の好ましい実施態様の場合には、ｂ−ｐＡ
−ミューティンにおいてＥＧＦ’　（上皮成長因子）ｔ
たは／ひよびクリングル（Ｋｒｌｎｇｅｌ）　［領域の
アミノ酸配列が欠失されている。ＥＧＦ領域Ｏ欠失によ
って半減期が天然Ｌ−ＰＡに比べて著しく延長される。

それというのもこの領域は肝臓における該タンパク質の
迅速な分解にとって不可欠だからである。クリンｒル■
領域は活性の損失なしに欠失されうる、この場合にはア
ミノ酸配列が倍化によって過度に延長されないという利
点が得られる。

本発明の好ましい実施態様においては、ｂ−ＰＡ−ミュ
ーティンのフィブリンフィンガー領域、つまジアミノ酸
４〜４９が倍化されている。

また極めて好ましい実施態様の場合には、ＥＧＦ領域の
アミノ酸、りまジアミノ酸５０〜８７が欠失されておシ
、クリングル１領域のアミノ酸９８〜１７５が欠失され
てりる。

他の好ましい本発明の実＃ｉ悲様の場合には、クリンｒ
ル■領域のアミノ酸、つまりアミノ酸１７６〜２６１が
倍化されている。さらに極めて好ましい実施態様の場合
、ＥＧＦ領域およびクリンデルＩ領域のアミノ酸が欠失
されている。

第３蕾目の好ましい実施態様の場合には、ＥＧＦおよび
クリ／デル１領域が欠失されておシかクワイプリンフィ
ンガーンよびクリンデルＵ領域が倍化されている。

本発明によるｔ、−ＰＡ−ミューティンが原核生物か真
核生物で発現されるかどうかに応じて、該ミューティン
はグ替コシル化または非グリコジル化されている。本発
明の好ましい実施態様の場合には、ｔ、−ＰＡ−ミュー
ティンはグリコジル化されてｓｒ　Ｄ　、従って天然０
ｈ−ＰＡに極めて類似している。

本発明の他の対象は、本発明によるｅ−ＰＡ−ミューテ
ィンの製造方法であり、このｐ数個の光全ｔ−ＰＡ遺伝
子を縦列配置で適当なベクターに挿入し、オリゴヌクレ
オチド部位の突然変異誘発によって、生成物に２いて数
倍化されていてはならないタンパク質領域のアミノ酸を
コードしているＤＮＡ配列を除去し、このようにして得
られた突然変異ベクターを適当な細胞に導入しかつ増幅
し、その中で欠失の起つ九ベクターｔ−取得し、同ベク
ターを適当な宿主細胞で発現させる。前記のオリゴヌク
レオチド部位の突然変異−発は自体公知の方法により実
施する（例えばＭＯｒｉｎａｇａ等、（１９８４）　Ｂ
ｌｏＬｅｃｈ−ｎＯＩＯｇＹ　２＊　６３４　）。

本発明の好ましい実施１１１１様においては、２個のＵ
−ＰＡ遺伝子金ベクターに挿入する前に、これらの遺伝
子から同様にオリゴヌクレオチド部位の突然変５ｒｔｓ
発によってＥＧＦ領域および／またはクリングルＩ領域
を除去する。

オリゴヌクレオチド部位の突然変異誘発のためには、結
合すべきＤＮＡ配列（Ｄ　５’−および５′−配列のヌ
クレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドを使用する。

好ましくは１８〜２６個のヌクレオチド長さを有するオ
リゴヌクレオチドを使用する。

他の好ましい実施態様においては、先づｇＧＦおよびク
リソデル１領域を除去し、次にフィブリンフィンガー（
Ｆ）、クリングルＩ　（Ｋ２）および軽い鎖（プロテア
ーゼ’）　＝　（Ｌ）の領域を２回連続的にベクターに
導入し、これによって配列Ｆ’に２ＬＦＫ２Ｌが得られ
かりＣの配列からオリゴヌクレオチド部位の突然変異誘
発によって、２個のＦ領域ｏ＠３の配列、すなわちに２
およびり。

ま几は２個のに２領域の間の配列、つまりＬおよびＦを
除去する。これからＦＦＫ２ＬまたはＰＩ３に２Ｌ領域
を有するミニ−ティンのためｃＤＮＡ配列を含むベクタ
ーが得られる。

本発明の好ましい実施態様においては、ｂ−ＰＡ−ＤＮ
ＡとしてＬ−ＦＡ−ｃＤＮＡを使用する。得られたベク
ターは好ましくは原核細胞で増幅され、この際ｎａｅｌ
ｑｆラスミドを含むＬｃｏｌｉ株を使用する。好筐しい
実施態様にかいては、その中で欠失の起ったベクターの
選択後に、該ベクターを真核生物で発現させる。この発
現は確かに原核生物でも可能であるが、原核生物からは
非グリコジル化生成物が得られる。しかしグリ ｌ；シル化生成物が天然のｔ、−ＰＡに類似しているの
で、真核生物での発現が有利である。極めて好ましい実
施態様においては、ＣＨＯ細胞で発現を行なう。好まし
くは真核生物での発現のためには、ベクターとしてジヒ
ドロ葉酸レダクターゼまたはウシのパピローマウィルス
ｋｉｎとする増鴇可能なベクターを使用する。

極めて好ましい実施態様においては、シラスミドｐＡｔ
８／ｉ　、ｐｋ１９／１　’ＣＥ、ｃｏｌｉで発現させ
る本発明の他の対象は、領域ＦＦＫ２ＬまたはＦＫ２に
２Ｌの念めＯミューティンＤＮＡ　’ｉ含むプラスミド
ｐＡ１８／１．１）Ａｉ９／１　、同一領域のＤＮＡ配
列を有するが、さらに真核シグナル配列も含むグラスミ
ドｐＡ２４およびｐＡ２５、およびＦＦＫ２ＬおよびＦ
Ｋ２に２Ｌのための増＋１ｇ可能な真核発現ベクターで
あるプラスミドｐＳＶ−ＦＦＫ２Ｌ−ｄｈｆｒおよびｐ
ｓＶ　−ＦＫ　２に２Ｌ　−ｄｈｆｒである。

本発明の他の対象は、少なくともフィデ替ンフィンガー
および／またはクリンデル■領域の数倍化されている、
本発明による？−ＰＡミューティンを含有する凝血塊溶
解剤である。該溶解剤は、極めて好ましくは、さらにＥ
ＧＦおよびクリンｒル］領域が欠失されでいるｔ−ＰＡ
誘導体を含有している。該溶解剤は極めて好ましい実施
態様の場合には、ＦＦ’に２ＬまたはＦＫ２に２Ｌ領域
を有するミューティンを含有している。

本発明は、増大されたフィブリン結合力およびフィブリ
ン賦活性を有し、好ましくは明らかする。さらに該ｆｌ
−ＰＡミューティンの場合には真核生物に２ける生成速
度が増大される。

従って、ｂ−ＰＡの含分が著しく少ないにも拘らず明ら
かに増大された効能を示す凝血塊溶解剤を製造するＯと
ができる。

次に図面との関連において実施例により本発明を詳述す
る。

例１ ＦＦＫ　２　Ｌの製造 ａ）前槽ＥＦ’に２Ｌ／ＦＫ２１゜ 出発プラスミドｐＲＥＭ　７６８５　（ａ　−ｃｘツバ
特特許出願公開第０２４２８３芳 は次の構成！！素を含む：　ｔａｃ−プロモーターＡＴ
Ｇ開始コドンｔ−有する１ａｃ−オペレーター領域、ミ
ューティンＦＫ２Ｌのコード領域、ｐＫＫの ２２３−３から転写ターミネータ−１β−ラクタマーゼ
遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子およびプラスミドｐＡ
ｃＹｃ　１　７　７の複製開始点。ミューティンＦＫ２
Ｌの配列は、ヌクレオチド１　９Ｏ−３３６ＣＦ領域）
、７１　５−１　８０９（Ｋ２領域、グロテアーゼ、比
較的小さい部分３’ＵＴ（非翻訳６′−領域））および
ＡＴＧ開始コドンから＊ｇされている。ヌクレオチドの
位ｆｔ　ｕ　Ｐｅｎｎ１ｃａ等（　Ｎａｔｕｒｅ　３　
０　Ｉ、２１４（１９８３））によって記載された配列
によシ費示される。

プラスミドｐＲｇＭ　７６８５を、ブロモ−ター／オペ
レーター領域および転写シグナルを含むミューティンコ
ード領域から成るｔ−ＰＡミューティンの発現カセット
の重複の之めに、制限酵素Ｘｈｏ　Ｉ　Ｉによりて切断
し九〇この制限バッチを寒天ゲルで電気泳動法により分
離し、約１４８０ｂｐの大きさの断片を率離し九。

第２のバッチではプラスミドｐＲｇＭ７　６　８　５勿
酵累ＢａｍＨＩで線状化し、次にコウシ腸産生アルカリ
性ホスファターゼで処理しｔ０ 得られた２つのＤＮＡ断片の結合後に結合体をＬａｃＩ
ｑ−プラスミドを含０Ｌｃｏｌｉ細胞（　Ｄ８Ｍ３６８
９）で形質転換させた。プラスミド’ｔ−Ｗする形質転
換細胞會、培地にカナマイシン２５〜／ｍｊｉ加えて選
択する。

制限酵素解析によって、形質転換細胞の中からプラスミ
ドｐＡ１ｓｔ−含むクローンを選択することができる。

このプラスミドに、就中ＸｈｏＩＩ断片の組込みおよび
所望の定位を保証する約ｔ４ｓｏｂｐの大きさの付加的
８ｍａ　［断片の出現によって、出発プラスミドｐＲＥ
Ｍ　７　６　８　５から区別される。従ってｐＡ１ｓｈ
前記発現カセットを縦列配置で２倍有する。

ｂ）突然変異誘発 ミューティン遺伝子Ｆ’Ｆ’に２Ｌの構成の九めの出発
プラスミドとしてｔｚｐＡ１５？用いる。

ｐＡ１５から所望の領域を欠失させるために、Ｍｏｒｉ
ｎａｇａ等、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２．６６４
（１９８４）の方法を用い九。ヘテロ二重鎖の形成の九
めにｐＡ　１５から２個の断片を分離しｆｔｏ断片Ａ：
ｐＡ１５に２ｍの制限酵素ＥａｍＨＩおよび８ａｌｉ　
（ポリリンカー領域）で切断し友。

切断生底物？デル′亀気泳動法により分離し、ゲルから
大きなりａｍＨＩ　／　Ｂａ１ｌ断片を溶離した。

断片Ｂ：ｐＡ１５″Ｉｔ制限酵素Ｘｈｏ　Ｉで線状化し
次。

線状化プラスミドを同様にしてデル電気泳動法により精
製し九。突然変異誘発の友めに次のオリイヌクレオチド
： ５’　ＧＣＣＴＧＴＣＡＡＡＧＴＧＡＴＣＴＣ）ＣＡ　
５’全合成する。

ヘテロ二重鎖の形成の穴めに、断片Ａ１断片Ｂ（それぞ
れ４５　Ｑ　ｆｍｏｌ　）およびオリイヌクレオチド（
７５１）Ｍｏｌ　）　ｋ混合し、先づＮａＣｔ５　Ｑ　
ｍＭ、トリスＨＣｔ１０　ｍＭ　（ｐ［（７，５）およ
びＭｇ８０４１０ｍＭｋ１００℃で３分恒温保持し、直
ちに氷上に移す。ＤＮＡの再結合’ｔ−６０℃で６０分
間行なう友。修復合成の几めに反応バッチ金調整しｔ：
デスオキシヌクレオチド三リン酸（０，２５ｍＭ）、Ａ
ＴＰ　（ｍＭ　）、ＮａＣｔ（Ｉ　ＤＯｍＭ　）、トリ
ス塩［ｐＨ７，５（６，５ｍＭ　）、ＭｇＣ’ｔ２（８
ｍＭ　）、β−メルカプトエタノール（１ｍＭ　）、Ｅ
、　ｃｏｌｉからのＤＮＡポリメツーゼ（０，１２５０
／μｌバツチ）のフレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ　）　断片お
よびＴ４りが一ゼ（０，ＩＵ／μｊバッチ）。次にこの
バッチｆ　１ａｃＩｑプラスミド（ＤＡＭ　３６８９　
）　ｋ含Ｕ　Ｅ、　ｃｏｌｉ　ａ’Ｍで形質転換させ、
形質転換細胞を培地にカナマイシン２５μｙ／彪を加え
て選択し友。

グローブとして前記の突然変異誘発オリゴヌクレオチド
七使用してコロニーハイブリッド法により、プラスミド
ルＡ１８／ｉｋ含むクローン七選択することができｔｏ
このグラスミドに、就中、差当ってミューティン発現カ
セットの重複によって導入された８ｍａ　ｌ断片の欠落
によって出発プラスミドとは相違する。第２因ｅＸｐＡ
１８／１の製造過糧を略示しである。

ｃ）　　Ｅ、　ｃｏｌｉにおけるＦＦＫ２Ｌの発現プラ
スミドｐＡ１８／１ｅ、１ａｃｅ”プラスミド金倉ひＥ
、　ｃｏ：ｔｉ細胞（ＤＢＭ　３６８９ンで形質転換さ
せ几。プラスミドｔＷする細胞を培地で６７゛Ｃで通気
下に０Ｄａ５ｏ　”　０．４　ｖで培養し、０．２１ラ
クトースまたｆｉ５ｍＭのＪＰ’ｌ’Ｇ　（インプロビ
ル−１−チオ−β−り一がラクトピラノシド）を加えて
３時間酵−ｘｍ導を行なう。所謂封入体を西独国特許出
願公開第５５５７７０８号に記載され友プｏ）コル（Ｐ
ｒｏｔｏｋｏｌＬ　）により細胞タンパク質から分離し
、突然変異されたｔ−ＦＡタンパク質か再生さｎ、７？
：ｅｃ、のようにして得られ九タンパク質に約４９　ｋ
Ｄの分子量を有し、ヒトのｔ−ＰＡに対するポリクロナ
ール抗体（ヤギで製造）に結合する。核再生ミューティ
ン（ヨーロッパ特許出幀公開第 ０２１９８７４号に記載されているように再生）は、プ
ラスミノーゲン分解試験においてアミド分解活性および
フィブリン賦活性を示す。

ｄ）真核シグナル配列を有するＦＦＫ２Ｉ、の構成ミュ
ーティン遺伝子にリーダー配列および３’ＵＴ（３’非
翻訳領域）（厚相補的ＤＮＡ配列に相応する）を結合す
るために次の断片全分離した； １）ＵＣｌ３のポリリンカー中に、ｔ−Ｆ’Ａの５’Ｕ
Ｔ（５’非翻訳領域）、リーダー配列およびヌクレオチ
ド位置２０８１でのＮ末端配列ｋＷするプラスミドｐ７
．１　Ｃ０８Ｍ４７１９　）から、約２．７　ｋｂの大
ささのＰｓｔｉ　／　Ｅ（ｉｎｄｌｌｌ断片を得た。

プラスミドｐｅＰＡ９８．１　（ヨーロッパ特許出願公
開第０２４２８３５号参照）からは、約１２００ｂｐｋ
包含しかつグロテアーゼのコード部位および３’Ｕ’ｒ
’ｔＷするＨｌｎｄｌｌ　／　Ｓｃａ［断片を分離しｆ
ｃｏ　ｐＡ、　１８　／　１からｌずＢａｍＨＩ　／８
ｃａｌ　ｈ片を精製し、このものからＰｓｔ［で部動的
に制限することによって約４７０　ｂｐ　ｔ−包含する
ｐｓｔｌ　／　８ｃａｌ断片會得九。この断片は重複さ
れた領域Ｆおよびに２領域のコード部位？有する。これ
らの断片會連結反応さゼ、１、ａｅＩｑプラスミド（Ｄ
ＢＭ　５６８９　）　’に含むＢ、　ｃｏｌｉで形質転
換さゼた。カナマイシン耐性形質転換体全上記突然変異
誘発プライマーで遮蔽した。長さ２７００１）ｐ（１）
Ｕ（’　１２ベクター）；　７９０ｂｐ、７３０ｂｐ、
１４０ｂｐおよび７０ｂｐ（ｔ−ＰＡ＠片）のＰａｔ■
断片で制限すると正しいプラスミド（ｐＡ　２５　）が
得られる。

例２ ＰＸ２に２Ｌの製造 ａ）　　Ｅ、　ｃｏｌｉにおける突然変異誘発および発
現ＦＫ２Ｌ二［１伝子−グラスミド１）Ａ１５から例１
によ、！７２Ｆ！／７１の断片ＡおよびＢｉ分離し九。

しかしこの場合にはへテロ二重ａ’ｒ形収するｔめに次
のオリー／スクレオチド： ５’　ＧＣＣＣＴＣＣＴ（）ＣＧＧＡＡＡＣＡＧＴＧ　
５’全使用し九〇 すべての実験段階金側１で記載し友ように行った。上記
突然変異誘発オリデヌクレオテドを用いるコロニーハイ
ブリッド法によって求めるプラスミドｐＡ１９／１　（
５，２ｋｂ）？含むクローン會見出した。このプラスミ
ドの特性上制限解析によって確認し、８ｍａｉ切断位置
の欠失を調べた〇 第２図は特にｐＡ１９／１の製造プロセスを略示する。

ｐＡ　１９　／　１　ｋ　Ｅ、　ｃｏｌｉ　（ＤＡＭ　
３６８９）中に移入し、ミューティンＦＫ２に２Ｌ　ｋ
ｍ友。

このタンパク質は約５２０００ダルトンの大きさ営頁す
る。同ミューティンはヒトのｔ−ＰＡに対する七ノクロ
ナール抗体（ヤギで製造）に結合し、グラスミノーデン
分解試験においてアミド分解活性およびフィブリン賦活
性を示す。

ｂ）真核シグナル配列ケ有′するＰＸ２に２Ｌ、の再構
成 ミューティン遺伝子ＦＫ２に２Ｉ、に原す−ダー配列會
結合するために久下の断片１分離し、結合し几： ｐ７．１（Ｄ８Ｍ４７１９）から分離され九２．７ｋｂ
の大きさのＢａｍＨＩ　／　Ｈｌｎｄ［［断片、ｐＡ　
２０　（ｐ　７．１のＰａ’Ｔａｌ切断位置にｔ−ＦＡ
コード配列からの４５０　ｂｐ　Ｐｓｔ［断片を挿入し
た）からの約０．２　ｋｂの大きさのＢａｍＨＩ　／　
８ｓｐｉ断片、 ｐＡ１９からの約１．３ｋｂの大きさの８ａｐｌ／＋ｉ
ｎａ　［［断片。

結合棒金Ｅ、　ｃｏｌｉ細胞（ＤＢＭ　３６８９ンで形
質転換し、グラスミド金倉む形質転換体を培地にアンビ
アす７５０μ＆／ｌ１ｔｋ加えることによって選択し九
。詳細な制限酵素解析によって所噴のグラスミドｐＡ　
２４の特性を確認し友。

例３ Ｆ’ＦＫ２ＬおよびＰＸ３に２Ｌの増幅可能な真核発現
ベクターの槽底 ｐＡ２５およびｐＡ　２４からＦ’Ｆ’に２１．および
ＰＸ２に２Ｌ　ｃＤＮＡ　ｋ、　Ｘｂａ　−Ｈ１ｎｄｌ
断片として分離し、ＦＦＫ２ＬおよびＰＸ２に、２Ｉ、
、　ＤＮＡおよび真核発現ベクターｐＫＣＲ（σＨａｒ
ｅ等、Ｐｒ０Ｃ。

Ｎａｔｌ、ＡＣａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　　７８　（１９
８１）１５２７〜１５３１）の断端ｔ５ｃクレアーゼ８
１で平滑にした後、前記ｃＤＮＡ　ｔ−同ベクターのＢ
ａｍＨＩの位置に挿入し友。結合体ｆ　Ｅ、　ｃｏｌｉ
（ＨＢｌ　（Ｎ　（ＤＥＩＭ１６０７））中に移入し、
アンぎシリン５０！４／Ｎｌｋ含可する培地でプラスミ
ド金倉むコロニー金分離し、５Ｖ４Ｑの初期プロモータ
ーに関してＦＦＫ２ＬおよびＰＸ３に２Ｌの正しい定位
【有するプラスミドを制限酵素切断地図によって特定し
た。発現ベクターはｐＫＣＲ−ＦＦＫ２ＬおよびｐＫｃ
’Ｒ−ＰＸ２に２Ｌと称する。これらのグラスミドから
それぞれの発現カセットｋ　Ａｈｚ　ＩＩ　−８ａｌ　
ｌ断片として分離した。この九めにｐＫＣＲ−ＦＦＫ２
ＬおよびｐＫｃＲ−ＰＸ２に２Ｌ　？！−８ａｌ　ｌで
部分的に切断し、次にＡａｔ　３１で切断し、断−ｔヌ
クレアーゼＳ１で平滑にし、相応の断片を低融点の寒天
ｒルで分離するＣとにより分離した。これらの断片ｔ１
増幅可能のベクターｐＡｄＤ　２６　Ｓ　Ｖ　（Ａ　）
（Ｋａｕｆｍａｎ　Ｍよぴ””ｐｔ　　１９８２　＊　
　Ｊ−Ｍｏｌ。

阻ｏ１．１５９，６０１−＜５２１　〕の、クレノウで
充填され九ＢｃｏＲＩの位置に挿入し友。この結合され
た反応複合体上ｇ、　ｃｏｌｉ　ＨＢ　１０１に移入し
、テトラサイクリンを含有する培地（１０μＩ／成）で
コロニー七分離し次。制限解析によって相応の組換え体
上見出し九〇同解析にまたｔ−ＰＡ誘導体の発現カセッ
トの定位上発現ベクターに対して相対的に決めた。分離
した発現ベクターｆｘ　ｐｓＶ　−ＦＦＫ２Ｌ　−ｄｈ
ｆｒおよびｐｓＶ　−ＦＫ２に２Ｌ　−ｄｈｆｒと称す
る（第６図）。

ｐｓＶ　−ＦＦＫ２Ｌ　−ｄｈｆｒ　Ｂ、８ａｌ　Ｉ’
ｆ用いて制限すると長さ２４７０　ｂｐおよび７１００
　ｂｐの２個の断片が得られることを特徴とする。

ｐｓＶ　−ＦＫ２に２Ｌ　−ｄｈｆｒ　ｈ、Ｓａｌ　ｌ
で制限すると長さ２４７０　ｂｐおよび６８６０ｂｐの
２個の断片が得られること全特性とする。

例４ ｍ成ＦＦＫ２ＬおよびＦ’に２に２Ｌを分泌するＣＨＯ
細胞の樹立 ＣＨＯｄｈｆｒ″″　細胞　（ＤＵＫＸ　　、　　　Ｄ
Ｅ（！ＰＲ’″　ン　、　　ｇｃＡｃｅ８８０７２１０
３ｋ、ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎによって記載さ
れているように増殖させた（　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、
　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、σ８Ａ　　７７　（１９８０）
、４２１６−４２２０）。該細胞ｔ１アデノシン、デオ
キシアデノシン、チミジンおよびペニシリンとストレプ
トマイシン上官む１０チクシ胎児血清の追加されている
α−培地で増重さゼる。

永続的発現のために、燐酸カルシウムと最終容積４　ａ
ｔ中の適当な発現祷、収体（ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ
ｄｅｒＥｂ、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　　５２　（１９７３
Ｌ４５６〜４６７）２０μμとの沈殿物全製造し友。こ
の沈殿物ｌ　ｌ［ｌ會９儂培養皿中の１（３ｍｌ培地中
の３１０’〜Ｉ　Ｘ　１０’細胞に加えた。同細胞を沈
殿物と共に６〜１８時間恒温保持し、培地？除去し、Ｔ
ＢＳ　（トリスＨＣｔ（出７．４）２５ｍｍｏｌ／／、
　ＮａＣ６１５７ｍｍｏｌ／／、ＫＣｌ５　ｍｍｏｌ　
／　ｌ　％Ｎａ２ｆ（ＰＯ４（ｐｋｉ　７−４　）　０
．６ｍｍｏｌ　／Ｊ）１０＋ｊで洗浄し、トリス緩衝塩
Ｍ溶液（ＴＢＳ　）中の２０＋１グリセリン’ｌ　ｔｕ
ｔと一緒に３〜５．５分恒温保持し、ＴＢＳで洗浄し、
次に適当な培地で恒温保持し九。ＣａＯ細胞を移入後４
８時間で１：１０形質転換させ、選択培地（Ｋａｕｆｍ
ａｎおよび８ｈａｒｐ　、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ
、　１５９（’Ｉ　９８２）６０１〜６２１〕で増殖さ
せた。

この選択培地は透析された１０幅ウつ胎児血清會含むα
−培地であシ、従りてアデノシン、デオキシアデノシン
およびチミジンを含有しない。

移入後２〜３′８後にトリプシン処理によりクローンを
分離し、天童培養の几めに利用し、上澄みの？、−ＰＡ
免疫活性をＫｌ、Ｉｓ人によって検ぺ九。次に場性りロ
ーンｔプールし、それぞれｌＸ１０６ｍ胞を有する４個
の平板を、メトトレキセート２０　ｎｍｏｌ　／　７３
紮含む培地に入れ九〇２週間後にメトトレキセート耐性
クローンが出現した。これらのクローンを増殖集密さゼ
、メトトレキセート１００　ｎｍｏｌ　／　／　ｋ　富
有する培地に暴露しｔ０耐性細胞に、メトトレキセート
濃度の段階的増大（３Ｑ　Ｑ　ｎｍｏｌ　／　ｌ、　５
００ｎｍｏｌ　／　ｌ　％　　１　μｍｏｌ　／　７３
および５　μｍｏｌ　／　ｌ　）を受けさせた。最後に
核クローンを限定的な希釈によって分離し、上澄みのｔ
−ＰＡ免疫活性を検べることによってｔ−ＰＡミューテ
ィンの最良の生成物を見出し九。

例５ ＥＬＩ８Ａ　（ｅｎｚｙｍｅ　１ｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕ
ｎｏｓｏｒｂｅｉ＊ｔ　ａｓｓａｙ）によるｔ−ＰＡ％
Ｆ’Ｆ’に２ＬおよびＦ’に２に２Ｌの測定 ９６個の穴を有するｆｆｍ１滴定板（ＮｕｎＣ社）に、
燐酸カリウム緩衝液（ｐ）１７−５　）　５０　ｍｍｏ
ｌ　／ｌ中の抗−ｃ−ｐＡ−ｘｇＧｃ８ｔＭｌ／ｍｅ）
ｋｍ布し、ＰＨ１（ＮａＣｔＯ，１５ｍｏｌ　／　ｌ　
、燐酸ナトリフＡ　ＣｐＨ７−５）　１０　ｍｍｏｌ　
／ｌ　：ｌ、０．５１　Ｒ８Ａ（ウシ血清アルブミ／）
で３回洗浄した。前記穴上組織培養上澄み２００μｊと
共に４゛０で１２時間恒温保持した。上澄みｔ注意栗く
除去し、収入をＰＨ１（燐酸塩緩衛塩類溶液）で３回洗
浄し友。次に該穴ｔペルオキシダーゼー複合ヒツジ抗ｔ
　−ＰＡＩｇＧ　、過酸化水素およびＡＢＴ８［Ｆ］（
２、２’−アジノージ（６−ニチルベンデチアデリンー
スルホネート（６）〕と−緒に恒温保持し７ｔｏ４０５
ｎｍで吸収量全測定し、吸収量と校正曲線との比較によ
って評ｇｆＪを行った。

例６ ｔ−ＰＡ％Ｆ’Ｆ’に２ＬおよびＦＫ２に２Ｌのフィブ
リノ−デフ賦活プラスミノーゲン分解活性の測定 プラスミノーデ／アクチベーター活性金、間接的な分光
光度試験（Ｖｅｒｈｅｉｊｅｎ等、　Ｔｈｒｏｍｂ。

Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ４８　（１９８２Ｌ　　２６６
〜２６９）によって測定し九。ｔ−ＰＡはプラスミノー
デン鷺活性セリンプロテアーゼであるプラスミンに変へ
、同プ２スミ／は発色性基質のペプチド結合を加水分解
し、この基質の吸収ｔ４０５ｎｍで最高３時間１での時
間間隔で追跡し次。発色性基質としてはトシル−グリフ
ループロリル−リシン−４−ニトラニリドーアセテート
（ＣｈｒｏｍｏｚｙｍｏＰ　Ｌ　）　１ｉ使用しｔ６該
試験は２５℃でトリｘ　ａｃｚ　ｃ　ｐｈ八へ）　０−
１　ｍｏｌ　／　／　。

トウイーン８０〔プラスミノーゲン０．１６μｍｏｌ／
ｌ、ＣＮＢｒ消化フィブリノーゲン（１２０μｇ／ｌ）
およびＣｈｒｏｍｏｚｙｍ’　Ｐ　Ｌ　：Ｉ　Ｑ、ｌ　
５　ｍｏｌ　／ノ中で行なった。

例７ 構Ｋ　ｔ、　−Ｐ　Ａ１７’ｃｆｉＦ’に２に２Ｌ　ｔ
−分泌丁ｂＣＨＯ細胞の培養上管みを、フィブリノーゲ
ン賦活タンパク質分解活性について、例６で記載し九よ
うにして試駿し、同時に上澄み液中のｔ−Ｐ　Ａ　’！
　７’ｊｒＸ、Ｆ’に２に２Ｌ　Ｉ）量ｉ　ＥＬＩＳＡ
によって測定し之。この際ＰＫ２に２Ｉ、のタンパク質
分解活性がフィブリノーゲンのＣＮＢｒ　Ｆｒ片により
テｔ−ＰＡのタンパク質分解活性とほぼ同じ強さ（約２
０〜６０倍）で賦活されることが判っ友。意外にも、Ｆ
Ｋ２に２ＬはＺ−ＰＡと比べると３倍増大された比活性
を有することが判っ九。構成ＰＫ２に２Ｌ　ｔ−分泌す
る０ｆ（Ｏ細胞は、第１の増幅段階ｖｋＫすでにベトリ
シャーレから溶去され九。

Ｏの原因は、血清中に存在するプラスミノーゲンから活
性セリンプロテアーゼするプラスミン音生じる、Ｆ’に
２に２Ｌによる活性化に帰せられる。免疫吸清され几培
養上溌みのｒルミ気泳動法による分離およびヒトのｔ−
ＰＡに対するペルオキシダーゼ標識抗体を用いる前記上
澄みの視覚化によシ、上澄み中にプロテアーゼ阻害物質
友るアプロテイニンの存在する場合には主として一本鎖
のＦ’に２に２Ｌが検出され、同物質の存在しない場合
にに二本鎖のＦＫ２に２Ｌが検出され友。

増幅可能な発埃ベクターであるｐｓＶ−ＦＦＫ２Ｌ−ｄ
ｈｆｒの移入され九ＣＨＯ細胞の上澄みハ、フィブリノ
ーゲンのＣＮＢ　ｒ断片の存在する場合に１−）ｔ−Ｐ
Ａのタンパク質分解活性を高め念。この誘導体は％ｔ−
ＦＡとはぼ同じ比活性ヶ有している。

【図面の簡単な説明】

第１図にｔ−ＰＡの構造を示す模式図であり、第２図は
本発明によるプラスミドｐＡ１８／１およびｐＡ１９／
１　の製造過程を示す模式図であシ、第６図に本発明に
よるプラスミドｐ８Ｖ　−ＦＦＫ２Ｌ−ｄｈｆｒおよび
ｐ８Ｖ　−ＦＫ２に２Ｌ　−ｄｈｆｒの製造過程を示す
模式図である。 Ｆｉｇ　、　１ ガー 上皮生長因子に対する相同性を有する 領域

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、フイブリンフインガーおよびクリンゲルII領域の少
   なくとも一つの天然アミノ酸配列を数倍化された形で有
   することを特徴とする組織プラスミノーゲンアクチベー
   ターミユーテイン。 ２、数個の完全なｔ−ＰＡ遺伝子を適当なベクター中に
   直接次々と挿入し、オリゴヌクレオチド部位の突然変異
   誘発によつて生成物中で数倍化されていてはならないア
   ミノ酸をコ ードしている配列を除去し、このようにして得られた突
   然変異ベクターを適当な細胞に導入しかつ増幅し、その
   中で欠失が起ったベクターを取得し、該ベクターを適当
   な宿主細胞で発現させることを特徴とする請求項１記載
   の組織プラスミノーゲンアクチベーターミユーテインの
   製造方法。 ３、請求項１記載の組織プラスミノーゲンアクチベータ
   ーミユーテインを含有することを特徴とする凝血塊溶解
   剤。