JP2575369B2 - 新規ペプチドのプラスミノ−ゲンアクチベ−タ− - Google Patents
新規ペプチドのプラスミノ−ゲンアクチベ−タ−Info
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6456—Plasminogen activators
- C12N9/6459—Plasminogen activators t-plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
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- C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、組織プラスミノーゲンアクチベーター活性
を持ち，遺伝子工学の技法により天然のプラスミノーゲ
ンアクチベーターに比べ改良された性質を有するポリペ
プチド，それをコードするDNA配列およびその作成法に
関する。また本発明は，上記DNA配列を含有する発現構
築物，それを含有するプラスミド，および該プラスミド
を保持する細胞に関する。さらにまた本発明は，上記ポ
リペプチドを含む製剤組成物に関する。
を持ち，遺伝子工学の技法により天然のプラスミノーゲ
ンアクチベーターに比べ改良された性質を有するポリペ
プチド，それをコードするDNA配列およびその作成法に
関する。また本発明は，上記DNA配列を含有する発現構
築物，それを含有するプラスミド，および該プラスミド
を保持する細胞に関する。さらにまた本発明は，上記ポ
リペプチドを含む製剤組成物に関する。
（従来技術） 組織プラスミノーゲンアクチベーター（tPA）は，凝
血の溶解に関連のあるセリンプロテアーゼである。この
分子は，他の天然に生じるポリペプチドと相同なアミノ
酸配列を示すいくつかの明確な領域を有する。Ｎ端末の
最初の領域は，フィブロネクチンと相同性のある領域で
ある。次の領域は，種々の成長因子と相同性を持つ。こ
の成長因子領域につづいて２つのクリングル領域があ
る。最後に，他のセリンプロテアーゼと類似性の見られ
る活性部位がある。
血の溶解に関連のあるセリンプロテアーゼである。この
分子は，他の天然に生じるポリペプチドと相同なアミノ
酸配列を示すいくつかの明確な領域を有する。Ｎ端末の
最初の領域は，フィブロネクチンと相同性のある領域で
ある。次の領域は，種々の成長因子と相同性を持つ。こ
の成長因子領域につづいて２つのクリングル領域があ
る。最後に，他のセリンプロテアーゼと類似性の見られ
る活性部位がある。
組織プラスミノーゲンアクチベーターおよびそのin
vivoでの凝血溶解能に関連して，少なくとも４種の異な
った特性が存在する。まず第１には，プラスミノーゲン
を開裂して，フィブリンを分解するプラスミンを生産す
るプロテアーゼ機能の比活性である。第２の特性は，プ
ラスミノーゲンアクチベーター阻害剤の阻害に対する感
受性である。第３の特性は，プラスミノーゲン分解活性
におけるプラスミノーゲンアクチベーターのフィブリン
依存性である。第４の特性は,tPAのフィブリン表面への
結合性である。これらの要因の各々が、凝血存在下でプ
ラスミノーゲンアクチベーターがプラスミノーゲンをプ
ラスミンに分解するその速さや特異性に役割をなしてい
る。従って，実質的な問題は，これらのカテゴリーに属
する一種かそれ以上の特性を改善するような組織プラス
ミノーゲンアクチベーター活性を有するポリペプチドが
生産できることにあろう。
vivoでの凝血溶解能に関連して，少なくとも４種の異な
った特性が存在する。まず第１には，プラスミノーゲン
を開裂して，フィブリンを分解するプラスミンを生産す
るプロテアーゼ機能の比活性である。第２の特性は，プ
ラスミノーゲンアクチベーター阻害剤の阻害に対する感
受性である。第３の特性は，プラスミノーゲン分解活性
におけるプラスミノーゲンアクチベーターのフィブリン
依存性である。第４の特性は,tPAのフィブリン表面への
結合性である。これらの要因の各々が、凝血存在下でプ
ラスミノーゲンアクチベーターがプラスミノーゲンをプ
ラスミンに分解するその速さや特異性に役割をなしてい
る。従って，実質的な問題は，これらのカテゴリーに属
する一種かそれ以上の特性を改善するような組織プラス
ミノーゲンアクチベーター活性を有するポリペプチドが
生産できることにあろう。
関連文献の簡単な説明 天然に存在するタンパクの元来の性質を高めるため
の，変異処理の利用については,Craik et al.,Science
（1985）228:291;Rosenberg et al.,Nature（1984）31
2:77−80およびWilkinson et al.,Nature（1984）307:
187−188に報告されている。Andreasen et al.,EMBO
J.（1984）３:51−56は,tPAの開裂部位でのクリッピン
グがプロテアーゼ活性に必要であることを報告した。Ny
et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA（1984）81:5355
は，ヒトtPAの構造と，機能的および構造的ドメインに
対するイントロンとエクソンの相互関係について報告し
た。A.J.van Zonneveld et al.,Abstract from ISTH M
eeting,July 14−19,1985は，ヒトの組織型プラスミノ
ーゲンアクチベーターの構造と機能の相互関係について
報告した。（J.Biol Chem.（1986）261:14214−14218）
Opdenakker et al.,EMBO Workshop on Plasminogen Ac
tivation（Amalfi,Italy,Octcber 14−18,1985）は，炭
水化物側鎖の除去によるtPA活性への影響について報告
した。Loskutoff et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA（19
83）80:2956−2960およびLoskutoff,Thrombos,Haemosto
s,THHADQ, 54（１）:118（S699）は，プラスミノーゲ
ンアクチベーター阻害剤の特性について述べた。
の，変異処理の利用については,Craik et al.,Science
（1985）228:291;Rosenberg et al.,Nature（1984）31
2:77−80およびWilkinson et al.,Nature（1984）307:
187−188に報告されている。Andreasen et al.,EMBO
J.（1984）３:51−56は,tPAの開裂部位でのクリッピン
グがプロテアーゼ活性に必要であることを報告した。Ny
et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA（1984）81:5355
は，ヒトtPAの構造と，機能的および構造的ドメインに
対するイントロンとエクソンの相互関係について報告し
た。A.J.van Zonneveld et al.,Abstract from ISTH M
eeting,July 14−19,1985は，ヒトの組織型プラスミノ
ーゲンアクチベーターの構造と機能の相互関係について
報告した。（J.Biol Chem.（1986）261:14214−14218）
Opdenakker et al.,EMBO Workshop on Plasminogen Ac
tivation（Amalfi,Italy,Octcber 14−18,1985）は，炭
水化物側鎖の除去によるtPA活性への影響について報告
した。Loskutoff et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA（19
83）80:2956−2960およびLoskutoff,Thrombos,Haemosto
s,THHADQ, 54（１）:118（S699）は，プラスミノーゲ
ンアクチベーター阻害剤の特性について述べた。
（発明が解決しようとする問題点） tPA分子に欠失や置換を独立にまたは組み合わせて採
用することにより，プラスミノーゲンアクチベーター活
性を持つポリペプチドが提供され，ここでグリコシル化
は変化を受け,C−末端は不完全となり，開裂部位は修飾
されている。その結果得られた生成物は，プラスミノー
ゲンを活性化して，フィブリン魂を溶解したり，凝血形
成を妨げたりするのに使用できることがわかる。これら
のポリペプチドは，部位特異的変異形成によって生成し
た変異遺伝子を発現させることによって産出される。
用することにより，プラスミノーゲンアクチベーター活
性を持つポリペプチドが提供され，ここでグリコシル化
は変化を受け,C−末端は不完全となり，開裂部位は修飾
されている。その結果得られた生成物は，プラスミノー
ゲンを活性化して，フィブリン魂を溶解したり，凝血形
成を妨げたりするのに使用できることがわかる。これら
のポリペプチドは，部位特異的変異形成によって生成し
た変異遺伝子を発現させることによって産出される。
（問題点を解決するための手段） 本発明のポリペプチドは，凝血を溶解することにおけ
る組織プラスミノーゲンアクチベーター活性を持つポリ
ペプチドであって，天然の組織プラスミノーゲンアクチ
ベーターの比活性の少なくとも0.3の比活性を有し，ま
た組織プラスミノーゲンアクチベーター活性を持つ天然
に生じるポリペプチド中のグリコシル化部位の数を減ら
すこと,C末端で少なくとも３個のアミノ酸を欠失させる
こと，または開裂部位のアミノ酸を置換することの結果
として，比活性，活性のフィブリン依存性，または阻害
剤感受性に関して少なくとも１つの改良された性質を持
つ。
る組織プラスミノーゲンアクチベーター活性を持つポリ
ペプチドであって，天然の組織プラスミノーゲンアクチ
ベーターの比活性の少なくとも0.3の比活性を有し，ま
た組織プラスミノーゲンアクチベーター活性を持つ天然
に生じるポリペプチド中のグリコシル化部位の数を減ら
すこと,C末端で少なくとも３個のアミノ酸を欠失させる
こと，または開裂部位のアミノ酸を置換することの結果
として，比活性，活性のフィブリン依存性，または阻害
剤感受性に関して少なくとも１つの改良された性質を持
つ。
本発明のポリペプチドは，組織プラスミノーゲン活性
を持つポリペプチドであって，ヒトの組織プラスミノー
ゲンアクチベーターに由来し，そしてアミノ酸位置117,
184および448のうち少なくとも２ヶ所でAsnのGlnによる
置換を持つ。
を持つポリペプチドであって，ヒトの組織プラスミノー
ゲンアクチベーターに由来し，そしてアミノ酸位置117,
184および448のうち少なくとも２ヶ所でAsnのGlnによる
置換を持つ。
本発明のポリペプチドは，組織プラスミノーゲン活性
を持つポリペプチドであって，ヒトの組織プラスミノー
ゲンアクチベーターに由来し，そしてMet525からPro527
までを欠いている。
を持つポリペプチドであって，ヒトの組織プラスミノー
ゲンアクチベーターに由来し，そしてMet525からPro527
までを欠いている。
本発明のポリペプチドは，組織プラスミノーゲン活性
を持つポリペプチドであって，ヒトの組織プラスミノー
ゲンアクチベーターに由来し，そしてLys277がArgに置
換されている。
を持つポリペプチドであって，ヒトの組織プラスミノー
ゲンアクチベーターに由来し，そしてLys277がArgに置
換されている。
本発明のポリペプチドは，ヒトの組織プラスミノーゲ
ンアクチベーターに由来し組織ペラスミノーゲン活性を
持つポリペプチドであって，アミノ酸117,184および448
の少なくとも１ヶ所のグリコシル化部位でAsnがGlnに置
換されており,Met525からPro527までの配列を欠いてい
る。
ンアクチベーターに由来し組織ペラスミノーゲン活性を
持つポリペプチドであって，アミノ酸117,184および448
の少なくとも１ヶ所のグリコシル化部位でAsnがGlnに置
換されており,Met525からPro527までの配列を欠いてい
る。
本発明のポリペプチドは，ヒトの組織プラスミノーゲ
ンアクチベーターに由来し組織プラスミノーゲン活性を
持つポリペプチドであって，アミノ酸117,184および448
の少なくとも１ヶ所のグリコシル化部位でAsnがGlnに置
換されており,Lsy277がArgに置換されている。
ンアクチベーターに由来し組織プラスミノーゲン活性を
持つポリペプチドであって，アミノ酸117,184および448
の少なくとも１ヶ所のグリコシル化部位でAsnがGlnに置
換されており,Lsy277がArgに置換されている。
本発明の薬剤組成物は，凝血を溶解することにおける
組織プラスミノーゲンアクチベーター活性を持つポリペ
プチドを凝血を溶解するに充分な量含みまた生理学的に
受容可能なキャリアを含む薬剤組成物であって，該ポリ
ペプチドが天然の組織プラスミノーゲンアクチベーター
の比活性の少なくとも0.3の比活性を有し，また組織プ
ラスミノーゲンアクチベーター活性を持つ天然に生じる
ポリペプチド中のグリコシル化部位の数を減らすこと,C
末端で少なくとも３個のアミノ酸を欠失させること，ま
たは開裂部位のアミノ酸を置換することの結果として，
比活性，活性のフィブリン依存性，または阻害剤感受性
に関して少なくとも１つの改良された性質を持つポリペ
プチドである。
組織プラスミノーゲンアクチベーター活性を持つポリペ
プチドを凝血を溶解するに充分な量含みまた生理学的に
受容可能なキャリアを含む薬剤組成物であって，該ポリ
ペプチドが天然の組織プラスミノーゲンアクチベーター
の比活性の少なくとも0.3の比活性を有し，また組織プ
ラスミノーゲンアクチベーター活性を持つ天然に生じる
ポリペプチド中のグリコシル化部位の数を減らすこと,C
末端で少なくとも３個のアミノ酸を欠失させること，ま
たは開裂部位のアミノ酸を置換することの結果として，
比活性，活性のフィブリン依存性，または阻害剤感受性
に関して少なくとも１つの改良された性質を持つポリペ
プチドである。
本発明のDNA配列は，ヒトの組織プラスミノーゲンア
クチベーターに由来し組織プラスミノーゲン活性を持つ
ポリペプチドをコードするDNA配列であって，該ポリペ
プチドが以下のうちの少なくとも１つを持つという点で
ヒトの組織プラスミノーゲンアクチベーターと異なる：
（ａ）117−119,184−186および448−450のグリコシル
化部位の少なくとも２ヶ所の障害；（ｂ）Ｃ末端での少
なくとも３個のアミノ酸の欠失；および（ｃ）ヒトの組
織プラスミノーゲンアクチベーターの開裂部位のアミノ
酸の置換。
クチベーターに由来し組織プラスミノーゲン活性を持つ
ポリペプチドをコードするDNA配列であって，該ポリペ
プチドが以下のうちの少なくとも１つを持つという点で
ヒトの組織プラスミノーゲンアクチベーターと異なる：
（ａ）117−119,184−186および448−450のグリコシル
化部位の少なくとも２ヶ所の障害；（ｂ）Ｃ末端での少
なくとも３個のアミノ酸の欠失；および（ｃ）ヒトの組
織プラスミノーゲンアクチベーターの開裂部位のアミノ
酸の置換。
本発明の発現構築物は，転写の順に，転写と翻訳の開
始領域，該開始領域の転写と翻訳の制御調節下にあるDN
A配列，および転写と翻訳の終結領域を含有する発現構
築物であって，該DNA配列がヒトの組織プラスミノーゲ
ンアクチベーターに由来し組織プラスミノーゲン活性を
持つポリペプチドをコードするDNA配列であって，該ポ
リペプチドが（ａ）117−119,184−186および448−450
のグリコシル化部位の少なくとも２ヶ所の障害，（ｂ）
Ｃ末端での少なくとも３個のアミノ酸の欠失，および
（ｃ）ヒトの組織プラスミノーゲンアクチベーターの開
裂部位のアミノ酸の置換のうちの少なくとも１つを持つ
という点でヒトの組織プラスミノーゲンアクチベーター
と異なるポリペプチドである。
始領域，該開始領域の転写と翻訳の制御調節下にあるDN
A配列，および転写と翻訳の終結領域を含有する発現構
築物であって，該DNA配列がヒトの組織プラスミノーゲ
ンアクチベーターに由来し組織プラスミノーゲン活性を
持つポリペプチドをコードするDNA配列であって，該ポ
リペプチドが（ａ）117−119,184−186および448−450
のグリコシル化部位の少なくとも２ヶ所の障害，（ｂ）
Ｃ末端での少なくとも３個のアミノ酸の欠失，および
（ｃ）ヒトの組織プラスミノーゲンアクチベーターの開
裂部位のアミノ酸の置換のうちの少なくとも１つを持つ
という点でヒトの組織プラスミノーゲンアクチベーター
と異なるポリペプチドである。
本発明のプラスミドは，宿主中で機能的な複製系およ
び発現構築物を含有するプラスミドであって，該発現構
築物が，転写の順に，転写と翻訳の開始領域，該開始領
域の転写と翻訳の制御調節下にあるDNA配列，および転
写と翻訳の終結領域を含有する発現構築物であって，該
DNA配列がヒトの組織プラスミノーゲンアクチベーター
に由来し組織プラスミノーゲン活性を持つポリペプチド
をコードするDNA配列であって，該ポリペプチドが
（ａ）117−119,184−186および448−450のグリコシル
化部位の少なくとも２ヶ所の障害，（ｂ）Ｃ末端での少
なくとも３個のアミノ酸の欠失，および（ｃ）ヒトの組
織プラスミノーゲンアクチベーターの開裂部位のアミノ
酸の置換のうちの少なくとも１つを持つという点でヒト
の組織プラスミノーゲンアクチベーターと異なるポリペ
プチドである。
び発現構築物を含有するプラスミドであって，該発現構
築物が，転写の順に，転写と翻訳の開始領域，該開始領
域の転写と翻訳の制御調節下にあるDNA配列，および転
写と翻訳の終結領域を含有する発現構築物であって，該
DNA配列がヒトの組織プラスミノーゲンアクチベーター
に由来し組織プラスミノーゲン活性を持つポリペプチド
をコードするDNA配列であって，該ポリペプチドが
（ａ）117−119,184−186および448−450のグリコシル
化部位の少なくとも２ヶ所の障害，（ｂ）Ｃ末端での少
なくとも３個のアミノ酸の欠失，および（ｃ）ヒトの組
織プラスミノーゲンアクチベーターの開裂部位のアミノ
酸の置換のうちの少なくとも１つを持つという点でヒト
の組織プラスミノーゲンアクチベーターと異なるポリペ
プチドである。
本発明のポリペプチドは，ヒトの組織プラスミノーゲ
ンアクチベーターに由来し組織プラスミノーゲン活性を
持つポリペプチドであって,Lys277がArgに置換されてお
り，またMet525からPro527までを欠いている。
ンアクチベーターに由来し組織プラスミノーゲン活性を
持つポリペプチドであって,Lys277がArgに置換されてお
り，またMet525からPro527までを欠いている。
本発明のポリペプチドは，ヒトの組織プラスミノーゲ
ンアクチベーターに由来し組織プラスミノーゲン活性を
持つポリペプチドであって，アミノ酸位置117,184およ
び448の少なくとも２ヶ所においてAsnがGlnに置換され
ており,Lys277がArgに置換されており，またMet525から
Pro527までを欠いている。
ンアクチベーターに由来し組織プラスミノーゲン活性を
持つポリペプチドであって，アミノ酸位置117,184およ
び448の少なくとも２ヶ所においてAsnがGlnに置換され
ており,Lys277がArgに置換されており，またMet525から
Pro527までを欠いている。
本発明の細胞は，プラスミドを含む生育可能な細胞で
あって，該プラスミドが宿主中で機能的な複製系および
発現構築物を含有するプラスミドであって，該発現構築
物が，転写の順に，転写と翻訳の開始領域，該開始領域
の転写と翻訳の制御調節下にあるDNA配列，および転写
と翻訳の終結領域を含有する発現構築物であって，該DN
A配列がヒトの組織プラスミノーゲンアクチベーターに
由来し組織プラスミノーゲン活性を持つポリペプチドを
コードするDNA配列であって，該ポリペプチドが（ａ）1
17−119,184−186および448−450のグリコシル化部位の
少なくとも２ヶ所の障害，（ｂ）Ｃ末端での少なくとも
３個のアミノ酸の欠失；および（ｃ）ヒトの組織プラス
ミノーゲンアクチベーターの開裂部位のアミノ酸の置換
のうち少なくとも１つを持つという点でヒトの組織プラ
スミノーゲンアクチベーターと異なるポリペプチドであ
る。
あって，該プラスミドが宿主中で機能的な複製系および
発現構築物を含有するプラスミドであって，該発現構築
物が，転写の順に，転写と翻訳の開始領域，該開始領域
の転写と翻訳の制御調節下にあるDNA配列，および転写
と翻訳の終結領域を含有する発現構築物であって，該DN
A配列がヒトの組織プラスミノーゲンアクチベーターに
由来し組織プラスミノーゲン活性を持つポリペプチドを
コードするDNA配列であって，該ポリペプチドが（ａ）1
17−119,184−186および448−450のグリコシル化部位の
少なくとも２ヶ所の障害，（ｂ）Ｃ末端での少なくとも
３個のアミノ酸の欠失；および（ｃ）ヒトの組織プラス
ミノーゲンアクチベーターの開裂部位のアミノ酸の置換
のうち少なくとも１つを持つという点でヒトの組織プラ
スミノーゲンアクチベーターと異なるポリペプチドであ
る。
本発明の方法は,DNA配列を作成するための方法であっ
て，該DNA配列がヒトの組織プラスミノーゲンアクチベ
ーターに由来し組織プラスミノーゲン活性を持つポリペ
プチドをコードするDNA配列であり，該ポリペプチドが
（ａ）117−119,184−186および448−450のグリコシル
化部位の少なくとも２ヶ所の障害，（ｂ）Ｃ末端での少
なくとも３個のアミノ酸の欠失，および（ｃ）ヒトの組
織プラスミノーゲンアクチベーターの開裂部位のアミノ
酸の置換のうち少なくとも１つを持つという点でヒトの
組織プラスミノーゲンアクチベーターと異なるポリペプ
チドであるDNA配列を作成するための方法であって，以
下の工程：（１）組織プラスミノーゲンアクチベーター
活性を持つ天然に生じるポリペプチドをコードする鋳型
を含有する原核生物プラスミドの一本鎖に,117−119,18
4−186および448−450のアミノ酸をコードするグリコシ
ル化部位の少なくとも２ヶ所のグリコシル化部位での障
害,C末端での少なくとも３個のアミノ酸の欠失，または
開裂部位のアミノ酸の置換を生じるミスマッチをもつオ
リゴデオキシヌクレオチドをアニーリングさせて，部分
的な二本鎖プラスミドを供する工程であって，ここで，
該オリゴデオキシヌクレオチドが，標的鋳型に関して85
から90％の相補性を有すること，ミスマッチされる座位
の反対側の相補性領域の融点がほぼ等しいこと，そして
前記変異形成座位以外の前記プラスミドのどの部位でも
70％より低い相補性を持つことにより特徴づけられる工
程；（２）修正能力を欠くDNAポリメラーゼにより該オ
リゴデオキシヌクレオチドを伸長して，二本鎖プラスミ
ドを供する工程；（３）該二本鎖プラスミドにより宿主
の原核生物細胞を形質転換し，該細胞を増殖させること
により該二本鎖プラスミドを複製させる工程；および
（４）該オリゴデオキシヌクレオチドの配列を持つプラ
スミドを単離する工程，を包含する。
て，該DNA配列がヒトの組織プラスミノーゲンアクチベ
ーターに由来し組織プラスミノーゲン活性を持つポリペ
プチドをコードするDNA配列であり，該ポリペプチドが
（ａ）117−119,184−186および448−450のグリコシル
化部位の少なくとも２ヶ所の障害，（ｂ）Ｃ末端での少
なくとも３個のアミノ酸の欠失，および（ｃ）ヒトの組
織プラスミノーゲンアクチベーターの開裂部位のアミノ
酸の置換のうち少なくとも１つを持つという点でヒトの
組織プラスミノーゲンアクチベーターと異なるポリペプ
チドであるDNA配列を作成するための方法であって，以
下の工程：（１）組織プラスミノーゲンアクチベーター
活性を持つ天然に生じるポリペプチドをコードする鋳型
を含有する原核生物プラスミドの一本鎖に,117−119,18
4−186および448−450のアミノ酸をコードするグリコシ
ル化部位の少なくとも２ヶ所のグリコシル化部位での障
害,C末端での少なくとも３個のアミノ酸の欠失，または
開裂部位のアミノ酸の置換を生じるミスマッチをもつオ
リゴデオキシヌクレオチドをアニーリングさせて，部分
的な二本鎖プラスミドを供する工程であって，ここで，
該オリゴデオキシヌクレオチドが，標的鋳型に関して85
から90％の相補性を有すること，ミスマッチされる座位
の反対側の相補性領域の融点がほぼ等しいこと，そして
前記変異形成座位以外の前記プラスミドのどの部位でも
70％より低い相補性を持つことにより特徴づけられる工
程；（２）修正能力を欠くDNAポリメラーゼにより該オ
リゴデオキシヌクレオチドを伸長して，二本鎖プラスミ
ドを供する工程；（３）該二本鎖プラスミドにより宿主
の原核生物細胞を形質転換し，該細胞を増殖させること
により該二本鎖プラスミドを複製させる工程；および
（４）該オリゴデオキシヌクレオチドの配列を持つプラ
スミドを単離する工程，を包含する。
本発明の感受性は，ヒトの組織プラスミノーゲンアク
チベーターと実質的に同じアミノ酸配列を持つポリペプ
チドであって，次の生理学的性質の少なくとも１つを持
つポリペプチド：天然に生じるヒトの組織プラスミノー
ゲンアクチベーターと比較して,6.2から7.0の範囲の比
活性;1.3から2.5の範囲のフィブリン依存性；およびプ
ラスミノーゲンアクチベーター阻害剤の阻害に対し10か
ら30％の範囲で低下した。
チベーターと実質的に同じアミノ酸配列を持つポリペプ
チドであって，次の生理学的性質の少なくとも１つを持
つポリペプチド：天然に生じるヒトの組織プラスミノー
ゲンアクチベーターと比較して,6.2から7.0の範囲の比
活性;1.3から2.5の範囲のフィブリン依存性；およびプ
ラスミノーゲンアクチベーター阻害剤の阻害に対し10か
ら30％の範囲で低下した。
以下に本発明を詳細に説明する。
プラスミノーゲンアクチベーターとしての特性が高め
られた新規ポリペプチドが，そのようなポリペプチドを
コードするDNAコード配列，適切な宿主内でそのような
配列を発現させるための発現カセット，新規ポリペプチ
ドを発現できる宿主，および新規ポリペプチドを生産す
る方法を含めて，提供される。新規ポリペプチドは，少
なくともひとつのグリコシル化部位に変化を含み,272か
ら280までの領域，特にPhe274−Arg275−Ile276−Lys
277（FRIK）にある開裂部位に少なくともひとつの変化
を含み，そして／または，分子の一端かまたは両端，特
にＣ−末端の切断を含む。唯一の修飾がグリコシル化部
位にあるとき,177−119と184−186の両方のグリコシル
化部位は同様にまたは異なって修飾される。（使用する
アミノ酸の番号付けはPennica et al.,Nature（1983）
301:214−221の報告に基づき，グリシン−アラニン−ア
ルギニン−セリン−チロシンの配列のセリンから始め
る。）組織プラスミノーゲンアクチベーター活性を持ち
ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーターに由来するポ
リペプチドにこのような変化を導入すると，生理学的特
性の改善が達成可能である。
られた新規ポリペプチドが，そのようなポリペプチドを
コードするDNAコード配列，適切な宿主内でそのような
配列を発現させるための発現カセット，新規ポリペプチ
ドを発現できる宿主，および新規ポリペプチドを生産す
る方法を含めて，提供される。新規ポリペプチドは，少
なくともひとつのグリコシル化部位に変化を含み,272か
ら280までの領域，特にPhe274−Arg275−Ile276−Lys
277（FRIK）にある開裂部位に少なくともひとつの変化
を含み，そして／または，分子の一端かまたは両端，特
にＣ−末端の切断を含む。唯一の修飾がグリコシル化部
位にあるとき,177−119と184−186の両方のグリコシル
化部位は同様にまたは異なって修飾される。（使用する
アミノ酸の番号付けはPennica et al.,Nature（1983）
301:214−221の報告に基づき，グリシン−アラニン−ア
ルギニン−セリン−チロシンの配列のセリンから始め
る。）組織プラスミノーゲンアクチベーター活性を持ち
ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーターに由来するポ
リペプチドにこのような変化を導入すると，生理学的特
性の改善が達成可能である。
新規ポリペプチドは，タンパク分解活性，特にプラス
ミノーゲン分解活性を増幅しており，プラスミノーゲン
アクチベーター阻害に対する感受性が低下し，フィブリ
ン親和性が増加し，そして／またはプラスミノーゲン分
解活性のフィブリン依存性が増している。
ミノーゲン分解活性を増幅しており，プラスミノーゲン
アクチベーター阻害に対する感受性が低下し，フィブリ
ン親和性が増加し，そして／またはプラスミノーゲン分
解活性のフィブリン依存性が増している。
興味深い第１の変化は，アミノ酸117−119,184−186
および448−450におけるグリコシル化部位の少なくとも
１つの修飾であり，アスパラギンが保存的または非保存
的に変化しているか，または，セリンかスレオニンが特
にグリシン，アラニンあるいはバリンに非保存的に変化
している。特に興味深いのは,117−119と184186のグリ
コシル化部位である。興味深い変異には，アスパラギン
が他のアミノ酸，好ましくはグルタミン，バリン，ロイ
シン，イソロイシン，アラニンまたはグリシン，より好
ましくはグルタミンに置換されこと，または，セリンが
スレオニンが他のアミノ酸，好ましくはアラニン，バリ
ンまたはメチオニンに置換されること，つまりメルカプ
ト基または中性水酸基をもたない３〜５個の炭素原子か
ら成る脂肪族アミノ酸に置換されること，が含まれる。
117と184におけるグリコシル化部位のアスパラギンのグ
ルタミンへの置換が特に興味深い。
および448−450におけるグリコシル化部位の少なくとも
１つの修飾であり，アスパラギンが保存的または非保存
的に変化しているか，または，セリンかスレオニンが特
にグリシン，アラニンあるいはバリンに非保存的に変化
している。特に興味深いのは,117−119と184186のグリ
コシル化部位である。興味深い変異には，アスパラギン
が他のアミノ酸，好ましくはグルタミン，バリン，ロイ
シン，イソロイシン，アラニンまたはグリシン，より好
ましくはグルタミンに置換されこと，または，セリンが
スレオニンが他のアミノ酸，好ましくはアラニン，バリ
ンまたはメチオニンに置換されること，つまりメルカプ
ト基または中性水酸基をもたない３〜５個の炭素原子か
ら成る脂肪族アミノ酸に置換されること，が含まれる。
117と184におけるグリコシル化部位のアスパラギンのグ
ルタミンへの置換が特に興味深い。
変異生成物特性の所望の変化に応じて，保存的変化ま
たは非保存的変化いずれかが含まれる。保存的な変化
は，アミノ酸間にセミコロンを付して示した。G,A;V,I,
L;D,E;K,R;N,Q;S,T;およびF,W,Y;ここで１つのグループ
のアミノ酸が他のグループのアミノ酸または上に示され
ていないアミノ酸に置換し，このような変化を非保存的
であると考える。
たは非保存的変化いずれかが含まれる。保存的な変化
は，アミノ酸間にセミコロンを付して示した。G,A;V,I,
L;D,E;K,R;N,Q;S,T;およびF,W,Y;ここで１つのグループ
のアミノ酸が他のグループのアミノ酸または上に示され
ていないアミノ酸に置換し，このような変化を非保存的
であると考える。
比活性は，分子のグリコシル化量を特にクリングル構
造内のグリコシル化部位，より特別にはＮ−末端からＣ
−末端方向の最初の２つのグリコシル化部位について減
少させると，増幅できることが見出された。
造内のグリコシル化部位，より特別にはＮ−末端からＣ
−末端方向の最初の２つのグリコシル化部位について減
少させると，増幅できることが見出された。
欠失，置換，挿入などのようなさまざまな障害をグリ
コシル化部位に導入することにより、グリコシル化部位
の３つ組を変えてグリコシル化部位を破壊する。例え
ば,117−119,184−186および448−450のグリコシル化部
位を同様にまたは異なって修飾する。
コシル化部位に導入することにより、グリコシル化部位
の３つ組を変えてグリコシル化部位を破壊する。例え
ば,117−119,184−186および448−450のグリコシル化部
位を同様にまたは異なって修飾する。
次に興味深い領域は，アミノ酸の274−278に生じる開
裂部位の修飾である。特に興味深いのは,277のリジンの
アルギニンへの置換のような保存的変化である。他の置
換としては,276のイソロイシンのバリン，ロイシン，グ
リシンまたはアラニンへの置換を含む。開裂部位の特異
的修飾はプラスミノーゲンアクチベーター阻害に対する
感受性を減少させ得ることがわかり，よってこのポリペ
プチドはin vivoで，天然での阻害量のプラスミノーゲ
ンアクチベーター阻害剤存在下で，野生型組織プラスミ
ノーゲンアクチベーターに比べて活性を増しているだろ
う。
裂部位の修飾である。特に興味深いのは,277のリジンの
アルギニンへの置換のような保存的変化である。他の置
換としては,276のイソロイシンのバリン，ロイシン，グ
リシンまたはアラニンへの置換を含む。開裂部位の特異
的修飾はプラスミノーゲンアクチベーター阻害に対する
感受性を減少させ得ることがわかり，よってこのポリペ
プチドはin vivoで，天然での阻害量のプラスミノーゲ
ンアクチベーター阻害剤存在下で，野生型組織プラスミ
ノーゲンアクチベーターに比べて活性を増しているだろ
う。
第３の興味ある変化は,N末端またはＣ末端の切断で，
特にＣ末端での少なくとも１アミノ酸から25アミノ酸ま
で，通常は10アミノ酸まで，より通常には３アミノ酸ま
での切断である。Ｎ末端では，セリンから始まりチロシ
ンに続く１〜５アミノ酸，特に１〜３アミノ酸が切断さ
れる。
特にＣ末端での少なくとも１アミノ酸から25アミノ酸ま
で，通常は10アミノ酸まで，より通常には３アミノ酸ま
での切断である。Ｎ末端では，セリンから始まりチロシ
ンに続く１〜５アミノ酸，特に１〜３アミノ酸が切断さ
れる。
Ｃ末端の切断は，フィブリン依存性を増幅させ，それ
によって組織プラスミノーゲンアクチベーターの特異性
の増加が達成される。フィブリン依存性を増加すること
で，開裂して凝血から離れたプラスミンとなるプラスミ
ノーゲンの量は実質的に減少し，プラスミンの副作用は
阻止されるであろう。
によって組織プラスミノーゲンアクチベーターの特異性
の増加が達成される。フィブリン依存性を増加すること
で，開裂して凝血から離れたプラスミンとなるプラスミ
ノーゲンの量は実質的に減少し，プラスミンの副作用は
阻止されるであろう。
本発明の新規ポリペプチドは，上に述べた２種,3種ま
たはそれ以上の変化を組み合わせて得られる。例えば,1
17と184のグリコシル化部位のアスパラギンのグルタミ
ンによる置換（第１の型の変化例）に加えて，開裂部位
277のリジンをアルギニンに置換することによる修飾
（第２の型の変化例），またはMet525からPro527までの
配列の切断（第３型の変化例）を行ってよい。
たはそれ以上の変化を組み合わせて得られる。例えば,1
17と184のグリコシル化部位のアスパラギンのグルタミ
ンによる置換（第１の型の変化例）に加えて，開裂部位
277のリジンをアルギニンに置換することによる修飾
（第２の型の変化例），またはMet525からPro527までの
配列の切断（第３型の変化例）を行ってよい。
いくつかの場合，むしろtPAを切断するよりは，鎖を
伸長するか，または末端のアミノ酸を一般に約１−12ア
ミノ酸,N末端とＣ末端の１つか両方で伸長する。付加し
たアミノ酸はリンカーとしてふるまったり，特別な免疫
応答を供したり，分子の生理学的特性を修飾したりする
であろう。
伸長するか，または末端のアミノ酸を一般に約１−12ア
ミノ酸,N末端とＣ末端の１つか両方で伸長する。付加し
たアミノ酸はリンカーとしてふるまったり，特別な免疫
応答を供したり，分子の生理学的特性を修飾したりする
であろう。
主題のポリペプチドをコードするDNA配列は，イント
ロンを含む染色体DNA,cDNA,合成DNA,またはそれらの組
み合わせを使って，さまざまな方法で調整される。所望
の変異は，遺伝子を適当な細菌の宿主中に，一本鎖バク
テリオファージベクターまたは二本鎖プラスミドベクタ
ーを用い，次に野生型配列に実質的に相補的ではある
が，トランスバージョン，転位，欠失または挿入などの
所望の変異を含むミスマッチの配列を用いて，クローニ
ングすることにより達成される。あるいは，便利な制限
酵素切断部位が存在すれば，特別な配列を削り，変異を
含んだ合成配列を導入できる。使用できる他の技術は，
二本鎖鋳型の部分エキソヌクレアーゼ消化，またはin
vitroでヘテロデュプレックスを形成して部分的一本鎖
領域をオリゴヌクレオチド−特異的変異形成にかけるこ
とである。
ロンを含む染色体DNA,cDNA,合成DNA,またはそれらの組
み合わせを使って，さまざまな方法で調整される。所望
の変異は，遺伝子を適当な細菌の宿主中に，一本鎖バク
テリオファージベクターまたは二本鎖プラスミドベクタ
ーを用い，次に野生型配列に実質的に相補的ではある
が，トランスバージョン，転位，欠失または挿入などの
所望の変異を含むミスマッチの配列を用いて，クローニ
ングすることにより達成される。あるいは，便利な制限
酵素切断部位が存在すれば，特別な配列を削り，変異を
含んだ合成配列を導入できる。使用できる他の技術は，
二本鎖鋳型の部分エキソヌクレアーゼ消化，またはin
vitroでヘテロデュプレックスを形成して部分的一本鎖
領域をオリゴヌクレオチド−特異的変異形成にかけるこ
とである。
特に興味深いのは，オリゴヌクレオチド特異的変異形
成である。（Zoller and Smith,Methods Enzymol.（198
3）100:468−500.） 欠失や挿入のミスマッチを含んだ適切なオリゴヌクレ
オチド配列としては，一般に約20から100ヌクレオチド
（nt），より一般的には20−60nt持つものを調製する。
この配列は，合成により簡単に調製でき，適当なクロー
ニングベクターでクローニングできる。このオリゴヌク
レオチドを，部位特異的変異形成用にtPA遺伝子かtPA類
似体の精製鋳型とアニールさせる。変異は独立に導入
し，変異の部位は約10塩基対（bp），より一般には約20
bp分離させる。異なった部位の変異は一段階または連続
的段階で導入し，各変異後その変異の存在やtPA類似体
の活性への効果を確かめる。
成である。（Zoller and Smith,Methods Enzymol.（198
3）100:468−500.） 欠失や挿入のミスマッチを含んだ適切なオリゴヌクレ
オチド配列としては，一般に約20から100ヌクレオチド
（nt），より一般的には20−60nt持つものを調製する。
この配列は，合成により簡単に調製でき，適当なクロー
ニングベクターでクローニングできる。このオリゴヌク
レオチドを，部位特異的変異形成用にtPA遺伝子かtPA類
似体の精製鋳型とアニールさせる。変異は独立に導入
し，変異の部位は約10塩基対（bp），より一般には約20
bp分離させる。異なった部位の変異は一段階または連続
的段階で導入し，各変異後その変異の存在やtPA類似体
の活性への効果を確かめる。
変異形成プライマーの設計には，いくつかの考察が含
まれる。一般に，プライマーの長さは，標的鋳型に対し
て，約85％より高く約95％より低い相補性を持つように
選択する。これによって，変異形成プライマーによる簡
単なプラーク選別が可能となるというさらなる利点が供
される。変異形成プライマーが，欠失を生じる場合，通
常欠失の各端に少なくとも約20bpの相補性が存在するで
あろう。また，プライマーは，変異座位の両端におい
て，だいたい等しい融点を供する必要がある。さらに考
えると，プライマーは鋳型上の不適当な部位からのプラ
イミングを，もし除かない場合は，最少にするよう選択
されるべきである。実際，変異座位以外のあらゆる部位
において，相補性は70％より低く，好ましくは60％より
低くあるべきである。従って，問題とする遺伝子のみな
らず，クローニングベクターについても考えるべきであ
る。特に考えなければならないことは，プライマーの
３′末端での相補性である。
まれる。一般に，プライマーの長さは，標的鋳型に対し
て，約85％より高く約95％より低い相補性を持つように
選択する。これによって，変異形成プライマーによる簡
単なプラーク選別が可能となるというさらなる利点が供
される。変異形成プライマーが，欠失を生じる場合，通
常欠失の各端に少なくとも約20bpの相補性が存在するで
あろう。また，プライマーは，変異座位の両端におい
て，だいたい等しい融点を供する必要がある。さらに考
えると，プライマーは鋳型上の不適当な部位からのプラ
イミングを，もし除かない場合は，最少にするよう選択
されるべきである。実際，変異座位以外のあらゆる部位
において，相補性は70％より低く，好ましくは60％より
低くあるべきである。従って，問題とする遺伝子のみな
らず，クローニングベクターについても考えるべきであ
る。特に考えなければならないことは，プライマーの
３′末端での相補性である。
便宜上，ベクターは，たとえばM13のような一本鎖状D
NAウィルス，特にベクターとして利用するため修飾され
たものである。便利なウィルスベクターはM13mp9であ
る。変異形成プライマーを鋳型やベクターと，必要なヌ
クレオチドおよびT4DNAリガーゼ存在下で，クレノー断
片やT4DNAポリメラーゼのような修正能力を欠いた適当
なポリメラーゼ存在下，アニーリング条件のもとに一緒
にして，それによって遺伝子を保持する環状ベクターが
複製可能となり，二本鎖複製型が供される。次いで二本
鎖DNAを適当な細胞に導入する。溶解性ベクターを供給
することで，変異形成が生じたtPAまたはtPA類似体の存
在をプライマーを使って選別できるプラークを得る。通
常，変異形成産物としての正確な配列を持つ可能性を増
すためには，感度を増加させた，少なくとも２回のくり
返し選別が必要であろう。
NAウィルス，特にベクターとして利用するため修飾され
たものである。便利なウィルスベクターはM13mp9であ
る。変異形成プライマーを鋳型やベクターと，必要なヌ
クレオチドおよびT4DNAリガーゼ存在下で，クレノー断
片やT4DNAポリメラーゼのような修正能力を欠いた適当
なポリメラーゼ存在下，アニーリング条件のもとに一緒
にして，それによって遺伝子を保持する環状ベクターが
複製可能となり，二本鎖複製型が供される。次いで二本
鎖DNAを適当な細胞に導入する。溶解性ベクターを供給
することで，変異形成が生じたtPAまたはtPA類似体の存
在をプライマーを使って選別できるプラークを得る。通
常，変異形成産物としての正確な配列を持つ可能性を増
すためには，感度を増加させた，少なくとも２回のくり
返し選別が必要であろう。
次に推定上正のクローンを，例えばプラーク精製，電
気泳動的精製などして，精製し，次いで配列決定する。
気泳動的精製などして，精製し，次いで配列決定する。
配列決定のために，少なくとも長さが約20から30塩基
で変異座位から少なくとも約55塩基離れた位置でアニー
ルするであろう配列決定プライマーを設計する。正確な
配列の妥当な保証を得るためには，変異座位の両側少な
くとも約50塩基を含む領域を配列決定することが望まし
い。
で変異座位から少なくとも約55塩基離れた位置でアニー
ルするであろう配列決定プライマーを設計する。正確な
配列の妥当な保証を得るためには，変異座位の両側少な
くとも約50塩基を含む領域を配列決定することが望まし
い。
一度正確に変異形成した遺伝子が得られたら，それを
単離し，適切な宿主中で発現させるために適切な発現ベ
クターに挿入する。
単離し，適切な宿主中で発現させるために適切な発現ベ
クターに挿入する。
哺乳類，昆虫および鳥類宿主に利用する発現ベクター
には，広範囲の種類が存在する。例えば，ここで参考文
献として採用するEPA 0,092,182に述べられているもの
を参照せよ。特に興味深いのは哺乳類ベクターで，これ
はシミアンウィルス，ウシ乳頭腫ウィルス，アデノウィ
ルスなどのようにウィルスのレプリコンを使用する。
には，広範囲の種類が存在する。例えば，ここで参考文
献として採用するEPA 0,092,182に述べられているもの
を参照せよ。特に興味深いのは哺乳類ベクターで，これ
はシミアンウィルス，ウシ乳頭腫ウィルス，アデノウィ
ルスなどのようにウィルスのレプリコンを使用する。
転写や翻訳の開始および終結制御領域は，天然上tPA
遺伝子に関連する領域，ウィルスの構造遺伝子由来の領
域または宿主遺伝子由来の領域である。多くのプロモー
ターが利用可能である。例えば,SV40の初期および後期
プロモーター，アデノウィルスの主要後期プロモータ
ー，β−アクチンプロモーター，ヒトCMV Immediate Ea
rly 〔IE1〕プロモーターなどである。望ましくは，プ
ロモーターは，発現を向上させるために，エンハンサー
とともに使う。
遺伝子に関連する領域，ウィルスの構造遺伝子由来の領
域または宿主遺伝子由来の領域である。多くのプロモー
ターが利用可能である。例えば,SV40の初期および後期
プロモーター，アデノウィルスの主要後期プロモータ
ー，β−アクチンプロモーター，ヒトCMV Immediate Ea
rly 〔IE1〕プロモーターなどである。望ましくは，プ
ロモーターは，発現を向上させるために，エンハンサー
とともに使う。
多くの場合tPA発現構築物を増幅することが望まし
い。増幅または他の理由のために，発現構築物を染色体
に組み込ませることが望ましい。この目的のためには，
構築物は不安定な複製系，例えば酵母ars１と結合され
るか，あるいは複製系を欠くであろう。組み込みについ
ては例えばAxel and Wigler,米国特許第4,399,216号を
参照せよ。通常，マーカー発現構築物は主題の発現構築
物とタンデムであろうし，そのマーカーは増幅遺伝子と
同じでも異なったものでもよい。これは，発現構築物と
タンデムであり,tPA発現構築物と同じ宿主内で機能を持
ち，そしてDHFR（ジヒドロ葉酸還元酵素）,TK（チミジ
ンキナーゼ）,MT−ＩおよびII（メタロチオネイン，例
えばヒト）,ODC（オルニチン脱炭酸酵素）のような増幅
可能な遺伝子をコードするようなtPAを有することによ
って達成できる。増幅可能遺伝子に従って宿主に圧力を
かけることにより，例えばDHFRならばメトトレキセート
で圧力をかけることによって，主題の発現構築物は増幅
される。
い。増幅または他の理由のために，発現構築物を染色体
に組み込ませることが望ましい。この目的のためには，
構築物は不安定な複製系，例えば酵母ars１と結合され
るか，あるいは複製系を欠くであろう。組み込みについ
ては例えばAxel and Wigler,米国特許第4,399,216号を
参照せよ。通常，マーカー発現構築物は主題の発現構築
物とタンデムであろうし，そのマーカーは増幅遺伝子と
同じでも異なったものでもよい。これは，発現構築物と
タンデムであり,tPA発現構築物と同じ宿主内で機能を持
ち，そしてDHFR（ジヒドロ葉酸還元酵素）,TK（チミジ
ンキナーゼ）,MT−ＩおよびII（メタロチオネイン，例
えばヒト）,ODC（オルニチン脱炭酸酵素）のような増幅
可能な遺伝子をコードするようなtPAを有することによ
って達成できる。増幅可能遺伝子に従って宿主に圧力を
かけることにより，例えばDHFRならばメトトレキセート
で圧力をかけることによって，主題の発現構築物は増幅
される。
用いる特別な宿主やシグナル配列に従って，発現され
たtPA類似体は宿主細胞質内に保持されるかまたは分泌
されるであろう。細胞質内に保持される場合,tPA類似体
は常法に従って宿主細胞をを溶解することにより単離
し，抽出および精製法，好ましくは電気泳動法，クロマ
トグラフィーのような方法を使用して精製する。tPAが
分泌される場合，分泌されたtPAは，アフィニティクロ
マトグラフィーを含む従来の方法に従って上澄液から単
離できる。
たtPA類似体は宿主細胞質内に保持されるかまたは分泌
されるであろう。細胞質内に保持される場合,tPA類似体
は常法に従って宿主細胞をを溶解することにより単離
し，抽出および精製法，好ましくは電気泳動法，クロマ
トグラフィーのような方法を使用して精製する。tPAが
分泌される場合，分泌されたtPAは，アフィニティクロ
マトグラフィーを含む従来の方法に従って上澄液から単
離できる。
本発明で使用するポリペプチドの特性を組み合わせる
と,tPAのような天然のプラスミノーゲンアクチベーター
よりも優れている。これらのポリペプチドは，天然のtP
Aに対して少なくとも0.6倍，しばしば少なくとも0.7
倍，通常は少なくとも1.0倍，一般に約1.1−7.0倍，そ
して好ましくは約6.2から7.0倍の比活性を持つであろ
う。活性のフィブリン依存性は，天然のtPAに対して少
なくとも0.4倍，しばしば少なくとも約0.6倍，通常は少
なくとも約0.7倍，そして好ましくは少なくとも約１〜
2.5倍で特に1.3から2.5倍であろう。プラスミノーゲン
アクチベーター阻害剤に対する感受性は，通常天然のtP
Aよりも高くはなく，天然のtPAの感受性に基づいて好ま
しくは，約５％低下し，より好ましくは約10％低下から
約90％低下までの範囲に及び，特に天然のtPAより約25
−90％低下しているであろう。この主題化合物は通常，
野生型tPAよりも少なくとも１つの見地においては優れ
ているであろう。（試験法については実験の項を参
照）。
と,tPAのような天然のプラスミノーゲンアクチベーター
よりも優れている。これらのポリペプチドは，天然のtP
Aに対して少なくとも0.6倍，しばしば少なくとも0.7
倍，通常は少なくとも1.0倍，一般に約1.1−7.0倍，そ
して好ましくは約6.2から7.0倍の比活性を持つであろ
う。活性のフィブリン依存性は，天然のtPAに対して少
なくとも0.4倍，しばしば少なくとも約0.6倍，通常は少
なくとも約0.7倍，そして好ましくは少なくとも約１〜
2.5倍で特に1.3から2.5倍であろう。プラスミノーゲン
アクチベーター阻害剤に対する感受性は，通常天然のtP
Aよりも高くはなく，天然のtPAの感受性に基づいて好ま
しくは，約５％低下し，より好ましくは約10％低下から
約90％低下までの範囲に及び，特に天然のtPAより約25
−90％低下しているであろう。この主題化合物は通常，
野生型tPAよりも少なくとも１つの見地においては優れ
ているであろう。（試験法については実験の項を参
照）。
特に興味深いのは，組織プラスミノーゲンアクチベー
ター活性を持ち，実質的にヒトtPAと同じアミノ酸配列
（置換，欠失および挿入を含む相異が10％より低い，通
常は５％より低い）を持っているポリペプチドである。
これらのポリペプチドは以下の性質の少なくとも１つを
持っているであろう。（ａ）比活性が天然tPAの比活性
の少なくとも約0.6倍，しばしば少なくとも約0.7倍，通
常は少なくとも約1.0倍，一般に約1.1から7.0倍，そし
て好ましくは約6.2から7.0倍である。（ｂ）フィブリン
依存性が天然tPAの少なくとも0.4倍，しばしば少なくと
も約0.6倍，一般には少なくとも約0.7倍，そして好まし
くは少なくとも約1.0から2.5倍，特に約1.5から2.5倍で
ある。（ｃ）ヒトプラスミノーゲンアクチベーター阻害
剤による阻害に対する感受性の低下が天然tPAの感受性
に比較して約５％であり，より好ましくは約10％の低下
から約90％の低下の範囲におよび，そして特に天然tPA
よりも約25から90％低下している。
ター活性を持ち，実質的にヒトtPAと同じアミノ酸配列
（置換，欠失および挿入を含む相異が10％より低い，通
常は５％より低い）を持っているポリペプチドである。
これらのポリペプチドは以下の性質の少なくとも１つを
持っているであろう。（ａ）比活性が天然tPAの比活性
の少なくとも約0.6倍，しばしば少なくとも約0.7倍，通
常は少なくとも約1.0倍，一般に約1.1から7.0倍，そし
て好ましくは約6.2から7.0倍である。（ｂ）フィブリン
依存性が天然tPAの少なくとも0.4倍，しばしば少なくと
も約0.6倍，一般には少なくとも約0.7倍，そして好まし
くは少なくとも約1.0から2.5倍，特に約1.5から2.5倍で
ある。（ｃ）ヒトプラスミノーゲンアクチベーター阻害
剤による阻害に対する感受性の低下が天然tPAの感受性
に比較して約５％であり，より好ましくは約10％の低下
から約90％の低下の範囲におよび，そして特に天然tPA
よりも約25から90％低下している。
主題のポリペプチドは，さまざまな血管の状態や病気
に対する予防処置または治療処置においてさまざまな方
法で特異的に使用され，哺乳類宿主，特にヒト宿主にお
ける血栓形成を防ぐであろう。従って，宿主が凝血形成
に感受性である場合はこれを手術中に投与してよく，あ
るいは血栓患者の処置用に投与してもよく，これによ
り，深い動脈血栓，肺塞栓，頭蓋血栓および冠状動脈血
栓内に形成している凝血を溶解する。
に対する予防処置または治療処置においてさまざまな方
法で特異的に使用され，哺乳類宿主，特にヒト宿主にお
ける血栓形成を防ぐであろう。従って，宿主が凝血形成
に感受性である場合はこれを手術中に投与してよく，あ
るいは血栓患者の処置用に投与してもよく，これによ
り，深い動脈血栓，肺塞栓，頭蓋血栓および冠状動脈血
栓内に形成している凝血を溶解する。
主題化合物は，腸管によって，または非経口的に，特
に注射または注入によって投与する。これらの化合物
は，ゼラチン，ゼラチン誘導体のグループから選択され
るタンパク安定化剤，アルブミンのような保護タンパ
ク，糖，糖アルコールまたはアミノ酸の存在下，水，生
理食塩水または適当な緩衝系のような生理的に受容可能
な支持体中にその有効量を単独であるいは他の治療薬，
特に血管病用楽と組み合わせて投与できる。次の実施例
は，説明のためであり，決してこれに限定されない。
に注射または注入によって投与する。これらの化合物
は，ゼラチン，ゼラチン誘導体のグループから選択され
るタンパク安定化剤，アルブミンのような保護タンパ
ク，糖，糖アルコールまたはアミノ酸の存在下，水，生
理食塩水または適当な緩衝系のような生理的に受容可能
な支持体中にその有効量を単独であるいは他の治療薬，
特に血管病用楽と組み合わせて投与できる。次の実施例
は，説明のためであり，決してこれに限定されない。
（実施例） 材料および方法 変異形成は，以下で述べるように一部変更した。Zoll
er and Smith,Meth.Enzymol.（1983）100:468−500,で
述べられている手順を用いて行った。合成DNA変異形成
と配列決定プライマーは,N,N−ジイソプロピルホスホロ
アシダイトを用いて,Urdea et al.,Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA（1983）80:7461−7465で述べられているようなシ
リカ支持体上での自動オリゴヌクレオチド合成により調
整した。配列決定プライマーを，バクテリオファージM1
3でのジデオキシヌクレオチド連鎖末端法（F.Sanger,S.
Nicklen and A.R.Coulson,Proc.Natl.Acad.Sci.USA（19
77）74:5463）による配列決定用に設計した。配列決定
プライマーは，長さが一般的に20から30塩基でM13mp9組
み換え鋳型に相補的であり，しかも変異座位から少なく
とも55塩基離れた位置でアニールするように設計した。
以下の表は，変異形成や配列決定に用いるオリゴマーを
示している。
er and Smith,Meth.Enzymol.（1983）100:468−500,で
述べられている手順を用いて行った。合成DNA変異形成
と配列決定プライマーは,N,N−ジイソプロピルホスホロ
アシダイトを用いて,Urdea et al.,Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA（1983）80:7461−7465で述べられているようなシ
リカ支持体上での自動オリゴヌクレオチド合成により調
整した。配列決定プライマーを，バクテリオファージM1
3でのジデオキシヌクレオチド連鎖末端法（F.Sanger,S.
Nicklen and A.R.Coulson,Proc.Natl.Acad.Sci.USA（19
77）74:5463）による配列決定用に設計した。配列決定
プライマーは，長さが一般的に20から30塩基でM13mp9組
み換え鋳型に相補的であり，しかも変異座位から少なく
とも55塩基離れた位置でアニールするように設計した。
以下の表は，変異形成や配列決定に用いるオリゴマーを
示している。
表Ｉ 変異形成プライマー 1a.CGCGCTGCTＣＴＧCCAGTTGGT 1b.CTGACCCＣＴＧCCCAAAGTAGC 2.TTGAGGAGTCGGGTGTTCCTGGTCA/GTTGTCACGAATCCAGTCTAGG
TAG 3.AGAGCCCTCCTＣTGATGCGA 4.CTＣTGATTTTAAACTGAGGCTGGCTGTA 5.GACTGTTCTＣＴＧAAGTAAATG 註：Ｎは野生型からの置換を示す。
TAG 3.AGAGCCCTCCTＣTGATGCGA 4.CTＣTGATTTTAAACTGAGGCTGGCTGTA 5.GACTGTTCTＣＴＧAAGTAAATG 註：Ｎは野生型からの置換を示す。
／は欠失を示す。
変異の効果 1.Asn 117→Gln,Asn 184→Gln 2.Met 525からPro 527までの欠失 3.Lys 277→Arg 4.Lys 277→Arg,Arg 275→Lys 5.Asn 177→Gln,Asn 184→Gln,Asn 448→Gln 配列決定プライマー 1a.ACCTTGCCTATCAGGATCAT 1b.CGAATCGCCCTGGCAGGCGTC 2.GTGGGTCTGGAGGAAGTCTGTA 3,4.GCACAGGAACCGCTCTCCGGG 5.TCGATCTGGGTTTCTGCAGTAGTTGTGGTT M13/tPA組み換え体の変異形成は，精製した鋳型を用
い，適当なプライマーをアニーリングしそしてT4ポリメ
ラーゼのクレノー断片で伸長させることにより行った。
変異体１は，両プライマー1aおよび1bを用いて変異処理
一回の操作で得た。変異体４は,125μg/mlの遺伝子32タ
ンパク，および挿入体に隣接するM13配列に結合するヘ
ルパープライマーの存在下で，変異体３に由来する鋳型
を用いて得た。プライマー４の効果（Arg 275→Lys）と
プライマー３の効果（Lys 277→Arg）を組み合わせるこ
とにより，上に示した２ヶ所の変異部位を形成した。変
異体５は変異体１に由来する鋳型を用いて得た。プライ
マー1aと1bの効果（Asn 117→Gln,Asn 184→Gln）をプ
ライマー５の効果（Asn 448→Gln）と組み合わせて，上
に示した３ヶ所の変異部位を形成した。JM101細胞への
トランスフェクション（Zoller and Smith,上記）に続
き，プラークを200−1000プラーク／プレートの濃度に
増殖させ，フィルターに釣り上げ，適当な変異形成プラ
イマーあるいはプローブでハイブリダイゼーションによ
り選別した。これらのプラークのうち10から40パーセン
トを，推定上陽性の候補としてまず同定した。ファージ
のドットブロットハイブリダイゼーションによる各実験
から，この推定物からおよそ６個を再選別することによ
り，強い候補が得られた。これらのファージを低濃度で
再度プレーティングすることによりプラークを純化し，
ニトロセルロースフィルターに移し，プライマーと再度
ハイブリダイゼーションした。推定上陽性のクローンの
DNA配列を，適当なプライマーと鋳型調製物を用いて決
定した。
い，適当なプライマーをアニーリングしそしてT4ポリメ
ラーゼのクレノー断片で伸長させることにより行った。
変異体１は，両プライマー1aおよび1bを用いて変異処理
一回の操作で得た。変異体４は,125μg/mlの遺伝子32タ
ンパク，および挿入体に隣接するM13配列に結合するヘ
ルパープライマーの存在下で，変異体３に由来する鋳型
を用いて得た。プライマー４の効果（Arg 275→Lys）と
プライマー３の効果（Lys 277→Arg）を組み合わせるこ
とにより，上に示した２ヶ所の変異部位を形成した。変
異体５は変異体１に由来する鋳型を用いて得た。プライ
マー1aと1bの効果（Asn 117→Gln,Asn 184→Gln）をプ
ライマー５の効果（Asn 448→Gln）と組み合わせて，上
に示した３ヶ所の変異部位を形成した。JM101細胞への
トランスフェクション（Zoller and Smith,上記）に続
き，プラークを200−1000プラーク／プレートの濃度に
増殖させ，フィルターに釣り上げ，適当な変異形成プラ
イマーあるいはプローブでハイブリダイゼーションによ
り選別した。これらのプラークのうち10から40パーセン
トを，推定上陽性の候補としてまず同定した。ファージ
のドットブロットハイブリダイゼーションによる各実験
から，この推定物からおよそ６個を再選別することによ
り，強い候補が得られた。これらのファージを低濃度で
再度プレーティングすることによりプラークを純化し，
ニトロセルロースフィルターに移し，プライマーと再度
ハイブリダイゼーションした。推定上陽性のクローンの
DNA配列を，適当なプライマーと鋳型調製物を用いて決
定した。
変異形成座位と隣接区分（すなわち，少なくとも50塩
基）をDNA配列分析により確認した直後，複製型（RF）D
NAをSal I制限エンドヌクレアーゼで分解し，Sal Iで前
もって分解してアルカリ性ホスファターゼ処理した哺乳
類発現ベクターpSV7dに挿入した。このベクターは,tPA
cDNA発現用のSV40初期プロモーターとエンハンサー,SV4
0ポリアデニル化部位，およびCOS細胞でベクターに用い
るためのSV40複製起点を供する。
基）をDNA配列分析により確認した直後，複製型（RF）D
NAをSal I制限エンドヌクレアーゼで分解し，Sal Iで前
もって分解してアルカリ性ホスファターゼ処理した哺乳
類発現ベクターpSV7dに挿入した。このベクターは,tPA
cDNA発現用のSV40初期プロモーターとエンハンサー,SV4
0ポリアデニル化部位，およびCOS細胞でベクターに用い
るためのSV40複製起点を供する。
プラスミドpSV7dを以下の様に構築した。SV40複製起
点および初期プロモーターを含む400bpのBamH I/Hind I
II断片をpSVgt I（Mulligan,R.et al.,J.Mol.Cell Bio
l．１:854−864（1981））より切出し，精製した。SV40
ポリＡ付加部位を含む240bpのSV40Bcl I/BanH I断片を,
pSV2/dhfr（Subramani et al.,J.Mol.Cell Biol.1:584
−864（1981））より切出し，精製した。これら断片を
以下のリンカーを介して融合した。
点および初期プロモーターを含む400bpのBamH I/Hind I
II断片をpSVgt I（Mulligan,R.et al.,J.Mol.Cell Bio
l．１:854−864（1981））より切出し，精製した。SV40
ポリＡ付加部位を含む240bpのSV40Bcl I/BanH I断片を,
pSV2/dhfr（Subramani et al.,J.Mol.Cell Biol.1:584
−864（1981））より切出し，精製した。これら断片を
以下のリンカーを介して融合した。
このリンカーは３つのすべての読み取り枠中の停止コド
ンと同様に,5個の制限部位を含む。SV40複製起点,SV40
初期プロモーター，停止コドン付きポリリンカーおよび
SV40ポリアデニル化部位を含む生じた670bpの断片を，
およそ1.5kbの欠失であるpBR322誘導体であるpMLの（Lu
sky and Botchan,Cell 36:391（1984））のBamH I部位
にクローン化し,pSV6を得た。pSV6のpML配列中のEcoR I
部位とEcoR V部位を，EcoR IとEcoR Vでの分解により除
去し，各末端の約200bpを除くためにBal31ヌクレアーゼ
で処理し，そして最終的に再連結してpSV7aを得た。Bal
31による切除も，EcoR V部位よりおよそ200bp離れた,SV
40領域の周辺にある１つのBamH I制限部位を除去した。
SV40領域にある第２のBamH I部位を除去するため,pSV7a
を，複製起点から上流のpML配列中で切断するNru Iで分
解した。これを，平滑末端連結により再環化し,pSV7bを
得た。
ンと同様に,5個の制限部位を含む。SV40複製起点,SV40
初期プロモーター，停止コドン付きポリリンカーおよび
SV40ポリアデニル化部位を含む生じた670bpの断片を，
およそ1.5kbの欠失であるpBR322誘導体であるpMLの（Lu
sky and Botchan,Cell 36:391（1984））のBamH I部位
にクローン化し,pSV6を得た。pSV6のpML配列中のEcoR I
部位とEcoR V部位を，EcoR IとEcoR Vでの分解により除
去し，各末端の約200bpを除くためにBal31ヌクレアーゼ
で処理し，そして最終的に再連結してpSV7aを得た。Bal
31による切除も，EcoR V部位よりおよそ200bp離れた,SV
40領域の周辺にある１つのBamH I制限部位を除去した。
SV40領域にある第２のBamH I部位を除去するため,pSV7a
を，複製起点から上流のpML配列中で切断するNru Iで分
解した。これを，平滑末端連結により再環化し,pSV7bを
得た。
pSV7cとpSV7dは連続したポリリンカー置換を示す。初
めに,pSV7bをStu IとXba Iで分解した。それから，次の
リンカーをベクターに連結し,pSV7Cを得た。
めに,pSV7bをStu IとXba Iで分解した。それから，次の
リンカーをベクターに連結し,pSV7Cを得た。
その後,pSV7cをBgl IIとXba Iで分解し，それから次の
リンカーと連結しpSV7dを得た。
リンカーと連結しpSV7dを得た。
ベクター内でのクローン化断片の適切な方向を軽減部
位解析で引き出した。変異を，Sal IとEcoR Iに対する
制限解析により，また変異座位に対し高度に特異的な適
切なプローブを用いたそのような断片のサザンブロッテ
ィングにより再確認した。
位解析で引き出した。変異を，Sal IとEcoR Iに対する
制限解析により，また変異座位に対し高度に特異的な適
切なプローブを用いたそのような断片のサザンブロッテ
ィングにより再確認した。
組合わせ変異体 次の４つの組合せ変異体を組み換えDNA技術を用いて
構築した：変異１および２の両方を含む変異体6,変異１
および３の両方を含む変異体7,変異２および３の両方を
含む変異体8,および３つの変異1,2および３をすべて含
む変異体９。変異の各々は便利な制限エンドヌクレアー
ゼ部位により分離されており，これにより，以前に単離
した変異体1,2および３の断片由来の所望の変異の会合
が促進された。各変異体の構築に用いた特異的な戦略を
以下で述べる。
構築した：変異１および２の両方を含む変異体6,変異１
および３の両方を含む変異体7,変異２および３の両方を
含む変異体8,および３つの変異1,2および３をすべて含
む変異体９。変異の各々は便利な制限エンドヌクレアー
ゼ部位により分離されており，これにより，以前に単離
した変異体1,2および３の断片由来の所望の変異の会合
が促進された。各変異体の構築に用いた特異的な戦略を
以下で述べる。
大規模なプラスミド調製を，記載の変異体構築のすべ
てに対して行った。そのDNAを組織培養細胞へのトラン
スフェクションに用いた。
てに対して行った。そのDNAを組織培養細胞へのトラン
スフェクションに用いた。
変異体６ 変異体１の1.72キロ塩基（kb）のBamH IからBstE II
までの断片は，変異させた部位Asn 117→GlnとAsn 184
→Glnの両方を含む。
までの断片は，変異させた部位Asn 117→GlnとAsn 184
→Glnの両方を含む。
この断片を,Met525からPro527までの欠失の所望変異
を含む変異体２の3.38kbのBamH IからBstE IIまでの断
片に連結した。この連結混合液を，コンピテントなエセ
リシア・コリを形質転換するのに用いた。生じたアンピ
シリン耐性コロニーのいくつかを増殖させ，そのDNA
を，サイズにより，また各変異領域に特異的な32P末端
標識化オリゴヌクレオチドプローブによるDNAのサザン
ブロットのDNAハイブリダイゼーション解析により選別
した。このようなクローンは，もし２つの個々の変異体
１の領域のオリゴヌクレオチドの各々，および変異体２
特異的プローブにハイブリダイズするならば，陽性とし
て記録した。この選別法を，各新しい構築に対し適切な
オリゴヌクレオチドプローブの置換により，各々の構築
物について用いた。使用した特異的オリゴヌクレオチド
は以前に挙げた。
を含む変異体２の3.38kbのBamH IからBstE IIまでの断
片に連結した。この連結混合液を，コンピテントなエセ
リシア・コリを形質転換するのに用いた。生じたアンピ
シリン耐性コロニーのいくつかを増殖させ，そのDNA
を，サイズにより，また各変異領域に特異的な32P末端
標識化オリゴヌクレオチドプローブによるDNAのサザン
ブロットのDNAハイブリダイゼーション解析により選別
した。このようなクローンは，もし２つの個々の変異体
１の領域のオリゴヌクレオチドの各々，および変異体２
特異的プローブにハイブリダイズするならば，陽性とし
て記録した。この選別法を，各新しい構築に対し適切な
オリゴヌクレオチドプローブの置換により，各々の構築
物について用いた。使用した特異的オリゴヌクレオチド
は以前に挙げた。
変異体７（１＆３） 変異させた部位を両方含む変異体１の2.95kbSca I断
片を,lys 277→Argの変換を含む変異体３の2.15kbSca I
断片に連結した。新構築の選別を，変異体３の変化およ
び変異体１の変換の各々に特異的なオリゴヌクレオチド
を用いて行った。
片を,lys 277→Argの変換を含む変異体３の2.15kbSca I
断片に連結した。新構築の選別を，変異体３の変化およ
び変異体１の変換の各々に特異的なオリゴヌクレオチド
を用いて行った。
変異体８（２＆３） 所望の変換を含む変異体２の3.38kbのBamH IからBstE
IIまでの断片を,Lys 277→Arg変異を含む変異体３の1.
72kbのBamH IからBstE IIまでの断片に連結した。正し
い組み換え体の選別を，各変異に特異的なオリゴヌクレ
オチドを用いて行った。
IIまでの断片を,Lys 277→Arg変異を含む変異体３の1.
72kbのBamH IからBstE IIまでの断片に連結した。正し
い組み換え体の選別を，各変異に特異的なオリゴヌクレ
オチドを用いて行った。
変異体９（１＆２＆３） 三重変異体の形成戦略として，新しく構築した二重変
異体の１つである変異体７を使用した。このプラスミド
をBamH IとBstE IIで開裂し，両変異体を含む1.72kbの
断片を単離した。変異体２からのプラスミドDNAを同じ
制限酵素で分解し,3.38kbの細片（変異を含む）を単離
した。
異体の１つである変異体７を使用した。このプラスミド
をBamH IとBstE IIで開裂し，両変異体を含む1.72kbの
断片を単離した。変異体２からのプラスミドDNAを同じ
制限酵素で分解し,3.38kbの細片（変異を含む）を単離
した。
これら２つの断片を連結し，この連結混合液を用いて
コンピテントなエセリシア・コリを形質転換した。正確
な三重変異体の選別は,DNA中の各変異部位に特異的なオ
リゴヌクレオチドを用いて，上記の様に行った。
コンピテントなエセリシア・コリを形質転換した。正確
な三重変異体の選別は,DNA中の各変異部位に特異的なオ
リゴヌクレオチドを用いて，上記の様に行った。
哺乳類細胞のトランスフェクション COS−７細胞（Gluzman,Cell（1981）23:175）を,Grah
am and van der Eb,Virology（1973）52:456−467で述
べられている手順を一部変更して用いて,pSV7d tPA発現
プラスミドでトランスフェクションした。サンプルを２
通りでディシュシに加え，二酸化炭素恒温器（37℃）
中,6時間，細胞上に固定させた。６時間後，上澄液を吸
引し，細胞をCaとMgのないリン酸緩衝生理食塩水（PBS
−CMF）で穏やかにゆすぎ，そして3.5−４分間，アジュ
バントとしての15％グリセロールにディッシュをさらし
た。ゆすいで,4.5mg/mlグルコース,3.7mg/ml Na2CO3,29
2μg/mlグルタミン,110μg/mlピルビン酸ナトリウム,10
0U/mlペニシリン,100U/mlストレプトマイシン，および1
0％胎児ウシ血清（FCS）を添加したDMEM培地を供給した
後，培地を胎児ウシ血清を欠く培地と置き換えた。血清
を除去して12時間後，下で述べるカゼイン−プラスミノ
ーゲン−寒天重層を用いて，細胞をtPAの発現について
分析した。最大発現は，トランスフェクション開始後36
と48時間の間で観察された。
am and van der Eb,Virology（1973）52:456−467で述
べられている手順を一部変更して用いて,pSV7d tPA発現
プラスミドでトランスフェクションした。サンプルを２
通りでディシュシに加え，二酸化炭素恒温器（37℃）
中,6時間，細胞上に固定させた。６時間後，上澄液を吸
引し，細胞をCaとMgのないリン酸緩衝生理食塩水（PBS
−CMF）で穏やかにゆすぎ，そして3.5−４分間，アジュ
バントとしての15％グリセロールにディッシュをさらし
た。ゆすいで,4.5mg/mlグルコース,3.7mg/ml Na2CO3,29
2μg/mlグルタミン,110μg/mlピルビン酸ナトリウム,10
0U/mlペニシリン,100U/mlストレプトマイシン，および1
0％胎児ウシ血清（FCS）を添加したDMEM培地を供給した
後，培地を胎児ウシ血清を欠く培地と置き換えた。血清
を除去して12時間後，下で述べるカゼイン−プラスミノ
ーゲン−寒天重層を用いて，細胞をtPAの発現について
分析した。最大発現は，トランスフェクション開始後36
と48時間の間で観察された。
CHO dhfr-細胞（Urlaub and Chasin,Proc.Natl.Acad.
Sci.USA（1980）77:4216）を，栄養培地（1.18mg/ml Na
2CO3,292μg/mlグルタミン,110μg/mlピルビン酸ナトリ
ウム,100U/mlペニシリン,100U/mlストプトマイシン,150
μ/mlプロリンおよび10％FCSを添加したF12）中でトラ
ンスフェクションする前日に,10cmディシュあたり５×1
05から106の細胞の濃度で塗布した。上で述べたトラン
スフェクション手順を,tPA発現プラスミドをアデノウィ
ルス主要後期プロモーターにより働くdhfr遺伝子を選択
マーカーとして持つプラスミドと混ぜたという一部の変
更を加えて用い，リン酸カルシウムでプラスミドを共沈
澱させた。dhfr遺伝子を持つプラスミドは，アデノウィ
ルス−２由来の主要後期プロモーター（Ad−MLP,地図単
位16−17.3）をマウスのdhfr cDNAの５′末端に融合さ
せることにより構築した。SV40初期領域ポリアデニル化
部位とSV40小ｔ抗原に対するイントロンをコードしてい
るDNAをpSV2−neo（Southern and Berg,J.Mol.Appl.Gen
et.（1982）１:327−341）より得，dhfr cDNAの３′末
端に融合した。これら３つの区分をpBR322にサブクロー
ン化し，プラスミドAd−dhfrを得た。DNAを細胞に添加
後48時間，細胞を選択培地（上記のようにプロリンと胎
児ウシ血清を添加した，あるいは透析した胎児ウシ血清
を添加したDMEM培地）に1:20となるように分配した。選
択培地で１−２週間増殖後，コロニーが現れ，カゼイン
−プラスミノーゲン−寒天重層分析によりtPA生産を検
定し，またカゼイン−プラスミノーゲンプレートで定量
分析した。
Sci.USA（1980）77:4216）を，栄養培地（1.18mg/ml Na
2CO3,292μg/mlグルタミン,110μg/mlピルビン酸ナトリ
ウム,100U/mlペニシリン,100U/mlストプトマイシン,150
μ/mlプロリンおよび10％FCSを添加したF12）中でトラ
ンスフェクションする前日に,10cmディシュあたり５×1
05から106の細胞の濃度で塗布した。上で述べたトラン
スフェクション手順を,tPA発現プラスミドをアデノウィ
ルス主要後期プロモーターにより働くdhfr遺伝子を選択
マーカーとして持つプラスミドと混ぜたという一部の変
更を加えて用い，リン酸カルシウムでプラスミドを共沈
澱させた。dhfr遺伝子を持つプラスミドは，アデノウィ
ルス−２由来の主要後期プロモーター（Ad−MLP,地図単
位16−17.3）をマウスのdhfr cDNAの５′末端に融合さ
せることにより構築した。SV40初期領域ポリアデニル化
部位とSV40小ｔ抗原に対するイントロンをコードしてい
るDNAをpSV2−neo（Southern and Berg,J.Mol.Appl.Gen
et.（1982）１:327−341）より得，dhfr cDNAの３′末
端に融合した。これら３つの区分をpBR322にサブクロー
ン化し，プラスミドAd−dhfrを得た。DNAを細胞に添加
後48時間，細胞を選択培地（上記のようにプロリンと胎
児ウシ血清を添加した，あるいは透析した胎児ウシ血清
を添加したDMEM培地）に1:20となるように分配した。選
択培地で１−２週間増殖後，コロニーが現れ，カゼイン
−プラスミノーゲン−寒天重層分析によりtPA生産を検
定し，またカゼイン−プラスミノーゲンプレートで定量
分析した。
各変異体の細胞系を,200cm2ディシュ中で融合するま
で増殖させ，無血清培地（DMEM）中で24時間の間保温
し，そして上澄液を以下で述べるように処理して，プラ
スミノーゲンアクチベーター活性を有するポリペプチド
を精製した。
で増殖させ，無血清培地（DMEM）中で24時間の間保温
し，そして上澄液を以下で述べるように処理して，プラ
スミノーゲンアクチベーター活性を有するポリペプチド
を精製した。
次の手順は，上で述べた６つのポリペプチドの活性を
決定するために用いた。
決定するために用いた。
変異タンパクの比活性を決定するためには，サンプル
の抗原濃度を定量することが必須だった。ポリクローナ
ル抗体を用いるEIA−キット（American Diagnostica,In
c.,Greenwith,CT）を用いた。検査は，キットに供され
ているプロトコール中に述べられている条件下で厳密に
行い，各サンプルの５希釈物を分析した。結果は少なく
とも３つの測定できる希釈物の平均として表した。
の抗原濃度を定量することが必須だった。ポリクローナ
ル抗体を用いるEIA−キット（American Diagnostica,In
c.,Greenwith,CT）を用いた。検査は，キットに供され
ているプロトコール中に述べられている条件下で厳密に
行い，各サンプルの５希釈物を分析した。結果は少なく
とも３つの測定できる希釈物の平均として表した。
プラスミノーゲンアクチベーター活性をもつ変異タンパ
クの濃度 すべての細胞培養上澄液を0.01％Tween80TMと0.01％N
a−アジドにした。次いで上澄液（50ml）を,3mlのHepar
in−Sepharose の存在下で室温,30分間，保温した。He
parin−Sepharose懸濁液をカラムに充填し,0.1Mリン酸
塩,0.01％Tween80TMを含む緩衝液（pH7.5）20mlでよく
洗浄した。最終的には,tPA活性は,0.05Mトリス−HCl,1M
KSCNおよび0.01％Tween80TMを含む緩衝液（pH7.5）で
溶出した。次いで溶出物を,0.01％Tween80TMと0.01％Na
−アジドを含むリン酸緩衝液（0.05M,pH7.5）5Lに対し
て４℃,16時間透析した。tPAサンプルを1mlずつ−25℃
で凍結した。
クの濃度 すべての細胞培養上澄液を0.01％Tween80TMと0.01％N
a−アジドにした。次いで上澄液（50ml）を,3mlのHepar
in−Sepharose の存在下で室温,30分間，保温した。He
parin−Sepharose懸濁液をカラムに充填し,0.1Mリン酸
塩,0.01％Tween80TMを含む緩衝液（pH7.5）20mlでよく
洗浄した。最終的には,tPA活性は,0.05Mトリス−HCl,1M
KSCNおよび0.01％Tween80TMを含む緩衝液（pH7.5）で
溶出した。次いで溶出物を,0.01％Tween80TMと0.01％Na
−アジドを含むリン酸緩衝液（0.05M,pH7.5）5Lに対し
て４℃,16時間透析した。tPAサンプルを1mlずつ−25℃
で凍結した。
凝血溶解検査（CLT） 凝血溶解検査を，凝固時間の代わりに溶解時間を 記録するために一部変更されている“KC 10−Koagulome
ter"（Amelung,FLG）を用いて行った。
ter"（Amelung,FLG）を用いて行った。
すべての試薬を37℃で予備保温した。tPA標品，ポリ
ペプチド検査サンプルおよびフィブリノーゲンを,1％Ha
emaccelTM（pH7.4）を含むリン酸緩衝液（0.67M）中で
必要とする濃度にまで希釈した。tPA標品あるいはサン
プルの0.2mlを,0.2mlのヒトプラスミノーゲン（10CTA/m
l）,0.5mlのウシフィブリノーゲン（0.15％）および最
終的に0.1のトロンビン（10IU/ml）と混合した。溶解時
間を記録し，検量曲線を用いてtPA単位で表した。各変
異タンパクの活性を少なくとも３回分析し，平均を計算
した。分析すべきサンプルの各々についてtPAの標品の
４種の希釈を行った。
ペプチド検査サンプルおよびフィブリノーゲンを,1％Ha
emaccelTM（pH7.4）を含むリン酸緩衝液（0.67M）中で
必要とする濃度にまで希釈した。tPA標品あるいはサン
プルの0.2mlを,0.2mlのヒトプラスミノーゲン（10CTA/m
l）,0.5mlのウシフィブリノーゲン（0.15％）および最
終的に0.1のトロンビン（10IU/ml）と混合した。溶解時
間を記録し，検量曲線を用いてtPA単位で表した。各変
異タンパクの活性を少なくとも３回分析し，平均を計算
した。分析すべきサンプルの各々についてtPAの標品の
４種の希釈を行った。
プラスミノーゲン溶解検定 変異タンパクのプラスミノーゲン溶解活性を,Ranby e
t al.,Thromb.Res.（1987）27:743−749で述べられて
いる放物線検定を用いて分析した。全試薬を37℃で予備
保温した。tPA標品あるいはtPAサンプルの0.1mlを,0.5m
lの緩衝液（0.1％Tween80TMと0.01％Na−アジドを含む
0.1Mトリス−HCL,pH7.5）,0.1mlの基質（S 2251（Ｈ−
Ｄ−Val−Leu−Lys−（パラーニトロアニリド）（Kabi
AB,Sweden））,3mM）,0.1mlのヒトプラスミノーゲン（1
CTA/ml）および0.1mlのフィブリン分解産物（10mg/ml）
と混合した。最終的には，混合液を37℃,45分間保温し
た。反応は0.1mlの酢酸（50％）を加えて停止させ，光
学濃度を405nmで読んだ。得られた検量曲線を用いてサ
ンプルの光学濃度を単位に変換した。結果は，少なくと
も５個の測定可能な希釈物の平均で表した。
t al.,Thromb.Res.（1987）27:743−749で述べられて
いる放物線検定を用いて分析した。全試薬を37℃で予備
保温した。tPA標品あるいはtPAサンプルの0.1mlを,0.5m
lの緩衝液（0.1％Tween80TMと0.01％Na−アジドを含む
0.1Mトリス−HCL,pH7.5）,0.1mlの基質（S 2251（Ｈ−
Ｄ−Val−Leu−Lys−（パラーニトロアニリド）（Kabi
AB,Sweden））,3mM）,0.1mlのヒトプラスミノーゲン（1
CTA/ml）および0.1mlのフィブリン分解産物（10mg/ml）
と混合した。最終的には，混合液を37℃,45分間保温し
た。反応は0.1mlの酢酸（50％）を加えて停止させ，光
学濃度を405nmで読んだ。得られた検量曲線を用いてサ
ンプルの光学濃度を単位に変換した。結果は，少なくと
も５個の測定可能な希釈物の平均で表した。
さらに，同様の検査をフィブリン分解産物（FDP）の
不在下で行った。この場合,0.5mlの代わりに0.6mlの緩
衝液が必要であった。
不在下で行った。この場合,0.5mlの代わりに0.6mlの緩
衝液が必要であった。
活性のフィブリン依存性 tPAおよび変異ポリペプチドがプラスミノーゲンをプ
ラスミンに活性化する能力に対する補因子（フィブリン
あるいはフィブリン分解産物（FDP）の影響を，凝血溶
解検査あるいはフィブリン依存性プラスミノーゲン溶解
検定で得た活性と，フィブリン非依存性プラスミノーゲ
ン溶解検定で決定した活性との比で表した。
ラスミンに活性化する能力に対する補因子（フィブリン
あるいはフィブリン分解産物（FDP）の影響を，凝血溶
解検査あるいはフィブリン依存性プラスミノーゲン溶解
検定で得た活性と，フィブリン非依存性プラスミノーゲ
ン溶解検定で決定した活性との比で表した。
フィブリン凝血のフィブリン−アフィニティー調製 ヒトのフィブリノーゲン（0.3％）0.2ml量をプラスチ
ック管に入れ,0.005mlのウシのトロンビン（500IU/ml）
と混合した。混合液を37℃で30分間静置させた。反応終
了後，凝血を注意深く除去し，抗トロンビンIII（3IU/m
l）とヘパリン（40IU/ml）を含む2mlの緩衝液（0.1Mト
リス−HCl,pH8.0）中で、37℃,30分間保温した。最終的
に，凝血を除去し,50mlの緩衝液（0.05Mトリス−HCl,0.
1M NaCl,pH7.5）に対して20分間,2回透析した。使用前
に，凝血をまわりの溶液より除いた。
ック管に入れ,0.005mlのウシのトロンビン（500IU/ml）
と混合した。混合液を37℃で30分間静置させた。反応終
了後，凝血を注意深く除去し，抗トロンビンIII（3IU/m
l）とヘパリン（40IU/ml）を含む2mlの緩衝液（0.1Mト
リス−HCl,pH8.0）中で、37℃,30分間保温した。最終的
に，凝血を除去し,50mlの緩衝液（0.05Mトリス−HCl,0.
1M NaCl,pH7.5）に対して20分間,2回透析した。使用前
に，凝血をまわりの溶液より除いた。
検査手順 すべてのサンプルをまず,0.1％Tween80TMを含むトリ
ス緩衝液（0.1M,pH7.5）に200ng/mlとなるように希釈し
た。その後サンプルを,5％ヒトアルブミンを含む同じ緩
衝液に最終濃度100ng/mlとなるように希釈した。続いて
0.4mlのサンプルをフィブリン凝血存在下，室温にて10
分間保温した。最後に溶液を除き，流体相中の抗原濃度
をEIAで決定した。この実験を各サンプルにつき２回行
った。
ス緩衝液（0.1M,pH7.5）に200ng/mlとなるように希釈し
た。その後サンプルを,5％ヒトアルブミンを含む同じ緩
衝液に最終濃度100ng/mlとなるように希釈した。続いて
0.4mlのサンプルをフィブリン凝血存在下，室温にて10
分間保温した。最後に溶液を除き，流体相中の抗原濃度
をEIAで決定した。この実験を各サンプルにつき２回行
った。
阻害検査 サンプルを,0.1％Tween80TMを含むトリス緩衝液（0.1
M,pH7.5）に最終濃度100ng/mlになるように希釈した。
M,pH7.5）に最終濃度100ng/mlになるように希釈した。
次いで0.2ml量を,65ウロキナーゼ阻害単位/mlの濃度
でプラスミノーゲンアクチベーター阻害剤を含む溶液0.
2mlと混合した。対照実験では，上で述べたポリペプチ
ドのサンプルを0.2mlの緩衝液（100％）と混合した。混
合液を10分間,37℃で保温した。保温時間終了時点でサ
ンプルを素早く希釈し，残存活性をフィブリン依存性プ
ラスミノーゲン溶解検定で分析した。この阻害検査は各
サンプルにつき２回行った。阻害感受性を阻害されてい
る％活性として表した。
でプラスミノーゲンアクチベーター阻害剤を含む溶液0.
2mlと混合した。対照実験では，上で述べたポリペプチ
ドのサンプルを0.2mlの緩衝液（100％）と混合した。混
合液を10分間,37℃で保温した。保温時間終了時点でサ
ンプルを素早く希釈し，残存活性をフィブリン依存性プ
ラスミノーゲン溶解検定で分析した。この阻害検査は各
サンプルにつき２回行った。阻害感受性を阻害されてい
る％活性として表した。
プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤をヒトの胎盤
より精製した。阻害画分は，いかなるタンパク分解活性
も，またプラスミン，トロンビンもしくはトリプシンの
阻害活性も含まない。
より精製した。阻害画分は，いかなるタンパク分解活性
も，またプラスミン，トロンビンもしくはトリプシンの
阻害活性も含まない。
変異タンパクの上記検定による値を表IIにまとめて示
す。
す。
（１）凝血溶解検査 （３）フィブリン依存性プラスミノーゲン溶解検定 （４）フィブリン非依存性プラスミノーゲン溶解検定 上の結果より，野生型tPAアミノ酸配列に変化を生じ
ることにより実質的な利点を達し得ることが，明白であ
る。従って，活性を増加させることができるだけでな
く，同時にプラスミノーゲンアクチベーター阻害剤に対
する感受性を低下させることができ，これにより効果的
な活性について全体として非常に実質的な増加がイン
ビボで達成できる。また酵素は，増強されたフィブリン
依存性を供するという点において実質的なより特異的に
することができ，従って凝血の不在下ではそれは実質的
に低下した活性を有する。よって，タンパク（あるいは
酵素）の血流中のレベルを最小にし，またtPAの望まし
くない副作用を実質的に減らすために，プラスミノーゲ
ンアクチベーター活性を持つこれらのポリペプチドはよ
り小量で投与でき，しかも凝血に対し増加した活性を供
する。
ることにより実質的な利点を達し得ることが，明白であ
る。従って，活性を増加させることができるだけでな
く，同時にプラスミノーゲンアクチベーター阻害剤に対
する感受性を低下させることができ，これにより効果的
な活性について全体として非常に実質的な増加がイン
ビボで達成できる。また酵素は，増強されたフィブリン
依存性を供するという点において実質的なより特異的に
することができ，従って凝血の不在下ではそれは実質的
に低下した活性を有する。よって，タンパク（あるいは
酵素）の血流中のレベルを最小にし，またtPAの望まし
くない副作用を実質的に減らすために，プラスミノーゲ
ンアクチベーター活性を持つこれらのポリペプチドはよ
り小量で投与でき，しかも凝血に対し増加した活性を供
する。
前述の本発明を，理解を明確にするために，図解と実
施例により幾分詳細に述べるが，ある程度の変化や一部
変更は，添付の特許請求の範囲内で行われ得ることは明
白であろう。
施例により幾分詳細に述べるが，ある程度の変化や一部
変更は，添付の特許請求の範囲内で行われ得ることは明
白であろう。
関連出願との相互関係 本出願は我々の出願第812,879号（出願日1985年12月2
3日）のCIP出願であり，その明細書のすべてを参考とし
てこの中に編入する。
3日）のCIP出願であり，その明細書のすべてを参考とし
てこの中に編入する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ナンシー エル．ヘイウッド アメリカ合衆国 カリフォルニア 94611 オークランド，セイレ ドライ ブ 7050 (72)発明者 ガイ ミュレンバック アメリカ合衆国 カリフォルニア 94618 オークランド，アプト．シー．, シクスティー−サード ストリート 309 (72)発明者 アーネスト−ギュンター アフティング ドイツ連邦共和国 3550 マールブルグ エーエム ゾネンハング 20 (72)発明者 エーリッヒ−ポール パクーズ ドイツ連邦共和国 3550 マールブルグ シュミーデッカー 18 (56)参考文献 特開 昭59−42321（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−247384（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−233630（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−130690（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−24（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−233630（ＪＰ，Ａ) 欧州公開199574（ＥＰ，Ａ２) Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，［23 ］（1984）Ｐ．6191−6195
Claims (25)
- 【請求項１】凝血を溶解する組織プラスミノーゲンアク
チベーター活性を有するポリペプチドであって、該ポリ
ペプチドは天然に生じるヒト組織プラスミノーゲンアク
チベーターの配列中で以下の： （ａ）少なくとも１つのグリコシル化部位でのアミノ酸
の置換による、グリコシル化部位の数の減少； （ｂ）Ｃ−末端での少なくとも３つのアミノ酸の欠失；
および、 （ｃ）開裂部位でのアミノ酸の置換； の少なくとも１つを有し、その結果として、以下の改良
された特性： （ｉ）比活性； （ii）活性のフィブリン依存性；および、 （iii）阻害剤感受性；の少なくとも１つを有する、ポ
リペプチド： ただし、（ａ）のみの修飾、および（ｃ）のみの修飾を
有するポリペプチドを除く。 - 【請求項２】Asn−Ｘ−ThrまたはAsn−Ｘ−Serで表され
る少なくとも１ケ所のグリコシル化部位に少なくとも１
個のアミノ酸の置換を持つ、請求項１に記載のポリペプ
チド。 - 【請求項３】アミノ酸117から119、184から186または44
8から450のグリコシル化部位の少なくとも１ヶ所でAsn
が置換されている、請求項２に記載のポリペプチド。 - 【請求項４】少なくとも２ヶ所のグリコシル化部位でAs
nがGlnに置換され、かつMet525からPro527までの配列を
欠いている、請求項２に記載のポリペプチド。 - 【請求項５】少なくとも２ヶ所のグリコシル化部位でAs
nがGlnに置換され、かつLys277がArgに置換されてい
る、請求項２に記載のポリペプチド。 - 【請求項６】Ser119、Ser186およびSer450のうち少なく
とも１ヶ所で非保存的置換を持つ、請求項２に記載のポ
リペプチド。 - 【請求項７】Ser119、Ser186またはSer450のGly、Alaま
たはValによる置換を少なくとも１個持つ、請求項７に
記載のポリペプチド。 - 【請求項８】272から280までの領域の開裂部位に１個ま
たはそれ以上の置換を持つ、請求項１に記載のポリペプ
チド。 - 【請求項９】244から277までの領域の開裂部位に１個ま
たはそれ以上の置換を持つ、請求項８に記載のポリペプ
チド。 - 【請求項１０】Lys277のIle以外のアミノ酸による置換
を持つ、請求項９に記載のポリペプチド。 - 【請求項１１】Lys277のArgによる置換を持つ、請求項1
0に記載のポリペプチド。 - 【請求項１２】Met525からPro527までの配列を欠く、請
求項１に記載のポリペプチド。 - 【請求項１３】５個以下のアミノ酸がＮ末端から欠失し
ている、請求項１に記載のポリペプチド。 - 【請求項１４】５個以下のアミノ酸がＮ末端から欠失し
ている、請求項２または３のいずれかに記載のポリペプ
チド。 - 【請求項１５】25個までのアミノ酸がＣ末端から欠失し
ている、請求項１から４のいずれかに記載のポリペプチ
ド。 - 【請求項１６】ヒトの組織プラスミノーゲンアクチベー
ターに由来し、そしてMet525からPro527までを欠いてい
る、請求項１に記載のポリペプチド。 - 【請求項１７】Lys277がArgに置換されている、請求項
１に記載のポリペプチド。 - 【請求項１８】アミノ酸117、184および448の少なくと
も１ヶ所のグリコシル化部位で、AsnがGlyに置換されて
おり、かつMet525からPro527までの配列を欠いている、
請求項１に記載のポリペプチド。 - 【請求項１９】アミノ酸117、184、および448の少なく
とも１ヶ所のグリコシル化部位で、AsnがGlnに置換され
ており、かつLsy277がArgに置換されている、請求項１
に記載のポリペプチド。 - 【請求項２０】Lys277がArgに置換されており、かつMet
525からPro527までを欠いている、請求項１に記載のポ
リペプチド。 - 【請求項２１】アミノ酸位置117、184および448の少な
くとも２ヶ所においてAsnがGlnに置換されており、かつ
Lys277がArgに置換されており、そしてMet525からPro52
7までを欠いている、請求項１に記載のポリペプチド。 - 【請求項２２】次の生理学的性質：天然に生じるヒト組
織プラスミノーゲンアクチベーターと比較して、6.2か
ら7.0の範囲の比活性;1.3から2.5の範囲のフィブリン依
存性；およびプラスミノーゲンアクチベーター阻害剤の
阻害に対し10から30％の範囲で低下した感受性；の少な
くとも１つを有する、請求項１に記載のポリペプチド。 - 【請求項２３】6.2から7.0の範囲の比活性を持つ、請求
項22に記載のポリペプチド。 - 【請求項２４】フィブリン依存性が1.3から2.5である、
請求項22に記載のポリペプチド。 - 【請求項２５】凝血を溶解するのに十分な量の組織プラ
スミノーゲンアクチベーター活性を有するポリペプチド
と生理学的に受容可能なキャリアとを含む血栓溶解剤で
あって、該ポリペプチドが、天然に生じるヒト組織プラ
スミノーゲンアクチベーターの配列中で以下の： （ａ）少なくとも１つのグリコシル化部位でのアミノ酸
の置換による、グリコシル化部位の数の減少； （ｂ）Ｃ−末端での少なくとも３つのアミノ酸の欠失；
および、 （ｃ）開裂部位でのアミノ酸の置換； の少なくとも１つを有し、その結果として、以下の改良
された特性： （ｉ）比活性； （ii）活性のフィブリン依存性；および、 （iii）阻害剤感受性；の少なくとも１つを有する、ポ
リペプチドであって、（ａ）のみの修飾、および（ｃ）
のみの修飾を有するポリペプチドを除くポリペプチドで
ある、血栓溶解剤。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US81287985A | 1985-12-23 | 1985-12-23 | |
| US812879 | 1985-12-23 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| JP6186171A Division JP2681000B2 (ja) | 1985-12-23 | 1994-08-08 | 新規ペプチドのプラスミノーゲンアクチベーターをコードする核酸 |
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|---|---|
| JPS62253380A JPS62253380A (ja) | 1987-11-05 |
| JP2575369B2 true JP2575369B2 (ja) | 1997-01-22 |
Family
ID=25210860
Family Applications (4)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61316095A Expired - Lifetime JP2575369B2 (ja) | 1985-12-23 | 1986-12-23 | 新規ペプチドのプラスミノ−ゲンアクチベ−タ− |
| JP6186171A Expired - Lifetime JP2681000B2 (ja) | 1985-12-23 | 1994-08-08 | 新規ペプチドのプラスミノーゲンアクチベーターをコードする核酸 |
| JP6186170A Expired - Lifetime JP2680999B2 (ja) | 1985-12-23 | 1994-08-08 | 新規ペプチドのプラスミノーゲンアクチベーターをコードする核酸を含有する細胞 |
| JP8337365A Expired - Lifetime JP2769314B2 (ja) | 1985-12-23 | 1996-12-17 | 新規プラスミノーゲンアクチベーター |
Family Applications After (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6186171A Expired - Lifetime JP2681000B2 (ja) | 1985-12-23 | 1994-08-08 | 新規ペプチドのプラスミノーゲンアクチベーターをコードする核酸 |
| JP6186170A Expired - Lifetime JP2680999B2 (ja) | 1985-12-23 | 1994-08-08 | 新規ペプチドのプラスミノーゲンアクチベーターをコードする核酸を含有する細胞 |
| JP8337365A Expired - Lifetime JP2769314B2 (ja) | 1985-12-23 | 1996-12-17 | 新規プラスミノーゲンアクチベーター |
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| EP (1) | EP0227462B1 (ja) |
| JP (4) | JP2575369B2 (ja) |
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| DE (1) | DE3684680D1 (ja) |
| DK (1) | DK623186A (ja) |
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| GR (1) | GR3004568T3 (ja) |
| ZA (1) | ZA869626B (ja) |
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