JPS62253380A - 新規ペプチドのプラスミノ−ゲンアクチベ−タ− - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は１組織プラスミノーゲンアクチベーター活性を
持ち、遺伝子工学の技法により天然のプラスミノーゲン
アクチベーターに比べ改良された性質を有するポリペプ
チド、それをコードするＤＮＡ配列およびその作成法に
関する。また本発明は。

上記ＤＮＡ配列を含有する発現構築物、それを含有する
プラスミド、および該プラスミドを保持する細胞に関す
る。さらにまた本発明は、上記ポリペプチドを含む製剤
組成物に関する。

（従来技術） 組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）は。

凝血の溶解に関連のあるセリンプロテアーゼである。こ
の分子は、他の天然に生じるポリペプチドと相同なアミ
ノ酸配列を示すいくつかの明確な領域を有する。Ｎ末端
の最初の領域は、フィブロネクチンと相同性のある領域
である。次の領域は。

種々の成長因子と相同性を持つ。この成長因子領域につ
づいて２つのクリングル領域がある。最後に、他のセリ
ンプロテアーゼと’Ｉ（Ｉｆｆ性の見ら耗る活性部位が
ある。

組織プラスミノーゲンアクチベーターおよびそのｉｎ　
　ｖｉｖｏでの凝血溶解能に関連して、少なくとも４種
の異なった特性が存在する。まず第１には。

プラスミノーゲンを開裂して、フィブリンを分解するプ
ラスミンを生産するプロテアーゼ機能の比活性である。

第２の特性は、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤
の阻害に対する感受性である。

第３の特性は、プラスミノーゲン分解活性におけるプラ
スミノーゲンアクチベーターのフィブリン依存性である
。第４の特性は、　ｔＰＡのフィブリン表面への結合性
である。これらの要因の各々が。

凝血存在下でプラスミノーゲンアクチベーターがプラス
ミノーゲンをプラスミンに分解するその゛速さや特異性
に役割をなしている。従って、実質的な問題は、これら
のカテゴリーに属する一種がそれ以上の特性を改善する
ような組織プラスミノーゲンアクチベーター活性を有す
るポリペプチドが生産できることにあろう。

゛　　　　の　　′　なｉ′　■ 天然に存在するタンパクの元来の性質を高めるための、
変異処理の利用については、　Ｃｒａｉｋ　ｅｔａｌ、
、　５ｃｉｅｎｃｅ（１９８５）　２２８：２９１　；
Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ　ｅｔ　　ａｌ、。

Ｎａｔｕｒｅ（１９８４）　３１２ニア７−８０および
一１１ｋｉｎｓｏｎ　ｅｔ　　ａｌ、。

Ｎａｔｕｒｅ　（１９８４）　　３０７：１８７−１８
８に報告されている。

Ａｎｄｒｅａｓｅｎ　ｅｔ　　ａｌ、、　ＥＭＢＯＪ、
（１９８４）　３　：　５１−５６は。

ｔＰＡの開裂部位でのクリッピングがプロテアーゼ活性
に必要であることを報告した。Ｎｙ　　ｅｔ　　旦、。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ
Ａ（１９８４）８１　：　５３５５は。

ヒトｔＰＡの構造と１機能的および構造的ドメインに対
するイントロンとエクソンの相互関係について報告した
。Ａ、　Ｊ、ｖａｎ　Ｚｏｎｎｅｖｅｌｄ　　ｅｔ　　
ａｌ。

八ｂｓｔｒａｃｔ　　ｆｒｏｍ　　ｒｓＴＨＭｅｅｔｉ
ｎｇ、　　Ｊｕｌｙ　　１４−１９＋１９８５は、ヒト
の組織型プラスミノーゲンアクチベーターの構造と機能
の相互関係について報告した。（Ｊ、　Ｂｉｏｌ　Ｃｂ
ｅｍ、　（１９８６）　２６１：１４２１４−１４２１
８）Ｏｐｄｅｎａｋｋｅｒｌ　旦、＋　ＥＭＢＯＷｏｒ
ｋｓｈｏ　　ｏｎ　Ｐｌａｓｍｉｎｏ　ｅｎ　Ａｃｔｉ
ｖａｔｉｏｎ（八ｍａｌｆｉ、　Ｉｔａｌｙ、　０ｃｔ
ｏｂｅｒ　１４−１８＋１９８５）は、炭水化物側鎖の
除去によるｔＰＡ活性への影響について報告した。Ｌｏ
ｓｋｕｔｏｆｆ　ｅｔ　　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ
ｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ（１９８３）８０　：　２９５６−２
９６０およびＬｏｓｋｕ　ｔｏｆ　ｆ　。

乃μ圓央ｈ」μ邊並馳す二匡肋則エ　旦用：　１１８（
Ｓ６９９）は、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤
の特性について述べた。

（発明が解決しようとする問題点） ｔＰＡ分子に欠失や置換を独立にまたは組み合わせて採
用することにより、プラスミノーゲンアクチベーター活
性を持つポリペプチドが提供され。

ここでグリコシル化は変化を受け、Ｃ−末端は不完全と
なり、開裂部位は修飾されている。その結果得られた生
成物は、プラスミノーゲンを活性化して、フィブリン塊
を溶解したり、凝血形成を妨げたりするのに使用できる
ことがわかる。これらのポリペプチドは１部位特異的変
異形成によって生成した変異遺伝子を発現させることに
よって産生される。

（問題点を解決するための手段） 本発明のポリペプチドは、凝血を溶解することにおける
Ｕ織プラスミノーゲンアクチベーター活性を持つポリペ
プチドであって、天然の組織プラスミノーゲンアクチベ
ーターの比活性の少なくとも０．３の比活性を有し、ま
た組織プラスミノーゲンアクチベーター活性を持つ天然
に生じるポリペプチド中のグリコシル化部位の数を減ら
すこと。

Ｃ末端で少なくとも３個のアミノ酸を欠失させること、
または開裂部位のアミノ酸を置換することの結果として
、比活性、活性のフィブリン依存性。

または阻害剤感受性に関して少なくとも１つの改良され
た性質を持つ。

本発明のポリペプチドは２組織プラスミノーゲン活性を
持つポリペプチドであって、ヒトの組織プラスミノーゲ
ンアクチベーターに由来し、そしてアミノ酸位置１１７
，１８４および４４８のうち少なくとも２ケ所でＡｓｎ
のＧｌｎによる置換を持つ。

本発明のポリペプチドは１組織プラスミノーゲン活性を
持つポリペプチドであって、ヒトの組織プラスミノーゲ
ンアクチベーターに由来し、そしてＭｅ　ｔ５２５から
Ｐｒｏ５２７までを欠いている。

本発明のポリペプチドは９組織プラスミノーゲン活性を
持つポリペプチドであって、ヒトの組織プラスミノーゲ
ンアクチベーターに由来し、そしてＬｙｓ２７７がＡｒ
ｇに置換されている。

本発明のポリペプチドは、ヒトの組織プラスミノーゲン
アクチベーターに由来し組織プラスミノーゲン活性を持
つポリペプチドであって、アミノ酸１１７．１８４およ
び４４８の少なくとも１ケ所のグリコシル化部位でＡｓ
ｎがＧｌｎに置換されており、ＭｅＬ５２５からＰｒｏ
５２７までの配列を欠いている。

本発明のポリペプチドは、ヒトの組織プラスミノーゲン
アクチベーターに由来し組織プラスミノーゲン活性を持
つポリペプチドであって、アミノ酸１１７．１８４およ
び４４８の少なくとも１ケ所のグリコシル化部位でＡｓ
ｎがＧｌｎに置換されており、　Ｌｓｙ２７７がＡｒｇ
に置換されている。

本発明の薬剤組成物は、凝血を溶解することにおける組
織プラスミノーゲンアクチベーター活性を持つポリペプ
チドを凝血を溶解するに充分な量含みまた生理学的に受
容可能なキャリアを含む薬剤組成物であって、該ポリペ
プチドが天然の組織プラスミノーゲンアクチベーターの
比活性の少なくとも０．３の比活性を有し、また組織プ
ラスミノーゲンアクチベーター活性を持つ天然に生じる
ポリペプチド中のグリコシル化部位の数を減らすこと、
Ｃ末端で少なくとも３個のアミノ酸を欠失させること、
または開裂部位のアミノ酸を置換することの結果として
、比活性、活性のフィブリン依存性、または阻害剤感受
性に関して少なくとも１つの改良された性質を持つポリ
ペプチドである。

本発明のＤＮＡ配列は、ヒトの組織プラスミノーゲンア
クチベーターに由来し組織プラスミノーゲン活性を持つ
ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列であって、該ポリ
ペプチドが以下のうちの少なくとも１つを持つという点
でヒトの組織プラスミノーゲンアクチベーターと異なる
：　（ａＪＩＩ７−１１９．１８４−１８６および４４
Ｂ−４５０のグリコシル化部位の少なくとも２ケ所の障
害；ＣｂｌＣ末端での少なくとも３個のアミノ酸の欠失
；および（ｃ）ヒトの組織プラスミノーゲンアクチベー
ターの開裂部位のアミノ酸の置換。

本発明の発現構築物は、転写の順に、転写と翻訳の開始
領域、該開始領域の転写と翻訳の制御調節下にあるＤＮ
Ａ配列、および転写と翻訳の終結領域を含有する発現構
築物であって、　Ｂｇ　ＤＮＡ配列がヒトの組織プラス
ミノーゲンアクチベーターに由来し組織プラスミノーゲ
ン活性を持つポリペプチドをコードするＤＮＡ配列であ
って、該ポリペプチドが（ａ）１１７−１１９．１８４
−１８６および４４８−４５０のグリコシル化部位の少
なくとも２ケ所の障害、（ｂ）Ｃ末端での少なくとも３
個のアミノ酸の欠失、および（ｃ）ヒトの組織プラスミ
ノーゲンアクチベーターの開裂部位のアミノ酸の置換の
うちの少なくとも１つを持つという点でヒトの組織プラ
スミノーゲンアクチベーターと異なるポリペプチドであ
る。

本発明のプラスミドは、宿主中で機能的な複製系および
発現構築物を含有するプラスミドであって、該発現構築
物が、転写の順に、転写と翻訳の開始領域、該開始領域
の転写と翻訳の制御ｉｌｌ　２ｍ節下にあるＤＮＡ配列
、および転写と翻訳の終結領域を含有する発現構築物で
あって、該ＤＮＡ配列がヒトの組織プラスミノーゲンア
クチベーターに由来し組織プラスミノーゲン活性を持つ
ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列であって、該ポリ
ペプチドが（ａｌ　１１７−１１９．１８４−１８６お
よび４４８−４５０のグリコシル化部位の少なくとも２
ケ所の障害、（ｂ）Ｃ末端での少なくとも３個のアミノ
酸の欠失、および（ｃ）ヒトの組織プラスミノーゲンア
クチベーターの開裂部位のアミノ酸の置換のうちの少な
くとも１つを持つという点でヒトの組織プラスミノーゲ
ンアクチベーターと異なるポリペプチドである。

本発明のポリペプチドは、ヒトの組織プラスミノーゲン
アクチベーターに由来しｍ織プラスミノーゲン活性を持
つポリペプチドであって、　Ｌｙｓ２７７が八ｒｇに置
換されており、またＭｅｔ５２５からＰｒｏ５２７まで
を欠いている。

本発明のポリペプチドは、ヒトの組織プラスミノーゲン
アクチベーターに由来し組織プラスミノーゲン活性を持
つポリペプチドであって、アミノ酸位置１１７．１８４
および４４８の少なくとも２ケ所においてＡｓｎがＧｌ
ｎに置換されており、　Ｌｙｓ２７７がＡｒｇに置換さ
れており、またＭｅ　ｔ５２５からＰｒｏ５２７までを
欠いている。

本発明の細胞は、プラスミドを含む生育可能な細胞であ
って、該プラスミドが宿主中で機能的な複製系および発
現構築物を含有するプラスミドであって、該発現構築物
が、転写の順に、転写と翻訳の開始領域、該開始領域の
転写と翻訳の制御調節下にあるＤＮＡ配列、および転写
と翻訳の終結領域を含有する発現構築物であって、該Ｄ
ＮＡ配列がヒトの組織プラスミノーゲンアクチベーター
に由来し組織プラスミノーゲン活性を持つポリペプチド
をコードするＤＮＡ配列であって、該ポリペプチドが（
ａｌ　１１７−．１１９．１８４４８６および４４８−
４５０のグリコシル化部位の少なくとも２ケ所の障害、
（ｂ）Ｃ末端での少なくとも３個のアミノ酸の欠失；お
よ゛び（ｃ）ヒトの組織プラスミノーゲンアクチベータ
ーの開裂部位のアミノ酸の置換のうちの少なくとも１つ
を持つという点でヒトの組織プラスミノーゲンアクチベ
ーターと異なるポリペプチドである。

本発明の方法は、　　ＤＮＡ配列を作成するための方法
であって、該ＤＮＡ配列がヒトの組織プラスミノーゲン
アクチベーターに由来し組織プラスミノーゲン活性を持
つポリペプチドをコードするＤＮＡ配列であり、該ポリ
ペプチドが（ａ）１１７−１１９．１８４−１８６およ
び４４８−４５０のグリコシル化部位の少なくとも２ケ
所の障害、（ｂ）Ｃ末端での少なくとも３個のアミノ酸
の欠失、およびｆｃ）ヒトの組織プラスミノーゲンアク
チベーターの開裂部位のアミノ酸の置換のうちの少なく
とも１つを持つという点でヒトの組織プラスミノーゲン
アクチベーターと異なるポリペプチドであるＤＮＡ配列
を作成するための方法であって、以下の工程：（１）組
織プラスミノーゲンアクチベーター活性を持つ天然に生
じるポリペプチドをコードする鋳型を含有する原核生物
プラスミドの一本鎖に、　１１７−１１９．１８４−１
８６および４４８−４５０のアミノ酸をコードするグリ
コシル化部位の少なくとも２ケ所のグリコシル化部位で
の障害、Ｃ末端での少なくとも３個のアミノ酸の欠失、
または開裂部位のアミノ酸の置換を生じるミスマツチを
もつオリゴデオキシヌクレオチドをアニーリングさせて
２部分的な二本鎖プラスミドを供する工程であって、こ
こで、該オリゴデオキシヌクレオチドが、標的鋳型に関
して８５から９０％の相補性を有すること、ミスマツチ
される座位の反対側の相補性領域の融点がほぼ等しいこ
と、そして前記変異形成座位以外の前記プラスミドのど
の部位でも７０％より低い相補性を持つことにより特徴
づけられる工程；（２）修正能力を欠＜　　ＤＮＡポリ
メラーゼにより該オリゴデオキシヌクレオチドを伸長し
て、二本鎖プラスミドを供する工程；（３）該二本鎖プ
ラスミドにより宿主の原核生物細胞を形質転換し、該細
胞を増殖させることにより該二本鎖プラスミドを複製さ
せる工程；および（４）該オリゴデオキシヌクレオチド
の配列を持つプラスミドを単離する工程、を包含する。

本発明の感受性は、ヒトの組織プラスミノーゲンアクチ
ベーターと実質的に同じアミノ酸配列を持つポリペプチ
ドであって９次の生理学的性質の少なくとも１つを持つ
ポリペプチド：天然に生じるヒトの組織プラスミノーゲ
ンアクチベーターと比較して、６．２から７、Ｃの範囲
の比活性：１．３から２゜５の範囲のフィブリン依存性
；およびプラスミノーゲンアクチベーター阻害剤の阻害
に対し１０から３０％の範囲で低下した。

以下に本発明の詳細な説明する。

プラスミノーゲンアクチベーターとしての特性が高めら
れた新規ポリペプチドが、そのようなポリペプチドをコ
ードするＤＮＡコード配列、適切な宿主内でそのような
配列を発現させるための発現カセット、新規ポリペプチ
ドを発現できる宿主。

および新規ポリペプチドを生産する方法を含めて。

提供される。新規ポリペプチドは、少なくともひとつの
グリコシル化部位に変化を含み、２７２から２８０まで
の領域、特にＰｈｅｚｔ４Ａｒｇｚ７５　１１ｅ２４６
−Ｌｙｓｔｔｔ（ＦＲＩＫ）にある開裂部位に少なくと
もひとつの変化を含み、そして／または９分子の一端か
または両端、特にＣ−末端の切断を含む。唯一の修飾が
グリコシル化部位にあるとき、　　１７７−１１９と１
８４−１８６の両方のグリコシル化部位は同様にまたは
異なって修飾される。（使用するアミノ酸の番号付けは
Ｐｅｎｎ１ｃａ　ｅｔ　　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　（
１９８３）　３０１：　２Ｊ４−２２１の報告に基づき
、グリシン−アラニン−アルギニン−セリン−チロシン
の配列のセリンから始める。）組織プラスミノーゲンア
クチベーター活性を持ちヒト組織プラスミノーゲンアク
チベーターに由来するポリペプチドにこのような変化を
専人すると、生理学的特性の改善が達成可能である。

新規ポリペプチドは、タンパク分解活性、特にプラスミ
ノーゲン分解活性を増幅しており、プラスミノーゲンア
クチベーター阻害に対する感受性が低下し、フィブリン
親和性が増加し、そして／またはプラスミノーゲン分解
活性のフィブリン依存性が増している。

興味深い第１の変化は、アミノ酸１１７−１１９．１８
４−１８６および４４８−４５０におけるグリコシル化
部位゛の少なくとも１つの修飾であり、アスパラギンが
保存的または非保存的に変化しているか、または。

セリンかスレオニンが特にグリシン、アラニンあるいは
バリンに非保存的に変化している。特に興味深いのは、
　１１７−１１９と１８４−１８６のグリコシル化部位
である。興味深い変異には、アスパラギンが他のアミノ
酸、好ましくはグルタミン、バリン。

ロイシン、イソロイシン、アラニンまたはグリシン、よ
り好ましくはグルタミンに置換されこと。

または、セリンかスレオニンが他のアミノ酸、好ましく
はアラニン、バリンまたはメチオニンに置換されること
、つまりメルカプト基または中性水酸基をもたない３〜
５個の炭素原子から成る脂肪族アミノ酸に置換されるこ
と、が含まれる。１１７と１８４におけるグリコシル化
部位のアスパラギンのグルタミンへの置換が特に興味深
い。

変異生成物特性の所望の変化に応じて、保存的変化また
は非保存的変化いずれかが含まれる。保存的な変化は、
アミノ酸間にセミコロンを付して示した。Ｇ、　Ａ、Ｖ
、　Ｉ、　ｔ、；ｏ、　Ｅ、に、　Ｒ，Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ
、およびＦ、Ｗ。

Ｙ；ここで１つのグループのアミノ酸が他のグループの
アミノ酸または上に示されていないアミノ酸に置換し、
このような変化を非保存的であると考える。

比活性は１分子のグリコシル化量を特にクリングル構造
内のグリコシル化部位、より特別にはＮ−末端からＣ−
末端方向の最初の２つのグリコシル化部位について減少
させると、増幅できることが見出された。

欠失、置換、挿入などのようなさまざまな障害をグリコ
シル化部位に導入することにより、グリコシル化部位の
３つ組を変えてグリコシル化部位を破壊する。例えば、
　１１７−１１９．１８４−１８６および４４８−４５
０のグリコシル化部位を同様にまたは異なって修飾する
。

次に興味深い領域は、アミノ酸の２７４−２７８に生じ
る開裂部位の修飾である。特に興味深いのは。

２７７のリジンのアルギニンへの置換のような保存的変
化である。他の置換としては、２７６のイソロイシンの
バリン、ロイシン、グリシンまたはアラニンへの置換を
含む。開裂部位の特異的修飾はプラスミノーゲンアクチ
ベーター阻害に対する感受性を減少させ得ることがわか
り、よってこのポリペプチドはｉｎ　　ｖｉｖｏで、天
然での阻害量のプラスミノーゲンアクチベーター阻害剤
存在下で、野生型組織プラスミノーゲンアクチベーター
に比べて活性を増しているだろう。

第３の興味ある変化は、Ｎ末端またはＣ末端の切断で、
特にＣ末端での少なくとも１アミノ酸から２５アミノ酸
まで１通常は１０アミノ酸まで、より通常には３アミノ
酸までの切断である。Ｎ末端では、セリンから始まりチ
ロシンに続く１〜５アミノ酸、特に１〜３アミノ酸が切
断される。

Ｃ末端の切断は、フィブリン依存性を増幅させ。

それによって組織プラスミノーゲンアクチベーターの特
異性の増加が達成される。フィブリン依存性を増加する
ことで、開裂して凝血から離れたプラスミンとなるプラ
スミノーゲンの量は実質的に減少し、プラスミンの副作
用は阻止されるであろう。

本発明の新規ポリペプチドは、上に述べた２種。

３種またはそれ以上の変化を組み合わせて得られる。例
えば、１１７と１８４のグリコシル化部位のアスパラギ
ンのグルタミンによる置換（第１の型の変化例）に加え
て、開裂部位２７７のリジンをアルギニンに置換するこ
とによる修飾（第２の型の変化例）、またはＭｅｔ５２
５からＰｒｏ５２７までの配列の切断（第３型の変化例
）を行ってよい。

いくつかの場合、むしろｔＰＡを切断するよりは。

鎖を伸長するか、または末端のアミノ酸を一般に約１−
１２アミノ酸、Ｎ末端とＣ末端の１つか両方で伸長する
。付加したアミノ酸はリンカ−としてふるまったり、特
別な免疫応答を供したり１分子の生理学的特性を修飾し
たりするであろう。

主題のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は。

イントロンを含む染色体ＤＮＡ、　ｃＤＮＡ、合成りＮ
Ａ　。

またはそれらの組み合わせを使って、さまざまな方法で
調整される。所望の変異は、遺伝子を適当な細菌の宿主
中に、−末鎖バタテリオファージベクタ一または二本鎖
プラスミドベクターを用い°。

次に野生型配列に実質的に相補的ではあるが、トランス
バージョン、転位、欠失または挿入などの所望の変異を
含むミスマツチの配列を用いて、クローニングすること
により達成される。あるいは。

便利な制限酵素切断部位が存在すれば、特別な配列を削
り、変異を含んだ合成配列を導入できる。

使用できる他の技術は、二本鎖鋳型の部分エキソヌクレ
アーゼ消化、またはｉｎ　　ｖｉｔｒｏでヘテロデュプ
レックスを形成して部分的−末鎖領域をオリゴヌクレオ
チド−特異的変異形成にかけることである。

特に興味深いのは、オリゴヌクレオチド特異的変異形成
である。（Ｚｏｌｌｅｒ　ａｎｄ　Ｓｍ１ｔｈ、　　Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ監ｕ肌しく１９８３）　１００：４６８−
５００．）欠失や挿入のミスマツチを含んだ適切なオリ
ゴヌクレオチド配列としては、一般に約２０から１００
ヌクレオチド（ｎｔ）、より一般的には２０−６０ｎ　
を持つものを調製する。この配列は２合成により簡単に
調製でき、適当なりローニングベクターでクローニング
できる。このオリゴヌクレオチドを２部位特異的変異形
成用にｔＰＡ遺伝子かｔＰＡ類似体の精製鋳型とアニー
ルさせる。変異は独立に導入し。

変異の部位は約１０塩基対（ｂｐ）　、より一般には約
２０ｂｐ分離させる。異なった部位の変異は一段階また
は連続的段階で導入し、各変異後その変異の存在やｔＰ
Ａ［似体の活性への効果を確かめる。

変異形成プライマーの設計には、いくつかの考察が含ま
れる。一般に、プライマーの長さは、標的鋳型に対して
、約８５％より高く約９５％より低い相補性を持つよう
に選択する。これによって３変異形成プライマーによる
簡単なプラーク選別が可能となるというさらなる利点が
供される。変異形成プライマーが、欠失を生じる場合１
通常欠失の各端に少なくとも約２０ｂｐの相補性が存在
するであろう。また、プライマーは、変異座位の両端に
おいて、だいたい等しい融点を供する必要がある。

さらに考えると、プライマーは鋳型上の不適当な部位か
らのプライミングを、もし除かない場合は。

最少にするよう選択されるべきである。実際、変異座位
以外のあらゆる部位において、相補性は７０％より低く
、好ましくは６０％より低くあるべきである。従って９
問題とする遺伝子のみならず、クローニングベクターに
ついても考えるべきである。

特に考えなければならないことは、プライマーの３′末
端での相補性である。

便宜上、ベクターは、たとえばＭ１３のような一本鎖状
ＤＮＡウィルス、特にベクターとして利用するため修飾
されたものである。便利なウィルスベクターはＭ１３ｍ
ｐ９である。変異形成プライマーを鋳型やベクターと、
必要なヌクレオチドおよびＴ４ＤＮ＾リガーゼ存在下で
、クレノー断片やＴ４ＤＮＡポリメラーゼのような修正
能力を欠いた適当なポリメラーゼ存在下、アニーリング
条件のもとに一緒にして、それによって遺伝子を保持す
る環状ベクターが複製可能となり、二本鎖複製型が供さ
れる。次いで二本鎖ＤＮＡを適当な細胞に導入する。溶
解性ベクターを供給することで、変異形成が生じたｔＰ
ＡまたはｔＰＡＩｉ似体の存在をプライマーを使って選
別できるプラークを得る。通常、変異形成産物としての
正確な配列を持つ可能性を増すためには。

感度を増加させた。少なくとも２回のくり返し選別が必
要であろう。

次に推定上止のクローンを１例えばプラーク精製、電気
泳動的精製などして、精製し１次いで配列決定する。

配列決定のために、少なくとも長さが約２０から３０塩
基で変異座位から少なくとも約５５塩基離れた位置でア
ニールするであろう配列決定プライマーを設計する。正
確な配列の妥当な保証を得るためには、変異座位の両側
少なくとも約５０塩基を含む領域を配列決定することが
望ましい。

一度正確に変異形成した遺伝子が得られたら。

それを単離し、適切な宿主中で発現させるために適切な
発現ベクターに挿入する。

哺乳類、昆虫および鳥類宿主に利用する発現ベクターに
は、広範囲の種類が存在する。例えば。

ここで参考文献として採用するＥＰＡ　Ｏ，０９２，１
８２に述べられているものを参照せよ。特に興味深いの
は哺乳類ベクターで、これはシミアンウィルス。

ウシ乳頭腫ウィルス、アデノウィルスなどのよ゛うなウ
ィルスのレプリコンを使用する。

転写や翻訳の開始および終結側′４Ｂ　ＳＪｆ域は、天
然上ｔｐ＾遺伝子に関連する領域、ウィルスの構造遺伝
子由来の領域または宿主遺伝子由来の領域である。多く
のプロモーターが利用可能である。例えば、　ＳＶ４０
の初期および後期プロモーター、アデノウィルスの主要
後期プロモーター、β−アクチンプロモーター、ヒトＣ
ＭＶ　Ｉｍｍｅｄｉａｔｅ　Ｅａｒｌｙ　　（ＩＥＩ）
プロモーターなどである。望ましくは、プロモーターは
２発現を向上させるために、エンハンサ−とともに使う
。

多くの場合ｔＰＡ発現構築物を増幅することが望ましい
。増幅または他の理由のために１発現構築物を染色体に
組み込ませることが望ましい。この目的のためには、構
築物は不安定な複製系１例えば酵母ａｒｓ　　１と結合
されるか、あるいは複製系を欠くであろう。組み込みに
ついては例えばＡｘｅｌａｎｄ　Ｗｉｇｌｅｒ＋米国特
許第４，３９９，２１６号を参照せよ。

通常、マーカー発現構築物は主題の発現構築物とタンデ
ムであろうし、そのマーカーは増幅遺伝子と同じでも異
なったものでもよい。これは２発現構築物とタンデムで
あり、　　ｔＰＡ発現構築物と同じ宿主内で機能を持ち
、そしてＤＨＰＲ（ジヒドロ葉酸還元酵素）　、　ＴＫ
　（チミジンキナーゼ）、ＭＴ−ｒおよび−■　（メタ
ロチオネイン、例えばヒト）、０ＯＣ（オルニチン脱炭
酸酵素）のような増幅可能な遺伝子をコードするような
ｔＰＡを有することによって達成できる。増幅可能遺伝
子に従って宿主に圧力をかけることにより１例えばＤ　
ＨＰ　Ｒならばメトトレキセートで圧力をかけることに
よって、主題の発現構築物は増幅される。

用いる特別な宿主やシグナル配列に従って９発現された
ｔＰＡ類似体は宿主細胞質内に保持されるかまたは分泌
されるであろう。細胞質内に保持される場合、　　ｔＰ
Ａ［似体は常法に従って宿主細胞をを溶解することによ
り単離し、抽出および精製法。

好ましくは電気泳動法、クロマトグラフィーのような方
法を使用して精製する。ｔＰＡが分泌される場合１分泌
されたｔＰＡは、アフィニティクロマトグラフィーを含
む従来の方法に従って上澄液から単離できる。

本発明で使用するポリペプチドの特性を組み合わせると
、　　ｔＰＡＯよううな天然のプラスミノーゲンアクチ
ベーターよりも優れている。これらのポリペプチドは、
天然のｔＰＡに対して少なくとも０．６倍、しばしば少
なくとも０．７倍１通常は少なくとも１、Ｃ倍、一般に
約１．１−７、Ｃ倍、そして好ましくは約６．２から７
、Ｃ倍の比活性を持つであろう。

活性のフィブリン依存性は、天然のｔＰＡに対して少な
くとも０．４倍、しばしば少なくとも約０．６倍。

通常は少なくとも約０．７倍、そして好ましくは少なく
とも約１〜２．５倍で特に１．３から２．５倍であろう
。プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤に対する感受
性は２通常天然のｔＰＡよりも高くはなく、天然のｔＰ
Ａの感受性に基づいて好ましくは。

約５％低下し、より好ましくは約１０％低下から約９０
％低下までの範囲に及び、特に天然のｔＰＡより約２５
−９０％低下しているであろう。この主題化合物は通常
、野生型ｔＰＡよりも少なくとも１つの見地においては
優れているであろう。（試験法については実験の項を参
照）。

特に興味深いのは１組織プラスミノーゲンアクチベータ
ー活性を持ち、実質的にヒトｔＰＡと同じアミノ酸配列
（置換、欠失および挿入を含む相異が１０％より低い１
通常は５％より低い）を持っているポリペプチドである
。これらのポリペプチドは以下の性質の少なくとも１つ
を持っているであろう。（ａｌ比活性が天然ｔＰＡの比
活性の少なくとも約０．６倍、しばしば少なくとも約０
．７倍１通常は少なくとも約１、Ｃ倍、一般に約１．１
から７、Ｃ倍。

そして好ましくは約６．２から７、Ｃ倍である。山）フ
イブリン依存性が天然ｔＰＡの少なくとも０．４倍。

しばしば少なくとも約０．６倍、一般には少なくとも約
０．７倍、そして好ましくは少なくとも約１、Ｃから２
．５倍、特に約１．５から２．５倍である。（ｃｌヒト
プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤による阻害に対
する感受性の低下が天然ｔＰＡの感受性に比較して約５
％であり、より好ましくは約１０％の低下から約９０％
の低下の範囲におよび、そして特に天然ｔＰＡよりも約
２５から９０％低下している。−主題のポリペプチドは
、さまざまな血管の状態や病気に対する予防処置または
治療処置においてさまざまな方法で特異的に使用され、
哺乳類宿主。

特にヒト宿主における血栓形成を防ぐであろう。

従って、宿主が凝血形成に感受性である場合はこれを手
術中に投与してよく、あるいは血栓患者の処置用に投与
してもよく、これにより、深い動脈血栓、肺塞栓２頭蓋
血栓および冠状動脈血栓内に形成している凝血を溶解す
る。

主題化合物は、腸管によって、または非経口的に、特に
注射または注入によって投与する。これらの化合物は、
ゼラチン、ゼラチン誘導体のグループから選択されるタ
ンパク安定化剤、アルブミンのような保護タンパク、　
ｔｉ、　Ｗアルコールまたはアミノ酸の存在下、水、生
理食塩水または適当な緩衝系のような生理的に受容可能
な支持体中にその有効量を単独であるいは他の治療薬、
特に血管病用架と組み合わせて投与できる。次の実施例
は、説明のためであり、決してこれに限定されない。

（以下余白） （実施例） 材料層よ墾方広 変異形成は、以下で述べるように一部変更した。

Ｚｏｌｌｅｒ　ａｎｄ　Ｓｍ１ｔｈ、　Ｍｅｔｈ、　Ｅ
ｎｚ　ｍｏｌ、　（１９８３）　１００　：４６８−５
００　、で述べられている手順を用いて行った。

合成りＮＡ変異形成と配列決定プライマーは、　Ｎ、　
Ｎ〜ジイソプロピルホスホロアシダイトを用いて、　Ｕ
ｒｄｅａｅｔ　　ａｌ、＋　　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　（１９８３）８０　：
　７４６１−７４６５で述べられているようなシリカ支
持体上での自動オリゴヌクレオチド合成により調製した
。配列決定プライマーを、バクテリオファージＭ１３で
のジデオキシヌクレオチド連鎖末端法（Ｆ、　Ｓａｎｇ
ｅｒ、　Ｓ、　Ｎ１ｃｋｌｅｎ　ａｎｄ　Ａ、　Ｒ，Ｃ
ｏｕｌｓｏｎ。

Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、
　　ＬＩＳＡ　　（１９７７）　　７４　　：　　５４
６３）による配列決定用に設計した。配列決定プライマ
ーは、長さが一般的に２０から３０塩基でＭ１３ｍｐ９
組み換え鋳型に相補的であり、しかも変異座位から少な
くとも５５塩基離れた位置でアニールするように設計し
た。以下の表は、変異形成や配列決定に用いるオリゴマ
ーを示している。

表Ｉ 変異形成プライマー ｌａ、　　　ＣＧＣＧＣＴＧＣＴＣＴＧＣＣＡＧＴＴＧ
ＧＴｌｂ、　　　ＣＴＧＡＣＣＣＣＴＧＣＣＣＡＡＡＧ
ＴＡＧＣ２、ＴＴＧＡＧＧＡＧＴＣＧＧＧＴＧＴＴＣＣ
ＴＧＧＴＣＡ／ＧＴＴＧＴＣＡＣＧＡＡ−ＴＣＣＡＧＴ
ＣＴＡＧＧＴＡＧ ３、　　　　ＡＧＡＧＣＣＣＴＣＣＴＣＴＧＡＴＧＣＧ
Ａ４、　　ＣＴ！、ＴＧＡＴＴＴＴＡＡＡＣＴＧＡＧＧ
ＣＴＧＧＣＴＧＴＡ５、　　ＧＡＣＴＧＴＴＣＴΩ胆Ａ
ＡＧＴＡＡＡＴＧ註二Σは野生型からの１換を示す。

／は欠失を示す。

変異の効果 １、　　Ａｓｎ　１１７　−＊　　Ｇｌｎ、　Ａｓｎ　
１８４　　→Ｇ１ｎ２、　　Ｍｅｔ　５２５からＰｒｏ
　５２７までの欠失３、　　Ｌｙｓ２７７　−”　　Ａ
ｒｇ４、　　Ｌｙｓ２７７　　→Ａｔｇ、　Ａｒｇ２７
５　　→Ｌｙｓ５、　　　八ｓｎ　　１７７　　　→　
　Ｇｌｎ、　　Ａｓｎ　　１８４　　　→　　Ｇｌｎ。

Ａｓｎ　４４８　−＝　　ＧＩｎ 配列決定プライマー ｌａ、　　　　　　八ＣＣＴＴＧＣＣＴＡＴＣＡＧＧＡ
ＴＣＡＴｌｂ、　　　　　　ＣＧＡＡＴＣＧＣＣＣＴＧ
ＧＣＡＧＧＣＧＴＣ２、ＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＡＧＡＡ
ＧＴＣＴＧＴ八３．４．　　　ＧＣＡＣＡＧＧＡＡＣＣ
へＣＴＣＴＣＣＧＧＧ５、　　　　　　　　ＴＣＧＡＴ
ＣＴＧＧＧＴＴＴＣＴＧＣＡＧＴＡＧＴＴＧＴＧＧＴＴ
Ｍ１３／　ｔｐａ組み換え体の変異形成は、精製した鋳
型を用い、適当なプライマーをアニーリングしそしてＴ
４ポリメラーゼのクレノー断片で伸長さ゛せることによ
り行った。変異体１は１両プライマー１ａおよび１ｂを
用いて変異処理−回の操作で得た。変異体４は、１２５
μｇ／−の遺伝子３２タンパク、および挿入体に隣接す
るＭ１３配列に結合するヘルパープライマーの存在下で
、変異体３に由来する鋳型を用いて得た。プライマー４
の効果（Ａｒｇ２７５　＝　Ｌｙｓ）とプライマー３の
効果（Ｌｙｓ　２７７　＝Ａｒｇ）を組み合わせること
により、上に示した２ケ所の変異部位を形成した。変異
体５は変異体１に由来する鋳型を用いて得た。プライマ
ー１ａと１ｂの効果（八ｓｎ　１１７　＝　Ｇｌｎ、　
Ａｓｎ　１８４−＊　Ｇｌｎ）をプライマー５の効果（
Ａｓｎ　４４８−”　Ｇｌｎ）と組み合わせて、上に示
した３ケ所の変異部位を形成した。

ＪＭＩＯＩ細胞へのトランスフェクション（Ｚｏｌｌｅ
ｒ　ａｎｄＳｍｉｔｈ、上記）に続き、プラークを２０
０−１０００プラーク／プレートの濃度に増殖させ、フ
ィルターに釣り上げ、適当な変異形成プライマーあるい
はプローブでハイブリダイゼーションにより選別した。

これらのプラークのうち１０から４０パーセントを。

推定上陽性の候補としてまず同定した。ファージのトン
ドブロットハイブリダイゼーションによる各実験から、
この推定物からおよそ６個を再選別することにより１強
い候補が得られた。これらのファージを低濃度で再度ブ
レーティングすることによりプラークを純化し、ニトロ
セルロースフィルターに移し、プライマーと再度ハイブ
リダイゼーションした。推定上陽性のクローンのＤＮＡ
配列を、適当なプライマーと鋳型調製物を用いて決定し
た。

変異形成座位と隣接区分（すなわち、少なくとも５０塩
基）をＤＮＡ配列分析により確認した直後。

複製型（ＲＦ）　　ＤＮＡをＳａｌ　ｌ制限エンドヌク
レアーゼで分解し、５ａｌｒで前もって分解してアルカ
リ性ホスファターゼ処理しだ哺乳類発現ベクターｐＳＶ
７ｄに挿入した。このベクターは、　ｔＰＡ　ｃＤＮＡ
発現用のＳＶ４０初期プロモーターとエンハンサ−、Ｓ
Ｖ４０ポリアデニル化部位、および」公細胞でベクター
に用いるためのＳＶ４０複製起点を供する。

プラスミドｐＳＶ７ｄを以下の様に構築した。ＳＶ４０
複製起点および初期プロモーターを含む４００ｂｐのＢ
ａｍ１ｌ　Ｔ　／　Ｈｉｎｄ　ｍ断片をｐＳＶｇｔ　Ｉ
　　（Ｍｕｌｌｉｇａｎ、　Ｒ。

ｅｔ　　ａｔ、、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏ
ｌ、　１　：　８５４−８６４　（１９８１））より切
出し、精製した。ＳＶ４０ポリＡ付加部位を含む２４０
ｂｐのＳＶ４０　Ｂｃｌ　Ｉ　／　Ｂａｍ）Ｉ　Ｉ断片
を、　ｐＳＶ２／ｄｈｆｒ　（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ　ｅ
ｔ　　ａｌ、＋　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ
。

１　：　５８４−８６４　（１９８１））より切出し、
精製した。これら断片を以下のリンカ−を介して融合し
た。

（以下余白） 停止コドン ５’　−ＡＧＣＴＡＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＧＴＣＴＡＧ
ＡＴＡＡＧＴＡＡＴ−３’ＴＣＴＡＧＡＧＧＧＣＣＣＡ
ＧＡＴＣＴＡＴＴＣＡＴＴＡＣＴＡＧＨｉｎｄｌｌＩ　
　Ｂｇｌ　ＩＩ　Ｓｍａ　Ｉ　Ｘｂａ　Ｉ　　　　Ｂｃ
ｌ　Ｉ　　突出このリンカ−は３つのすべての読み取り
枠中の停止コドンと同様に、５個の制限部位を含む。Ｓ
Ｖ４０複製起点、　ＳＶ４０初期プロモーター、停止コ
ドン付きポリリンカーおよびＳＶ４０ポリアデニル化部
位を含む生じた６７０ｂｐの断片を、およそ１．５ｋｂ
の欠失のあるｐＢＲ３２２誘導体であるｐＭＬの（Ｌｕ
ｓｋｙ　ａｎｄ　Ｂｏｔｃｈａｎ。

並置　四：　３９１　（１９８４）　’）の勿Ｉ１１部
位にクローン化し、　ｐＳＶ６を得た。　ｐＳＶ６（７
）　ｐＭＬ配列中（７）　ＥｃｏＲ１部位とＥｃｏＲＶ
部位を、　　ＥｃｏＲＩとＥｃｏＲＶでの分解により除
去し、各末端の約２００ｂｐを除くために±３１ヌクレ
アーゼで処理し、そして最終的に再連結してｐＳＶ？ａ
を得た。」旦３１による切除も、　　ＥｃｏＲＶ部位よ
りおよそ２００ｂｐ離れた。　５Ｖ４０６Ｊｆ域の周辺
にある１つのＢａｍＨＩ制限部位を除去した。ＳＶ４０
領域にある第２のＢａｍＨｒ部位を除去するため、　　
ｐＳＶ７ａを、複製起点から上流のｐＭＬ配列中で切断
する」皿で分解した。これを、平滑末端連結により再環
化し、　ｐＳＶ７ｂを得た。

ｐＳＶ７ｃとｐＳＶ７ｄは連続したポリリンカー置換を
示す。初めに、　　ｐＳＶ７ｂを５ｔｕｌとＸｂａ　Ｉ
で分解した。それから１次のリンカ−をベクターに連結
し。

ｐＳＶ７Ｃを得た。

［１ｇ１ｌＩ　ＥｃｏＲＩ　　ＳｍａＩ　　ＫｐｎＩ　
ＸｂａＩ５’　−ＡＧＡＴＣＴＣＧＡＡＴＴＣＣＣＣＧ
ＧＧＧＧＴＡＣＣＴＴＣＴＡＧＡＧＣＴＴＡＡＧＧＧＧ
ＣＣＣＣＣＡＴＧＧＡＧＡＴＣその後、　　ｐＳＶ７ｃ
をＪＬＬＩＩとＸｂａ　Ｉで分解し、それから次のリン
カ−と連結しｐＳＶ７ｄを得た。

Ｂｇｌｌｌ　ＥｃｏＲＩ　　Ｓｍａｌ　Ｘｂａｌ　　Ｂ
ａｍＨＩ　５ａｉ１５’　−ＧＡＴＣＴＣＧＡＡＴＴＣ
ＣＣＣＧＧＧＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＡ
ＧＣＴＴＡＡＧＧＧＧＣＣＣＡＧＡＴＣＴＣＣＴＡＧＧ
ＣＡＣＧＴＧＧＡＴＣベクター内でのクローン化断片の
適切な方向を制限部位解析で引き出した。変異を、」旦
ＩとＥｃｏＲに対する制限解析により、また変異座位に
対し高度に特異的な適切なプローブを用いたそのような
断片のサザンブロツティングにより再確認した。

■金丈変異体 次の４つの組合せ変異体を組み換えＤＮＡ技術を用いて
構築した：変異１および２の両方を含む変異体６．変異
１および３の両方を含む変異体７゜変異２および３の両
方を含む変異体８．および３つの変異１，２および３を
すべて含む変異体９゜変異の各々は便利な制限エンドヌ
クレアーゼ部位により分離されており、これにより、以
前に単離した変異体１．２および３の断片由来の所望の
変異の会合が促進された。各変異体の構築に用いた特異
的な戦略を以下で述べる。

大規模なプラスミド調製を、記載の変異体構築のすべて
に対して行った。そのＤＮＡを組織培養細胞へのトラン
スフェクションに用いた。

変異体ｉ 変異体１の１．７２キロ塩基（ｋｂ）の」憇ＩＩ　Ｉか
らＩ　　ＢｓｔＥＩＩまでの断片は、変異させた部位Ａ
ｓｎ　１１７−＋ＧｌｎとＡｓｎ　１８４−ｅ　Ｇｌｎ
の両方を含む。

この断片を、　ＭｅｔｓｚｓからＰｒｏ、□７までの欠
失の所望変異を含む変異体２の３．３８ｋｂのＢａｍＨ
Ｉから」旦ＥＵまでの断片に連結した。この連結混合液
を、コンピテントなエセリシア・コリを形質転換するの
に用いた。生じたアンピシリン耐性コロニーのいくつか
を増殖させ、そのＤＮＡを、サイズにより、また各変異
領域に特異的な３２Ｐ末端標識化オリゴヌクレオチドプ
ローブによるＤＮＡのサザンプロットのＤＮＡハイブリ
ダイゼーション解析により選別した。このようなりロー
ンは、もし２つの個々の変異体１の領域のオリゴヌクレ
オチドの各々、および変異体２特異的プローブにハイブ
リダイズするならば、陽性として記録した。この選別法
を、各新しい構築に対し適切なオリゴヌクレオチドプロ
ーブの置換により、各々の構築物について用いた。

使用した特異的オリゴヌクレオチドは以前に挙げた。

−・　７　　（１＆３） 変異させた部位を両方含む変異体１の２．９５ｋｂ　Ｓ
ｅａ　１断片を、ｌｙｓ　ｔｒｒ　−Ａｒｇの変換を含
む変異体３の２．１５ｋｂ　Ｓｃａ　ｌ断片に連結した
。新構築の選別を。

変異体３の変化および変異体ｌの変換の各々に特異的な
オリゴヌクレオチドを用いて行った。

・　　８２＆３） 所望の変換を含む変異体２の３．３８ｋｂのＢａｍＨＩ
から」旦Ｅ■までの断片をｒ　Ｌｙｓ　２？？　＝　Ａ
ｒｇ変異を含む変異体３の１．７２ｋｂの勿ＩＩ　Ｉか
ら」旦ＥＩ［までの断片に連結した。正しい組み換え体
の選別を、各変異に特異的なオリゴヌクレオチドを用い
て行った。

Ｆ　　　９　（１＆２＆３） 三重変異体の形成戦略として、新しく構築した二重変異
体の１つである変異体７を使用した。このプラスミドを
ＢａｍＨＩξＢｓｔＥＩＩで開裂し１両変異体を含む１
．７２ｋｂの断片を単離した。変異体２からのプラスミ
ドＤＮＡを同じ制限酵素で分解し、　３．３８ｋｂの細
片（変異を含む）を単離した。

これら２つの断片を連結し、この連結混合液を用いてコ
ンピテントなエセリシア・コリを形質転換した。正確な
三重変異体の選別は、　　ＤＮＡ中の各変異部位に特異
的なオリゴヌクレオチドを用いて。

上記の様に行った。

細胞のトランスフェクション ＣＯ５−７細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ、　　Ｃｅ旦（１９８
１）　２３　：　１７５）を、　Ｇｒａｈａｍ　ａｎｄ
　ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ＋　　７　（１９７３）５２　
：　４５６−４６７で述べられている手順を一部変更し
て用いて、　ｐＳＶ７ｄ　ｔＰＡ発現プラスミドでトラ
ンスフェクションした。サンプルを２通りでディシュシ
に加え、二酸化炭素恒温器（３７℃）中、６時間。

細胞上に固定させた。６時間後２上澄液を吸引シ。

細胞をＣａとＭｇのないリン酸緩衝生理食塩水（１’Ｂ
Ｓ−ＣＭＦ）で穏やかにゆすぎ、そして３．５−４分間
、アジュバントとしての１５％グリセロールにディツシ
ュをさらした。ゆすいで、４．５■／ｒＲ１グルコース
。

３．７ｍｇ／ｍｆｆ１　ＮａｚＣＯｚ　、　　２９２μ
ｇ／−グルタミン。

１１０μｇ１ｍｌピルビン酸ナトリウム、　１００Ｕ／
−ペニシリン、　１００Ｕ／−ストレプトマイシン、お
よび１０％胎児ウシ血清（ＦＣＳ）を添加したＤＭＥＭ
培地を供給した後、培地を胎児ウシ血清を欠く培地と置
き換えた。血清を除去して１２時間後、下で述べるカゼ
イン−プラスミノーゲン−寒天重層を用いて。

細胞をｔＰＡの発現について分析した。最大発現は。

トランスフェクション開始後３６と４８時間の間で観察
された。

Ｃｌｌ０　ｄｈｆｒ−細胞（Ｕｒｌａｕｂ　ａｎｄ　Ｃ
ｈａｓｉｎ、　Ｐｒｏｃ、・Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　（１９８０）　７７　
：　４２１６　）を、栄養培地（１，１８ｗ／ｄ　Ｎａ
ｚＣＯ＊　、　　２９２μｇ　／ｍｌグルタミン、１１
０μｇ／−ピルビン酸ナトリウム、　１００Ｕ／−ペニ
シリン、　１０００／−ストブトマイシン、１５０μｇ
／−プロリンおよび１０％ＦＣ３を添加したＦ１２）中
でトランスフェクションする前日に、　１０ｃｍディシ
ュあたり５Ｘ１０’から１０６の細胞の濃度で塗布した
。上で述べたトランスフェクション手順を。

ｔＰＡ発現プラスミドをアデノウィルス主要後期プロモ
ーターにより働（ｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして
持つプラスミドと混ぜたという一部の変更を加えて用い
、リン酸カルシウムでプラスミドを共沈澱させた。ｄｈ
ｆｒ遺伝子を持つプラスミドは。

アデノウィルス−２由来の主要後期プロモーター（Ａｄ
−ＮＬＰ、地図単位１６−１７．３）をマウスの用几ｃ
ＤＮへの５゛末端に融合させることにより構築した。Ｓ
Ｖ４０初期領域ポリアデニル化部位とＳＶ４０小を抗原
に対す、るイントロンをコードしているＤＮＡをｐＳＶ
２−ｎｅｏ　　　　（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　　ａｎｄ　　
Ｂｅｒｇ、　　　　Ｊ、　　　Ｍｏ１．　　Ａ　　　１
．　　　Ｇｅｎｅｔ。

（１９８２）　１　：　３２７−３４１　’）より得、
　ｄｈｆｒ　ｃＤＮＡの３゛末端に融合した。これらの
３つの区分をｐＢＲ３２２にサブクローン化し、プラス
ミドＡｄ　−ｄｈｆｒを得た。

ＤＮＡを細胞に添加後４８時間、細胞を選択培地（上記
のようにプロリンと胎児ウシ血清を添加した。

あるいは透析した胎児ウシ血清を添加したＤＭＥＭｔ音
地）に１：２０となるように分配した。選択培地で１−
２週間増殖後、コロニーが現れ、カゼイン−プラスミノ
ーゲン−寒天重層分析によりｔＰＡ生産を検定し、また
カゼイン−プラスミノーゲンプレートで定量分析した。

各変異体の細胞系を、　　２００ｃｆｆｌデイシユ中で
融合するまで増殖させ、無血清培地（ＤＭＥＭ）中で２
４時間の間保温し、そして上澄液を以下で述べるように
処理して、プラスミノーゲンアクチベーター活性を有す
るポリペプチドを精製した。

次の手順は、上で述べた６つのポリペプチドの活性を決
定するために用いた。

変異タンパクの比活性を決定するためには、サンプルの
抗原濃度を定量することが必須だった。

ポリクローナル抗体を用いるＥＴＡ−キット（Ａｍｅｒ
ｉｃａｎＤｉａｇｎｏｓｔｉｃａ、　Ｉｎｃ、＋　Ｇｒ
ｅｅｎｗｉｃｈ、　ＣＴ）を用いた。

検査は、キットに供されているプロトコール中に述べら
れている条件下で厳密に行い、各サンプルの５希釈物を
分析した。結果は、少なくとも３つの測定できる希釈物
の平均として表した。

すべての細胞培養上澄液を０、Ｃ１％Ｔｗｅｅｎ　８０
Ｔ１″と０、Ｃ１％Ｎａ−アジドにした。次いで上澄液
（５０ｍ１．）を、３−のＨｅｐａｒｉｎ−Ｓｅｐｈａ
ｒｏｓｅ＠の存在下で室温。

３０分間、保温した。Ｈｅ　ｐ　ａ　ｒ　ｉ　ｎ　−Ｓ
　ｅ　ｐ　ｈ　ａ　ｒ　ｏ　ｓ　ｅ　′Ｍ、濁液をカラ
ムに充填し、　　０．１Ｍリン酸塩、　０、Ｃ１％Ｔｅ
ｖｅｅｎ８０ＴＨを含む緩衝液（ｐＨ７，５）　２０ａ
ｄ！でよく洗浄した。

最終的には、　　ｔＰＡ活性は、　０、Ｃ５Ｍ　　Ｉ−
リス−１１ＣＩ　。

Ｉ　Ｍ　ＫＳＣＮおよび０、Ｃ１％Ｔｗｅｅｎ　８０”
を含む緩衝液（ｐｉｌ　７．５）で溶出した。次いで溶
出物を、　０、Ｃ１％Ｔｗｅｅｎ８０”、！＝０、Ｃ１
％Ｎａ−７ジドを含むリン酸緩衝液（０，０５門、　ｐ
Ｈ７，５＞　　５Ｌに対して４℃、１６時間透析した。

ｔＰＡサンプルを１ｄずつ一２５℃で凍結した。

°血？ｈ″　査（ｃＬＴ） 凝血溶解検査を、凝固時間の代わりに溶解時間を記録す
るために一部変更されている“にＣ１０−Ｋｏａｇｕｌ
ｏ−ｍｅｔｅｒ　”　（Ａｍｅｌｕｎｇ、　ＦＲＧ）を
用いて行った。

すべての試薬を３７℃で予備保温した。ｔＰＡ標品。

ポリペプチド検査サンプルおよびフィブリノーゲンを、
１％ＨａｅｍａｃｃｅｌＴＭ（ｐＨ７，４）を含むリン
酸緩衝液（０，６７Ｍ　）中で必要とする濃度にまで希
釈した。　ｔＰＡ標品あるいはサンプルの０．２−を、
０．２−のヒトプラスミノーゲン（ＩＯＣＴＡ／、ｗＪ
）　、　０．５＋ｄのウシフィブリノーゲン（０，１５
％）および最終的に０．１ｄのトロンビン（１０１０／
ｄ）と混合した。

溶解時間を記録し、検量曲線を用いてｔＰＡ単位で表し
た。各変異タンパクの活性を少なくとも３回分析し、平
均を計算した。分析すべきサンプルの各々についてｔＰ
Ａの標品の４種の希釈を行った。

プラスミノ−゛ン沖７ 変異タンパクのプラスミノーゲン溶解活性を。

Ｒａｎｂｙ　ｅｔ旦、＋Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｒｅｓ、　（
１９８２）２７　：　７４３−７４９で述べられている
放物線検定を用いて分析した。

全試薬を３７℃で予備保温した。ｔＰＡ標品あるいはｔ
ＰＡサンプ／Ｉ／（７）　０．１−を、　　０．５ｍ１
Ｏ：Ｊ緩衝液（ｏ、１％Ｔｗｅｅｎ　８０”と０、Ｃ１
％Ｎａ−アジドを含む０．１Ｍトリス−１１ＣＬ、　ｐ
Ｈ７，５）、　　０．１−の基１１（Ｓ　２２５１（Ｉ
ｒ−Ｄ−Ｖａｌ−［、ｅｕ−Ｌｙｓ−（バラ−ニトロア
ニリド）　（Ｋａｂｉ　ＡＢ、　Ｓｗｅｄｅｎ））。

３ｍＭ）、　０．１−のヒトプラスミノーゲン（ＩＣＴ
Ａ／ｍｌ）および０．１１ｎ１のフィブリン分解産物（
１０■／−）と混合した。最終的には、混合液を３７℃
、４５分間保温した。反応は０．１−の酢酸（５０％）
を加えて停止させ、光学濃度を４０５ｒ＋ｍで読んだ。

得られた検量曲線を用いてサンプルの光学濃度を単位に
変換した。結果は、少なくとも５個の測定可能な希釈物
の平均で表した。

さらに、同様の検査をフィブリン分解産物（ＦＤＰ）の
不在下で行った。この場合、　　０．５１ｎ１の代わり
に０．６艷の緩衝液が必要であった。

ゞ　のフィブリン ｔＰＡおよび変異ポリペプチドがプラスミノーゲンをプ
ラスミンに活性化する能力に対する補因子（フィブリン
あるいはフィブリン分解産物（ＦＤＰ）の影響を、凝血
溶解検査あるいはフィブリン依存性プラスミノーゲン溶
解検定で得た活性と、フィブリン非依存性プラスミノー
ゲン溶解検定で決定した活性との比で表した。

フィブリン裸　のライブ１ンーアフイニテイー量ヒトの
フィブリノーゲン（０，３％）　　０．２＋ｄ！ｉｔを
プラスチック管に入れ、　　０、Ｃ０５−のウシのトロ
ンビン（５００ＩＵ／ｍｆｆ１）と混合した。混合液を
３７℃で３０分間静置させた。反応終了後、凝血を注意
深く除去し、抗トロンビンＩＩＩ　（３ＩＵ／ｍｆｆ１
）とヘパリン（４０ｒＵ／ｍｆ）を含む２−の緩衝液（
０，１Ｍ１−リス−Ｆ［Ｃ１゜ｐＨ８，０）中で３７℃
、３０分間保温した。最終的に。

凝血を除去し、５０−の緩衝液（０，０５Ｍ　）リス−
ＨＣｌ　。

０、ＩＭ　ＮａＣ１，ｐＨ７，５）に対して２０分間、
２回透析した。使用前に、凝血をまわりの溶液より除い
た。

検査玉皿 すべてのサンプルをまず、０．１％Ｔｗｅｅｎ８０ＴＭ
を含むトリス緩衝液（０，１Ｍ、　ｐＨ７，５）に２０
０ｎｇ／−となるように希釈した。その後サンプルを、
５％ヒトアルブミンを含む同じ緩衝液に最終濃度１１０
０ｎ／ｍｌとなるように希釈した。続いて０．４−のサ
ンプルをフィブリン凝血存在下、室温にて１０分間保温
した。最後に溶液を除き、流体相中の抗原濃度をＥＩＡ
で決定した。この実験を各サンプルにつき２回行った。

ｌ１捜査 サンプルを、０．１％Ｔ賀ｅｅｎ８０”を含むトリス緩
衝液（０，１Ｍ、　ｐ＋＋　７．５）に最終濃度１１０
０ｎ／−になるように希釈した。

次いで０．２−量を、６５ウロキナ一ゼ阻害単位／−の
濃度でプラスミノーゲンアクチベーター阻害剤を含む溶
液０．２−と混合した。対照実験では。

上で述べたポリペプチドのサンプルを０．２−の緩衝液
（１００％）と混合した。混合液を１０分間、３７℃で
保温した。保温時間終了時点でサンプルを素早く希釈し
、残存活性をフィブリン依存性プラスミノーゲン溶解検
定で分析した。この阻害検査は各サンプルにつき２回行
った。■害悪受性を阻害されている％活性として表した
。

プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤をヒトの胎盤よ
り精製した。阻害画分は、いかなるタンパク分解活性も
、またプラスミン、トロンビンもしくはトリプシンの阻
害活性も含まない。

変異タンパクの上記検定による値を表■にまとめて示す
。

（以下余白） （１）凝血溶解検査 （３）フィブリン依存性プラスミノーゲン溶解検定（４
）フィブリン非依存性プラスミノーゲン溶解検定 上の結果より、野生型ｔＰＡアミノ酸配列配列化を生じ
ることにより実質的な利点を達し得ることが、明白であ
る。従って、活性を増加させることができるだけでなく
、同時にプラスミノーゲンアクチベーター阻害剤に対す
る感受性を低下させることができ、これにより効果的な
活性について全体として非常に実質的な増加が４ｙｅｙ
’ｆで達成できる。また酵素は、増強されたフィブリン
依存性を供するという点において実質的により特異的に
することができ、従って凝血の不在下ではそれは実質的
に低下した活性を有する。よって、タンパク（あるいは
酵素）の血流中のレベルを最小にし、またｔＰＡの望ま
しくない副作用を実質的に減らすために、プラスミノー
ゲンアクチベーター活性を持つこれらのポリペプチドは
より小量で投与でき、しかも凝血に対し増加した活性を
供する。

前述の本発明を、理解を明確にするために３図解と実施
例により幾分詳細に述べるが、ある程度の変化や一部変
更は、添付の特許請求の範囲内で行われ得ることは明白
であろう。

′　　　との　　　　・ 本出願は我々の出願第８１２，８７９号（出願臼１９８
５年１２月２３日）のＣＩＰ出願であり、その明細書の
すべてを参考としてこの中に編入する。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、凝血を溶解することにおける組織プラスミノーゲン
   アクチベーター活性を持つポリペプチドであって、天然
   の組織プラスミノーゲンアクチベーターの比活性の少な
   くとも０．３の比活性を有し、また組織プラスミノーゲ
   ンアクチベーター活性を持つ天然に生じるポリペプチド
   中のグリコシル化部位の数を減らすこと、Ｃ末端で少な
   くとも３個のアミノ酸を欠失させること、または開裂部
   位のアミノ酸を置換することの結果として、比活性、活
   性のフィブリン依存性、または阻害剤感受性に関して少
   なくとも１つの改良された性質を持つポリペプチド。 ２、前記天然に生じるポリペプチドがヒトの組織プラス
   ミノーゲンアクチベーターである特許請求の範囲第１項
   に記載のポリペプチド。 ３、Ａｓｎ−Ｘ−ＴｈｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒで表
   される少なくとも１ヶ所のグリコシル化部位に少なくと
   も１個のアミノ酸の置換を持つ特許請求の範囲第１項に
   記載のポリペプチド。 ４、アミノ酸１１７−１１９、１８４−１８６および４
   ４８−４５０のグリコシル化部位の少なくとも１ケ所で
   Ａｓｎが置換されている特許請求の範囲第３項に記載の
   ポリペプチド。 ５、アミノ酸１１７−１１９、１８４−１８６および４
   ４８−４５０のグリコシル化部位の少なくとも１ヶ所で
   ＡｓｎがＧｌｎに置換されている特許請求の範囲第３項
   に記載のポリペプチド。 ６、少なくとも２ヶ所のグリコシル化部位でＡｓｎがＧ
   ｌｎに置換され、またＭｅｔ５２５からＰｒｏ５２７ま
   での配列を欠いている特許請求の範囲第５項に記載のポ
   リペプチド。 ７、少なくとも２ヶ所のグリコシル化部位でＡｓｎがＧ
   ｌｎに置換され、またＬｙｓ２２７がＡｒｇに置換され
   ている特許請求の範囲第５項に記載のポリペプチド。 ８、Ｓｅｒ１１９、Ｓｅｒ１８６およびＳｅｒ４５０の
   うち少なくとも１ヶ所で非保存的置換を持つ特許請求の
   範囲第３項に記載のポリペプチド。 ９、Ｓｅｒ１１９、Ｓｅｒ１８６またはＳｅｒ４５０の
   Ｇｌｙ、ＡｌａまたはＶａｌによる置換を少なくとも１
   個持つ特許請求の範囲第８項に記載のポリペプチド。 １０、２７２から２８０までの領域の開裂部位に１個ま
   たはそれ以上の置換を持つ特許請求の範囲第１項に記載
   のポリペプチド。 １１、２７４から２７７までの領域の開裂部位に１個ま
   たはそれ以上の置換を持つ特許請求の範囲第１０項に記
   載のポリペプチド。 １２、Ｌｙｓ２７７の置換を持つ特許請求の範囲第１１
   項に記載のポリペプチド。 １３、Ｌｙｓ２７７のＡｒｇによる置換を持つ特許請求
   の範囲第１２項に記載のポリペプチド。 １４、Ｍｅｔ５２５からＰｒｏ５２７までの配列を欠く
   特許請求の範囲第１項に記載のポリペプチド。 １５、５個以下のアミノ酸がＮ末端から欠失している特
   許請求の範囲第１項に記載のポリペプチド。 １６、５個以下のアミノ酸がＮ末端から欠失している特
   許請求の範囲第２項−第１３項のいずれかに記載のポリ
   ペプチド。 １７、２５個までのアミノ酸がＣ末端から欠失している
   特許請求の範囲第１項−第１４項のいずれかに記載のポ
   リペプチド。 １８、組織プラスミノーゲン活性を持つポリペプチドで
   あって、ヒトの組織プラスミノーゲンアクチベーターに
   由来し、そしてアミノ酸位置１１７、１８４および４４
   ８のうち少なくとも２ヶ所でＡｓｎのＧｌｎによる置換
   を持つポリペプチド。 １９、組織プラスミノーゲン活性を持つポリペプチドで
   あって、ヒトの組織プラスミノーゲンアクチベーターに
   由来し、そしてＭｅｔ５２５からＰｒｏ５２７までを欠
   いているポリペプチド。 ２０、組織プラスミノーゲン活性を持つポリペプチドで
   あって、ヒトの組織プラスミノーゲンアクチベーターに
   由来し、そしてＬｙｓ２７７がＡｒｇに置換されている
   ポリペプチド。 ２１、ヒトの組織プラスミノーゲンアクチベーターに由
   来し組織プラスミノーゲン活性を持つポリペプチドであ
   って、アミノ酸１１７、１８４および４４８の少なくと
   も１ヶ所のグリコシル化部位でＡｓｎがＧｌｎに置換さ
   れており、Ｍｅｔ５２５からＰｒｏ５２７までの配列を
   欠いているポリペプチド。 ２２、ヒトの組織プラスミノーゲンアクチベーターに由
   来し組織プラスミノーゲン活性を持つポリペプチドであ
   って、アミノ酸１１７、１８４および４４８の少なくと
   も１ヶ所のグリコシル化部位でＡｓｎがＧｌｎに置換さ
   れており、Ｌｓｙ２７７がＡｒｇに置換されているポリ
   ペプチド。 ２３、凝血を溶解することにおける組織プラスミノーゲ
   ンアクチベーター活性を持つポリペプチドを凝血を溶解
   するに充分な量含みまた生理学的に受容可能なキャリア
   を含む薬剤組成物であって、該ポリペプチドが天然の組
   織プラスミノーゲンアクチベーターの比活性の少なくと
   も０．３の比活性を有し、また組織プラスミノーゲンア
   クチベーター活性を持つ天然に生じるポリペプチド中の
   グリコシル化部位の数を減らすこと、Ｃ末端で少なくと
   も３個のアミノ酸を欠失させること、または開裂部位の
   アミノ酸を置換することの結果として、比活性、活性の
   フィブリン依存性、または阻害剤感受性に関して少なく
   とも１つの改良された性質を持つポリペプチドである薬
   剤組成物。 ２４、ヒトの組織プラスミノーゲンアクチベーターに由
   来し組織プラスミノーゲン活性を持つポリペプチドをコ
   ードするＤＮＡ配列であって、該ポリペプチドが以下の
   うちの少なくとも１つを持つという点でヒトの組織プラ
   スミノーゲンアクチベーターと異なるＤＮＡ配列：（ａ
   ）１１７−１１９、１８４−１８６および４４８−４５
   ０のグリコシル化部位の少なくとも２ヶ所の障害；（ｂ
   ）Ｃ末端での少なくとも３個のアミノ酸の欠失；および
   （ｃ）ヒトの組織プラスミノーゲンアクチベーターの開
   裂部位のアミノ酸の置換。 ２５、前記グリコシル化部位に前記少なくとも２ヶ所の
   障害を持つ特許請求の範囲第２４項に記載のＤＮＡ配列
   。 ２６、Ｃ末端に少なくとも３個のアミノ酸の欠失を持つ
   特許請求の範囲第２４項に記載のＤＨＡ配列。 ２７、アミノ酸１１７、１８４および４４８の少なくと
   も２ヶ所のグリコシル化部位でＡｓｎがＧｌｎに置換さ
   れており、Ｍｅｔ５２５からＰｒｏ５２７までの配列を
   欠いている特許請求の範囲第２４項に記載のＤＮＡ配列
   。 ２８、アミノ酸１１７、１８４および４４８のグリコシ
   ル化部位の少なくとも２ヶ所でＡｓｎがＧｌｎに置換さ
   れており、またＬｙｓ２７７がＡｒｇに置換されている
   特許請求の範囲第２４項に記載のＤＮＡ配列。 ２９、ヒトの組織プラスミノーゲンアクチベーターの開
   裂部位にアミノ酸の置換を持つ特許請求の範囲第２４項
   に記載のＤＮＡ配列。 ３０、転写の順に、転写と翻訳の開始領域、該開始領域
   の転写と翻訳の制御調節下にあるＤＮＡ配列、および転
   写と翻訳の終結領域を含有する発現構築物であって、該
   ＤＮＡ配列がヒトの組織プラスミノーゲンアクチベータ
   ーに由来し組織プラスミノーゲン活性を持つポリペプチ
   ドをコードするＤＮＡ配列であって、該ポリペプチドが
   （ａ）１１７−１１９、１８４−１８６および４４８−
   ４５０のグリコシル化部位の少なくとも２ヶ所の障害、
   （ｂ）Ｃ末端での少なくとも３個のアミノ酸の欠失、お
   よび（ｃ）ヒトの組織プラスミノーゲンアクチベーター
   の開裂部位のアミノ酸の置換のうちの少なくとも１つを
   持つという点でヒトの組織プラスミノーゲンアクチベー
   ターと異なるポリペプチドである発現構築物。 ３１、前記転写と翻訳の発現領域が真核生物で機能的で
   ある特許請求の範囲第３０項に記載の発現構築物。 ３２、前記真核生物が哺乳類である特許請求の範囲第３
   １項に記載の発現構築物。 ３３、宿主中で機能的な複製系および発現構築物を含有
   するプラスミドであって、該発現構築物が、転写の順に
   、転写と翻訳の開始領域、該開始領域の転写と翻訳の制
   御調節下にあるＤＮＡ配列、および転写と翻訳の終結領
   域を含有する発現構築物であって、該ＤＮＡ配列がヒト
   の組織プラスミノーゲンアクチベーターに由来し組織プ
   ラスミノーゲン活性を持つポリペプチドをコードするＤ
   ＮＡ配列であって、該ポリペプチドが（ａ）１１７−１
   １９、１８４−１８６および４４８−４５０のグリコシ
   ル化部位の少なくとも２ヶ所の障害、（ｂ）Ｃ末端での
   少なくとも３個のアミノ酸の欠失、および（ｃ）ヒトの
   組織プラスミノーゲンアクチベーターの開裂部位のアミ
   ノ酸の置換のうちの少なくとも１つを持つという点でヒ
   トの組織プラスミノーゲンアクチベーターと異なるポリ
   ペプチドであるプラスミド。 ３４、真核生物宿主中で複製可能な特許請求の範囲第３
   ３項に記載のプラスミド。 ３５、前記真核生物宿主が哺乳類である特許請求の範囲
   第３４項に記載のプラスミド。 ３６、ヒトの組織プラスミノーゲンアクチベーターに由
   来し組織プラスミノーゲン活性を持つポリペプチドであ
   って、Ｌｙｓ２７７がＡｒｇに置換されており、またＭ
   ｅｔ５２５からＰｒｏ５２７までを欠いているポリペプ
   チド。 ３７、ヒトの組織プラスミノーゲンアクチベーターに由
   来し組織プラスミノーゲン活性を持つポリペプチドであ
   って、アミノ酸位置１１７、１８４および４４８の少な
   くとも２ヶ所においてＡｓｎがＧｌｎに置換されており
   、Ｌｙｓ２７７がＡｒｇに置換されており、またＭｅｔ
   ５２５からＰｒｏ５２７までを欠いているポリペプチド
   。 ３８、プラスミドを含む生育可能な細胞であって、該プ
   ラスミドが宿主中で機能的な複製系および発現構築物を
   含有するプラスミドであって、該発現構築物が、転写の
   順に、転写と翻訳の開始領域、該開始領域の転写と翻訳
   の制御調節下にあるＤＮＡ配列、および転写と翻訳の終
   結領域を含有する発現構築物であって、該ＤＮＡ配列が
   ヒトの組織プラスミノーゲンアクチベーターに由来し組
   織プラスミノーゲン活性を持つポリペプチドをコードす
   るＤＮＡ配列であって、該ポリペプチドが（ａ）１１７
   −１１９、１８４−１８６および４４８−４５０のグリ
   コシル化部位の少なくとも２ヶ所の障害、（ｂ）Ｃ末端
   での少なくとも３個のアミノ酸の欠失、および（ｃ）ヒ
   トの組織プラスミノーゲンアクチベーターの開裂部位の
   アミノ酸の置換のうちの少なくとも１つを持つという点
   でヒトの組織プラスミノーゲンアクチベーターと異なる
   ポリペプチドである細胞。 ３９、前記細胞が真核生物のものである特許請求の範囲
   第３８項に記載の細胞。 ４０、前記真核細胞が哺乳類の細胞である特許請求の範
   囲第３９項に記載の細胞。 ４１、ＤＮＡ配列を作成するための方法であって、該Ｄ
   ＮＡ配列がヒトの組織プラスミノーゲンアクチベーター
   に由来し組織プラスミノーゲン活性を持つポリペプチド
   をコードするＤＮＡ配列であり、該ポリペプチドが（ａ
   ）１１７−１１９、１８４−１８６および４４８−４５
   ０のグリコシル化部位の少なくとも２ヶ所の障害、（ｂ
   ）Ｃ末端での少なくとも３個のアミノ酸の欠失、および
   （ｃ）ヒトの組織プラスミノーゲンアクチベーターの開
   裂部位のアミノ酸の置換のうちの少なくとも１つを持つ
   という点でヒトの組織プラスミノーゲンアクチベーター
   と異なるポリペプチドであるＤＮＡ配列を作成する方法
   であって、以下の工程： （１）組織プラスミノーゲンアクチベーター活性を持つ
   天然に生じるポリペプチドをコードする鋳型を含有する
   原核生物プラスミドの一本鎖に、１１７−１１９、１８
   ４−１８６および４４８−４５０のアミノ酸をコードす
   るグリコシル化部位の少なくとも２ヶ所のグリコシル化
   部位での障害、Ｃ末端での少なくとも３個のアミノ酸の
   欠失、または開裂部位のアミノ酸の置換を生じるミスマ
   ッチをもつオリゴデオキシヌクレオチドをアニーリング
   させて、部分的な二本鎖プラスミドを供する工程であっ
   て、 ここで、該オリゴデオキシヌクレオチドが、標的鋳型に
   関して８５から９０％の相補性を有すること、ミスマッ
   チされる座位の反対側の相補性領域の融点がほぼ等しい
   こと、そして前記変異形成座位以外の前記プラスミドの
   どの部位でも７０％より低い相補性を持つことにより特
   徴づけられる工程；（２）修正能力を欠く　ＤＮＡポリ
   メラーゼにより該オリゴデオキシヌクレオチドを伸長し
   て、二本鎖プラスミドを供する工程； （３）該二本鎖プラスミドにより宿主の原核生物細胞を
   形質転換し、該細胞を増殖させることにより該二本鎖プ
   ラスミドを複製させる工程；および（４）該オリゴデオ
   キシヌクレオチドの配列を持つプラスミドを単離する工
   程、 を包含する方法。 ４２、ヒトの組織プラスミノーゲンアクチベーターと実
   質的に同じアミノ酸配列を持つポリペプチドであって、
   次の生理学的性質の少なくとも１つを持つポリペプチド
   ：天然に生じるヒトの組織プラスミノーゲンアクチベー
   ターと比較して、６．２から７．０の範囲の比活性；１
   ．３から２．５の範囲のフィブリン依存性；およびプラ
   スミノーゲンアクチベーター阻害剤の阻害に対し１０か
   ら３０％の範囲で低下した感受性。 ４３、６．２から７．０の範囲の比活性を持つ特許請求
   の範囲第４２項に記載のポリペプチド。 ４４、約１．３から２．５のフィブリン依存性を持つ特
   許請求の範囲第４２項に記載のポリペプチド。