JPS62253380A - 新規ペプチドのプラスミノ−ゲンアクチベ−タ− - Google Patents
新規ペプチドのプラスミノ−ゲンアクチベ−タ−Info
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- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6456—Plasminogen activators
- C12N9/6459—Plasminogen activators t-plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
(産業上の利用分野)
本発明は1組織プラスミノーゲンアクチベーター活性を
持ち、遺伝子工学の技法により天然のプラスミノーゲン
アクチベーターに比べ改良された性質を有するポリペプ
チド、それをコードするDNA配列およびその作成法に
関する。また本発明は。
持ち、遺伝子工学の技法により天然のプラスミノーゲン
アクチベーターに比べ改良された性質を有するポリペプ
チド、それをコードするDNA配列およびその作成法に
関する。また本発明は。
上記DNA配列を含有する発現構築物、それを含有する
プラスミド、および該プラスミドを保持する細胞に関す
る。さらにまた本発明は、上記ポリペプチドを含む製剤
組成物に関する。
プラスミド、および該プラスミドを保持する細胞に関す
る。さらにまた本発明は、上記ポリペプチドを含む製剤
組成物に関する。
(従来技術)
組織プラスミノーゲンアクチベーター(tPA)は。
凝血の溶解に関連のあるセリンプロテアーゼである。こ
の分子は、他の天然に生じるポリペプチドと相同なアミ
ノ酸配列を示すいくつかの明確な領域を有する。N末端
の最初の領域は、フィブロネクチンと相同性のある領域
である。次の領域は。
の分子は、他の天然に生じるポリペプチドと相同なアミ
ノ酸配列を示すいくつかの明確な領域を有する。N末端
の最初の領域は、フィブロネクチンと相同性のある領域
である。次の領域は。
種々の成長因子と相同性を持つ。この成長因子領域につ
づいて2つのクリングル領域がある。最後に、他のセリ
ンプロテアーゼと’I(Iff性の見ら耗る活性部位が
ある。
づいて2つのクリングル領域がある。最後に、他のセリ
ンプロテアーゼと’I(Iff性の見ら耗る活性部位が
ある。
組織プラスミノーゲンアクチベーターおよびそのin
vivoでの凝血溶解能に関連して、少なくとも4種
の異なった特性が存在する。まず第1には。
vivoでの凝血溶解能に関連して、少なくとも4種
の異なった特性が存在する。まず第1には。
プラスミノーゲンを開裂して、フィブリンを分解するプ
ラスミンを生産するプロテアーゼ機能の比活性である。
ラスミンを生産するプロテアーゼ機能の比活性である。
第2の特性は、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤
の阻害に対する感受性である。
の阻害に対する感受性である。
第3の特性は、プラスミノーゲン分解活性におけるプラ
スミノーゲンアクチベーターのフィブリン依存性である
。第4の特性は、 tPAのフィブリン表面への結合性
である。これらの要因の各々が。
スミノーゲンアクチベーターのフィブリン依存性である
。第4の特性は、 tPAのフィブリン表面への結合性
である。これらの要因の各々が。
凝血存在下でプラスミノーゲンアクチベーターがプラス
ミノーゲンをプラスミンに分解するその゛速さや特異性
に役割をなしている。従って、実質的な問題は、これら
のカテゴリーに属する一種がそれ以上の特性を改善する
ような組織プラスミノーゲンアクチベーター活性を有す
るポリペプチドが生産できることにあろう。
ミノーゲンをプラスミンに分解するその゛速さや特異性
に役割をなしている。従って、実質的な問題は、これら
のカテゴリーに属する一種がそれ以上の特性を改善する
ような組織プラスミノーゲンアクチベーター活性を有す
るポリペプチドが生産できることにあろう。
゛ の ′ なi′ ■
天然に存在するタンパクの元来の性質を高めるための、
変異処理の利用については、 Craik etal、
、 5cience(1985) 228:291 ;
Rosenberg et al、。
変異処理の利用については、 Craik etal、
、 5cience(1985) 228:291 ;
Rosenberg et al、。
Nature(1984) 312ニア7−80および
一11kinson et al、。
一11kinson et al、。
Nature (1984) 307:187−18
8に報告されている。
8に報告されている。
Andreasen et al、、 EMBOJ、
(1984) 3 : 51−56は。
(1984) 3 : 51−56は。
tPAの開裂部位でのクリッピングがプロテアーゼ活性
に必要であることを報告した。Ny et 旦、。
に必要であることを報告した。Ny et 旦、。
Proc、 Natl、 Acad、 Sci、 US
A(1984)81 : 5355は。
A(1984)81 : 5355は。
ヒトtPAの構造と1機能的および構造的ドメインに対
するイントロンとエクソンの相互関係について報告した
。A、 J、van Zonneveld et
al。
するイントロンとエクソンの相互関係について報告した
。A、 J、van Zonneveld et
al。
八bstract from rsTHMeeti
ng、 July 14−19+1985は、ヒト
の組織型プラスミノーゲンアクチベーターの構造と機能
の相互関係について報告した。(J、 Biol Cb
em、 (1986) 261:14214−1421
8)Opdenakkerl 旦、+ EMBOWor
ksho on Plasmino en Acti
vation(八malfi、 Italy、 0ct
ober 14−18+1985)は、炭水化物側鎖の
除去によるtPA活性への影響について報告した。Lo
skutoff et al、、 Proc、 Na
tl、Acad。
ng、 July 14−19+1985は、ヒト
の組織型プラスミノーゲンアクチベーターの構造と機能
の相互関係について報告した。(J、 Biol Cb
em、 (1986) 261:14214−1421
8)Opdenakkerl 旦、+ EMBOWor
ksho on Plasmino en Acti
vation(八malfi、 Italy、 0ct
ober 14−18+1985)は、炭水化物側鎖の
除去によるtPA活性への影響について報告した。Lo
skutoff et al、、 Proc、 Na
tl、Acad。
Sci、 USA(1983)80 : 2956−2
960およびLosku tof f 。
960およびLosku tof f 。
乃μ圓央h」μ邊並馳す二匡肋則エ 旦用: 118(
S699)は、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤
の特性について述べた。
S699)は、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤
の特性について述べた。
(発明が解決しようとする問題点)
tPA分子に欠失や置換を独立にまたは組み合わせて採
用することにより、プラスミノーゲンアクチベーター活
性を持つポリペプチドが提供され。
用することにより、プラスミノーゲンアクチベーター活
性を持つポリペプチドが提供され。
ここでグリコシル化は変化を受け、C−末端は不完全と
なり、開裂部位は修飾されている。その結果得られた生
成物は、プラスミノーゲンを活性化して、フィブリン塊
を溶解したり、凝血形成を妨げたりするのに使用できる
ことがわかる。これらのポリペプチドは1部位特異的変
異形成によって生成した変異遺伝子を発現させることに
よって産生される。
なり、開裂部位は修飾されている。その結果得られた生
成物は、プラスミノーゲンを活性化して、フィブリン塊
を溶解したり、凝血形成を妨げたりするのに使用できる
ことがわかる。これらのポリペプチドは1部位特異的変
異形成によって生成した変異遺伝子を発現させることに
よって産生される。
(問題点を解決するための手段)
本発明のポリペプチドは、凝血を溶解することにおける
U織プラスミノーゲンアクチベーター活性を持つポリペ
プチドであって、天然の組織プラスミノーゲンアクチベ
ーターの比活性の少なくとも0.3の比活性を有し、ま
た組織プラスミノーゲンアクチベーター活性を持つ天然
に生じるポリペプチド中のグリコシル化部位の数を減ら
すこと。
U織プラスミノーゲンアクチベーター活性を持つポリペ
プチドであって、天然の組織プラスミノーゲンアクチベ
ーターの比活性の少なくとも0.3の比活性を有し、ま
た組織プラスミノーゲンアクチベーター活性を持つ天然
に生じるポリペプチド中のグリコシル化部位の数を減ら
すこと。
C末端で少なくとも3個のアミノ酸を欠失させること、
または開裂部位のアミノ酸を置換することの結果として
、比活性、活性のフィブリン依存性。
または開裂部位のアミノ酸を置換することの結果として
、比活性、活性のフィブリン依存性。
または阻害剤感受性に関して少なくとも1つの改良され
た性質を持つ。
た性質を持つ。
本発明のポリペプチドは2組織プラスミノーゲン活性を
持つポリペプチドであって、ヒトの組織プラスミノーゲ
ンアクチベーターに由来し、そしてアミノ酸位置117
,184および448のうち少なくとも2ケ所でAsn
のGlnによる置換を持つ。
持つポリペプチドであって、ヒトの組織プラスミノーゲ
ンアクチベーターに由来し、そしてアミノ酸位置117
,184および448のうち少なくとも2ケ所でAsn
のGlnによる置換を持つ。
本発明のポリペプチドは1組織プラスミノーゲン活性を
持つポリペプチドであって、ヒトの組織プラスミノーゲ
ンアクチベーターに由来し、そしてMe t525から
Pro527までを欠いている。
持つポリペプチドであって、ヒトの組織プラスミノーゲ
ンアクチベーターに由来し、そしてMe t525から
Pro527までを欠いている。
本発明のポリペプチドは9組織プラスミノーゲン活性を
持つポリペプチドであって、ヒトの組織プラスミノーゲ
ンアクチベーターに由来し、そしてLys277がAr
gに置換されている。
持つポリペプチドであって、ヒトの組織プラスミノーゲ
ンアクチベーターに由来し、そしてLys277がAr
gに置換されている。
本発明のポリペプチドは、ヒトの組織プラスミノーゲン
アクチベーターに由来し組織プラスミノーゲン活性を持
つポリペプチドであって、アミノ酸117.184およ
び448の少なくとも1ケ所のグリコシル化部位でAs
nがGlnに置換されており、MeL525からPro
527までの配列を欠いている。
アクチベーターに由来し組織プラスミノーゲン活性を持
つポリペプチドであって、アミノ酸117.184およ
び448の少なくとも1ケ所のグリコシル化部位でAs
nがGlnに置換されており、MeL525からPro
527までの配列を欠いている。
本発明のポリペプチドは、ヒトの組織プラスミノーゲン
アクチベーターに由来し組織プラスミノーゲン活性を持
つポリペプチドであって、アミノ酸117.184およ
び448の少なくとも1ケ所のグリコシル化部位でAs
nがGlnに置換されており、 Lsy277がArg
に置換されている。
アクチベーターに由来し組織プラスミノーゲン活性を持
つポリペプチドであって、アミノ酸117.184およ
び448の少なくとも1ケ所のグリコシル化部位でAs
nがGlnに置換されており、 Lsy277がArg
に置換されている。
本発明の薬剤組成物は、凝血を溶解することにおける組
織プラスミノーゲンアクチベーター活性を持つポリペプ
チドを凝血を溶解するに充分な量含みまた生理学的に受
容可能なキャリアを含む薬剤組成物であって、該ポリペ
プチドが天然の組織プラスミノーゲンアクチベーターの
比活性の少なくとも0.3の比活性を有し、また組織プ
ラスミノーゲンアクチベーター活性を持つ天然に生じる
ポリペプチド中のグリコシル化部位の数を減らすこと、
C末端で少なくとも3個のアミノ酸を欠失させること、
または開裂部位のアミノ酸を置換することの結果として
、比活性、活性のフィブリン依存性、または阻害剤感受
性に関して少なくとも1つの改良された性質を持つポリ
ペプチドである。
織プラスミノーゲンアクチベーター活性を持つポリペプ
チドを凝血を溶解するに充分な量含みまた生理学的に受
容可能なキャリアを含む薬剤組成物であって、該ポリペ
プチドが天然の組織プラスミノーゲンアクチベーターの
比活性の少なくとも0.3の比活性を有し、また組織プ
ラスミノーゲンアクチベーター活性を持つ天然に生じる
ポリペプチド中のグリコシル化部位の数を減らすこと、
C末端で少なくとも3個のアミノ酸を欠失させること、
または開裂部位のアミノ酸を置換することの結果として
、比活性、活性のフィブリン依存性、または阻害剤感受
性に関して少なくとも1つの改良された性質を持つポリ
ペプチドである。
本発明のDNA配列は、ヒトの組織プラスミノーゲンア
クチベーターに由来し組織プラスミノーゲン活性を持つ
ポリペプチドをコードするDNA配列であって、該ポリ
ペプチドが以下のうちの少なくとも1つを持つという点
でヒトの組織プラスミノーゲンアクチベーターと異なる
: (aJII7−119.184−186および44
B−450のグリコシル化部位の少なくとも2ケ所の障
害;CblC末端での少なくとも3個のアミノ酸の欠失
;および(c)ヒトの組織プラスミノーゲンアクチベー
ターの開裂部位のアミノ酸の置換。
クチベーターに由来し組織プラスミノーゲン活性を持つ
ポリペプチドをコードするDNA配列であって、該ポリ
ペプチドが以下のうちの少なくとも1つを持つという点
でヒトの組織プラスミノーゲンアクチベーターと異なる
: (aJII7−119.184−186および44
B−450のグリコシル化部位の少なくとも2ケ所の障
害;CblC末端での少なくとも3個のアミノ酸の欠失
;および(c)ヒトの組織プラスミノーゲンアクチベー
ターの開裂部位のアミノ酸の置換。
本発明の発現構築物は、転写の順に、転写と翻訳の開始
領域、該開始領域の転写と翻訳の制御調節下にあるDN
A配列、および転写と翻訳の終結領域を含有する発現構
築物であって、 Bg DNA配列がヒトの組織プラス
ミノーゲンアクチベーターに由来し組織プラスミノーゲ
ン活性を持つポリペプチドをコードするDNA配列であ
って、該ポリペプチドが(a)117−119.184
−186および448−450のグリコシル化部位の少
なくとも2ケ所の障害、(b)C末端での少なくとも3
個のアミノ酸の欠失、および(c)ヒトの組織プラスミ
ノーゲンアクチベーターの開裂部位のアミノ酸の置換の
うちの少なくとも1つを持つという点でヒトの組織プラ
スミノーゲンアクチベーターと異なるポリペプチドであ
る。
領域、該開始領域の転写と翻訳の制御調節下にあるDN
A配列、および転写と翻訳の終結領域を含有する発現構
築物であって、 Bg DNA配列がヒトの組織プラス
ミノーゲンアクチベーターに由来し組織プラスミノーゲ
ン活性を持つポリペプチドをコードするDNA配列であ
って、該ポリペプチドが(a)117−119.184
−186および448−450のグリコシル化部位の少
なくとも2ケ所の障害、(b)C末端での少なくとも3
個のアミノ酸の欠失、および(c)ヒトの組織プラスミ
ノーゲンアクチベーターの開裂部位のアミノ酸の置換の
うちの少なくとも1つを持つという点でヒトの組織プラ
スミノーゲンアクチベーターと異なるポリペプチドであ
る。
本発明のプラスミドは、宿主中で機能的な複製系および
発現構築物を含有するプラスミドであって、該発現構築
物が、転写の順に、転写と翻訳の開始領域、該開始領域
の転写と翻訳の制御ill 2m節下にあるDNA配列
、および転写と翻訳の終結領域を含有する発現構築物で
あって、該DNA配列がヒトの組織プラスミノーゲンア
クチベーターに由来し組織プラスミノーゲン活性を持つ
ポリペプチドをコードするDNA配列であって、該ポリ
ペプチドが(al 117−119.184−186お
よび448−450のグリコシル化部位の少なくとも2
ケ所の障害、(b)C末端での少なくとも3個のアミノ
酸の欠失、および(c)ヒトの組織プラスミノーゲンア
クチベーターの開裂部位のアミノ酸の置換のうちの少な
くとも1つを持つという点でヒトの組織プラスミノーゲ
ンアクチベーターと異なるポリペプチドである。
発現構築物を含有するプラスミドであって、該発現構築
物が、転写の順に、転写と翻訳の開始領域、該開始領域
の転写と翻訳の制御ill 2m節下にあるDNA配列
、および転写と翻訳の終結領域を含有する発現構築物で
あって、該DNA配列がヒトの組織プラスミノーゲンア
クチベーターに由来し組織プラスミノーゲン活性を持つ
ポリペプチドをコードするDNA配列であって、該ポリ
ペプチドが(al 117−119.184−186お
よび448−450のグリコシル化部位の少なくとも2
ケ所の障害、(b)C末端での少なくとも3個のアミノ
酸の欠失、および(c)ヒトの組織プラスミノーゲンア
クチベーターの開裂部位のアミノ酸の置換のうちの少な
くとも1つを持つという点でヒトの組織プラスミノーゲ
ンアクチベーターと異なるポリペプチドである。
本発明のポリペプチドは、ヒトの組織プラスミノーゲン
アクチベーターに由来しm織プラスミノーゲン活性を持
つポリペプチドであって、 Lys277が八rgに置
換されており、またMet525からPro527まで
を欠いている。
アクチベーターに由来しm織プラスミノーゲン活性を持
つポリペプチドであって、 Lys277が八rgに置
換されており、またMet525からPro527まで
を欠いている。
本発明のポリペプチドは、ヒトの組織プラスミノーゲン
アクチベーターに由来し組織プラスミノーゲン活性を持
つポリペプチドであって、アミノ酸位置117.184
および448の少なくとも2ケ所においてAsnがGl
nに置換されており、 Lys277がArgに置換さ
れており、またMe t525からPro527までを
欠いている。
アクチベーターに由来し組織プラスミノーゲン活性を持
つポリペプチドであって、アミノ酸位置117.184
および448の少なくとも2ケ所においてAsnがGl
nに置換されており、 Lys277がArgに置換さ
れており、またMe t525からPro527までを
欠いている。
本発明の細胞は、プラスミドを含む生育可能な細胞であ
って、該プラスミドが宿主中で機能的な複製系および発
現構築物を含有するプラスミドであって、該発現構築物
が、転写の順に、転写と翻訳の開始領域、該開始領域の
転写と翻訳の制御調節下にあるDNA配列、および転写
と翻訳の終結領域を含有する発現構築物であって、該D
NA配列がヒトの組織プラスミノーゲンアクチベーター
に由来し組織プラスミノーゲン活性を持つポリペプチド
をコードするDNA配列であって、該ポリペプチドが(
al 117−.119.184486および448−
450のグリコシル化部位の少なくとも2ケ所の障害、
(b)C末端での少なくとも3個のアミノ酸の欠失;お
よ゛び(c)ヒトの組織プラスミノーゲンアクチベータ
ーの開裂部位のアミノ酸の置換のうちの少なくとも1つ
を持つという点でヒトの組織プラスミノーゲンアクチベ
ーターと異なるポリペプチドである。
って、該プラスミドが宿主中で機能的な複製系および発
現構築物を含有するプラスミドであって、該発現構築物
が、転写の順に、転写と翻訳の開始領域、該開始領域の
転写と翻訳の制御調節下にあるDNA配列、および転写
と翻訳の終結領域を含有する発現構築物であって、該D
NA配列がヒトの組織プラスミノーゲンアクチベーター
に由来し組織プラスミノーゲン活性を持つポリペプチド
をコードするDNA配列であって、該ポリペプチドが(
al 117−.119.184486および448−
450のグリコシル化部位の少なくとも2ケ所の障害、
(b)C末端での少なくとも3個のアミノ酸の欠失;お
よ゛び(c)ヒトの組織プラスミノーゲンアクチベータ
ーの開裂部位のアミノ酸の置換のうちの少なくとも1つ
を持つという点でヒトの組織プラスミノーゲンアクチベ
ーターと異なるポリペプチドである。
本発明の方法は、 DNA配列を作成するための方法
であって、該DNA配列がヒトの組織プラスミノーゲン
アクチベーターに由来し組織プラスミノーゲン活性を持
つポリペプチドをコードするDNA配列であり、該ポリ
ペプチドが(a)117−119.184−186およ
び448−450のグリコシル化部位の少なくとも2ケ
所の障害、(b)C末端での少なくとも3個のアミノ酸
の欠失、およびfc)ヒトの組織プラスミノーゲンアク
チベーターの開裂部位のアミノ酸の置換のうちの少なく
とも1つを持つという点でヒトの組織プラスミノーゲン
アクチベーターと異なるポリペプチドであるDNA配列
を作成するための方法であって、以下の工程:(1)組
織プラスミノーゲンアクチベーター活性を持つ天然に生
じるポリペプチドをコードする鋳型を含有する原核生物
プラスミドの一本鎖に、 117−119.184−1
86および448−450のアミノ酸をコードするグリ
コシル化部位の少なくとも2ケ所のグリコシル化部位で
の障害、C末端での少なくとも3個のアミノ酸の欠失、
または開裂部位のアミノ酸の置換を生じるミスマツチを
もつオリゴデオキシヌクレオチドをアニーリングさせて
2部分的な二本鎖プラスミドを供する工程であって、こ
こで、該オリゴデオキシヌクレオチドが、標的鋳型に関
して85から90%の相補性を有すること、ミスマツチ
される座位の反対側の相補性領域の融点がほぼ等しいこ
と、そして前記変異形成座位以外の前記プラスミドのど
の部位でも70%より低い相補性を持つことにより特徴
づけられる工程;(2)修正能力を欠< DNAポリ
メラーゼにより該オリゴデオキシヌクレオチドを伸長し
て、二本鎖プラスミドを供する工程;(3)該二本鎖プ
ラスミドにより宿主の原核生物細胞を形質転換し、該細
胞を増殖させることにより該二本鎖プラスミドを複製さ
せる工程;および(4)該オリゴデオキシヌクレオチド
の配列を持つプラスミドを単離する工程、を包含する。
であって、該DNA配列がヒトの組織プラスミノーゲン
アクチベーターに由来し組織プラスミノーゲン活性を持
つポリペプチドをコードするDNA配列であり、該ポリ
ペプチドが(a)117−119.184−186およ
び448−450のグリコシル化部位の少なくとも2ケ
所の障害、(b)C末端での少なくとも3個のアミノ酸
の欠失、およびfc)ヒトの組織プラスミノーゲンアク
チベーターの開裂部位のアミノ酸の置換のうちの少なく
とも1つを持つという点でヒトの組織プラスミノーゲン
アクチベーターと異なるポリペプチドであるDNA配列
を作成するための方法であって、以下の工程:(1)組
織プラスミノーゲンアクチベーター活性を持つ天然に生
じるポリペプチドをコードする鋳型を含有する原核生物
プラスミドの一本鎖に、 117−119.184−1
86および448−450のアミノ酸をコードするグリ
コシル化部位の少なくとも2ケ所のグリコシル化部位で
の障害、C末端での少なくとも3個のアミノ酸の欠失、
または開裂部位のアミノ酸の置換を生じるミスマツチを
もつオリゴデオキシヌクレオチドをアニーリングさせて
2部分的な二本鎖プラスミドを供する工程であって、こ
こで、該オリゴデオキシヌクレオチドが、標的鋳型に関
して85から90%の相補性を有すること、ミスマツチ
される座位の反対側の相補性領域の融点がほぼ等しいこ
と、そして前記変異形成座位以外の前記プラスミドのど
の部位でも70%より低い相補性を持つことにより特徴
づけられる工程;(2)修正能力を欠< DNAポリ
メラーゼにより該オリゴデオキシヌクレオチドを伸長し
て、二本鎖プラスミドを供する工程;(3)該二本鎖プ
ラスミドにより宿主の原核生物細胞を形質転換し、該細
胞を増殖させることにより該二本鎖プラスミドを複製さ
せる工程;および(4)該オリゴデオキシヌクレオチド
の配列を持つプラスミドを単離する工程、を包含する。
本発明の感受性は、ヒトの組織プラスミノーゲンアクチ
ベーターと実質的に同じアミノ酸配列を持つポリペプチ
ドであって9次の生理学的性質の少なくとも1つを持つ
ポリペプチド:天然に生じるヒトの組織プラスミノーゲ
ンアクチベーターと比較して、6.2から7、Cの範囲
の比活性:1.3から2゜5の範囲のフィブリン依存性
;およびプラスミノーゲンアクチベーター阻害剤の阻害
に対し10から30%の範囲で低下した。
ベーターと実質的に同じアミノ酸配列を持つポリペプチ
ドであって9次の生理学的性質の少なくとも1つを持つ
ポリペプチド:天然に生じるヒトの組織プラスミノーゲ
ンアクチベーターと比較して、6.2から7、Cの範囲
の比活性:1.3から2゜5の範囲のフィブリン依存性
;およびプラスミノーゲンアクチベーター阻害剤の阻害
に対し10から30%の範囲で低下した。
以下に本発明の詳細な説明する。
プラスミノーゲンアクチベーターとしての特性が高めら
れた新規ポリペプチドが、そのようなポリペプチドをコ
ードするDNAコード配列、適切な宿主内でそのような
配列を発現させるための発現カセット、新規ポリペプチ
ドを発現できる宿主。
れた新規ポリペプチドが、そのようなポリペプチドをコ
ードするDNAコード配列、適切な宿主内でそのような
配列を発現させるための発現カセット、新規ポリペプチ
ドを発現できる宿主。
および新規ポリペプチドを生産する方法を含めて。
提供される。新規ポリペプチドは、少なくともひとつの
グリコシル化部位に変化を含み、272から280まで
の領域、特にPhezt4Argz75 11e246
−Lysttt(FRIK)にある開裂部位に少なくと
もひとつの変化を含み、そして/または9分子の一端か
または両端、特にC−末端の切断を含む。唯一の修飾が
グリコシル化部位にあるとき、 177−119と1
84−186の両方のグリコシル化部位は同様にまたは
異なって修飾される。(使用するアミノ酸の番号付けは
Penn1ca et al、、 Nature (
1983) 301: 2J4−221の報告に基づき
、グリシン−アラニン−アルギニン−セリン−チロシン
の配列のセリンから始める。)組織プラスミノーゲンア
クチベーター活性を持ちヒト組織プラスミノーゲンアク
チベーターに由来するポリペプチドにこのような変化を
専人すると、生理学的特性の改善が達成可能である。
グリコシル化部位に変化を含み、272から280まで
の領域、特にPhezt4Argz75 11e246
−Lysttt(FRIK)にある開裂部位に少なくと
もひとつの変化を含み、そして/または9分子の一端か
または両端、特にC−末端の切断を含む。唯一の修飾が
グリコシル化部位にあるとき、 177−119と1
84−186の両方のグリコシル化部位は同様にまたは
異なって修飾される。(使用するアミノ酸の番号付けは
Penn1ca et al、、 Nature (
1983) 301: 2J4−221の報告に基づき
、グリシン−アラニン−アルギニン−セリン−チロシン
の配列のセリンから始める。)組織プラスミノーゲンア
クチベーター活性を持ちヒト組織プラスミノーゲンアク
チベーターに由来するポリペプチドにこのような変化を
専人すると、生理学的特性の改善が達成可能である。
新規ポリペプチドは、タンパク分解活性、特にプラスミ
ノーゲン分解活性を増幅しており、プラスミノーゲンア
クチベーター阻害に対する感受性が低下し、フィブリン
親和性が増加し、そして/またはプラスミノーゲン分解
活性のフィブリン依存性が増している。
ノーゲン分解活性を増幅しており、プラスミノーゲンア
クチベーター阻害に対する感受性が低下し、フィブリン
親和性が増加し、そして/またはプラスミノーゲン分解
活性のフィブリン依存性が増している。
興味深い第1の変化は、アミノ酸117−119.18
4−186および448−450におけるグリコシル化
部位゛の少なくとも1つの修飾であり、アスパラギンが
保存的または非保存的に変化しているか、または。
4−186および448−450におけるグリコシル化
部位゛の少なくとも1つの修飾であり、アスパラギンが
保存的または非保存的に変化しているか、または。
セリンかスレオニンが特にグリシン、アラニンあるいは
バリンに非保存的に変化している。特に興味深いのは、
117−119と184−186のグリコシル化部位
である。興味深い変異には、アスパラギンが他のアミノ
酸、好ましくはグルタミン、バリン。
バリンに非保存的に変化している。特に興味深いのは、
117−119と184−186のグリコシル化部位
である。興味深い変異には、アスパラギンが他のアミノ
酸、好ましくはグルタミン、バリン。
ロイシン、イソロイシン、アラニンまたはグリシン、よ
り好ましくはグルタミンに置換されこと。
り好ましくはグルタミンに置換されこと。
または、セリンかスレオニンが他のアミノ酸、好ましく
はアラニン、バリンまたはメチオニンに置換されること
、つまりメルカプト基または中性水酸基をもたない3〜
5個の炭素原子から成る脂肪族アミノ酸に置換されるこ
と、が含まれる。117と184におけるグリコシル化
部位のアスパラギンのグルタミンへの置換が特に興味深
い。
はアラニン、バリンまたはメチオニンに置換されること
、つまりメルカプト基または中性水酸基をもたない3〜
5個の炭素原子から成る脂肪族アミノ酸に置換されるこ
と、が含まれる。117と184におけるグリコシル化
部位のアスパラギンのグルタミンへの置換が特に興味深
い。
変異生成物特性の所望の変化に応じて、保存的変化また
は非保存的変化いずれかが含まれる。保存的な変化は、
アミノ酸間にセミコロンを付して示した。G、 A、V
、 I、 t、;o、 E、に、 R,N、Q、S、T
、およびF、W。
は非保存的変化いずれかが含まれる。保存的な変化は、
アミノ酸間にセミコロンを付して示した。G、 A、V
、 I、 t、;o、 E、に、 R,N、Q、S、T
、およびF、W。
Y;ここで1つのグループのアミノ酸が他のグループの
アミノ酸または上に示されていないアミノ酸に置換し、
このような変化を非保存的であると考える。
アミノ酸または上に示されていないアミノ酸に置換し、
このような変化を非保存的であると考える。
比活性は1分子のグリコシル化量を特にクリングル構造
内のグリコシル化部位、より特別にはN−末端からC−
末端方向の最初の2つのグリコシル化部位について減少
させると、増幅できることが見出された。
内のグリコシル化部位、より特別にはN−末端からC−
末端方向の最初の2つのグリコシル化部位について減少
させると、増幅できることが見出された。
欠失、置換、挿入などのようなさまざまな障害をグリコ
シル化部位に導入することにより、グリコシル化部位の
3つ組を変えてグリコシル化部位を破壊する。例えば、
117−119.184−186および448−45
0のグリコシル化部位を同様にまたは異なって修飾する
。
シル化部位に導入することにより、グリコシル化部位の
3つ組を変えてグリコシル化部位を破壊する。例えば、
117−119.184−186および448−45
0のグリコシル化部位を同様にまたは異なって修飾する
。
次に興味深い領域は、アミノ酸の274−278に生じ
る開裂部位の修飾である。特に興味深いのは。
る開裂部位の修飾である。特に興味深いのは。
277のリジンのアルギニンへの置換のような保存的変
化である。他の置換としては、276のイソロイシンの
バリン、ロイシン、グリシンまたはアラニンへの置換を
含む。開裂部位の特異的修飾はプラスミノーゲンアクチ
ベーター阻害に対する感受性を減少させ得ることがわか
り、よってこのポリペプチドはin vivoで、天
然での阻害量のプラスミノーゲンアクチベーター阻害剤
存在下で、野生型組織プラスミノーゲンアクチベーター
に比べて活性を増しているだろう。
化である。他の置換としては、276のイソロイシンの
バリン、ロイシン、グリシンまたはアラニンへの置換を
含む。開裂部位の特異的修飾はプラスミノーゲンアクチ
ベーター阻害に対する感受性を減少させ得ることがわか
り、よってこのポリペプチドはin vivoで、天
然での阻害量のプラスミノーゲンアクチベーター阻害剤
存在下で、野生型組織プラスミノーゲンアクチベーター
に比べて活性を増しているだろう。
第3の興味ある変化は、N末端またはC末端の切断で、
特にC末端での少なくとも1アミノ酸から25アミノ酸
まで1通常は10アミノ酸まで、より通常には3アミノ
酸までの切断である。N末端では、セリンから始まりチ
ロシンに続く1〜5アミノ酸、特に1〜3アミノ酸が切
断される。
特にC末端での少なくとも1アミノ酸から25アミノ酸
まで1通常は10アミノ酸まで、より通常には3アミノ
酸までの切断である。N末端では、セリンから始まりチ
ロシンに続く1〜5アミノ酸、特に1〜3アミノ酸が切
断される。
C末端の切断は、フィブリン依存性を増幅させ。
それによって組織プラスミノーゲンアクチベーターの特
異性の増加が達成される。フィブリン依存性を増加する
ことで、開裂して凝血から離れたプラスミンとなるプラ
スミノーゲンの量は実質的に減少し、プラスミンの副作
用は阻止されるであろう。
異性の増加が達成される。フィブリン依存性を増加する
ことで、開裂して凝血から離れたプラスミンとなるプラ
スミノーゲンの量は実質的に減少し、プラスミンの副作
用は阻止されるであろう。
本発明の新規ポリペプチドは、上に述べた2種。
3種またはそれ以上の変化を組み合わせて得られる。例
えば、117と184のグリコシル化部位のアスパラギ
ンのグルタミンによる置換(第1の型の変化例)に加え
て、開裂部位277のリジンをアルギニンに置換するこ
とによる修飾(第2の型の変化例)、またはMet52
5からPro527までの配列の切断(第3型の変化例
)を行ってよい。
えば、117と184のグリコシル化部位のアスパラギ
ンのグルタミンによる置換(第1の型の変化例)に加え
て、開裂部位277のリジンをアルギニンに置換するこ
とによる修飾(第2の型の変化例)、またはMet52
5からPro527までの配列の切断(第3型の変化例
)を行ってよい。
いくつかの場合、むしろtPAを切断するよりは。
鎖を伸長するか、または末端のアミノ酸を一般に約1−
12アミノ酸、N末端とC末端の1つか両方で伸長する
。付加したアミノ酸はリンカ−としてふるまったり、特
別な免疫応答を供したり1分子の生理学的特性を修飾し
たりするであろう。
12アミノ酸、N末端とC末端の1つか両方で伸長する
。付加したアミノ酸はリンカ−としてふるまったり、特
別な免疫応答を供したり1分子の生理学的特性を修飾し
たりするであろう。
主題のポリペプチドをコードするDNA配列は。
イントロンを含む染色体DNA、 cDNA、合成りN
A 。
A 。
またはそれらの組み合わせを使って、さまざまな方法で
調整される。所望の変異は、遺伝子を適当な細菌の宿主
中に、−末鎖バタテリオファージベクタ一または二本鎖
プラスミドベクターを用い°。
調整される。所望の変異は、遺伝子を適当な細菌の宿主
中に、−末鎖バタテリオファージベクタ一または二本鎖
プラスミドベクターを用い°。
次に野生型配列に実質的に相補的ではあるが、トランス
バージョン、転位、欠失または挿入などの所望の変異を
含むミスマツチの配列を用いて、クローニングすること
により達成される。あるいは。
バージョン、転位、欠失または挿入などの所望の変異を
含むミスマツチの配列を用いて、クローニングすること
により達成される。あるいは。
便利な制限酵素切断部位が存在すれば、特別な配列を削
り、変異を含んだ合成配列を導入できる。
り、変異を含んだ合成配列を導入できる。
使用できる他の技術は、二本鎖鋳型の部分エキソヌクレ
アーゼ消化、またはin vitroでヘテロデュプ
レックスを形成して部分的−末鎖領域をオリゴヌクレオ
チド−特異的変異形成にかけることである。
アーゼ消化、またはin vitroでヘテロデュプ
レックスを形成して部分的−末鎖領域をオリゴヌクレオ
チド−特異的変異形成にかけることである。
特に興味深いのは、オリゴヌクレオチド特異的変異形成
である。(Zoller and Sm1th、 M
ethods監u肌しく1983) 100:468−
500.)欠失や挿入のミスマツチを含んだ適切なオリ
ゴヌクレオチド配列としては、一般に約20から100
ヌクレオチド(nt)、より一般的には20−60n
を持つものを調製する。この配列は2合成により簡単に
調製でき、適当なりローニングベクターでクローニング
できる。このオリゴヌクレオチドを2部位特異的変異形
成用にtPA遺伝子かtPA類似体の精製鋳型とアニー
ルさせる。変異は独立に導入し。
である。(Zoller and Sm1th、 M
ethods監u肌しく1983) 100:468−
500.)欠失や挿入のミスマツチを含んだ適切なオリ
ゴヌクレオチド配列としては、一般に約20から100
ヌクレオチド(nt)、より一般的には20−60n
を持つものを調製する。この配列は2合成により簡単に
調製でき、適当なりローニングベクターでクローニング
できる。このオリゴヌクレオチドを2部位特異的変異形
成用にtPA遺伝子かtPA類似体の精製鋳型とアニー
ルさせる。変異は独立に導入し。
変異の部位は約10塩基対(bp) 、より一般には約
20bp分離させる。異なった部位の変異は一段階また
は連続的段階で導入し、各変異後その変異の存在やtP
A[似体の活性への効果を確かめる。
20bp分離させる。異なった部位の変異は一段階また
は連続的段階で導入し、各変異後その変異の存在やtP
A[似体の活性への効果を確かめる。
変異形成プライマーの設計には、いくつかの考察が含ま
れる。一般に、プライマーの長さは、標的鋳型に対して
、約85%より高く約95%より低い相補性を持つよう
に選択する。これによって3変異形成プライマーによる
簡単なプラーク選別が可能となるというさらなる利点が
供される。変異形成プライマーが、欠失を生じる場合1
通常欠失の各端に少なくとも約20bpの相補性が存在
するであろう。また、プライマーは、変異座位の両端に
おいて、だいたい等しい融点を供する必要がある。
れる。一般に、プライマーの長さは、標的鋳型に対して
、約85%より高く約95%より低い相補性を持つよう
に選択する。これによって3変異形成プライマーによる
簡単なプラーク選別が可能となるというさらなる利点が
供される。変異形成プライマーが、欠失を生じる場合1
通常欠失の各端に少なくとも約20bpの相補性が存在
するであろう。また、プライマーは、変異座位の両端に
おいて、だいたい等しい融点を供する必要がある。
さらに考えると、プライマーは鋳型上の不適当な部位か
らのプライミングを、もし除かない場合は。
らのプライミングを、もし除かない場合は。
最少にするよう選択されるべきである。実際、変異座位
以外のあらゆる部位において、相補性は70%より低く
、好ましくは60%より低くあるべきである。従って9
問題とする遺伝子のみならず、クローニングベクターに
ついても考えるべきである。
以外のあらゆる部位において、相補性は70%より低く
、好ましくは60%より低くあるべきである。従って9
問題とする遺伝子のみならず、クローニングベクターに
ついても考えるべきである。
特に考えなければならないことは、プライマーの3′末
端での相補性である。
端での相補性である。
便宜上、ベクターは、たとえばM13のような一本鎖状
DNAウィルス、特にベクターとして利用するため修飾
されたものである。便利なウィルスベクターはM13m
p9である。変異形成プライマーを鋳型やベクターと、
必要なヌクレオチドおよびT4DN^リガーゼ存在下で
、クレノー断片やT4DNAポリメラーゼのような修正
能力を欠いた適当なポリメラーゼ存在下、アニーリング
条件のもとに一緒にして、それによって遺伝子を保持す
る環状ベクターが複製可能となり、二本鎖複製型が供さ
れる。次いで二本鎖DNAを適当な細胞に導入する。溶
解性ベクターを供給することで、変異形成が生じたtP
AまたはtPAIi似体の存在をプライマーを使って選
別できるプラークを得る。通常、変異形成産物としての
正確な配列を持つ可能性を増すためには。
DNAウィルス、特にベクターとして利用するため修飾
されたものである。便利なウィルスベクターはM13m
p9である。変異形成プライマーを鋳型やベクターと、
必要なヌクレオチドおよびT4DN^リガーゼ存在下で
、クレノー断片やT4DNAポリメラーゼのような修正
能力を欠いた適当なポリメラーゼ存在下、アニーリング
条件のもとに一緒にして、それによって遺伝子を保持す
る環状ベクターが複製可能となり、二本鎖複製型が供さ
れる。次いで二本鎖DNAを適当な細胞に導入する。溶
解性ベクターを供給することで、変異形成が生じたtP
AまたはtPAIi似体の存在をプライマーを使って選
別できるプラークを得る。通常、変異形成産物としての
正確な配列を持つ可能性を増すためには。
感度を増加させた。少なくとも2回のくり返し選別が必
要であろう。
要であろう。
次に推定上止のクローンを1例えばプラーク精製、電気
泳動的精製などして、精製し1次いで配列決定する。
泳動的精製などして、精製し1次いで配列決定する。
配列決定のために、少なくとも長さが約20から30塩
基で変異座位から少なくとも約55塩基離れた位置でア
ニールするであろう配列決定プライマーを設計する。正
確な配列の妥当な保証を得るためには、変異座位の両側
少なくとも約50塩基を含む領域を配列決定することが
望ましい。
基で変異座位から少なくとも約55塩基離れた位置でア
ニールするであろう配列決定プライマーを設計する。正
確な配列の妥当な保証を得るためには、変異座位の両側
少なくとも約50塩基を含む領域を配列決定することが
望ましい。
一度正確に変異形成した遺伝子が得られたら。
それを単離し、適切な宿主中で発現させるために適切な
発現ベクターに挿入する。
発現ベクターに挿入する。
哺乳類、昆虫および鳥類宿主に利用する発現ベクターに
は、広範囲の種類が存在する。例えば。
は、広範囲の種類が存在する。例えば。
ここで参考文献として採用するEPA O,092,1
82に述べられているものを参照せよ。特に興味深いの
は哺乳類ベクターで、これはシミアンウィルス。
82に述べられているものを参照せよ。特に興味深いの
は哺乳類ベクターで、これはシミアンウィルス。
ウシ乳頭腫ウィルス、アデノウィルスなどのよ゛うなウ
ィルスのレプリコンを使用する。
ィルスのレプリコンを使用する。
転写や翻訳の開始および終結側′4B SJf域は、天
然上tp^遺伝子に関連する領域、ウィルスの構造遺伝
子由来の領域または宿主遺伝子由来の領域である。多く
のプロモーターが利用可能である。例えば、 SV40
の初期および後期プロモーター、アデノウィルスの主要
後期プロモーター、β−アクチンプロモーター、ヒトC
MV Immediate Early (IEI)
プロモーターなどである。望ましくは、プロモーターは
2発現を向上させるために、エンハンサ−とともに使う
。
然上tp^遺伝子に関連する領域、ウィルスの構造遺伝
子由来の領域または宿主遺伝子由来の領域である。多く
のプロモーターが利用可能である。例えば、 SV40
の初期および後期プロモーター、アデノウィルスの主要
後期プロモーター、β−アクチンプロモーター、ヒトC
MV Immediate Early (IEI)
プロモーターなどである。望ましくは、プロモーターは
2発現を向上させるために、エンハンサ−とともに使う
。
多くの場合tPA発現構築物を増幅することが望ましい
。増幅または他の理由のために1発現構築物を染色体に
組み込ませることが望ましい。この目的のためには、構
築物は不安定な複製系1例えば酵母ars 1と結合
されるか、あるいは複製系を欠くであろう。組み込みに
ついては例えばAxeland Wigler+米国特
許第4,399,216号を参照せよ。
。増幅または他の理由のために1発現構築物を染色体に
組み込ませることが望ましい。この目的のためには、構
築物は不安定な複製系1例えば酵母ars 1と結合
されるか、あるいは複製系を欠くであろう。組み込みに
ついては例えばAxeland Wigler+米国特
許第4,399,216号を参照せよ。
通常、マーカー発現構築物は主題の発現構築物とタンデ
ムであろうし、そのマーカーは増幅遺伝子と同じでも異
なったものでもよい。これは2発現構築物とタンデムで
あり、 tPA発現構築物と同じ宿主内で機能を持ち
、そしてDHPR(ジヒドロ葉酸還元酵素) 、 TK
(チミジンキナーゼ)、MT−rおよび−■ (メタ
ロチオネイン、例えばヒト)、0OC(オルニチン脱炭
酸酵素)のような増幅可能な遺伝子をコードするような
tPAを有することによって達成できる。増幅可能遺伝
子に従って宿主に圧力をかけることにより1例えばD
HP Rならばメトトレキセートで圧力をかけることに
よって、主題の発現構築物は増幅される。
ムであろうし、そのマーカーは増幅遺伝子と同じでも異
なったものでもよい。これは2発現構築物とタンデムで
あり、 tPA発現構築物と同じ宿主内で機能を持ち
、そしてDHPR(ジヒドロ葉酸還元酵素) 、 TK
(チミジンキナーゼ)、MT−rおよび−■ (メタ
ロチオネイン、例えばヒト)、0OC(オルニチン脱炭
酸酵素)のような増幅可能な遺伝子をコードするような
tPAを有することによって達成できる。増幅可能遺伝
子に従って宿主に圧力をかけることにより1例えばD
HP Rならばメトトレキセートで圧力をかけることに
よって、主題の発現構築物は増幅される。
用いる特別な宿主やシグナル配列に従って9発現された
tPA類似体は宿主細胞質内に保持されるかまたは分泌
されるであろう。細胞質内に保持される場合、 tP
A[似体は常法に従って宿主細胞をを溶解することによ
り単離し、抽出および精製法。
tPA類似体は宿主細胞質内に保持されるかまたは分泌
されるであろう。細胞質内に保持される場合、 tP
A[似体は常法に従って宿主細胞をを溶解することによ
り単離し、抽出および精製法。
好ましくは電気泳動法、クロマトグラフィーのような方
法を使用して精製する。tPAが分泌される場合1分泌
されたtPAは、アフィニティクロマトグラフィーを含
む従来の方法に従って上澄液から単離できる。
法を使用して精製する。tPAが分泌される場合1分泌
されたtPAは、アフィニティクロマトグラフィーを含
む従来の方法に従って上澄液から単離できる。
本発明で使用するポリペプチドの特性を組み合わせると
、 tPAOよううな天然のプラスミノーゲンアクチ
ベーターよりも優れている。これらのポリペプチドは、
天然のtPAに対して少なくとも0.6倍、しばしば少
なくとも0.7倍1通常は少なくとも1、C倍、一般に
約1.1−7、C倍、そして好ましくは約6.2から7
、C倍の比活性を持つであろう。
、 tPAOよううな天然のプラスミノーゲンアクチ
ベーターよりも優れている。これらのポリペプチドは、
天然のtPAに対して少なくとも0.6倍、しばしば少
なくとも0.7倍1通常は少なくとも1、C倍、一般に
約1.1−7、C倍、そして好ましくは約6.2から7
、C倍の比活性を持つであろう。
活性のフィブリン依存性は、天然のtPAに対して少な
くとも0.4倍、しばしば少なくとも約0.6倍。
くとも0.4倍、しばしば少なくとも約0.6倍。
通常は少なくとも約0.7倍、そして好ましくは少なく
とも約1〜2.5倍で特に1.3から2.5倍であろう
。プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤に対する感受
性は2通常天然のtPAよりも高くはなく、天然のtP
Aの感受性に基づいて好ましくは。
とも約1〜2.5倍で特に1.3から2.5倍であろう
。プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤に対する感受
性は2通常天然のtPAよりも高くはなく、天然のtP
Aの感受性に基づいて好ましくは。
約5%低下し、より好ましくは約10%低下から約90
%低下までの範囲に及び、特に天然のtPAより約25
−90%低下しているであろう。この主題化合物は通常
、野生型tPAよりも少なくとも1つの見地においては
優れているであろう。(試験法については実験の項を参
照)。
%低下までの範囲に及び、特に天然のtPAより約25
−90%低下しているであろう。この主題化合物は通常
、野生型tPAよりも少なくとも1つの見地においては
優れているであろう。(試験法については実験の項を参
照)。
特に興味深いのは1組織プラスミノーゲンアクチベータ
ー活性を持ち、実質的にヒトtPAと同じアミノ酸配列
(置換、欠失および挿入を含む相異が10%より低い1
通常は5%より低い)を持っているポリペプチドである
。これらのポリペプチドは以下の性質の少なくとも1つ
を持っているであろう。(al比活性が天然tPAの比
活性の少なくとも約0.6倍、しばしば少なくとも約0
.7倍1通常は少なくとも約1、C倍、一般に約1.1
から7、C倍。
ー活性を持ち、実質的にヒトtPAと同じアミノ酸配列
(置換、欠失および挿入を含む相異が10%より低い1
通常は5%より低い)を持っているポリペプチドである
。これらのポリペプチドは以下の性質の少なくとも1つ
を持っているであろう。(al比活性が天然tPAの比
活性の少なくとも約0.6倍、しばしば少なくとも約0
.7倍1通常は少なくとも約1、C倍、一般に約1.1
から7、C倍。
そして好ましくは約6.2から7、C倍である。山)フ
イブリン依存性が天然tPAの少なくとも0.4倍。
イブリン依存性が天然tPAの少なくとも0.4倍。
しばしば少なくとも約0.6倍、一般には少なくとも約
0.7倍、そして好ましくは少なくとも約1、Cから2
.5倍、特に約1.5から2.5倍である。(clヒト
プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤による阻害に対
する感受性の低下が天然tPAの感受性に比較して約5
%であり、より好ましくは約10%の低下から約90%
の低下の範囲におよび、そして特に天然tPAよりも約
25から90%低下している。−主題のポリペプチドは
、さまざまな血管の状態や病気に対する予防処置または
治療処置においてさまざまな方法で特異的に使用され、
哺乳類宿主。
0.7倍、そして好ましくは少なくとも約1、Cから2
.5倍、特に約1.5から2.5倍である。(clヒト
プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤による阻害に対
する感受性の低下が天然tPAの感受性に比較して約5
%であり、より好ましくは約10%の低下から約90%
の低下の範囲におよび、そして特に天然tPAよりも約
25から90%低下している。−主題のポリペプチドは
、さまざまな血管の状態や病気に対する予防処置または
治療処置においてさまざまな方法で特異的に使用され、
哺乳類宿主。
特にヒト宿主における血栓形成を防ぐであろう。
従って、宿主が凝血形成に感受性である場合はこれを手
術中に投与してよく、あるいは血栓患者の処置用に投与
してもよく、これにより、深い動脈血栓、肺塞栓2頭蓋
血栓および冠状動脈血栓内に形成している凝血を溶解す
る。
術中に投与してよく、あるいは血栓患者の処置用に投与
してもよく、これにより、深い動脈血栓、肺塞栓2頭蓋
血栓および冠状動脈血栓内に形成している凝血を溶解す
る。
主題化合物は、腸管によって、または非経口的に、特に
注射または注入によって投与する。これらの化合物は、
ゼラチン、ゼラチン誘導体のグループから選択されるタ
ンパク安定化剤、アルブミンのような保護タンパク、
ti、 Wアルコールまたはアミノ酸の存在下、水、生
理食塩水または適当な緩衝系のような生理的に受容可能
な支持体中にその有効量を単独であるいは他の治療薬、
特に血管病用架と組み合わせて投与できる。次の実施例
は、説明のためであり、決してこれに限定されない。
注射または注入によって投与する。これらの化合物は、
ゼラチン、ゼラチン誘導体のグループから選択されるタ
ンパク安定化剤、アルブミンのような保護タンパク、
ti、 Wアルコールまたはアミノ酸の存在下、水、生
理食塩水または適当な緩衝系のような生理的に受容可能
な支持体中にその有効量を単独であるいは他の治療薬、
特に血管病用架と組み合わせて投与できる。次の実施例
は、説明のためであり、決してこれに限定されない。
(以下余白)
(実施例)
材料層よ墾方広
変異形成は、以下で述べるように一部変更した。
Zoller and Sm1th、 Meth、 E
nz mol、 (1983) 100 :468−5
00 、で述べられている手順を用いて行った。
nz mol、 (1983) 100 :468−5
00 、で述べられている手順を用いて行った。
合成りNA変異形成と配列決定プライマーは、 N、
N〜ジイソプロピルホスホロアシダイトを用いて、 U
rdeaet al、+ Proc、 Natl、
Acad、 Sci、 USA (1983)80 :
7461−7465で述べられているようなシリカ支
持体上での自動オリゴヌクレオチド合成により調製した
。配列決定プライマーを、バクテリオファージM13で
のジデオキシヌクレオチド連鎖末端法(F、 Sang
er、 S、 N1cklen and A、 R,C
oulson。
N〜ジイソプロピルホスホロアシダイトを用いて、 U
rdeaet al、+ Proc、 Natl、
Acad、 Sci、 USA (1983)80 :
7461−7465で述べられているようなシリカ支
持体上での自動オリゴヌクレオチド合成により調製した
。配列決定プライマーを、バクテリオファージM13で
のジデオキシヌクレオチド連鎖末端法(F、 Sang
er、 S、 N1cklen and A、 R,C
oulson。
Proc、 Natl、 Acad、 Sci、
LISA (1977) 74 : 54
63)による配列決定用に設計した。配列決定プライマ
ーは、長さが一般的に20から30塩基でM13mp9
組み換え鋳型に相補的であり、しかも変異座位から少な
くとも55塩基離れた位置でアニールするように設計し
た。以下の表は、変異形成や配列決定に用いるオリゴマ
ーを示している。
LISA (1977) 74 : 54
63)による配列決定用に設計した。配列決定プライマ
ーは、長さが一般的に20から30塩基でM13mp9
組み換え鋳型に相補的であり、しかも変異座位から少な
くとも55塩基離れた位置でアニールするように設計し
た。以下の表は、変異形成や配列決定に用いるオリゴマ
ーを示している。
表I
変異形成プライマー
la、 CGCGCTGCTCTGCCAGTTG
GTlb、 CTGACCCCTGCCCAAAG
TAGC2、TTGAGGAGTCGGGTGTTCC
TGGTCA/GTTGTCACGAA−TCCAGT
CTAGGTAG 3、 AGAGCCCTCCTCTGATGCG
A4、 CT!、TGATTTTAAACTGAGG
CTGGCTGTA5、 GACTGTTCTΩ胆A
AGTAAATG註二Σは野生型からの1換を示す。
GTlb、 CTGACCCCTGCCCAAAG
TAGC2、TTGAGGAGTCGGGTGTTCC
TGGTCA/GTTGTCACGAA−TCCAGT
CTAGGTAG 3、 AGAGCCCTCCTCTGATGCG
A4、 CT!、TGATTTTAAACTGAGG
CTGGCTGTA5、 GACTGTTCTΩ胆A
AGTAAATG註二Σは野生型からの1換を示す。
/は欠失を示す。
変異の効果
1、 Asn 117 −* Gln、 Asn
184 →G1n2、 Met 525からPro
527までの欠失3、 Lys277 −” A
rg4、 Lys277 →Atg、 Arg27
5 →Lys5、 八sn 177 →
Gln、 Asn 184 → Gln。
184 →G1n2、 Met 525からPro
527までの欠失3、 Lys277 −” A
rg4、 Lys277 →Atg、 Arg27
5 →Lys5、 八sn 177 →
Gln、 Asn 184 → Gln。
Asn 448 −= GIn
配列決定プライマー
la、 八CCTTGCCTATCAGGA
TCATlb、 CGAATCGCCCTG
GCAGGCGTC2、GTGGGTCTGGAGAA
GTCTGT八3.4. GCACAGGAACC
へCTCTCCGGG5、 TCGAT
CTGGGTTTCTGCAGTAGTTGTGGTT
M13/ tpa組み換え体の変異形成は、精製した鋳
型を用い、適当なプライマーをアニーリングしそしてT
4ポリメラーゼのクレノー断片で伸長さ゛せることによ
り行った。変異体1は1両プライマー1aおよび1bを
用いて変異処理−回の操作で得た。変異体4は、125
μg/−の遺伝子32タンパク、および挿入体に隣接す
るM13配列に結合するヘルパープライマーの存在下で
、変異体3に由来する鋳型を用いて得た。プライマー4
の効果(Arg275 = Lys)とプライマー3の
効果(Lys 277 =Arg)を組み合わせること
により、上に示した2ケ所の変異部位を形成した。変異
体5は変異体1に由来する鋳型を用いて得た。プライマ
ー1aと1bの効果(八sn 117 = Gln、
Asn 184−* Gln)をプライマー5の効果(
Asn 448−” Gln)と組み合わせて、上に示
した3ケ所の変異部位を形成した。
TCATlb、 CGAATCGCCCTG
GCAGGCGTC2、GTGGGTCTGGAGAA
GTCTGT八3.4. GCACAGGAACC
へCTCTCCGGG5、 TCGAT
CTGGGTTTCTGCAGTAGTTGTGGTT
M13/ tpa組み換え体の変異形成は、精製した鋳
型を用い、適当なプライマーをアニーリングしそしてT
4ポリメラーゼのクレノー断片で伸長さ゛せることによ
り行った。変異体1は1両プライマー1aおよび1bを
用いて変異処理−回の操作で得た。変異体4は、125
μg/−の遺伝子32タンパク、および挿入体に隣接す
るM13配列に結合するヘルパープライマーの存在下で
、変異体3に由来する鋳型を用いて得た。プライマー4
の効果(Arg275 = Lys)とプライマー3の
効果(Lys 277 =Arg)を組み合わせること
により、上に示した2ケ所の変異部位を形成した。変異
体5は変異体1に由来する鋳型を用いて得た。プライマ
ー1aと1bの効果(八sn 117 = Gln、
Asn 184−* Gln)をプライマー5の効果(
Asn 448−” Gln)と組み合わせて、上に示
した3ケ所の変異部位を形成した。
JMIOI細胞へのトランスフェクション(Zolle
r andSmith、上記)に続き、プラークを20
0−1000プラーク/プレートの濃度に増殖させ、フ
ィルターに釣り上げ、適当な変異形成プライマーあるい
はプローブでハイブリダイゼーションにより選別した。
r andSmith、上記)に続き、プラークを20
0−1000プラーク/プレートの濃度に増殖させ、フ
ィルターに釣り上げ、適当な変異形成プライマーあるい
はプローブでハイブリダイゼーションにより選別した。
これらのプラークのうち10から40パーセントを。
推定上陽性の候補としてまず同定した。ファージのトン
ドブロットハイブリダイゼーションによる各実験から、
この推定物からおよそ6個を再選別することにより1強
い候補が得られた。これらのファージを低濃度で再度ブ
レーティングすることによりプラークを純化し、ニトロ
セルロースフィルターに移し、プライマーと再度ハイブ
リダイゼーションした。推定上陽性のクローンのDNA
配列を、適当なプライマーと鋳型調製物を用いて決定し
た。
ドブロットハイブリダイゼーションによる各実験から、
この推定物からおよそ6個を再選別することにより1強
い候補が得られた。これらのファージを低濃度で再度ブ
レーティングすることによりプラークを純化し、ニトロ
セルロースフィルターに移し、プライマーと再度ハイブ
リダイゼーションした。推定上陽性のクローンのDNA
配列を、適当なプライマーと鋳型調製物を用いて決定し
た。
変異形成座位と隣接区分(すなわち、少なくとも50塩
基)をDNA配列分析により確認した直後。
基)をDNA配列分析により確認した直後。
複製型(RF) DNAをSal l制限エンドヌク
レアーゼで分解し、5alrで前もって分解してアルカ
リ性ホスファターゼ処理しだ哺乳類発現ベクターpSV
7dに挿入した。このベクターは、 tPA cDNA
発現用のSV40初期プロモーターとエンハンサ−、S
V40ポリアデニル化部位、および」公細胞でベクター
に用いるためのSV40複製起点を供する。
レアーゼで分解し、5alrで前もって分解してアルカ
リ性ホスファターゼ処理しだ哺乳類発現ベクターpSV
7dに挿入した。このベクターは、 tPA cDNA
発現用のSV40初期プロモーターとエンハンサ−、S
V40ポリアデニル化部位、および」公細胞でベクター
に用いるためのSV40複製起点を供する。
プラスミドpSV7dを以下の様に構築した。SV40
複製起点および初期プロモーターを含む400bpのB
am1l T / Hind m断片をpSVgt I
(Mulligan、 R。
複製起点および初期プロモーターを含む400bpのB
am1l T / Hind m断片をpSVgt I
(Mulligan、 R。
et at、、 J、 Mo1. Ce1l Bio
l、 1 : 854−864 (1981))より切
出し、精製した。SV40ポリA付加部位を含む240
bpのSV40 Bcl I / Bam)I I断片
を、 pSV2/dhfr (Subramani e
t al、+ J、 Mo1. Ce1l Biol
。
l、 1 : 854−864 (1981))より切
出し、精製した。SV40ポリA付加部位を含む240
bpのSV40 Bcl I / Bam)I I断片
を、 pSV2/dhfr (Subramani e
t al、+ J、 Mo1. Ce1l Biol
。
1 : 584−864 (1981))より切出し、
精製した。これら断片を以下のリンカ−を介して融合し
た。
精製した。これら断片を以下のリンカ−を介して融合し
た。
(以下余白)
停止コドン
5’ −AGCTAGATCTCCCGGGTCTAG
ATAAGTAAT−3’TCTAGAGGGCCCA
GATCTATTCATTACTAGHindllI
Bgl II Sma I Xba I Bc
l I 突出このリンカ−は3つのすべての読み取り
枠中の停止コドンと同様に、5個の制限部位を含む。S
V40複製起点、 SV40初期プロモーター、停止コ
ドン付きポリリンカーおよびSV40ポリアデニル化部
位を含む生じた670bpの断片を、およそ1.5kb
の欠失のあるpBR322誘導体であるpMLの(Lu
sky and Botchan。
ATAAGTAAT−3’TCTAGAGGGCCCA
GATCTATTCATTACTAGHindllI
Bgl II Sma I Xba I Bc
l I 突出このリンカ−は3つのすべての読み取り
枠中の停止コドンと同様に、5個の制限部位を含む。S
V40複製起点、 SV40初期プロモーター、停止コ
ドン付きポリリンカーおよびSV40ポリアデニル化部
位を含む生じた670bpの断片を、およそ1.5kb
の欠失のあるpBR322誘導体であるpMLの(Lu
sky and Botchan。
並置 四: 391 (1984) ’)の勿I11部
位にクローン化し、 pSV6を得た。 pSV6(7
) pML配列中(7) EcoR1部位とEcoRV
部位を、 EcoRIとEcoRVでの分解により除
去し、各末端の約200bpを除くために±31ヌクレ
アーゼで処理し、そして最終的に再連結してpSV?a
を得た。」旦31による切除も、 EcoRV部位よ
りおよそ200bp離れた。 5V406Jf域の周辺
にある1つのBamHI制限部位を除去した。SV40
領域にある第2のBamHr部位を除去するため、
pSV7aを、複製起点から上流のpML配列中で切断
する」皿で分解した。これを、平滑末端連結により再環
化し、 pSV7bを得た。
位にクローン化し、 pSV6を得た。 pSV6(7
) pML配列中(7) EcoR1部位とEcoRV
部位を、 EcoRIとEcoRVでの分解により除
去し、各末端の約200bpを除くために±31ヌクレ
アーゼで処理し、そして最終的に再連結してpSV?a
を得た。」旦31による切除も、 EcoRV部位よ
りおよそ200bp離れた。 5V406Jf域の周辺
にある1つのBamHI制限部位を除去した。SV40
領域にある第2のBamHr部位を除去するため、
pSV7aを、複製起点から上流のpML配列中で切断
する」皿で分解した。これを、平滑末端連結により再環
化し、 pSV7bを得た。
pSV7cとpSV7dは連続したポリリンカー置換を
示す。初めに、 pSV7bを5tulとXba I
で分解した。それから1次のリンカ−をベクターに連結
し。
示す。初めに、 pSV7bを5tulとXba I
で分解した。それから1次のリンカ−をベクターに連結
し。
pSV7Cを得た。
[1g1lI EcoRI SmaI KpnI
XbaI5’ −AGATCTCGAATTCCCCG
GGGGTACCTTCTAGAGCTTAAGGGG
CCCCCATGGAGATCその後、 pSV7c
をJLLIIとXba Iで分解し、それから次のリン
カ−と連結しpSV7dを得た。
XbaI5’ −AGATCTCGAATTCCCCG
GGGGTACCTTCTAGAGCTTAAGGGG
CCCCCATGGAGATCその後、 pSV7c
をJLLIIとXba Iで分解し、それから次のリン
カ−と連結しpSV7dを得た。
Bglll EcoRI Smal Xbal B
amHI 5ai15’ −GATCTCGAATTC
CCCGGGTCTAGAGGATCCGTCGACA
GCTTAAGGGGCCCAGATCTCCTAGG
CACGTGGATCベクター内でのクローン化断片の
適切な方向を制限部位解析で引き出した。変異を、」旦
IとEcoRに対する制限解析により、また変異座位に
対し高度に特異的な適切なプローブを用いたそのような
断片のサザンブロツティングにより再確認した。
amHI 5ai15’ −GATCTCGAATTC
CCCGGGTCTAGAGGATCCGTCGACA
GCTTAAGGGGCCCAGATCTCCTAGG
CACGTGGATCベクター内でのクローン化断片の
適切な方向を制限部位解析で引き出した。変異を、」旦
IとEcoRに対する制限解析により、また変異座位に
対し高度に特異的な適切なプローブを用いたそのような
断片のサザンブロツティングにより再確認した。
■金丈変異体
次の4つの組合せ変異体を組み換えDNA技術を用いて
構築した:変異1および2の両方を含む変異体6.変異
1および3の両方を含む変異体7゜変異2および3の両
方を含む変異体8.および3つの変異1,2および3を
すべて含む変異体9゜変異の各々は便利な制限エンドヌ
クレアーゼ部位により分離されており、これにより、以
前に単離した変異体1.2および3の断片由来の所望の
変異の会合が促進された。各変異体の構築に用いた特異
的な戦略を以下で述べる。
構築した:変異1および2の両方を含む変異体6.変異
1および3の両方を含む変異体7゜変異2および3の両
方を含む変異体8.および3つの変異1,2および3を
すべて含む変異体9゜変異の各々は便利な制限エンドヌ
クレアーゼ部位により分離されており、これにより、以
前に単離した変異体1.2および3の断片由来の所望の
変異の会合が促進された。各変異体の構築に用いた特異
的な戦略を以下で述べる。
大規模なプラスミド調製を、記載の変異体構築のすべて
に対して行った。そのDNAを組織培養細胞へのトラン
スフェクションに用いた。
に対して行った。そのDNAを組織培養細胞へのトラン
スフェクションに用いた。
変異体i
変異体1の1.72キロ塩基(kb)の」憇II Iか
らI BstEIIまでの断片は、変異させた部位A
sn 117−+GlnとAsn 184−e Gln
の両方を含む。
らI BstEIIまでの断片は、変異させた部位A
sn 117−+GlnとAsn 184−e Gln
の両方を含む。
この断片を、 MetszsからPro、□7までの欠
失の所望変異を含む変異体2の3.38kbのBamH
Iから」旦EUまでの断片に連結した。この連結混合液
を、コンピテントなエセリシア・コリを形質転換するの
に用いた。生じたアンピシリン耐性コロニーのいくつか
を増殖させ、そのDNAを、サイズにより、また各変異
領域に特異的な32P末端標識化オリゴヌクレオチドプ
ローブによるDNAのサザンプロットのDNAハイブリ
ダイゼーション解析により選別した。このようなりロー
ンは、もし2つの個々の変異体1の領域のオリゴヌクレ
オチドの各々、および変異体2特異的プローブにハイブ
リダイズするならば、陽性として記録した。この選別法
を、各新しい構築に対し適切なオリゴヌクレオチドプロ
ーブの置換により、各々の構築物について用いた。
失の所望変異を含む変異体2の3.38kbのBamH
Iから」旦EUまでの断片に連結した。この連結混合液
を、コンピテントなエセリシア・コリを形質転換するの
に用いた。生じたアンピシリン耐性コロニーのいくつか
を増殖させ、そのDNAを、サイズにより、また各変異
領域に特異的な32P末端標識化オリゴヌクレオチドプ
ローブによるDNAのサザンプロットのDNAハイブリ
ダイゼーション解析により選別した。このようなりロー
ンは、もし2つの個々の変異体1の領域のオリゴヌクレ
オチドの各々、および変異体2特異的プローブにハイブ
リダイズするならば、陽性として記録した。この選別法
を、各新しい構築に対し適切なオリゴヌクレオチドプロ
ーブの置換により、各々の構築物について用いた。
使用した特異的オリゴヌクレオチドは以前に挙げた。
−・ 7 (1&3)
変異させた部位を両方含む変異体1の2.95kb S
ea 1断片を、lys trr −Argの変換を含
む変異体3の2.15kb Sca l断片に連結した
。新構築の選別を。
ea 1断片を、lys trr −Argの変換を含
む変異体3の2.15kb Sca l断片に連結した
。新構築の選別を。
変異体3の変化および変異体lの変換の各々に特異的な
オリゴヌクレオチドを用いて行った。
オリゴヌクレオチドを用いて行った。
・ 82&3)
所望の変換を含む変異体2の3.38kbのBamHI
から」旦E■までの断片をr Lys 2?? = A
rg変異を含む変異体3の1.72kbの勿II Iか
ら」旦EI[までの断片に連結した。正しい組み換え体
の選別を、各変異に特異的なオリゴヌクレオチドを用い
て行った。
から」旦E■までの断片をr Lys 2?? = A
rg変異を含む変異体3の1.72kbの勿II Iか
ら」旦EI[までの断片に連結した。正しい組み換え体
の選別を、各変異に特異的なオリゴヌクレオチドを用い
て行った。
F 9 (1&2&3)
三重変異体の形成戦略として、新しく構築した二重変異
体の1つである変異体7を使用した。このプラスミドを
BamHIξBstEIIで開裂し1両変異体を含む1
.72kbの断片を単離した。変異体2からのプラスミ
ドDNAを同じ制限酵素で分解し、 3.38kbの細
片(変異を含む)を単離した。
体の1つである変異体7を使用した。このプラスミドを
BamHIξBstEIIで開裂し1両変異体を含む1
.72kbの断片を単離した。変異体2からのプラスミ
ドDNAを同じ制限酵素で分解し、 3.38kbの細
片(変異を含む)を単離した。
これら2つの断片を連結し、この連結混合液を用いてコ
ンピテントなエセリシア・コリを形質転換した。正確な
三重変異体の選別は、 DNA中の各変異部位に特異
的なオリゴヌクレオチドを用いて。
ンピテントなエセリシア・コリを形質転換した。正確な
三重変異体の選別は、 DNA中の各変異部位に特異
的なオリゴヌクレオチドを用いて。
上記の様に行った。
細胞のトランスフェクション
CO5−7細胞(Gluzman、 Ce旦(198
1) 23 : 175)を、 Graham and
van der Eb+ 7 (1973)52
: 456−467で述べられている手順を一部変更し
て用いて、 pSV7d tPA発現プラスミドでトラ
ンスフェクションした。サンプルを2通りでディシュシ
に加え、二酸化炭素恒温器(37℃)中、6時間。
1) 23 : 175)を、 Graham and
van der Eb+ 7 (1973)52
: 456−467で述べられている手順を一部変更し
て用いて、 pSV7d tPA発現プラスミドでトラ
ンスフェクションした。サンプルを2通りでディシュシ
に加え、二酸化炭素恒温器(37℃)中、6時間。
細胞上に固定させた。6時間後2上澄液を吸引シ。
細胞をCaとMgのないリン酸緩衝生理食塩水(1’B
S−CMF)で穏やかにゆすぎ、そして3.5−4分間
、アジュバントとしての15%グリセロールにディツシ
ュをさらした。ゆすいで、4.5■/rR1グルコース
。
S−CMF)で穏やかにゆすぎ、そして3.5−4分間
、アジュバントとしての15%グリセロールにディツシ
ュをさらした。ゆすいで、4.5■/rR1グルコース
。
3.7mg/mff1 NazCOz 、 292μ
g/−グルタミン。
g/−グルタミン。
110μg1mlピルビン酸ナトリウム、 100U/
−ペニシリン、 100U/−ストレプトマイシン、お
よび10%胎児ウシ血清(FCS)を添加したDMEM
培地を供給した後、培地を胎児ウシ血清を欠く培地と置
き換えた。血清を除去して12時間後、下で述べるカゼ
イン−プラスミノーゲン−寒天重層を用いて。
−ペニシリン、 100U/−ストレプトマイシン、お
よび10%胎児ウシ血清(FCS)を添加したDMEM
培地を供給した後、培地を胎児ウシ血清を欠く培地と置
き換えた。血清を除去して12時間後、下で述べるカゼ
イン−プラスミノーゲン−寒天重層を用いて。
細胞をtPAの発現について分析した。最大発現は。
トランスフェクション開始後36と48時間の間で観察
された。
された。
Cll0 dhfr−細胞(Urlaub and C
hasin、 Proc、・Natl。
hasin、 Proc、・Natl。
Acad、 Sci、 USA (1980) 77
: 4216 )を、栄養培地(1,18w/d Na
zCO* 、 292μg /mlグルタミン、11
0μg/−ピルビン酸ナトリウム、 100U/−ペニ
シリン、 1000/−ストブトマイシン、150μg
/−プロリンおよび10%FC3を添加したF12)中
でトランスフェクションする前日に、 10cmディシ
ュあたり5X10’から106の細胞の濃度で塗布した
。上で述べたトランスフェクション手順を。
: 4216 )を、栄養培地(1,18w/d Na
zCO* 、 292μg /mlグルタミン、11
0μg/−ピルビン酸ナトリウム、 100U/−ペニ
シリン、 1000/−ストブトマイシン、150μg
/−プロリンおよび10%FC3を添加したF12)中
でトランスフェクションする前日に、 10cmディシ
ュあたり5X10’から106の細胞の濃度で塗布した
。上で述べたトランスフェクション手順を。
tPA発現プラスミドをアデノウィルス主要後期プロモ
ーターにより働(dhfr遺伝子を選択マーカーとして
持つプラスミドと混ぜたという一部の変更を加えて用い
、リン酸カルシウムでプラスミドを共沈澱させた。dh
fr遺伝子を持つプラスミドは。
ーターにより働(dhfr遺伝子を選択マーカーとして
持つプラスミドと混ぜたという一部の変更を加えて用い
、リン酸カルシウムでプラスミドを共沈澱させた。dh
fr遺伝子を持つプラスミドは。
アデノウィルス−2由来の主要後期プロモーター(Ad
−NLP、地図単位16−17.3)をマウスの用几c
DNへの5゛末端に融合させることにより構築した。S
V40初期領域ポリアデニル化部位とSV40小を抗原
に対す、るイントロンをコードしているDNAをpSV
2−neo (Southern and
Berg、 J、 Mo1. A 1
. Genet。
−NLP、地図単位16−17.3)をマウスの用几c
DNへの5゛末端に融合させることにより構築した。S
V40初期領域ポリアデニル化部位とSV40小を抗原
に対す、るイントロンをコードしているDNAをpSV
2−neo (Southern and
Berg、 J、 Mo1. A 1
. Genet。
(1982) 1 : 327−341 ’)より得、
dhfr cDNAの3゛末端に融合した。これらの
3つの区分をpBR322にサブクローン化し、プラス
ミドAd −dhfrを得た。
dhfr cDNAの3゛末端に融合した。これらの
3つの区分をpBR322にサブクローン化し、プラス
ミドAd −dhfrを得た。
DNAを細胞に添加後48時間、細胞を選択培地(上記
のようにプロリンと胎児ウシ血清を添加した。
のようにプロリンと胎児ウシ血清を添加した。
あるいは透析した胎児ウシ血清を添加したDMEMt音
地)に1:20となるように分配した。選択培地で1−
2週間増殖後、コロニーが現れ、カゼイン−プラスミノ
ーゲン−寒天重層分析によりtPA生産を検定し、また
カゼイン−プラスミノーゲンプレートで定量分析した。
地)に1:20となるように分配した。選択培地で1−
2週間増殖後、コロニーが現れ、カゼイン−プラスミノ
ーゲン−寒天重層分析によりtPA生産を検定し、また
カゼイン−プラスミノーゲンプレートで定量分析した。
各変異体の細胞系を、 200cfflデイシユ中で
融合するまで増殖させ、無血清培地(DMEM)中で2
4時間の間保温し、そして上澄液を以下で述べるように
処理して、プラスミノーゲンアクチベーター活性を有す
るポリペプチドを精製した。
融合するまで増殖させ、無血清培地(DMEM)中で2
4時間の間保温し、そして上澄液を以下で述べるように
処理して、プラスミノーゲンアクチベーター活性を有す
るポリペプチドを精製した。
次の手順は、上で述べた6つのポリペプチドの活性を決
定するために用いた。
定するために用いた。
変異タンパクの比活性を決定するためには、サンプルの
抗原濃度を定量することが必須だった。
抗原濃度を定量することが必須だった。
ポリクローナル抗体を用いるETA−キット(Amer
icanDiagnostica、 Inc、+ Gr
eenwich、 CT)を用いた。
icanDiagnostica、 Inc、+ Gr
eenwich、 CT)を用いた。
検査は、キットに供されているプロトコール中に述べら
れている条件下で厳密に行い、各サンプルの5希釈物を
分析した。結果は、少なくとも3つの測定できる希釈物
の平均として表した。
れている条件下で厳密に行い、各サンプルの5希釈物を
分析した。結果は、少なくとも3つの測定できる希釈物
の平均として表した。
すべての細胞培養上澄液を0、C1%Tween 80
T1″と0、C1%Na−アジドにした。次いで上澄液
(50m1.)を、3−のHeparin−Sepha
rose@の存在下で室温。
T1″と0、C1%Na−アジドにした。次いで上澄液
(50m1.)を、3−のHeparin−Sepha
rose@の存在下で室温。
30分間、保温した。He p a r i n −S
e p h a r o s e ′M、濁液をカラ
ムに充填し、 0.1Mリン酸塩、 0、C1%Te
veen80THを含む緩衝液(pH7,5) 20a
d!でよく洗浄した。
e p h a r o s e ′M、濁液をカラ
ムに充填し、 0.1Mリン酸塩、 0、C1%Te
veen80THを含む緩衝液(pH7,5) 20a
d!でよく洗浄した。
最終的には、 tPA活性は、 0、C5M I−
リス−11CI 。
リス−11CI 。
I M KSCNおよび0、C1%Tween 80”
を含む緩衝液(pil 7.5)で溶出した。次いで溶
出物を、 0、C1%Tween80”、!=0、C1
%Na−7ジドを含むリン酸緩衝液(0,05門、 p
H7,5> 5Lに対して4℃、16時間透析した。
を含む緩衝液(pil 7.5)で溶出した。次いで溶
出物を、 0、C1%Tween80”、!=0、C1
%Na−7ジドを含むリン酸緩衝液(0,05門、 p
H7,5> 5Lに対して4℃、16時間透析した。
tPAサンプルを1dずつ一25℃で凍結した。
°血?h″ 査(cLT)
凝血溶解検査を、凝固時間の代わりに溶解時間を記録す
るために一部変更されている“にC10−Koagul
o−meter ” (Amelung、 FRG)を
用いて行った。
るために一部変更されている“にC10−Koagul
o−meter ” (Amelung、 FRG)を
用いて行った。
すべての試薬を37℃で予備保温した。tPA標品。
ポリペプチド検査サンプルおよびフィブリノーゲンを、
1%HaemaccelTM(pH7,4)を含むリン
酸緩衝液(0,67M )中で必要とする濃度にまで希
釈した。 tPA標品あるいはサンプルの0.2−を、
0.2−のヒトプラスミノーゲン(IOCTA/、wJ
) 、 0.5+dのウシフィブリノーゲン(0,15
%)および最終的に0.1dのトロンビン(1010/
d)と混合した。
1%HaemaccelTM(pH7,4)を含むリン
酸緩衝液(0,67M )中で必要とする濃度にまで希
釈した。 tPA標品あるいはサンプルの0.2−を、
0.2−のヒトプラスミノーゲン(IOCTA/、wJ
) 、 0.5+dのウシフィブリノーゲン(0,15
%)および最終的に0.1dのトロンビン(1010/
d)と混合した。
溶解時間を記録し、検量曲線を用いてtPA単位で表し
た。各変異タンパクの活性を少なくとも3回分析し、平
均を計算した。分析すべきサンプルの各々についてtP
Aの標品の4種の希釈を行った。
た。各変異タンパクの活性を少なくとも3回分析し、平
均を計算した。分析すべきサンプルの各々についてtP
Aの標品の4種の希釈を行った。
プラスミノ−゛ン沖7
変異タンパクのプラスミノーゲン溶解活性を。
Ranby et旦、+Thromb、 Res、 (
1982)27 : 743−749で述べられている
放物線検定を用いて分析した。
1982)27 : 743−749で述べられている
放物線検定を用いて分析した。
全試薬を37℃で予備保温した。tPA標品あるいはt
PAサンプ/I/(7) 0.1−を、 0.5m1
O:J緩衝液(o、1%Tween 80”と0、C1
%Na−アジドを含む0.1Mトリス−11CL、 p
H7,5)、 0.1−の基11(S 2251(I
r−D−Val−[、eu−Lys−(バラ−ニトロア
ニリド) (Kabi AB、 Sweden))。
PAサンプ/I/(7) 0.1−を、 0.5m1
O:J緩衝液(o、1%Tween 80”と0、C1
%Na−アジドを含む0.1Mトリス−11CL、 p
H7,5)、 0.1−の基11(S 2251(I
r−D−Val−[、eu−Lys−(バラ−ニトロア
ニリド) (Kabi AB、 Sweden))。
3mM)、 0.1−のヒトプラスミノーゲン(ICT
A/ml)および0.11n1のフィブリン分解産物(
10■/−)と混合した。最終的には、混合液を37℃
、45分間保温した。反応は0.1−の酢酸(50%)
を加えて停止させ、光学濃度を405r+mで読んだ。
A/ml)および0.11n1のフィブリン分解産物(
10■/−)と混合した。最終的には、混合液を37℃
、45分間保温した。反応は0.1−の酢酸(50%)
を加えて停止させ、光学濃度を405r+mで読んだ。
得られた検量曲線を用いてサンプルの光学濃度を単位に
変換した。結果は、少なくとも5個の測定可能な希釈物
の平均で表した。
変換した。結果は、少なくとも5個の測定可能な希釈物
の平均で表した。
さらに、同様の検査をフィブリン分解産物(FDP)の
不在下で行った。この場合、 0.51n1の代わり
に0.6艷の緩衝液が必要であった。
不在下で行った。この場合、 0.51n1の代わり
に0.6艷の緩衝液が必要であった。
ゞ のフィブリン
tPAおよび変異ポリペプチドがプラスミノーゲンをプ
ラスミンに活性化する能力に対する補因子(フィブリン
あるいはフィブリン分解産物(FDP)の影響を、凝血
溶解検査あるいはフィブリン依存性プラスミノーゲン溶
解検定で得た活性と、フィブリン非依存性プラスミノー
ゲン溶解検定で決定した活性との比で表した。
ラスミンに活性化する能力に対する補因子(フィブリン
あるいはフィブリン分解産物(FDP)の影響を、凝血
溶解検査あるいはフィブリン依存性プラスミノーゲン溶
解検定で得た活性と、フィブリン非依存性プラスミノー
ゲン溶解検定で決定した活性との比で表した。
フィブリン裸 のライブ1ンーアフイニテイー量ヒトの
フィブリノーゲン(0,3%) 0.2+d!itを
プラスチック管に入れ、 0、C05−のウシのトロ
ンビン(500IU/mff1)と混合した。混合液を
37℃で30分間静置させた。反応終了後、凝血を注意
深く除去し、抗トロンビンIII (3IU/mff1
)とヘパリン(40rU/mf)を含む2−の緩衝液(
0,1M1−リス−F[C1゜pH8,0)中で37℃
、30分間保温した。最終的に。
フィブリノーゲン(0,3%) 0.2+d!itを
プラスチック管に入れ、 0、C05−のウシのトロ
ンビン(500IU/mff1)と混合した。混合液を
37℃で30分間静置させた。反応終了後、凝血を注意
深く除去し、抗トロンビンIII (3IU/mff1
)とヘパリン(40rU/mf)を含む2−の緩衝液(
0,1M1−リス−F[C1゜pH8,0)中で37℃
、30分間保温した。最終的に。
凝血を除去し、50−の緩衝液(0,05M )リス−
HCl 。
HCl 。
0、IM NaC1,pH7,5)に対して20分間、
2回透析した。使用前に、凝血をまわりの溶液より除い
た。
2回透析した。使用前に、凝血をまわりの溶液より除い
た。
検査玉皿
すべてのサンプルをまず、0.1%Tween80TM
を含むトリス緩衝液(0,1M、 pH7,5)に20
0ng/−となるように希釈した。その後サンプルを、
5%ヒトアルブミンを含む同じ緩衝液に最終濃度110
0n/mlとなるように希釈した。続いて0.4−のサ
ンプルをフィブリン凝血存在下、室温にて10分間保温
した。最後に溶液を除き、流体相中の抗原濃度をEIA
で決定した。この実験を各サンプルにつき2回行った。
を含むトリス緩衝液(0,1M、 pH7,5)に20
0ng/−となるように希釈した。その後サンプルを、
5%ヒトアルブミンを含む同じ緩衝液に最終濃度110
0n/mlとなるように希釈した。続いて0.4−のサ
ンプルをフィブリン凝血存在下、室温にて10分間保温
した。最後に溶液を除き、流体相中の抗原濃度をEIA
で決定した。この実験を各サンプルにつき2回行った。
l1捜査
サンプルを、0.1%T賀een80”を含むトリス緩
衝液(0,1M、 p++ 7.5)に最終濃度110
0n/−になるように希釈した。
衝液(0,1M、 p++ 7.5)に最終濃度110
0n/−になるように希釈した。
次いで0.2−量を、65ウロキナ一ゼ阻害単位/−の
濃度でプラスミノーゲンアクチベーター阻害剤を含む溶
液0.2−と混合した。対照実験では。
濃度でプラスミノーゲンアクチベーター阻害剤を含む溶
液0.2−と混合した。対照実験では。
上で述べたポリペプチドのサンプルを0.2−の緩衝液
(100%)と混合した。混合液を10分間、37℃で
保温した。保温時間終了時点でサンプルを素早く希釈し
、残存活性をフィブリン依存性プラスミノーゲン溶解検
定で分析した。この阻害検査は各サンプルにつき2回行
った。■害悪受性を阻害されている%活性として表した
。
(100%)と混合した。混合液を10分間、37℃で
保温した。保温時間終了時点でサンプルを素早く希釈し
、残存活性をフィブリン依存性プラスミノーゲン溶解検
定で分析した。この阻害検査は各サンプルにつき2回行
った。■害悪受性を阻害されている%活性として表した
。
プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤をヒトの胎盤よ
り精製した。阻害画分は、いかなるタンパク分解活性も
、またプラスミン、トロンビンもしくはトリプシンの阻
害活性も含まない。
り精製した。阻害画分は、いかなるタンパク分解活性も
、またプラスミン、トロンビンもしくはトリプシンの阻
害活性も含まない。
変異タンパクの上記検定による値を表■にまとめて示す
。
。
(以下余白)
(1)凝血溶解検査
(3)フィブリン依存性プラスミノーゲン溶解検定(4
)フィブリン非依存性プラスミノーゲン溶解検定 上の結果より、野生型tPAアミノ酸配列配列化を生じ
ることにより実質的な利点を達し得ることが、明白であ
る。従って、活性を増加させることができるだけでなく
、同時にプラスミノーゲンアクチベーター阻害剤に対す
る感受性を低下させることができ、これにより効果的な
活性について全体として非常に実質的な増加が4yey
’fで達成できる。また酵素は、増強されたフィブリン
依存性を供するという点において実質的により特異的に
することができ、従って凝血の不在下ではそれは実質的
に低下した活性を有する。よって、タンパク(あるいは
酵素)の血流中のレベルを最小にし、またtPAの望ま
しくない副作用を実質的に減らすために、プラスミノー
ゲンアクチベーター活性を持つこれらのポリペプチドは
より小量で投与でき、しかも凝血に対し増加した活性を
供する。
)フィブリン非依存性プラスミノーゲン溶解検定 上の結果より、野生型tPAアミノ酸配列配列化を生じ
ることにより実質的な利点を達し得ることが、明白であ
る。従って、活性を増加させることができるだけでなく
、同時にプラスミノーゲンアクチベーター阻害剤に対す
る感受性を低下させることができ、これにより効果的な
活性について全体として非常に実質的な増加が4yey
’fで達成できる。また酵素は、増強されたフィブリン
依存性を供するという点において実質的により特異的に
することができ、従って凝血の不在下ではそれは実質的
に低下した活性を有する。よって、タンパク(あるいは
酵素)の血流中のレベルを最小にし、またtPAの望ま
しくない副作用を実質的に減らすために、プラスミノー
ゲンアクチベーター活性を持つこれらのポリペプチドは
より小量で投与でき、しかも凝血に対し増加した活性を
供する。
前述の本発明を、理解を明確にするために3図解と実施
例により幾分詳細に述べるが、ある程度の変化や一部変
更は、添付の特許請求の範囲内で行われ得ることは明白
であろう。
例により幾分詳細に述べるが、ある程度の変化や一部変
更は、添付の特許請求の範囲内で行われ得ることは明白
であろう。
′ との ・
本出願は我々の出願第812,879号(出願臼198
5年12月23日)のCIP出願であり、その明細書の
すべてを参考としてこの中に編入する。
5年12月23日)のCIP出願であり、その明細書の
すべてを参考としてこの中に編入する。
以上
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、凝血を溶解することにおける組織プラスミノーゲン
アクチベーター活性を持つポリペプチドであって、天然
の組織プラスミノーゲンアクチベーターの比活性の少な
くとも0.3の比活性を有し、また組織プラスミノーゲ
ンアクチベーター活性を持つ天然に生じるポリペプチド
中のグリコシル化部位の数を減らすこと、C末端で少な
くとも3個のアミノ酸を欠失させること、または開裂部
位のアミノ酸を置換することの結果として、比活性、活
性のフィブリン依存性、または阻害剤感受性に関して少
なくとも1つの改良された性質を持つポリペプチド。 2、前記天然に生じるポリペプチドがヒトの組織プラス
ミノーゲンアクチベーターである特許請求の範囲第1項
に記載のポリペプチド。 3、Asn−X−ThrまたはAsn−X−Serで表
される少なくとも1ヶ所のグリコシル化部位に少なくと
も1個のアミノ酸の置換を持つ特許請求の範囲第1項に
記載のポリペプチド。 4、アミノ酸117−119、184−186および4
48−450のグリコシル化部位の少なくとも1ケ所で
Asnが置換されている特許請求の範囲第3項に記載の
ポリペプチド。 5、アミノ酸117−119、184−186および4
48−450のグリコシル化部位の少なくとも1ヶ所で
AsnがGlnに置換されている特許請求の範囲第3項
に記載のポリペプチド。 6、少なくとも2ヶ所のグリコシル化部位でAsnがG
lnに置換され、またMet525からPro527ま
での配列を欠いている特許請求の範囲第5項に記載のポ
リペプチド。 7、少なくとも2ヶ所のグリコシル化部位でAsnがG
lnに置換され、またLys227がArgに置換され
ている特許請求の範囲第5項に記載のポリペプチド。 8、Ser119、Ser186およびSer450の
うち少なくとも1ヶ所で非保存的置換を持つ特許請求の
範囲第3項に記載のポリペプチド。 9、Ser119、Ser186またはSer450の
Gly、AlaまたはValによる置換を少なくとも1
個持つ特許請求の範囲第8項に記載のポリペプチド。 10、272から280までの領域の開裂部位に1個ま
たはそれ以上の置換を持つ特許請求の範囲第1項に記載
のポリペプチド。 11、274から277までの領域の開裂部位に1個ま
たはそれ以上の置換を持つ特許請求の範囲第10項に記
載のポリペプチド。 12、Lys277の置換を持つ特許請求の範囲第11
項に記載のポリペプチド。 13、Lys277のArgによる置換を持つ特許請求
の範囲第12項に記載のポリペプチド。 14、Met525からPro527までの配列を欠く
特許請求の範囲第1項に記載のポリペプチド。 15、5個以下のアミノ酸がN末端から欠失している特
許請求の範囲第1項に記載のポリペプチド。 16、5個以下のアミノ酸がN末端から欠失している特
許請求の範囲第2項−第13項のいずれかに記載のポリ
ペプチド。 17、25個までのアミノ酸がC末端から欠失している
特許請求の範囲第1項−第14項のいずれかに記載のポ
リペプチド。 18、組織プラスミノーゲン活性を持つポリペプチドで
あって、ヒトの組織プラスミノーゲンアクチベーターに
由来し、そしてアミノ酸位置117、184および44
8のうち少なくとも2ヶ所でAsnのGlnによる置換
を持つポリペプチド。 19、組織プラスミノーゲン活性を持つポリペプチドで
あって、ヒトの組織プラスミノーゲンアクチベーターに
由来し、そしてMet525からPro527までを欠
いているポリペプチド。 20、組織プラスミノーゲン活性を持つポリペプチドで
あって、ヒトの組織プラスミノーゲンアクチベーターに
由来し、そしてLys277がArgに置換されている
ポリペプチド。 21、ヒトの組織プラスミノーゲンアクチベーターに由
来し組織プラスミノーゲン活性を持つポリペプチドであ
って、アミノ酸117、184および448の少なくと
も1ヶ所のグリコシル化部位でAsnがGlnに置換さ
れており、Met525からPro527までの配列を
欠いているポリペプチド。 22、ヒトの組織プラスミノーゲンアクチベーターに由
来し組織プラスミノーゲン活性を持つポリペプチドであ
って、アミノ酸117、184および448の少なくと
も1ヶ所のグリコシル化部位でAsnがGlnに置換さ
れており、Lsy277がArgに置換されているポリ
ペプチド。 23、凝血を溶解することにおける組織プラスミノーゲ
ンアクチベーター活性を持つポリペプチドを凝血を溶解
するに充分な量含みまた生理学的に受容可能なキャリア
を含む薬剤組成物であって、該ポリペプチドが天然の組
織プラスミノーゲンアクチベーターの比活性の少なくと
も0.3の比活性を有し、また組織プラスミノーゲンア
クチベーター活性を持つ天然に生じるポリペプチド中の
グリコシル化部位の数を減らすこと、C末端で少なくと
も3個のアミノ酸を欠失させること、または開裂部位の
アミノ酸を置換することの結果として、比活性、活性の
フィブリン依存性、または阻害剤感受性に関して少なく
とも1つの改良された性質を持つポリペプチドである薬
剤組成物。 24、ヒトの組織プラスミノーゲンアクチベーターに由
来し組織プラスミノーゲン活性を持つポリペプチドをコ
ードするDNA配列であって、該ポリペプチドが以下の
うちの少なくとも1つを持つという点でヒトの組織プラ
スミノーゲンアクチベーターと異なるDNA配列:(a
)117−119、184−186および448−45
0のグリコシル化部位の少なくとも2ヶ所の障害;(b
)C末端での少なくとも3個のアミノ酸の欠失;および
(c)ヒトの組織プラスミノーゲンアクチベーターの開
裂部位のアミノ酸の置換。 25、前記グリコシル化部位に前記少なくとも2ヶ所の
障害を持つ特許請求の範囲第24項に記載のDNA配列
。 26、C末端に少なくとも3個のアミノ酸の欠失を持つ
特許請求の範囲第24項に記載のDHA配列。 27、アミノ酸117、184および448の少なくと
も2ヶ所のグリコシル化部位でAsnがGlnに置換さ
れており、Met525からPro527までの配列を
欠いている特許請求の範囲第24項に記載のDNA配列
。 28、アミノ酸117、184および448のグリコシ
ル化部位の少なくとも2ヶ所でAsnがGlnに置換さ
れており、またLys277がArgに置換されている
特許請求の範囲第24項に記載のDNA配列。 29、ヒトの組織プラスミノーゲンアクチベーターの開
裂部位にアミノ酸の置換を持つ特許請求の範囲第24項
に記載のDNA配列。 30、転写の順に、転写と翻訳の開始領域、該開始領域
の転写と翻訳の制御調節下にあるDNA配列、および転
写と翻訳の終結領域を含有する発現構築物であって、該
DNA配列がヒトの組織プラスミノーゲンアクチベータ
ーに由来し組織プラスミノーゲン活性を持つポリペプチ
ドをコードするDNA配列であって、該ポリペプチドが
(a)117−119、184−186および448−
450のグリコシル化部位の少なくとも2ヶ所の障害、
(b)C末端での少なくとも3個のアミノ酸の欠失、お
よび(c)ヒトの組織プラスミノーゲンアクチベーター
の開裂部位のアミノ酸の置換のうちの少なくとも1つを
持つという点でヒトの組織プラスミノーゲンアクチベー
ターと異なるポリペプチドである発現構築物。 31、前記転写と翻訳の発現領域が真核生物で機能的で
ある特許請求の範囲第30項に記載の発現構築物。 32、前記真核生物が哺乳類である特許請求の範囲第3
1項に記載の発現構築物。 33、宿主中で機能的な複製系および発現構築物を含有
するプラスミドであって、該発現構築物が、転写の順に
、転写と翻訳の開始領域、該開始領域の転写と翻訳の制
御調節下にあるDNA配列、および転写と翻訳の終結領
域を含有する発現構築物であって、該DNA配列がヒト
の組織プラスミノーゲンアクチベーターに由来し組織プ
ラスミノーゲン活性を持つポリペプチドをコードするD
NA配列であって、該ポリペプチドが(a)117−1
19、184−186および448−450のグリコシ
ル化部位の少なくとも2ヶ所の障害、(b)C末端での
少なくとも3個のアミノ酸の欠失、および(c)ヒトの
組織プラスミノーゲンアクチベーターの開裂部位のアミ
ノ酸の置換のうちの少なくとも1つを持つという点でヒ
トの組織プラスミノーゲンアクチベーターと異なるポリ
ペプチドであるプラスミド。 34、真核生物宿主中で複製可能な特許請求の範囲第3
3項に記載のプラスミド。 35、前記真核生物宿主が哺乳類である特許請求の範囲
第34項に記載のプラスミド。 36、ヒトの組織プラスミノーゲンアクチベーターに由
来し組織プラスミノーゲン活性を持つポリペプチドであ
って、Lys277がArgに置換されており、またM
et525からPro527までを欠いているポリペプ
チド。 37、ヒトの組織プラスミノーゲンアクチベーターに由
来し組織プラスミノーゲン活性を持つポリペプチドであ
って、アミノ酸位置117、184および448の少な
くとも2ヶ所においてAsnがGlnに置換されており
、Lys277がArgに置換されており、またMet
525からPro527までを欠いているポリペプチド
。 38、プラスミドを含む生育可能な細胞であって、該プ
ラスミドが宿主中で機能的な複製系および発現構築物を
含有するプラスミドであって、該発現構築物が、転写の
順に、転写と翻訳の開始領域、該開始領域の転写と翻訳
の制御調節下にあるDNA配列、および転写と翻訳の終
結領域を含有する発現構築物であって、該DNA配列が
ヒトの組織プラスミノーゲンアクチベーターに由来し組
織プラスミノーゲン活性を持つポリペプチドをコードす
るDNA配列であって、該ポリペプチドが(a)117
−119、184−186および448−450のグリ
コシル化部位の少なくとも2ヶ所の障害、(b)C末端
での少なくとも3個のアミノ酸の欠失、および(c)ヒ
トの組織プラスミノーゲンアクチベーターの開裂部位の
アミノ酸の置換のうちの少なくとも1つを持つという点
でヒトの組織プラスミノーゲンアクチベーターと異なる
ポリペプチドである細胞。 39、前記細胞が真核生物のものである特許請求の範囲
第38項に記載の細胞。 40、前記真核細胞が哺乳類の細胞である特許請求の範
囲第39項に記載の細胞。 41、DNA配列を作成するための方法であって、該D
NA配列がヒトの組織プラスミノーゲンアクチベーター
に由来し組織プラスミノーゲン活性を持つポリペプチド
をコードするDNA配列であり、該ポリペプチドが(a
)117−119、184−186および448−45
0のグリコシル化部位の少なくとも2ヶ所の障害、(b
)C末端での少なくとも3個のアミノ酸の欠失、および
(c)ヒトの組織プラスミノーゲンアクチベーターの開
裂部位のアミノ酸の置換のうちの少なくとも1つを持つ
という点でヒトの組織プラスミノーゲンアクチベーター
と異なるポリペプチドであるDNA配列を作成する方法
であって、以下の工程: (1)組織プラスミノーゲンアクチベーター活性を持つ
天然に生じるポリペプチドをコードする鋳型を含有する
原核生物プラスミドの一本鎖に、117−119、18
4−186および448−450のアミノ酸をコードす
るグリコシル化部位の少なくとも2ヶ所のグリコシル化
部位での障害、C末端での少なくとも3個のアミノ酸の
欠失、または開裂部位のアミノ酸の置換を生じるミスマ
ッチをもつオリゴデオキシヌクレオチドをアニーリング
させて、部分的な二本鎖プラスミドを供する工程であっ
て、 ここで、該オリゴデオキシヌクレオチドが、標的鋳型に
関して85から90%の相補性を有すること、ミスマッ
チされる座位の反対側の相補性領域の融点がほぼ等しい
こと、そして前記変異形成座位以外の前記プラスミドの
どの部位でも70%より低い相補性を持つことにより特
徴づけられる工程;(2)修正能力を欠く DNAポリ
メラーゼにより該オリゴデオキシヌクレオチドを伸長し
て、二本鎖プラスミドを供する工程; (3)該二本鎖プラスミドにより宿主の原核生物細胞を
形質転換し、該細胞を増殖させることにより該二本鎖プ
ラスミドを複製させる工程;および(4)該オリゴデオ
キシヌクレオチドの配列を持つプラスミドを単離する工
程、 を包含する方法。 42、ヒトの組織プラスミノーゲンアクチベーターと実
質的に同じアミノ酸配列を持つポリペプチドであって、
次の生理学的性質の少なくとも1つを持つポリペプチド
:天然に生じるヒトの組織プラスミノーゲンアクチベー
ターと比較して、6.2から7.0の範囲の比活性;1
.3から2.5の範囲のフィブリン依存性;およびプラ
スミノーゲンアクチベーター阻害剤の阻害に対し10か
ら30%の範囲で低下した感受性。 43、6.2から7.0の範囲の比活性を持つ特許請求
の範囲第42項に記載のポリペプチド。 44、約1.3から2.5のフィブリン依存性を持つ特
許請求の範囲第42項に記載のポリペプチド。
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