JP2680999B2 - 新規ペプチドのプラスミノーゲンアクチベーターをコードする核酸を含有する細胞 - Google Patents
新規ペプチドのプラスミノーゲンアクチベーターをコードする核酸を含有する細胞Info
- Publication number
- JP2680999B2 JP2680999B2 JP6186170A JP18617094A JP2680999B2 JP 2680999 B2 JP2680999 B2 JP 2680999B2 JP 6186170 A JP6186170 A JP 6186170A JP 18617094 A JP18617094 A JP 18617094A JP 2680999 B2 JP2680999 B2 JP 2680999B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- plasminogen activator
- polypeptide
- activity
- tpa
- site
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 66
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 title claims description 11
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 title claims description 11
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 title claims description 11
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims 6
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 61
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 61
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 claims abstract description 26
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 claims abstract description 26
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims abstract description 16
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims abstract description 16
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims abstract description 14
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 45
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 27
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 claims description 19
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 claims description 19
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 17
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 16
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 8
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 8
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 3
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 claims description 2
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 61
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 abstract description 21
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 abstract description 21
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 21
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 abstract description 21
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 abstract description 8
- 239000002797 plasminogen activator inhibitor Substances 0.000 abstract description 8
- 102000010752 Plasminogen Inactivators Human genes 0.000 abstract description 7
- 108010077971 Plasminogen Inactivators Proteins 0.000 abstract description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 6
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000001342 plasminogenolytic effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 abstract 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 39
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 33
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 30
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 26
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 25
- 102000013566 Plasminogen Human genes 0.000 description 24
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 description 24
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 21
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 18
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 16
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 16
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 13
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 description 12
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 10
- 230000008859 change Effects 0.000 description 9
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 9
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 9
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 8
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 7
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 6
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 6
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 108010058861 Fibrin Fibrinogen Degradation Products Proteins 0.000 description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 5
- 239000000208 fibrin degradation product Substances 0.000 description 5
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 5
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 5
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 5
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 5
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 4
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 4
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 3
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 3
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 3
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000006884 silylation reaction Methods 0.000 description 3
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 2
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical group CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical group CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Chemical group CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 2
- 102000052812 Ornithine decarboxylases Human genes 0.000 description 2
- 108700005126 Ornithine decarboxylases Proteins 0.000 description 2
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 2
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 2
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- -1 amino Asn Chemical compound 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Chemical group CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 2
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 235000017550 sodium carbonate Nutrition 0.000 description 2
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 description 2
- 101150010939 tpa gene Proteins 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 2
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- UAHFGYDRQSXQEB-PWPYQVNISA-N 4-nle-α-msh Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(C)=O)C1=CC=C(O)C=C1 UAHFGYDRQSXQEB-PWPYQVNISA-N 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 102000004411 Antithrombin III Human genes 0.000 description 1
- 108090000935 Antithrombin III Proteins 0.000 description 1
- 206010003178 Arterial thrombosis Diseases 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000003416 Asparagus officinalis Species 0.000 description 1
- 235000005340 Asparagus officinalis Nutrition 0.000 description 1
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 1
- 101100392772 Caenorhabditis elegans gln-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100289888 Caenorhabditis elegans lys-5 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102100024746 Dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 238000011891 EIA kit Methods 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 101710085030 Gene 32 protein Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 238000005719 Graham synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091027305 Heteroduplex Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000605403 Homo sapiens Plasminogen Proteins 0.000 description 1
- 101000595925 Homo sapiens Plasminogen-like protein B Proteins 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 241000701109 Human adenovirus 2 Species 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 229930190887 Leptomycin Natural products 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 101100278853 Mus musculus Dhfr gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102100039419 Plasminogen activator inhibitor 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100035195 Plasminogen-like protein B Human genes 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 208000010378 Pulmonary Embolism Diseases 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 101710185500 Small t antigen Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 241000984929 Tibeta Species 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 229960005348 antithrombin iii Drugs 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000013602 bacteriophage vector Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000009109 curative therapy Methods 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 108020001096 dihydrofolate reductase Proteins 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- YMTINGFKWWXKFG-UHFFFAOYSA-N fenofibrate Chemical compound C1=CC(OC(C)(C)C(=O)OC(C)C)=CC=C1C(=O)C1=CC=C(Cl)C=C1 YMTINGFKWWXKFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 150000002333 glycines Chemical group 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 229940106780 human fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000000937 inactivator Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000013493 large scale plasmid preparation Methods 0.000 description 1
- YACHGFWEQXFSBS-RJXCBBHPSA-N leptomycin Chemical compound OC(=O)/C=C(C)/C[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)[C@H](C)/C=C(\C)/C=C/C[C@@H](C)\C=C(/CC)\C=C\[C@@H]1OC(=O)C=C[C@@H]1C YACHGFWEQXFSBS-RJXCBBHPSA-N 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000000465 moulding Methods 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 230000000174 oncolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 230000033885 plasminogen activation Effects 0.000 description 1
- ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M potassium thiocyanate Chemical compound [K+].[S-]C#N ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940124272 protein stabilizer Drugs 0.000 description 1
- 238000011536 re-plating Methods 0.000 description 1
- 238000007100 recyclization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 1
- 102220201851 rs143406017 Human genes 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 230000001732 thrombotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N trisodium borate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]B([O-])[O-] BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 108010065822 urokinase inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000010792 warming Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6456—Plasminogen activators
- C12N9/6459—Plasminogen activators t-plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Diabetes (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は，組織プラスミノーゲン
アクチベーター活性を持ち，遺伝子工学の技法により天
然のプラスミノーゲンアクチベーターに比べ改良された
性質を有するポリペプチド，それをコードするDNA 配列
およびその作成法に関する。また本発明は，上記 DNA配
列を含有する発現構築物，それを含有するプラスミド，
および該プラスミドを保持する細胞に関する。さらにま
た本発明は，上記ポリペプチドを含む製剤組成物に関す
る。 【０００２】 【従来の技術】組織プラスミノーゲンアクチベーター(t
PA）は，凝血の溶解に関連のあるセリンプロテアーゼで
ある。この分子は，他の天然に生じるポリペプチドと相
同なアミノ酸配列を示すいくつかの明確な領域を有す
る。Ｎ末端の最初の領域は，フィブロネクチンと相同性
のある領域である。次の領域は，種々の成長因子と相同
性を持つ。この成長因子領域につづいて２つのクリング
ル領域がある。最後に，他のセリンプロテアーゼと類似
性の見られる活性部位がある。 【０００３】組織プラスミノーゲンアクチベーターおよ
びそのin vivoでの凝血溶解能に関連して，少なくとも
４種の異なった特性が存在する。まず第１には，プラス
ミノーゲンを開裂して，フィブリンを分解するプラスミ
ンを生産するプロテアーゼ機能の比活性である。第２の
特性は，プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤の阻害
に対する感受性である。第３の特性は，プラスミノーゲ
ン分解活性におけるプラスミノーゲンアクチベーターの
フィブリン依存性である。第４の特性は，tPAのフィブ
リン表面への結合性である。これらの要因の各々が，凝
血存在下でプラスミノーゲンアクチベーターがプラスミ
ノーゲンをプラスミンに分解するその速さや特異性に役
割をなしている。従って，実質的な問題は，これらのカ
テゴリーに属する一種かそれ以上の特性を改善するよう
な組織プラスミノーゲンアクチベーター活性を有するポ
リペプチドが生産できることにあろう。 【０００４】関連文献の簡単な説明 天然に存在するタンパクの元来の性質を高めるための，
変異処理の利用については，Craik et.al., Science(19
85) 228:291；Rosenberg et al.,Nature(1984) 312:77
-80およびWilkinson et al.,Nature (1984) 307:187-
188に報告されている。Andreasen et al., EMBO J.(19
84)３：51-56 は，tPAの開裂部位でのクリッピングがプ
ロテアーゼ活性に必要であることを報告した。Ny et
al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1984)81：5355は，ヒ
ト tPAの構造と，機能的および構造的ドメインに対する
イントロンとエクソンの相互関係について報告した。A.
J. van Zonneveld et al.,Abstract from ISTH Meet
ing, July 14-19,1985は，ヒトの組織型プラスミノーゲ
ンアクチベーターの構造と機能の相互関係について報告
した。（J. Biol Chem. (1986) 261:14214-14218)Opden
akker et al.,EMBO Workshop on Plasminogen Activat
ion(Amalfi, Italy, October 14-18,1985）は，炭水化
物側鎖の除去による tPA活性への影響について報告し
た。Loskutoff et al., Proc. Natl.Acad. Sci. USA(1
983)80：2956-2960 およびLoskutoff,Thrombos, Haemos
tos, THHADQ, 54(1)：118(S699) は，プラスミノーゲ
ンアクチベーター阻害剤の特性について述べた。 【０００５】 【発明が解決しようとする問題点】tPA分子に欠失や置
換を独立にまたは組み合わせて採用することにより，プ
ラスミノーゲンアクチベーター活性を持つポリペプチド
が提供され，ここでグリコシル化は変化を受け，Ｃ−末
端は不完全となり，開裂部位は修飾されている。その結
果得られた生成物は，プラスミノーゲンを活性化して，
フィブリン塊を溶解したり，凝血形成を妨げたりするの
に使用できることがわかる。これらのポリペプチドは，
部位特異的変異形成によって生成した変異遺伝子を発現
させることによって産生される。 【０００６】 【問題点を解決するための手段】本発明のポリペプチド
は，凝血を溶解することにおける組織プラスミノーゲン
アクチベーター活性を持つポリペプチドであって，天然
の組織プラスミノーゲンアクチベーターの比活性の少な
くとも 0.3の比活性を有し，また組織プラスミノーゲン
アクチベーター活性を持つ天然に生じるポリペプチド中
のグリコシル化部位の数を減らすこと，Ｃ末端で少なく
とも３個のアミノ酸を欠失させること，または開裂部位
のアミノ酸を置換することの結果として，比活性，活性
のフィブリン依存性，または，阻害剤感受性に関して少
なくとも１つの改良された性質を持つ。 【０００７】本発明のポリペプチドは，組織プラスミノ
ーゲン活性を持つポリペプチドであって，ヒトの組織プ
ラスミノーゲンアクチベーターに由来し，そしてアミノ
酸位置117,184および448のうち少なくとも２ヶ所でAsn
のGln による置換を持つ。 【０００８】本発明のポリペプチドは，組織プラスミノ
ーゲン活性を持つポリペプチドであって，ヒトの組織プ
ラスミノーゲンアクチベーターに由来し，そしてMet525
からPro527までを欠いている。 【０００９】本発明のポリペプチドは，組織プラスミノ
ーゲン活性を持つポリペプチドであって，ヒトの組織プ
ラスミノーゲンアクチベーターに由来し，そしてLys277
が Argに置換されている。 【００１０】本発明のポリペプチドは，ヒトの組織プラ
スミノーゲンアクチベーターに由来し組織プラスミノー
ゲン活性を持つポリペプチドであって，アミノ酸117, 1
84および448 の少なくとも１ヶ所のグリコシル化部位で
AsnがGlnに置換されており,Met525からPro527までの配
列を欠いている。 【００１１】本発明のポリペプチドは，ヒトの組織プラ
スミノーゲンアクチベーターに由来し組織プラスミノー
ゲン活性を持つポリペプチドであって，アミノ酸117, 1
84および448 の少なくとも１ヶ所のグリコシル化部位で
AsnがGlnに置換されており，Lsy277がArg に置換されて
いる。 【００１２】本発明の薬剤組成物は，凝血を溶解するこ
とにおける組織プラスミノーゲンアクチベーター活性を
持つポリペプチドを凝血を溶解するに充分な量含みまた
生理学的に受容可能なキャリアを含む薬剤組成物であっ
て，該ポリペプチドが天然の組織プラスミノーゲンアク
チベーターの比活性の少なくとも 0.3の比活性を有し，
また組織プラスミノーゲンアクチベーター活性を持つ天
然に生じるポリペプチド中のグリコシル化部位の数を減
らすこと，Ｃ末端で少なくとも３個のアミノ酸を欠失さ
せること，または開裂部位のアミノ酸を置換することの
結果として，比活性，活性のフィブリン依存性，または
阻害剤感受性に関して少なくとも１つの改良された性質
を持つポリペプチドである。 【００１３】本発明の DNA配列は，ヒトの組織プラスミ
ノーゲンアクチベーターに由来し組織プラスミノーゲン
活性を持つポリペプチドをコードする DNA配列であっ
て，該ポリペプチドが以下のうちの少なくとも１つを持
つという点でヒトの組織プラスミノーゲンアクチベータ
ーと異なる：(a)117-119, 184-186 および448-450 のグ
リコシル化部位の少なくとも２ヶ所の障害；(b)Ｃ末端
での少なくとも３個のアミノ酸の欠失；および，(c)ヒ
トの組織プラスミノーゲンアクチベーターの開裂部位の
アミノ酸の置換。 【００１４】本発明の発現構築物は，転写の順に，転写
と翻訳の開始領域，該開始領域の転写と翻訳の制御調節
下にある DNA配列，および転写と翻訳の終結領域を含有
する発現構築物であって，該DNA配列がヒトの組織プラ
スミノーゲンアクチベーターに由来し組織プラスミノー
ゲン活性を持つポリペプチドをコードする DNA配列であ
って，該ポリペプチドが，(a)117-119, 184-186および4
48-450 のグリコシル化部位の少なくとも２ヶ所の障
害，(b)Ｃ末端での少なくとも３個のアミノ酸の欠失，
および，(c)ヒトの組織プラスミノーゲンアクチベータ
ーの開裂部位のアミノ酸の置換のうちの少なくとも１つ
を持つという点でヒトの組織プラスミノーゲンアクチベ
ーターと異なるポリペプチドである。 【００１５】本発明のプラスミドは，宿主中で機能的な
複製系および発現構築物を含有するプラスミドであっ
て，該発現構築物が，転写の順に，転写と翻訳の開始領
域，該開始領域の転写と翻訳の制御調節下にある DNA配
列，および転写と翻訳の終結領域を含有する発現構築物
であって，該 DNA配列がヒトの組織プラスミノーゲンア
クチベーターに由来し組織プラスミノーゲン活性を持つ
ポリペプチドをコードする DNA配列であって，該ポリペ
プチドが，(a)117-119, 184-186 および448-450のグリ
コシル化部位の少なくとも２ヶ所の障害，(b)Ｃ末端で
の少なくとも３個のアミノ酸の欠失，および，(c)ヒト
の組織プラスミノーゲンアクチベーターの開裂部位のア
ミノ酸の置換のうちの少なくとも１つを持つという点で
ヒトの組織プラスミノーゲンアクチベーターと異なるポ
リペプチドである。 【００１６】本発明のポリペプチドは，ヒトの組織プラ
スミノーゲンアクチベーターに由来し組織プラスミノー
ゲン活性を持つポリペプチドであって，Lys277がArg に
置換されており，またMet525からPro527までを欠いてい
る。 【００１７】本発明のポリペプチドは，ヒトの組織プラ
スミノーゲンアクチベーターに由来し組織プラスミノー
ゲン活性を持つポリペプチドであって，アミノ酸位置11
7, 184および448 の少なくとも２ヶ所において Asnが G
lnに置換されており，Lys277がArg に置換されており，
またMet525からPro527までを欠いている。 【００１８】本発明の細胞は，プラスミドを含む生育可
能な細胞であって，該プラスミドが宿主中で機能的な複
製系および発現構築物を含有するプラスミドであって，
該発現構築物が，転写の順に，転写と翻訳の開始領域，
該開始領域の転写と翻訳の制御調節下にある DNA配列，
および転写と翻訳の終結領域を含有する発現構築物であ
って，該 DNA配列がヒトの組織プラスミノーゲンアクチ
ベーターに由来し組織プラスミノーゲン活性を持つポリ
ペプチドをコードする DNA配列であって，該ポリペプチ
ドが，(a)117-119, 184-186 および448-450 のグリコシ
ル化部位の少なくとも２ヶ所の障害，(b)Ｃ末端での少
なくとも３個のアミノ酸の欠失；および，(c)ヒトの組
織プラスミノーゲンアクチベーターの開裂部位のアミノ
酸の置換のうちの少なくとも１つを持つという点でヒト
の組織プラスミノーゲンアクチベーターと異なるポリペ
プチドである。 【００１９】本発明の方法は， DNA配列を作成するため
の方法であって，該 DNA配列がヒトの組織プラスミノー
ゲンアクチベーターに由来し組織プラスミノーゲン活性
を持つポリペプチドをコードする DNA配列であり，該ポ
リペプチドが，(a)117-119,184-186および448-450 のグ
リコシル化部位の少なくとも２ヶ所の障害，(b)Ｃ末端
での少なくとも３個のアミノ酸の欠失，および，(c)ヒ
トの組織プラスミノーゲンアクチベーターの開裂部位の
アミノ酸の置換のうちの少なくとも１つを持つという点
でヒトの組織プラスミノーゲンアクチベーターと異なる
ポリペプチドである DNA配列を作成するための方法であ
って，以下の工程：(1)組織プラスミノーゲンアクチベ
ーター活性を持つ天然に生じるポリペプチドをコードす
る鋳型を含有する原核生物プラスミドの一本鎖に，117-
119, 184-186および448-450のアミノ酸をコードするグ
リコシル化部位の少なくとも２ヶ所のグリコシル化部位
での障害，Ｃ末端での少なくとも３個のアミノ酸の欠
失，または開裂部位のアミノ酸の置換を生じるミスマッ
チをもつオリゴデオキシヌクレオチドをアニーリングさ
せて，部分的な二本鎖プラスミドを供する工程であっ
て，ここで，該オリゴデオキシヌクレオチドが，標的鋳
型に関して85から90％の相補性を有すること，ミスマッ
チされる座位の反対側の相補性領域の融点がほぼ等しい
こと，そして前記変異形成座位以外の前記プラスミドの
どの部位でも70％より低い相補性を持つことにより特徴
づけられる工程；(2)修正能力を欠く DNAポリメラーゼ
により該オリゴデオキシヌクレオチドを伸長して，二本
鎖プラスミドを供する工程；(3)該二本鎖プラスミドに
より宿主の原核生物細胞を形質転換し，該細胞を増殖さ
せることにより該二本鎖プラスミドを複製させる工程；
および4)該オリゴデオキシヌクレオチドの配列を持つプ
ラスミドを単離する工程，を包含する。 【００２０】本発明の感受性は，ヒトの組織プラスミノ
ーゲンアクチベーターと実質的に同じアミノ酸配列を持
つポリペプチドであって，次の生理学的性質の少なくと
も１つを持つポリペプチド：天然に生じるヒトの組織プ
ラスミノーゲンアクチベーターと比較して，6.2 から7.
0 の範囲の比活性； 1.3から2.5 の範囲のフィブリン依
存性；およびプラスミノーゲンアクチベーター阻害剤の
阻害に対し10から30％の範囲で低下した。 【００２１】以下に本発明を詳細に説明する。 【００２２】プラスミノーゲンアクチベーターとしての
特性が高められた新規ポリペプチドが，そのようなポリ
ペプチドをコードする DNAコード配列，適切な宿主内で
そのような配列を発現させるための発現カセット，新規
ポリペプチドを発現できる宿主，および新規ポリペプチ
ドを生産する方法を含めて，提供される。新規ポリペプ
チドは，少なくともひとつのグリコシル化部位に変化を
含み， 272から280 までの領域，特にPhe274−Arg275−
Ile276−Lys277(FRIK)にある開裂部位に少なくともひと
つの変化を含み，そして／または，分子の一端かまたは
両端，特にＣ−末端の切断を含む。唯一の修飾がグリコ
シル化部位にあるとき， 177-119と184-186 の両方のグ
リコシル化部位は同様にまたは異なって修飾される。
（使用するアミノ酸の番号付けはPennica et al., Nat
ure (1983) 301: 214-221 の報告に基づき，グリシン−
アラニン−アルギニン−セリン−チロシンの配列のセリ
ンから始める。）組織プラスミノーゲンアクチベーター
活性を持ちヒト組織プラスミノーゲンアクチベーターに
由来するポリペプチドにこのような変化を導入すると，
生理学的特性の改善が達成可能である。 【００２３】新規ポリペプチドは，タンパク分解活性，
特にプラスミノーゲン分解活性を増幅しており，プラス
ミノーゲンアクチベーター阻害に対する感受性が低下
し，フィブリン親和性が増加し，そして／またはプラス
ミノーゲン分解活性のフィブリン依存性が増している。 【００２４】興味深い第１の変化は，アミノ酸117-119,
184-186 および448-450 におけるグリコシル化部位の少
なくとも１つの修飾であり，アスパラギンが保存的また
は非保存的に変化しているか，または，セリンかスレオ
ニンが特にグリシン，アラニンあるいはバリンに非保存
的に変化している。特に興味深いのは，117-119 と184-
186 のグリコシル化部位である。興味深い変異には，ア
スパラギンが他のアミノ酸，好ましくはグルタミン，バ
リン，ロイシン，イソロイシン，アラニンまたはグリシ
ン，より好ましくはグルタミンに置換されこと，また
は，セリンかスレオニンが他のアミノ酸，好ましくはア
ラニン，バリンまたはメチオニンに置換されること，つ
まりメルカプト基または中性水酸基をもたない３〜５個
の炭素原子から成る脂肪族アミノ酸に置換されること，
が含まれる。 117と184 におけるグリコシル化部位のア
スパラギンのグルタミンへの置換が特に興味深い。 【００２５】変異生成物特性の所望の変化に応じて，保
存的変化または非保存的変化いずれかが含まれる。保存
的な変化は，アミノ酸間にセミコロンを付して示した。
G,A;V,I,L;D,E;K,R;N,Q;S,T;およびF,W,Y;ここで１つの
グループのアミノ酸が他のグループのアミノ酸または上
に示されていないアミノ酸に置換し，このような変化を
非保存的であると考える。 【００２６】比活性は，分子のグリコシル化量を特にク
リングル構造内のグリコシル化部位，より特別にはＮ−
末端からＣ−末端方向の最初の２つのグリコシル化部位
について減少させると，増幅できることが見出された。 【００２７】欠失，置換，挿入などのようなさまざまな
障害をグリコシル化部位に導入することにより，グリコ
シル化部位の３つ組を変えてグリコシル化部位を破壊す
る。例えば，117-119,184-186 および448 -450のグリコ
シル化部位を同様にまたは異なって修飾する。 【００２８】次に興味深い領域は，アミノ酸の274-278
に生じる開裂部位の修飾である。特に興味深いのは，27
7 のリジンのアルギニンへの置換のような保存的変化で
ある。他の置換としては，276 のイソロイシンのバリ
ン，ロイシン，グリシンまたはアラニンへの置換を含
む。開裂部位の特異的修飾はプラスミノーゲンアクチベ
ーター阻害に対する感受性を減少させ得ることがわか
り，よってこのポリペプチドはin vivoで，天然での阻
害量のプラスミノーゲンアクチベーター阻害剤存在下
で，野生型組織プラスミノーゲンアクチベーターに比べ
て活性を増しているだろう。 【００２９】第３の興味ある変化は，Ｎ末端またはＣ末
端の切断で，特にＣ末端での少なくとも１アミノ酸から
25アミノ酸まで，通常は10アミノ酸まで，より通常には
３アミノ酸までの切断である。Ｎ末端では，セリンから
始まりチロシンに続く１〜５アミノ酸，特に１〜３アミ
ノ酸が切断される。 【００３０】Ｃ末端の切断は，フィブリン依存性を増幅
させ，それによって組織プラスミノーゲンアクチベータ
ーの特異性の増加が達成される。フィブリン依存性を増
加することで，開裂して凝血から離れたプラスミンとな
るプラスミノーゲンの量は実質的に減少し，プラスミン
の副作用は阻止されるであろう。 【００３１】本発明の新規ポリペプチドは，上に述べた
２種，３種またはそれ以上の変化を組み合わせて得られ
る。例えば，117 と184 のグリコシル化部位のアスパラ
ギンのグルタミンによる置換（第１の型の変化例）に加
えて，開裂部位277 のリジンをアルギニンに置換するこ
とによる修飾（第２の型の変化例），またはMet525から
Pro527までの配列の切断（第３型の変化例）を行ってよ
い。 【００３２】いくつかの場合，むしろ tPAを切断するよ
りは，鎖を伸長するか，または末端のアミノ酸を一般に
約１−12アミノ酸，Ｎ末端とＣ末端の１つか両方で伸長
する。付加したアミノ酸はリンカーとしてふるまった
り，特別な免疫応答を供したり，分子の生理学的特性を
修飾したりするであろう。 【００３３】主題のポリペプチドをコードする DNA配列
は，イントロンを含む染色体 DNA，cDNA，合成DNA ，ま
たはそれらの組み合わせを使って，さまざまな方法で調
整される。所望の変異は，遺伝子を適当な細菌の宿主中
に，一本鎖バクテリオファージベクターまたは二本鎖プ
ラスミドベクターを用い，次に野生型配列に実質的に相
補的ではあるが，トランスバージョン，転位，欠失また
は挿入などの所望の変異を含むミスマッチの配列を用い
て，クローニングすることにより達成される。あるい
は，便利な制限酵素切断部位が存在すれば，特別な配列
を削り，変異を含んだ合成配列を導入できる。使用でき
る他の技術は，二本鎖鋳型の部分エキソヌクレアーゼ消
化，またはin vitro でヘテロデュプレックスを形成し
て部分的一本鎖領域をオリゴヌクレオチド−特異的変異
形成にかけることである。 【００３４】特に興味深いのは，オリゴヌクレオチド特
異的変異形成である(Zoller and Smith, Methods Enzy
mol.(1983) 100:468-500.)。 【００３５】欠失や挿入のミスマッチを含んだ適切なオ
リゴヌクレオチド配列としては，一般に約20から100 ヌ
クレオチド(nt)，より一般的には20−60nt持つものを調
製する。この配列は，合成により簡単に調製でき，適当
なクローニングベクターでクローニングできる。このオ
リゴヌクレオチドを，部位特異的変異形成用に tPA遺伝
子か tPA類似体の精製鋳型とアニールさせる。変異は独
立に導入し，変異の部位は約10塩基対(bp)，より一般に
は約20bp分離させる。異なった部位の変異は一段階また
は連続的段階で導入し，各変異後その変異の存在や tPA
類似体の活性への効果を確かめる。 【００３６】変異形成プライマーの設計には，いくつか
の考察が含まれる。一般に，プライマーの長さは，標的
鋳型に対して，約85％より高く約95％より低い相補性を
持つように選択する。これによって，変異形成プライマ
ーによる簡単なプラーク選別が可能となるというさらな
る利点が供される。変異形成プライマーが，欠失を生じ
る場合，通常欠失の各端に少なくとも約20bpの相補性が
存在するであろう。また，プライマーは，変異座位の両
端において，だいたい等しい融点を供する必要がある。
さらに考えると，プライマーは鋳型上の不適当な部位か
らのプライミングを，もし除かない場合は，最少にする
よう選択されるべきである。実際，変異座位以外のあら
ゆる部位において，相補性は70％より低く，好ましくは
60％より低くあるべきである。従って，問題とする遺伝
子のみならず，クローニングベクターについても考える
べきである。特に考えなければならないことは，プライ
マーの3'末端での相補性である。 【００３７】便宜上，ベクターは，たとえばM13 のよう
な一本鎖状 DNAウィルス，特にベクターとして利用する
ため修飾されたものである。便利なウィルスベクターは
M13mp9である。変異形成プライマーを鋳型やベクター
と，必要なヌクレオチドおよびT4DNA リガーゼ存在下
で，クレノー断片やT4DNA ポリメラーゼのような修正能
力を欠いた適当なポリメラーゼ存在下，アニーリング条
件のもとに一緒にして，それによって遺伝子を保持する
環状ベクターが複製可能となり，二本鎖複製型が供され
る。次いで二本鎖 DNAを適当な細胞に導入する。溶解性
ベクターを供給することで，変異形成が生じたtPA また
は tPA類似体の存在をプライマーを使って選別できるプ
ラークを得る。通常，変異形成産物としての正確な配列
を持つ可能性を増すためには，感度を増加させた，少な
くとも２回のくり返し選別が必要であろう。 【００３８】次に推定上正のクローンを，例えばプラー
ク精製，電気泳動的精製などして，精製し，次いで配列
決定する。 【００３９】配列決定のために，少なくとも長さが約20
から30塩基で変異座位から少なくとも約55塩基離れた位
置でアニールするであろう配列決定プライマーを設計す
る。正確な配列の妥当な保証を得るためには，変異座位
の両側少なくとも約50塩基を含む領域を配列決定するこ
とが望ましい。 【００４０】一度正確に変異形成した遺伝子が得られた
ら，それを単離し，適切な宿主中で発現させるために適
切な発現ベクターに挿入する。 【００４１】哺乳類，昆虫および鳥類宿主に利用する発
現ベクターには，広範囲の種類が存在する。例えば，こ
こで参考文献として採用するEPA 0,092,182 に述べられ
ているものを参照せよ。特に興味深いのは哺乳類ベクタ
ーで，これはシミアンウィルス，ウシ乳頭腫ウィルス，
アデノウィルスなどのようなウィルスのレプリコンを使
用する。 【００４２】転写や翻訳の開始および終結制御領域は，
天然上 tPA遺伝子に関連する領域，ウィルスの構造遺伝
子由来の領域または宿主遺伝子由来の領域である。多く
のプロモーターが利用可能である。例えば，SV40の初期
および後期プロモーター，アデノウィルスの主要後期プ
ロモーター，β−アクチンプロモーター，ヒトCMV Imme
diate Early 〔IE1〕プロモーターなどである。望まし
くは，プロモーターは，発現を向上させるために，エン
ハンサーとともに使う。 【００４３】多くの場合 tPA発現構築物を増幅すること
が望ましい。増幅または他の理由のために，発現構築物
を染色体に組み込ませることが望ましい。この目的のた
めには，構築物は不安定な複製系，例えば酵母ars １と
結合されるか，あるいは複製系を欠くであろう。組み込
みについては例えばAxeland Wigler, 米国特許第4,399,
216 号を参照せよ。通常，マーカー発現構築物は主題の
発現構築物とタンデムであろうし，そのマーカーは増幅
遺伝子と同じでも異なったものでもよい。これは，発現
構築物とタンデムであり，tPA発現構築物と同じ宿主内
で機能を持ち，そしてDHFR（ジヒドロ葉酸還元酵素），
TK（チミジンキナーゼ），MT−Ｉおよび−ＩＩ（メタロ
チオネイン，例えばヒト）,ODC（オルニチン脱炭酸酵
素）のような増幅可能な遺伝子をコードするような tPA
を有することによって達成できる。増幅可能遺伝子に従
って宿主に圧力をかけることにより，例えばDHFRならば
メトトレキセートで圧力をかけることによって，主題の
発現構築物は増幅される。 【００４４】用いる特別な宿主やシグナル配列に従っ
て，発現された tPA類似体は宿主細胞質内に保持される
かまたは分泌されるであろう。細胞質内に保持される場
合， tPA類似体は常法に従って宿主細胞をを溶解するこ
とにより単離し，抽出および精製法，好ましくは電気泳
動法，クロマトグラフィーのような方法を使用して精製
する。tPAが分泌される場合，分泌された tPAは，アフ
ィニティクロマトグラフィーを含む従来の方法に従って
上澄液から単離できる。 【００４５】本発明で使用するポリペプチドの特性を組
み合わせると， tPAのよううな天然のプラスミノーゲン
アクチベーターよりも優れている。これらのポリペプチ
ドは，天然の tPAに対して少なくとも0.6 倍，しばしば
少なくとも 0.7倍，通常は少なくとも 1.0倍，一般に約
1.1−7.0 倍，そして好ましくは約 6.2から7.0 倍の比
活性を持つであろう。活性のフィブリン依存性は，天然
の tPAに対して少なくとも 0.4倍，しばしば少なくとも
約 0.6倍，通常は少なくとも約 0.7倍，そして好ましく
は少なくとも約１−2.5 倍で特に1.3 から2.5 倍であろ
う。プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤に対する感
受性は，通常天然の tPAよりも高くはなく，天然の tPA
の感受性に基づいて好ましくは，約５％低下し，より好
ましくは約10％低下から約90％低下までの範囲に及び，
特に天然の tPAより約25−90％低下しているであろう。
この主題化合物は通常，野生型 tPAよりも少なくとも１
つの見地においては優れているであろう。（試験法につ
いては実験の項を参照）。特に興味深いのは，組織プラ
スミノーゲンアクチベーター活性を持ち，実質的にヒト
tPAと同じアミノ酸配列（置換，欠失および挿入を含む
相異が10％より低い，通常は５％より低い）を持ってい
るポリペプチドである。これらのポリペプチドは以下の
性質の少なくとも１つを持っているであろう。(a)比活
性が天然 tPAの比活性の少なくとも約 0.6倍，しばしば
少なくとも約 0.7倍，通常は少なくとも約 1.0倍，一般
に約 1.1から7.0 倍，そして好ましくは約 6.2から7.0
倍である。(b)フィブリン依存性が天然 tPAの少なくと
も 0.4倍，しばしば少なくとも約 0.6倍，一般には少な
くとも約 0.7倍，そして好ましくは少なくとも約 1.0か
ら2.5 倍，特に約1.5 から2.5 倍である。(c)ヒトプラ
スミノーゲンアクチベーター阻害剤による阻害に対する
感受性の低下が天然 tPAの感受性に比較して約５％であ
り，より好ましくは約10％の低下から約90％の低下の範
囲におよび，そして特に天然 tPAよりも約25から90％低
下している。 【００４６】主題のポリペプチドは，さまざまな血管の
状態や病気に対する予防処置または治療処置においてさ
まざまな方法で特異的に使用され，哺乳類宿主，特にヒ
ト宿主における血栓形成を防ぐであろう。従って，宿主
が凝血形成に感受性である場合はこれを手術中に投与し
てよく，あるいは血栓患者の処置用に投与してもよく，
これにより，深い動脈血栓，肺塞栓，頭蓋血栓および冠
状動脈血栓内に形成している凝血を溶解する。 【００４７】主題化合物は，腸管によって，または非経
口的に，特に注射または注入によって投与する。これら
の化合物は，ゼラチン，ゼラチン誘導体のグループから
選択されるタンパク安定化剤，アルブミンのような保護
タンパク，糖，糖アルコールまたはアミノ酸の存在下，
水，生理食塩水または適当な緩衝系のような生理的に受
容可能な支持体中にその有効量を単独であるいは他の治
療薬，特に血管病用薬と組み合わせて投与できる。次の
実施例は，説明のためであり，決してこれに限定されな
い。 【００４８】 【実施例】材料および方法 変異形成は，以下で述べるように一部変更した。Zoller
and Smith, Meth. Enzymol. (1983) 100 : 468-500 ，
で述べられている手順を用いて行った。合成DNA 変異形
成と配列決定プライマーは，N, N−ジイソプロピルホス
ホロアシダイトを用いて，Urdea et al., Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA (1983) 80 : 7461-7465で述べられ
ているようなシリカ支持体上での自動オリゴヌクレオチ
ド合成により調製した。配列決定プライマーを，バクテ
リオファージ M13でのジデオキシヌクレオチド連鎖末端
法（F. Sanger, S. Nicklen and A. R. Coulson, Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA (1977) 74 : 5463)による配
列決定用に設計した。配列決定プライマーは，長さが一
般的に20から30塩基で M13mp9 組み換え鋳型に相補的で
あり，しかも変異座位から少なくとも55塩基離れた位置
でアニールするように設計した。以下の表は，変異形成
や配列決定に用いるオリゴマーを示している。 【００４９】 【表１】 【００５０】変異の効果 1. Asn 117 → Gln, Asn 184 → Gln 2. Met 525から Pro 527までの欠失 3. Lys 277 → Arg 4. Lys 277 → Arg, Arg 275 → Lys 5. Asn 177 → Gln, Asn 184 → Gln, Asn 448 → Gln 配列決定プライマー 1a. ACCTTGCCTATCAGGATCAT 1b. CGAATCGCCCTGGCAGGCGTC 2. GTGGGTCTGGAGAAGTCTGTA 3, 4. GCACAGGAACCGCTCTCCGGG 5. TCGATCTGGGTTTCTGCAGTAGTTGTGGTT M13／tPA 組み換え体の変異形成は，精製した鋳型を用
い，適当なプライマーをアニーリングしそしてT4ポリメ
ラーゼのクレノー断片で伸長させることにより行った。
変異体１は，両プライマー１ａおよび１ｂを用いて変異
処理一回の操作で得た。変異体４は， 125μg ／mlの遺
伝子32タンパク，および挿入体に隣接する M13配列に結
合するヘルパープライマーの存在下で，変異体３に由来
する鋳型を用いて得た。プライマー４の効果（Arg 275
→ Lys）とプライマー３の効果（Lys 277 →Arg)を組み
合わせることにより，上に示した２ヶ所の変異部位を形
成した。変異体５は変異体１に由来する鋳型を用いて得
た。プライマー１ａと１ｂの効果（Asn 117 → Gln，As
n 184 → Gln）をプライマー５の効果（Asn 448 →Gl
n）と組み合わせて，上に示した３ヶ所の変異部位を形
成した。 JM101細胞へのトランスフェクション（Zoller
and Smith,上記）に続き，プラークを 200−1000プラ
ーク／プレートの濃度に増殖させ，フィルターに釣り上
げ，適当な変異形成プライマーあるいはプローブでハイ
ブリダイゼーションにより選別した。これらのプラーク
のうち10から40パーセントを，推定上陽性の候補として
まず同定した。ファージのドットブロットハイブリダイ
ゼーションによる各実験から，この推定物からおよそ６
個を再選別することにより，強い候補が得られた。これ
らのファージを低濃度で再度プレーティングすることに
よりプラークを純化し，ニトロセルロースフィルターに
移し，プライマーと再度ハイブリダイゼーションした。
推定上陽性のクローンの DNA配列を，適当なプライマー
と鋳型調製物を用いて決定した。 【００５１】変異形成座位と隣接区分（すなわち，少な
くとも50塩基）を DNA配列分析により確認した直後，複
製型（RF） DNAを SalＩ制限エンドヌクレアーゼで分解
し，SalＩで前もって分解してアルカリ性ホスファター
ゼ処理した哺乳類発現ベクターpSV7d に挿入した。この
ベクターは，tPA cDNA発現用のSV40初期プロモーターと
エンハンサー，SV40ポリアデニル化部位，および COS細
胞でベクターに用いるためのSV40複製起点を供する。 【００５２】プラスミド pSV7dを以下の様に構築した。
SV40複製起点および初期プロモーターを含む 400bpの B
amHＩ／HindＩＩＩ断片を pSVgtＩ（Mulligan, R.et a
l.,J. Mol. Cell Biol. 1 : 854-864 (1981)）より切出
し，精製した。SV40ポリＡ付加部位を含む 240bpのSV40
BclＩ／ BamHＩ断片を，pSV2／dhfr（Subramani et a
l., J. Mol. Cell Biol. 1 : 584-864 (1981)）より切
出し，精製した。これら断片を以下のリンカーを介して
融合した。 【００５３】 このリンカーは３つのすべての読み取り枠中の停止コド
ンと同様に，５個の制限部位を含む。SV40複製起点，SV
40初期プロモーター，停止コドン付きポリリンカーおよ
びSV40ポリアデニル化部位を含む生じた 670bpの断片
を，およそ 1.5kbの欠失のあるpBR322誘導体である pML
の（Lusky and Botchan, Cell 36 : 391 (1984) ）の
BamHＩ部位にクローン化し，pSV6を得た。pSV6の pML配
列中の EcoRI部位と EcoRV部位を， EcoRIと EcoRVでの
分解により除去し，各末端の約 200bpを除くために Bal
31ヌクレアーゼで処理し，そして最終的に再連結して p
SV7aを得た。 Bal31による切除も， EcoRV部位よりおよ
そ 200bp離れた，SV40領域の周辺にある１つの BamHＩ
制限部位を除去した。SV40領域にある第２の BamHＩ部
位を除去するため， pSV7aを，複製起点から上流の pML
配列中で切断する NruＩで分解した。これを，平滑末端
連結により再環化し，pSV7b を得た。 【００５４】pSV7cと pSV7dは連続したポリリンカー置
換を示す。初めに， pSV7bを StuＩと XbaＩで分解し
た。それから，次のリンカーをベクターに連結し， pSV
7Cを得た。 【００５５】 その後， pSV7cを BglＩＩと XbaＩで分解し，それから
次のリンカーと連結しpSV7dを得た。 【００５６】 ベクター内でのクローン化断片の適切な方向を制限部位
解析で引き出した。変異を， SalＩと EcoRＩに対する
制限解析により，また変異座位に対し高度に特異的な適
切なプローブを用いたそのような断片のサザンブロッテ
ィングにより再確認した。 【００５７】組合せ変異体 次の４つの組合せ変異体を組み換え DNA技術を用いて構
築した：変異１および２の両方を含む変異体６，変異１
および３の両方を含む変異体７，変異２および３の両方
を含む変異体８，および３つの変異１，２および３をす
べて含む変異体９。変異の各々は便利な制限エンドヌク
レアーゼ部位により分離されており，これにより，以前
に単離した変異体１，２および３の断片由来の所望の変
異の会合が促進された。各変異体の構築に用いた特異的
な戦略を以下で述べる。 【００５８】大規模なプラスミド調製を，記載の変異体
構築のすべてに対して行った。そのDNAを組織培養細胞
へのトランスフェクションに用いた。 【００５９】変異体６ 変異体１の1.72キロ塩基（kb）の BamHＩから BstEＩＩ
までの断片は，変異させた部位Asn 117 → GlnとAsn 18
4 → Glnの両方を含む。 【００６０】この断片を，Met525からPro527までの欠失
の所望変異を含む変異体２の3.38kbの BamHＩから BstE
ＩＩまでの断片に連結した。この連結混合液を，コンピ
テントなエセリシア・コリを形質転換するのに用いた。
生じたアンピシリン耐性コロニーのいくつかを増殖さ
せ，その DNAを，サイズにより，また各変異領域に特異
的な 32P末端標識化オリゴヌクレオチドプローブによる
DNAのサザンブロットのDNAハイブリダイゼーション解
析により選別した。このようなクローンは，もし２つの
個々の変異体１の領域のオリゴヌクレオチドの各々，お
よび変異体２特異的プローブにハイブリダイズするなら
ば，陽性として記録した。この選別法を，各新しい構築
に対し適切なオリゴヌクレオチドプローブの置換によ
り，各々の構築物について用いた。使用した特異的オリ
ゴヌクレオチドは以前に挙げた。 【００６１】変異体７（１＆３） 変異させた部位を両方含む変異体１の2.95kb ScaＩ断片
を，lys 277 → Argの変換を含む変異体３の2.15kb Sca
Ｉ断片に連結した。新構築の選別を，変異体３の変化お
よび変異体１の変換の各々に特異的なオリゴヌクレオチ
ドを用いて行った。 【００６２】変異体８（２＆３） 所望の変換を含む変異体２の3.38kbの BamHＩから BstE
ＩＩまでの断片を，Lys 277 → Arg変異を含む変異体３
の1.72kbの BamHＩから BstEＩＩまでの断片に連結し
た。正しい組み換え体の選別を，各変異に特異的なオリ
ゴヌクレオチドを用いて行った。 【００６３】変異体９（１＆２＆３） 三重変異体の形成戦略として，新しく構築した二重変異
体の１つである変異体７を使用した。このプラスミドを
BamHＩと BstEＩＩで開裂し，両変異体を含む1.72kbの
断片を単離した。変異体２からのプラスミド DNAを同じ
制限酵素で分解し，3.38kbの細片（変異を含む）を単離
した。 【００６４】これら２つの断片を連結し，この連結混合
液を用いてコンピテントなエセリシア・コリを形質転換
した。正確な三重変異体の選別は， DNA中の各変異部位
に特異的なオリゴヌクレオチドを用いて，上記の様に行
った。 【００６５】哺乳類細胞のトランスフェクション COS-7細胞（Gluzman, Cell (1981) 23 : 175）を，Gra
ham and van der Eb,Virology (1973) 52 : 456-467で
述べられている手順を一部変更して用いて，pSV7d tPA
発現プラスミドでトランスフェクションした。サンプル
を２通りでディッシュに加え，二酸化炭素恒温器（37
℃）中，６時間，細胞上に固定させた。６時間後，上澄
液を吸引し，細胞をCaとMgのないリン酸緩衝生理食塩水
（PBS-CMF)で穏やかにゆすぎ，そして 3.5−４分間，ア
ジュバントとしての15％グリセロールにディッシュをさ
らした。ゆすいで， 4.5mg／mlグルコース， 3.7mg／ml
Na2CO3 ， 292μg ／mlグルタミン， 110μg ／mlピル
ビン酸ナトリウム，100U／mlペニシリン，100U／mlスト
レプトマイシン，および10％胎児ウシ血清（FCS)を添加
したDMEM培地を供給した後，培地を胎児ウシ血清を欠く
培地と置き換えた。血清を除去して12時間後，下で述べ
るカゼイン−プラスミノーゲン−寒天重層を用いて，細
胞を tPAの発現について分析した。最大発現は，トラン
スフェクション開始後36と48時間の間で観察された。 【００６６】CHO dhfr-細胞（Urlaub and Chasin, Pro
c. Natl.Acad. Sci. USA (1980) 77: 4216 ）を，栄養
培地（1.18mg／ml Na2CO3 ， 292μg ／mlグルタミン，
110μg ／mlピルビン酸ナトリウム，100U／mlペニシリ
ン，100U／mlストプトマイシン， 150μg ／mlプロリン
および10％ FCSを添加した F12）中でトランスフェクシ
ョンする前日に，10cmディッシュあたり５×105 から10
6 の細胞の濃度で塗布した。上で述べたトランスフェク
ション手順を，tPA 発現プラスミドをアデノウィルス主
要後期プロモーターにより働くdhfr遺伝子を選択マーカ
ーとして持つプラスミドと混ぜたという一部の変更を加
えて用い，リン酸カルシウムでプラスミドを共沈澱させ
た。dhfr遺伝子を持つプラスミドは，アデノウィルス-2
由来の主要後期プロモーター（Ad-MLP, 地図単位16−1
7.3）をマウスのdhfr cDNA の5'末端に融合させること
により構築した。SV40初期領域ポリアデニル化部位と S
V40小ｔ抗原に対するイントロンをコードしている DNA
を pSV2-neo （Southern andBerg, J. Mol. Appl. Gen
et. (1982) 1 : 327-341 ）より得，dhfr cDNA の3'末
端に融合した。これらの３つの区分をpBR322にサブクロ
ーン化し，プラスミドAd−dhfrを得た。DNA を細胞に添
加後48時間，細胞を選択培地（上記のようにプロリンと
胎児ウシ血清を添加した，あるいは透析した胎児ウシ血
清を添加したDMEM培地）に１：20となるように分配し
た。選択培地で１−２週間増殖後，コロニーが現れ，カ
ゼイン−プラスミノーゲン−寒天重層分析により tPA生
産を検定し，またカゼイン−プラスミノーゲンプレート
で定量分析した。 【００６７】各変異体の細胞系を， 200cm3ディッシュ
中で融合するまで増殖させ，無血清培地（DMEM）中で24
時間の間保温し，そして上澄液を以下で述べるように処
理して，プラスミノーゲンアクチベーター活性を有する
ポリペプチドを精製した。 【００６８】次の手順は上で述べた６つのポリペプチド
の活性を決定するために用いた。 【００６９】変異タンパクの比活性を決定するために
は，サンプルの抗原濃度を定量することが必須だった。
ポリクローナル抗体を用いる EIA−キット（American D
iagnostica, Inc., Greenwich, CT）を用いた。検査
は，キットに供されているプロトコール中に述べられて
いる条件下で厳密に行い，各サンプルの５希釈物を分析
した。結果は，少なくとも３つの測定できる希釈物の平
均として表した。 【００７０】プラスミノーゲンアクチベーター活性をも
つ変異タンパクの濃度 すべての細胞培養上澄液を0.01％Tween 80TMと0.01％Na
−アジドにした。次いで上澄液（50ml）を，３mlの Hep
arin-SepharoseRの存在下で室温，30分間，保温した。
Heparin-Sepharose懸濁液をカラムに充填し， 0.1M リ
ン酸塩，0.01％Tween80TMを含む緩衝液（pH 7.5）20ml
でよく洗浄した。最終的には， tPA活性は，0.05M トリ
ス−HCl ，１M KSCNおよび0.01％Tween 80TMを含む緩衝
液（pH 7.5）で溶出した。次いで溶出物を，0.01％ Twe
en 80TMと0.01％Na−アジドを含むリン酸緩衝液（0.05M
，pH 7.5）５L に対して４℃，16時間透析した。tPA
サンプルを１mlずつ−25℃で凍結した。 【００７１】凝血溶解検査（CLT) 凝血溶解検査を，凝固時間の代わりに溶解時間を記録す
るために一部変更されている“KC 10-Koagulo-meter ”
（Amelung, FRG）を用いて行った。 【００７２】すべての試薬を37℃で予備保温した。 tPA
標品，ポリペプチド検査サンプルおよびフィブリノーゲ
ンを，１％ HaemaccelTM（pH 7.4）を含むリン酸緩衝液
（0.67M ）中で必要とする濃度にまで希釈した。 tPA標
品あるいはサンプルの 0.2mlを，0.2 mlのヒトプラスミ
ノーゲン（10CTA／ml），0.5mlのウシフィブリノーゲン
（0.15％）および最終的に 0.1mlのトロンビン（10IU／
ml）と混合した。溶解時間を記録し，検量曲線を用いて
tPA単位で表した。各変異タンパクの活性を少なくとも
３回分析し，平均を計算した。分析すべきサンプルの各
々について tPAの標品の４種の希釈を行った。 【００７３】プラスミノーゲン溶解検定 変異タンパクのプラスミノーゲン溶解活性を，Ranby et
al.,Thromb. Res.(1982)27：743-749 で述べられてい
る放物線検定を用いて分析した。全試薬を37℃で予備保
温した。tPA標品あるいはtPA サンプルの 0.1mlを， 0.
5mlの緩衝液(0.1％Tween 80TMと0.01％Na−アジドを含
む0.1Mトリス−HCL, pH 7.5)， 0.1mlの基質(S 2251(H-
D-Val-Leu-Lys-（パラ−ニトロアニリド）(Kabi AB, Sw
eden))，３mM), 0.1mlのヒトプラスミノーゲン（1CTA／
ml）および0.1 mlのフィブリン分解産物（10mg／ml）と
混合した。最終的には，混合液を37℃，45分間保温し
た。反応は 0.1mlの酢酸（50％）を加えて停止させ，光
学濃度を 405nmで読んだ。得られた検量曲線を用いてサ
ンプルの光学濃度を単位に変換した。結果は，少なくと
も５個の測定可能な希釈物の平均で表した。 【００７４】さらに，同様の検査をフィブリン分解産物
（FDP)の不在下で行った。この場合， 0.5mlの代わりに
0.6mlの緩衝液が必要であった。 【００７５】活性のフィブリン依存性 tPA および変異ポリペプチドがプラスミノーゲンをプラ
スミンに活性化する能力に対する補因子（フィブリンあ
るいはフィブリン分解産物（FDP)の影響を，凝血溶解検
査あるいはフィブリン依存性プラスミノーゲン溶解検定
で得た活性と，フィブリン非依存性プラスミノーゲン溶
解検定で決定した活性との比で表した。フィブリン凝血のフィブリン−アフィニティー調製 ヒトのフィブリノーゲン（ 0.3％） 0.2ml量をプラスチ
ック管に入れ， 0.005mlのウシのトロンビン（500IU/m
l）と混合した。混合液を37℃で30分間静置させた。反
応終了後，凝血を注意深く除去し，抗トロンビンＩＩＩ
（３IU/ml）とヘパリン（40IU/ml）を含む２mlの緩衝液
（0.1Mトリス−HCl, pH 8.0）中で37℃，30分間保温し
た。最終的に，凝血を除去し，50mlの緩衝液（0.05M ト
リス−HCl ，0.1M NaCl, pH 7.5)に対して20分間，２回
透析した。使用前に，凝血をまわりの溶液より除いた。 【００７６】検査手順 すべてのサンプルをまず， 0.1％ Tween80TMを含むトリ
ス緩衝液（0.1M, pH 7.5）に200ng/mlとなるように希釈
した。その後サンプルを，５％ヒトアルブミンを含む同
じ緩衝液に，最終濃度100ng/mlとなるように希釈した。
続いて，0.4mlのサンプルをフィブリン凝血存在下，室
温にて10分間保温した。最後に溶液を除き，流体相中の
抗原濃度をEIAで決定した。この実験を各サンプルにつ
き２回行った。 【００７７】阻害検査 サンプルを， 0.1％ Tween80TMを含むトリス緩衝液（0.
1M, pH 7.5）に最終濃度100ng/mlになるように希釈し
た。 【００７８】次いで 0.2ml量を，65ウロキナーゼ阻害単
位／mlの濃度でプラスミノーゲンアクチベーター阻害剤
を含む溶液 0.2mlと混合した。対照実験では，上で述べ
たポリペプチドのサンプルを 0.2mlの緩衝液（ 100％）
と混合した。混合液を10分間，37℃で保温した。保温時
間終了時点でサンプルを素早く希釈し，残存活性をフィ
ブリン依存性プラスミノーゲン溶解検定で分析した。こ
の阻害検査は各サンプルにつき２回行った。阻害感受性
を阻害されている％活性として表した。 【００７９】プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤を
ヒトの胎盤より精製した。阻害画分は，いかなるタンパ
ク分解活性も，またプラスミン，トロンビンもしくはト
リプシンの阻害活性も含まない。 【００８０】変異タンパクの上記検定による値を表ＩＩ
にまとめて示す。 【００８１】 【表２】【００８２】 【表３】【００８３】上の結果より，野生型tPA アミノ酸配列に
変化を生じることにより実質的な利点を達し得ること
が，明白である。従って，活性を増加させることができ
るだけでなく，同時にプラスミノーゲンアクチベーター
阻害剤に対する感受性を低下させることができ，これに
より効果的な活性について全体として非常に実質的な増
加がイン ビボで達成できる。また酵素は，増強された
フィブリン依存性を供するという点において実質的によ
り特異的にすることができ，従って凝血の不在下ではそ
れは実質的に低下した活性を有する。よって，タンパク
（あるいは酵素）の血流中のレベルを最小にし，またtP
A の望ましくない副作用を実質的に減らすために，プラ
スミノーゲンアクチベーター活性を持つこれらのポリペ
プチドはより小量で投与でき，しかも凝血に対し増加し
た活性を供する。 【００８４】前述の本発明を，理解を明確にするため
に，図解と実施例により幾分詳細に述べるが，ある程度
の変化や一部変更は，添付の特許請求の範囲内で行われ
得ることは明白であろう。
アクチベーター活性を持ち，遺伝子工学の技法により天
然のプラスミノーゲンアクチベーターに比べ改良された
性質を有するポリペプチド，それをコードするDNA 配列
およびその作成法に関する。また本発明は，上記 DNA配
列を含有する発現構築物，それを含有するプラスミド，
および該プラスミドを保持する細胞に関する。さらにま
た本発明は，上記ポリペプチドを含む製剤組成物に関す
る。 【０００２】 【従来の技術】組織プラスミノーゲンアクチベーター(t
PA）は，凝血の溶解に関連のあるセリンプロテアーゼで
ある。この分子は，他の天然に生じるポリペプチドと相
同なアミノ酸配列を示すいくつかの明確な領域を有す
る。Ｎ末端の最初の領域は，フィブロネクチンと相同性
のある領域である。次の領域は，種々の成長因子と相同
性を持つ。この成長因子領域につづいて２つのクリング
ル領域がある。最後に，他のセリンプロテアーゼと類似
性の見られる活性部位がある。 【０００３】組織プラスミノーゲンアクチベーターおよ
びそのin vivoでの凝血溶解能に関連して，少なくとも
４種の異なった特性が存在する。まず第１には，プラス
ミノーゲンを開裂して，フィブリンを分解するプラスミ
ンを生産するプロテアーゼ機能の比活性である。第２の
特性は，プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤の阻害
に対する感受性である。第３の特性は，プラスミノーゲ
ン分解活性におけるプラスミノーゲンアクチベーターの
フィブリン依存性である。第４の特性は，tPAのフィブ
リン表面への結合性である。これらの要因の各々が，凝
血存在下でプラスミノーゲンアクチベーターがプラスミ
ノーゲンをプラスミンに分解するその速さや特異性に役
割をなしている。従って，実質的な問題は，これらのカ
テゴリーに属する一種かそれ以上の特性を改善するよう
な組織プラスミノーゲンアクチベーター活性を有するポ
リペプチドが生産できることにあろう。 【０００４】関連文献の簡単な説明 天然に存在するタンパクの元来の性質を高めるための，
変異処理の利用については，Craik et.al., Science(19
85) 228:291；Rosenberg et al.,Nature(1984) 312:77
-80およびWilkinson et al.,Nature (1984) 307:187-
188に報告されている。Andreasen et al., EMBO J.(19
84)３：51-56 は，tPAの開裂部位でのクリッピングがプ
ロテアーゼ活性に必要であることを報告した。Ny et
al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1984)81：5355は，ヒ
ト tPAの構造と，機能的および構造的ドメインに対する
イントロンとエクソンの相互関係について報告した。A.
J. van Zonneveld et al.,Abstract from ISTH Meet
ing, July 14-19,1985は，ヒトの組織型プラスミノーゲ
ンアクチベーターの構造と機能の相互関係について報告
した。（J. Biol Chem. (1986) 261:14214-14218)Opden
akker et al.,EMBO Workshop on Plasminogen Activat
ion(Amalfi, Italy, October 14-18,1985）は，炭水化
物側鎖の除去による tPA活性への影響について報告し
た。Loskutoff et al., Proc. Natl.Acad. Sci. USA(1
983)80：2956-2960 およびLoskutoff,Thrombos, Haemos
tos, THHADQ, 54(1)：118(S699) は，プラスミノーゲ
ンアクチベーター阻害剤の特性について述べた。 【０００５】 【発明が解決しようとする問題点】tPA分子に欠失や置
換を独立にまたは組み合わせて採用することにより，プ
ラスミノーゲンアクチベーター活性を持つポリペプチド
が提供され，ここでグリコシル化は変化を受け，Ｃ−末
端は不完全となり，開裂部位は修飾されている。その結
果得られた生成物は，プラスミノーゲンを活性化して，
フィブリン塊を溶解したり，凝血形成を妨げたりするの
に使用できることがわかる。これらのポリペプチドは，
部位特異的変異形成によって生成した変異遺伝子を発現
させることによって産生される。 【０００６】 【問題点を解決するための手段】本発明のポリペプチド
は，凝血を溶解することにおける組織プラスミノーゲン
アクチベーター活性を持つポリペプチドであって，天然
の組織プラスミノーゲンアクチベーターの比活性の少な
くとも 0.3の比活性を有し，また組織プラスミノーゲン
アクチベーター活性を持つ天然に生じるポリペプチド中
のグリコシル化部位の数を減らすこと，Ｃ末端で少なく
とも３個のアミノ酸を欠失させること，または開裂部位
のアミノ酸を置換することの結果として，比活性，活性
のフィブリン依存性，または，阻害剤感受性に関して少
なくとも１つの改良された性質を持つ。 【０００７】本発明のポリペプチドは，組織プラスミノ
ーゲン活性を持つポリペプチドであって，ヒトの組織プ
ラスミノーゲンアクチベーターに由来し，そしてアミノ
酸位置117,184および448のうち少なくとも２ヶ所でAsn
のGln による置換を持つ。 【０００８】本発明のポリペプチドは，組織プラスミノ
ーゲン活性を持つポリペプチドであって，ヒトの組織プ
ラスミノーゲンアクチベーターに由来し，そしてMet525
からPro527までを欠いている。 【０００９】本発明のポリペプチドは，組織プラスミノ
ーゲン活性を持つポリペプチドであって，ヒトの組織プ
ラスミノーゲンアクチベーターに由来し，そしてLys277
が Argに置換されている。 【００１０】本発明のポリペプチドは，ヒトの組織プラ
スミノーゲンアクチベーターに由来し組織プラスミノー
ゲン活性を持つポリペプチドであって，アミノ酸117, 1
84および448 の少なくとも１ヶ所のグリコシル化部位で
AsnがGlnに置換されており,Met525からPro527までの配
列を欠いている。 【００１１】本発明のポリペプチドは，ヒトの組織プラ
スミノーゲンアクチベーターに由来し組織プラスミノー
ゲン活性を持つポリペプチドであって，アミノ酸117, 1
84および448 の少なくとも１ヶ所のグリコシル化部位で
AsnがGlnに置換されており，Lsy277がArg に置換されて
いる。 【００１２】本発明の薬剤組成物は，凝血を溶解するこ
とにおける組織プラスミノーゲンアクチベーター活性を
持つポリペプチドを凝血を溶解するに充分な量含みまた
生理学的に受容可能なキャリアを含む薬剤組成物であっ
て，該ポリペプチドが天然の組織プラスミノーゲンアク
チベーターの比活性の少なくとも 0.3の比活性を有し，
また組織プラスミノーゲンアクチベーター活性を持つ天
然に生じるポリペプチド中のグリコシル化部位の数を減
らすこと，Ｃ末端で少なくとも３個のアミノ酸を欠失さ
せること，または開裂部位のアミノ酸を置換することの
結果として，比活性，活性のフィブリン依存性，または
阻害剤感受性に関して少なくとも１つの改良された性質
を持つポリペプチドである。 【００１３】本発明の DNA配列は，ヒトの組織プラスミ
ノーゲンアクチベーターに由来し組織プラスミノーゲン
活性を持つポリペプチドをコードする DNA配列であっ
て，該ポリペプチドが以下のうちの少なくとも１つを持
つという点でヒトの組織プラスミノーゲンアクチベータ
ーと異なる：(a)117-119, 184-186 および448-450 のグ
リコシル化部位の少なくとも２ヶ所の障害；(b)Ｃ末端
での少なくとも３個のアミノ酸の欠失；および，(c)ヒ
トの組織プラスミノーゲンアクチベーターの開裂部位の
アミノ酸の置換。 【００１４】本発明の発現構築物は，転写の順に，転写
と翻訳の開始領域，該開始領域の転写と翻訳の制御調節
下にある DNA配列，および転写と翻訳の終結領域を含有
する発現構築物であって，該DNA配列がヒトの組織プラ
スミノーゲンアクチベーターに由来し組織プラスミノー
ゲン活性を持つポリペプチドをコードする DNA配列であ
って，該ポリペプチドが，(a)117-119, 184-186および4
48-450 のグリコシル化部位の少なくとも２ヶ所の障
害，(b)Ｃ末端での少なくとも３個のアミノ酸の欠失，
および，(c)ヒトの組織プラスミノーゲンアクチベータ
ーの開裂部位のアミノ酸の置換のうちの少なくとも１つ
を持つという点でヒトの組織プラスミノーゲンアクチベ
ーターと異なるポリペプチドである。 【００１５】本発明のプラスミドは，宿主中で機能的な
複製系および発現構築物を含有するプラスミドであっ
て，該発現構築物が，転写の順に，転写と翻訳の開始領
域，該開始領域の転写と翻訳の制御調節下にある DNA配
列，および転写と翻訳の終結領域を含有する発現構築物
であって，該 DNA配列がヒトの組織プラスミノーゲンア
クチベーターに由来し組織プラスミノーゲン活性を持つ
ポリペプチドをコードする DNA配列であって，該ポリペ
プチドが，(a)117-119, 184-186 および448-450のグリ
コシル化部位の少なくとも２ヶ所の障害，(b)Ｃ末端で
の少なくとも３個のアミノ酸の欠失，および，(c)ヒト
の組織プラスミノーゲンアクチベーターの開裂部位のア
ミノ酸の置換のうちの少なくとも１つを持つという点で
ヒトの組織プラスミノーゲンアクチベーターと異なるポ
リペプチドである。 【００１６】本発明のポリペプチドは，ヒトの組織プラ
スミノーゲンアクチベーターに由来し組織プラスミノー
ゲン活性を持つポリペプチドであって，Lys277がArg に
置換されており，またMet525からPro527までを欠いてい
る。 【００１７】本発明のポリペプチドは，ヒトの組織プラ
スミノーゲンアクチベーターに由来し組織プラスミノー
ゲン活性を持つポリペプチドであって，アミノ酸位置11
7, 184および448 の少なくとも２ヶ所において Asnが G
lnに置換されており，Lys277がArg に置換されており，
またMet525からPro527までを欠いている。 【００１８】本発明の細胞は，プラスミドを含む生育可
能な細胞であって，該プラスミドが宿主中で機能的な複
製系および発現構築物を含有するプラスミドであって，
該発現構築物が，転写の順に，転写と翻訳の開始領域，
該開始領域の転写と翻訳の制御調節下にある DNA配列，
および転写と翻訳の終結領域を含有する発現構築物であ
って，該 DNA配列がヒトの組織プラスミノーゲンアクチ
ベーターに由来し組織プラスミノーゲン活性を持つポリ
ペプチドをコードする DNA配列であって，該ポリペプチ
ドが，(a)117-119, 184-186 および448-450 のグリコシ
ル化部位の少なくとも２ヶ所の障害，(b)Ｃ末端での少
なくとも３個のアミノ酸の欠失；および，(c)ヒトの組
織プラスミノーゲンアクチベーターの開裂部位のアミノ
酸の置換のうちの少なくとも１つを持つという点でヒト
の組織プラスミノーゲンアクチベーターと異なるポリペ
プチドである。 【００１９】本発明の方法は， DNA配列を作成するため
の方法であって，該 DNA配列がヒトの組織プラスミノー
ゲンアクチベーターに由来し組織プラスミノーゲン活性
を持つポリペプチドをコードする DNA配列であり，該ポ
リペプチドが，(a)117-119,184-186および448-450 のグ
リコシル化部位の少なくとも２ヶ所の障害，(b)Ｃ末端
での少なくとも３個のアミノ酸の欠失，および，(c)ヒ
トの組織プラスミノーゲンアクチベーターの開裂部位の
アミノ酸の置換のうちの少なくとも１つを持つという点
でヒトの組織プラスミノーゲンアクチベーターと異なる
ポリペプチドである DNA配列を作成するための方法であ
って，以下の工程：(1)組織プラスミノーゲンアクチベ
ーター活性を持つ天然に生じるポリペプチドをコードす
る鋳型を含有する原核生物プラスミドの一本鎖に，117-
119, 184-186および448-450のアミノ酸をコードするグ
リコシル化部位の少なくとも２ヶ所のグリコシル化部位
での障害，Ｃ末端での少なくとも３個のアミノ酸の欠
失，または開裂部位のアミノ酸の置換を生じるミスマッ
チをもつオリゴデオキシヌクレオチドをアニーリングさ
せて，部分的な二本鎖プラスミドを供する工程であっ
て，ここで，該オリゴデオキシヌクレオチドが，標的鋳
型に関して85から90％の相補性を有すること，ミスマッ
チされる座位の反対側の相補性領域の融点がほぼ等しい
こと，そして前記変異形成座位以外の前記プラスミドの
どの部位でも70％より低い相補性を持つことにより特徴
づけられる工程；(2)修正能力を欠く DNAポリメラーゼ
により該オリゴデオキシヌクレオチドを伸長して，二本
鎖プラスミドを供する工程；(3)該二本鎖プラスミドに
より宿主の原核生物細胞を形質転換し，該細胞を増殖さ
せることにより該二本鎖プラスミドを複製させる工程；
および4)該オリゴデオキシヌクレオチドの配列を持つプ
ラスミドを単離する工程，を包含する。 【００２０】本発明の感受性は，ヒトの組織プラスミノ
ーゲンアクチベーターと実質的に同じアミノ酸配列を持
つポリペプチドであって，次の生理学的性質の少なくと
も１つを持つポリペプチド：天然に生じるヒトの組織プ
ラスミノーゲンアクチベーターと比較して，6.2 から7.
0 の範囲の比活性； 1.3から2.5 の範囲のフィブリン依
存性；およびプラスミノーゲンアクチベーター阻害剤の
阻害に対し10から30％の範囲で低下した。 【００２１】以下に本発明を詳細に説明する。 【００２２】プラスミノーゲンアクチベーターとしての
特性が高められた新規ポリペプチドが，そのようなポリ
ペプチドをコードする DNAコード配列，適切な宿主内で
そのような配列を発現させるための発現カセット，新規
ポリペプチドを発現できる宿主，および新規ポリペプチ
ドを生産する方法を含めて，提供される。新規ポリペプ
チドは，少なくともひとつのグリコシル化部位に変化を
含み， 272から280 までの領域，特にPhe274−Arg275−
Ile276−Lys277(FRIK)にある開裂部位に少なくともひと
つの変化を含み，そして／または，分子の一端かまたは
両端，特にＣ−末端の切断を含む。唯一の修飾がグリコ
シル化部位にあるとき， 177-119と184-186 の両方のグ
リコシル化部位は同様にまたは異なって修飾される。
（使用するアミノ酸の番号付けはPennica et al., Nat
ure (1983) 301: 214-221 の報告に基づき，グリシン−
アラニン−アルギニン−セリン−チロシンの配列のセリ
ンから始める。）組織プラスミノーゲンアクチベーター
活性を持ちヒト組織プラスミノーゲンアクチベーターに
由来するポリペプチドにこのような変化を導入すると，
生理学的特性の改善が達成可能である。 【００２３】新規ポリペプチドは，タンパク分解活性，
特にプラスミノーゲン分解活性を増幅しており，プラス
ミノーゲンアクチベーター阻害に対する感受性が低下
し，フィブリン親和性が増加し，そして／またはプラス
ミノーゲン分解活性のフィブリン依存性が増している。 【００２４】興味深い第１の変化は，アミノ酸117-119,
184-186 および448-450 におけるグリコシル化部位の少
なくとも１つの修飾であり，アスパラギンが保存的また
は非保存的に変化しているか，または，セリンかスレオ
ニンが特にグリシン，アラニンあるいはバリンに非保存
的に変化している。特に興味深いのは，117-119 と184-
186 のグリコシル化部位である。興味深い変異には，ア
スパラギンが他のアミノ酸，好ましくはグルタミン，バ
リン，ロイシン，イソロイシン，アラニンまたはグリシ
ン，より好ましくはグルタミンに置換されこと，また
は，セリンかスレオニンが他のアミノ酸，好ましくはア
ラニン，バリンまたはメチオニンに置換されること，つ
まりメルカプト基または中性水酸基をもたない３〜５個
の炭素原子から成る脂肪族アミノ酸に置換されること，
が含まれる。 117と184 におけるグリコシル化部位のア
スパラギンのグルタミンへの置換が特に興味深い。 【００２５】変異生成物特性の所望の変化に応じて，保
存的変化または非保存的変化いずれかが含まれる。保存
的な変化は，アミノ酸間にセミコロンを付して示した。
G,A;V,I,L;D,E;K,R;N,Q;S,T;およびF,W,Y;ここで１つの
グループのアミノ酸が他のグループのアミノ酸または上
に示されていないアミノ酸に置換し，このような変化を
非保存的であると考える。 【００２６】比活性は，分子のグリコシル化量を特にク
リングル構造内のグリコシル化部位，より特別にはＮ−
末端からＣ−末端方向の最初の２つのグリコシル化部位
について減少させると，増幅できることが見出された。 【００２７】欠失，置換，挿入などのようなさまざまな
障害をグリコシル化部位に導入することにより，グリコ
シル化部位の３つ組を変えてグリコシル化部位を破壊す
る。例えば，117-119,184-186 および448 -450のグリコ
シル化部位を同様にまたは異なって修飾する。 【００２８】次に興味深い領域は，アミノ酸の274-278
に生じる開裂部位の修飾である。特に興味深いのは，27
7 のリジンのアルギニンへの置換のような保存的変化で
ある。他の置換としては，276 のイソロイシンのバリ
ン，ロイシン，グリシンまたはアラニンへの置換を含
む。開裂部位の特異的修飾はプラスミノーゲンアクチベ
ーター阻害に対する感受性を減少させ得ることがわか
り，よってこのポリペプチドはin vivoで，天然での阻
害量のプラスミノーゲンアクチベーター阻害剤存在下
で，野生型組織プラスミノーゲンアクチベーターに比べ
て活性を増しているだろう。 【００２９】第３の興味ある変化は，Ｎ末端またはＣ末
端の切断で，特にＣ末端での少なくとも１アミノ酸から
25アミノ酸まで，通常は10アミノ酸まで，より通常には
３アミノ酸までの切断である。Ｎ末端では，セリンから
始まりチロシンに続く１〜５アミノ酸，特に１〜３アミ
ノ酸が切断される。 【００３０】Ｃ末端の切断は，フィブリン依存性を増幅
させ，それによって組織プラスミノーゲンアクチベータ
ーの特異性の増加が達成される。フィブリン依存性を増
加することで，開裂して凝血から離れたプラスミンとな
るプラスミノーゲンの量は実質的に減少し，プラスミン
の副作用は阻止されるであろう。 【００３１】本発明の新規ポリペプチドは，上に述べた
２種，３種またはそれ以上の変化を組み合わせて得られ
る。例えば，117 と184 のグリコシル化部位のアスパラ
ギンのグルタミンによる置換（第１の型の変化例）に加
えて，開裂部位277 のリジンをアルギニンに置換するこ
とによる修飾（第２の型の変化例），またはMet525から
Pro527までの配列の切断（第３型の変化例）を行ってよ
い。 【００３２】いくつかの場合，むしろ tPAを切断するよ
りは，鎖を伸長するか，または末端のアミノ酸を一般に
約１−12アミノ酸，Ｎ末端とＣ末端の１つか両方で伸長
する。付加したアミノ酸はリンカーとしてふるまった
り，特別な免疫応答を供したり，分子の生理学的特性を
修飾したりするであろう。 【００３３】主題のポリペプチドをコードする DNA配列
は，イントロンを含む染色体 DNA，cDNA，合成DNA ，ま
たはそれらの組み合わせを使って，さまざまな方法で調
整される。所望の変異は，遺伝子を適当な細菌の宿主中
に，一本鎖バクテリオファージベクターまたは二本鎖プ
ラスミドベクターを用い，次に野生型配列に実質的に相
補的ではあるが，トランスバージョン，転位，欠失また
は挿入などの所望の変異を含むミスマッチの配列を用い
て，クローニングすることにより達成される。あるい
は，便利な制限酵素切断部位が存在すれば，特別な配列
を削り，変異を含んだ合成配列を導入できる。使用でき
る他の技術は，二本鎖鋳型の部分エキソヌクレアーゼ消
化，またはin vitro でヘテロデュプレックスを形成し
て部分的一本鎖領域をオリゴヌクレオチド−特異的変異
形成にかけることである。 【００３４】特に興味深いのは，オリゴヌクレオチド特
異的変異形成である(Zoller and Smith, Methods Enzy
mol.(1983) 100:468-500.)。 【００３５】欠失や挿入のミスマッチを含んだ適切なオ
リゴヌクレオチド配列としては，一般に約20から100 ヌ
クレオチド(nt)，より一般的には20−60nt持つものを調
製する。この配列は，合成により簡単に調製でき，適当
なクローニングベクターでクローニングできる。このオ
リゴヌクレオチドを，部位特異的変異形成用に tPA遺伝
子か tPA類似体の精製鋳型とアニールさせる。変異は独
立に導入し，変異の部位は約10塩基対(bp)，より一般に
は約20bp分離させる。異なった部位の変異は一段階また
は連続的段階で導入し，各変異後その変異の存在や tPA
類似体の活性への効果を確かめる。 【００３６】変異形成プライマーの設計には，いくつか
の考察が含まれる。一般に，プライマーの長さは，標的
鋳型に対して，約85％より高く約95％より低い相補性を
持つように選択する。これによって，変異形成プライマ
ーによる簡単なプラーク選別が可能となるというさらな
る利点が供される。変異形成プライマーが，欠失を生じ
る場合，通常欠失の各端に少なくとも約20bpの相補性が
存在するであろう。また，プライマーは，変異座位の両
端において，だいたい等しい融点を供する必要がある。
さらに考えると，プライマーは鋳型上の不適当な部位か
らのプライミングを，もし除かない場合は，最少にする
よう選択されるべきである。実際，変異座位以外のあら
ゆる部位において，相補性は70％より低く，好ましくは
60％より低くあるべきである。従って，問題とする遺伝
子のみならず，クローニングベクターについても考える
べきである。特に考えなければならないことは，プライ
マーの3'末端での相補性である。 【００３７】便宜上，ベクターは，たとえばM13 のよう
な一本鎖状 DNAウィルス，特にベクターとして利用する
ため修飾されたものである。便利なウィルスベクターは
M13mp9である。変異形成プライマーを鋳型やベクター
と，必要なヌクレオチドおよびT4DNA リガーゼ存在下
で，クレノー断片やT4DNA ポリメラーゼのような修正能
力を欠いた適当なポリメラーゼ存在下，アニーリング条
件のもとに一緒にして，それによって遺伝子を保持する
環状ベクターが複製可能となり，二本鎖複製型が供され
る。次いで二本鎖 DNAを適当な細胞に導入する。溶解性
ベクターを供給することで，変異形成が生じたtPA また
は tPA類似体の存在をプライマーを使って選別できるプ
ラークを得る。通常，変異形成産物としての正確な配列
を持つ可能性を増すためには，感度を増加させた，少な
くとも２回のくり返し選別が必要であろう。 【００３８】次に推定上正のクローンを，例えばプラー
ク精製，電気泳動的精製などして，精製し，次いで配列
決定する。 【００３９】配列決定のために，少なくとも長さが約20
から30塩基で変異座位から少なくとも約55塩基離れた位
置でアニールするであろう配列決定プライマーを設計す
る。正確な配列の妥当な保証を得るためには，変異座位
の両側少なくとも約50塩基を含む領域を配列決定するこ
とが望ましい。 【００４０】一度正確に変異形成した遺伝子が得られた
ら，それを単離し，適切な宿主中で発現させるために適
切な発現ベクターに挿入する。 【００４１】哺乳類，昆虫および鳥類宿主に利用する発
現ベクターには，広範囲の種類が存在する。例えば，こ
こで参考文献として採用するEPA 0,092,182 に述べられ
ているものを参照せよ。特に興味深いのは哺乳類ベクタ
ーで，これはシミアンウィルス，ウシ乳頭腫ウィルス，
アデノウィルスなどのようなウィルスのレプリコンを使
用する。 【００４２】転写や翻訳の開始および終結制御領域は，
天然上 tPA遺伝子に関連する領域，ウィルスの構造遺伝
子由来の領域または宿主遺伝子由来の領域である。多く
のプロモーターが利用可能である。例えば，SV40の初期
および後期プロモーター，アデノウィルスの主要後期プ
ロモーター，β−アクチンプロモーター，ヒトCMV Imme
diate Early 〔IE1〕プロモーターなどである。望まし
くは，プロモーターは，発現を向上させるために，エン
ハンサーとともに使う。 【００４３】多くの場合 tPA発現構築物を増幅すること
が望ましい。増幅または他の理由のために，発現構築物
を染色体に組み込ませることが望ましい。この目的のた
めには，構築物は不安定な複製系，例えば酵母ars １と
結合されるか，あるいは複製系を欠くであろう。組み込
みについては例えばAxeland Wigler, 米国特許第4,399,
216 号を参照せよ。通常，マーカー発現構築物は主題の
発現構築物とタンデムであろうし，そのマーカーは増幅
遺伝子と同じでも異なったものでもよい。これは，発現
構築物とタンデムであり，tPA発現構築物と同じ宿主内
で機能を持ち，そしてDHFR（ジヒドロ葉酸還元酵素），
TK（チミジンキナーゼ），MT−Ｉおよび−ＩＩ（メタロ
チオネイン，例えばヒト）,ODC（オルニチン脱炭酸酵
素）のような増幅可能な遺伝子をコードするような tPA
を有することによって達成できる。増幅可能遺伝子に従
って宿主に圧力をかけることにより，例えばDHFRならば
メトトレキセートで圧力をかけることによって，主題の
発現構築物は増幅される。 【００４４】用いる特別な宿主やシグナル配列に従っ
て，発現された tPA類似体は宿主細胞質内に保持される
かまたは分泌されるであろう。細胞質内に保持される場
合， tPA類似体は常法に従って宿主細胞をを溶解するこ
とにより単離し，抽出および精製法，好ましくは電気泳
動法，クロマトグラフィーのような方法を使用して精製
する。tPAが分泌される場合，分泌された tPAは，アフ
ィニティクロマトグラフィーを含む従来の方法に従って
上澄液から単離できる。 【００４５】本発明で使用するポリペプチドの特性を組
み合わせると， tPAのよううな天然のプラスミノーゲン
アクチベーターよりも優れている。これらのポリペプチ
ドは，天然の tPAに対して少なくとも0.6 倍，しばしば
少なくとも 0.7倍，通常は少なくとも 1.0倍，一般に約
1.1−7.0 倍，そして好ましくは約 6.2から7.0 倍の比
活性を持つであろう。活性のフィブリン依存性は，天然
の tPAに対して少なくとも 0.4倍，しばしば少なくとも
約 0.6倍，通常は少なくとも約 0.7倍，そして好ましく
は少なくとも約１−2.5 倍で特に1.3 から2.5 倍であろ
う。プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤に対する感
受性は，通常天然の tPAよりも高くはなく，天然の tPA
の感受性に基づいて好ましくは，約５％低下し，より好
ましくは約10％低下から約90％低下までの範囲に及び，
特に天然の tPAより約25−90％低下しているであろう。
この主題化合物は通常，野生型 tPAよりも少なくとも１
つの見地においては優れているであろう。（試験法につ
いては実験の項を参照）。特に興味深いのは，組織プラ
スミノーゲンアクチベーター活性を持ち，実質的にヒト
tPAと同じアミノ酸配列（置換，欠失および挿入を含む
相異が10％より低い，通常は５％より低い）を持ってい
るポリペプチドである。これらのポリペプチドは以下の
性質の少なくとも１つを持っているであろう。(a)比活
性が天然 tPAの比活性の少なくとも約 0.6倍，しばしば
少なくとも約 0.7倍，通常は少なくとも約 1.0倍，一般
に約 1.1から7.0 倍，そして好ましくは約 6.2から7.0
倍である。(b)フィブリン依存性が天然 tPAの少なくと
も 0.4倍，しばしば少なくとも約 0.6倍，一般には少な
くとも約 0.7倍，そして好ましくは少なくとも約 1.0か
ら2.5 倍，特に約1.5 から2.5 倍である。(c)ヒトプラ
スミノーゲンアクチベーター阻害剤による阻害に対する
感受性の低下が天然 tPAの感受性に比較して約５％であ
り，より好ましくは約10％の低下から約90％の低下の範
囲におよび，そして特に天然 tPAよりも約25から90％低
下している。 【００４６】主題のポリペプチドは，さまざまな血管の
状態や病気に対する予防処置または治療処置においてさ
まざまな方法で特異的に使用され，哺乳類宿主，特にヒ
ト宿主における血栓形成を防ぐであろう。従って，宿主
が凝血形成に感受性である場合はこれを手術中に投与し
てよく，あるいは血栓患者の処置用に投与してもよく，
これにより，深い動脈血栓，肺塞栓，頭蓋血栓および冠
状動脈血栓内に形成している凝血を溶解する。 【００４７】主題化合物は，腸管によって，または非経
口的に，特に注射または注入によって投与する。これら
の化合物は，ゼラチン，ゼラチン誘導体のグループから
選択されるタンパク安定化剤，アルブミンのような保護
タンパク，糖，糖アルコールまたはアミノ酸の存在下，
水，生理食塩水または適当な緩衝系のような生理的に受
容可能な支持体中にその有効量を単独であるいは他の治
療薬，特に血管病用薬と組み合わせて投与できる。次の
実施例は，説明のためであり，決してこれに限定されな
い。 【００４８】 【実施例】材料および方法 変異形成は，以下で述べるように一部変更した。Zoller
and Smith, Meth. Enzymol. (1983) 100 : 468-500 ，
で述べられている手順を用いて行った。合成DNA 変異形
成と配列決定プライマーは，N, N−ジイソプロピルホス
ホロアシダイトを用いて，Urdea et al., Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA (1983) 80 : 7461-7465で述べられ
ているようなシリカ支持体上での自動オリゴヌクレオチ
ド合成により調製した。配列決定プライマーを，バクテ
リオファージ M13でのジデオキシヌクレオチド連鎖末端
法（F. Sanger, S. Nicklen and A. R. Coulson, Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA (1977) 74 : 5463)による配
列決定用に設計した。配列決定プライマーは，長さが一
般的に20から30塩基で M13mp9 組み換え鋳型に相補的で
あり，しかも変異座位から少なくとも55塩基離れた位置
でアニールするように設計した。以下の表は，変異形成
や配列決定に用いるオリゴマーを示している。 【００４９】 【表１】 【００５０】変異の効果 1. Asn 117 → Gln, Asn 184 → Gln 2. Met 525から Pro 527までの欠失 3. Lys 277 → Arg 4. Lys 277 → Arg, Arg 275 → Lys 5. Asn 177 → Gln, Asn 184 → Gln, Asn 448 → Gln 配列決定プライマー 1a. ACCTTGCCTATCAGGATCAT 1b. CGAATCGCCCTGGCAGGCGTC 2. GTGGGTCTGGAGAAGTCTGTA 3, 4. GCACAGGAACCGCTCTCCGGG 5. TCGATCTGGGTTTCTGCAGTAGTTGTGGTT M13／tPA 組み換え体の変異形成は，精製した鋳型を用
い，適当なプライマーをアニーリングしそしてT4ポリメ
ラーゼのクレノー断片で伸長させることにより行った。
変異体１は，両プライマー１ａおよび１ｂを用いて変異
処理一回の操作で得た。変異体４は， 125μg ／mlの遺
伝子32タンパク，および挿入体に隣接する M13配列に結
合するヘルパープライマーの存在下で，変異体３に由来
する鋳型を用いて得た。プライマー４の効果（Arg 275
→ Lys）とプライマー３の効果（Lys 277 →Arg)を組み
合わせることにより，上に示した２ヶ所の変異部位を形
成した。変異体５は変異体１に由来する鋳型を用いて得
た。プライマー１ａと１ｂの効果（Asn 117 → Gln，As
n 184 → Gln）をプライマー５の効果（Asn 448 →Gl
n）と組み合わせて，上に示した３ヶ所の変異部位を形
成した。 JM101細胞へのトランスフェクション（Zoller
and Smith,上記）に続き，プラークを 200−1000プラ
ーク／プレートの濃度に増殖させ，フィルターに釣り上
げ，適当な変異形成プライマーあるいはプローブでハイ
ブリダイゼーションにより選別した。これらのプラーク
のうち10から40パーセントを，推定上陽性の候補として
まず同定した。ファージのドットブロットハイブリダイ
ゼーションによる各実験から，この推定物からおよそ６
個を再選別することにより，強い候補が得られた。これ
らのファージを低濃度で再度プレーティングすることに
よりプラークを純化し，ニトロセルロースフィルターに
移し，プライマーと再度ハイブリダイゼーションした。
推定上陽性のクローンの DNA配列を，適当なプライマー
と鋳型調製物を用いて決定した。 【００５１】変異形成座位と隣接区分（すなわち，少な
くとも50塩基）を DNA配列分析により確認した直後，複
製型（RF） DNAを SalＩ制限エンドヌクレアーゼで分解
し，SalＩで前もって分解してアルカリ性ホスファター
ゼ処理した哺乳類発現ベクターpSV7d に挿入した。この
ベクターは，tPA cDNA発現用のSV40初期プロモーターと
エンハンサー，SV40ポリアデニル化部位，および COS細
胞でベクターに用いるためのSV40複製起点を供する。 【００５２】プラスミド pSV7dを以下の様に構築した。
SV40複製起点および初期プロモーターを含む 400bpの B
amHＩ／HindＩＩＩ断片を pSVgtＩ（Mulligan, R.et a
l.,J. Mol. Cell Biol. 1 : 854-864 (1981)）より切出
し，精製した。SV40ポリＡ付加部位を含む 240bpのSV40
BclＩ／ BamHＩ断片を，pSV2／dhfr（Subramani et a
l., J. Mol. Cell Biol. 1 : 584-864 (1981)）より切
出し，精製した。これら断片を以下のリンカーを介して
融合した。 【００５３】 このリンカーは３つのすべての読み取り枠中の停止コド
ンと同様に，５個の制限部位を含む。SV40複製起点，SV
40初期プロモーター，停止コドン付きポリリンカーおよ
びSV40ポリアデニル化部位を含む生じた 670bpの断片
を，およそ 1.5kbの欠失のあるpBR322誘導体である pML
の（Lusky and Botchan, Cell 36 : 391 (1984) ）の
BamHＩ部位にクローン化し，pSV6を得た。pSV6の pML配
列中の EcoRI部位と EcoRV部位を， EcoRIと EcoRVでの
分解により除去し，各末端の約 200bpを除くために Bal
31ヌクレアーゼで処理し，そして最終的に再連結して p
SV7aを得た。 Bal31による切除も， EcoRV部位よりおよ
そ 200bp離れた，SV40領域の周辺にある１つの BamHＩ
制限部位を除去した。SV40領域にある第２の BamHＩ部
位を除去するため， pSV7aを，複製起点から上流の pML
配列中で切断する NruＩで分解した。これを，平滑末端
連結により再環化し，pSV7b を得た。 【００５４】pSV7cと pSV7dは連続したポリリンカー置
換を示す。初めに， pSV7bを StuＩと XbaＩで分解し
た。それから，次のリンカーをベクターに連結し， pSV
7Cを得た。 【００５５】 その後， pSV7cを BglＩＩと XbaＩで分解し，それから
次のリンカーと連結しpSV7dを得た。 【００５６】 ベクター内でのクローン化断片の適切な方向を制限部位
解析で引き出した。変異を， SalＩと EcoRＩに対する
制限解析により，また変異座位に対し高度に特異的な適
切なプローブを用いたそのような断片のサザンブロッテ
ィングにより再確認した。 【００５７】組合せ変異体 次の４つの組合せ変異体を組み換え DNA技術を用いて構
築した：変異１および２の両方を含む変異体６，変異１
および３の両方を含む変異体７，変異２および３の両方
を含む変異体８，および３つの変異１，２および３をす
べて含む変異体９。変異の各々は便利な制限エンドヌク
レアーゼ部位により分離されており，これにより，以前
に単離した変異体１，２および３の断片由来の所望の変
異の会合が促進された。各変異体の構築に用いた特異的
な戦略を以下で述べる。 【００５８】大規模なプラスミド調製を，記載の変異体
構築のすべてに対して行った。そのDNAを組織培養細胞
へのトランスフェクションに用いた。 【００５９】変異体６ 変異体１の1.72キロ塩基（kb）の BamHＩから BstEＩＩ
までの断片は，変異させた部位Asn 117 → GlnとAsn 18
4 → Glnの両方を含む。 【００６０】この断片を，Met525からPro527までの欠失
の所望変異を含む変異体２の3.38kbの BamHＩから BstE
ＩＩまでの断片に連結した。この連結混合液を，コンピ
テントなエセリシア・コリを形質転換するのに用いた。
生じたアンピシリン耐性コロニーのいくつかを増殖さ
せ，その DNAを，サイズにより，また各変異領域に特異
的な 32P末端標識化オリゴヌクレオチドプローブによる
DNAのサザンブロットのDNAハイブリダイゼーション解
析により選別した。このようなクローンは，もし２つの
個々の変異体１の領域のオリゴヌクレオチドの各々，お
よび変異体２特異的プローブにハイブリダイズするなら
ば，陽性として記録した。この選別法を，各新しい構築
に対し適切なオリゴヌクレオチドプローブの置換によ
り，各々の構築物について用いた。使用した特異的オリ
ゴヌクレオチドは以前に挙げた。 【００６１】変異体７（１＆３） 変異させた部位を両方含む変異体１の2.95kb ScaＩ断片
を，lys 277 → Argの変換を含む変異体３の2.15kb Sca
Ｉ断片に連結した。新構築の選別を，変異体３の変化お
よび変異体１の変換の各々に特異的なオリゴヌクレオチ
ドを用いて行った。 【００６２】変異体８（２＆３） 所望の変換を含む変異体２の3.38kbの BamHＩから BstE
ＩＩまでの断片を，Lys 277 → Arg変異を含む変異体３
の1.72kbの BamHＩから BstEＩＩまでの断片に連結し
た。正しい組み換え体の選別を，各変異に特異的なオリ
ゴヌクレオチドを用いて行った。 【００６３】変異体９（１＆２＆３） 三重変異体の形成戦略として，新しく構築した二重変異
体の１つである変異体７を使用した。このプラスミドを
BamHＩと BstEＩＩで開裂し，両変異体を含む1.72kbの
断片を単離した。変異体２からのプラスミド DNAを同じ
制限酵素で分解し，3.38kbの細片（変異を含む）を単離
した。 【００６４】これら２つの断片を連結し，この連結混合
液を用いてコンピテントなエセリシア・コリを形質転換
した。正確な三重変異体の選別は， DNA中の各変異部位
に特異的なオリゴヌクレオチドを用いて，上記の様に行
った。 【００６５】哺乳類細胞のトランスフェクション COS-7細胞（Gluzman, Cell (1981) 23 : 175）を，Gra
ham and van der Eb,Virology (1973) 52 : 456-467で
述べられている手順を一部変更して用いて，pSV7d tPA
発現プラスミドでトランスフェクションした。サンプル
を２通りでディッシュに加え，二酸化炭素恒温器（37
℃）中，６時間，細胞上に固定させた。６時間後，上澄
液を吸引し，細胞をCaとMgのないリン酸緩衝生理食塩水
（PBS-CMF)で穏やかにゆすぎ，そして 3.5−４分間，ア
ジュバントとしての15％グリセロールにディッシュをさ
らした。ゆすいで， 4.5mg／mlグルコース， 3.7mg／ml
Na2CO3 ， 292μg ／mlグルタミン， 110μg ／mlピル
ビン酸ナトリウム，100U／mlペニシリン，100U／mlスト
レプトマイシン，および10％胎児ウシ血清（FCS)を添加
したDMEM培地を供給した後，培地を胎児ウシ血清を欠く
培地と置き換えた。血清を除去して12時間後，下で述べ
るカゼイン−プラスミノーゲン−寒天重層を用いて，細
胞を tPAの発現について分析した。最大発現は，トラン
スフェクション開始後36と48時間の間で観察された。 【００６６】CHO dhfr-細胞（Urlaub and Chasin, Pro
c. Natl.Acad. Sci. USA (1980) 77: 4216 ）を，栄養
培地（1.18mg／ml Na2CO3 ， 292μg ／mlグルタミン，
110μg ／mlピルビン酸ナトリウム，100U／mlペニシリ
ン，100U／mlストプトマイシン， 150μg ／mlプロリン
および10％ FCSを添加した F12）中でトランスフェクシ
ョンする前日に，10cmディッシュあたり５×105 から10
6 の細胞の濃度で塗布した。上で述べたトランスフェク
ション手順を，tPA 発現プラスミドをアデノウィルス主
要後期プロモーターにより働くdhfr遺伝子を選択マーカ
ーとして持つプラスミドと混ぜたという一部の変更を加
えて用い，リン酸カルシウムでプラスミドを共沈澱させ
た。dhfr遺伝子を持つプラスミドは，アデノウィルス-2
由来の主要後期プロモーター（Ad-MLP, 地図単位16−1
7.3）をマウスのdhfr cDNA の5'末端に融合させること
により構築した。SV40初期領域ポリアデニル化部位と S
V40小ｔ抗原に対するイントロンをコードしている DNA
を pSV2-neo （Southern andBerg, J. Mol. Appl. Gen
et. (1982) 1 : 327-341 ）より得，dhfr cDNA の3'末
端に融合した。これらの３つの区分をpBR322にサブクロ
ーン化し，プラスミドAd−dhfrを得た。DNA を細胞に添
加後48時間，細胞を選択培地（上記のようにプロリンと
胎児ウシ血清を添加した，あるいは透析した胎児ウシ血
清を添加したDMEM培地）に１：20となるように分配し
た。選択培地で１−２週間増殖後，コロニーが現れ，カ
ゼイン−プラスミノーゲン−寒天重層分析により tPA生
産を検定し，またカゼイン−プラスミノーゲンプレート
で定量分析した。 【００６７】各変異体の細胞系を， 200cm3ディッシュ
中で融合するまで増殖させ，無血清培地（DMEM）中で24
時間の間保温し，そして上澄液を以下で述べるように処
理して，プラスミノーゲンアクチベーター活性を有する
ポリペプチドを精製した。 【００６８】次の手順は上で述べた６つのポリペプチド
の活性を決定するために用いた。 【００６９】変異タンパクの比活性を決定するために
は，サンプルの抗原濃度を定量することが必須だった。
ポリクローナル抗体を用いる EIA−キット（American D
iagnostica, Inc., Greenwich, CT）を用いた。検査
は，キットに供されているプロトコール中に述べられて
いる条件下で厳密に行い，各サンプルの５希釈物を分析
した。結果は，少なくとも３つの測定できる希釈物の平
均として表した。 【００７０】プラスミノーゲンアクチベーター活性をも
つ変異タンパクの濃度 すべての細胞培養上澄液を0.01％Tween 80TMと0.01％Na
−アジドにした。次いで上澄液（50ml）を，３mlの Hep
arin-SepharoseRの存在下で室温，30分間，保温した。
Heparin-Sepharose懸濁液をカラムに充填し， 0.1M リ
ン酸塩，0.01％Tween80TMを含む緩衝液（pH 7.5）20ml
でよく洗浄した。最終的には， tPA活性は，0.05M トリ
ス−HCl ，１M KSCNおよび0.01％Tween 80TMを含む緩衝
液（pH 7.5）で溶出した。次いで溶出物を，0.01％ Twe
en 80TMと0.01％Na−アジドを含むリン酸緩衝液（0.05M
，pH 7.5）５L に対して４℃，16時間透析した。tPA
サンプルを１mlずつ−25℃で凍結した。 【００７１】凝血溶解検査（CLT) 凝血溶解検査を，凝固時間の代わりに溶解時間を記録す
るために一部変更されている“KC 10-Koagulo-meter ”
（Amelung, FRG）を用いて行った。 【００７２】すべての試薬を37℃で予備保温した。 tPA
標品，ポリペプチド検査サンプルおよびフィブリノーゲ
ンを，１％ HaemaccelTM（pH 7.4）を含むリン酸緩衝液
（0.67M ）中で必要とする濃度にまで希釈した。 tPA標
品あるいはサンプルの 0.2mlを，0.2 mlのヒトプラスミ
ノーゲン（10CTA／ml），0.5mlのウシフィブリノーゲン
（0.15％）および最終的に 0.1mlのトロンビン（10IU／
ml）と混合した。溶解時間を記録し，検量曲線を用いて
tPA単位で表した。各変異タンパクの活性を少なくとも
３回分析し，平均を計算した。分析すべきサンプルの各
々について tPAの標品の４種の希釈を行った。 【００７３】プラスミノーゲン溶解検定 変異タンパクのプラスミノーゲン溶解活性を，Ranby et
al.,Thromb. Res.(1982)27：743-749 で述べられてい
る放物線検定を用いて分析した。全試薬を37℃で予備保
温した。tPA標品あるいはtPA サンプルの 0.1mlを， 0.
5mlの緩衝液(0.1％Tween 80TMと0.01％Na−アジドを含
む0.1Mトリス−HCL, pH 7.5)， 0.1mlの基質(S 2251(H-
D-Val-Leu-Lys-（パラ−ニトロアニリド）(Kabi AB, Sw
eden))，３mM), 0.1mlのヒトプラスミノーゲン（1CTA／
ml）および0.1 mlのフィブリン分解産物（10mg／ml）と
混合した。最終的には，混合液を37℃，45分間保温し
た。反応は 0.1mlの酢酸（50％）を加えて停止させ，光
学濃度を 405nmで読んだ。得られた検量曲線を用いてサ
ンプルの光学濃度を単位に変換した。結果は，少なくと
も５個の測定可能な希釈物の平均で表した。 【００７４】さらに，同様の検査をフィブリン分解産物
（FDP)の不在下で行った。この場合， 0.5mlの代わりに
0.6mlの緩衝液が必要であった。 【００７５】活性のフィブリン依存性 tPA および変異ポリペプチドがプラスミノーゲンをプラ
スミンに活性化する能力に対する補因子（フィブリンあ
るいはフィブリン分解産物（FDP)の影響を，凝血溶解検
査あるいはフィブリン依存性プラスミノーゲン溶解検定
で得た活性と，フィブリン非依存性プラスミノーゲン溶
解検定で決定した活性との比で表した。フィブリン凝血のフィブリン−アフィニティー調製 ヒトのフィブリノーゲン（ 0.3％） 0.2ml量をプラスチ
ック管に入れ， 0.005mlのウシのトロンビン（500IU/m
l）と混合した。混合液を37℃で30分間静置させた。反
応終了後，凝血を注意深く除去し，抗トロンビンＩＩＩ
（３IU/ml）とヘパリン（40IU/ml）を含む２mlの緩衝液
（0.1Mトリス−HCl, pH 8.0）中で37℃，30分間保温し
た。最終的に，凝血を除去し，50mlの緩衝液（0.05M ト
リス−HCl ，0.1M NaCl, pH 7.5)に対して20分間，２回
透析した。使用前に，凝血をまわりの溶液より除いた。 【００７６】検査手順 すべてのサンプルをまず， 0.1％ Tween80TMを含むトリ
ス緩衝液（0.1M, pH 7.5）に200ng/mlとなるように希釈
した。その後サンプルを，５％ヒトアルブミンを含む同
じ緩衝液に，最終濃度100ng/mlとなるように希釈した。
続いて，0.4mlのサンプルをフィブリン凝血存在下，室
温にて10分間保温した。最後に溶液を除き，流体相中の
抗原濃度をEIAで決定した。この実験を各サンプルにつ
き２回行った。 【００７７】阻害検査 サンプルを， 0.1％ Tween80TMを含むトリス緩衝液（0.
1M, pH 7.5）に最終濃度100ng/mlになるように希釈し
た。 【００７８】次いで 0.2ml量を，65ウロキナーゼ阻害単
位／mlの濃度でプラスミノーゲンアクチベーター阻害剤
を含む溶液 0.2mlと混合した。対照実験では，上で述べ
たポリペプチドのサンプルを 0.2mlの緩衝液（ 100％）
と混合した。混合液を10分間，37℃で保温した。保温時
間終了時点でサンプルを素早く希釈し，残存活性をフィ
ブリン依存性プラスミノーゲン溶解検定で分析した。こ
の阻害検査は各サンプルにつき２回行った。阻害感受性
を阻害されている％活性として表した。 【００７９】プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤を
ヒトの胎盤より精製した。阻害画分は，いかなるタンパ
ク分解活性も，またプラスミン，トロンビンもしくはト
リプシンの阻害活性も含まない。 【００８０】変異タンパクの上記検定による値を表ＩＩ
にまとめて示す。 【００８１】 【表２】【００８２】 【表３】【００８３】上の結果より，野生型tPA アミノ酸配列に
変化を生じることにより実質的な利点を達し得ること
が，明白である。従って，活性を増加させることができ
るだけでなく，同時にプラスミノーゲンアクチベーター
阻害剤に対する感受性を低下させることができ，これに
より効果的な活性について全体として非常に実質的な増
加がイン ビボで達成できる。また酵素は，増強された
フィブリン依存性を供するという点において実質的によ
り特異的にすることができ，従って凝血の不在下ではそ
れは実質的に低下した活性を有する。よって，タンパク
（あるいは酵素）の血流中のレベルを最小にし，またtP
A の望ましくない副作用を実質的に減らすために，プラ
スミノーゲンアクチベーター活性を持つこれらのポリペ
プチドはより小量で投与でき，しかも凝血に対し増加し
た活性を供する。 【００８４】前述の本発明を，理解を明確にするため
に，図解と実施例により幾分詳細に述べるが，ある程度
の変化や一部変更は，添付の特許請求の範囲内で行われ
得ることは明白であろう。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所
(Ｃ１２Ｎ 5/10
Ｃ１２Ｒ 1:91）
(73)特許権者 594134154
Ｐｏｓｔｆａｃｈ 1140，3550 Ｍａｒ
ｂｕｒｇ−Ｌａｈｎ，Ｆｅｄｅｒａｌ
Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｇｅｒｍａｎ
ｙ
(72)発明者 ガイ ミュレンバック
アメリカ合衆国 カリフォルニア
94618 オークランド，アプト．シー．,
シクスティー−サード ストリート
309
(72)発明者 アーネスト−ギュンター アフティング
ドイツ連邦共和国 3550 マールブルグ
エーエム ゾネンハング 20
(72)発明者 エーリッヒ−ポール パクーズ
ドイツ連邦共和国 3550 マールブルグ
シュミーデッカー 18
(56)参考文献 特開 昭62−130690（ＪＰ，Ａ)
特開 昭62−24（ＪＰ，Ａ)
特開 昭61−233630（ＪＰ，Ａ)
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．少なくとも以下の１つ： （ａ）少なくとも１つのグリコシル化部位での少なくと
も１つのアミノ酸の置換； （ｂ）Ｃ−末端での少なくとも３つのアミノ酸の欠失；
または、 （ｃ）ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーターの開裂
部位における少なくとも１つのアミノ酸の置換； を有する点で、天然に生じるヒト組織プラスミノーゲン
アクチベーターとは異なるヒト組織プラスミノーゲンア
クチベーターをコードする核酸を有する生育可能な細
胞： ただし、(a)のみの修飾を有するポリペプチドをコード
する核酸を有する生育可能な細胞を除き、そして、(c)
のみの修飾を有するポリペプチドをコードする核酸を有
する生育可能な細胞を除くが、(c)のみの修飾を有する
ポリペプチドをコードする核酸であっても、アミノ酸２
７７位のリジンがアルギニンで置換されているヒト組織
プラスミノーゲンアクチベーターをコードする核酸を有
する生育可能な細胞は含む。 ２．前記細胞が真核細胞である、請求項１に記載の細
胞。 ３．前記真核細胞が哺乳動物細胞である、請求項２に記
載の細胞。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US81287985A | 1985-12-23 | 1985-12-23 | |
| US812,879 | 1985-12-23 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61316095A Division JP2575369B2 (ja) | 1985-12-23 | 1986-12-23 | 新規ペプチドのプラスミノ−ゲンアクチベ−タ− |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0787973A JPH0787973A (ja) | 1995-04-04 |
| JP2680999B2 true JP2680999B2 (ja) | 1997-11-19 |
Family
ID=25210860
Family Applications (4)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61316095A Expired - Lifetime JP2575369B2 (ja) | 1985-12-23 | 1986-12-23 | 新規ペプチドのプラスミノ−ゲンアクチベ−タ− |
| JP6186171A Expired - Lifetime JP2681000B2 (ja) | 1985-12-23 | 1994-08-08 | 新規ペプチドのプラスミノーゲンアクチベーターをコードする核酸 |
| JP6186170A Expired - Lifetime JP2680999B2 (ja) | 1985-12-23 | 1994-08-08 | 新規ペプチドのプラスミノーゲンアクチベーターをコードする核酸を含有する細胞 |
| JP8337365A Expired - Lifetime JP2769314B2 (ja) | 1985-12-23 | 1996-12-17 | 新規プラスミノーゲンアクチベーター |
Family Applications Before (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61316095A Expired - Lifetime JP2575369B2 (ja) | 1985-12-23 | 1986-12-23 | 新規ペプチドのプラスミノ−ゲンアクチベ−タ− |
| JP6186171A Expired - Lifetime JP2681000B2 (ja) | 1985-12-23 | 1994-08-08 | 新規ペプチドのプラスミノーゲンアクチベーターをコードする核酸 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8337365A Expired - Lifetime JP2769314B2 (ja) | 1985-12-23 | 1996-12-17 | 新規プラスミノーゲンアクチベーター |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US5501853A (ja) |
| EP (1) | EP0227462B1 (ja) |
| JP (4) | JP2575369B2 (ja) |
| AT (1) | ATE74379T1 (ja) |
| AU (1) | AU605124B2 (ja) |
| DE (1) | DE3684680D1 (ja) |
| DK (1) | DK623186A (ja) |
| ES (1) | ES2031826T3 (ja) |
| GR (1) | GR3004568T3 (ja) |
| ZA (1) | ZA869626B (ja) |
Families Citing this family (43)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IE81135B1 (en) * | 1984-10-01 | 2000-03-22 | Genzyme Corp | Recombinant DNA techniques and the products thereof |
| DE3684680D1 (de) * | 1985-12-23 | 1992-05-07 | Chiron Corp | Peptidplasminogenaktivatoren. |
| US5002887A (en) * | 1986-01-31 | 1991-03-26 | Genetics Institute, Inc. | Truncated thrombolytic proteins |
| US5837518A (en) * | 1986-01-31 | 1998-11-17 | Genetics Institute, Inc. | Thrombolytic proteins |
| WO1987004722A1 (en) * | 1986-01-31 | 1987-08-13 | Genetics Institute, Inc. | Novel thrombolytic proteins |
| US5258298A (en) * | 1986-01-31 | 1993-11-02 | Genetics Institute, Inc. | Deletion and glycosylation mutant of human tissue plasminogen activator |
| DE3682891D1 (de) * | 1986-02-17 | 1992-01-23 | Stichting Centraal Lab | Gewebeplasminogen-aktivator-mutant, dafuer kodierende rekombinante genetische information und verfahren zur herstellung dieser mutanten, deren verwendung und pharmazeutische zusammensetzungen. |
| IE81073B1 (en) * | 1986-03-18 | 2000-01-12 | Genentech Inc | Modified human tissue-type plasminogen activator and its preparation |
| US5047241A (en) * | 1986-07-11 | 1991-09-10 | American Home Products Corporation | Tris-Kringle plasminogen activator with novel K2 insert |
| US5242819A (en) * | 1986-12-05 | 1993-09-07 | Ciba-Geigy Corporation | DNA molecules encoding hybrid proteins of tissue plasminogen activator and urokinase |
| US5580559A (en) * | 1986-12-05 | 1996-12-03 | Ciba-Geigy Corporation | Hybrid plasminogen activator |
| FI882407A (fi) * | 1987-05-22 | 1988-11-23 | Zymogenetics Inc | Fibrinolytiska proteiner. |
| US5149533A (en) * | 1987-06-04 | 1992-09-22 | Zymogenetics, Inc. | Modified t-PA with kringle-/replaced by another kringle |
| SE8702562L (sv) * | 1987-06-18 | 1988-12-19 | Kabigen Ab | Nya fibrinolytiska enzymer |
| US5302390A (en) * | 1987-07-01 | 1994-04-12 | Beecham Group Plc | Hybrid proteins of human plasminogen and human t-PA, pharmaceutical compositions and methods of treatment |
| JP2708749B2 (ja) * | 1987-08-10 | 1998-02-04 | エーザイ株式会社 | 修飾型ｔＰＡ含有注射用組成物 |
| US5037752A (en) * | 1987-10-09 | 1991-08-06 | Monsanto Company | Modified tissue plasminogen activator substituted at cysteine-73 and lysine-277 |
| DE3888619D1 (de) * | 1987-10-09 | 1994-04-28 | Monsanto Co | Modifizierter Gewebeplasminogenaktivator. |
| US4963357A (en) * | 1987-10-09 | 1990-10-16 | Monsanto Company | Tissue plasminogen activator modified by the substitution of Arg for Cys at position 73, methods and pharmaceutical compositions therefor |
| US5244676A (en) * | 1987-10-09 | 1993-09-14 | Monsanto Company | Modified tissue plasminogen activator with modified glycosylation site |
| AU618039B2 (en) * | 1987-10-29 | 1991-12-12 | Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd. | Novel polypeptide compounds |
| US5094953A (en) * | 1988-03-21 | 1992-03-10 | Genentech, Inc. | Human tissue plasminogen activator variants |
| US5346824A (en) * | 1988-05-20 | 1994-09-13 | Genentech, Inc. | DNA encoding variants of tissue plasminogen activators and expression vectors and hosts thereof |
| US5270198A (en) * | 1988-05-20 | 1993-12-14 | Genentech, Inc. | DNA molecules encoding variants of tissue plasminogen activators, vectors, and host cells |
| IL90146A (en) * | 1988-05-20 | 1994-10-07 | Genentech Inc | Glycosylation derivatives of tissue plasminogen activator |
| DE3823805A1 (de) * | 1988-07-14 | 1990-01-18 | Basf Ag | Neue polypeptide, ihre herstellung und verwendung |
| US5108901A (en) * | 1988-09-02 | 1992-04-28 | Genentech, Inc. | Tissue plasminogen activator having zymogenic or fibrin specific properties |
| US5258180A (en) * | 1988-09-02 | 1993-11-02 | Genetech, Inc. | Tissue plasminogen activator having fibrin specific properties and deletion of amino acids 466-970, compositions and methods of treatment |
| US5714145A (en) * | 1988-09-02 | 1998-02-03 | Genentech, Inc. | Tissue plasminogen activator having zymogenic or fibrin specific properties |
| US5262170A (en) * | 1988-09-02 | 1993-11-16 | Genentech, Inc. | Tissue plasminogen activator having zymogenic or fibrin specific properties and substituted at amino acid positions 296-299, DNA molecules encoding them, vectors, and host cells |
| US5070021A (en) * | 1989-01-10 | 1991-12-03 | Monsanto Company | Method of modifying oligosaccharide structure of tissue plasminogen activator |
| CA2007364A1 (en) * | 1989-01-17 | 1990-07-17 | David J. Livingston | Gene sequences encoding modified residues situated in the protease domain of tpa |
| IT1243774B (it) * | 1990-08-02 | 1994-06-28 | Erba Carlo Spa | Derivati della prourochinasi |
| US5223408A (en) * | 1991-07-11 | 1993-06-29 | Genentech, Inc. | Method for making variant secreted proteins with altered properties |
| DK0643772T3 (da) * | 1992-06-03 | 1998-02-02 | Genentech Inc | Glycosyleringsvarianter af vævsplasminogenaktivator med forbedrede terapeutiske egenskaber |
| WO2000065070A2 (en) | 1999-04-26 | 2000-11-02 | Genentech, Inc. | Cell culture process for glycoproteins |
| US6649597B1 (en) | 2000-06-22 | 2003-11-18 | The University Of Iowa Research Foundation | Targeting vector to the urokinase plasminogen activator receptor |
| WO2002020802A1 (fr) * | 2000-09-04 | 2002-03-14 | Hunan Royal Biotech | Lignee cellulaire exprimant un activateur de plasminogene tissulaire humain mutant, procede de recombinaison et procede de preparation de la proteine exprimee |
| IL145209A0 (en) * | 2000-09-06 | 2002-06-30 | Pfizer Prod Inc | Pharmaceutical combinations for the treatment of stroke and traumatic brain injury |
| KR100701265B1 (ko) * | 2006-01-16 | 2007-04-02 | 대한민국 | 재조합 사람 조직형 플라스미노겐 활성인자 발현벡터 및 플라스미노겐 활성인자를 소변으로 분비하는 형질전환돼지 생산방법 |
| KR100834561B1 (ko) * | 2006-12-08 | 2008-06-02 | 가톨릭대학교 산학협력단 | 크링글 도메인 1 및 2로 이루어진 비-글리코실화 재조합단백질, 그 제조 방법 및 이를 포함하는 조성물 |
| WO2009099631A1 (en) | 2008-02-08 | 2009-08-13 | Miles Lindsey A | Novel plasminogen receptor, polypeptides & antibodies thereof |
| KR100855024B1 (ko) | 2008-04-30 | 2008-08-28 | 가톨릭대학교 산학협력단 | 크링글 도메인 １ 및 ２ 로 이루어진 비-글리코실화 재조합단백질 |
Family Cites Families (29)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AR241654A1 (es) * | 1982-05-05 | 1992-10-30 | Genentech Inc | Procedimiento para producir activador de plasminogeno de tejido humano. |
| SU1662352A3 (ru) * | 1982-05-05 | 1991-07-07 | Генентек, Инк (Фирма) | Штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент активатора плазминогена тканевого типа |
| EP0125254A1 (en) * | 1982-10-28 | 1984-11-21 | Beecham Group Plc | Enzyme derivatives and their use in the treatment of thrombosis |
| GB8401786D0 (en) | 1984-01-24 | 1984-02-29 | Ray M S | Design and operation of adsorbent container |
| US4753879A (en) * | 1984-08-27 | 1988-06-28 | Biogen N.V. | Modified tissue plasminogen activators |
| IE81135B1 (en) * | 1984-10-01 | 2000-03-22 | Genzyme Corp | Recombinant DNA techniques and the products thereof |
| DE3537176C2 (de) * | 1984-10-18 | 1994-06-09 | Zymogenetics Inc | Gewebeplasminogenaktivator und Verfahren zu seiner Herstellung |
| JPS61247384A (ja) * | 1984-10-18 | 1986-11-04 | チモ−ジエネテイツクス インコ−ポレ−テツド | 酵母中でプラスミノ−ゲン活性化因子を発現する方法 |
| EP0201153A3 (en) * | 1985-02-09 | 1987-10-07 | Beecham Group Plc | Modified enzyme and process for its preparation |
| GB8503358D0 (en) * | 1985-02-09 | 1985-03-13 | Beecham Group Plc | Compounds |
| US5073494A (en) * | 1985-04-22 | 1991-12-17 | Genentech, Inc. | Human tissue plasminogen activator substituted at position 275 or at positions 275 and 277 |
| GR861037B (en) * | 1985-04-22 | 1986-07-16 | Genentech Inc | Novel human tissue plasminogen activator mutants |
| JPH0811066B2 (ja) * | 1985-09-30 | 1996-02-07 | インテグレーテッド・ジエネティックス・インコーポレーテッド | 組換えｄｎａが生産するヒト子宮プラスミノ−ゲンアクチベ−タ− |
| GB8528321D0 (en) * | 1985-11-18 | 1985-12-24 | Ciba Geigy Ag | Modified fibrinolytic agents |
| US5106741A (en) * | 1985-12-20 | 1992-04-21 | The Upjohn Company | Tissue plasminogen activator (TPA) analogs |
| ES2053449T3 (es) * | 1985-12-20 | 1994-08-01 | Upjohn Co | Analogos (tpa) de activadores de plasminogeno de tejido. |
| DE3684680D1 (de) * | 1985-12-23 | 1992-05-07 | Chiron Corp | Peptidplasminogenaktivatoren. |
| DE3682891D1 (de) * | 1986-02-17 | 1992-01-23 | Stichting Centraal Lab | Gewebeplasminogen-aktivator-mutant, dafuer kodierende rekombinante genetische information und verfahren zur herstellung dieser mutanten, deren verwendung und pharmazeutische zusammensetzungen. |
| US4751084A (en) * | 1986-02-26 | 1988-06-14 | Monsanto Company | Tissue plasminogen activator from normal human colon cells |
| IE81073B1 (en) * | 1986-03-18 | 2000-01-12 | Genentech Inc | Modified human tissue-type plasminogen activator and its preparation |
| ATE90967T1 (de) * | 1986-03-28 | 1993-07-15 | Creative Biomolecules Inc | Proteinanaloge des gewebs-plasminogenaktivators. |
| JPH0761266B2 (ja) * | 1986-07-03 | 1995-07-05 | 株式会社ミドリ十字 | 変異ヒトプロウロキナ−ゼ |
| DK345087A (da) * | 1986-07-11 | 1988-01-12 | Novo Industri As | Modificeret vaevsplasminogenaktivator |
| EP0266032A1 (en) * | 1986-08-29 | 1988-05-04 | Beecham Group Plc | Modified fibrinolytic enzyme |
| PT86162B (pt) * | 1986-11-21 | 1990-11-20 | Smithkline Beecham Corp | Expressao de proteina recombinante |
| NL8700013A (nl) * | 1987-01-06 | 1988-08-01 | Leuven Res & Dev Vzw | Hybride plasminogeenactivatoren met verbeterde trombolytische eigenschappen en geneesmiddelen die deze plasminogeenactivatoren bevatten. |
| GB8705377D0 (en) * | 1987-03-07 | 1987-04-08 | Beecham Group Plc | Compounds |
| US5009888A (en) * | 1987-04-13 | 1991-04-23 | Genzyme Corporation | Therapeutic enzyme-antibody complexes |
| US5258180A (en) * | 1988-09-02 | 1993-11-02 | Genetech, Inc. | Tissue plasminogen activator having fibrin specific properties and deletion of amino acids 466-970, compositions and methods of treatment |
-
1986
- 1986-12-22 DE DE8686310009T patent/DE3684680D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1986-12-22 EP EP86310009A patent/EP0227462B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-12-22 DK DK623186A patent/DK623186A/da not_active Application Discontinuation
- 1986-12-22 AT AT86310009T patent/ATE74379T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-12-22 ZA ZA869626A patent/ZA869626B/xx unknown
- 1986-12-22 AU AU66830/86A patent/AU605124B2/en not_active Ceased
- 1986-12-22 ES ES198686310009T patent/ES2031826T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1986-12-22 US US06/944,117 patent/US5501853A/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-12-23 JP JP61316095A patent/JP2575369B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1992
- 1992-05-12 GR GR920400916T patent/GR3004568T3/el unknown
-
1994
- 1994-03-10 US US08/208,202 patent/US5439679A/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-08-08 JP JP6186171A patent/JP2681000B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1994-08-08 JP JP6186170A patent/JP2680999B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-01-31 US US08/381,308 patent/US5656269A/en not_active Expired - Fee Related
-
1996
- 1996-12-17 JP JP8337365A patent/JP2769314B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-02-13 US US08/799,823 patent/US5976530A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2031826T3 (es) | 1993-01-01 |
| EP0227462B1 (en) | 1992-04-01 |
| GR3004568T3 (ja) | 1993-04-28 |
| US5439679A (en) | 1995-08-08 |
| US5656269A (en) | 1997-08-12 |
| DE3684680D1 (de) | 1992-05-07 |
| JP2575369B2 (ja) | 1997-01-22 |
| DK623186A (da) | 1987-08-26 |
| JPH09187287A (ja) | 1997-07-22 |
| JPH0787973A (ja) | 1995-04-04 |
| EP0227462A3 (en) | 1987-10-07 |
| ATE74379T1 (de) | 1992-04-15 |
| AU605124B2 (en) | 1991-01-10 |
| JP2769314B2 (ja) | 1998-06-25 |
| ZA869626B (en) | 1987-10-28 |
| JPH0775583A (ja) | 1995-03-20 |
| AU6683086A (en) | 1987-06-25 |
| EP0227462A2 (en) | 1987-07-01 |
| US5501853A (en) | 1996-03-26 |
| JP2681000B2 (ja) | 1997-11-19 |
| DK623186D0 (da) | 1986-12-22 |
| JPS62253380A (ja) | 1987-11-05 |
| US5976530A (en) | 1999-11-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2680999B2 (ja) | 新規ペプチドのプラスミノーゲンアクチベーターをコードする核酸を含有する細胞 | |
| JP2527454B2 (ja) | 新しい血栓溶解タンパク質 | |
| EP0319312B1 (en) | Vectors and compounds for direct expression of activated human protein C | |
| US5580560A (en) | Modified factor VII/VIIa | |
| US5225537A (en) | Methods for producing hybrid phospholipid-binding proteins | |
| KR920007666B1 (ko) | 변형된 섬유소 용해제의 제조방법 | |
| FR2526443A1 (fr) | Activateur de plasminogene de tissu humain, son procede de production et composition pharmaceutique le contenant | |
| JP2001513631A (ja) | 修飾されたプロテアーゼ切断部位を有するｘ因子類似体 | |
| JPH07147984A (ja) | ポリクリングルプラスミノーゲン活性化因子をコードする遺伝子およびそれを含有するベクター | |
| US5358932A (en) | Hybrid protein C | |
| CA2071630C (en) | Hybrid protein c | |
| JPH0448434B2 (ja) | ||
| EP0297066B1 (en) | Novel fibrinolytic enzymes | |
| EP0323149B1 (en) | Vectors and compounds for expression of zymogen forms of human protein C | |
| EP0387380A1 (en) | Mutants of urinary plasminogen activator, their production and use | |
| EP0373896A1 (en) | Novel thrombolytic proteins, process for producing the same, and drugs containing the same as active ingredient | |
| AU3064989A (en) | Modified gene sequences encoding modified tpa and products therefrom | |
| US6682733B1 (en) | Fibrinolytic enzymes | |
| JPH0578397A (ja) | 血栓溶解タンパク質 | |
| JPH0739374A (ja) | 新規なｔ−ＰＡ改変体 | |
| JPH0571228B2 (ja) | ||
| JPH03285685A (ja) | 新規プラスミノーゲン活性化因子誘導体およびその製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 19970707 |