JP2680999B2 - 新規ペプチドのプラスミノーゲンアクチベーターをコードする核酸を含有する細胞 - Google Patents
新規ペプチドのプラスミノーゲンアクチベーターをコードする核酸を含有する細胞Info
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Description
【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は,組織プラスミノーゲン
アクチベーター活性を持ち,遺伝子工学の技法により天
然のプラスミノーゲンアクチベーターに比べ改良された
性質を有するポリペプチド,それをコードするDNA 配列
およびその作成法に関する。また本発明は,上記 DNA配
列を含有する発現構築物,それを含有するプラスミド,
および該プラスミドを保持する細胞に関する。さらにま
た本発明は,上記ポリペプチドを含む製剤組成物に関す
る。 【0002】 【従来の技術】組織プラスミノーゲンアクチベーター(t
PA)は,凝血の溶解に関連のあるセリンプロテアーゼで
ある。この分子は,他の天然に生じるポリペプチドと相
同なアミノ酸配列を示すいくつかの明確な領域を有す
る。N末端の最初の領域は,フィブロネクチンと相同性
のある領域である。次の領域は,種々の成長因子と相同
性を持つ。この成長因子領域につづいて2つのクリング
ル領域がある。最後に,他のセリンプロテアーゼと類似
性の見られる活性部位がある。 【0003】組織プラスミノーゲンアクチベーターおよ
びそのin vivoでの凝血溶解能に関連して,少なくとも
4種の異なった特性が存在する。まず第1には,プラス
ミノーゲンを開裂して,フィブリンを分解するプラスミ
ンを生産するプロテアーゼ機能の比活性である。第2の
特性は,プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤の阻害
に対する感受性である。第3の特性は,プラスミノーゲ
ン分解活性におけるプラスミノーゲンアクチベーターの
フィブリン依存性である。第4の特性は,tPAのフィブ
リン表面への結合性である。これらの要因の各々が,凝
血存在下でプラスミノーゲンアクチベーターがプラスミ
ノーゲンをプラスミンに分解するその速さや特異性に役
割をなしている。従って,実質的な問題は,これらのカ
テゴリーに属する一種かそれ以上の特性を改善するよう
な組織プラスミノーゲンアクチベーター活性を有するポ
リペプチドが生産できることにあろう。 【0004】関連文献の簡単な説明 天然に存在するタンパクの元来の性質を高めるための,
変異処理の利用については,Craik et.al., Science(19
85) 228:291;Rosenberg et al.,Nature(1984) 312:77
-80およびWilkinson et al.,Nature (1984) 307:187-
188に報告されている。Andreasen et al., EMBO J.(19
84)3:51-56 は,tPAの開裂部位でのクリッピングがプ
ロテアーゼ活性に必要であることを報告した。Ny et
al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1984)81:5355は,ヒ
ト tPAの構造と,機能的および構造的ドメインに対する
イントロンとエクソンの相互関係について報告した。A.
J. van Zonneveld et al.,Abstract from ISTH Meet
ing, July 14-19,1985は,ヒトの組織型プラスミノーゲ
ンアクチベーターの構造と機能の相互関係について報告
した。(J. Biol Chem. (1986) 261:14214-14218)Opden
akker et al.,EMBO Workshop on Plasminogen Activat
ion(Amalfi, Italy, October 14-18,1985)は,炭水化
物側鎖の除去による tPA活性への影響について報告し
た。Loskutoff et al., Proc. Natl.Acad. Sci. USA(1
983)80:2956-2960 およびLoskutoff,Thrombos, Haemos
tos, THHADQ, 54(1):118(S699) は,プラスミノーゲ
ンアクチベーター阻害剤の特性について述べた。 【0005】 【発明が解決しようとする問題点】tPA分子に欠失や置
換を独立にまたは組み合わせて採用することにより,プ
ラスミノーゲンアクチベーター活性を持つポリペプチド
が提供され,ここでグリコシル化は変化を受け,C−末
端は不完全となり,開裂部位は修飾されている。その結
果得られた生成物は,プラスミノーゲンを活性化して,
フィブリン塊を溶解したり,凝血形成を妨げたりするの
に使用できることがわかる。これらのポリペプチドは,
部位特異的変異形成によって生成した変異遺伝子を発現
させることによって産生される。 【0006】 【問題点を解決するための手段】本発明のポリペプチド
は,凝血を溶解することにおける組織プラスミノーゲン
アクチベーター活性を持つポリペプチドであって,天然
の組織プラスミノーゲンアクチベーターの比活性の少な
くとも 0.3の比活性を有し,また組織プラスミノーゲン
アクチベーター活性を持つ天然に生じるポリペプチド中
のグリコシル化部位の数を減らすこと,C末端で少なく
とも3個のアミノ酸を欠失させること,または開裂部位
のアミノ酸を置換することの結果として,比活性,活性
のフィブリン依存性,または,阻害剤感受性に関して少
なくとも1つの改良された性質を持つ。 【0007】本発明のポリペプチドは,組織プラスミノ
ーゲン活性を持つポリペプチドであって,ヒトの組織プ
ラスミノーゲンアクチベーターに由来し,そしてアミノ
酸位置117,184および448のうち少なくとも2ヶ所でAsn
のGln による置換を持つ。 【0008】本発明のポリペプチドは,組織プラスミノ
ーゲン活性を持つポリペプチドであって,ヒトの組織プ
ラスミノーゲンアクチベーターに由来し,そしてMet525
からPro527までを欠いている。 【0009】本発明のポリペプチドは,組織プラスミノ
ーゲン活性を持つポリペプチドであって,ヒトの組織プ
ラスミノーゲンアクチベーターに由来し,そしてLys277
が Argに置換されている。 【0010】本発明のポリペプチドは,ヒトの組織プラ
スミノーゲンアクチベーターに由来し組織プラスミノー
ゲン活性を持つポリペプチドであって,アミノ酸117, 1
84および448 の少なくとも1ヶ所のグリコシル化部位で
AsnがGlnに置換されており,Met525からPro527までの配
列を欠いている。 【0011】本発明のポリペプチドは,ヒトの組織プラ
スミノーゲンアクチベーターに由来し組織プラスミノー
ゲン活性を持つポリペプチドであって,アミノ酸117, 1
84および448 の少なくとも1ヶ所のグリコシル化部位で
AsnがGlnに置換されており,Lsy277がArg に置換されて
いる。 【0012】本発明の薬剤組成物は,凝血を溶解するこ
とにおける組織プラスミノーゲンアクチベーター活性を
持つポリペプチドを凝血を溶解するに充分な量含みまた
生理学的に受容可能なキャリアを含む薬剤組成物であっ
て,該ポリペプチドが天然の組織プラスミノーゲンアク
チベーターの比活性の少なくとも 0.3の比活性を有し,
また組織プラスミノーゲンアクチベーター活性を持つ天
然に生じるポリペプチド中のグリコシル化部位の数を減
らすこと,C末端で少なくとも3個のアミノ酸を欠失さ
せること,または開裂部位のアミノ酸を置換することの
結果として,比活性,活性のフィブリン依存性,または
阻害剤感受性に関して少なくとも1つの改良された性質
を持つポリペプチドである。 【0013】本発明の DNA配列は,ヒトの組織プラスミ
ノーゲンアクチベーターに由来し組織プラスミノーゲン
活性を持つポリペプチドをコードする DNA配列であっ
て,該ポリペプチドが以下のうちの少なくとも1つを持
つという点でヒトの組織プラスミノーゲンアクチベータ
ーと異なる:(a)117-119, 184-186 および448-450 のグ
リコシル化部位の少なくとも2ヶ所の障害;(b)C末端
での少なくとも3個のアミノ酸の欠失;および,(c)ヒ
トの組織プラスミノーゲンアクチベーターの開裂部位の
アミノ酸の置換。 【0014】本発明の発現構築物は,転写の順に,転写
と翻訳の開始領域,該開始領域の転写と翻訳の制御調節
下にある DNA配列,および転写と翻訳の終結領域を含有
する発現構築物であって,該DNA配列がヒトの組織プラ
スミノーゲンアクチベーターに由来し組織プラスミノー
ゲン活性を持つポリペプチドをコードする DNA配列であ
って,該ポリペプチドが,(a)117-119, 184-186および4
48-450 のグリコシル化部位の少なくとも2ヶ所の障
害,(b)C末端での少なくとも3個のアミノ酸の欠失,
および,(c)ヒトの組織プラスミノーゲンアクチベータ
ーの開裂部位のアミノ酸の置換のうちの少なくとも1つ
を持つという点でヒトの組織プラスミノーゲンアクチベ
ーターと異なるポリペプチドである。 【0015】本発明のプラスミドは,宿主中で機能的な
複製系および発現構築物を含有するプラスミドであっ
て,該発現構築物が,転写の順に,転写と翻訳の開始領
域,該開始領域の転写と翻訳の制御調節下にある DNA配
列,および転写と翻訳の終結領域を含有する発現構築物
であって,該 DNA配列がヒトの組織プラスミノーゲンア
クチベーターに由来し組織プラスミノーゲン活性を持つ
ポリペプチドをコードする DNA配列であって,該ポリペ
プチドが,(a)117-119, 184-186 および448-450のグリ
コシル化部位の少なくとも2ヶ所の障害,(b)C末端で
の少なくとも3個のアミノ酸の欠失,および,(c)ヒト
の組織プラスミノーゲンアクチベーターの開裂部位のア
ミノ酸の置換のうちの少なくとも1つを持つという点で
ヒトの組織プラスミノーゲンアクチベーターと異なるポ
リペプチドである。 【0016】本発明のポリペプチドは,ヒトの組織プラ
スミノーゲンアクチベーターに由来し組織プラスミノー
ゲン活性を持つポリペプチドであって,Lys277がArg に
置換されており,またMet525からPro527までを欠いてい
る。 【0017】本発明のポリペプチドは,ヒトの組織プラ
スミノーゲンアクチベーターに由来し組織プラスミノー
ゲン活性を持つポリペプチドであって,アミノ酸位置11
7, 184および448 の少なくとも2ヶ所において Asnが G
lnに置換されており,Lys277がArg に置換されており,
またMet525からPro527までを欠いている。 【0018】本発明の細胞は,プラスミドを含む生育可
能な細胞であって,該プラスミドが宿主中で機能的な複
製系および発現構築物を含有するプラスミドであって,
該発現構築物が,転写の順に,転写と翻訳の開始領域,
該開始領域の転写と翻訳の制御調節下にある DNA配列,
および転写と翻訳の終結領域を含有する発現構築物であ
って,該 DNA配列がヒトの組織プラスミノーゲンアクチ
ベーターに由来し組織プラスミノーゲン活性を持つポリ
ペプチドをコードする DNA配列であって,該ポリペプチ
ドが,(a)117-119, 184-186 および448-450 のグリコシ
ル化部位の少なくとも2ヶ所の障害,(b)C末端での少
なくとも3個のアミノ酸の欠失;および,(c)ヒトの組
織プラスミノーゲンアクチベーターの開裂部位のアミノ
酸の置換のうちの少なくとも1つを持つという点でヒト
の組織プラスミノーゲンアクチベーターと異なるポリペ
プチドである。 【0019】本発明の方法は, DNA配列を作成するため
の方法であって,該 DNA配列がヒトの組織プラスミノー
ゲンアクチベーターに由来し組織プラスミノーゲン活性
を持つポリペプチドをコードする DNA配列であり,該ポ
リペプチドが,(a)117-119,184-186および448-450 のグ
リコシル化部位の少なくとも2ヶ所の障害,(b)C末端
での少なくとも3個のアミノ酸の欠失,および,(c)ヒ
トの組織プラスミノーゲンアクチベーターの開裂部位の
アミノ酸の置換のうちの少なくとも1つを持つという点
でヒトの組織プラスミノーゲンアクチベーターと異なる
ポリペプチドである DNA配列を作成するための方法であ
って,以下の工程:(1)組織プラスミノーゲンアクチベ
ーター活性を持つ天然に生じるポリペプチドをコードす
る鋳型を含有する原核生物プラスミドの一本鎖に,117-
119, 184-186および448-450のアミノ酸をコードするグ
リコシル化部位の少なくとも2ヶ所のグリコシル化部位
での障害,C末端での少なくとも3個のアミノ酸の欠
失,または開裂部位のアミノ酸の置換を生じるミスマッ
チをもつオリゴデオキシヌクレオチドをアニーリングさ
せて,部分的な二本鎖プラスミドを供する工程であっ
て,ここで,該オリゴデオキシヌクレオチドが,標的鋳
型に関して85から90%の相補性を有すること,ミスマッ
チされる座位の反対側の相補性領域の融点がほぼ等しい
こと,そして前記変異形成座位以外の前記プラスミドの
どの部位でも70%より低い相補性を持つことにより特徴
づけられる工程;(2)修正能力を欠く DNAポリメラーゼ
により該オリゴデオキシヌクレオチドを伸長して,二本
鎖プラスミドを供する工程;(3)該二本鎖プラスミドに
より宿主の原核生物細胞を形質転換し,該細胞を増殖さ
せることにより該二本鎖プラスミドを複製させる工程;
および4)該オリゴデオキシヌクレオチドの配列を持つプ
ラスミドを単離する工程,を包含する。 【0020】本発明の感受性は,ヒトの組織プラスミノ
ーゲンアクチベーターと実質的に同じアミノ酸配列を持
つポリペプチドであって,次の生理学的性質の少なくと
も1つを持つポリペプチド:天然に生じるヒトの組織プ
ラスミノーゲンアクチベーターと比較して,6.2 から7.
0 の範囲の比活性; 1.3から2.5 の範囲のフィブリン依
存性;およびプラスミノーゲンアクチベーター阻害剤の
阻害に対し10から30%の範囲で低下した。 【0021】以下に本発明を詳細に説明する。 【0022】プラスミノーゲンアクチベーターとしての
特性が高められた新規ポリペプチドが,そのようなポリ
ペプチドをコードする DNAコード配列,適切な宿主内で
そのような配列を発現させるための発現カセット,新規
ポリペプチドを発現できる宿主,および新規ポリペプチ
ドを生産する方法を含めて,提供される。新規ポリペプ
チドは,少なくともひとつのグリコシル化部位に変化を
含み, 272から280 までの領域,特にPhe274−Arg275−
Ile276−Lys277(FRIK)にある開裂部位に少なくともひと
つの変化を含み,そして/または,分子の一端かまたは
両端,特にC−末端の切断を含む。唯一の修飾がグリコ
シル化部位にあるとき, 177-119と184-186 の両方のグ
リコシル化部位は同様にまたは異なって修飾される。
(使用するアミノ酸の番号付けはPennica et al., Nat
ure (1983) 301: 214-221 の報告に基づき,グリシン−
アラニン−アルギニン−セリン−チロシンの配列のセリ
ンから始める。)組織プラスミノーゲンアクチベーター
活性を持ちヒト組織プラスミノーゲンアクチベーターに
由来するポリペプチドにこのような変化を導入すると,
生理学的特性の改善が達成可能である。 【0023】新規ポリペプチドは,タンパク分解活性,
特にプラスミノーゲン分解活性を増幅しており,プラス
ミノーゲンアクチベーター阻害に対する感受性が低下
し,フィブリン親和性が増加し,そして/またはプラス
ミノーゲン分解活性のフィブリン依存性が増している。 【0024】興味深い第1の変化は,アミノ酸117-119,
184-186 および448-450 におけるグリコシル化部位の少
なくとも1つの修飾であり,アスパラギンが保存的また
は非保存的に変化しているか,または,セリンかスレオ
ニンが特にグリシン,アラニンあるいはバリンに非保存
的に変化している。特に興味深いのは,117-119 と184-
186 のグリコシル化部位である。興味深い変異には,ア
スパラギンが他のアミノ酸,好ましくはグルタミン,バ
リン,ロイシン,イソロイシン,アラニンまたはグリシ
ン,より好ましくはグルタミンに置換されこと,また
は,セリンかスレオニンが他のアミノ酸,好ましくはア
ラニン,バリンまたはメチオニンに置換されること,つ
まりメルカプト基または中性水酸基をもたない3〜5個
の炭素原子から成る脂肪族アミノ酸に置換されること,
が含まれる。 117と184 におけるグリコシル化部位のア
スパラギンのグルタミンへの置換が特に興味深い。 【0025】変異生成物特性の所望の変化に応じて,保
存的変化または非保存的変化いずれかが含まれる。保存
的な変化は,アミノ酸間にセミコロンを付して示した。
G,A;V,I,L;D,E;K,R;N,Q;S,T;およびF,W,Y;ここで1つの
グループのアミノ酸が他のグループのアミノ酸または上
に示されていないアミノ酸に置換し,このような変化を
非保存的であると考える。 【0026】比活性は,分子のグリコシル化量を特にク
リングル構造内のグリコシル化部位,より特別にはN−
末端からC−末端方向の最初の2つのグリコシル化部位
について減少させると,増幅できることが見出された。 【0027】欠失,置換,挿入などのようなさまざまな
障害をグリコシル化部位に導入することにより,グリコ
シル化部位の3つ組を変えてグリコシル化部位を破壊す
る。例えば,117-119,184-186 および448 -450のグリコ
シル化部位を同様にまたは異なって修飾する。 【0028】次に興味深い領域は,アミノ酸の274-278
に生じる開裂部位の修飾である。特に興味深いのは,27
7 のリジンのアルギニンへの置換のような保存的変化で
ある。他の置換としては,276 のイソロイシンのバリ
ン,ロイシン,グリシンまたはアラニンへの置換を含
む。開裂部位の特異的修飾はプラスミノーゲンアクチベ
ーター阻害に対する感受性を減少させ得ることがわか
り,よってこのポリペプチドはin vivoで,天然での阻
害量のプラスミノーゲンアクチベーター阻害剤存在下
で,野生型組織プラスミノーゲンアクチベーターに比べ
て活性を増しているだろう。 【0029】第3の興味ある変化は,N末端またはC末
端の切断で,特にC末端での少なくとも1アミノ酸から
25アミノ酸まで,通常は10アミノ酸まで,より通常には
3アミノ酸までの切断である。N末端では,セリンから
始まりチロシンに続く1〜5アミノ酸,特に1〜3アミ
ノ酸が切断される。 【0030】C末端の切断は,フィブリン依存性を増幅
させ,それによって組織プラスミノーゲンアクチベータ
ーの特異性の増加が達成される。フィブリン依存性を増
加することで,開裂して凝血から離れたプラスミンとな
るプラスミノーゲンの量は実質的に減少し,プラスミン
の副作用は阻止されるであろう。 【0031】本発明の新規ポリペプチドは,上に述べた
2種,3種またはそれ以上の変化を組み合わせて得られ
る。例えば,117 と184 のグリコシル化部位のアスパラ
ギンのグルタミンによる置換(第1の型の変化例)に加
えて,開裂部位277 のリジンをアルギニンに置換するこ
とによる修飾(第2の型の変化例),またはMet525から
Pro527までの配列の切断(第3型の変化例)を行ってよ
い。 【0032】いくつかの場合,むしろ tPAを切断するよ
りは,鎖を伸長するか,または末端のアミノ酸を一般に
約1−12アミノ酸,N末端とC末端の1つか両方で伸長
する。付加したアミノ酸はリンカーとしてふるまった
り,特別な免疫応答を供したり,分子の生理学的特性を
修飾したりするであろう。 【0033】主題のポリペプチドをコードする DNA配列
は,イントロンを含む染色体 DNA,cDNA,合成DNA ,ま
たはそれらの組み合わせを使って,さまざまな方法で調
整される。所望の変異は,遺伝子を適当な細菌の宿主中
に,一本鎖バクテリオファージベクターまたは二本鎖プ
ラスミドベクターを用い,次に野生型配列に実質的に相
補的ではあるが,トランスバージョン,転位,欠失また
は挿入などの所望の変異を含むミスマッチの配列を用い
て,クローニングすることにより達成される。あるい
は,便利な制限酵素切断部位が存在すれば,特別な配列
を削り,変異を含んだ合成配列を導入できる。使用でき
る他の技術は,二本鎖鋳型の部分エキソヌクレアーゼ消
化,またはin vitro でヘテロデュプレックスを形成し
て部分的一本鎖領域をオリゴヌクレオチド−特異的変異
形成にかけることである。 【0034】特に興味深いのは,オリゴヌクレオチド特
異的変異形成である(Zoller and Smith, Methods Enzy
mol.(1983) 100:468-500.)。 【0035】欠失や挿入のミスマッチを含んだ適切なオ
リゴヌクレオチド配列としては,一般に約20から100 ヌ
クレオチド(nt),より一般的には20−60nt持つものを調
製する。この配列は,合成により簡単に調製でき,適当
なクローニングベクターでクローニングできる。このオ
リゴヌクレオチドを,部位特異的変異形成用に tPA遺伝
子か tPA類似体の精製鋳型とアニールさせる。変異は独
立に導入し,変異の部位は約10塩基対(bp),より一般に
は約20bp分離させる。異なった部位の変異は一段階また
は連続的段階で導入し,各変異後その変異の存在や tPA
類似体の活性への効果を確かめる。 【0036】変異形成プライマーの設計には,いくつか
の考察が含まれる。一般に,プライマーの長さは,標的
鋳型に対して,約85%より高く約95%より低い相補性を
持つように選択する。これによって,変異形成プライマ
ーによる簡単なプラーク選別が可能となるというさらな
る利点が供される。変異形成プライマーが,欠失を生じ
る場合,通常欠失の各端に少なくとも約20bpの相補性が
存在するであろう。また,プライマーは,変異座位の両
端において,だいたい等しい融点を供する必要がある。
さらに考えると,プライマーは鋳型上の不適当な部位か
らのプライミングを,もし除かない場合は,最少にする
よう選択されるべきである。実際,変異座位以外のあら
ゆる部位において,相補性は70%より低く,好ましくは
60%より低くあるべきである。従って,問題とする遺伝
子のみならず,クローニングベクターについても考える
べきである。特に考えなければならないことは,プライ
マーの3'末端での相補性である。 【0037】便宜上,ベクターは,たとえばM13 のよう
な一本鎖状 DNAウィルス,特にベクターとして利用する
ため修飾されたものである。便利なウィルスベクターは
M13mp9である。変異形成プライマーを鋳型やベクター
と,必要なヌクレオチドおよびT4DNA リガーゼ存在下
で,クレノー断片やT4DNA ポリメラーゼのような修正能
力を欠いた適当なポリメラーゼ存在下,アニーリング条
件のもとに一緒にして,それによって遺伝子を保持する
環状ベクターが複製可能となり,二本鎖複製型が供され
る。次いで二本鎖 DNAを適当な細胞に導入する。溶解性
ベクターを供給することで,変異形成が生じたtPA また
は tPA類似体の存在をプライマーを使って選別できるプ
ラークを得る。通常,変異形成産物としての正確な配列
を持つ可能性を増すためには,感度を増加させた,少な
くとも2回のくり返し選別が必要であろう。 【0038】次に推定上正のクローンを,例えばプラー
ク精製,電気泳動的精製などして,精製し,次いで配列
決定する。 【0039】配列決定のために,少なくとも長さが約20
から30塩基で変異座位から少なくとも約55塩基離れた位
置でアニールするであろう配列決定プライマーを設計す
る。正確な配列の妥当な保証を得るためには,変異座位
の両側少なくとも約50塩基を含む領域を配列決定するこ
とが望ましい。 【0040】一度正確に変異形成した遺伝子が得られた
ら,それを単離し,適切な宿主中で発現させるために適
切な発現ベクターに挿入する。 【0041】哺乳類,昆虫および鳥類宿主に利用する発
現ベクターには,広範囲の種類が存在する。例えば,こ
こで参考文献として採用するEPA 0,092,182 に述べられ
ているものを参照せよ。特に興味深いのは哺乳類ベクタ
ーで,これはシミアンウィルス,ウシ乳頭腫ウィルス,
アデノウィルスなどのようなウィルスのレプリコンを使
用する。 【0042】転写や翻訳の開始および終結制御領域は,
天然上 tPA遺伝子に関連する領域,ウィルスの構造遺伝
子由来の領域または宿主遺伝子由来の領域である。多く
のプロモーターが利用可能である。例えば,SV40の初期
および後期プロモーター,アデノウィルスの主要後期プ
ロモーター,β−アクチンプロモーター,ヒトCMV Imme
diate Early 〔IE1〕プロモーターなどである。望まし
くは,プロモーターは,発現を向上させるために,エン
ハンサーとともに使う。 【0043】多くの場合 tPA発現構築物を増幅すること
が望ましい。増幅または他の理由のために,発現構築物
を染色体に組み込ませることが望ましい。この目的のた
めには,構築物は不安定な複製系,例えば酵母ars 1と
結合されるか,あるいは複製系を欠くであろう。組み込
みについては例えばAxeland Wigler, 米国特許第4,399,
216 号を参照せよ。通常,マーカー発現構築物は主題の
発現構築物とタンデムであろうし,そのマーカーは増幅
遺伝子と同じでも異なったものでもよい。これは,発現
構築物とタンデムであり,tPA発現構築物と同じ宿主内
で機能を持ち,そしてDHFR(ジヒドロ葉酸還元酵素),
TK(チミジンキナーゼ),MT−Iおよび−II(メタロ
チオネイン,例えばヒト),ODC(オルニチン脱炭酸酵
素)のような増幅可能な遺伝子をコードするような tPA
を有することによって達成できる。増幅可能遺伝子に従
って宿主に圧力をかけることにより,例えばDHFRならば
メトトレキセートで圧力をかけることによって,主題の
発現構築物は増幅される。 【0044】用いる特別な宿主やシグナル配列に従っ
て,発現された tPA類似体は宿主細胞質内に保持される
かまたは分泌されるであろう。細胞質内に保持される場
合, tPA類似体は常法に従って宿主細胞をを溶解するこ
とにより単離し,抽出および精製法,好ましくは電気泳
動法,クロマトグラフィーのような方法を使用して精製
する。tPAが分泌される場合,分泌された tPAは,アフ
ィニティクロマトグラフィーを含む従来の方法に従って
上澄液から単離できる。 【0045】本発明で使用するポリペプチドの特性を組
み合わせると, tPAのよううな天然のプラスミノーゲン
アクチベーターよりも優れている。これらのポリペプチ
ドは,天然の tPAに対して少なくとも0.6 倍,しばしば
少なくとも 0.7倍,通常は少なくとも 1.0倍,一般に約
1.1−7.0 倍,そして好ましくは約 6.2から7.0 倍の比
活性を持つであろう。活性のフィブリン依存性は,天然
の tPAに対して少なくとも 0.4倍,しばしば少なくとも
約 0.6倍,通常は少なくとも約 0.7倍,そして好ましく
は少なくとも約1−2.5 倍で特に1.3 から2.5 倍であろ
う。プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤に対する感
受性は,通常天然の tPAよりも高くはなく,天然の tPA
の感受性に基づいて好ましくは,約5%低下し,より好
ましくは約10%低下から約90%低下までの範囲に及び,
特に天然の tPAより約25−90%低下しているであろう。
この主題化合物は通常,野生型 tPAよりも少なくとも1
つの見地においては優れているであろう。(試験法につ
いては実験の項を参照)。特に興味深いのは,組織プラ
スミノーゲンアクチベーター活性を持ち,実質的にヒト
tPAと同じアミノ酸配列(置換,欠失および挿入を含む
相異が10%より低い,通常は5%より低い)を持ってい
るポリペプチドである。これらのポリペプチドは以下の
性質の少なくとも1つを持っているであろう。(a)比活
性が天然 tPAの比活性の少なくとも約 0.6倍,しばしば
少なくとも約 0.7倍,通常は少なくとも約 1.0倍,一般
に約 1.1から7.0 倍,そして好ましくは約 6.2から7.0
倍である。(b)フィブリン依存性が天然 tPAの少なくと
も 0.4倍,しばしば少なくとも約 0.6倍,一般には少な
くとも約 0.7倍,そして好ましくは少なくとも約 1.0か
ら2.5 倍,特に約1.5 から2.5 倍である。(c)ヒトプラ
スミノーゲンアクチベーター阻害剤による阻害に対する
感受性の低下が天然 tPAの感受性に比較して約5%であ
り,より好ましくは約10%の低下から約90%の低下の範
囲におよび,そして特に天然 tPAよりも約25から90%低
下している。 【0046】主題のポリペプチドは,さまざまな血管の
状態や病気に対する予防処置または治療処置においてさ
まざまな方法で特異的に使用され,哺乳類宿主,特にヒ
ト宿主における血栓形成を防ぐであろう。従って,宿主
が凝血形成に感受性である場合はこれを手術中に投与し
てよく,あるいは血栓患者の処置用に投与してもよく,
これにより,深い動脈血栓,肺塞栓,頭蓋血栓および冠
状動脈血栓内に形成している凝血を溶解する。 【0047】主題化合物は,腸管によって,または非経
口的に,特に注射または注入によって投与する。これら
の化合物は,ゼラチン,ゼラチン誘導体のグループから
選択されるタンパク安定化剤,アルブミンのような保護
タンパク,糖,糖アルコールまたはアミノ酸の存在下,
水,生理食塩水または適当な緩衝系のような生理的に受
容可能な支持体中にその有効量を単独であるいは他の治
療薬,特に血管病用薬と組み合わせて投与できる。次の
実施例は,説明のためであり,決してこれに限定されな
い。 【0048】 【実施例】材料および方法 変異形成は,以下で述べるように一部変更した。Zoller
and Smith, Meth. Enzymol. (1983) 100 : 468-500 ,
で述べられている手順を用いて行った。合成DNA 変異形
成と配列決定プライマーは,N, N−ジイソプロピルホス
ホロアシダイトを用いて,Urdea et al., Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA (1983) 80 : 7461-7465で述べられ
ているようなシリカ支持体上での自動オリゴヌクレオチ
ド合成により調製した。配列決定プライマーを,バクテ
リオファージ M13でのジデオキシヌクレオチド連鎖末端
法(F. Sanger, S. Nicklen and A. R. Coulson, Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA (1977) 74 : 5463)による配
列決定用に設計した。配列決定プライマーは,長さが一
般的に20から30塩基で M13mp9 組み換え鋳型に相補的で
あり,しかも変異座位から少なくとも55塩基離れた位置
でアニールするように設計した。以下の表は,変異形成
や配列決定に用いるオリゴマーを示している。 【0049】 【表1】 【0050】変異の効果 1. Asn 117 → Gln, Asn 184 → Gln 2. Met 525から Pro 527までの欠失 3. Lys 277 → Arg 4. Lys 277 → Arg, Arg 275 → Lys 5. Asn 177 → Gln, Asn 184 → Gln, Asn 448 → Gln 配列決定プライマー 1a. ACCTTGCCTATCAGGATCAT 1b. CGAATCGCCCTGGCAGGCGTC 2. GTGGGTCTGGAGAAGTCTGTA 3, 4. GCACAGGAACCGCTCTCCGGG 5. TCGATCTGGGTTTCTGCAGTAGTTGTGGTT M13/tPA 組み換え体の変異形成は,精製した鋳型を用
い,適当なプライマーをアニーリングしそしてT4ポリメ
ラーゼのクレノー断片で伸長させることにより行った。
変異体1は,両プライマー1aおよび1bを用いて変異
処理一回の操作で得た。変異体4は, 125μg /mlの遺
伝子32タンパク,および挿入体に隣接する M13配列に結
合するヘルパープライマーの存在下で,変異体3に由来
する鋳型を用いて得た。プライマー4の効果(Arg 275
→ Lys)とプライマー3の効果(Lys 277 →Arg)を組み
合わせることにより,上に示した2ヶ所の変異部位を形
成した。変異体5は変異体1に由来する鋳型を用いて得
た。プライマー1aと1bの効果(Asn 117 → Gln,As
n 184 → Gln)をプライマー5の効果(Asn 448 →Gl
n)と組み合わせて,上に示した3ヶ所の変異部位を形
成した。 JM101細胞へのトランスフェクション(Zoller
and Smith,上記)に続き,プラークを 200−1000プラ
ーク/プレートの濃度に増殖させ,フィルターに釣り上
げ,適当な変異形成プライマーあるいはプローブでハイ
ブリダイゼーションにより選別した。これらのプラーク
のうち10から40パーセントを,推定上陽性の候補として
まず同定した。ファージのドットブロットハイブリダイ
ゼーションによる各実験から,この推定物からおよそ6
個を再選別することにより,強い候補が得られた。これ
らのファージを低濃度で再度プレーティングすることに
よりプラークを純化し,ニトロセルロースフィルターに
移し,プライマーと再度ハイブリダイゼーションした。
推定上陽性のクローンの DNA配列を,適当なプライマー
と鋳型調製物を用いて決定した。 【0051】変異形成座位と隣接区分(すなわち,少な
くとも50塩基)を DNA配列分析により確認した直後,複
製型(RF) DNAを SalI制限エンドヌクレアーゼで分解
し,SalIで前もって分解してアルカリ性ホスファター
ゼ処理した哺乳類発現ベクターpSV7d に挿入した。この
ベクターは,tPA cDNA発現用のSV40初期プロモーターと
エンハンサー,SV40ポリアデニル化部位,および COS細
胞でベクターに用いるためのSV40複製起点を供する。 【0052】プラスミド pSV7dを以下の様に構築した。
SV40複製起点および初期プロモーターを含む 400bpの B
amHI/HindIII断片を pSVgtI(Mulligan, R.et a
l.,J. Mol. Cell Biol. 1 : 854-864 (1981))より切出
し,精製した。SV40ポリA付加部位を含む 240bpのSV40
BclI/ BamHI断片を,pSV2/dhfr(Subramani et a
l., J. Mol. Cell Biol. 1 : 584-864 (1981))より切
出し,精製した。これら断片を以下のリンカーを介して
融合した。 【0053】 このリンカーは3つのすべての読み取り枠中の停止コド
ンと同様に,5個の制限部位を含む。SV40複製起点,SV
40初期プロモーター,停止コドン付きポリリンカーおよ
びSV40ポリアデニル化部位を含む生じた 670bpの断片
を,およそ 1.5kbの欠失のあるpBR322誘導体である pML
の(Lusky and Botchan, Cell 36 : 391 (1984) )の
BamHI部位にクローン化し,pSV6を得た。pSV6の pML配
列中の EcoRI部位と EcoRV部位を, EcoRIと EcoRVでの
分解により除去し,各末端の約 200bpを除くために Bal
31ヌクレアーゼで処理し,そして最終的に再連結して p
SV7aを得た。 Bal31による切除も, EcoRV部位よりおよ
そ 200bp離れた,SV40領域の周辺にある1つの BamHI
制限部位を除去した。SV40領域にある第2の BamHI部
位を除去するため, pSV7aを,複製起点から上流の pML
配列中で切断する NruIで分解した。これを,平滑末端
連結により再環化し,pSV7b を得た。 【0054】pSV7cと pSV7dは連続したポリリンカー置
換を示す。初めに, pSV7bを StuIと XbaIで分解し
た。それから,次のリンカーをベクターに連結し, pSV
7Cを得た。 【0055】 その後, pSV7cを BglIIと XbaIで分解し,それから
次のリンカーと連結しpSV7dを得た。 【0056】 ベクター内でのクローン化断片の適切な方向を制限部位
解析で引き出した。変異を, SalIと EcoRIに対する
制限解析により,また変異座位に対し高度に特異的な適
切なプローブを用いたそのような断片のサザンブロッテ
ィングにより再確認した。 【0057】組合せ変異体 次の4つの組合せ変異体を組み換え DNA技術を用いて構
築した:変異1および2の両方を含む変異体6,変異1
および3の両方を含む変異体7,変異2および3の両方
を含む変異体8,および3つの変異1,2および3をす
べて含む変異体9。変異の各々は便利な制限エンドヌク
レアーゼ部位により分離されており,これにより,以前
に単離した変異体1,2および3の断片由来の所望の変
異の会合が促進された。各変異体の構築に用いた特異的
な戦略を以下で述べる。 【0058】大規模なプラスミド調製を,記載の変異体
構築のすべてに対して行った。そのDNAを組織培養細胞
へのトランスフェクションに用いた。 【0059】変異体6 変異体1の1.72キロ塩基(kb)の BamHIから BstEII
までの断片は,変異させた部位Asn 117 → GlnとAsn 18
4 → Glnの両方を含む。 【0060】この断片を,Met525からPro527までの欠失
の所望変異を含む変異体2の3.38kbの BamHIから BstE
IIまでの断片に連結した。この連結混合液を,コンピ
テントなエセリシア・コリを形質転換するのに用いた。
生じたアンピシリン耐性コロニーのいくつかを増殖さ
せ,その DNAを,サイズにより,また各変異領域に特異
的な 32P末端標識化オリゴヌクレオチドプローブによる
DNAのサザンブロットのDNAハイブリダイゼーション解
析により選別した。このようなクローンは,もし2つの
個々の変異体1の領域のオリゴヌクレオチドの各々,お
よび変異体2特異的プローブにハイブリダイズするなら
ば,陽性として記録した。この選別法を,各新しい構築
に対し適切なオリゴヌクレオチドプローブの置換によ
り,各々の構築物について用いた。使用した特異的オリ
ゴヌクレオチドは以前に挙げた。 【0061】変異体7(1&3) 変異させた部位を両方含む変異体1の2.95kb ScaI断片
を,lys 277 → Argの変換を含む変異体3の2.15kb Sca
I断片に連結した。新構築の選別を,変異体3の変化お
よび変異体1の変換の各々に特異的なオリゴヌクレオチ
ドを用いて行った。 【0062】変異体8(2&3) 所望の変換を含む変異体2の3.38kbの BamHIから BstE
IIまでの断片を,Lys 277 → Arg変異を含む変異体3
の1.72kbの BamHIから BstEIIまでの断片に連結し
た。正しい組み換え体の選別を,各変異に特異的なオリ
ゴヌクレオチドを用いて行った。 【0063】変異体9(1&2&3) 三重変異体の形成戦略として,新しく構築した二重変異
体の1つである変異体7を使用した。このプラスミドを
BamHIと BstEIIで開裂し,両変異体を含む1.72kbの
断片を単離した。変異体2からのプラスミド DNAを同じ
制限酵素で分解し,3.38kbの細片(変異を含む)を単離
した。 【0064】これら2つの断片を連結し,この連結混合
液を用いてコンピテントなエセリシア・コリを形質転換
した。正確な三重変異体の選別は, DNA中の各変異部位
に特異的なオリゴヌクレオチドを用いて,上記の様に行
った。 【0065】哺乳類細胞のトランスフェクション COS-7細胞(Gluzman, Cell (1981) 23 : 175)を,Gra
ham and van der Eb,Virology (1973) 52 : 456-467で
述べられている手順を一部変更して用いて,pSV7d tPA
発現プラスミドでトランスフェクションした。サンプル
を2通りでディッシュに加え,二酸化炭素恒温器(37
℃)中,6時間,細胞上に固定させた。6時間後,上澄
液を吸引し,細胞をCaとMgのないリン酸緩衝生理食塩水
(PBS-CMF)で穏やかにゆすぎ,そして 3.5−4分間,ア
ジュバントとしての15%グリセロールにディッシュをさ
らした。ゆすいで, 4.5mg/mlグルコース, 3.7mg/ml
Na2CO3 , 292μg /mlグルタミン, 110μg /mlピル
ビン酸ナトリウム,100U/mlペニシリン,100U/mlスト
レプトマイシン,および10%胎児ウシ血清(FCS)を添加
したDMEM培地を供給した後,培地を胎児ウシ血清を欠く
培地と置き換えた。血清を除去して12時間後,下で述べ
るカゼイン−プラスミノーゲン−寒天重層を用いて,細
胞を tPAの発現について分析した。最大発現は,トラン
スフェクション開始後36と48時間の間で観察された。 【0066】CHO dhfr-細胞(Urlaub and Chasin, Pro
c. Natl.Acad. Sci. USA (1980) 77: 4216 )を,栄養
培地(1.18mg/ml Na2CO3 , 292μg /mlグルタミン,
110μg /mlピルビン酸ナトリウム,100U/mlペニシリ
ン,100U/mlストプトマイシン, 150μg /mlプロリン
および10% FCSを添加した F12)中でトランスフェクシ
ョンする前日に,10cmディッシュあたり5×105 から10
6 の細胞の濃度で塗布した。上で述べたトランスフェク
ション手順を,tPA 発現プラスミドをアデノウィルス主
要後期プロモーターにより働くdhfr遺伝子を選択マーカ
ーとして持つプラスミドと混ぜたという一部の変更を加
えて用い,リン酸カルシウムでプラスミドを共沈澱させ
た。dhfr遺伝子を持つプラスミドは,アデノウィルス-2
由来の主要後期プロモーター(Ad-MLP, 地図単位16−1
7.3)をマウスのdhfr cDNA の5'末端に融合させること
により構築した。SV40初期領域ポリアデニル化部位と S
V40小t抗原に対するイントロンをコードしている DNA
を pSV2-neo (Southern andBerg, J. Mol. Appl. Gen
et. (1982) 1 : 327-341 )より得,dhfr cDNA の3'末
端に融合した。これらの3つの区分をpBR322にサブクロ
ーン化し,プラスミドAd−dhfrを得た。DNA を細胞に添
加後48時間,細胞を選択培地(上記のようにプロリンと
胎児ウシ血清を添加した,あるいは透析した胎児ウシ血
清を添加したDMEM培地)に1:20となるように分配し
た。選択培地で1−2週間増殖後,コロニーが現れ,カ
ゼイン−プラスミノーゲン−寒天重層分析により tPA生
産を検定し,またカゼイン−プラスミノーゲンプレート
で定量分析した。 【0067】各変異体の細胞系を, 200cm3ディッシュ
中で融合するまで増殖させ,無血清培地(DMEM)中で24
時間の間保温し,そして上澄液を以下で述べるように処
理して,プラスミノーゲンアクチベーター活性を有する
ポリペプチドを精製した。 【0068】次の手順は上で述べた6つのポリペプチド
の活性を決定するために用いた。 【0069】変異タンパクの比活性を決定するために
は,サンプルの抗原濃度を定量することが必須だった。
ポリクローナル抗体を用いる EIA−キット(American D
iagnostica, Inc., Greenwich, CT)を用いた。検査
は,キットに供されているプロトコール中に述べられて
いる条件下で厳密に行い,各サンプルの5希釈物を分析
した。結果は,少なくとも3つの測定できる希釈物の平
均として表した。 【0070】プラスミノーゲンアクチベーター活性をも
つ変異タンパクの濃度 すべての細胞培養上澄液を0.01%Tween 80TMと0.01%Na
−アジドにした。次いで上澄液(50ml)を,3mlの Hep
arin-SepharoseRの存在下で室温,30分間,保温した。
Heparin-Sepharose懸濁液をカラムに充填し, 0.1M リ
ン酸塩,0.01%Tween80TMを含む緩衝液(pH 7.5)20ml
でよく洗浄した。最終的には, tPA活性は,0.05M トリ
ス−HCl ,1M KSCNおよび0.01%Tween 80TMを含む緩衝
液(pH 7.5)で溶出した。次いで溶出物を,0.01% Twe
en 80TMと0.01%Na−アジドを含むリン酸緩衝液(0.05M
,pH 7.5)5L に対して4℃,16時間透析した。tPA
サンプルを1mlずつ−25℃で凍結した。 【0071】凝血溶解検査(CLT) 凝血溶解検査を,凝固時間の代わりに溶解時間を記録す
るために一部変更されている“KC 10-Koagulo-meter ”
(Amelung, FRG)を用いて行った。 【0072】すべての試薬を37℃で予備保温した。 tPA
標品,ポリペプチド検査サンプルおよびフィブリノーゲ
ンを,1% HaemaccelTM(pH 7.4)を含むリン酸緩衝液
(0.67M )中で必要とする濃度にまで希釈した。 tPA標
品あるいはサンプルの 0.2mlを,0.2 mlのヒトプラスミ
ノーゲン(10CTA/ml),0.5mlのウシフィブリノーゲン
(0.15%)および最終的に 0.1mlのトロンビン(10IU/
ml)と混合した。溶解時間を記録し,検量曲線を用いて
tPA単位で表した。各変異タンパクの活性を少なくとも
3回分析し,平均を計算した。分析すべきサンプルの各
々について tPAの標品の4種の希釈を行った。 【0073】プラスミノーゲン溶解検定 変異タンパクのプラスミノーゲン溶解活性を,Ranby et
al.,Thromb. Res.(1982)27:743-749 で述べられてい
る放物線検定を用いて分析した。全試薬を37℃で予備保
温した。tPA標品あるいはtPA サンプルの 0.1mlを, 0.
5mlの緩衝液(0.1%Tween 80TMと0.01%Na−アジドを含
む0.1Mトリス−HCL, pH 7.5), 0.1mlの基質(S 2251(H-
D-Val-Leu-Lys-(パラ−ニトロアニリド)(Kabi AB, Sw
eden)),3mM), 0.1mlのヒトプラスミノーゲン(1CTA/
ml)および0.1 mlのフィブリン分解産物(10mg/ml)と
混合した。最終的には,混合液を37℃,45分間保温し
た。反応は 0.1mlの酢酸(50%)を加えて停止させ,光
学濃度を 405nmで読んだ。得られた検量曲線を用いてサ
ンプルの光学濃度を単位に変換した。結果は,少なくと
も5個の測定可能な希釈物の平均で表した。 【0074】さらに,同様の検査をフィブリン分解産物
(FDP)の不在下で行った。この場合, 0.5mlの代わりに
0.6mlの緩衝液が必要であった。 【0075】活性のフィブリン依存性 tPA および変異ポリペプチドがプラスミノーゲンをプラ
スミンに活性化する能力に対する補因子(フィブリンあ
るいはフィブリン分解産物(FDP)の影響を,凝血溶解検
査あるいはフィブリン依存性プラスミノーゲン溶解検定
で得た活性と,フィブリン非依存性プラスミノーゲン溶
解検定で決定した活性との比で表した。フィブリン凝血のフィブリン−アフィニティー調製 ヒトのフィブリノーゲン( 0.3%) 0.2ml量をプラスチ
ック管に入れ, 0.005mlのウシのトロンビン(500IU/m
l)と混合した。混合液を37℃で30分間静置させた。反
応終了後,凝血を注意深く除去し,抗トロンビンIII
(3IU/ml)とヘパリン(40IU/ml)を含む2mlの緩衝液
(0.1Mトリス−HCl, pH 8.0)中で37℃,30分間保温し
た。最終的に,凝血を除去し,50mlの緩衝液(0.05M ト
リス−HCl ,0.1M NaCl, pH 7.5)に対して20分間,2回
透析した。使用前に,凝血をまわりの溶液より除いた。 【0076】検査手順 すべてのサンプルをまず, 0.1% Tween80TMを含むトリ
ス緩衝液(0.1M, pH 7.5)に200ng/mlとなるように希釈
した。その後サンプルを,5%ヒトアルブミンを含む同
じ緩衝液に,最終濃度100ng/mlとなるように希釈した。
続いて,0.4mlのサンプルをフィブリン凝血存在下,室
温にて10分間保温した。最後に溶液を除き,流体相中の
抗原濃度をEIAで決定した。この実験を各サンプルにつ
き2回行った。 【0077】阻害検査 サンプルを, 0.1% Tween80TMを含むトリス緩衝液(0.
1M, pH 7.5)に最終濃度100ng/mlになるように希釈し
た。 【0078】次いで 0.2ml量を,65ウロキナーゼ阻害単
位/mlの濃度でプラスミノーゲンアクチベーター阻害剤
を含む溶液 0.2mlと混合した。対照実験では,上で述べ
たポリペプチドのサンプルを 0.2mlの緩衝液( 100%)
と混合した。混合液を10分間,37℃で保温した。保温時
間終了時点でサンプルを素早く希釈し,残存活性をフィ
ブリン依存性プラスミノーゲン溶解検定で分析した。こ
の阻害検査は各サンプルにつき2回行った。阻害感受性
を阻害されている%活性として表した。 【0079】プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤を
ヒトの胎盤より精製した。阻害画分は,いかなるタンパ
ク分解活性も,またプラスミン,トロンビンもしくはト
リプシンの阻害活性も含まない。 【0080】変異タンパクの上記検定による値を表II
にまとめて示す。 【0081】 【表2】【0082】 【表3】【0083】上の結果より,野生型tPA アミノ酸配列に
変化を生じることにより実質的な利点を達し得ること
が,明白である。従って,活性を増加させることができ
るだけでなく,同時にプラスミノーゲンアクチベーター
阻害剤に対する感受性を低下させることができ,これに
より効果的な活性について全体として非常に実質的な増
加がイン ビボで達成できる。また酵素は,増強された
フィブリン依存性を供するという点において実質的によ
り特異的にすることができ,従って凝血の不在下ではそ
れは実質的に低下した活性を有する。よって,タンパク
(あるいは酵素)の血流中のレベルを最小にし,またtP
A の望ましくない副作用を実質的に減らすために,プラ
スミノーゲンアクチベーター活性を持つこれらのポリペ
プチドはより小量で投与でき,しかも凝血に対し増加し
た活性を供する。 【0084】前述の本発明を,理解を明確にするため
に,図解と実施例により幾分詳細に述べるが,ある程度
の変化や一部変更は,添付の特許請求の範囲内で行われ
得ることは明白であろう。
アクチベーター活性を持ち,遺伝子工学の技法により天
然のプラスミノーゲンアクチベーターに比べ改良された
性質を有するポリペプチド,それをコードするDNA 配列
およびその作成法に関する。また本発明は,上記 DNA配
列を含有する発現構築物,それを含有するプラスミド,
および該プラスミドを保持する細胞に関する。さらにま
た本発明は,上記ポリペプチドを含む製剤組成物に関す
る。 【0002】 【従来の技術】組織プラスミノーゲンアクチベーター(t
PA)は,凝血の溶解に関連のあるセリンプロテアーゼで
ある。この分子は,他の天然に生じるポリペプチドと相
同なアミノ酸配列を示すいくつかの明確な領域を有す
る。N末端の最初の領域は,フィブロネクチンと相同性
のある領域である。次の領域は,種々の成長因子と相同
性を持つ。この成長因子領域につづいて2つのクリング
ル領域がある。最後に,他のセリンプロテアーゼと類似
性の見られる活性部位がある。 【0003】組織プラスミノーゲンアクチベーターおよ
びそのin vivoでの凝血溶解能に関連して,少なくとも
4種の異なった特性が存在する。まず第1には,プラス
ミノーゲンを開裂して,フィブリンを分解するプラスミ
ンを生産するプロテアーゼ機能の比活性である。第2の
特性は,プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤の阻害
に対する感受性である。第3の特性は,プラスミノーゲ
ン分解活性におけるプラスミノーゲンアクチベーターの
フィブリン依存性である。第4の特性は,tPAのフィブ
リン表面への結合性である。これらの要因の各々が,凝
血存在下でプラスミノーゲンアクチベーターがプラスミ
ノーゲンをプラスミンに分解するその速さや特異性に役
割をなしている。従って,実質的な問題は,これらのカ
テゴリーに属する一種かそれ以上の特性を改善するよう
な組織プラスミノーゲンアクチベーター活性を有するポ
リペプチドが生産できることにあろう。 【0004】関連文献の簡単な説明 天然に存在するタンパクの元来の性質を高めるための,
変異処理の利用については,Craik et.al., Science(19
85) 228:291;Rosenberg et al.,Nature(1984) 312:77
-80およびWilkinson et al.,Nature (1984) 307:187-
188に報告されている。Andreasen et al., EMBO J.(19
84)3:51-56 は,tPAの開裂部位でのクリッピングがプ
ロテアーゼ活性に必要であることを報告した。Ny et
al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1984)81:5355は,ヒ
ト tPAの構造と,機能的および構造的ドメインに対する
イントロンとエクソンの相互関係について報告した。A.
J. van Zonneveld et al.,Abstract from ISTH Meet
ing, July 14-19,1985は,ヒトの組織型プラスミノーゲ
ンアクチベーターの構造と機能の相互関係について報告
した。(J. Biol Chem. (1986) 261:14214-14218)Opden
akker et al.,EMBO Workshop on Plasminogen Activat
ion(Amalfi, Italy, October 14-18,1985)は,炭水化
物側鎖の除去による tPA活性への影響について報告し
た。Loskutoff et al., Proc. Natl.Acad. Sci. USA(1
983)80:2956-2960 およびLoskutoff,Thrombos, Haemos
tos, THHADQ, 54(1):118(S699) は,プラスミノーゲ
ンアクチベーター阻害剤の特性について述べた。 【0005】 【発明が解決しようとする問題点】tPA分子に欠失や置
換を独立にまたは組み合わせて採用することにより,プ
ラスミノーゲンアクチベーター活性を持つポリペプチド
が提供され,ここでグリコシル化は変化を受け,C−末
端は不完全となり,開裂部位は修飾されている。その結
果得られた生成物は,プラスミノーゲンを活性化して,
フィブリン塊を溶解したり,凝血形成を妨げたりするの
に使用できることがわかる。これらのポリペプチドは,
部位特異的変異形成によって生成した変異遺伝子を発現
させることによって産生される。 【0006】 【問題点を解決するための手段】本発明のポリペプチド
は,凝血を溶解することにおける組織プラスミノーゲン
アクチベーター活性を持つポリペプチドであって,天然
の組織プラスミノーゲンアクチベーターの比活性の少な
くとも 0.3の比活性を有し,また組織プラスミノーゲン
アクチベーター活性を持つ天然に生じるポリペプチド中
のグリコシル化部位の数を減らすこと,C末端で少なく
とも3個のアミノ酸を欠失させること,または開裂部位
のアミノ酸を置換することの結果として,比活性,活性
のフィブリン依存性,または,阻害剤感受性に関して少
なくとも1つの改良された性質を持つ。 【0007】本発明のポリペプチドは,組織プラスミノ
ーゲン活性を持つポリペプチドであって,ヒトの組織プ
ラスミノーゲンアクチベーターに由来し,そしてアミノ
酸位置117,184および448のうち少なくとも2ヶ所でAsn
のGln による置換を持つ。 【0008】本発明のポリペプチドは,組織プラスミノ
ーゲン活性を持つポリペプチドであって,ヒトの組織プ
ラスミノーゲンアクチベーターに由来し,そしてMet525
からPro527までを欠いている。 【0009】本発明のポリペプチドは,組織プラスミノ
ーゲン活性を持つポリペプチドであって,ヒトの組織プ
ラスミノーゲンアクチベーターに由来し,そしてLys277
が Argに置換されている。 【0010】本発明のポリペプチドは,ヒトの組織プラ
スミノーゲンアクチベーターに由来し組織プラスミノー
ゲン活性を持つポリペプチドであって,アミノ酸117, 1
84および448 の少なくとも1ヶ所のグリコシル化部位で
AsnがGlnに置換されており,Met525からPro527までの配
列を欠いている。 【0011】本発明のポリペプチドは,ヒトの組織プラ
スミノーゲンアクチベーターに由来し組織プラスミノー
ゲン活性を持つポリペプチドであって,アミノ酸117, 1
84および448 の少なくとも1ヶ所のグリコシル化部位で
AsnがGlnに置換されており,Lsy277がArg に置換されて
いる。 【0012】本発明の薬剤組成物は,凝血を溶解するこ
とにおける組織プラスミノーゲンアクチベーター活性を
持つポリペプチドを凝血を溶解するに充分な量含みまた
生理学的に受容可能なキャリアを含む薬剤組成物であっ
て,該ポリペプチドが天然の組織プラスミノーゲンアク
チベーターの比活性の少なくとも 0.3の比活性を有し,
また組織プラスミノーゲンアクチベーター活性を持つ天
然に生じるポリペプチド中のグリコシル化部位の数を減
らすこと,C末端で少なくとも3個のアミノ酸を欠失さ
せること,または開裂部位のアミノ酸を置換することの
結果として,比活性,活性のフィブリン依存性,または
阻害剤感受性に関して少なくとも1つの改良された性質
を持つポリペプチドである。 【0013】本発明の DNA配列は,ヒトの組織プラスミ
ノーゲンアクチベーターに由来し組織プラスミノーゲン
活性を持つポリペプチドをコードする DNA配列であっ
て,該ポリペプチドが以下のうちの少なくとも1つを持
つという点でヒトの組織プラスミノーゲンアクチベータ
ーと異なる:(a)117-119, 184-186 および448-450 のグ
リコシル化部位の少なくとも2ヶ所の障害;(b)C末端
での少なくとも3個のアミノ酸の欠失;および,(c)ヒ
トの組織プラスミノーゲンアクチベーターの開裂部位の
アミノ酸の置換。 【0014】本発明の発現構築物は,転写の順に,転写
と翻訳の開始領域,該開始領域の転写と翻訳の制御調節
下にある DNA配列,および転写と翻訳の終結領域を含有
する発現構築物であって,該DNA配列がヒトの組織プラ
スミノーゲンアクチベーターに由来し組織プラスミノー
ゲン活性を持つポリペプチドをコードする DNA配列であ
って,該ポリペプチドが,(a)117-119, 184-186および4
48-450 のグリコシル化部位の少なくとも2ヶ所の障
害,(b)C末端での少なくとも3個のアミノ酸の欠失,
および,(c)ヒトの組織プラスミノーゲンアクチベータ
ーの開裂部位のアミノ酸の置換のうちの少なくとも1つ
を持つという点でヒトの組織プラスミノーゲンアクチベ
ーターと異なるポリペプチドである。 【0015】本発明のプラスミドは,宿主中で機能的な
複製系および発現構築物を含有するプラスミドであっ
て,該発現構築物が,転写の順に,転写と翻訳の開始領
域,該開始領域の転写と翻訳の制御調節下にある DNA配
列,および転写と翻訳の終結領域を含有する発現構築物
であって,該 DNA配列がヒトの組織プラスミノーゲンア
クチベーターに由来し組織プラスミノーゲン活性を持つ
ポリペプチドをコードする DNA配列であって,該ポリペ
プチドが,(a)117-119, 184-186 および448-450のグリ
コシル化部位の少なくとも2ヶ所の障害,(b)C末端で
の少なくとも3個のアミノ酸の欠失,および,(c)ヒト
の組織プラスミノーゲンアクチベーターの開裂部位のア
ミノ酸の置換のうちの少なくとも1つを持つという点で
ヒトの組織プラスミノーゲンアクチベーターと異なるポ
リペプチドである。 【0016】本発明のポリペプチドは,ヒトの組織プラ
スミノーゲンアクチベーターに由来し組織プラスミノー
ゲン活性を持つポリペプチドであって,Lys277がArg に
置換されており,またMet525からPro527までを欠いてい
る。 【0017】本発明のポリペプチドは,ヒトの組織プラ
スミノーゲンアクチベーターに由来し組織プラスミノー
ゲン活性を持つポリペプチドであって,アミノ酸位置11
7, 184および448 の少なくとも2ヶ所において Asnが G
lnに置換されており,Lys277がArg に置換されており,
またMet525からPro527までを欠いている。 【0018】本発明の細胞は,プラスミドを含む生育可
能な細胞であって,該プラスミドが宿主中で機能的な複
製系および発現構築物を含有するプラスミドであって,
該発現構築物が,転写の順に,転写と翻訳の開始領域,
該開始領域の転写と翻訳の制御調節下にある DNA配列,
および転写と翻訳の終結領域を含有する発現構築物であ
って,該 DNA配列がヒトの組織プラスミノーゲンアクチ
ベーターに由来し組織プラスミノーゲン活性を持つポリ
ペプチドをコードする DNA配列であって,該ポリペプチ
ドが,(a)117-119, 184-186 および448-450 のグリコシ
ル化部位の少なくとも2ヶ所の障害,(b)C末端での少
なくとも3個のアミノ酸の欠失;および,(c)ヒトの組
織プラスミノーゲンアクチベーターの開裂部位のアミノ
酸の置換のうちの少なくとも1つを持つという点でヒト
の組織プラスミノーゲンアクチベーターと異なるポリペ
プチドである。 【0019】本発明の方法は, DNA配列を作成するため
の方法であって,該 DNA配列がヒトの組織プラスミノー
ゲンアクチベーターに由来し組織プラスミノーゲン活性
を持つポリペプチドをコードする DNA配列であり,該ポ
リペプチドが,(a)117-119,184-186および448-450 のグ
リコシル化部位の少なくとも2ヶ所の障害,(b)C末端
での少なくとも3個のアミノ酸の欠失,および,(c)ヒ
トの組織プラスミノーゲンアクチベーターの開裂部位の
アミノ酸の置換のうちの少なくとも1つを持つという点
でヒトの組織プラスミノーゲンアクチベーターと異なる
ポリペプチドである DNA配列を作成するための方法であ
って,以下の工程:(1)組織プラスミノーゲンアクチベ
ーター活性を持つ天然に生じるポリペプチドをコードす
る鋳型を含有する原核生物プラスミドの一本鎖に,117-
119, 184-186および448-450のアミノ酸をコードするグ
リコシル化部位の少なくとも2ヶ所のグリコシル化部位
での障害,C末端での少なくとも3個のアミノ酸の欠
失,または開裂部位のアミノ酸の置換を生じるミスマッ
チをもつオリゴデオキシヌクレオチドをアニーリングさ
せて,部分的な二本鎖プラスミドを供する工程であっ
て,ここで,該オリゴデオキシヌクレオチドが,標的鋳
型に関して85から90%の相補性を有すること,ミスマッ
チされる座位の反対側の相補性領域の融点がほぼ等しい
こと,そして前記変異形成座位以外の前記プラスミドの
どの部位でも70%より低い相補性を持つことにより特徴
づけられる工程;(2)修正能力を欠く DNAポリメラーゼ
により該オリゴデオキシヌクレオチドを伸長して,二本
鎖プラスミドを供する工程;(3)該二本鎖プラスミドに
より宿主の原核生物細胞を形質転換し,該細胞を増殖さ
せることにより該二本鎖プラスミドを複製させる工程;
および4)該オリゴデオキシヌクレオチドの配列を持つプ
ラスミドを単離する工程,を包含する。 【0020】本発明の感受性は,ヒトの組織プラスミノ
ーゲンアクチベーターと実質的に同じアミノ酸配列を持
つポリペプチドであって,次の生理学的性質の少なくと
も1つを持つポリペプチド:天然に生じるヒトの組織プ
ラスミノーゲンアクチベーターと比較して,6.2 から7.
0 の範囲の比活性; 1.3から2.5 の範囲のフィブリン依
存性;およびプラスミノーゲンアクチベーター阻害剤の
阻害に対し10から30%の範囲で低下した。 【0021】以下に本発明を詳細に説明する。 【0022】プラスミノーゲンアクチベーターとしての
特性が高められた新規ポリペプチドが,そのようなポリ
ペプチドをコードする DNAコード配列,適切な宿主内で
そのような配列を発現させるための発現カセット,新規
ポリペプチドを発現できる宿主,および新規ポリペプチ
ドを生産する方法を含めて,提供される。新規ポリペプ
チドは,少なくともひとつのグリコシル化部位に変化を
含み, 272から280 までの領域,特にPhe274−Arg275−
Ile276−Lys277(FRIK)にある開裂部位に少なくともひと
つの変化を含み,そして/または,分子の一端かまたは
両端,特にC−末端の切断を含む。唯一の修飾がグリコ
シル化部位にあるとき, 177-119と184-186 の両方のグ
リコシル化部位は同様にまたは異なって修飾される。
(使用するアミノ酸の番号付けはPennica et al., Nat
ure (1983) 301: 214-221 の報告に基づき,グリシン−
アラニン−アルギニン−セリン−チロシンの配列のセリ
ンから始める。)組織プラスミノーゲンアクチベーター
活性を持ちヒト組織プラスミノーゲンアクチベーターに
由来するポリペプチドにこのような変化を導入すると,
生理学的特性の改善が達成可能である。 【0023】新規ポリペプチドは,タンパク分解活性,
特にプラスミノーゲン分解活性を増幅しており,プラス
ミノーゲンアクチベーター阻害に対する感受性が低下
し,フィブリン親和性が増加し,そして/またはプラス
ミノーゲン分解活性のフィブリン依存性が増している。 【0024】興味深い第1の変化は,アミノ酸117-119,
184-186 および448-450 におけるグリコシル化部位の少
なくとも1つの修飾であり,アスパラギンが保存的また
は非保存的に変化しているか,または,セリンかスレオ
ニンが特にグリシン,アラニンあるいはバリンに非保存
的に変化している。特に興味深いのは,117-119 と184-
186 のグリコシル化部位である。興味深い変異には,ア
スパラギンが他のアミノ酸,好ましくはグルタミン,バ
リン,ロイシン,イソロイシン,アラニンまたはグリシ
ン,より好ましくはグルタミンに置換されこと,また
は,セリンかスレオニンが他のアミノ酸,好ましくはア
ラニン,バリンまたはメチオニンに置換されること,つ
まりメルカプト基または中性水酸基をもたない3〜5個
の炭素原子から成る脂肪族アミノ酸に置換されること,
が含まれる。 117と184 におけるグリコシル化部位のア
スパラギンのグルタミンへの置換が特に興味深い。 【0025】変異生成物特性の所望の変化に応じて,保
存的変化または非保存的変化いずれかが含まれる。保存
的な変化は,アミノ酸間にセミコロンを付して示した。
G,A;V,I,L;D,E;K,R;N,Q;S,T;およびF,W,Y;ここで1つの
グループのアミノ酸が他のグループのアミノ酸または上
に示されていないアミノ酸に置換し,このような変化を
非保存的であると考える。 【0026】比活性は,分子のグリコシル化量を特にク
リングル構造内のグリコシル化部位,より特別にはN−
末端からC−末端方向の最初の2つのグリコシル化部位
について減少させると,増幅できることが見出された。 【0027】欠失,置換,挿入などのようなさまざまな
障害をグリコシル化部位に導入することにより,グリコ
シル化部位の3つ組を変えてグリコシル化部位を破壊す
る。例えば,117-119,184-186 および448 -450のグリコ
シル化部位を同様にまたは異なって修飾する。 【0028】次に興味深い領域は,アミノ酸の274-278
に生じる開裂部位の修飾である。特に興味深いのは,27
7 のリジンのアルギニンへの置換のような保存的変化で
ある。他の置換としては,276 のイソロイシンのバリ
ン,ロイシン,グリシンまたはアラニンへの置換を含
む。開裂部位の特異的修飾はプラスミノーゲンアクチベ
ーター阻害に対する感受性を減少させ得ることがわか
り,よってこのポリペプチドはin vivoで,天然での阻
害量のプラスミノーゲンアクチベーター阻害剤存在下
で,野生型組織プラスミノーゲンアクチベーターに比べ
て活性を増しているだろう。 【0029】第3の興味ある変化は,N末端またはC末
端の切断で,特にC末端での少なくとも1アミノ酸から
25アミノ酸まで,通常は10アミノ酸まで,より通常には
3アミノ酸までの切断である。N末端では,セリンから
始まりチロシンに続く1〜5アミノ酸,特に1〜3アミ
ノ酸が切断される。 【0030】C末端の切断は,フィブリン依存性を増幅
させ,それによって組織プラスミノーゲンアクチベータ
ーの特異性の増加が達成される。フィブリン依存性を増
加することで,開裂して凝血から離れたプラスミンとな
るプラスミノーゲンの量は実質的に減少し,プラスミン
の副作用は阻止されるであろう。 【0031】本発明の新規ポリペプチドは,上に述べた
2種,3種またはそれ以上の変化を組み合わせて得られ
る。例えば,117 と184 のグリコシル化部位のアスパラ
ギンのグルタミンによる置換(第1の型の変化例)に加
えて,開裂部位277 のリジンをアルギニンに置換するこ
とによる修飾(第2の型の変化例),またはMet525から
Pro527までの配列の切断(第3型の変化例)を行ってよ
い。 【0032】いくつかの場合,むしろ tPAを切断するよ
りは,鎖を伸長するか,または末端のアミノ酸を一般に
約1−12アミノ酸,N末端とC末端の1つか両方で伸長
する。付加したアミノ酸はリンカーとしてふるまった
り,特別な免疫応答を供したり,分子の生理学的特性を
修飾したりするであろう。 【0033】主題のポリペプチドをコードする DNA配列
は,イントロンを含む染色体 DNA,cDNA,合成DNA ,ま
たはそれらの組み合わせを使って,さまざまな方法で調
整される。所望の変異は,遺伝子を適当な細菌の宿主中
に,一本鎖バクテリオファージベクターまたは二本鎖プ
ラスミドベクターを用い,次に野生型配列に実質的に相
補的ではあるが,トランスバージョン,転位,欠失また
は挿入などの所望の変異を含むミスマッチの配列を用い
て,クローニングすることにより達成される。あるい
は,便利な制限酵素切断部位が存在すれば,特別な配列
を削り,変異を含んだ合成配列を導入できる。使用でき
る他の技術は,二本鎖鋳型の部分エキソヌクレアーゼ消
化,またはin vitro でヘテロデュプレックスを形成し
て部分的一本鎖領域をオリゴヌクレオチド−特異的変異
形成にかけることである。 【0034】特に興味深いのは,オリゴヌクレオチド特
異的変異形成である(Zoller and Smith, Methods Enzy
mol.(1983) 100:468-500.)。 【0035】欠失や挿入のミスマッチを含んだ適切なオ
リゴヌクレオチド配列としては,一般に約20から100 ヌ
クレオチド(nt),より一般的には20−60nt持つものを調
製する。この配列は,合成により簡単に調製でき,適当
なクローニングベクターでクローニングできる。このオ
リゴヌクレオチドを,部位特異的変異形成用に tPA遺伝
子か tPA類似体の精製鋳型とアニールさせる。変異は独
立に導入し,変異の部位は約10塩基対(bp),より一般に
は約20bp分離させる。異なった部位の変異は一段階また
は連続的段階で導入し,各変異後その変異の存在や tPA
類似体の活性への効果を確かめる。 【0036】変異形成プライマーの設計には,いくつか
の考察が含まれる。一般に,プライマーの長さは,標的
鋳型に対して,約85%より高く約95%より低い相補性を
持つように選択する。これによって,変異形成プライマ
ーによる簡単なプラーク選別が可能となるというさらな
る利点が供される。変異形成プライマーが,欠失を生じ
る場合,通常欠失の各端に少なくとも約20bpの相補性が
存在するであろう。また,プライマーは,変異座位の両
端において,だいたい等しい融点を供する必要がある。
さらに考えると,プライマーは鋳型上の不適当な部位か
らのプライミングを,もし除かない場合は,最少にする
よう選択されるべきである。実際,変異座位以外のあら
ゆる部位において,相補性は70%より低く,好ましくは
60%より低くあるべきである。従って,問題とする遺伝
子のみならず,クローニングベクターについても考える
べきである。特に考えなければならないことは,プライ
マーの3'末端での相補性である。 【0037】便宜上,ベクターは,たとえばM13 のよう
な一本鎖状 DNAウィルス,特にベクターとして利用する
ため修飾されたものである。便利なウィルスベクターは
M13mp9である。変異形成プライマーを鋳型やベクター
と,必要なヌクレオチドおよびT4DNA リガーゼ存在下
で,クレノー断片やT4DNA ポリメラーゼのような修正能
力を欠いた適当なポリメラーゼ存在下,アニーリング条
件のもとに一緒にして,それによって遺伝子を保持する
環状ベクターが複製可能となり,二本鎖複製型が供され
る。次いで二本鎖 DNAを適当な細胞に導入する。溶解性
ベクターを供給することで,変異形成が生じたtPA また
は tPA類似体の存在をプライマーを使って選別できるプ
ラークを得る。通常,変異形成産物としての正確な配列
を持つ可能性を増すためには,感度を増加させた,少な
くとも2回のくり返し選別が必要であろう。 【0038】次に推定上正のクローンを,例えばプラー
ク精製,電気泳動的精製などして,精製し,次いで配列
決定する。 【0039】配列決定のために,少なくとも長さが約20
から30塩基で変異座位から少なくとも約55塩基離れた位
置でアニールするであろう配列決定プライマーを設計す
る。正確な配列の妥当な保証を得るためには,変異座位
の両側少なくとも約50塩基を含む領域を配列決定するこ
とが望ましい。 【0040】一度正確に変異形成した遺伝子が得られた
ら,それを単離し,適切な宿主中で発現させるために適
切な発現ベクターに挿入する。 【0041】哺乳類,昆虫および鳥類宿主に利用する発
現ベクターには,広範囲の種類が存在する。例えば,こ
こで参考文献として採用するEPA 0,092,182 に述べられ
ているものを参照せよ。特に興味深いのは哺乳類ベクタ
ーで,これはシミアンウィルス,ウシ乳頭腫ウィルス,
アデノウィルスなどのようなウィルスのレプリコンを使
用する。 【0042】転写や翻訳の開始および終結制御領域は,
天然上 tPA遺伝子に関連する領域,ウィルスの構造遺伝
子由来の領域または宿主遺伝子由来の領域である。多く
のプロモーターが利用可能である。例えば,SV40の初期
および後期プロモーター,アデノウィルスの主要後期プ
ロモーター,β−アクチンプロモーター,ヒトCMV Imme
diate Early 〔IE1〕プロモーターなどである。望まし
くは,プロモーターは,発現を向上させるために,エン
ハンサーとともに使う。 【0043】多くの場合 tPA発現構築物を増幅すること
が望ましい。増幅または他の理由のために,発現構築物
を染色体に組み込ませることが望ましい。この目的のた
めには,構築物は不安定な複製系,例えば酵母ars 1と
結合されるか,あるいは複製系を欠くであろう。組み込
みについては例えばAxeland Wigler, 米国特許第4,399,
216 号を参照せよ。通常,マーカー発現構築物は主題の
発現構築物とタンデムであろうし,そのマーカーは増幅
遺伝子と同じでも異なったものでもよい。これは,発現
構築物とタンデムであり,tPA発現構築物と同じ宿主内
で機能を持ち,そしてDHFR(ジヒドロ葉酸還元酵素),
TK(チミジンキナーゼ),MT−Iおよび−II(メタロ
チオネイン,例えばヒト),ODC(オルニチン脱炭酸酵
素)のような増幅可能な遺伝子をコードするような tPA
を有することによって達成できる。増幅可能遺伝子に従
って宿主に圧力をかけることにより,例えばDHFRならば
メトトレキセートで圧力をかけることによって,主題の
発現構築物は増幅される。 【0044】用いる特別な宿主やシグナル配列に従っ
て,発現された tPA類似体は宿主細胞質内に保持される
かまたは分泌されるであろう。細胞質内に保持される場
合, tPA類似体は常法に従って宿主細胞をを溶解するこ
とにより単離し,抽出および精製法,好ましくは電気泳
動法,クロマトグラフィーのような方法を使用して精製
する。tPAが分泌される場合,分泌された tPAは,アフ
ィニティクロマトグラフィーを含む従来の方法に従って
上澄液から単離できる。 【0045】本発明で使用するポリペプチドの特性を組
み合わせると, tPAのよううな天然のプラスミノーゲン
アクチベーターよりも優れている。これらのポリペプチ
ドは,天然の tPAに対して少なくとも0.6 倍,しばしば
少なくとも 0.7倍,通常は少なくとも 1.0倍,一般に約
1.1−7.0 倍,そして好ましくは約 6.2から7.0 倍の比
活性を持つであろう。活性のフィブリン依存性は,天然
の tPAに対して少なくとも 0.4倍,しばしば少なくとも
約 0.6倍,通常は少なくとも約 0.7倍,そして好ましく
は少なくとも約1−2.5 倍で特に1.3 から2.5 倍であろ
う。プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤に対する感
受性は,通常天然の tPAよりも高くはなく,天然の tPA
の感受性に基づいて好ましくは,約5%低下し,より好
ましくは約10%低下から約90%低下までの範囲に及び,
特に天然の tPAより約25−90%低下しているであろう。
この主題化合物は通常,野生型 tPAよりも少なくとも1
つの見地においては優れているであろう。(試験法につ
いては実験の項を参照)。特に興味深いのは,組織プラ
スミノーゲンアクチベーター活性を持ち,実質的にヒト
tPAと同じアミノ酸配列(置換,欠失および挿入を含む
相異が10%より低い,通常は5%より低い)を持ってい
るポリペプチドである。これらのポリペプチドは以下の
性質の少なくとも1つを持っているであろう。(a)比活
性が天然 tPAの比活性の少なくとも約 0.6倍,しばしば
少なくとも約 0.7倍,通常は少なくとも約 1.0倍,一般
に約 1.1から7.0 倍,そして好ましくは約 6.2から7.0
倍である。(b)フィブリン依存性が天然 tPAの少なくと
も 0.4倍,しばしば少なくとも約 0.6倍,一般には少な
くとも約 0.7倍,そして好ましくは少なくとも約 1.0か
ら2.5 倍,特に約1.5 から2.5 倍である。(c)ヒトプラ
スミノーゲンアクチベーター阻害剤による阻害に対する
感受性の低下が天然 tPAの感受性に比較して約5%であ
り,より好ましくは約10%の低下から約90%の低下の範
囲におよび,そして特に天然 tPAよりも約25から90%低
下している。 【0046】主題のポリペプチドは,さまざまな血管の
状態や病気に対する予防処置または治療処置においてさ
まざまな方法で特異的に使用され,哺乳類宿主,特にヒ
ト宿主における血栓形成を防ぐであろう。従って,宿主
が凝血形成に感受性である場合はこれを手術中に投与し
てよく,あるいは血栓患者の処置用に投与してもよく,
これにより,深い動脈血栓,肺塞栓,頭蓋血栓および冠
状動脈血栓内に形成している凝血を溶解する。 【0047】主題化合物は,腸管によって,または非経
口的に,特に注射または注入によって投与する。これら
の化合物は,ゼラチン,ゼラチン誘導体のグループから
選択されるタンパク安定化剤,アルブミンのような保護
タンパク,糖,糖アルコールまたはアミノ酸の存在下,
水,生理食塩水または適当な緩衝系のような生理的に受
容可能な支持体中にその有効量を単独であるいは他の治
療薬,特に血管病用薬と組み合わせて投与できる。次の
実施例は,説明のためであり,決してこれに限定されな
い。 【0048】 【実施例】材料および方法 変異形成は,以下で述べるように一部変更した。Zoller
and Smith, Meth. Enzymol. (1983) 100 : 468-500 ,
で述べられている手順を用いて行った。合成DNA 変異形
成と配列決定プライマーは,N, N−ジイソプロピルホス
ホロアシダイトを用いて,Urdea et al., Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA (1983) 80 : 7461-7465で述べられ
ているようなシリカ支持体上での自動オリゴヌクレオチ
ド合成により調製した。配列決定プライマーを,バクテ
リオファージ M13でのジデオキシヌクレオチド連鎖末端
法(F. Sanger, S. Nicklen and A. R. Coulson, Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA (1977) 74 : 5463)による配
列決定用に設計した。配列決定プライマーは,長さが一
般的に20から30塩基で M13mp9 組み換え鋳型に相補的で
あり,しかも変異座位から少なくとも55塩基離れた位置
でアニールするように設計した。以下の表は,変異形成
や配列決定に用いるオリゴマーを示している。 【0049】 【表1】 【0050】変異の効果 1. Asn 117 → Gln, Asn 184 → Gln 2. Met 525から Pro 527までの欠失 3. Lys 277 → Arg 4. Lys 277 → Arg, Arg 275 → Lys 5. Asn 177 → Gln, Asn 184 → Gln, Asn 448 → Gln 配列決定プライマー 1a. ACCTTGCCTATCAGGATCAT 1b. CGAATCGCCCTGGCAGGCGTC 2. GTGGGTCTGGAGAAGTCTGTA 3, 4. GCACAGGAACCGCTCTCCGGG 5. TCGATCTGGGTTTCTGCAGTAGTTGTGGTT M13/tPA 組み換え体の変異形成は,精製した鋳型を用
い,適当なプライマーをアニーリングしそしてT4ポリメ
ラーゼのクレノー断片で伸長させることにより行った。
変異体1は,両プライマー1aおよび1bを用いて変異
処理一回の操作で得た。変異体4は, 125μg /mlの遺
伝子32タンパク,および挿入体に隣接する M13配列に結
合するヘルパープライマーの存在下で,変異体3に由来
する鋳型を用いて得た。プライマー4の効果(Arg 275
→ Lys)とプライマー3の効果(Lys 277 →Arg)を組み
合わせることにより,上に示した2ヶ所の変異部位を形
成した。変異体5は変異体1に由来する鋳型を用いて得
た。プライマー1aと1bの効果(Asn 117 → Gln,As
n 184 → Gln)をプライマー5の効果(Asn 448 →Gl
n)と組み合わせて,上に示した3ヶ所の変異部位を形
成した。 JM101細胞へのトランスフェクション(Zoller
and Smith,上記)に続き,プラークを 200−1000プラ
ーク/プレートの濃度に増殖させ,フィルターに釣り上
げ,適当な変異形成プライマーあるいはプローブでハイ
ブリダイゼーションにより選別した。これらのプラーク
のうち10から40パーセントを,推定上陽性の候補として
まず同定した。ファージのドットブロットハイブリダイ
ゼーションによる各実験から,この推定物からおよそ6
個を再選別することにより,強い候補が得られた。これ
らのファージを低濃度で再度プレーティングすることに
よりプラークを純化し,ニトロセルロースフィルターに
移し,プライマーと再度ハイブリダイゼーションした。
推定上陽性のクローンの DNA配列を,適当なプライマー
と鋳型調製物を用いて決定した。 【0051】変異形成座位と隣接区分(すなわち,少な
くとも50塩基)を DNA配列分析により確認した直後,複
製型(RF) DNAを SalI制限エンドヌクレアーゼで分解
し,SalIで前もって分解してアルカリ性ホスファター
ゼ処理した哺乳類発現ベクターpSV7d に挿入した。この
ベクターは,tPA cDNA発現用のSV40初期プロモーターと
エンハンサー,SV40ポリアデニル化部位,および COS細
胞でベクターに用いるためのSV40複製起点を供する。 【0052】プラスミド pSV7dを以下の様に構築した。
SV40複製起点および初期プロモーターを含む 400bpの B
amHI/HindIII断片を pSVgtI(Mulligan, R.et a
l.,J. Mol. Cell Biol. 1 : 854-864 (1981))より切出
し,精製した。SV40ポリA付加部位を含む 240bpのSV40
BclI/ BamHI断片を,pSV2/dhfr(Subramani et a
l., J. Mol. Cell Biol. 1 : 584-864 (1981))より切
出し,精製した。これら断片を以下のリンカーを介して
融合した。 【0053】 このリンカーは3つのすべての読み取り枠中の停止コド
ンと同様に,5個の制限部位を含む。SV40複製起点,SV
40初期プロモーター,停止コドン付きポリリンカーおよ
びSV40ポリアデニル化部位を含む生じた 670bpの断片
を,およそ 1.5kbの欠失のあるpBR322誘導体である pML
の(Lusky and Botchan, Cell 36 : 391 (1984) )の
BamHI部位にクローン化し,pSV6を得た。pSV6の pML配
列中の EcoRI部位と EcoRV部位を, EcoRIと EcoRVでの
分解により除去し,各末端の約 200bpを除くために Bal
31ヌクレアーゼで処理し,そして最終的に再連結して p
SV7aを得た。 Bal31による切除も, EcoRV部位よりおよ
そ 200bp離れた,SV40領域の周辺にある1つの BamHI
制限部位を除去した。SV40領域にある第2の BamHI部
位を除去するため, pSV7aを,複製起点から上流の pML
配列中で切断する NruIで分解した。これを,平滑末端
連結により再環化し,pSV7b を得た。 【0054】pSV7cと pSV7dは連続したポリリンカー置
換を示す。初めに, pSV7bを StuIと XbaIで分解し
た。それから,次のリンカーをベクターに連結し, pSV
7Cを得た。 【0055】 その後, pSV7cを BglIIと XbaIで分解し,それから
次のリンカーと連結しpSV7dを得た。 【0056】 ベクター内でのクローン化断片の適切な方向を制限部位
解析で引き出した。変異を, SalIと EcoRIに対する
制限解析により,また変異座位に対し高度に特異的な適
切なプローブを用いたそのような断片のサザンブロッテ
ィングにより再確認した。 【0057】組合せ変異体 次の4つの組合せ変異体を組み換え DNA技術を用いて構
築した:変異1および2の両方を含む変異体6,変異1
および3の両方を含む変異体7,変異2および3の両方
を含む変異体8,および3つの変異1,2および3をす
べて含む変異体9。変異の各々は便利な制限エンドヌク
レアーゼ部位により分離されており,これにより,以前
に単離した変異体1,2および3の断片由来の所望の変
異の会合が促進された。各変異体の構築に用いた特異的
な戦略を以下で述べる。 【0058】大規模なプラスミド調製を,記載の変異体
構築のすべてに対して行った。そのDNAを組織培養細胞
へのトランスフェクションに用いた。 【0059】変異体6 変異体1の1.72キロ塩基(kb)の BamHIから BstEII
までの断片は,変異させた部位Asn 117 → GlnとAsn 18
4 → Glnの両方を含む。 【0060】この断片を,Met525からPro527までの欠失
の所望変異を含む変異体2の3.38kbの BamHIから BstE
IIまでの断片に連結した。この連結混合液を,コンピ
テントなエセリシア・コリを形質転換するのに用いた。
生じたアンピシリン耐性コロニーのいくつかを増殖さ
せ,その DNAを,サイズにより,また各変異領域に特異
的な 32P末端標識化オリゴヌクレオチドプローブによる
DNAのサザンブロットのDNAハイブリダイゼーション解
析により選別した。このようなクローンは,もし2つの
個々の変異体1の領域のオリゴヌクレオチドの各々,お
よび変異体2特異的プローブにハイブリダイズするなら
ば,陽性として記録した。この選別法を,各新しい構築
に対し適切なオリゴヌクレオチドプローブの置換によ
り,各々の構築物について用いた。使用した特異的オリ
ゴヌクレオチドは以前に挙げた。 【0061】変異体7(1&3) 変異させた部位を両方含む変異体1の2.95kb ScaI断片
を,lys 277 → Argの変換を含む変異体3の2.15kb Sca
I断片に連結した。新構築の選別を,変異体3の変化お
よび変異体1の変換の各々に特異的なオリゴヌクレオチ
ドを用いて行った。 【0062】変異体8(2&3) 所望の変換を含む変異体2の3.38kbの BamHIから BstE
IIまでの断片を,Lys 277 → Arg変異を含む変異体3
の1.72kbの BamHIから BstEIIまでの断片に連結し
た。正しい組み換え体の選別を,各変異に特異的なオリ
ゴヌクレオチドを用いて行った。 【0063】変異体9(1&2&3) 三重変異体の形成戦略として,新しく構築した二重変異
体の1つである変異体7を使用した。このプラスミドを
BamHIと BstEIIで開裂し,両変異体を含む1.72kbの
断片を単離した。変異体2からのプラスミド DNAを同じ
制限酵素で分解し,3.38kbの細片(変異を含む)を単離
した。 【0064】これら2つの断片を連結し,この連結混合
液を用いてコンピテントなエセリシア・コリを形質転換
した。正確な三重変異体の選別は, DNA中の各変異部位
に特異的なオリゴヌクレオチドを用いて,上記の様に行
った。 【0065】哺乳類細胞のトランスフェクション COS-7細胞(Gluzman, Cell (1981) 23 : 175)を,Gra
ham and van der Eb,Virology (1973) 52 : 456-467で
述べられている手順を一部変更して用いて,pSV7d tPA
発現プラスミドでトランスフェクションした。サンプル
を2通りでディッシュに加え,二酸化炭素恒温器(37
℃)中,6時間,細胞上に固定させた。6時間後,上澄
液を吸引し,細胞をCaとMgのないリン酸緩衝生理食塩水
(PBS-CMF)で穏やかにゆすぎ,そして 3.5−4分間,ア
ジュバントとしての15%グリセロールにディッシュをさ
らした。ゆすいで, 4.5mg/mlグルコース, 3.7mg/ml
Na2CO3 , 292μg /mlグルタミン, 110μg /mlピル
ビン酸ナトリウム,100U/mlペニシリン,100U/mlスト
レプトマイシン,および10%胎児ウシ血清(FCS)を添加
したDMEM培地を供給した後,培地を胎児ウシ血清を欠く
培地と置き換えた。血清を除去して12時間後,下で述べ
るカゼイン−プラスミノーゲン−寒天重層を用いて,細
胞を tPAの発現について分析した。最大発現は,トラン
スフェクション開始後36と48時間の間で観察された。 【0066】CHO dhfr-細胞(Urlaub and Chasin, Pro
c. Natl.Acad. Sci. USA (1980) 77: 4216 )を,栄養
培地(1.18mg/ml Na2CO3 , 292μg /mlグルタミン,
110μg /mlピルビン酸ナトリウム,100U/mlペニシリ
ン,100U/mlストプトマイシン, 150μg /mlプロリン
および10% FCSを添加した F12)中でトランスフェクシ
ョンする前日に,10cmディッシュあたり5×105 から10
6 の細胞の濃度で塗布した。上で述べたトランスフェク
ション手順を,tPA 発現プラスミドをアデノウィルス主
要後期プロモーターにより働くdhfr遺伝子を選択マーカ
ーとして持つプラスミドと混ぜたという一部の変更を加
えて用い,リン酸カルシウムでプラスミドを共沈澱させ
た。dhfr遺伝子を持つプラスミドは,アデノウィルス-2
由来の主要後期プロモーター(Ad-MLP, 地図単位16−1
7.3)をマウスのdhfr cDNA の5'末端に融合させること
により構築した。SV40初期領域ポリアデニル化部位と S
V40小t抗原に対するイントロンをコードしている DNA
を pSV2-neo (Southern andBerg, J. Mol. Appl. Gen
et. (1982) 1 : 327-341 )より得,dhfr cDNA の3'末
端に融合した。これらの3つの区分をpBR322にサブクロ
ーン化し,プラスミドAd−dhfrを得た。DNA を細胞に添
加後48時間,細胞を選択培地(上記のようにプロリンと
胎児ウシ血清を添加した,あるいは透析した胎児ウシ血
清を添加したDMEM培地)に1:20となるように分配し
た。選択培地で1−2週間増殖後,コロニーが現れ,カ
ゼイン−プラスミノーゲン−寒天重層分析により tPA生
産を検定し,またカゼイン−プラスミノーゲンプレート
で定量分析した。 【0067】各変異体の細胞系を, 200cm3ディッシュ
中で融合するまで増殖させ,無血清培地(DMEM)中で24
時間の間保温し,そして上澄液を以下で述べるように処
理して,プラスミノーゲンアクチベーター活性を有する
ポリペプチドを精製した。 【0068】次の手順は上で述べた6つのポリペプチド
の活性を決定するために用いた。 【0069】変異タンパクの比活性を決定するために
は,サンプルの抗原濃度を定量することが必須だった。
ポリクローナル抗体を用いる EIA−キット(American D
iagnostica, Inc., Greenwich, CT)を用いた。検査
は,キットに供されているプロトコール中に述べられて
いる条件下で厳密に行い,各サンプルの5希釈物を分析
した。結果は,少なくとも3つの測定できる希釈物の平
均として表した。 【0070】プラスミノーゲンアクチベーター活性をも
つ変異タンパクの濃度 すべての細胞培養上澄液を0.01%Tween 80TMと0.01%Na
−アジドにした。次いで上澄液(50ml)を,3mlの Hep
arin-SepharoseRの存在下で室温,30分間,保温した。
Heparin-Sepharose懸濁液をカラムに充填し, 0.1M リ
ン酸塩,0.01%Tween80TMを含む緩衝液(pH 7.5)20ml
でよく洗浄した。最終的には, tPA活性は,0.05M トリ
ス−HCl ,1M KSCNおよび0.01%Tween 80TMを含む緩衝
液(pH 7.5)で溶出した。次いで溶出物を,0.01% Twe
en 80TMと0.01%Na−アジドを含むリン酸緩衝液(0.05M
,pH 7.5)5L に対して4℃,16時間透析した。tPA
サンプルを1mlずつ−25℃で凍結した。 【0071】凝血溶解検査(CLT) 凝血溶解検査を,凝固時間の代わりに溶解時間を記録す
るために一部変更されている“KC 10-Koagulo-meter ”
(Amelung, FRG)を用いて行った。 【0072】すべての試薬を37℃で予備保温した。 tPA
標品,ポリペプチド検査サンプルおよびフィブリノーゲ
ンを,1% HaemaccelTM(pH 7.4)を含むリン酸緩衝液
(0.67M )中で必要とする濃度にまで希釈した。 tPA標
品あるいはサンプルの 0.2mlを,0.2 mlのヒトプラスミ
ノーゲン(10CTA/ml),0.5mlのウシフィブリノーゲン
(0.15%)および最終的に 0.1mlのトロンビン(10IU/
ml)と混合した。溶解時間を記録し,検量曲線を用いて
tPA単位で表した。各変異タンパクの活性を少なくとも
3回分析し,平均を計算した。分析すべきサンプルの各
々について tPAの標品の4種の希釈を行った。 【0073】プラスミノーゲン溶解検定 変異タンパクのプラスミノーゲン溶解活性を,Ranby et
al.,Thromb. Res.(1982)27:743-749 で述べられてい
る放物線検定を用いて分析した。全試薬を37℃で予備保
温した。tPA標品あるいはtPA サンプルの 0.1mlを, 0.
5mlの緩衝液(0.1%Tween 80TMと0.01%Na−アジドを含
む0.1Mトリス−HCL, pH 7.5), 0.1mlの基質(S 2251(H-
D-Val-Leu-Lys-(パラ−ニトロアニリド)(Kabi AB, Sw
eden)),3mM), 0.1mlのヒトプラスミノーゲン(1CTA/
ml)および0.1 mlのフィブリン分解産物(10mg/ml)と
混合した。最終的には,混合液を37℃,45分間保温し
た。反応は 0.1mlの酢酸(50%)を加えて停止させ,光
学濃度を 405nmで読んだ。得られた検量曲線を用いてサ
ンプルの光学濃度を単位に変換した。結果は,少なくと
も5個の測定可能な希釈物の平均で表した。 【0074】さらに,同様の検査をフィブリン分解産物
(FDP)の不在下で行った。この場合, 0.5mlの代わりに
0.6mlの緩衝液が必要であった。 【0075】活性のフィブリン依存性 tPA および変異ポリペプチドがプラスミノーゲンをプラ
スミンに活性化する能力に対する補因子(フィブリンあ
るいはフィブリン分解産物(FDP)の影響を,凝血溶解検
査あるいはフィブリン依存性プラスミノーゲン溶解検定
で得た活性と,フィブリン非依存性プラスミノーゲン溶
解検定で決定した活性との比で表した。フィブリン凝血のフィブリン−アフィニティー調製 ヒトのフィブリノーゲン( 0.3%) 0.2ml量をプラスチ
ック管に入れ, 0.005mlのウシのトロンビン(500IU/m
l)と混合した。混合液を37℃で30分間静置させた。反
応終了後,凝血を注意深く除去し,抗トロンビンIII
(3IU/ml)とヘパリン(40IU/ml)を含む2mlの緩衝液
(0.1Mトリス−HCl, pH 8.0)中で37℃,30分間保温し
た。最終的に,凝血を除去し,50mlの緩衝液(0.05M ト
リス−HCl ,0.1M NaCl, pH 7.5)に対して20分間,2回
透析した。使用前に,凝血をまわりの溶液より除いた。 【0076】検査手順 すべてのサンプルをまず, 0.1% Tween80TMを含むトリ
ス緩衝液(0.1M, pH 7.5)に200ng/mlとなるように希釈
した。その後サンプルを,5%ヒトアルブミンを含む同
じ緩衝液に,最終濃度100ng/mlとなるように希釈した。
続いて,0.4mlのサンプルをフィブリン凝血存在下,室
温にて10分間保温した。最後に溶液を除き,流体相中の
抗原濃度をEIAで決定した。この実験を各サンプルにつ
き2回行った。 【0077】阻害検査 サンプルを, 0.1% Tween80TMを含むトリス緩衝液(0.
1M, pH 7.5)に最終濃度100ng/mlになるように希釈し
た。 【0078】次いで 0.2ml量を,65ウロキナーゼ阻害単
位/mlの濃度でプラスミノーゲンアクチベーター阻害剤
を含む溶液 0.2mlと混合した。対照実験では,上で述べ
たポリペプチドのサンプルを 0.2mlの緩衝液( 100%)
と混合した。混合液を10分間,37℃で保温した。保温時
間終了時点でサンプルを素早く希釈し,残存活性をフィ
ブリン依存性プラスミノーゲン溶解検定で分析した。こ
の阻害検査は各サンプルにつき2回行った。阻害感受性
を阻害されている%活性として表した。 【0079】プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤を
ヒトの胎盤より精製した。阻害画分は,いかなるタンパ
ク分解活性も,またプラスミン,トロンビンもしくはト
リプシンの阻害活性も含まない。 【0080】変異タンパクの上記検定による値を表II
にまとめて示す。 【0081】 【表2】【0082】 【表3】【0083】上の結果より,野生型tPA アミノ酸配列に
変化を生じることにより実質的な利点を達し得ること
が,明白である。従って,活性を増加させることができ
るだけでなく,同時にプラスミノーゲンアクチベーター
阻害剤に対する感受性を低下させることができ,これに
より効果的な活性について全体として非常に実質的な増
加がイン ビボで達成できる。また酵素は,増強された
フィブリン依存性を供するという点において実質的によ
り特異的にすることができ,従って凝血の不在下ではそ
れは実質的に低下した活性を有する。よって,タンパク
(あるいは酵素)の血流中のレベルを最小にし,またtP
A の望ましくない副作用を実質的に減らすために,プラ
スミノーゲンアクチベーター活性を持つこれらのポリペ
プチドはより小量で投与でき,しかも凝血に対し増加し
た活性を供する。 【0084】前述の本発明を,理解を明確にするため
に,図解と実施例により幾分詳細に述べるが,ある程度
の変化や一部変更は,添付の特許請求の範囲内で行われ
得ることは明白であろう。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所
(C12N 5/10
C12R 1:91)
(73)特許権者 594134154
Postfach 1140,3550 Mar
burg−Lahn,Federal
Republic of German
y
(72)発明者 ガイ ミュレンバック
アメリカ合衆国 カリフォルニア
94618 オークランド,アプト.シー.,
シクスティー−サード ストリート
309
(72)発明者 アーネスト−ギュンター アフティング
ドイツ連邦共和国 3550 マールブルグ
エーエム ゾネンハング 20
(72)発明者 エーリッヒ−ポール パクーズ
ドイツ連邦共和国 3550 マールブルグ
シュミーデッカー 18
(56)参考文献 特開 昭62−130690(JP,A)
特開 昭62−24(JP,A)
特開 昭61−233630(JP,A)
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 1.少なくとも以下の1つ: (a)少なくとも1つのグリコシル化部位での少なくと
も1つのアミノ酸の置換; (b)C−末端での少なくとも3つのアミノ酸の欠失;
または、 (c)ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーターの開裂
部位における少なくとも1つのアミノ酸の置換; を有する点で、天然に生じるヒト組織プラスミノーゲン
アクチベーターとは異なるヒト組織プラスミノーゲンア
クチベーターをコードする核酸を有する生育可能な細
胞: ただし、(a)のみの修飾を有するポリペプチドをコード
する核酸を有する生育可能な細胞を除き、そして、(c)
のみの修飾を有するポリペプチドをコードする核酸を有
する生育可能な細胞を除くが、(c)のみの修飾を有する
ポリペプチドをコードする核酸であっても、アミノ酸2
77位のリジンがアルギニンで置換されているヒト組織
プラスミノーゲンアクチベーターをコードする核酸を有
する生育可能な細胞は含む。 2.前記細胞が真核細胞である、請求項1に記載の細
胞。 3.前記真核細胞が哺乳動物細胞である、請求項2に記
載の細胞。
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