NL8701021A - Humane t-pa(u-pa) substitutie-mutant eiwitten, daarvoor coderend recombinant dna, getransfecteerde gastheercellen, bereiding van de mutant eiwitten, en farmaceutische preparaten. - Google Patents

Description

h

Nw 9130

Titel: humane t-PA(u-PA) substitutie-mutant eiwitten, daarvoor coderend recombinant DNA, getransfecteerde gastheercellen, bereiding van de mutant eiwitten, en farmaceutische preparaten.

De uitvinding heeft betrekking op de constructie van een recombinant DNA molekuul en de expressie van het recombinant DNA molekuul in gastheercellen. Ook heeft de uitvinding betrekking op een werkwijze voor 5 het bereiden van humane substitutie mutanten, die zijn opgebouwd uit een segment van het glycoprotelne weefsel-type plasminogeen activator (t-PA) en uit een segment van het glycoprotelne urokinase (u-PA). Tevens betreft de uitvinding farmaceutische preparaten met anti-thrombotische 10 werking.

De theoretische gedachte, welke ten grondslag ligt aan de onderhavige uitvinding, namelijk op basis van gegevens over de chromosomale structuur van het t-PA gen (exon-intron verdeling) en de veronderstelde 15 secondaire structuur van het t-PA eiwit, het deleteren-, substitueren en muteren van autonome structurele en functionele domeinen van t-PA, is reeds neergelegd in een eerdere octrooiaanvrage (ff. Pannekoek et al., Europese Octrooiaanvrage 86200223.5 t-PA deleties.

20 Het humane glycoprotelne weefsel-type plasminogeen activator (t-PA) is en serine protease, dat wordt gesynthetiseerd in vasculair endotheelcellen, alsook in verschillende cellijnen zoals de Bowes melanoma cellijn (Rifkin et al., 1974; Rijken et al,, 1980). t-PA vervult een 25 essentiële rol in de fibrinolyse, het proces dat verantwoordelijk is voor het oplosbaar maken en derhalve verwijderen van een bloedstolsel. Het enzym t-PA katalyseert de omzetting van hetzymogeen plasminogeen in het actieve serine protease piasmine. Piasmine is het enzym dat 30 primair verantwoordelijk wordt geacht voor het lyseren 870102 1 ψ -2- Μ * van de belangrijkste eiwit-component in bloedstolsels, n.1. fibrine. In afwezigheid van fibrine heeft t-PA slechts een zeer lage plasminogeen activator activiteit, terwijl in aanwezigheid van fibrine de activiteit van 5 t-PA met een factor 100 tot meer dan 1000 wordt versneld. Door deze eigenschap van t-PA wordt piasmine vrijwel uitsluitend gegenereerd op het fibrine-oppervlak van een stolsel, en wordt een systemische vorming van piasmine in de circulatie vermeden. Dergelijke waarnemingen hebben 10 de aandacht getrokken voor t-PA als een nuttig anti-throm-bolyticum. Echter, de isolatie op grote schaal van t-PA uit de natuurlijke omgeving (bloedplasma) zou door de lage concentratie (circa 1 ng per ml) op aanzienlijke praktische en logistieke problemen stuiten. Recombinant 15 DNA technieken kunnen hierin een uitkomst bieden, teneinde relatief grote hoeveelheden te doen produceren. Het is inderdaad aangetoond, dat t-PA gesynthetiseerd met behulp van deze technieken een nuttig preparaat vertegenwoordigt voor de behandeling van patiënten, die getroffen 20 zijn door myoard infarct (Verstraete et al., 1985; Williams et al., 1986). Evenwel, het in deze studies intraveneus toedienen van een effectieve dosis t-PA vereist relatief grote hoeveelheden en kan, in een aantal gevallen, leiden tot de afbraak van andere componenten dan fibrine en 25 tot ongewenste bloedingsneigingen. De noodzaak om bij een anti-thrombotische therapie grote hoeveelheden t-PA toe te dienen hangt met name samen met de snelle klaring van t-PA in vivo (halfwaardetijd is enkele minuten).

Dit fenomeen wordt toegeschreven aan interactie met 30 een hepatische component, via welke t-PA uit de circulatie wordt verwijderd (Emeis et al., 1985), en door inactivatie via complexering met serine protease remmers, met name met de endotheliale plasminogeen activator inhibitor PAI-1 (Sprengers en Kluft, 1987). Derhalve is het wenselijk 35 dat molekulaire varianten van t-PA worden ontwikkeld, die een effectievere anti-thrombolytische werking dan 870102 < * -3- t-PA tentoonspreiden, bijvoorbeeld doordat dergelijke varianten minder efficient worden geremd door PAI-1.

Alvorens, de constructie van dergelijke molekulaire varianten en hun eigenschappen te beschrijven, zullen 5 de structurele- en biologische eigenschappen van t-PA kort worden samengevat.

t-PA wordt gesynthetiseerd als een uit één keten bestaand molekuul en kan door piasmine worden omgezet tot een uit twee ketens bestaand molekuul, middels het 10 verbreken van een enkele arginine-isoleucine peptide binding (Wallén et al., 1980). Tweeketenig t-PA bestaat uit een amino-terminale "zware" keten (H; 38 kD) en een carboxy-terminale "lichte" keten (L; 34 kD), die bijeen worden gehouden door een enkele disulfide binding.

15 Uitgaande van een gezuiverd t-PA preparaat, verkregen uit geconditioneerd medium van gekweekte Bowes melanoma cellen, is de volledige aminozuur volgorde alsook de positie van de asparagine-gekoppelde glycosylering vastgesteld (Pohl et al., 1984).

20 De constructie en isolatie van een recombinant DNA molekuul, dat de volledige genetische informatie voor t-PA (z.g.n. "full-length t-PA copie DNA of cDNA) draagt werd voor de eerste maal gerapporteerd in 1983 (Pennica et al., 1983). Tevens is de productie van biolo-25 gisch actief recombinant t-PA door getransfecteerde weefselkweek cellen gerapporteerd (Goeddel et al., 1983).

In de eerstgenoemde studies is vastgesteld, dat t-PA als een z.g.n. "precursor" eiwit wordt gesynthetiseerd, dat bestaat uit 562 aminozuren. De bepaling van de amino-30 zuur volgorde van de amino-terminus van natief t-PA

uit Bowes melanoma cellen toonde aan, dat t-PA voorkomt in twee natuurlijke varianten (Pohl et al., 1984). De S variant bestaat uit 527 aminozuren, terwijl de L variant is samengesteld uit 530 residuen. Concluderend, een 35 amino-terminaal segment van hetzij 32 hetzij 35 aminozuren wordt van het precursor eiwit afgesplitst, teneinde 87(1021 . f -4- twee typen t-PA te genereren. Er zijn geen aanwijzingen, dat andere eigenschappen aan de S- en de L variant toegeschreven moeten worden.

Op grond van homologie tussen de aminozuur volgorde 5 van t-PA met die van andere plasma-eiwitten is een model voorgesteld voor de secondaire structuur van t-PA (Pennica et al., 1983; Banyai et al., 1983). In dit model zijn verschillende structurele segmenten, die homologie vertonen met andere plasma eiwitten, geassembleerd tot een samenge-10 steld molekuul, mogelijk opgebouwd uit autonome structurele domeinen. De opheldering van de structuur van het chromosomale t-PA gen (Ny et al., 1984) heeft ondersteuning verleend voor dit hypothetische model. Deze studie toonde aan, dat de voorgestelde structurele domeinen precies 15 gecodeerd worden door hetzij een enkel exon of door een set van naastliggende exons. De H-keten van het t-PA eiwit is dan als volgt samengesteld (vanaf de amino-terminus) : a. het signaal peptide, gevolgd door de pro-sequentie, 20 segmenten die overeenkomst vertonen met het pre-pro gedeelte van ondermeer serum albumine (Patterson en Geiler, 1977; Lawn et al., 1981).

b. het z.g.n. "finger" (F) domein, dat homoloog is met de beschreven type I fingers van fibronectine (Sekiguchi 25 et al., 1981; Petersen et al., 1983).

c. Het "epidermal growth factor-achtige" (EGF of E) domein, dat structurele overeenkomsten vertoont met zowel humaan- als muize EGF (Savage et al., 1972; Gregory en Preston, 1977).

30 d. Twee zogenoemde "kringle" domeinen (Kl en K2), die ondermeer gekenmerkt worden door corresponderende posities van drie "interne" disulfide bindingen. De kringle structuur was reeds eerder beschreven voor piasmi-nogeen, dat vijf van dergelijke structuren draagt (S ottrup-Jensen 35 et al., 1978).

De carboxy-terminale L-keten van t-PA vertoont f 7 β 1 n <5 1 ·" * Ir? *·. ·* g * -5- homologie met de "familie van trypsine-achtige" serine proteasen. Recentelijk is op ons laboratorium aangetoond, dat dit gedeelte van het t-PA molekuul het katalytisch centrum bevat voor de plasminogeen activator activiteit 5 en tevens de voornaamste interactie plaats is voor de fysiologische remmer van t-PA, de endotheliale plasminogeen activator inhibitor PAI-1 (MacDonald et al., 1985; Van Zonneveld et al., 1986a).

Het voornoemde model voor de secondaire structuur 10 van t-PA doet vermoeden, dat de voorgestelde autonome structuren tevens autonome functies zouden kunnen representeren. Deze hypothese heeft, door onderzoek uitgevoerd op ons laboratorium, belangrijke ondersteuning verkregen (Europese Octrooiaanvrage 86200223.5 H. Pannekoek et 15 al., t-PA deleties; Van Zonneveld et al., 1986b). In dit onderzoek zijn t-PA cDNA deletie mutanten geconstrueerd en de door dergelijke t-PA cDNA's gecodeerde mutant eiwitten zijn vervolgens tot expressie gebracht middels transfectie van z.g.n. muize Ltk- cellen met het overeenkomstige 20 t-PA cDNA, waaruit een gedefinieerd gedeelte van het cDNA is gedeleteerd. De resultaten van deze studie toonden aan, dat de mogelijkheid de plasminogeen activator activiteit van t-PA, door de aanwezigheid van fibrine, sterk te versnellen gemedieerd wordt door twee discrete domeinen 25 van het t-PA molekuul, t.w. het finger domein (F) en het kringle domein K2. Tevens kon de versnellende werking van fibrine op de t-PA activiteit gecorreleerd worden met de fibrine-bindende eigenschap van t-PA, die eveneens gemedieerd wordt door de voornoemde twee discrete domeinen.

30 Geconcludeerd kon worden, dat althans de H-keten van het t-PA eiwit opgebouwd is uit structurele domeinen, die een autonome functie hebben. Deze gevolgtrekking opent de mogelijkheid om specifieke eigenschappen van dit molekuul te combineren met andere molekulen om aldus 35 nieuwe substitutie mutanten te verkrijgen, waarin een nieuwe combinatie van eigenschappen is opgeslagen en B ? 0 ? 1 y -6- op functionele wijze tot uitdrukking komt.

De uitvinding heeft betrekking op de constructie van cDNA's, coderend voor substitutie-mutanten van t-PA, waarbij een constant gedeelte van het op ons laboratorium 5 geconstrueerde t-PA cDNA gefuseerd is met een verschillend gedeelte van een (partieel) cDNA dat codeert voor de z.g.n. B-keten van het humane urokinase (u-PA) (Verde et al., 1984). Hiermede wordt beoogd een recombinant DNA molekuul te construeren, dat codeert voor een fusie-eiwit 10 waarin eigenschappen van zowel t-PA als u-PA zijn vertegenwoordigd. Urokinase (u-PA) is evenals t-PA een plasminogeen activator en wordt geïsoleerd uit urine of uit geconditioneerd medium van verscheidene gekweekte cellijnen. Er zijn twee verschillende vormen van urinair u-PA geïdentifi-15 ceerd, n.1. een hoog molekulaire (HMW u-PA; 54 kD) en een laag molekulaire (LMW u-PA; 33 kD) vorm, die beide plasminogeen activator activiteit bezitten. LMW u-PA wordt beschouwd als een proteolytisch degradatie product van HMW u-PA. De aminozuur volgorde van zowel HMW u-PA 20 als LMW u-PA, alsook de positie van asparaginine-gekoppelde glycosyleringsplaatsen, is volledig opgehelderd (Günzler et al., 1982a; Günzler et al., 1982b; Steffens et al., 1982). HMW u-PA bestaat uit twee ketens, die door een enkele disulfide binding zijn verbonden. De amino-terminale 25 keten (A-keten) bevat 157 residuen (1 t/m 157) en de carboxy-terminale keten (B-keten) bevat 253 aminozuren (159 t/m 411). LMW u-PA bestaat eveneens uit twee ketens, welke op dezelfde wijze en op dezelfde plaats als HMW u-PA door een disulfide binding zijn verbonden. De amino-ter-30 minale keten (Al) bestaat uit 22 residuen (136 t/m 157) en de carboxy-terminale B-keten is identiek aan de B-keten van HMW u-PA (159 t/m 411).

De constructie en isolatie van een recombinant DNA molekuul, dat de volledige genetische informatie 35 draagt voor humaan u-PA (z.g.n. u-PA cDNA) en de expressie van biologisch actief u-PA, gesynthetiseerd in Escherichia 8?c f ;:<? 1 -7- coli bacteriën, getransformeerd met een plasmide dat u-PA cDNA draagt, is beschreven (Heyneker et al., 1983).

De nucleotide volgorde van volledige lengte u-PA cDNA werd in deze studies vastgesteld, zodat de aminozuur 5 volgorde hieruit kon worden afgeleid. u-PA wordt gesynthetiseerd als een precursor molekuul bestaande uit 431 aminozuren. Het amino-terminale segment van 20 aminozuren, dat waarschijnlijk een signaal peptide functie heeft, wordt verwijderd. De aminozuur volgorde van de resterende 10 411 residuen stemt overeen met de volgorde bepaald van een u-PA preparaat, gezuiverd uit urine (Günzler et al., 1982a en 1982b; Steffens et al., 1982).

Onafhankelijk van de bovenstaande studie is door Blasi en medewerkers (Verde et al., 1984) een u-PA cDNA 15 geconstrueerd, dat tenminste de genetische informatie draagt voor de B-keten van humaan u-PA. Dit recombinant DNA molekuul is in de onderhavige aanvrage gebruikt voor de constructie van "t-PA substitutie mutant cDNA's", terwijl een ander deel is afgeleid van de op ons laborato-20 rium geconstrueerde volledige lengte t-PA cDNA (Van Zonneveld et al., 1986b). Het "u-PA cDNA" construct (Verde et al., 1984) is niet geheel opgebouwd uit cDNA daar eveneens twee ("unspliced") introns aanwezig zijn op dit DNA. Aannemelijk is, dat bij de constructie van 25 dit (partiële) u-PA CDNA is uitgegaan van een boodschapper RNA (mRNA) preparaat, waarin zich mRNA bevond dat nog introns bevatte. De aanwezigheid van deze twee introns in het u-PA cDNA maakt het noodzakelijk bij expressie-studies gebruik te maken van eukaryoten of weefselkweek cellen 30 van eukaryoten als gastheercellen, daar prokaryoten zoals Escherichia coli niet in staat zullen zijn deze introns uit het corresponderende mRNA te elimineren.

Het u-PA eiwit kan, evenals het t-PA eiwit, worden beschouwd als een molekuul dat is opgebouwd uit een 35 aantal discrete domeinen, die ieder een autonome functie vervullen. Uit de waarneming# dat zowel HMW u-PA als LMW u-PA plasminogeen activator activiteit bezit kan 8701.,1 -8- de gevolgtrekking worden getrokken, dat de B-keten het katalytisch centrum van u-PA draagt. De conclusie is in overeenstemming met de observatie, dat de B-keten homologie vertoont met de familie van trypsine-achtige 5 serine proteasen, een conclusie die eveneens voor de L-keten van t-PA werd getrokken. Daarnaast is vastgesteld, dat het amino-terminale fragment (genoemd ATF), welke zich uitstrekt van aminozuur 1 t/m 135, een autonome functie heeft in de binding van HMW u-PA aan een receptor 10 op de buitenmembraan van een monocytaire cellijn (Stoppelli et al., 1985).

Urokinase (u-PA) is op grote schaal toegepast als anti-thrombolyticum. Echter, u-PA vertoont een eigenschap die dergelijke toepassingen ernstig belemmert.

15 in tegenstelling tot t-PA, bezit u-PA een substantiële plasminogeen activator activiteit in afwezigheid van fibrine. Deze eigenschap heeft tot gevolg, dat bij in vivo toediening zowel circulerend- als aan fibrine gebonden plasminogeen zonder onderscheid wordt omgezet tot piasmine.

20 Systemische vorming van piasmine leidt tot proteolytische degradatie van fibrinogeen en van de bloedstollingsfactoren Factor V en Factor vm, mogelijk resulterend in ernstige bloedingscomplicaties.

De uitvinders zijn er nu in geslaagd om twee verschil-25 lende, humane molekulen (substitutie-mutant cDNA's) te construeren en tot expressie te brengen in gastheercellen. Deze recombinant DNA molekulen bevatten naast een vector-gedeelte een DNA sequentie, die codeert voor het belangrijkste gedeelte van de H-keten van t-PA en een DNA 30 sequentie, die tenminste codeert voor de volledige B-keten van u-PA. Hiermede wordt beoogd de eigenschap, dat de plasminogeen activator activiteit van t-PA sterk versneld wordt door de interactie van het kringle 2 (K2) domein en het finger (F) domein van t-PA met fibrine, toe te 35 voegen aan de plasminogeen activator activiteit van u-PA, welke gelegen is op.de B-keten van u-PA. Hierbij 87 6 1 n-p 1 . V In . r , -9- moet nogmaals benadrukt worden, dat de plasminogeen activator activiteit van u-PA, in afwezigheid van fibrine ("basale activiteit"), aanmerkelijk hoger is dan de basale activiteit van t-PA.

5 Verder wordt de uitvinding belichaamd in een werkwijze voor het bereiden van humane t-PA(u-PA) substitutie-mutant eiwitten, waarbij op een op zichzelf bekende wijze gastheercellen worden gekweekt, die onder toepassing van een dergelijk recombinant DNA zijn getransfecteerd, 10 en de door de gastheercellen geproduceerde humane t-PA(u-PA) substitutie-mutanten daarvan worden gewonnen.

Deze humane t-PA(u-PA) substitutie-mutant eiwitten zijn bij aanwezigheid van fibrine volgens in vitro experimenten actievere plasminogeen activatoren dan t-PA, 15 en zijn bovendien minder gevoelig voor de fysiologische remmer van t-PA, t.w. de endotheliale plasminogeen activator remmer (PAI-1).

Ook wordt de uitvinding belichaamd in een farmaceutisch preparaat met invloed op de bloedstolling en/of 20 op de fibrinolyse, omvattende humane t-PA(u-PA) substitutie-mutant eiwitten, verkregen onder toepassing van een dergelijke werkwijze, alsmede in gastheercellen, die als gevolg van transfectie met behulp van een recombinant DNA molekuul als bovenstaand gedefinieerd in staat 25 zijn om humane t-PA(u-PA) substitutie-mutant eiwitten te produceren.

Onderstaand zal in detail worden aangegeven, hoe de humane t-PA(u-PA) substitutie-mutant cDNA's zijn geconstrueerd en tot expressie gebracht zijn. Deze twee 30 mutanten zijn geconstrueerd op een wijze, waarbij rekening werd gehouden met: a) Het aantal aminozuren (arbitrair 14 residuen) dat kringle 2 (K2) van t-PA scheidt van de arginine-isoleucine peptide binding, welke door piasmine wordt verbroken, 35 resulterend in tweeketenig t-PA (Pennica et al., 1983), of 8/01 i ·: 1 -10- b) Het aantal aminozuren (arbitrair 27 residuen) dat de enkele kringle van u-PA scheidt van de lysine-isoleu-cine peptide binding, welke door piasmine wordt verbroken, resulterend in tweeketening u-PA (Heyneker et al., 5 1983).

Constructie van t-PA substitutie mutant cDNA's

Uitgangsmaterialen voor de constructies waren 10 twee recombinant DNA plasmiden. Plasmide pSV2/t-PA bevat de volledige genetische informatie (cDNA) voor humaan t-PA en de nucleotide volgorde van dit plasmide is geheel vastgesteld (Mulligan en Berg, 1981; Van Zonneveld et al, 1986b). Daarnaast werd gebruik gemaakt van het plasmide 15 pHUK-1, dat een gedeeltelijk cDNA bevat coderend voor tenminste de B-keten van humaan u-PA (Verde et al., 1984). De nucleotide volgorde van plasmide pHUK-1 is eveneens volledig opgehelderd (Okayama en Berg, 1983;

Verde et al., 1984). De nummering van restrictie plaatsen 20 in t-PA cDNA zijn genomen van Pennica et al. (1983), terwijl de nummering van restrictie plaatsen in u-PA DNA en cDNA zijn aangegeven door Verde et al. (1984).

Het DNA van plasmide pSV2/t-PA werd volledig gedigereerd met het restrictie endonuclease PstI en daarna 25 gedeeltelijk gedigereerd met het restrictie endonuclease EcoRI, met het oogmerk de restrictie plaats voor EcoRI op positie 1273 niet te "knippen". Als gevolg van deze digestie kon een restrictie fragment worden geïsoleerd, dat correspondeert met het t-PA cDNA segment vanaf EcoRI 30 (positie 801) tot PstI (positie 1312) (Fragment A).

Het DNA van plasmide pHUK-1 werd volledig gedigereerd met de restrictie endonucleases PstI en EcoRI. Als gevolg van deze digestie kon een restrictie fragment worden geïsoleerd, dat correspondeert met het u-PA (c)DNA segment 35 vanaf PstI (positie 386) tot EcoRI (positie 727) (Fragment B) · f: ?.$ < -11-

Het DNA van de vector, zijnde de replicatieve dubbelstrengige vorm van de bacteriofaag M13mp8 ( Vieira en Messing, 1982), werd volledig gedigereerd met het restrictie endonuclease EcoRI. De nu lineaire vector 5 werd gemengd met de Fragmenten A en B en met behulp van het enzym DNA ligase werd vervolgens een recombinant DNA construct bereid, bestaande uit de bovengenoemde drie componenten, waarbij het PstI uiteinde van t-PA (positie 1312) gefuseerd is met het PstI uiteinde van 10 u-pa (positie 386) en de beide EcoRI uiteinden (positie 801 van t-PA en positie 727 van u-PA) gefuseerd zijn met de beide EcoRI uiteinden van M13mp8. Dit construct werd genoemd M13mp8/t-PA:ju-PA.

Uitgaande van de enkelstrengige vorm van het DNA i5 van de bacteriofaag M13mp8/t-PA: :u-PA werden met behulp van de z.g.n. "outlooping" methode (Kramer et al., 1984) twee deletie-mutanten geconstrueerd, volgens de overwegingen zoals eerder uiteengezet. Daartoe werden twee z.g.n. "primers" gesynthetiseerd, die ieder een lengte hebben 20 van 36 nucleotiden. De nucleotide volgorde is onderstaand aangegeven:

Primer I 5' GATGTGCCCTCCTGCTCCCAGTGTGGCCAAAAGACT 3'

(aminozuren) DVPSCS QCGQK T

25

Primer II 5' GATGTGCCCTCCTGCTCCGGAAAAAAGCCCTCCTCT 3'

(aminozuren) D VPSCSGKKPSS

N.B. De corresponderende aminozuren zijn met de een-letter code aangegeven.

30

De 5' terminale helft van beide primers (18 nucleotiden) zijn identiek aan de baseparen 958 t/m 975 van t-PA cDNA, welke coderen voor de aminozuren aspara-ginezuur (D), valine (V), proline (P), serine (S), cysteine (C) en serine (S). De 3' terminale helft van primer 35 I correspondeert met de baseparen 677 t/m 698 van u-PA DNA en coderen voor de aminozuren glutamine (Q), cysteine £*01021 -12- (C), glycine (G), glutamine (Q), lysine (K) en threonine (T). De 3' terminale helft van primer II correspondeert met de baseparen 638 t/m 655 van u-PA en coderen voor de aminozuren glycine (G), lysine (K)f lysine (K), proline 5 (P), serine (S) en serine (S).

Door toepassing van de "outloop” methode, waarbij enkelstrengig DNA van de bacteriofaag Ml3mp8/t-PA::u-PA werd gehybridiseerd met hetzij primer I hetzij primer II en vervolgens in vitro een dubbelstrengige hetero-10 duplex wordt gesynthetiseerd, gevolgd door transformatie van geschikte Escherichia coli bacteriën, werden de gewenste deleties aangebracht. Door deze procedure werd een segment t-PA cDNA gedeleteerd, dat ondermeer de EcoRI restrictie plaats op positie 1273 en de PstI restrictie 15 plaats op 1312 bevat. Het segment u-PA, dat werd gedeleteerd, bevat ondermeer de restrictie plaats voor PstI op positie 386. Voor beide constructies is het nu mogelijk na zuivering van de dubbelstrengige vorm van het gemuteerde M13mp8/t-PA::u-PA een EcoRI restrictie fragment te isoleren, dat de gewenste 20 deletie bevat. Bij gebruikmaking van primer I is de lengte van dit fragment 222 baseparen (Fusiefragment A) en bij gebruikmaking van primer II is de lengte van dit fragment 261 baseparen (Fusiefragment B).

In de volgende stappen van de constructies worden 25 de Fusiefragmenten aan de 5' zijde gefuseerd met het aansluitende t-PA cDNA uit de volledige lengte t-PA cDNA en aan de 3' zijde worden de Fusiefragmenten gefuseerd met het aansluitende u-PA (c)DNA, afkomstig van het plasmide pHUK-1. Daartoe werd het DNA van het plasmide 30 pSV2/t-PA (Van Zonneveld et al., 1986b) volledig gedigereerd met de restrictie enzymen HindlII en EcoRI, waardoor een restrictie fragment kon worden geïsoleerd, dat zich uitstrekt van de HindlII restrictie plaats op het vector gedeelte van pSV2/t-PA en de EcoRI plaats op positie 35 801 in het t-PA cDNA gedeelte. Tevens werd pHUK-1 DNA

(Verde et al., 1984) volledig gedigereerd met het restrictie endonuclease PstI en gedeeltelijk met het restrictie 8701021 -13- endonuclease EcoRI, waarbij vermeden werd dat de EcoRI restrictie plaats op positie 1364 word "geknipt". Aldus kon een EcoRI-Pstl fragment worden geïsoleerd, dat correspondeert met de posities 727 en 1969 voor, respectievelijk EcoRI 5 en Pstl op pHUK-1. De vector, die voor de navolgende constructie werd gebruikt is het plasmide pUC19, dat werd gedigereerd met de restrictie endonucleasen Hindlll en Pstl (Yanisch-Peron et al., 1985).

Het Fusiefragment A (222 baseparen; EcoRI uiteinden) 10 werd gemengd met het HindlII-EcoRI fragment afkomstig van pSV2/t-PA, het EcoRI-PstI fragment afkomstig van pHUK-1 en de gedigereerde vector pUC19. Op dezelfde wijze werd het Fusiefragment B (261 baseparen), afzonderlijk, met dezelfde drie fragmenten gemengd. Na ligering 15 en transformatie van Escherichia coli stam DH1 (Maniatis et al., 1982) konden de gewenste twee verschillende recombinant DNA plasmiden worden geïsoleerd. Deze plasmiden werden genoemd: pUC19/t-PA::u-PA-I en püC19/t-PA::u-PA-II.

Het DNA van de plasmiden püC19/t-PA::U-PA-I en 20 püC19/t-PA::u-PA-II werd volledig gedigereerd met het restrictie endonuclease Hindlll en gedeeltelijk met het restrictie endonuclease BamHI, waarbij vermeden werd de BamHI plaats in het u-PA DNA gedeelte op positie 1654 te "knippen". Aldus konden twee HindlII-BamHI fragmenten 25 worden geïsoleerd, welke gerelateerd zijn aan de oorspronkelijke "outlooping" met hetzij primer I of primer II, waarvan de Hindlll restrictie plaats afkomstig is van het vector gedeelte van pSV2/t-PA en de BamHI restrictie plaats van het polylinker gedeelte van de vector püC19. In 30 essentie bevatten de HindlII-BamHI fragmenten de fusies tussen t-PA cDNA, coderend voor het belangrijkste gedeelte van de H-keten van t-PA, en de B-keten van u-PA (waarbij het verschil tussen de beide fragmenten tot uitdrukking komt in 13 aminozuren meer bij toepassing van primer 35 ii ten opzichte van de toepassing met primer I). Tenslotte werden de beide HindlII-BamHI afzonderlijk gebruikt om het volledige lengte t-PA cDNA gedeelte op het plasmide pSV2/t-PA te vervangen. Daartoe werd het DNA van plasmide pSV2/t-PA volledig gedigereerd met de restrictie endonucleasen e? c ion -14-

HindlII en BglII en het fragment geïsoleerd dat het vector gedeelte bevat. Daar de restrictie endonucleasen BamHI en BglII dezelfde DNA uiteinden genereren, konden vervolgens de bovengenoemde HindlII-BamHI fragmenten 5 geligeerd worden met de gedigereerde vector. Na transformatie van Escherichia coli DH1 bacteriën werden de gewenste twee typen recombinant DNA plasmiden geïsoleerd en gezuiverd (Maniatis et al., 1982). De nucleotide volgorde van de relevante sequenties van deze uiteindelijke plasmiden, 10 genoemd pSV2/t-PA:ju-PA-I en pSV2/t-PA::u-PA-II, werd volledig bepaald door middel van "DNA sequencen" (Sanger et al., 1977) en het relevante gedeelte van de fusie tussen t-PA cDNA en u-PA (c)DNA, alsook de corresponderende aminozuur volgorde, is in Fig. 1 weergegeven. De in 15 de navolgende paragrafen te bespreken mutant eiwitten werden genoemd t-PA::u-PA-I en t-PA::u-PA-II en worden gecodeerd door, respectievelijk, pSV2/t-PA::u-PA-I DNA en pSV2/t-PA::u-PA-II DNA. Tenslotte kan worden vermeld, dat als gevolg van de beschreven constructies, de laatstgenoemde 20 plasmiden nog slechts één intron in het u-PA gedeelte bevatten, welke oorspronkelijk afkomstig is van het plasmide pHUK-1.

Op 28 april 1987 is bij het Centraal Bureau voor Schimmelcultures (CBS) te Baarn gedeponeerd een 13. coli 25 K12 stam DH1 [pSV2/t-PA::u-PA-II], nummer CBS 293.87.

Uit het aldus toegankelijk gemaakte plasmide kan gemakkelijk, bijv. via de outlooping techniek, het kortere plasmide pSV2/t-PA:ïu-PA-I worden geconstrueerd.

30 Expressie van de mutant eiwitten t-PA::u-PA-I en t-PA::u-PA-II

De muize fibroblast cellijn (mouse· Ltk-) werd gekweekt in z.g.n. "Iscove's minimal medium", waaraan 35 werd toegevoegd, penicilline, streptomycine en 10% (v/v) foetaal kalf serum. Transfectie van deze cellen werd uitgevoerd zoals beschreven (Lopata et al., 1984; Van Zonneveld et al., 1986b). Na transfectie werden de cellen geïncubeerd in het bovengenoemde medium, echter zonder δ7: · ,2 1 -15- foe taal kalf serum. Vijf dagen na de transfectie werden geconditioneerde media geoogst, waarna Tween-80 en natrium-azide werden toegevoegd tot een eindconcentratie van, respectievelijk, 0.01% (v/v) en 0.02% (w/v). Daarna werden de geconditioneerde 5 media gedurende 16 uren bij 4 graden Celsius gedialyseerd tegen een buffer, bestaande uit 50 mM natrium-fosfaat (pH 7.4), 0.01% (v/v) Tween-80 en 0.02% (w/v) natrium-azide. Preparaten, welke op de bovenstaande wijze werden behandeld, werden dan bewaard bij 4 graden Celsius.

10

Bepaling concentratie mutant eiwitten in geconditioneerde media

De bepaling van de concentratie van de gesecreteerde 15 mutant eiwitten t-PA:ïu-PA-I, t-PAs:u-PA-II, alsook

van controle transfectie experimenten met pSV2/t-PA

DNA, coderend voor recombinant t-PA (rt-PA), werd uitgevoerd met behulp van een immunoradiometrische methode (IRMA).

De IRMA is gebaseerd op de aanwezigheid van kringle 20 1 (KI) van t-PA op alle te onderzoeken eiwitten en de

beschikbaarheid van twee verschillende monoclonale anti-t-PA

antistoffen gericht tegen KI (Van Zonneveld et al.,

1986c). Deze twee antistof preparaten zijn genoemd CLB-t-PA

72 en CLB-t-PA 16 (Van Zonneveld et al., 1986c).

25 De monoclonale anti-t-PA antistof CLB-t-PA 72 werd gekoppeld aan cyanogeen-bromide geactiveerde Sepharose en geincubeerd in 10.5 raM natrium-fosfaat (pH 7.4), 150 mM natrium-chloride (PBS), waaraan was toegevoegd 1% (w/v) runder serum albumine, 0.1% (v/v) Tween-20 30 en verschillende verdunningen van de geconditioneerde media van de getransfecteerde weefselkweek cellen, welke tevoren met behulp van Amicon centricon 30 filters circa een factor 50 waren geconcentreerd. Vervolgens werd 125 een i-gelabeld IgG-preparaat (15,000 tellen per minuut) 35 van monoclonaal CLB-t-PA 16 aan het bovengenoemde mengsel toegevoegd, teneinde de binding van antigeen aan 8701021 -16- de geïmmobiliseerde monoclonale antistof te kunnen meten.

De incubaties werden uitgevoerd in een totaal volume van 0.5 ml gedurende 18 uren bij kamertemperatuur. Tijdens de incubaties werden de mengsels "head-over-head" geroteerd.

5 De Sepharose "beads" werden vijf maal gewassen met een buffer, bevattende 0.9 M natrium-chloride, 0.1% (v/v)

Tween-20 en 10 mM EDTA en de gebonden radioactiviteit werd gemeten met behulp van een radioactiviteitsteller voor gamma-straling. Verdunningen van een standaard 10 preparaat Bowes melanoma t-PA werden gebruikt als referentie materiaal voor de concentratie bepaling. Een karakteristieke concentratie bepaling gaf de volgende resultaten: rt-PA 16 ng/ml; t-PA::u-PA-I 0.6 ng/ml en t-PA::u-PA-II 0.4 ng/ml zijnde de concentraties in de ongeconcentreerde 15 geconditioneerde media voor getransfecteerde cellen, welke onder vergelijkbare omstandigheden waren behandeld.

Het lagere expressie niveau van de mutant plasmino-geen activator eiwitten, in vergelijking met rt-PA, zal mogelijk toegeschreven moeten worden aan de aanwe-20 zigheid van een intron in het u-PA gedeelte van de t-PA substitutie mutanten. Indien "splicing" van dit intron een limiterende stap is, zou dit kunnen resulteren in een lager expressie niveau voor de mutant eiwitten, in vergelijking met de expressie van rt-PA.

25

Analyse van mutant eiwitten met behulp van gelatine-plas-minoqeen gelelectroforese

Een analyse van de mutant plasminogeen activator 30 eiwitten met behulp van gelatine-plasminogeen gelelectroforese, kan leiden tot conclusies over twee parameters van deze eiwitten, t.w. een semi-kwantitatief inzicht in de plasminogeen activator activiteit in afwezigheid van fibrine en een relatief molekulair gewicht. De bereiding 35 van dergelijke gelen (polyacrylamide, waarin geco-polymeriseerd gelatine en plasminogeen), alsook het principe waarop 870 U'1 . .

-17- dit analyse systeem is gebaseerd, is reeds eerder beschreven (Van Zonneveld et al., 1986b). De resultaten van deze analyse zijn in Fig. 2 weergegeven.

Geconcludeerd kan worden, dat beide t-PA substitutie 5 mutanten plasminogeen activator activiteit bezitten.

Deze waarneming is in overeenstemming met de vaststelling van de nucleotide volgorde van de mutant DNA1s, waarbij geen stopcodons in het translatie "leesframe" konden worden aangetoond en met de lengte van het relevante 10 coderende gedeelte van de mutant DNA's. Het relatieve molekulair gewicht van t-PA::u-PA-I en t-PA:ïu-PA-II komt overeen met lengte van het betreffende coderende gedeelte van pSV2/t-PA:ïu-PA-I en pSV2/t-PA::u-PA-II, welke correspondeert met respectievelijk, 527 en 540 15 aminozuren.

Kinetiek van plasminogeen activatie door de mutant eiwitten t-PA::u-PA-I en t-PA::u-PA-II

20 De activatie van Glu-plasminogeen tot piasmine door t-PA::u-PA-I en t-PA::u-PA-II (en door de controles rt-PA en HMW u-PA) werd uitgevoerd bij 37 graden Celsius in een buffer, bestaande uit 0.1 M TRIS-HC1 (pH 7.4), 01% (v/v) Tween-80, 0.57 mM van het chromogene substraat 25 s-2251 en, indien aangegeven, 120 /ug/ml fibrinogeen fragmenten, gegenereerd door digestie met cyanogeen-bromide (genoemd "stimulator") (Verheijen et al., 1982). Het totale reactie-volume was 250 microliter en de reacties werden uitgevoerd in "96-wells" microtiter plaatjes.

30 Een Titertek Multiscan spectrofotometer, uitgerust met een thermostaat, werd gebruikt om de ontwikkeling van de optische dichtheid bij 405 nm gedurende 5 tot 6 uren met intervallen van 10 minuten te vervolgen. Initiële reactie-snelheden werden verkregen door grafisch het 35 verband uit te zetten tussen de toename van de optische dichtheid bij 405 nm per minuut tegen de incubatietijd.

β 7 C 1 £· - 1

S

-18-

Onder deze omstandigheden correspondeert een toename van de optische dichtheid bij 405 nm per minuut met 1 eenheid met een hoeveelheid van 40 pmoles piasmine in een volume van 250 microliter (concentratie piasmine 5 160 nM). In afwezigheid van stimulator werd voor 0.2-0.4 ng/ml t-PA::u-PA-I, t-PA::u-PA-II en HMW u-PA de Glu-plasmino-geen concentratie gevarieerd van 0.11 tot 0.55 /uM, terwijl voor 1.6-3.2 ng/ml rt-PA de Glu-plasminogeen concentratie werd gevarieerd van 0.55 tot 4.4 /uM. In 10 aanwezigheid van stimulator (120 /ug/ml) werd de Glu-plasminogeen concentratie gevarieerd van 1.7 tot 27.5 nM voor 0.08-0.2 ng/ml van ieder van de mutant eiwitten, 0.32-0.64 ng/ml rt-PA en 0.1-0.2 ng/ml HMW u-PA. Voor iedere Glu-plasminogeen concentratie, zowel in aan- als afwezigheid van 15 stimulator, werden de experimenten in duplo uitgevoerd en vier maal herhaald. Met behulp van de verkregen resultaten werden z.g.n. "Lineweaver-Burk plots" uitgezet, gebruikmakend van "gewogen” lineaire regressie analyse, waarna de z.g.n. Km- en de v(max) waarden konden worden bepaald.

20 De z.g.n. k(cat) waarde kon worden berekend door gebruikmaking van de molekulair gewichten van de verschillende plasminogeen activatoren, namelijk t-PA::u-PA-I 72 kD, t-PA::u-PA-II 74 kD, rt-PA 70 kD en HMW u-PA 54 kD. De resultaten zijn in Tabel 1 weergegeven.

25 Deze kinetische analyse staat een aantal gevolgtrek kingen toe, die betrekking hebben op de affiniteit van de verschillende plasminogeen activatoren voor het substraat Glu-plasminogeen (maatstaf is de Km waarde) en de omzettings-snelheid (maatstaf is de k(cat) waarde), in aan- en 30 afwezigheid van het fibrine mimeticum "stimulator".

In afwezigheid van stimulator is de affiniteit van t-PA::u-PA-I (Km=0.61 /uM) en t-PA::u-PA-II (Km=0.88 /uM) voor Glu-plasminogeen in dezelfde orde van grootte als HMW u-PA (Km=2.2 /uM). Dit resultaat is het gevolg 35 van het feit, dat de mutant eiwitten en HMW u-PA hetzelfde katalytisch centrum dragen, gesitueerd op de B-keten P ? f? *< A 9 1 '*· ί V ü ïj ? -19- van u-PA. De aanwezigheid van verschillende amino-terminale ketens op de mutant eiwitten onderling, alsook in vergelijking met HMW u-PA, heeft geen of vrijwel geen effect op de affiniteit voor het substraat. De affiniteit van de 5 mutant eiwitten voor het substraat is ten minste een factor 57 tot 82 groter dan de affiniteit van rt-PA voor het substraat. De omzettings-snelheden voor de mutant plasminogeen activatoren, rt-PA en HMW u-PA is in dezelfde orde van grootte (0.25-0.65 sec-*-).

10 In aanwezigheid van fibrine, althans stimulator die het effect van fibrine imiteert, neemt voor alle plasminogeen activatoren de affiniteit voor het substraat Glu-plasminogeen sterk toe. Voor de mutant eiwitten t-PA::u-PA-I en t-PA:ïu-PA-II neemt de affiniteit toe 15 met een factor 122 tot 220 (Km van 0.61-0.88 /uM naar 0.005-0.004 /uM), voor rt-PA met een factor van ten minste 3125 (Km van^> 50 /uM naar 0.016 /uM) en voor HMW u-PA met een factor 30 (Km van 2.2 /uM naar 0.073 /uM). Uit deze waarden kan de conclusie worden getrokken, 20 dat de affiniteit voor het substraat Glu-plasminogeen in aanwezigheid van de stimulator een factor 4.1 tot 7.3 toeneemt door de aanwezigheid van de amino-ter-minale t-PA H-keten, in plaats van de amino-terminale u-PA A-keten. Ook in aanwezigheid van stimulator zijn 25 de omzettingssnelheden van de verschillende plasminogeen activatoren niet essentieel verschillend k(cat) 0.26 - 0.45 sec-1 · De vergelijking van de enzymatische activiteit, gerepresenteerd door de quotient k(cat)/Km in aanwezigheid en in afwezigheid van stimulator toont aan, dat deze 30 voor rt-PA toeneemt met een factor van ten minste 2100 (van kleiner dan 0.01 sec-1 /uM"1 naar 21 sec"1 /uM"1), voor t-PA::u-PA-I met een factor 220 (van 0.41 sec"1 /uM-1 naar 90 sec"1 /uM"1), voor t-PA::u-PA-II met een factor 288 (van 0.34 sec-1 /uM"1 naar 98 sec"1 /uM"1) 35 en voor HMW u-PA met een factor 12 (van 0.29 sec"1 /uM"1 naar 3.6 sec"1 /uM"1). De efficiëntere plasminogeen 6/ l;H'2 1 -20- activatie door HMW u-PA in aanwezigheid van stimulator moet worden toegeschreven aan een conformatie verandering van plasminogeen door de stimulator (Lijnen et al., 1984). Ditzelfde fenomeen zal eveneens optreden in de 5 reacties met de mutant plasminogeen activatoren en rt-PA.

Uit de vergelijking van de enzymatische activiteit [k(cat)/Kml waarde kan derhalve worden geconcludeerd, dat in aanwezigheid van fibrine de mutant eiwitten 4 tot 5 maal effectiever zijn in plasminogeen activatie 10 dan rt-PA en circa 25 effectiever zijn dan HMW u-PA.

Op grond van de bevindingen, dat de kinetische parameters van t-PA::u-PA-I en t-PA::u-PA-II in aan- en afwezigheid van "stimulator" niet wezenlijk verschillen, zullen de navolgende experimenten met het mutant eiwit t-PA::u-PA-II 15 worden uitgevoerd. Zoals eerder uiteengezet bevat t-PA::u-PA-II 13 aminozuur residuen meer dan t-PA::u-PA-I.

Complex vorming van de mutant plasminogeen activatoren met de endotheliale plasminogeen activator remmer (PAI-1) 20 en de remming van de mutant plasminogeen activatoren door PAI-1

De endotheliale plasminogeen activator remmer (PAI-1) wordt beschouwd als de fysiologische remmer 25 van het fibrinolytische proces en derhalve als een belangrijke regulator in vivo van de "netto fibrinolytische activiteit" (overzichtsartikel: Sprengers en Kluft, 1987). PAI-1 wordt ondermeer gesynthetiseerd door gekweekte vasculaire endotheel cellen. PAI-1 complexeert zeer snel zowel 30 met u-PA als met t-PA (tweede-orde reactie constante boven 10? M“1 sec“l (Sprengers en Kluft, 1987). Het complex van de plasminogeen activatoren met PAI-1 is resistent tegen natrium dodecylsulfaat (SDS), zodat de vorming van een complex geanalyseerd kan worden met 35 behulp van SDS-polyacrylamide gelelectroforese technieken. Echter, de activiteit van de plasminogeen activatoren in complex met PAI-1 kan alleen na behandeling met Triton 87 01 ;·;:1 -21- X-100 worden gedemonstreerd (Loskutoff et al., 1983), mogelijk tengevolge van intrinsieke plasminogeen activator activiteit van het complex of tengevolge van dissociatie van plasminogeen activator uit het complex. PAI-1, dat 5 door gekweekte endotheel cellen wordt gesynthetiseerd en gesecreteerd, wordt aangetroffen als een mengsel van inactieve, latente en actieve remmer. De latente vorm kan geactiveerd worden door behandeling met bepaalde chemicaliën, zoals SDS.

10 Recent is door een aantal groepen PAI-1 cDNA gecon strueerd, dat de volledige genetische informatie draagt voor het humane PAI-1 glycoproteïne (Ny et al., 1986;

Pannekoek et al., 1986; Ginsburg et al., 1986; Andreasen et al., 1986). De aminozuur volgorde van PAI-1 kon worden 15 afgeleid na de opheldering van de volledige nucleotide sequentie. De aminozuur volgorde van PAI-1 toont significante homologie met eiwitten, die behoren tot de "familie" van serine protease remmers (z.g.n. serpins). Het werkingsmechanisi van de serpins, met name dat van het prototype alpha-l-an-20 titrypsin met de serine protease elastase, is uitvoerig bestudeerd (Loebermann et al., 1984; Carrell en Boswell, 1986). Het is aannemelijk, dat het werkingsmechanisme van PAI-1 met t-PA en u-PA sterk gelijkt op dat van alpha-l-antitrypsine met elastase. Op grond van deze 25 overwegingen kan worden aangenomen, dat serpins, zoals PAI-1, een 1 : 1 molair complex vormen met het "target" protease.

De complex vorming van PAI-1 met de mutant plasminogeen activator t-PA:su-PA-II, alsook met de controles 30 rt-PA en HMW u-PA werd als volgt bepaald. 0.2 ng van de plasminogeen activatoren werden afzonderlijk geïncubeerd met een overmaat PAI-1. Daarna werd een buffer toegevoegd, bestaande uit 2% (w/v) sucrose, 5 /ug/ml broomfenol blauw en 2.5% (w/v) SDS en de monsters werden geanalyseerd 35 met behulp van SDS-polyacrylamide gelelectroforese.

Na electroforese werd een fibrine-agarose indicator 8 7 0 · Λ** 1 -22- gel bereid, die tevens plasminogeen bevatte (Granelli-Piperno en Reich, 1978), en gebruikt als "overlay" voor de met Triton X-100 behandelde SDS-polyacrylamide gel. Door diffusie van hetzij "vrije" plasminogeen activator hetzij 5 gecomplexeerd met PAI-1, kan zowel de activiteit van plasminogeen activatoren semi-kwantitatief worden bepaald en kan tevens het molekulair gewicht van de plasminogeen activator worden vastgelegd. De resultaten zijn in Fig.

3 weergegeven.

10 Uit de resultaten van deze analyse kunnen twee conclusies worden getrokken. Ten eerste vormt PAI-1 een complex met zowel t-PA::u-PA-II als met de controle plasminogeen activatoren t-PA en HMW u-PA. Deze conclusie kan worden afgeleid uit de waarneming, dat het molekulair 15 gewicht van de plasminogeen activator activiteit toeneemt na preincubatie met PAI-1. Ten tweede kan worden geconstateerd, dat het molekulair gewicht van het complex, dat PAI-1 vormt met t-PA::u-PA-II, rt-PA en HMW u-PA, voor alle plasminogeen activatoren correspondeert met een 1 : 20 1 molair complex. Deze gevolgtrekking is gebaseerd op de waarneming, dat na pre-incubatie met PAI-1, de plasminogeen activator activiteit migreert met een molekulair gewicht, dat correspondeert met de som van de molekulair gewichten van de plasminogeen activatoren (circa 70-74 kD) en 25 van PAI-1 (circa 52 kD).

De effectiviteit van remming van de mutant plasminogeen activator, rt-PA en HMW u-PA door PAI-1 werd vervolgens bepaald. Hiertoe werd de latente fractie van het PAI-1 preparaat (totaal circa 130 ng) tevoren geactiveerd 30 met SDS (eindconcentratie 0.1% (w/v)). Verschillende verdunningen van het geactiveerde uitgangspreparaat werden behandeld met een gelijk volume (55 /ul) 0.2 M TRIS-HC1 (pH 7.4), 0.2% (v/v) Tween-80, 6% (v/v) Triton X-100 gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Vervolgens 35 werd in een volume van 30 /ul één van de plasminogeen activatoren toegevoegd, hetgeen overeenkwam met 0.024 87 0-1 02 1-· -23- ng t-PA::u-PA-II, 0.024 ng rt-PA of 0.024 ng HMW u-PA.

De mengsels werden gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geincubeerd. De resterende plasminogeen activator activiteit van de verschillende activatoren werd tenslotte als 5 volgt bepaald. Toegevoegd werd 110 /ul van een mengsel, bevattende 0.1 M TRIS-HC1 (pH 7.4), 0.1% (v/v) Tween-80, humaan Glu-plasminogeen (eindconcentratie 0.11 uM), chromogeen substraat S-2251 (eindconcentratie 0.54 mM) en "stimulator" (120 /ug/ml). De bepaling van de optische 10 dichtheid bij 405 nm, als maat voor de plasminogeen activator activiteit, is reeds in een voorgaande paragraaf toegelicht. De resultaten zijn in Pig. 4 weergegeven.

Uit de resultaten kunnen de volgende conclusies worden getrokken. Bij vergelijking van de hoeveelheid 15 PAI-1, welke nodig is om de plasminogeen activator activiteit van de verschillende plasminogeen activatoren met 50% te remmen, kan geconstateerd worden, dat circa 5 maal meer PAI-1 vereist is voor de mutant t-PA::u-PA-II dan voor rt-PA of HMW u-PA. Derhalve kan de mutant plasminogeen 20 activator beschouwd worden als een molekuul, dat resistenter is tegen de fysiologische remmer PAI-1 dan rt-PA en HMW u-PA. De dissociatie constanten van de verschillende plasminogeen activator-PAI-1 complexen konden worden bepaald met behulp van een Scatchard-type analyse (Scatchard, 25 1949). In overeenstemming met de bovenstaande conclusie kon de conclusie worden getrokken, dat het complex van rt-PA en HMW u-PA met PAI-1 minder gemakkelijk dissocieert dan het complex van de mutant plasminogeen activatoren met PAI-1. Onderstaand worden de berekende dissociatie 30 constanten weergegeven:

Plasminogeen activator Kd

t-PA::u-PA-II 4.1 x 10“12M

rt-PA 0.6 x 10”12M

HMW u-PA 0.24 x10“12M

8701021 -24-

Materialen en Methoden DNA analyse: 5

Het isoleren van plasmide DNA# de analyse van DNA gedigereerd met restrictie endonucleasen met behulp van agarose- en polyacrylamide gelelectroforese, "Southern" blotting, het isoleren van restrictie fragmenten, het 10 merken van DNA met radioactiviteit, hetzij door "nick translatie", hetzij met T4 polynucleotide kinase en de techniek van kolonie-hybridisatie werden uitgevoerd zoals beschreven (Maniatis et al., 1982). Het bepalen van de volgorde van basen in het DNA (DNA sequencen) 15 werd uitgevoerd met de dideoxy methode (Sanger et al., 1977). De gebruikte restrictie endonucleasen en andere enzymen waren gekocht van New England Biolabs (Beverley,

Mass., V.S.) en radioactief gemerkte nucleotiden van The Radiochemical Centre (Amersham, Engeland).

20

Transfectie van weefselkweek cellen:

De procedure voor het verkrijgen van "transient" expressie met behulp van getransfecteerde muize Lkt-25 cellen werd uitgevoerd, zoals eerder beschreven (Lopata et al., 1984; Van Zonneveld et al., 1986b).

Gelatine-plasminogeen gelelectroforese: 30 De bereiding van polyacrylamide gelen, die gelatine en plasminogeen bevatten, en het uitvoeren van de electroforetische analyse van monsters met behulp van deze gelen is reeds eerder beschreven (Van Zonneveld et al., 1986b).

35 Fibrine overlay techniek:

De bepaling van plasminogeen activator activiteit 870 1 02 1 -25- en het molekulair gewicht behorende bij die activiteit werd uitgevoerd met de fibrine overlay techniek, na SDS-polyacrylamide gelelectroforese van monsters, zoals eerder beschreven (Granelli-Piperno en Reich, 1978).

5

Bepaling van plasminogeen activator activiteit;

Bij deze bepaling wordt gebruik gemaakt van het chromogene substraat S-2251, dat specifiek is voor piasmine. 10 Activatie van Glu-plasmirïogeen door rt-PA, Bowes melanoma t-PA en andere t-PA afgeleiden wordt sterk versneld door toevoeging van splitsingsproducten van fibrinogeen, behandeld met cyanogeen-bromide. Deze laatstgenoemde component wordt "stimulator" genoemd (Verheijen et al., 15 1982). Indien de plasminogeen activator activiteit wordt bepaald na pre-incubatie met PAI-1, wordt als PAI-1 preparaat gebruikt hetzij geconditioneerd (serum-vrij) medium van gekweekte humane vasculaire endotheel cellen (concentratie PAI-1; 2.4 /ug/ml) hetzij een gezuiverd 20 preparaat PAI-1 (100 /ug/ml; Lambers et al., 1987).

Met beide preparaten werden overeenkomstige resultaten behaald.

Overige materialen; 25 HMW u-PA (tweeketenig) was een gift van Dr. G.

Cassani (Lepetit, Milaan, Italië). Bowes melanoma t-PA (tweeketenig) werd gekocht van Biopool (Umea, Zweden). Glu-plasminogeen, "stimulator" en het chromogene substraat 30 s-2251 werd betrokken van KabiVitrum (Stockholm, Zweden).

£: ? C ·: Γ Γ 1 ί -26- TABEL 1 - stimulator + stimulator PREPARAAT Km k(cat) k(cat)/Km Km k(oat) k(cat)/Km rt-PA >50 0.49 <0.01 0.016 0.34 >21 t-PA::u-PA-I 0.61 0.25 0.41 0.005 0.45 90 t-PA::u-PA-II 0.88 0.30 0.34 0.004 0.39 98 HMW u-PA 2.2 0.65 0.29 0.073 0.26 3.6

De Km waarden zijn weergegeven in ^uM. De k(cat) waarden zijn weergegeven in sec”·*·, zodat de quotient k(cat)/Km de dimensie /UM”·*·.sec”·*· heeft.

Toelichting bij de Figuren:

Fig. 1

Aangegeven is de nucleotide volgorde van het cDNA gebied, coderend voor het fusie-gedeelte van, respectievelijk, t-PA::u-PA-I (boven) en t-PA:su-PA-II (onder).

Tevens zijn de corresponderende aminozuren van de t-PA gedeelten en de u-PA gedeelten aangegeven. De nummering boven de nucleotiden volgorden correspondeert met die van de t-PA nucleotide volgorde (955 etc.) en de u-PA nucleotide volgorde (679 etc., 640 etc.). De nummering onder de aminozuur volgorden correspondeert met die van de t-PA aminozuur volgorde (256 etc.) en de u-PA aminozuur volgorde (147 etc., 134 etc.). De onderstreepte nucleotide volgorde geeft de synthetische primers aan, die voor de constructie van de beide mutanten zijn gebruikt.

Fig. 2.

Gelatine-plasminogeen gelelectroforese. De uitvoering 87 0 1 -Ί 4 -27- van deze analyse is weergegeven in de tekst. Achtereenvolgens zijn geanalyseerd: 1. 1 ng Bowes melanoma t-PA (controle); 2. 0.1 ng Bowes melanoma t-PA; 3. 1 ng rt-PA; 4. 0.1 ng rt-PA; 5. 0.1 ng t-PA::u-PA-I; 6. 0.1 ng t-PA::u-PA-II; 5 7. 0.1 ng HMW u-PA. Deze analyse toont aan, dat de activiteit van de t-PA substitutie mutanten, in afwezigheid van fibrine in dit systeem, vergelijkbaar is met HMW u-PA en hoger dan hetzij (natief) Bowes melanoma t-PA, hetzij rt-PA. Links staan de referentie molekulair gewichten 10 70,000 en 54,000 van, respectievelijk, t-PA en HMW u-PA aangegeven.

Pig. 3.

15 Pibrine-overlay na SDS-polyacrylamide gelelectroforese.

Deze techniek is beschreven in de Materialen en Methoden, terwijl de details zijn weergegeven in de tekst. Achtereenvolgens is, van links naar rechts, geanalyseerd de eventuele complexvorming PAI-1 met één van de plasminogeen activatoren, 20 t-PA::u-PA-II zonder PAI-1 (MW ca. 70,000); t-PA::u-PA-II met PAI-1 (MW groter dan 70,000); rt-PA zonder PAI-1 (MW ca. 70,000); rt-PA met PAI-1 (MW groter dan 70,000); HMW u-PA zonder PAI-1 (MW ca. 54,000); HMW u-PA met PAI-1 (MW groter dan 70,000); geconditioneerd medium 25 van gekweekte humane endotheelcellen (ECCM), bevattende een complex van PAI-1 en t-PA; ECCM, waaraan toegevoegd geconditioneerd medium van gekweekte, ongetransfecteerde muize Ltk~ cellen.

30 Fig. 4.

De gegevens over de test voor de bepaling van de remming van de activiteit van de verschillende plasminogeen activatoren door (toenemende hoeveelheden) PAI-1 is 35 uitvoerig beschreven in de tekst.

8 7 «Λ 1 7 r 1 VJ * V :· v’ £* $

Claims (10)

1. Humane t-PA(u-PA) substitutie-mutant eiwitten, opgebouwd uit een gedeelte van humaan t-PA en een gedeelte van humaan u-PA, waarbij het t-PA deel de H-keten of een gemodificeerde H-keten omvat en in essentie 5 de L-keten mist, en het u-PA deel de B-keten omvat en in essentie de A-keten mist.

2. Humane t-PA(u-PA) substitutie-mutant eiwitten volgens conclusie 1, waarin het t-PA deel in essentie uit de volledige H-keten bestaat.

3. Humane t-PA(u-PA) substitutie-mutant eiwitten volgens conclusie 1, waarin het t-PA deel in essentie bestaat uit een gemodificeerde H-keten welke een of meer K2 domeinen bevat en een of meer van de andere domeinen van de H-keten mist, en/of een of meer F domeinen 15 bevat en een of meer van de andere domeinen van de H-keten mist.

4. Humane t-PA(u-PA) substitutie-mutant eiwitten t-PA::u-PA-I en t-PA:ïu-PA-II.

5. Recombinante genetische informatie in de vorm 20 van RNA, enkelstrengs DNA of dubbelstrengs DNA, welke codeert voor humane t-PA(u-PA) substitutie-mutant eiwitten volgens een van de conclusies 1-4.

6. Recombinante klonerings- en/of expressievector, zoals bijvoorbeeld een plasmide, omvattende een geschikte 25 klonerings- en/of expressievector met daarin ingevoegd recombinante genetische informatie volgens conclusie 5.

7. Recombinante plasmiden püC19/t-PA::u-PA-I; pUC19/-t-PA::u-PA-II; pSV2/t-PA::u-PA-i; en pSV2/t-PA::u-PA-II.

8. Werkwijze voor het bereiden van humane t-PA (u-PA) 30 substitutie-mutant eiwitten volgens een van de conclusies 1-4, waarbij geschikte gastheercellen worden gekweekt welke onder toepassing van recombinante genetische informatie volgens conclusie 5, in het bijzonder recombi- 8. c i c'; i -32- nant DNA volgens conclusie 6 of conclusie 7, zijn getransformeerd, bijvoorbeeld getransfecteerd, en de door de gastheercellen geproduceerde humane t-PA(u-PA) substitutie-mutant eiwitten worden gewonnen.

9. Gastheercellen, welke onder toepassing van recombi- nante genetische informatie volgens conclusie 5, in het bijzonder recombinant DNA volgens conclusie 6 of conclusie 7, zijn getransformeerd, bijvoorbeeld getransfecteerd, en in staat zijn tot vermenigvuldiging en/of 10 expressie van de recombinante genetische informatie welke codeert voor humane t-PA(u-PA) substitutie-mutant eiwitten volgens een van de conclusies 1-4.

10. Farmaceutische preparaten met invloed op de bloed-stolling en/of op de fibrinolyse, omvattende een humaan 15 t-PA(u-PA) substitutie-mutant eiwit volgens een van de conclusies 1-4 alsmede een of meerdere farmaceutische aanvaardbare dragers, verdunningsmiddelen en/of hulpstoffen. 8. o i ;