KR0138997B1 - 흡혈박쥐 타액 플라스미노겐 활성인자 - Google Patents
흡혈박쥐 타액 플라스미노겐 활성인자Info
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Abstract
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Description
제1도는 정제된 흡혈박쥐(vampire bat) 플라스미노겐 활성인자의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동도이다.
제2도는 tPA 및 40kd 박쥐 플라스미노겐 활성인자 단백질에 의해 촉매된 혈소판 결핍된 혈장 응혈의 용해율(%)을 나타낸다.
제3도는 tPA 및 40kd 박쥐 플라스미노겐 활성인자 단백질에 의해 촉매된 혈소판 풍부 혈장 응혈의 용해율(%)을 나타낸다.
제4도는 혈장 성분에 의한 플라스미노겐 활성인자의 불활성화를 나타낸다.
제5도는 실버 염색(silver stain) 및 피브린 오토그라피로 동정된, SDS-PAGE 상에서의 40kd 및 45kd 단백질의 분자량도이다.
제6도는 박쥐-PA 및 tPA에 의해 촉매된 응혈 용해도이다.
제7도는 피브린에 대한 플라스미노겐 활성인자의 결합도이다.
제8a도는 흡혈박쥐 플라스미노겐 활성인자 cDNA의 뉴클레오티드 서열 및 플라스미노겐 활성인자의 아미노산 서열도이다.
제8b도는 사람 tPA와 비교한 흡혈박쥐 플라스미노겐 활성인자의 아미노산 서열에 대한 도식도이다.
제9도는 공지의 플라스미드 pSP73으로부터 유도되고 박쥐-PA(H) 유전자 서열을 함유하는 플라스미드 pSZ88-100-20의 합성 및 궁극적으로 공지의 플라스미드 pD5로부터 유도되고 박쥐-PA(H) 유전자 서열을 함유하는 플라스미드 pSZ88-104-20의 합성 도식도이다.
제10도는 공지의 플라스미드 pSP73으로부터 유도되고 박쥐-PA(H) 유전자 서열을 함유하는 플라스미드 pSZ89-109, pSZ89-110, p89WO-10 및 p89WO-8 및 공지의 플라스미드 pD5로부터 유도되고 박쥐-PA(H) 유전자 서열을 함유하는 플라스미드 pSZ89-111, pSZ89-112 및 pSZ89-113의 합성 도식도이다.
제11도는 공지의 플라스미드 pSP73으로부터 유도되고 박쥐-PA(I) 유전자 서열을 함유하는 플라스미드 p89WO-14, p89WO-5, 6, p89WO-9 및 p89WO-12 및 공지의 플라스미드 pD5로부터 유도되고 박쥐-PA(I) 유전자 서열을 함유하는 플라스미드 p89WO-1, p89WO-2A, B, C, p89WO-3 및 p89WO-4의 합성 도식도이다.
제12도는 공지의 플라스미드 pD5 및 p89WP-17 및 p89-WO-18로부터 각각 플라스미드 p89WP-20AB 및 p89WP-19AB을 합성하는 도식도이며, p89WP-17은 p89WO-11로부터 수득되고, p89WO-18은 p89WO-9로부터 수득된다.
본 발명은 흡혈박쥐 타액 플라스미노겐 활성인자에 관한 것이다.
흡혈박쥐는 희생물에 상처를 가해 수득한 신선한 혈액의 섭취에 절대적으로 의존한다. 이러한 상처는 표면상의 얕은 상처임에도 몇시간동안 출혈이 지속된다.
데스모더스 로턴더스(Desmodus rotundus)의 흡혈박쥐 타액의 성분이 연구되었으며 연구결과 포유동물 혈액의 지혈 기전을 3가지의 독특한 수준으로 방해하는 것으로 밝혀졌다.
이들은 또한 혈소판 응집을 억제하고 플라스미노겐을 활성화 시키는 것으로 밝혀졌다[참조 : Hawkey., C. M., Nature 211 : 434(1966) 및 Hawkey, C. M. Br. J. Haematol. 13L : 1014(1967)]. 이들 활성은 각각 독특한 단백질 분획과 관련되어 있다. 플라스미노겐을 활성화시키는 분획은 데스모키나아제로 명명되어 있다[참조 : Hawkey, C. M., Nature]. 문헌[참조 : Cartwright, T., Blocd]에 데스모더스 타액으로부터 데스모키나아제의 정제가 기술되어 있으며, 이 효소가 예비 형성된 응혈의 용해시 우로키나아제(UK) 및 스트렙토키나아제보다 더욱 효과적이라고 제시한다.
혈전용해제로서 조직형 플라스미노겐 활성인자(tPA)를 사용하면 심각한 출혈합병증, 비교적 빈번한 재교합 발생, 균일하지 못한 효과 및 제1형 플라스미노겐 활성인자 억제제(PAI-1)와 같은 플라스미노겐 활성인자 억제제에 의한 불활성화에 대한 민감성을 포함한 여러가지 단점이 있다[참조 : Loskutoff, Seminars in Thrombosis and Hemostasis, Vol. 14, No. 1(1988)].
혈전용해 요법으로 야기되는 출혈 합병증은 순환 플라스미노겐의 활성화에 원인이 있거나, 적어도 이에 의해 악화되는 것으로 믿어진다. tPA의 피브린에 대한 결합능력은 이의 피브린-결합 플라스미노겐에 대한 현저한 기질 선호성이 원인이 되는 것으로 생각된다. 그럼에도 불구하고, 이론적 고찰 및 임상적 연구결과는 응혈의 신속한 용해에 요구되는 tPA의 농도 상승이 또한 감지가능한 양의 순환 플라스미노겐을 활성화시키는 것으로 나타났다.
또한, tPA와 혈장억제제의 상호작용이 주입도중 및 후에 tPA의 작용활성을 약화시켜 잠정적으로 재교합에 기여하는 것으로 믿어진다.
혈전용해제로서 tPA를 사용하는데 따른 다른 단점은 요구되는 tPA의 투여량이 100 내지 150mg으로 다량이어서, 상기 치료방법이 극도로 비용이 많이 든다는 점이다.
본 출원인은 피브린-결합 플라스미노겐에 대해 현저하게 큰 선택성을 나타내고, 따라서 혈전용해치료에 사용할 경우 출혈소질의 중증도 및 빈도의 감소와 관련시킬 수 있는 데스모더스 로턴더스 타액 및 타액선에 존재하는 플라스미노겐 활성인자를 발견하였다. 또한, 상기 활성인자는 PAI-1과 같은 혈장 억제제에 의해 즉시 불활성되지 않으므로, 재교합 빈도의 감소와 관련될 수 있다.
본 발명의 목적은 안전성 및 효능에 있어서 tPA 보다 우수한 피브린 용해제를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 본 발명의 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 동정하고, 조직 유래 cDNA로부터 상기 서열을 구성하여, 상기 서열을 발현벡터에 자동적으로 삽입시키는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 단백질을 생성하도록 발현벡터로 형질전환시킨 숙주미생물 또는 진핵세포로부터 본 발명의 단백질을 생성하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 본 발명의 단백질에 대해 반응성인 항체를 생성하는 것이다.
본 발명은 데스모더스 로턴더스 타액 및 타액선으로부터 수득되거나 유도된, 정제 및 부분정제된 플라스미노겐 활성인자 단백질, 흡혈박쥐 데스모더스 로턴더스 타액 및 타액선으로부터 단백질을 정제하는 방법, 이들 단백질을 암호화하는 DNA 서열, 재조합 DNA 방법으로 이들이 생성하는 방법, 이들 단백질과 특이적으로 반응성인 항체 및 본 발명의 단백질을 함유하는 피브린-결합 플라스미노겐 활성화용 약제학적 조성물을 포함한다.
흡혈박쥐 타액 및 타액선으로부터 분리된 단백질 플라스미노겐 활성인자는 몇몇 구조 및 기능 기준에 있어서 tPA 및 우로키나아제 모두와 상이하다. tPA와는 달리, 본 발명의 플라스미노겐 활성인자는 크링글(kringle) 2영역 및 플라스민-민감성 프로쎄싱 부위를 함유하지 않는다. 이들 활성인자 및 tPA의 등몰량은, 이미 형성된 혈장 응혈물의 용해를 촉매하는 능력을 모니터링 하는 경우 유사한 효능을 나타낸다. 플라스미노겐에 대한 흡혈박쥐 플라스미노겐 활성인자의 활성은, 피브린 보조인자의 존재하에 27,000배 이상 자극된다. tPA에 대한 상응하는 값은 단지 205배이다. tPA의 완전한 길이 형태, 핑거-마이너스 형태 및 핑거 EGF-마이너스 형태에 상응하는 3개의 상이한 PA가 흡혈박쥐 타액으로부터 분리되었다. 이들은 각각, 박쥐-PA(H), 박쥐-PA(I) 및 박쥐-PA(L)로 표시한다. 이후 박쥐-PA는, 3개의 분자형태 H, I 및 L을 함유하는 비분별된 제제에 상응한다. 다른 2개의 PA와는 달리, 완전한 길이의 PA는 피브린에 단단하게 결합한다. 박쥐-PA(H), 박쥐-PA(I) 및 박쥐-PA(L)의 Mr 값은, 디티오트레이톨의 존재하에 SDS-PAGE에 의해 측정한 결과 각각 49, 42 및 40kD으로 나타났다(제1도, 제1선). 탈당화된 형태의 박쥐-PA(H), 박쥐-PA(I) 및 박쥐-PA(L)(엔도글리코시다제 F를 사용하여 N-결합된 탄수화물 쇄를 제거함으로써 수득)의 겉보기 Mr을 SDS-PAGE로 측정한 결과 각각 44, 40 및 38kD였다(제1도, 제2선). 이들 단백질은, 피브린 보조인자의 존재를 매우 필요로 하고, 혈장 응혈물의 용해를 촉매하는 현저한 능력을 나타낸다. 피브린-결합 플라스미노겐에 대한 이들 단백질의 선택성 기전은, 피브린 응혈의 존재하에 경감되는 NaCl에 의한 강력한 억제 및 직접적인 피브린 결합을 포함한 여러 요인의 결과이다. 또한, 흡혈박쥐 플라스미노겐 활성인자는 혈장중에 존재하는 억제제에 의한 불활성화에 대해 tPA 보다 덜 민감하다.
데스모더스 로턴더스 타액에서 유도된 완전한 길이의 당단백질 플라스미노겐 활성인자(Bat-PA(H))의 cDNA로부터 예측된 아미노산 서열은 하기와 같다:
Ala-Tyr-Gly-Val-Ala-Cys-Arg-Asp-Glu-Lys-Thr-Gln-
Met-Ile-Tyr-Gln-Gln-Gln-Glu-Ser-Trp-Leu-Arg-Pro-
Glu-Val-Arg-Ser-Lys-Arg-Val-Glu-His-Cys-Arg-Cys-
Asp-Arg-Gly-Leu-Ala-Gln-Cys-His-Thr-Val-Pro-Val-
Lys-Ser-Cys-Ser-Glu-Leu-Arg-Cys-Phe-Asn-Gly-Gly-
Thr-Cys-Trp-Gln-Ala-Ala-Ser-Phe-Ser-Asp-Phe-Val-
Cys-Gln-Cys-Pro-Lys-Gly-Tyr-Thr-Gly-Lys-Gln-Cys-
Glu-Val-Asp-Thr-His-Ala-Thr-Cys-Tyr-Lys-Asp-Gln-
Gly-Val-Thr-Tyr-Arg-Gly-Thr-Trp-Ser-Thr-Ser-Glu-
Ser-Gly-Ala-Gln-Cys-Ile-Asn-Trp-Asn-Ser-Asn-Leu-
Leu-Thr-Arg-Arg-Thr-Tyr-Asn-Gly-Arg-Arg-Ser-Asp-
Ala-Ile-Thr-Leu-Gly-Leu-Gly-Asn-His-Asn-Tyr-Cys-
Arg-Asn-Pro-Asp-Asn-Asn-Ser-Lys-Pro-Trp-Cys-Tyr-
Val-Ile-Lys-Ala-Ser-Lys-Phe-Ile-Leu-Glu-Phe-Cys-
Ser-Val-Pro-Val-Cys-Ser-Lys-Ala-Thr-Cys-Gly-Leu-
Arg-Lys-Tyr-Lys-Glu-Pro-Gln-Leu-His-Ser-Thr-Gly-
Gly-Leu-Phe-Thr-Asp-Ile-Thr-Ser-His-Pro-Trp-Gln-
Ala-Ala-Ile-Phe-Ala-Gln-Asn-Arg-Arg-Ser-Ser-Gly-
Glu-Arg-Phe-Leu-Cys-Gly-Gly-Ile-Leu-Ile-Ser-Ser-
Cys-Trp-Val-Leu-Thr-Ala-Ala-His-Cys-Phe-Gln-Glu-
Arg-Tyr-Pro-Pro-Gln-His-Leu-Arg-Val-Val-Leu-Gly-
Arg-Thr-Tyr-Arg-Val-Lys-Pro-Gly-Lys-Glu-Glu-Gln-
Thr-Phe-Glu-Val-Glu-Lys-Cys-Ile-Val-His-Glu-Glu-
Phe-Asp-Asp-Asp-Thr-Tyr-Asn-Asn-Asp-Ile-Ala-Leu-
Leu-Gln-Leu-Lys-Ser-Gly-Ser-Pro-Gln-Cys-Ala-Gln-
Glu-Ser-Asp-Ser-Val-Arg-Ala-Ile-Cys-Leu-Pro-Glu-
Ala-Asn-Leu-Gln-Leu-Pro-Asp-Trp-Thr-Glu-Cys-Glu-
Leu-Ser-Gly-Tyr-Gly-Lys-His-Lys-Ser-Ser-Ser-Pro-
Phe-Tyr-Ser-Glu-Gln-Leu-Lys-Glu-Gly-His-Val-Arg-
Leu-Tyr-Pro-Ser-Ser-Arg-Cys-Thr-Ser-Lys-Phe-Leu-
Phe-Asn-Lys-Thr-Val-Thr-Lys-Asn-Met-Leu-Cys-Ala-
Gly-Asp-Thr-Arg-Ser-Gly-Glu-Ile-His-Pro-Asn-Val-
His-Asp-Ala-Cys-Gln-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Leu-
Val-Cys-Met-Asn-Asp-Asn-His-Met-Thr-Leu-Leu-Gly-
Ile-Ile-Ser-Trp-Gly-Val-Gly-Cys-Gly-Glu-Lys-Asp-
Ile-Pro-Gly-Val-Thr-Thr-Lys-Val-Thr-Asn-Tyr-Leu-
Gly-Trp-Ile-Arg-Asp-Asn-Met-Arg-Pro-
박쥐-PA(H)는 제8a도에 제시된 아미노산 1 내지 441의 서열을 함유한다. 박쥐-PA(I)는 제8a도에 제시된 아미노산 1 내지 50 내지 441의 서열을 함유하고, 박쥐-PA(L)은 제8a도에 제시된 아미노산 1 내지 3 및 87내지 441의 서열을 함유한다. 또한, 단백질 L에서 위치 88의 아미노산을 트레오닌에서 프롤린으로 변화되었다.
또한, 본 발명은
(a) 흡혈박쥐로부터 수득한 하악선을 균질화하여 혼합물을 형성하고, 이 혼합물을 원심분리하여 상등액 분획을 형성하며;
(b) 상등액을 포스포셀룰로즈 양이온-교환 컬럼에 적용시켜 컬럼에 박쥐-PA를 흡수시키고;
(c) 컬럼을 용출시켜 박쥐-PA를 함유하는 분획을 수득하고;
(d) 활성분획을 합하고, 고정된 에리트리나(Erythrina) 트립신 억제제(ETI)를 지닌 친화성 크로마토그래피 컬럼에 합한 활성분획을 적용시키며, pH가 낮은 완충액으로 박쥐-PA를 용출시키는 단계를 포함하여, 흡혈박쥐 타액의 플라스미노겐 활성인자를 정제하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 단백질을 암호화하는 DNA 서열, 본 발명의 삽입된 DNA 서열을 지닌 클로닝 비히클, 본 발명의 단백질과 반응성인 항체 및 유효량의 본 발명의 단백질을 함유하는 피브린-결합 플라스미노겐 활성화용 약제학적 조성물도 본 발명에 속한다.
각각의 플라스미노겐 활성화 인자들은 피브린에 의해 활성화된다. 상기 활성인자들을 구별짓는 유일한 판별가능한 특징은, 박쥐-PA(H)는 갖는 피브린에 단단하게 결합하는 능력인데, 이러한 특성은 핑거(Finger) 영역의 존재와 상관관계가 있다. 피브린-결합된 플라스미노겐에 대한 박쥐-PA(I) 및 박쥐-PA(L)의 특이성은 피브린에 단단하게 결합하는 능력과는 무관한 것으로 여겨진다.
박쥐-PA 활성의 엄격한 피브린 의존성은 피브린 용해 치료에 있어서 바람직한 특징이다. 혈전용해제의 사용에 수반되는 출혈 합병증은, 순환 플라스미노겐을 활성화시켜 플라스민을 생성시킴으로써 더 악화될 수 있다. 출혈 합병증의 중증도 및 빈도는 활성인자가 피브린 응혈 부위에 작용하는 본 발명의 플라스미노겐 활성인자를 사용함으로써 경감될 수 있다.
293-Bat-PA-1 포유동물 세포(CRL 10180) BPA-CN-pSZ88-104-20 세균 세포(ATCC 68050), BPA-CK-pSZ89-111-17 세균 세포(ATCC 68052), BPA-FK-p89WO-1 세균 세포(ATCC 68051), BPA-FN-p89WO-2C 세균 세포(ATCC 68053) 및 BPA-DK-p89WP-20A 세균 세포(ATCC 68049)는 부다페스트 조약에 따라 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection : ATCC : Bethesda, MD, USA)에 1989년 7월 11일에 기탁되었다. 이들 세포는 본 특허 허여시 입수가능하다. 기탁물은 또한 본 출원 또는 이의 후속 출원이 출원되는 나라에서 외국 특허법에 의해 요구될때 입수가능하다. 그러나, 기탁물의 입수가능성 여부가, 특허사정된 특허권리를 저하시키는, 본 발명을 실행하기 위한 인가증(licence)은 아니다.
제1도에서 샘플은 흡혈박쥐 타액선(제1선 및 3선) 및 타액(제2선 및 4선)으로부터의 것이다. 각 샘플을 SDS-PAGE에 앞서 엔도글리코시다제 F로 처리한다.
제1선 및 2선 : 웨스턴 블롯팅 및 면역염색.
제3선 및 4선 : 피브린 오토그라피.
본 발명은 천연 및 재조합-유도된 정제 플라스미노겐 활성인자 단백질 및 흡혈박쥐 데스모더스 로턴더스 타액 및 타액선과 연관된 단백질의 특정한 마이크로이종 형태 또는 단편 형태에 관한 것이다.
단백질 및 폴리펩타이드는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되었으며 이는 아미드 결합으로 서로 결합된 아미노산의 선형 중합체를 언급한다. 쇄중의 아미노산 서열은 단백질 또는 폴리펩타이드의 생물학적 작용에 있어서 중요한 의미를 갖는다. 본 명세서에서 사용된 플라스미노겐 활성자는, 아르기닌 및 리신의 펩타이드 및 에스테르를 가수분해시키고, 피브린을 가용성 생성물로 전환시키는 효소인 플라스민의 형성을 촉매하는 단백질을 언급한다.
단백질에 대한 모노클로날 및 폴리클로날 항체가 본 발명에 따른 단백질을 분리하고 동정하는데 유용하다. 이들 항체는 당해분야에 공지된 어떠한 통상의 기술에 의해서도 제조될 수 있다. 예를 들면, 폴리클로날 항체는 데스모더스 로턴더스 플라스미노겐 활성인자 단백질을 주사한 토끼와 같은 동물에 의해 합성될 수 있다. 주사후, 동물 중의 항체 농도가 상승한다. 이어서, 동물로부터 항체-함유 혈액, 즉, 항혈청을 채취한다. 이어서, 플라스미노겐 활성인자-특이적 항체를 수많은 분리기술 중의 하나, 예를 들면 친화성 크로마토그래피에 의해, 항혈청 중의 다른 항체로부터 분리시킨다. 모노클로날 항체는 문헌[참조 : Kohler and Milste in Nature, 256, pp. 495-497(1975)]에 기술된 방법을 사용하여 제조할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 천연 단백질이란 상응하는 유전자에 의해 생성된 완전한 길이 단백질을 언급한다. 재조합-유도됨이란 목적 단백질에 대한 유전자 또는 cDNA의 분리 및 목적 단백질을 과생성시킬 세포를 작제하기 위한 정제 유전자 또는 cDNA의 이용을 언급한다. 단편 형태는 천연 단백질보다 적은 수의 아미노산을 가지지만 플라스미노겐 활성인자의 활성부위(들)를 함유하는 단백질 또는 플라스미노겐의 부분으로서 정의된다. 본 명세서내에서 사용된 마이크로이종 형이란 단일유전자 생성물을 언급하며, 이는 해독됨에 따라 구조적으로 변형된, DNA의 단일 유전자 단위로부터 생성된 단백질이다. 그러나, 이와 같은 구조적 변형에 의해 단백질의 활성에 어떤 상당한 변화도 발생되지 않는다. 이러한 변형은 생체내 또는 분리 및 정제공정 동안 발생할 수 있다. 생체내 변형으로 N-말단에서의 아세틸화, 단백질 분해, 당화 또는 인산화가 나타날 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
단백질 분해에는 하나 이상의 말단 아미노산이 순서대로, 효소적으로 절단되어 본래의 유전자
생성물보다 적은 수의 아미노산을 가지는 마이크로이종 형태를 생성하는 엑소단백질 분해(exoproteolysis)가 포함될 수 있다. 단백질 분해에는 또한 아미노산 서열내의 특정 위치에서 팹타이드를 절단하는 엔도프로테아제의 작용으로부터 발생되는 엔도단백질 분해(endoproteolytic) 변형이 포함된다. 유사한 변형현상이 정제과정 동안 발생하여 마이크로이종 형태를 생성시킬 수 있다. 정제하는 동안에 발생하는 가장 일반적인 변형은 단백질분해이다.
본 발명의 또다른 양태는 제8a도에 도시된 아미노산 1 내지 441의 폴리펩타이드 서열과 95% 이상 상동성인 폴리펩타이드 서열을 갖고, 피브린 보조인자의 존재하에 자극되는 플라스미노겐-활성화 작용을 가지며, 피브린에 단단히 결합할 수 있는 플라스미노겐-활성화 단백질이다.
본 발명의 또다른 양태는 제8a도에 도시된 아미노산 1 내지 441의 폴리펩타이드 서열과 90% 이상 상동성인 폴리펩타이드 서열을 갖고, 피브린 보조인자의 존재하에 자극되는 플라스미노겐-활성화 작용을 가지며, 피브린에 단단히 결합할 수 있는 플라스미노겐-활성화 단백질이다.
본 발명의 또다른 양태는 제8a도에 도시된 아미노산 1 내지 3 및 50 내지 441의 폴리펩타이드 서열과 95% 이상 상동성인 폴리펩타이드 서열을 갖고, 피브린 보조인자의 존재하에 자극되는 플라스미노겐-활성화 작용을 갖는 플라스미노겐-활성화 단백질이다.
본 발명의 또다른 양태는 제8a도에 도시된 아미노산 1 내지 3 및 50 내지 441의 폴리펩타이드 서열과 90% 이상 상동성인 폴리펩타이드 서열을 갖고, 피브린 보조인자의 존재하에 자극되는 플라스미노겐-활성화 작용을 갖는 플라스미노겐-활성화 단백질이다.
본 발명의 또다른 양태는 제8a도에 도시된 아미노산 1 내지 3 및 87 내지 441(88 위치의 아미노산이 트레오닌에서 프롤린으로 대체되었음)의 폴리펩타이드 서열과 95% 이상 상동성인 폴리펩타이드 서열을 갖고, 피브린 보조인자의 존재하에 자극되는 플라스미노겐-활성화 작용을 갖는 플라스미노겐-활성화 단백질이다.
본 발명의 또다른 양태는 제8a도에 도시된 아미노산 1 내지 3 및 87 내지 441(88 위치의 아미노산이 트레오닌에서 프롤린으로 대체되었음)의 폴리펩타이드 서열과 90% 이상 상동성인 폴리펩타이드 서열을 갖고, 피브린 보조인자의 존재하에 자극되는 플라스미노겐-활성화 작용을 갖는 플라스미노겐-활성화 단백질이다.
본 발명은 또한 개개 단백질에 대한 유전정보의 분리 및 정제방법 및 상응하는 단백질을 발현시키는 방법에 관한 것이다.
제1도는 정제된 박쥐 플라스미노겐 활성인자의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 나타낸 것이다. 샘플을 11% 적층 SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동 하기전에 25mM 디티오트레이톨로 예비처리한다. 제1선은 흡혈박쥐 타액선으로부터 정제한 활성인자(3.6㎍)를 도시한 것이고, 제2선은 엔도글리코시다제 F(Boehringer Mannheim)(0.1단위, 24시간, 37℃)로 처리한 활성인자(3.6㎍)를 도시한 것이며; 제3선은 엔도글리코시다제 F 0.1 단위를 도시한 것이다. 단백질 분자량 마커는 지시된 바와 같다. 타액선(제1선) 및 타액(제2선)으로부터의 박쥐 플라스미노겐 활성인자(100ng)를 토끼 항-박쥐 플라스미노겐 활성인자 항체 및 알칼린-포스파타제 결합된, 염소 항-토끼 IgG를 사용하여 웨스턴 블롯팅 분석한다.
타액선(제3선) 및 타액(제4선)으로부터의 활성인자(15IU)의 피브린 오토그라피는 문헌[참조 : Laemmli, U.K., Nature, 227, pp. 680-685(1970)]에 기술된 바와 같이 수행한다.
제1도에 나타낸 데이타를 수득하기 위해, 데스모더스 로턴더스 박쥐로부터의 동결된 주요 및 부수 하악선(6g)을 100mM 트리스-HCl, 0.5M NaCl, pH 7.5 40ml중에 넣고 브린크만(Brinkmann) 균질화기를 사용하여 즉시 균질화시킨다. 균질물을 27,000xg에서 20분 동안 원심분리시킨다. 상등액 분획을 100,000xg에서 30분 동안 원심분리시켜 맑게 하고, 50mM NaCl, 20mM 트리스-HCl, pH 7.0 및 0.01% 트윈 80으로 희석시키고, 20mM 트리스-HCl, pH 7.2, 50mM NaCl 및 0.01% 트윈 80 중에서 평형화시킨 포스포셀룰로즈 양이온 교환 컬럼(Whatmann P11)에 적용시킨다. 샘플을 적용시킨 다음, 포스포셀룰로즈 컬럼을 상기 평형 완충액으로 철저히 세척한다.
박쥐 플라스미노겐 활성인자를 20mM 트리스-HCl, pH 7.2, 0.5M NaCl 및 0.01% 트윈 80을 사용하여 포스포셀룰로즈 컬럼으로부터 용출시키고, CNBr-활성화된 세파로스 4B(Pharmacia)에 커플링된 에리트리나 트립신 억제제(ETI)(American Diagnostica)로 이루어진 친화성 컬럼에 적용시킨다. 친화성 컬럼을 20mM NaH2PO4, 0.5M NaCl, pH 7.0 및 0.1% 트윈 80으로 세척하고, 활성인자를 계속해서 50mM Na 아세테이트, 0.2M NaCl, pH 4.0 및 0.1% 트윈 80으로 용출시킨다. 활성인자를 함유하는 분획을 모아 1M 트리스 염기를 가하여 25mM의 최종 트리스 농도를 얻는다. 정제된 샘플을 -70℃에서 보관한다. 단백질 농도는 표준물로서 소 혈청 알부민을 사용하여 바이오래드(Biorad) 염료-결합 분석법으로 평가한다.
제6도는 박쥐 플라스미노겐 활성인자 및 tPA에 의해 촉매화된 응혈 용해를 도시한 것이다. 혈장 응혈은 0.21U의 사람 트롬빈(Sigma) 및 7.5mM CaCl2를 [125I] 피브리노겐(100,000cpm/응혈)을 함유하는 사람 혈장195μl에 가하여 형성한다.
각 샘플의 최종 용적은 200μl이다. 응혈은 작은 나무 막대기의 존재하에 형성되어 이에 부착하며, 37℃에서 30분 동안 경과시키고, 급류로 압착시켜, 히루딘(Sigma) 25U/ml를 가한 혈장 250μl에 옮긴다. 플라스미노겐 활성인자를 함유하는 0.1M 트리스-HCl, pH 8.0, 0.01% 트윈 80 25μl를 응혈을 채운용액에 가하고, 샘플을 37℃에서 항온처리하고, 분취량을 회수하여 가용성 피브린 분해 생성물에 대해 계수한다. 타액선으로부터 정제된 박쥐 플라스미노겐 활성인자 및 2-쇄 tPA를 본 연구를 위해 사용한다. ▼, 3nM 박쥐-PA; ■, 3nM t-PA; ●, 10nM 박쥐-PA; ▲, 10nM t-PA, 박쥐 플라스미노겐 활성인자 및 t-PA는, 이미 형성된 혈장 응혈로부터 방사선 표지된 피브린 분해 생성물의 방출을 촉매하는 이의 능력에 대해 조사될 경우, 유사한 효율을 나타낸다.
제7도는 피브린에 대한 플라스미노겐 활성인자의 결합을 나타낸다. 제1선, 박쥐-PA, 1.8pmole ; 제2선 및 3선, 각각 피브린 샘플을 함유하는 박쥐 플라스미노겐 활성인자로부터의 펠렛 및 상등액 분획 10% 용적 ; 제4선, 1-쇄 tPA, 1.8pmole ; 제5선 및 6선, 각각 t-PA-함유 피브린 샘플로부터의 펠렛 및 상등액 분획 10% 용적 ; 제7선, 우로키나제, 0.5pmole ; 제8선 및 9선, 각각 우로키나제 함유 피브린 샘플로부터의 펠렛 및 상등액 분획 10% 용적, 3종의 박쥐 플라스미노겐 활성인자(제1선)는 상등액 및 펠렛 분획 사이에 동등하지 않게 분포된다. 박쥐-PA(I) 및 박쥐-PA(L)은 피브린에 대하여 식별할만한 친화력을 나타내지 않고 상등액 분획에 주로 편재되는 반면(제3선), 다량의 박쥐-PA(H)가 피브린 펠렛내에 분배된다.(제2선). tPA(제4선) 및 우로키나제(제7선)의 분취량도 피브린에 대한 이의 결합능력에 대해 조사한다. 예상한 바와 같이, tPA는 피브린에 강하게 결합하고 펠렛 분획내에 분배되나(제5선), 우로키나제는 상등액 분획에 배타적으로 편재된다(제9선).
10mM NaH2PO4, 140mM NaCl, pH 7.4, 0.01% 트윈 80(사람 피브리노겐 1mg/ml 함유), EDTA(5mM) 및 박쥐 프라스미노겐 활성인자(18pmole) 또는 10-쇄 tPA(18pmole) 또는 우로키나제(5.5pmole) 200μl에 0.2IU의 트롬빈을 첨가하여 피브린 응혈을 생성한다. 우선적으로 1-쇄 tPA(PAM-1, Americal Diagnostica)와 결합하는 모노크로날 항체 컬럼으로 크로마토그래피시켜 1-쇄 및 2-쇄 tPA의 혼합물로부터 1-쇄 tPA를 정제한다. 피브린 응혈을 37℃에서 1시간 동안 경과시키고, 10분 동안 100,000xg에서 원심분리시킨다. 펠렛 분획을 NaH2PO4, NaCl, 트윈 80 완충액 400μl로 세척하여 0.5% SDS 150μl 에 재현탁시키고 일정하게 교반시키면서 1.5시간 동안 37℃에서 항온처리한다. 박쥐 플라스미노겐 활성인자를 함유하는 펠렛 및 상등액 분획을 Enodo F로 처리한다. 샘플을 SDS-PAGE에 적용시키고 FA 분석한다.
[플라스미노겐 활성인자 분석]
[피브린 평판법]
소 또는 사람 피브리노겐(2mg/ml) 및 사람 Glu-플라스미노겐(6μg/ml)를 1% 아가로즈 용액(55℃에 유지)에 용해시켜 피브린 평판을 형성한다. 그후 혼합용액을 보정된 면역확산 평판으로 주조하기전에 사람 트롬빈(1.5단위)를 가한다. 경화된 피브린 평판에 구멍을 내어 웰을 만들고 컬럼 분획을 적용시킨다. 활성물이 존재하는 부분에 용해 분위가 관찰된다. 37℃에서 항온처리 시간 당 용해 면적(㎟) 을 효소의 활성 단위에 연관시킬 수 있다.
[피브린 오토그라피]
샘플을 비-환원 조건하에 SDS-PAGE에 적용시키고, 아크릴 아미드 겔을 트리톤 X-100(2.5%)중에서 철저히 세척한 후, 플라스미노겐-함유 피브린 아가로즈 겔에 놓는다. 플라스미노겐 활성인자는 트리톤 처리로 인해 재생되며, 아가로즈 겔내로 확산되어, 플라스미노겐을 활성화시켜 플라스민을 생성한다. 생성된 플라스민은 피브린을 분해시켜서 분해되지 않은 피브린 영역과 쉽게 구별되는 피브린 용해 지역을 나타낸다.
[커플링된 아미도 분해 분석]
플라스민 수득을 위한 플라스미노겐 활성화를 데사피브(Desafib)의 존재하에 조사하고 플라스민으로 생성을 비색 플라스민 기질인 스펙트로자임(Spectrozyme) PL로 조사한다. 박쥐 플라스 미노겐 활성인자를 사람 Glu-플라스미노겐(20㎍/ml), 스펙트로자인 PL(0.4mM) 및 데사피브(80㎍/ml)와 항온처리한다. 혼합물을 37℃에서 60분동안 항온처리한다. 10% SDS 50 μl를 처리하여 반응을 종결한다. 405mm에서 절단된 기질의 흡광도를 조사한다. 박쥐 플라스미노겐 활성인자의 활성 단위는 37℃에서 1분후에 스펙트로자임 PL 1μl mole의 전환을 촉매하는 효소의 양이다.
[활성 부위 적정]
흡혈박쥐 플라스미노겐 활성인자를 두가지 다른 기술로 작정하여 작용 물농도를 측정한다. 제1의 기술은, 보정 트립신 표준물을 트립신 및 플라스미노겐 활성인지 둘 모두에 대한 클로로메틸 케톤 억제제의 보정 표준 용액으로 역-적정하는 원리에 기반을 둔다. 트립신 용액(500nM)을 4-메틸-움벨리페리-p-구아니딘벤조에이트(MUGB)를 사용하여 직접 적정한다. 클로로메틸 케톤(단실-글루타밀-글리실-아르기닌 클로로메틸 케톤, DNS-EGRCK)을 MUGB-보정 트립신에 대해 적정한다. 이러한 보정 트립신 용액과 보정 클로로메틸 케톤 용액과의 반응에 의해, CK 표준물을 활성인자와 예비항온처리할 경우, 트립신 표준물의 억제 감소가 측정 가능하다.
박쥐 플라스미노겐 활성인자의 존재로 인해, 트립신-CK 대조군에 대한 활성이 증가하며 증가량은 플라스미노겐 활성 인자의 양에 비례한다. 두번째 기술은, 낮은 온도(5℃)에서 반응이 수행될 경우, 박쥐 플라스미노겐 활성 인자에 MUGBE를 첨가한 후 파열 동력학의 관찰에 관한 것이다.
SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 :
본 발명자들은 라엠리(Laemmli) 시스템[참조 : Nature, 227, pp. 680-685(1970)]의 변형된 프로토콜을 이용하였다. 적층 및 분리 겔(0.75mm)은 각각 4% 및 10%의 폴리아크릴아미드를 함유한다. 겔은 75볼트에서 20시간 동안 전기 영동시킨다. 단백질은 실버염색을 통해 검출된다.
[박쥐 플라스미노겐 활성인자 단백질의 정제]
재료 :
데스모더스 포턴더스의 타액 및 타액선을 항체협회(Bedfovd, TX) 및 Dr. C. Rupprecht(Rabies Unit, Wistar Institute, philadelphia, PA)로부터 구입한다.
아미도분해 분석을 위한 피브리노겐, 플라스미노겐, 트롬빈 및 기질은 American Diagnostica(New York, NY.)으로부터 구입한다. 전기 영동에 사용되는 재료는 BioRad, Inc.로부터 구입한다. 컬럼 크로마토그래피에 사용되는 재료는 Pharmacia로부터 구입한다. HPLC 컬럼은 Vydac의 제품이다. 면역확산 평판은 ICN로부터 구입한다.
방법 :
흡혈박쥐 타액으로부터 활성인자를 정제하는데는 포스포셀룰로즈, 페닐-세파로즈 및 C4 역상 HPLC 크로마토그래피 단계가 수반된다.
흡혈박쥐 데스모더스 로턴더스의 타액을 10mM 트리스(pH 7.4), 50mM NaCl, 0.01% 트윈-20 용액으로 3배 용적으로 희석한다. 희석시킨 타액을 4℃의 에펜도르프 원심분리기에서 12000rpm으로 5분간 원심분리한다. 상등액을 포스포셀룰로즈컬럼(25×20cm)에 직접 로딩시키고 타액을 희석시키기 위해 사용된 것과 동일한 완충제로 세척한다. 컬럼을 6ml/시간의 유속으로 작동시킨다. 피브린 평판법으로 수행된 용해영역에 의해 활성을 측정한후, O.D.280에서 단백질을 조사한다.
박쥐 플라스미노겐 활성인자는 포스포셀룰로즈 컬럼에 단단히 결합한다. 1M NaCl을 사용하여서 용출시킨 활성물을 회수율은 94%이었다.(표 I)
플라스미노겐 활성인자 함유하는 포스포셀룰로즈 컬럼의 분획을 합하여 2.5M NaCl의 존재하에 페닐-세파 로즈 컬럼(1.5×5.0cm)에 직접 적용시킨다. 컬럼을 10mM 트리스 완충제중의 2M NaCl-0M NaCl의 구배 및 10% 글리세롤로 세척한다. 모든 활성물이 용출될때까지 10%의 글리세롤 용액으로 계속 세척한다.
페닐-세파로즈 컬럼을 사용하여 크로마토그래피하여 활성물의 82%를 회수한다(표 I). 그러나, 활성물은 2개의 피크로 분획화되므로, 피크 1 및 2를 별도로 수집한다. SDS-PAGE에 이은 실버 염색 및 피브린 오토그라피를 통해 측정한 결과, 두 피크의 분자량은 서로 상이하다(제5도). 박쥐-PA(L)를 나타낸다고 간주되는 피크 1은 염 구배(2M-OM NaCl)의 말기에 용출된다. 피크 2는 박쥐-PA(L)로 간주된다.
페닐-세파로즈후, 박쥐-PA(L)가 약 660배 정제되었다. 데사피브가 박쥐 플라스미노겐 활성인자에대한 효과적인 보조 인자가 아니기 때문에, 박쥐-PA(I) 효소의 총 활성을 플라스미노겐/스펙트로자임 PL 커플링 시스템을 사용한 아미도 분해 분석으로 적절히 측정되지 않았다.
표 I
정제표
* 데사피브는 이러한 종류의 박쥐 PA에 대한 적절한 보조인자가 아니다. N.D. : 측정하지 않음.
단백질에 대한 최종 정제단계는 물중 0.1%(v/v) 트리 플루오로아세트산(TFA)으로 평형시킨 C4 역상 HPLC 컬럼이다. 단백질의 분획-수거물을 동결건조시켜 농축하고 HPLC 컬럼에 직접 적용한다. 0.1% TFA의 존재하에 25% 내지 55% 아세트니트릴의 구배를 통해 효소를 용출시킨다. 단백질 피크는 O.D. 214에서 조사하고 별도로 수거한다. 휘발성 물질의 진공 원심분리하여 제거한 후, 동결건조한다. 단백질을 10mM 아세트산 중에 재용해시킨다. 아세트산을 트리스 트윈 완충제로 중화시킨 후, 피브린 평판법을 이용하여 활성물을 분석한다.
흡혈박쥐 타액선으로부터 박쥐 플라스미노겐 활성 인자의 정제는 하기와 같이 수행한다.
흡혈박쥐로부터의 주요 및 부수 하악선을 10mM 트리스-HCl, 0.5M NaCl, 0.1% 트윈80(pH 7.5)을 함유하는 완충제에 가한 후, 폴리트론을 사용하여 즉시 균질화시킨다. 원심분리후, 맑은 SN 분획은 Amicon 교반 셀(YM 10 막)를 사용하여 10mM 트리스-HCl, 50mM NaCl(pH 7.2)중에서 농축시키고 평형시킨다.
보유물을 10mM 트리스-HCl, 50mM NaCl, 0.01% 트윈 80(pH 7.2)로 평형시킨 포스포셀룰로즈 컬럼(What mann)에 직접 적용시킨다. 플라스미노겐 활성인자 단백질을 포스포셀룰로즈컬럼에 정략적으로 흡수시킨후, 0.5M NaCl 보통된 적용 완충제로 단계적으로 용출시킨다. 활성 회수율은 전형적으로 80%이상이다.
활성인자 활성물을 함유하는 분획을 합하여 세파로즈 4B에 커플링시킨 에리트리나 트립신 억제제(ETI)로 이루어진 친화성 컬럼에 적용시킨다. 다량의 활성물이 상기 컬럼에 흡수되며, 50mM Na 아세테이트, pH 4.0, 0.2M NaCl 및 0.1% 트윈 80으로 컬럼을 세척하여 효과적으로 용출시킨다. 상기 방법을 이용한 하악선 추출물로부터의 박쥐 플라스미노겐 활성인자 활성물의 최종 회수율은 91%로써, 하악선 6g으로부터의 박쥐 플라스미노겐 활성인자 대략 5.4mg을 수득한다. 박쥐 플라스미노겐 활성인자 제제의 균질성은, 평가된 단백질 농도를 4-메틸-움벨리펠리-p-구아니디노벤조에이트를 사용하여 활성-부위적정에 의해 측정된 바와 같은 계산된 작용 몰농도와 대응시켜 알 수 있다[참조 : Urano et al., Biochem. Biophys Res. Comm. 150, 45-51(1988)].
합한 활성 분획을 SDS-PAGE한 후 단백질을 염색한 결과, Mr 값의 범위를 나타내는 밴드가 복합적인 배열을 나타낸다. 활성 분획의 이동은 FA 분석으로 정의된 바와 같은 활성 영역에 해당한다. 아미노산분석, N-말단 분석과 활성부위 적정 데이터 간의 일치외에 이러한 상호관계는 활성인자가 성공적으로 정제되어 균질하다는 증거를 제공한다.
단백질 특성화 및 활성 :
본 발명의 플라스미노겐 활성인자는 플라스미노겐-비함유 피브린 평판의 사용시 활성이 없다. 피브린 I(데사피브)의 존재하에 플라스미노겐과 활성인자를 항온처리한 결과 항-플라스민(-오겐)항체를 사용한 웨스턴 블롯팅 및 면역염색으로 판단된 바오 같이 플라스민이 생성되었다. 이들 플라스민은 사람 피브린에 결합된 사람 플라스미노겐 및 소의 피브린에 결합된 소의 플라스미노겐에 대해 활성을 나타낸다.
세파로즈 G-200 겔 여과 크로마토그래피시, 조 타액 중에 존재하는 박쥐 플라스미노겐 활성인자 활성물의 분자량이 대략 130K인 광범위한 피크로서 용출되었다. 상기 분자량은 아마도 박쥐 플라스미노겐 활성인자가 합쳐진 분자량일 것이다. 이는 0.01% 트윈 20 존재하에 FPLC 세파로즈 컬럼상에서 32K 영역부근으로 추정된다.
정제연구시, 박쥐 플라스미노겐 활성인자는, 크링글 도메인을 통해 피브린에 결합된 단백질을 정제하는데 효과적인 단계로 이미 제시되었던 리신-세파로즈와 상호작용을 하지 않았다. 따라서, 피브린에 대한 활성인자의 결합기전은 tPA와는 구별된다.
활성인자를 엔도글리코시디제 H 및 F로 처리하면 활성인자가 당단백질임을 나타내는 저분자량의 활성단백질이 형성된다. 이들 단백질과 맥아- 및 콘카나발린 A-아가로즈와의 상호작용은 또한 이러한 결론을 입증한다.
Glu-플라스미노겐 활성화시키는 박쥐-PA(H)의 능력은 플라스민-특이도 아미도 분해 기질의 전환을 조사하는 커플링 분석으로 평가한다(표 II). Glu-플라스미노겐에 대한 박쥐-PA(H)의 특이적활성(IU/nmol)은 피브린 유사물(mimetic)의 부재하에 분석할 경우 tPA 보다 대략 260배 낮았다. 그러나, 데사피브 존재하의 Glu-플라스미노겐에 대한 박쥐-PA(H)의 특이적 활성은 tPA에 의해 나타난 활성의 약 85%였다. 따라서, 데사피브는 tPA 및 박쥐-PA(H) 활성을 각각 205 및 45,000배 촉진시킨다. 3종류의 분자형태를 함유하는 Bat-PA에 의해 나타난 특이적 활성은 데사피브 부재하의 박쥐-PA(H)에는 필적하지만, 상기 피브린 보조인자 존재하의 박쥐-PA(H)보다는 대략 30%가 낮았다.(표 II) 및 박쥐-PA(I) 및 박쥐-PA(L)의 활성이 데사피브 80ug/ml에 의해 박쥐-PA(H)와 동일한 정도로 촉진되지 않음을 유추할수 있다.
표 II
박쥐-PA(H), 박쥐-PA 및 tPA에 의한 플라스미노겐의 활성화
이들 데이터는 상술된 커플링된 아미도분해 분석을 이용한 특이적 활성(IU/nmol)를 제시하고 있다. 2-쇄 tPA가 이들 분석을 위해 사용되며 ; 1-쇄 tPA의 촉매적 활성은 그 결과가 분석시 불가피한 2-쇄 tPA 형성으로 혼동되기 때문에 보고되지 않았다. 데사피브는 지정 분석에 함유된다. 촉진 배수 아래의 수는 데사피브 부재시에 대한 존재시에 특이적 활성비이다. 괄호안의 수는 tPA에 의해 나타난 활성에 대한 데사피브에 의한 플라스미노겐 활성인자 활성화 촉진비를 의미한다.
플라스미노겐-함유 피브린 응혈의 용해를 촉매하는 tPA 및 박쥐-PA(H)의 능력도 비교되어있다. tPA의 농도가 0.25 내지 10nM인 경우와 동일한 속도의 응혈 용해 속도를 달성하기 위해서는 다소 고농도의 박쥐-PA(H)가 요구된다. 선택된 용해 속도를 갖는(용량-반응곡선으로부터 유도된) tPA 및 박쥐-PA(H)의 농도가 하기 표 III에 나타난다. tPA에 대한 박쥐-PA(H)의 특이적 활성은 59 내지 72%의 범위이며 플라스 미노겐-활성화 농도와 상호관련있다. 고농도에서 tPA에 대한 박쥐-PA(H)의 특이적 활성증가는, 피브린 및/또는 플라스 미노겐과 상호작용하는 양식에 있어서 이러한 플라스미노겐 활성인자 사이의 차이를 반영한다.
표 III
tPA와 박쥐-PA(H)에 의하여 매개된 피브린 응혈 용해
혼탁도 측정분석법을 이용하는 응혈-용해 실험을 하기 농도의 2-쇄 tPA 또는 박쥐-PA(H)로 4회씩 수행한다 : 0.25, 0.50, 1.0, 2.5, 5.0, 7.5 및 10.0nM, 응혈용해 속도는 소프트맥스(Softmax) 역학 소프트웨어로 각각의 응혈 용해 프로필을 분석하여 결정한 바와 같은 혼탁도의 최대 감소율(-mOD/분)로 표시된다.
각각 tPA 및 박쥐-PA(H)에 대하여 4개 및 6개의 독립적인 직선형 용량-반응곡선(속도 대 log[플라스미노겐 활성인자])이 나타났다. 지시된 응혈 용해 속도를 유도하는 플라스미노겐-활성인자 농도를 표에 수록하였다. tPA 및 박쥐-PA(H)에 대한 모든 용량-반응 곡선을 분석하여 작성된 최적 직선을 묘사하는 방정식으로부터 이러한 값이 유도되었다. 상대효능가는 지시된 응혈 용해 속도를 유도하는 박쥐-PA(H) 농도에 대한 tPA의 비이다.
본 발명의 박쥐 플라스미노겐 활성인자는 급속 작용형 1의 플라스미노겐 활성인자 억제제(PAI-1)에 의한 불활성에 대하여 tPA 보다 덜 민감하다.
폐색용기 영역내의 PAI-1의 농도는 혈장 연구로부터 평가된 농도보다 훨씬 클 수 있다고 생각된다. 혈장중의 잠재성 PAI-1 및 트롬빈, 아데노신 디포스페이트 및 다른 혈소판 효능제의 의하여 방출될 수 있는 PAI-1을 함유하는 혈소판의 존재는 폐색영역의 비교적 높은 국부농도에 기여한다. PAI-1은 tPA의 활성을 특이적으로 차단하는 항-활성인자로 작용한다.
제4도는 tPA가 흡혈박쥐 타액 플라스미노겐 활성인자의 경우보다 플라스미노겐 활성인자 억제제에 의하여 더욱 용이하게 불활성화됨을 나타낸다. tPA 및 흡혈 박쥐 타액 플라스미노겐 활성인자를 각각 혈장중에서 항온처리하고 이들 각각의 활성을 시간의 함수로써 조사한다.
피브린 응혈의 용해를 조사한 결과 tPA와 40kd 단백질 모두에 의한 플라스미노겐 활성화의 NaCl-매개된 억제는 관찰되지 않았다. 이 경우에 있어서, 피브리노겐(표지된 것과 표지되지 않은 것 모두), 플라스미노겐, α2-항플라스민, 인자 XIIIa 및 0.1M NaCl이 함유되거나 되지 않은 완충액을 포함한 정제된 성분으로부터 응혈이 생성되었다.
[박쥐-PA의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 임모빌론(Immobilon)(PVDF막)상으로의 단백질의 블롯팅]
트립신 억제제 친화성 컬럼으로부터의 활성 분획을 합하고, 비닥(Vydac) C4 HPLC 컬럼을 사용하여 더욱 분획화시키고, 이로부터 약 40% 아세토니트릴/0.1% 트리플루오로아세트산으로 플라스미노겐 활성인자 단백질을 용출시킨다. HPLC 컬럼으로부터 용출된 활성을 갖는 두개의 주요 피크(피브린 평가 자가 용해에 의해 측정)를 검출할 수 있다. 활성을 갖는 두개의 피크를 분리해서 합하고 박쥐-PA(I) 및 박쥐-PA(II)로 표시한다.
SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)시키고 피브린 오토그라피한 결과, 박쥐-PA(I)과 (II) 모두가 분자량 42,000 내지 46,000달튼 범위의 용해 영역을 갖는 유사한 양상을 나타냈다. 박쥐-PA(I)과 (II) 모두는 세린 프로테인 아제에 대한 활성-부위 표지제인3H-DFP(디이소프로필플루오로 포스페이트)로 표시시킬 수 있다.
박쥐 플라스미노겐 활성인자 I 및 II 를 라엠리 시스템[참조 : Nature, 227, pp. 680-685(1970)]의 변형 프로토콜을 이용하여 폴리아크릴아미드 겔 전기영동하였다. 적층 및 분리 겔(0.75mM)은 각각 4% 및 10% 폴리아크릴아미드를 함유한다.
겔을 20시간 동안 75볼트에서 전기영동시킨다.
SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분리시킨 단백질을 임모빌론(PVDF막)[Millipore, 카탈로그제IPVH304FO호]상에 전기블롯팅시킨다. 단백질의 전기블롯팅은 필수적으로 문헌[참조 : Mastsudaira, J. Biol. Chem. 261, pp. 10035-10038, 1987]에 기재된 바에 따라 수행한다. 간략하게는, 단백질을 SDS-폴리아크릴아미드 겔로부터 30 볼트에서 15시간 동안 전기용출시킨다. 이어서, 임모빌론 블롯을 쿠마시 블루로 염색시켜서 블롯상에 단백질의 밴드가 나타나게 한다.
블롯으로부터 단백질 밴드를 직접 절단하여 블롯팅한 샘플 밑에 놓인 폴리브렌 예비컨디셔닝된 필터가 장치된 모델 477A 기체상 서열 분석기에 넣는다. 서열분석기 프로그램과 시약은 제조업자(Applied Biosystems)로부터 공급된다. 방출된 아미노산 유도체를 온-라인 HPLC 시스템으로 동정한다.
[흡혈박쥐 타액으로부터 수득한 플라스미노겐 활성 인자의 N-말단 아미노산 서열]
SDS-PAGE 분획화된 플라스미노겐 활성인자의 N-말단 서열분석은 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막(임모빌론, Millpore) 및 온-라인 PTH 분석기가 장착된 Applied Biosystems 모델 470 서열분석기를 사용하여 수행한다[참조 : Matsudaira, P., J. Biol. Chem. 262, 10035-10038(1987)]. 활성인자를 디티오트레이톨/요오도아세트아미드로 환원/알킬화 시키고, 변형된 단백질을 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) V8 프로테아제(Boehringer Mannheim)와 배양한 다음, 비닥 C-18 HPLC 컬럼을 사용하여 단백질 분해성 단편을 분리해냄으로써 플라스미노겐 활성인자의 V8-단편이 생성되었다. 활성부위 펩타이드 단편인 T1은 다음과 같이 동정한다 : 플라스미노겐 활성인자를 데사피브(Ameriican Diagnostical)의 존재하에 [1, 3-3H]디이소프로필 플루오로 포스페이트(New England Nuclear)와 함께 항온처리하고, 디티오 트레이톨 및 요오도아세트아미드로 처리한 다음, 트립신으로 분해시키고, 방사표지된 단편을 HPLC로 분리한 다음 서열분석한다.
플라스미노겐 활성인자 활성을 나타내는 8개의 단백질 밴드가 암모빌론 블롯상에 동정되며 서열분석한다. 수득한 서열은 하기에 기재한 바와 같다. A - ( ) - 특정 위치에서는 동정될 수 있는 아미노산이 없음을 의미하며, 이는 대부분 단백질 서열분석기로부터 특정 아미노산이 불안정하고 회수율이 저조하기 때문이다.
밴드 1-Ala-Tyr-Gly-Gly-Pro-Ser-Glu-( )-Arg-Tyr-Phe
밴드 2-Ala-Tyr-Gly-Gly-Pro-Ser-Ala-( )-( )-Tyr-( )-Asp-Gln-Gly-Val
밴드 3-Ala-Tyr-Gly-Val-Ala-Cys-Lys-Asp-Glu-Ile-Thr-Gln-Met-(Thr)-Tyr
밴드 4-Ala-Tyr-Gly-Val-Ala-Cys-Glu-Asp-Glu-Ile-Thr-Gln-Met-(Thr)-Tyr-Lys
밴드 5-Ala-Tyr-Gly-Gly-Pro-Ser-Glu-Leu-( )-Tyr-Phe-Ile-Gly-Gly
밴드 6-Ala-Tyr-Gly-Asp-Pro-His-Ala-Thr-Ala-Tyr-Lys-Asp-Gln-Gly-Val
밴드 7-Ala-Tyr-Gly-Asp-Pro-His-Ala-Thr-Cys-Tyr-Lys-Asp-Gln-Gly-Val-Thr-Tyr-Arg-Gly
밴드 8-Ala-Tyr-Gly-Asp-Pro-His-Ala-Thr-Cys-Thr-Cys-Tyr-Lys-Asp-Gln-Gly-Val-Thr-Tyr-Alg-Gly-Thr
[박쥐의 플라스미노겐 활성인자 cDNA의 분자 클로닝]
재조합 DNAS 기술은, 상이한 세포 일반적으로 상이한 유기체로부터의 유전정보인 DNA의 단편을 DNA가 수득된 유기체의 외부에서 말단-대-말단을 결합시키고, 이 하이브리드 DNA를 원래의 DNA가 암호화한 단백질의 생성을 가능케 하는 세포내로 도입시키는 기술을 의미한다. 유전 정보인 DNA 또는 mRNA는 분리하여 적당한 클로닝 벡터내로 도입시킨 다음, 적당한 숙주 세포내로 형질감염시킨다.
본 명세서에서 사용된 클로닝 벡터는 특정의 실험용 이종 DNA의 도입을 허용하는 DNA서열로서, 조합된 DNA는 안정하게 존재할 수 있고 실험용 DNA에 의해 지시되는 단백질을 발현시킬 수 있는 숙주세포내로 도입된다. 벡터 DNA와 조합된 이종 DNA는 재조합 기술로부터 유도된 재조합 DNA 분자로 구성되어 있다. 클로닝 벡터에는 플라스미드, 박테리오파아지, 바이러스 및 코스미드가 포함된다. 특정한 클로팅 벡터를 사용하여 신규한 데스모더스 단백질 DNA 서열을 클로닝시킬수 있다. 본 명세서에서, 발현 벡터는 적당한 숙주내에서 유전자의 클로닝된 복제물의 전사 및 이들의 mRNA의 해도에 필요한 DNA 서열을 의미한다. 상기 벡터들은 세균, 효모, 곤충 및 포유 동물 세포와 같은 다양한 세포내에서 원핵 또는 진핵성 유전자를 발현시키는데 사용될 수 있다. 단백질은 다수의 바이러스 시스템 내에서도 발현시킬 수 있다. 적절히 작제된 발현 벡터는 다음을 함유해야 한다: 숙주세포내자가 복제를 위한 복제 기원, 선택성 마커, 제한된 수의 유용한 제한 효소 부위, 다수 복제수, 및 강력한 프로모터, 프로모터는 RNA 폴리머라제가 DNA에 결합하여 RNA 합성을 개시하도록 지시하는 DNA 서열로서 정의된다. 강력한 프로모터는 mRNA 가 높은 빈도로 개시되도록 유도하는 프로모터이다. 발현벡터에는 클로닝 벡터, 변형된 클로닝 벡터, 특별히 고안된 플라스미드 또는 바이러스가 포함될 수 있으나, 이로써 제한되지는 않는다.
본 발명의 단백질은 데스모더스 천연 단백질중의 규정된 유전자에 의해 특정화된 완전 단백질 또는 이의 단편 또는 서브단위, 또는 완전 단백질의 하이드리드 또는 이의 단편 또는 서브단위로서 존재할 수 있으나 이로써 제한되지는 않으며, 단, 상기 단백질은 피브린의 존재를 엄격히 필요로 하는 데스모더스 로턴더스 타액으로부터 유도된 플라스미노겐 활성인자의 특성을 나타내야 한다. 본 명세서에서 사용된 완전 단백질은 적절한 데스모더스 유전자에 의해 생성된 완전한 길이의 전사후 변형된 폴리펩타이드를 지칭한다. 완전 단백질은 적절한 데스모더스 로턴더스 타액으로부터 정제에 의해 또는 상응하는 재조합 유도된 유전자 생성물의 적절한 발현벡터내에서의 발현에 의해 수득될 수 있다. 단백질 단편 또는 서브단위는 완전 단백질 보다 더 적은 수의 아미노산을 함유하며 천연 단백질에서와 동일한 조건하에서 플라스미노겐 활성화 능력을 보유하는 단백질의 특정한 부분을 지칭한다. 하이브리드 단백질에는 용합 단백질 또는 발현 벡터내 다수의 유전자의 발현으로부터 생성되는 단백질의 포함되나 이로써 제한되지는 않는다. 융합 단백질은 제한된 수의 암호와 아미노산이 발현 벡터에 의해 발현되고 발현결과 특정의 플라스미노겐 활성인자 플리펩타이드에 이들이 결합되는 단백질로서 정의한다. 다수의 유전자로부터 생성되는 단백질에는 플라스미노겐 활성화를 증진시키는 펩타이드 결합에 의해 제2폴리펩타이드(들)에 결합된 특정 활성 폴리펩타이드가 포함될 수 있다.
타액선을 갓죽인 10마리의 흡혈 박쥐로부터 수득하고 폴리 A+RNA의 분리에 사용한다. 이 RNA는 2×106개 이상의 재조합 박테리오파아지로 이루어진 λgt22 일방향성 cDNA 라이브러리를 작제하는데 사용한다. 노던 블롯팅 분석에 사용되는 추가의 RNA 제제를 드라이 아이스상에서 급속 동결시킨 타액선으로부터 분리한다. 이 RNA의 질은 신선한 조직에서 분리된 것에 필적한다.
저온 구아니디늄 트이오시아네이트법에 의해 흡혈박쥐의 주요 및 부수 하악선으로부터 모든 RNA를 분리한다[참조 : Han. J. et al., Biochem, 26, 1617-1625(1987)]. 폴리(A) RNA는 올리고(dT)-셀룰로오스 크로마토그래피에 의해 분리한다. 이본쇄 cDNA는 앞서 기술한 바와 같이 구블러(Gubler)와 호프만(Hoffman)의 방법[참조 : Gene 25, 263-269(1983)]을 변경시켜 제조한다[참조 : Dixon, R. A. F et al. Nature 321, 75-79(1986)]. cDNA를 아가로스 겔 전기영동하여 1 내지 2kb 및 2 내지 7kb 길이로 크기별로 분획하여 람다 ZAP 암(arm)(Stratagene)의 EcoRI 부위에 연결시킨다. 라이브러리를 이. 콜라이 균주 L.E 392상에 증폭시키고 문헌[참조 : Maniatis, T., et al., Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY]에 기술된 바와 같이 플라크 하이브리드화에 의해 선별한다. 펩타이드 N-1, N-3, N-2 및 T-1에 상응하는 부분적으로 중첩되는 상보적인 올리고뉴클레오티드의 쌍을 어닐링하고, 클레노우 단편과 4개의 [32P] 알파-dNTP로 표지하여 라이브러리로부터 니크로셀룰로즈 필터 리프트를 프로브하는데 사용한다. 하이브리드화 및 세척조건은 문헌[참조 : M aniatis et al., 상기 참조]에 기재된 바와 같이, 양성 크론을 플라크 정제하고 제공자의 교시에 따라 헬퍼 파아지로 동시감염시켜 cDNA 삽입물을 구제한다. 디데옥시뉴클레오티드법(참조 : Sanger, F. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., Vol. 74, pp.5463-5467(1977)]에 따라 일본쇄 및 이본쇄 DNA 서열분석을 수행한다.
제8a도는 플라스미노겐 활성인자(들) cDNA의 뉴클레오티드 서열 및 활성인자(들)의 아미노산 서열을 나타낸다. 뉴클레오티드 서열은 가장 긴 클론의 5' 말단으로부터 확장되어 개방 판독 프레임 전반에 걸쳐 있다. 폴리(A) 테일로 끝나는 3' 비해독 서열의 추가의 800nt는 나타나지 않았다. 뉴클레오티드 서열은 제1염기가되는 제시된 개시 코돈을 지니는 각 라인의 왼쪽에 번호를 매긴다. 예견된 아미노산 서열은 단일문자 코드로 나타냈으며 각 라인의 오른쪽에 번호를 매긴다. 박쥐-PA(H), 박쥐-PA(Ⅰ) 및 박쥐-PA(L)에 대해 결정된 아미노산 서열은 밑줄을 긋고 각각 N-1, N-2 및 N-3로 나타냈다. 박쥐-PA(H)는 시그날펩타이드가 tPA의 시그날 절단 부위와 유사한 위치에서 절단되는 완전한-길이 형태에 상응한다. 박쥐-PA(Ⅰ)는 박쥐-PA(H)와 같은 3개의 아미노산으로 개시되며 이어서 EGF 영역에 상응하는 N-2로 시작하는 서열이 뒤따른다. 그러므로, 박쥐-PA(Ⅰ)는 박쥐-PA(H)의 핑거-마이너스 형태에 해당한다. 박쥐-PA(L)의 고유한 아미노산 서열은 동일한 3개의 아미노산로 개시되고, EGF 영역이후의 N-3의 제2아미노산이 트레오닌에서 프롤린으로 변화된 것을 제외하고는 N-3에서 개시되는 폴리펩타이드 부분이 뒤따르며, 박쥐-PA(H) 단백질의 핑거-마이너스 및 EGF-마이너스 형태를 형성한다. 2개의 스타필로코커스 V8 단백질 분해 단편(V-1, V-2) 및 트립신 분해 단편(T-1)의 아미노산 서열도 밑줄을 그었다. 점선 밑줄은 결정할 수 없거나 cDAN로부터 예견된 아미노산과 일치하지 않는 아미노산 잔기를 나타낸다. [3H]DIEP로 표지된 활성부위 Ser의 위치는 (*)으로 나타냈다. 예견된 N-연결된 당화 부위는 박스로 표시한 아미노산으로 나타냈다.
박쥐 PA cDNA를 함유하는 3개의 파아지 클론을 기초로하여 올리고뉴클레오티드 프라이머를 합성하였다. 박쥐 PA cDNA 클론을 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)으로 증폭시킨다.[참조 : 미합중국 특허 제4,800,159호, 컬럼 2, 라인 36-68, 컬럼 3-4 및 컬럼 5, 라인 1-20, 본원에 참조로 인용됨]. cDNA 본쇄를 분리될 때까지 가열하며 동시에 각 본쇄에 결합하는 프라이머를 가한다. 프라이머는 복제기능을 수행하는 DNA 폴리머라제가 본쇄의 특정 부분을 복제하도록 지시한다. 이러한 과정은 복제물의 생성됨에 따라 일련의 가열 및 냉각사이클, 본쇄를 분리하기 위한 가열, 및 냉각을 계속한다. 특정 본쇄의 더 많은 복제물이 생성되도록 사이클을 반복한다.
증폭 반응을 통하여,말단 제한 부위가 함유된 암호화 영역이 수득되었다.
하기 기술하는 바와 같이 3종류의 박쥐 플라스미노겐 활성인자 형태(박쥐-PA(H), 박쥐-PA(I) 및 박쥐-PA(L)에 대한 발현벡터를 제조한 다음, 일시적 형질 감염법(발현이 성공적으로 달성되었는지의 여부를 정성적으로 측정하기 위해 사용됨) 또는 안정적 형질감염법(바람직하게는 생존 클론을 설정하는데 사용함)에 따라 세포롤 형질감염시킨다.
일시적 형질감염법의 경우, 형질감염에 앞서서 2.5×106개 세포/100㎜ 디쉬를 24시간 동안 10ml 배지에 플레이팅한다. 형질 감염 2 내지 4시간 전에 배지를 교환한다. 각각의 100㎜ 디쉬당 5㎍/250μl ddH2O의 농도로 필터 멸균된 재조합 박쥐 PA-pD5 플라스미드 DNA를 제조하여 DNA/CaPO4침전물을 제조한다.
이 침전물을 0.5M CaCl2와 ddH2O 500μl와 혼합하여 최종 용적이 1ml가 되게 한다. 2xHBS 1ml를 약교반하에 적가한다. 제제를 실온에서 10 내지 30분동안 방치시키고 침전물을 약 선회하에 평판에 균일하게 적가한다. 이 단계후에 방법은 형질감염되는 세포에 따라 다소 차이가 있다. CVI 세포는 37℃ 및 10% CO2에서 4시간 동안 배양하는 한편, COS7 및 293 세포는 37℃ 및 6% CO2에서 4시간 동안 배양한다. 형질감염 시킨지 4시간 후에, 293 세포에 대한 배지를 제거한다. 형질감염 시킨지 4시간 후에 CV1 및 COS7 세포에 글리세롤 쇽을 2분동안 가하고(배지중 15% 글리세롤), PBS로 2회 세정한다. 이어서 신선한 배지를 가한다.
세포를 37℃에서 배양하고 형질감염 시킨지 24, 48 및 72시간 후에 분석한다.
안정적 형질감염법의 경우, 일시적 형질감염법을 다음과 같이 변형시킨다. 100㎜ 디쉬당 2.5×106개 세포가 아닌 100㎜ 디쉬당 5×105개 세포를 플레이팅한다. Neo 발현 플라스미드 0.5㎍을 G418 선별용 DNA/CaPO4침전물중에 포함시킨다. 세포를 G418 내성 콜로니아 발생할때까지 2 내지 3일 간격으로 배지를 교환하면서 48시간 동안 선별을 계속한다.
각종 박쥐 플라스미노겐 활성인자 형태에 대한 중간체 및 발현벡터를 하기 방법으로 제조한다.
Ⅰ. 박쥐-PA(H)
1. 5' 천연 NTL :
프라이머로서 하기에 나타낸 올리고데옥시뉴클레오티드 쌍 141과 142 및 27과 19를 사용하여
cDNA를 PCR 증폭시킴으로써 cDNA 라이브러리로부터 박쥐-PA(H) cDNA를 유도시킨다 :
10mM 트리스-C1 pH 8.3, 50mM KCl, 1.5mM MgCl2, 각 dNTP 200μM, 각 PCR 프라이머 100pmol, cDNA 또는 라이브러리 DNA 10 내지 100ng 및 Taq 폴리머라제 2.5 단위로 이루어진 반응용적 100μl 중에서 PCR을 수행한다. 반응은 DNA 써모사이클러(thermocycler)에서 30사이클동안 프로그래밍한다. 각 사이클에는 94℃에서 2분간의 변성, 60℃에서 2분간의 어닐링 및 72℃에서 2분간의 중합반응이 포함된다.
증폭된 cDNA를 겔 정제한 다음, BalⅡ로 제한분해시키고 pSP73 Bgl Ⅱ 부위에 연결시킨다. 서열 검증후, 박쥐-PA(H) 개방 판독 프레임을 아데노바이러스 주요 후기 프로모터를 함유하는 진핵세포성 발현벡터 pD5에 서브 클로닝하여 pSZ88-104-20을 생성한다(도 9 참조). 293 세포를 pSZ88-104-20으로 형질감염시켜 293-Bat-PA-1 포유동물 세포(ATCC 기탁, 기탁번호 CRL 10180)를 생성한다. 이 콜라이 세포를 pSZ88-104-20으로 형질감염시켜 BPA-CN-pSZ88-104-20 세균 세포(ATCC 기탁번호 68050)를 생성한다.
2. 5'코자크(Kozak) NTL
프라이머로서 올리고데옥시뉴클레이티드 쌍 18과 19를 사용하여 전술한 바와 같이 박쥐-PA(H) cDNA를 PCR 증폭시킨다 :
AAT ACA ATG AAG AC3′
증폭된 cDNA를 겔정제시킨 후, Xba I 및 HindⅢ으로 절단하고, Xba I 와 HindⅢ 부위 사이에 중간체 벡터 pSP73에 연결시켜 pSZ89-109, pSZ89-110, p89WO-10 및 p89WO-8을 생성한다. 박쥐-PA(H) 개방 판독 프레임을 원래의 BamH I 클로닝부위 대신에 다수의 클로닝부위를 함유하는 pD5-mcs 벡터의 Sac I/Spe I 부위에 추가로 서브클로닝시켜 pSZ89-111-17, pSZ89-112 및 pSZ89-113을 생성한다.(참조 : 제10도). 이 콜라이 세포를 pSZ89-111-17로 형질감염시켜 BPA-CK-pSZ89-111-17 세균 세포(ATCC 기탁번호 68052)를 생성한다.
Ⅱ. 박쥐-PA(I)
박쥐-PA(I) 개방 판독 프레임을 전술한 바와 같은 PCR 방법에 의해 cDNA 라이브러리로부터 유도하였으며, 완전한 이소형태에 비해 작은 크기로 인지되었다.
천연 NTL을 함유하는 박쥐-PA(I)이 올리고데옥시뉴클레오티드 쌍 27과 19로부터 유도되는 반면에 코작크 NTL을 함유하는 박쥐-PA(I)은 올리고데옥시뉴클레오티드 쌍 18과 19로부터 유도된다. 증폭된 박쥐-PA(I) 개방 판독 프레임을 pSP73 내로 클로닝시키기 위해 HindⅢ 및 Xba I 로 절단하여 p89WO-14, p89WO-5, 6, p89WO-9 및 p89FWO-12를 생성하거나, pD5-mcs 벡터내로 클로닝시키기 위해 Spel 및 Sac I으로 절단하여 p89WO-1, p89WO-2, A, B, C, p89WO-3 및 p89WO-4를 생성한다(참조 : 제11도).
이. 콜라이 세포를 p89WO-1으로 형질감염시켜 BPA-FK-p89WO-1 세균세포(ATCC 기탁번호 68051)를 생성한다. 이. 콜라이 세포를 p89-WO-2C로 형질감염시켜 BPA-FN-p89WO-2C 세균세포(ATCC 기탁번호 68053)를 생성한다.
Ⅲ. 박쥐-PA(L)
박쥐-PA(L) 개방 판독 프레임을 프라이머로서 올리고데옥시뉴클레오티드 쌍 18과 11.4를 사용하여 라이브러리 DNA를 PCR 증폭시켜 cDNA 라이브러리로부터 유도한다 :
11.4 5CCT TCC TTC TGA TGA CCT TC3'
증폭된 DNA를 겔 정제한 뒤 Nco I 로 절단하고, 박쥐-PA(L)의 5' 부위를 암호화 하는 세 개의 Nco I 단편중 가장 작은 것을 다시 겔 정제하여 Nco I 절단된 p89WO-11(pSP73 중의 박쥐-PA(H) 개방 판독 프레임)에 연결시켜 각기 p89WP-17 및 p89WP-18을 수득한다. 이어서 박쥐-PA(L) 개방 판독 프레임을 Sac I 및 Spe I 으로 절단하여 중간체 벡터로부터 방출시키고 pD5-mcs 벡터내로 서브클로닝하여 p89W-20AB 및 p89WP-19Ab를 수득한다(참조 : 제12도). 이. 콜라이 세포를 p89WP-20A로 형질감염시켜 BPA-DK-p89WP-20A 세균 세포(ATCC 기탁번호 68049)를 생성한다.
COS-7을 형질감염시킨지 48시간 후 제거한 컨디셔닝된 배지를 피브린 한천 평판 분석한 결과 BatPA가 50ng/ml인 것으로 나타났다.
클론 pSZ88-104-20이 최고의 발현체인 것으로 밝혀졌다. 이 클론을 293 세포중에 설정하고 박쥐 PA활성/유착 단층을 1일단 0.5μg/ml/일 이상 발현시켰다.
부티레이트에 대한 만성노출 및 배지 최적화는 발현수준을 10μg/ml/일 이상까지 상승시켰다. 기타의 적합한 발현벡터는 pSZ89-111-17(천연 5'-NTL 보다는 오히려 코작크를 갖는 pSZ88-104-20의 유도체), EBV/EBNA/D5BatPA-C 및 CMVIE-AK1-BatPA-C, 및 HIV LTR/BatPA-C이다.
[사람조직 플라스미노겐 활성인자에 대한 비교]
사람조직 플라스미노겐 활성인자와 본 발명의 박쥐-PA(H)의 1차 아미노산 서열구조의 비교 결과를 하기에 나타냈다.
사람 tPA의 피브로넥틴 핑거 영역(서열 9 내지 46)은 박쥐-PA(H) 서열 6 내지 43과 78% 상동성이다. 사람 tPA의 표피성장 인자영역(서열 46 내지 95)은 박쥐-PA(H) 서열 43 내지 92와 75% 상동성이다. 사람 tPA의 제1크링글 영역(서열 95 내지 177)은 박쥐-PA(H) 서열 92 내지 174와 67% 상동성이다.
사람 tPA의 제2크링글영역(서열 178 내지 265)은 박쥐-PA(H)에서 아무런 대응물도 갖지 않는다. 박쥐-PA(H) 아미노산 175 및 176은 리신 및 알라닌이다. 박쥐-PA(H)의 아미노산 190 내지 441, 즉 “경쇄”는 사람 tPA 경쇄서열 280 내지 531과 74% 상동성이다.
제8b도는 박쥐-PA(H)의 아미노산 서열 및 사람 t-PA와 비교결과를 도식적으로 나타낸 것이다(참조 : Pennica et al. Nature Vol. 301, 214-221(1983)]. 박쥐-PA의 개개의 아미노산을 단일 문자 코드로 나타내었다. ●은 박쥐-PA(H)와 사람 tPA간의 아미노산이 동일함을 나타낸다. ○은 상이한 잔기를 나타낸다. 제안된 디설파이드 패턴은 t-PA와 동일하다. 가정한 N-연결된 당화 위치는 꼬리표를 붙인 괄호로 나타낸다.
이러한 플라스미노겐 활성인자의 천연 유도체 박쥐-PA(I) 및 박쥐-PA(L)외에, 본 발명의 범위내의 다른 유도체도 핑거 영역(아미노산(-3) 내지 43) 또는 표피성장 인자영역(아미노산 43 내지 84)을 제외하고는 플라스미노겐 활성인자이다.
또다른 유도체는 돌연변이된 탄수화물지지 아미노산 잔기를 갖는 박쥐-PA(H)이다. 각각 긴 반감기를 포함한 바람직한 플라스미노겐 활성화 특징을 나타낸다.
본 발명의 범위에는 또한 경쇄 박쥐-PA(서열 190 내지 441) 및 중쇄 사람 tPA(서열 1 내지 278)의 융합단백질, 및 플라스미노겐 활성 특성을 갖는 이의 유도체가 포함된다. 박쥐-PA의 단백질분해 영역은 제1형 플라스미노겐 활성인자 억제제에 의해 현저하게 불활성화되지 않기 때문에 융합단백질은 사람 조직 플라스미노겐 활성인자 보다 뛰어난 약리학적 특성을 갖는 것으로 생각된다.
전술한 바와 같이 박쥐 플라스미노겐 활성인자의 활성은 피브린 보조인자의 존재하에서 상당히 촉진다.
박쥐 플라스미노겐 활성 인자는 피브린-결합 플라스미노겐에 대해 tPA 보다 90배 이상 선택성인 것으로 나타난다. tPA의 제2크링글영역은 활성의 피브린-유도 자극을 중개하는데 결정적인 역할을 하는 것으로 믿어지는 리신-결합 부위를 포함하고 있다. 이에 비해, 본 발명의 활성인자의 아미노산 서열은 이의 두드러운 피브린-선택성이 tPA의 제2크링글 영역과 유사한 영역의 존재로 인한 것이 아님을 보인다. 더욱이, 박쥐 플라스미노겐 활성인자의 Lys-세파로스에의 결합 무능력은 리신-결합 부위의 존재가 플라스미노겐의 피브린-특이활성에 무관함을 보여준다.
본 발명의 활성인자의 크링글 영역은 tPA의 제2크링글 영역과 상이함에도 불구하고 활성물의 피브린-유도된 자극을 중개한다.
활성인자는 또한 박쥐 효소중에 플라스민-민감성 프로세싱 부위가 없기 때문에 tPA와 구조적으로 상이하다.
상기에 기술된 박쥐-PA 단백질은 결정된 DNA 유전자와 연역적인 아미노산 서열분석에 의해 규정된다. 천연인 대립 형질 변이가 존재할 것으로 이해된다. 이들 변이는 전체 서열 중의 아미노산 상이성(들) 또는 이 서열중에 발생하는 아미노산(들)의 결실, 치환, 삽입, 역위 또는 첨가에 의해 입증될 수 있다. 또한, 당화의 위치 및 정조는 숙주 세포의 환경 특성에 의존한다.
각종 박쥐 플라스미노겐 활성인자 유도체 제조를 위한 재조합 DNA 기술을 사용함에 있어서, 예를 들어 기본이 되는 DNA의 부위 지시된 돌연변이 유발을 이용하여 생성된 단일 또는 다수의 아미노산 치환, 결실, 첨가 또는 대체에 의해 다양하게 변형시킨 유도체가 잠정적으로 존재한다. 필수적이고 특징적인 박쥐 플라스미노겐 활성인자의 활성이 영향받지 않고 남아있는 한, 박쥐 플라스미노겐 활성인자의 유도체를 생성시키는 이와 같은 모든 대립형질의 변이 및 변형은 본 발명의 범위내에 포함된다. 박쥐 플라스미노겐 활성인자는 .
(1) 첫 번째 아미노산으로서 메티오닌을 갖거나(구조 유전자의 앞에 ATG 개시 시그날 코돈을 삽입함으로써 존재),
(2) 메니오닌이 세포내 또는 세포의 절단되는 경우, 이의 정상적인 첫 번째 아미노산을 갖고 또는
(3) 통상적인 시그날 폴리펩타이드 이외의 이의 시그날 폴리펩타이드 또는 결합된 단백질과 함께(여기에서, 시그날 폴리펩타이드 또는 결합물은 세포내 또는 세포의 환경에서 특이적으로 절단될 수 있다(참조 : 영국 특허원 공개번호 제2,007,676호]), 또는
(4) 이종의 불필요한 폴리펩타이드를 절단할 필요없이 성숙형으로 직접 발현시킴으로써 제조된다. 후자는 플라스미노겐 활성인자를 이의 시그날 펩타이드와 함께 발현시키도록 발현 비히클을 디자인한 경우 주어진 숙주가 시그날 펩타이드를 제거하지 못하거나 충분히 제거하지 못하는 경우에 특히 중요하다. 이렇게 여러형태로 생성된 박쥐 플라스미노겐 활성인자를 회수하고 각종 혈관증상 또는 질환의 치료에 적합한 수준으로 정해진다.
[치료]
이러한 단백질은 상당량을 혈액내로 전달할 편리한 방법에 의해 투여할 수 있다. 정맥내 투여가 현재 바람직한 투여형태로 주목된다. 이들은 수용성이며, 따라서 용액으로 유효하게 투여할 수 있다.
하나의 적용예에서, 본 발명의 단백질 적정량을 심장마비 있는 동물에 정맥내 투여한다. 혈전용해를 달성하기 위한 적합한 투여량은 200㎎ 이하이며, 바람직하게는 25 내지 150㎎, 더 바람직하게는 약 25 내지 50㎎이다.
또한 단백질은 상기한 투여량으로 수시간에 걸친 연속적 환약 주입에 의해 적용할 수 있다.
단백질은 혈소판 응집 억제제와 함께 동시 투여하여 혈전용해 및 혈소판 응집 억제의 연합 효과를 유도할 수 있다. 동시투여는 혈소판 응집 억제제를 혈소판 응집 억제량, 예들 들어, 0.05 내지 2μM의 안전상태혈장 농도에 이르는 양으로 정맥내 투여함을 포함한다.
Claims (22)
- a) 플라스미노겐을 활성화시키기 위해 피브린 보조인자를 필요로하고,b) 혈장 응혈의 용해를 촉매하며,c) 피브린 응혈이 존재하는 경우 NaCl에 의해 억제되지 않고, 탈당화된 형태를 SDS-PAGE로 분석시 분자량이 약 44,000달톤임을 특징으로 하는, 하기 아미노산 서열을 갖는 정제된 당화되거나 비당화된 플라미노겐 활성화 단백질.
- a) 플라스미노겐을 활성화시키기 위해 피브린 보조인자를 필요로 하고,b) 혈장 응혈의 용해를 촉매하며,c) 피브린 응혈이 존재하는 경우 NaCl에 의해 억제되지 않고, 탈당화된 형태를 SDS-PAGE로 분석시 분자량이 약 38,000달톤임을 특징으로 하는, 하기 아미노산 서열을 갖는 정제된 당화되거나 비당화된 플라스미노겐 활성화 단백질.
- 제1항에 있어서, 하기의 아미노산 서열을 갖는, 플라스미노겐을 활성화시키기 위해 피브린 보조 인자를 필요로 하는 플라스미노겐 활성화 단백질.
- a) 플라스미노겐을 활성화시키기 위해 피브린 보조인자를 필요로 하고,b) 혈장 응혈의 용해를 촉매하며,c) 피브린 응혈이 존재하는 경우 NaCl에 의해 억제되지 않고, 탈당화된 형태를 SDS-PAGE로 분석시 분자량이 약 40,000달톤임을 특징으로 하는, 하기 아미노산 서열을 갖는 정제된 당화되거나 비당화된 플라스미노겐 활성화 단백질.
- 제2항에 따른 단백질 암호화 DNA 서열.
- 제1항에 따른 단백질 암호화 DNA 서열.
- 제3항에 따른 단백질 암호화 DNA 서열.
- 제4항에 따른 단백질 암호화 DNA 서열.
- 제5항에 따른 삽입 DNA 서열을 포함하는 복제성 클로닝 비히클.
- 제6항에 따른 삽입 DNA 서열을 포함하는 복제성 클로닝 비히클.
- 제7항에 따른 삽입 DNA 서열을 포함하는 복제성 클로닝 비히클.
- 제8항에 따른 삽입 DNA 서열을 포함하는 복제성 클로닝 비히클.
- 유효량의 제1항에 따른 단백질을 포함하는 피브린-결합된 플라스미노겐을 활성화하기 위한 약제학적 조성물.
- 제1항에 따른 단백질과 특이적으로 반응하는 항체.
- 제1항에 있어서, a) 분자량이 약 44,000달톤이고,b) 활성 부위 및 사람 조직 플라스미노겐 활성인자의 상응하는 영역과 90% 이상 상동성인 핑거, 표피 성장인자 및 크링글(kringle) 1영역을 포함하며,c) 플라스미노겐을 활성화시키기 위해 피브린 보조인자를 필요로하는 플라스미노겐 활성화 단백질.
- 제15항에 있어서, 피브린에 결합하는 단백질.
- 제15항에 있어서, 돌연변이된 탄수화물-지지 아미노산 잔기를 함유하는 단백질.
- 제4항에 있어서, a) 분자량이 약 40,000달톤이고,b) 활성 부위 및 사람 조직 플라스미노겐 활성인자의 상응하는 영역과 90% 이상 동성인 표피 성장인자 및 크링글 1영역을 포함하며,c) 플라스미노겐을 활성화시키기 위해 피브린 보조인자를 필요로하는 플라스미노겐 활성화 단백질.
- 제2항에 있어서, a) 분자량이 약 38,000달톤이고,b) 사람 조직 플라스미노겐 활성인자의 상응하는 영역과 90% 이상 상동성인 크링글 1영역을 포함하며,c) 플라스미노겐을 활성화시키기 위해 피브린 보조인자를 필요로하는 플라스미노겐 활성화 단백질.
- 제8a도에 나타낸 아미노산 190내지 441에 해당하는 아미노산 서열 및 조직형 플라스미노겐 활성인자로부터의 중쇄 서열을 포함하며, 제1형 플라스미노겐 활성인자 억제제 존재하에, 조직 플라스미노겐 활성인자가 나타내는 플라스미노겐 활성화 활성보다 큰 플라스미노겐 활성화 활성을 갖는 플라스미노겐 활성화 융합 단백질.
- 제11항의 클로닝 비히클로 형질감염된 포유동물 293 세포.
- 제11항의 클로닝 비히클로 형질감염된 이. 콜라이 세포.
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