NO314548B1 - Fremgangsmåte for rensing av et plasminogenaktiverende protein fra vampyrflaggermus - Google Patents

Description

Vampyrer eller blodsugende flaggermus er absolutt avhengige av en næring i form av friskt blod som de får ved å gi offeret et sår. Selv om disse sårene bare er i over-flaten, fortsetter de å lekke ut blod i flere timer.

Bestanddeler i spytt fra vampyr (Desmodus rotundus) ble undersøkt, og man fant at disse hadde innvirkning på den hemostatiske mekanisme hos pattedyrblod på tre spesielle områder. Man kunne vise at de inhiberte blodplateaggregering og aktiverte plasminogen (Hawkey, CM. , Nature, 211:434 (1966) og Hawkey, CM. , Br. J. Haematol., 13:1014 (1967)). Hver av disse virkninger kunne knyttes til en spesiell proteinfrak-jon. Den fraksjon som aktiverte plasminogen, ble betegnet "desmokinase" (Hawkey, CM., Nature). Cartwright, T. , Blood, beskriver rensing av desmokinase fra Desmodus-spyttsekret og angir at det er mer effektivt enn urokinase (UK) og strepto-kinase for lyse av tidligere dannet koagel.

Bruken av vevs-plasminogenaktivator (tissue-type plasminogen activator = tPA) som trombolytisk agens er be-heftet med en rekke ulemper, bl.a. alvorlige blødningskompli-kasjoner, relativt hyppig reokklusjon, manglende jevn virkning og tendens til inaktivering fra plasminogenaktivator-inhibitorer som plasminogenaktivator-inhibitor av type 1 (PAI-1) (Loskutoff, Seminars in Thrombosis and Hemostasis,

bind 14, nr. 1 (1988)).

Man antar at blødningskomplikasjoner ved trombolytisk behandling forårsakes eller økes ved aktivering av sirkulerende plasminogen. Man tror at evnen hos tPA til å binde seg til fibrin er årsak til dens markerte substrat-preferanse overfor fibrinbundet plasminogen. Ikke desto mindre har teoretiske studier og resultater av kliniske forsøk vist at de høye innhold av tPA som er nødvendige for hurtig koagel-oppløsning, også fører til aktivering av be-tydelige mengder sirkulerende plasminogen.

Videre antar man at samvirkereaksjoner mellom tPA og plasmainhibitorer svekker aktiviteten hos tPA under og etter infusjon og derved medvirker potensielt til reokklu-

sjon.

En annen ulempe som følger med bruk av tPA som trombolytisk middel, er at den nødvendige dose tPA er stor, mellom 100 og 150 mg, hvilket gjør denne behandlingen svært kostbar.

Man har nå funnet plasminogenaktivatorer i spytt og spyttkjertler fra Desmodus rotundus som oppviser større selektivitet overfor fibrinbundet plasminogen og derfor kan redusere graden og hyppigheten av blødnings-diatese ved trombolytisk behandling. Videre blir disse aktivatorer ikke lett inaktivert av plasmainhibitorer som PAI-1 og kan derfor gi mindre hyppig reokklusjon.

Det er en hensikt med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe fibrinolytiske midler som er bedre enn tPA både med hensyn til sikkerhet og. virkningsgrad.

Plasminogenaktivator-protein isolert fra spytt og spyttkjertler hos vampyr, skiller seg fra både tPA og urokinase med hensyn til forskjellige strukturelle og funk-sjonelle trekk. Til forskjell fra tPA inneholder plasminogenaktivatorer renset ifølge oppfinnelsen, ikke kjede-dom^ne 2 (kringle 2 domain) og plasmin-sensitivt reaksjonspunkt. Ekvimolare mengder av disse aktivatorer og tPA er like effektive med hensyn til å katalysere lyse av tidligere dannet plasmakoagel. Virkningen overfor plasminogen stimuleres minst 27.000 ganger i nærvær av fibrin-cofaktor. Tilsvarende verdi for tPA er bare 205 ganger. Man har isolert tre spesielle arter som svarer til tPA i full lengde, finger-minus-tPA og finger-EGF-minus-tPA, ut fra vampyrflaggermus-spytt.

Disse har hhv. fått betegnelsene Bat-PA(H), Bat-PA(I) og Bat-PA(L). Senere referanser til "Bat-PA" betegner det ikke-fraksjonerte preparat som inneholder de tre molekylformer H, I og L. Den molekylære art med full lengde binder seg fast til fibrin til forskjell fra de andre to. Bat-PA(H), Bat-PA(I) og Bat-PA(L) har Mr-tall på hhv. 49, 42 og 40 kd, som målt i SDS-PAGE i nærvær av dithiothreitol (fig. I, spor 1) . De tilsynelatende Mr-verdier for deglycosylerte former av Bat-PA(H), Bat-PA(I) og Bat-PA(L) (fremstilt ved å fjerne N-bundet carbohydrat-kjeder med endoglycosidase F), som bestemt med SDS-PAGE, er hhv. 44, 40 og 38 kd (fig. 1, søyle 2) . Disse proteiner har et kraftig behov for nærvær av fibrin-cofaktor og en bemerkelsesverdig evne til å katalysere lyse av plasmakoagel. Mekanismen som styrer selektiviteten av disse proteiner overfor fibrinbundet plasminogen, er et resultat av forskjellige faktorer som direkte fibrinbinding og kraftig inhibering av NaCl som oppheves i nærvær av fibrinkoagel. Videre er vampyr-plasminogenaktivatorer mindre utsatt enn tPA for inaktivering med inhibitorer som finnes i plasma.

Oppfinnelsen gjelder en fremgangsmåte for rensing av et plasminogenaktiverende protein med en molvekt under

50 000 dalton som er kjennetegnet ved at man:

(a) homogeniserer submandibulære kjertler fra vampyrflaggermus Desmodus rotundus til en blanding, sentrifugerer blandingen og danner en supernatantfraksjon,

(b) klarer og konsentrerer supernatanten,

(c) appliserer retentatet på en kationebytterkolonne av fosfocellulose og absorberer plasminogenaktivatoren på kolonnen, (d) eluerer kolonnen til fraksjoner som inneholder plasminogenaktiverende proteiner,

(e) slår sammen fraksjonene og appliserer dem på

en affinitetskolonne med festnet Erythrina trypsininhibitor, (f) fraksjonerer plasminogenaktivatorene ved høy-trykksvæskekromatografi og (g) separerer plasminogenaktivatorene ved SDS-polyacrylamidgel-elektroforese.

Alle de plasminogenaktiverende arter aktiveres av fibrin. Det eneste trekk som har kunnet skille artene, er den eksklusive ende hos Bat-PA(H) til å bindes nært til fibrin, en egenskap som henger sammen med nærværet av "Finger"-doménet. Den spesifikke virkning hos Bat-PA(I) og Bat-PA(L) overfor fibrinbundet plasminogen synes å være uav-hengig av evnen til å bindes nært til fibrin.

Den kraftige fibrinavhengighet for virkning av Bat-PA er en karakteristisk egenskap som er ønskelig ved fibrinolytisk terapi. Blødningskomplikasjoner som følger med anvendelse av trombolytiske midler, kan forverres ved aktivering av sirkulerende plasminogen som danner plasmin. Hyppighet og grad av blødningskomplikasjoner kan reduseres ved å bruke en plasminogenaktivator renset i henhold til oppfinnelsen med virkning lokalisert til området for fibrinkoagel.

Det vises til vedlagte diagrammer og tegninger hvor: Figur 1 viser SDS-polyacrylamidgelelektroforese av renset vampyr-plasminogenaktivator. Prøvene er fra vampyr-spyttkjertler (kolonne 1 og 3) og av spytt (kolonne 2 og 4). Hver prøve ble behandlet med endoglycosidase F før SDS-PAGE. Kolonne 1 og 2: "Western blotting and immunostain". Kolonne 3 og 4: Fibrinautografi. Figur 2 viser % lyse av blodplatefattig plasmakoagel katalysert av tPA og av 40 kd vampyr-plasminogenaktivator protein. Figur 3 viser % lyse av blodplater tikt plasmakoagel katalysert av tPA og 40 kd plasminogenaktivatorprotein. Figur 4 viser inaktivering av plasminogenaktivator ved bestanddeler i plasma. Figur 5 viser molvekt målt ved SDS-PAGE på proteiner 40 kd og 45 kd som identifiseres med sølvfremkall-ing og fibrinautografi. Figur 6 viser koagel-lyse katalysert av Bat-PA og tPA. Figur 7 viser binding av plasminogenaktivator til fibrin.

Oppfinnelsen angår rensing av native plasminogenaktivatorproteiner og eventuelle mikroheterogene eller fragmentære former av disse proteiner med opphav i spytt og spyttkjertler fra vampyr-flaggermus Desmodus rotundus.

Betegnelsene protein og polypeptid brukes om hver-andre og refererer til en lineær polymer av aminosyrer bundet sammen med amidbindinger. Sekvensen av aminosyrer i kjeden er av avgjørende betydning for den biologiske funksjon til proteinet eller polypeptidet. Plasminogenaktivatorer betegner proteiner som katalyserer dannelsen av plasmin, et enzym som hydrolyserer peptider og estere av arginin og lysin og omdanner fibrin til oppløselige produkter.

Native proteiner betegner her proteiner i full lengde dannet av de tilsvarende gener.

Fragmentformer betegner deler av proteiner eller polypeptider som har færre aminosyrer enn det native protein, men inneholder den aktive posisjon eller posisjoner hos plasminogenaktivatoren. Mikroheterogene former betegner et enkelt genprodukt, dvs. et protein som er dannet av en enkelt genenhet i DNA som er strukturelt modifisert etter omdanning. Disse strukturforandringer vil imidlertid ikke gi noen vesentlige forandringer av proteinets aktivitet. Modifikasjonene eller forandringene kan foregå enten in vivo eller under isolerings- og renseprosesser. Modifikasjon in vivo kan føre til, men er ikke begrenset til, acetylering ved N-terminus, .proteolyse, glycosylering eller fosforylering. Proteolyse kan være exoproteolyse hvor én eller flere ende-plasserte aminosyrer i sekvens blir enzymatisk spaltet under dannelse av mikroheterogene former som har færre aminosyrer enn det opprinnelige genprodukt. Proteolyse kan også være endo-proteolytisk modifikasjon som skyldes innvirkning av endo-proteaser som spalter peptidet ved spesielle stillinger i aminosyresekvensen. Lignende modifiseringer kan foregå under renseprosesser som kan gi dannelse av mikroheterogene former. Den vanligste modifikasjon under en renseprosess er proteolyse.

Figur 1 viser SDS-polyacrylamidgel-elektroforese (SDS-PAGE) for renset plasminogenaktivator fra flaggermus. Prøvene ble forbehandlet med 25 mM dithiothreitol før elektroforese på 11% stablet SDS-polyaerylamidgel. Kolonne 1 viser aktivator (3,6 /ug) renset fra vampyr-spyttkjertler, kolonne 2 viser aktivator (3,6 /ug) behandlet med endoglycosidase F (Boehringer Mannheim) (0,1 enheter i 24 timer ved

37°C), og kolonne 3, 0,1 enheter av endoglycosidase F. Protein-molvekt-markeringer er som angitt. Vampyr-plasminogenaktivator (100 ng) fra spyttkjertler (kolonne 1) og spytt (kolonne 2) ble analysert med "Western blotting" ved hjelp av anti-vampyr-plasminogenaktivator-antistoffer hos kanin og anti-kanin-IgG hos geit, alkalifosfatase-korrespon-derende. Fibrinautografi fra aktivator (15 IU) fra kjertler (kolonne 3) og spytt (kolonne 4) ble utført som beskrevet av Laemmli, U.K. Nature, 227, s. 680-685 (1970).

For fremlegging av de data som er vist på figur 1, ble frosne, primære og tilliggende submandibulære kjertler (6 g) fra Desmodus rotundus satt til 40 ml 10 mM Tris-HCl, 0,5 M NaCl, pH 7,5, og straks homogenisert i en Brinkmann homogenisator. Homogenatet ble sentrifugert ved 27.000 x g i 20 minutter. Supernatant■fraksjone<n> ble klaret ved sentrifugering ved 100.000 x g i 30 minutter, fortynnet til 50 mM NaCl med 20 mM Tris-HCl, pH 7,0, 0,01% Tween® 80 og påsatt en kationvekslerkolonne av fosfocellulose (Whatman Pil) innstilt i likevekt med 20 mM Tris-HCl, pH 7,2, 50 mM NaCl og 0,01% Tweeri® 80. Etter påsetting av prøven ble fosfocellulosekolonnen vasket fullstendig med ovenstående likevektspuffer. Plasminogenaktivator ble eluert fra fosfocellulosekolonnen med 20 mM Tris-HCl, pH 7,2, 0,5 M NaCl og 0,01% Tweeri® 80 og påsatt en affinitetskolonne som inneholdt Erythrina trypsininhibitor (ETI) (American Diagnostica) koblet til CNBr-aktivert Sepharose® 4B (Pharmacia). Affinitetskolonnen ble vasket med 20 mM NaH2P04, 0,5 M NaCl, pH 7,0, 0,1% Tween® 80 og aktivatoren ble derpå eluert med 50 mM Na-acetat, 0,2 M NaCl, pH 4,0, 0,1% Tween® 80. Fraksjoner inneholdende aktivator, ble slått sammen, og det ble tilsatt 1 M Tris-grunnlag som ga en sluttkonsentrasjon av Tris på 25 mM. Den rensede prøven ble lagret ved -70°C. Proteinkonsentrasjonen ble anslått etter fargebindingsprøven til Biorad med kveg-serumalbumin som standard.

Figur 6 viser koagel-lyse katalysert med vampyr-plasminogenaktivator og tPA. Plasmakoagel ble dannet ved å sette 0,2 IU humant trombin (Sigma) og 7,5 mM CaCl2 til

noe

195 /ul humant plasma som inneholdt [I] fibrinogen (100.000 cpm/koagel). Sluttvolumet for hver prøve var 200 /ul. Koagelet ble dannet i nærvær av og heftet til små trepinner, aldret i 30 minutter ved 37°C, avpresset overskudd av væske og overført til 250 /ul plasma tilsatt 25 u/ml "Hirudin" (Sigma).

25 /ul 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0, 0,01% Tween® 80 inneholdende plasminogenaktivator, ble satt til oppløsningen som badet koagelprøvene, prøvene ble inkubert ved 37°C og tatt og ut tellet med hensyn på oppløselige nedbrytningsprodukter av fibrin. Vampyr-plasminogenaktivator renset fra spyttkjertler og to-kjedet tPA ble brukt til denne undersøkelsen. ▼ , 3 nM Bat-PA; i , 3 nM t-PA; #, 10 nM Bat-PA; A , 10 nM t-PA. Vampyr-plasminogenaktivator og t-PA viste seg like effektive når det gjaldt evne til å katalysere frigivelsen av radioaktivt merket fibrin-nedbrytningsprodukter fra tidligere dannet plasmakoagel. Figur 7 viser binding av plasminogenaktivatorer til fibrin. Kolonne 1, Bat-PA, 1,8 pmol; kolonne 2 og 3, 10 volum% av hhv. pellet og supernatantfraksjoner, fra den plasminogenaktivatorholdige fibrinprøve; kolonne 4, enkeltkjedet tPA, 1,8 pmol; kolonne 5 og 6, 10 volum% av pellet og supernatantfraksjoner, respektivt, fra den tPA-holdige fibrinprøve; kolonne- 7, urokinase, 0,5 pmol; kolonne 8 og 9, 10 volum% pellet og supernatantfraksjoner, respektivt, fra de urokinaseholdige fibrinprøver. De tre plasminogenaktivator-arter (kolonne 1) er ujevnt fordelt mellom supernatantfraksjoner og pelletfraksjoner. Mesteparten av Bat-PA(H) fordeler seg i fibrinpelletene (kolonne 2), mens Bat-PA(I) og Bat-PA(L) ikke har noen tydelig affinitet til fibrin og for det meste finnes i supernatanten (kolonne 3). Prøver av tPA (kolonne 4) og urokinase (kolonne 7) ble også undersøkt med hensyn til bindingsevne til fibrin. Som ventet, binder tPA seg kraftig til fibrin og fordeler seg i pelletfraksjonen (kolonne 5),

mens urokinase utelukkende finnes i supernatantfraksjonen

j

(kolonne 9).

Det ble dannet fibrinkoagel ved å tilsette 0,2 IU trombin til 200 /ul 10 mM NaH2P04, 140 mM NaCl, pH 7,4, 0,01% Tweeri® 80 inneholdende humant fibrinogen (1 mg/ml), EDTA (5 mM) og vampyr-plasminogenaktivator (18 pmol) eller enkeltkjedet tPA (18 pmol) eller urokianse (5,5 pmol). Enkeltkjedet tPA ble renset ut fra en blanding av enkeltkjedet og dobbeltkjedet tPA ved kromatografering i en kolonne av mono-klonale antistoffer som fortrinnsvis binder enkeltkjedet tPA (PAM-1, American Diagnostica). Fibrinkoagel ble aldret i 1 time ved 37°C og sentrifugert ved 100.000 g i 10 minutter. Pelletfraksjoner ble vasket med 400 /ul Na2HP04, NaCl, Twee 80 puffer, suspendert på nytt i 150 /ul 0,5% SDS og inkubert ved 37°C i 1,5 time under stadig røring. Pellet- og super-natantf raksjoner som inneholder vampyr-plasminogenaktivator, ble behandlet med "Endo F". Prøvene gjennomgikk SDS-PAGE og ble FA-analysert.

Forsøksmetoder med plasminogenaktivator

Fibrinplatemetode: Det ble dannet fibrinplater ved å oppløse fibrinogen fra kveg eller mennesker (2 mg/ml) og humant Glu-plasminogen (6 /ug/ml) i 1% agaroaseoppløsning (som holdes ved 55°C). Humant trombin (1,5 enheter) ble tilsatt før opp-løsningen ble støpt -ut til kalibrerte immunodiffusjonsplater. Det ble slått ut brønner i en herdet fibrinplate, og det ble påsatt kolonnefraksjoner. Det ble observert oppløste områder, områder av lyse, hvor aktivitet fant sted. Lyse-arealet (mm ) pr. inkuberingstid ved 37°C kan korreleres til aktivitets-enheter for enzymer.

Fibrinautografi: Prøver gjennomgikk SDS-PAGE under ikke-reduserende forhold, og acrylamidgel ble omhyggelig vasket i Triton®X-lOO (2,5%) og plassert på en plasminogenholdig fibrin-agarosegel. Plasminogenaktivatorene renaturerer på grunn av Triton-behandlingen og diffunderer ut i agarosegelen hvor de aktiverer plasminogen til plasmin. Det dannede plasmin vil nedbryte fibrinet som gir en sone av fibrinolyse som lett kan skilles ut mot bakgrunnen av ikke nedbrutt fibrin.

Koplet amidolytisk prøve: Aktivering av plasminogen til plasmin ble undersøkt i nærvær av "Desafib" og produksjon av plasmin ble fulgt med kolorimetrisk plasminsubstrat, "Spectrozyme" PL. Vampyr-plasminogenaktivatorene ble inkubert med humant Glu-plasminogen (20 /ug/ml), "Spectrozyme" PL (0,4 mM) og "Desafib" (80 /ug/ml). Blandingen ble inkubert ved 37°C i 60 minutter. Reaksjonen ble avsluttet ved tilsetning av 50 /ul 10% SDS. Absorpsjon av spaltet substrat ble fulgt ved 405 nm. 1 aktivitetsenhet for vampyr-plasminogenaktivator svarer til den mengden enzym som katalyserer omdannelsen av 1 yumol "Spectrozyme" PL i 1 minutt ved 37°C.

Titrering av aktiv stilling: Vampyr-plasminogenaktivatorer ble titrert etter to forskjellige metoder for å bestemme funksjonell molaritet. Første metode er basert på prinsippet med tilbaketitrering av en kalibrert trypsinstandard med en kalibrert standardoppløsning av klormethylketon-inhibitor for både trypsin og plasminogenaktivator. En oppløsning av trypsin (500 nM) ble titrert direkte med 4-methyl-umbelli-feryl-p-guanidinbenzoat (MUGB). Klormethylketonet (Dansyl-glutamyl-glycyl-arginin-klormethyl-keton, DNS-EGRCK) ble titrert mot MUGB-kalibrert trypsin. Reaksjonen mellom en slik kalibrert trypsinoppløsning og en kalibrert klormethyl-ketonoppløsning gjør det mulig å måle reduksjon av inhibering av trypsinstandarden når CK-standarden blir preinkubert med aktivator. Nærvær av vampyr-plasminogenaktivator resulterer i økt aktivitet i forhold til trypsin-CK-kontrollprøven, proporsjonalt med mengden plasminogenaktivator.

Den andre metoden består i observasjon av "burst kinetics" som følger tilsetning av MUGBE til plasminogenaktivator når reaksjonen er utført ved lav temperatur (5°C).

SDS- polyacrylamidgel- elektroforese: Det ble brukt en modifisert utgave av Laemmli-systemet (Nature, 227, s. 680-685

(1970)). Stablegel og skillegel (0,75 mm) inneholdt 4% og 10% polyacrylamid, respektivt. Gelkolonnene ble påsatt 75 volt i 20 timer. Protein ble påvist ved sølvfarging.

Rensing av vampyr- plasminogenaktivatorproteiner

Råstoffer: Spytt og spyttkjertler fra Desmodus rotundus ble kjøpt fra Antibody Associates, TX og fra dr. C. Rupprecht, Rabies Unit, Wistar Institute, Philadelphia, PA. Fibrinogen, plasminogen, trombin og substrater for amidolytiske prøver ble kjøpt fra American Diagnostica, New York, NY. Materialer til elektroforese ble levert fra Biorad Inc., og materialer til kolonnekromatografering fra Pharmacia. HPLC-kolonner var levert av Vydac. Immunodiffusjonsplater ble levert fra ICN.

Fremgangsmåte: Rensing av aktivatorer utvunnet av vampyr-spytt, skjer på fosfocellulose, fenyl-sepharose og omvendt fase-kromatografi (C4 reverse phase HPLC chromatography).

Spytt fra vampyr Desmodus rotundus ble fortynnet til 3 ganger volumet med 10 mM Tris, pH 7,4, 50 mM NaCl, 0,01% Twee 20-oppløsning. Det fortynnede spytt ble sentrifugert i 5 minutter ved 12.000 omdreininger i minuttet ved 4°C i Eppendorf-sentrifuge. Supernatanten ble fylt direkte på en f osf ocellulose-kolonne (25 x 10 cm) og vasket med samme puffer som ble brukt til fortynning av spyttet. Kolonnen ble eluert under en strømningsmengde på 6 ml/time. Aktivitet ble bestemt ved måling av lyse-arealet etter fibrinplatemetoden, og proteinet ble målt ved O.D. 280.

Vampyr-plasminogenaktivatorer hadde kraftig binding til fosfocellulosekolonnen. Gjenvinning av aktiviteten ved eluering med 1 M NaCl var 94% (tabell I).

Fraksjoner fra fosfocellulosekolonnen som inneholdt plasminogenaktivatoraktivitet, ble slått sammen og påført direkte på en fenyl-sepharosekolonne (1,5 x 5,0 cm) i nærvær av 2,5 M NaCl. Kolonnen ble vasket med en gradient av 2 M NaCl til 0 M NaCl og 10% glycerol i 10 mM i Tris-puffer. Vasking med 10% glyceroloppløsning ble fortsatt til all aktivitet var eluert.

Kromatografi på fenyl-sepharosekolonnen ga 82% gjenvinning av aktiviteten (tabell I). Imidlertid var aktiviteten delt i to topper, 1 og 2, som ble behandlet hver for seg. De to toppene oppviste forskjellig molekylvekt i henhold til påvisning ved sølvfarging etter SDS-PAGE og fibrinautografi (figur 5). Topp 1, som søkerne antar er Bat-PA(L), ble eluert mot slutten av saltgradienten (2 M - 0 M NaCl). Søkerne antar at topp 2 utgjør Bat-PA(I).

Etter fenyl-sepharosekolonnen ble det oppnådd en rensegrad for Bat-PA(L) på omkring 660 ganger. Total aktivitet for Bat-PA(I)-enzym ble ikke bestemt optimalt ved amido-lyseprøven med koplingssystemet plasminogen/spectrozyme PL, da "Desafib" ikke er noen effektiv cofaktor for denne plasminogenaktivator fra vampyr.

Det avsluttende rensetrinn for proteinene besto i en omvendt fase-kolonnekromatografering ("C4 reverse phase HPLC") (High Pressure Liquid Chromatography = HPLC) som var

innstilt i likevekt med 0,1% (v/v) trifluoreddiksyre (trifluoroacetic acid = TFA) i vann. De fraksjonerte eluater ble konsentrert ved frysetørring og påsatt direkte på HPLC-kolonnen. Enzymet ble eluert med en gradient av 25 til 55% acetonitril i nærvær av 0,1% TFA. Proteintopper ble målt

ved O.D. 214 og samlet separat. Flyktige stoffer ble fjernet i ved vakuumsentrifugering fulgt av frysetørking. Proteinene ble oppløst på nytt i 10 mM eddiksyre. Aktiviteten ble målt ved fibrinplatemetoden etter at eddiksyren var nøytralisert med Tris-Tween®-puffer.

Rensing av plasminogenaktivator fra spyttkjertler hos vampyr-flaggermus ble"gjennomført som følger: Primære og tilliggende submandibulære kjertler fra blodsugende flaggermus ble satt til en puffer som inneholdt 10 mM Tris-HCl, 0,5 M NaCl, 0,1% Tweeri® 80, pH 7,5, og umiddelbart homogenisert i en polytron. Etter sentrifugering ble den klare supernatantfraksjon konsentrert og innstilt i likevekt med 10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, pH 7,2, ved bruk av et rørecelleapparat av typen "Amicon" (membran YM 10). Retentatet ble direkte påsatt en fosfocellulosekolonne (Whatman) i likevekt med 10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 0,01% Twee n® 80, pH 7,2. ■Plasminogenaktivatorproteinet absorberes kvantitativt på fosfocellulosekolonnen og elueres i trinn med pufferen tilsatt 0,5 M NaCl. Aktivitetsutbyttet er typisk over 80%.

Fraksjoner som inneholder aktivatoraktivitet, ble slått sammen og satt på en affinitetskolonne av Erythrina trypsininhibitor (ETI) koplet til Sepharose<®> 4B. Mesteparten av aktiviteten ble absorbert på denne kolonnen og effektivt eluert med 50 mM Na-acetat, pH 4,0, 0,2 M NaCl og 0,1% Tweeri<® >80. Den totale utvinningsgrad for plasminogenaktivatoraktivitet fra kjertelekstraktet etter ovennevnte fremgangsmåte var 91%, som ga ca. 5,4 mg plasminogenaktivator av 6 g kjertler. Homogeniteten for preparatet av vampyr-plasminogenaktivator ble angitt ved samsvar mellom anslått proteinkon-sentrasjon og beregnet funksjonell molaritet målt ved titrering av aktiv stilling ved hjelp av 4-methyl-umbelliferyl-p-guanidinobenzoat (Urano et al., Biochem. Biophys Res. Comm. 150, 45-51 (1988)).

Proteinpåvisning etter SDS-PAGE for de samlede aktive fraksjoner viser et innviklet mønster av bånd som har en rekke Mr-verdier. Vandringen av disse arter svarer til aktivitetssoner som fremkommer ved FA-analyse. Denne sammen-heng i tillegg til overensstemmelsen mellom aminosyreanalyse, N-terminalanalyse og titrering av aktive posisjoner gir bevis på at aktivatoren er renset til homogenitet.

Proteinkarakterisering og aktivitet:

Plasminogenaktivatorer i henhold til foreliggende oppfinnelse viser ingen aktivitet med plasminogenfrie fibrinplater. Inkubering av aktivatorer med plasminogen i nærvær av fibrin I ("Desafib") resulterer i dannelse av plasmin bedømt ved "western blotting and immunostaining" med anti-plasmin(ogen)-antistoffer. De viser aktivitet overfor menneske-plasminogen bundet til menneske-fibrin og overfor kveg-plasminogen bundet til kveg-fibrin.

Ved gelfiltreringskromatografi på Sepharose® G-200 ble aktiviteten av plasminogenaktivator i utgangsspytt eluert som en bred topp med omtrentlig molvekt lik 130K. Denne molvekt er sannsynligvis molvekten for aggregert plasminogenaktivator. Den syntes å være omkring 32K på FPLC-sepharosekolonne i nærvær av 0,01% Twee 20.

Under rensetrinnene hadde plasminogenaktivator ingen reaksjon overfor lysin-sepharose, hvilket tidligere er vist å være et effektivt trinn til rensing av proteiner som binder seg til fibrin via sekvensdomenet "kringle domain". Således er bindingsmekanismen for aktivatorene til fibrin forskjellig fra tPA.

Behandling av aktivatorene med endoglycosidase H og F resulterer i aktive proteiner med lavere molvekt som tyder på at aktivatorene er glycoproteiner. Reaksjoner mellom disse proteiner og agarose fra hvetespire og concanavalin A gir ytterligere støtte for denne konklusjon.

Evnen hos Bat-PA(H) til aktivering av Glu-plasminogen ble målt ved en koplingsprøve som fulgte omsetningen av plasmin-spesifikt amidolytisk substrat (tabell II). Denne spesifikke aktivitet (IU/nmol) for Bat-PA(H) overfor Glu-plasminogen var omtrent 260 ganger mindre enn tPA i fravær av fibrin-mimetisk forbindelse. Imidlertid var den spesifikke aktivitet for Bat-PA(H) overfor Glu-plasminogen i nærvær av "Desafib" ca. 85% av aktiviteten til tPA. således stimulerte "Desafib" tPA- og Bat-PA(H)-aktiviteten hhv. 205 og 45.000 ganger. Den spesifikke virkning av Bat-PA, preparatet som inneholdt alle tre molekylformer, var som for Bat-PA(H) i fravær av "Desafib", men.omtrent 30% lavere enn Bat-PA(H) i nærvær av denne fibrin-cofaktor (tabell II). Man antar at aktivitetene til Bat-PA(I) og Bat-PA(L) ikke stimuleres i samme grad som for Bat-PA(H) av 80 /ug/ml "Desafib".

Disse tallene gjengir spesifikk virkning (IU/nmol) ved bruk av koplet amidolyseprøve som beskrevet tidligere. To-kjedet tPA ble brukt til disse prøver; den katalytiske virkning av en-kjedet tPA er ikke angitt da resultatene for-styrres av den uunngåelige dannelse av to-kjedet tPA under prøven. "Desafib" ble inkludert i prøven som angitt. Tallene under relativ stimulering betegner forholdene mellom de spesifikke aktiviteter. Tallene i parentes betegner stimulering av plasminogenaktivatoraktivitet fra "Desafib" i forhold til aktivitet fra tPA.

Egenskaper fra tPA og Bat-PA(H) med hensyn til katalysering av lyse av plasminogenholdig fibrinkoagel ble også sammenlignet. Det kreves noe høyere konsentrasjoner av Bat-PA(H) for å oppnå en koagel-lysegrad som er like stor som

med konsentrasjoner av tPA mellom 0,25 og 10 nM. Konsentrasjoner av tPA og Bat-PA(H) (avledet fra kurver over dose-respons) som gir en valgt hastighet av koagel-lyse, er gjen-

gitt i tabell III. Den spesifikke aktivitet for Bat-PA(H) i forhold til tPA lå mellom <*>59 og 72% og ble sammenlignet med plasminogenaktivert konsentrasjon. Den økede spesifikke aktivitet for Bat-PA(H) i forhold til tPA ved høyere konsentrasjoner kan skyldes forskjeller mellom disse plasminogenaktivatorer med hensyn til deres virkemåter overfor fibrin og/eller plasminogen. ;;Eksperimenter med koagel-lyse ved hjelp av turbi-dimeterforsøk ble gjennomført som firfoldige prøver med følgende konsentrasjoner av 2-kjedet tPA eller Bat-PA(H): 0,25, 0,50, 1,0, 2,5, 5,0, 7,5 og 10,0 nM. Man noterte hastighet for koagel-lyse som den maksimale hastighet for synkende turbiditet (-mOD/min) ved analyse av hver koagel-lyse-profil med databehandling (Softmax kinetic software). Det ble satt opp fire og seks uavhengige lineære kurver over dose-respons (hastighet mot log [plasminogenaktivator]) for hhv. tPA og Bat-PA(H). Tabellen gjengir de konsentrasjoner av plasminogenaktivator som fører til de angitte hastigheter for koagel-lyse. Disse tall ble utregnet ut fra ligninger som beskriver de best tilpassede kurver ut fra analyse av alle dose-responskurver for tPA og Bat-PA(H). Tallene for relativ virkning er forholdet mellom tPA- og Bat-PA(H)-konsentrasjoner som gir den oppførte hastighet for koagel-lyse. ;Vampyr-plasminogenaktivatorer renset i henhold til foreliggende oppfinnelse er mindre utsatt enn tPÅ for inaktivering fra den hurtigvirkende plasminogenaktivator-inhibitor av type 1 (PAI-1). ;Man antar at konsentrasjonen av PAI-1 i området for okkluderte blodkar kan være mye høyere enn konsentrasjoner som bedømmes ut fra plasmaprøver. Latent PAI-1 i plasma og blodplater som inneholder PAI-1 som kan frigjøres av trombin, adenosin-difosfat og andre blodplateaktive stoffer, medvirker til relativt høye lokale konsentrasjoner i okkluderte områder. PAI-1 virker som antiaktivator som spesifikt blokkerer aktivitet hos tPA. ;Figur 4 viser at tPA blir lettere inaktivert av plasminogenaktivator-inhibitorer enn plasminogenaktivatorer av spyttsekret fra vampyr. tPA og vampyr-plasminogenaktivatorer ble begge inkubert i blodplasma og deres respek-tive aktiviteter målt som funksjon av tiden. ;NaCl-inhibering av plasminogenaktivering fra både tPA og 40 kd protein ble ikke funnet ved måling av fibrinkoagel-lyse. I disse tilfeller ble det laget koagel av rensede bestanddeler som omfattet fibrinogen (både radioaktivt merket og ikke-merket), plasminogen, cc-2-antiplasmin, faktor XHIa og puffer med eller uten 0,1 M NaCl. ;SDS- polyacrylamidgel- elektroforese av Bat- PA og oppsuging av proteiner på " Immobilon" ( PVDF- membraner) ;De samlede aktive fraksjoner fra en affinitetskolonne med trypsininhibitor ble videre fraksjonert på en HPLC-kolonne "Vydac" C4, hvorfra plasminogenaktivator-proteinet ble eluert ved omtrent 40% acetonitril/O,1% trifluoreddiksyre. Man fant to større aktivitetstopper (bestemt ved fibrinplate-autolyse) ved eluering fra HPLC-kolonnen. De to aktivitetstopper ble slått sammen hver for seg og fikk betegnelsen Bat-PA (I) og<*>Bat-PA (II).

Med SDS-polyacrylamidgel-elektroforese (SDS-PAGE) fulgt av fibrinautografi viste både Bat-PA (I) og (II) et lignende mønster av lyse-soner som strakk seg fra molvekter 42.000-46.000 dalton. Både Bat-PA (I) og (II) kunne merkes radioaktivt med <3>H-DFP (diisopropylfluorfosfat) som er et merkingsreagens for aktivt sete for serinproteinaser.

Polyacrylamidgel-elektroforese av plasminogenaktivatorer av typen I og II ble utført som en modifikasjon av Laemmli-systemet (Nature, 227, s. 680-685 (1970)). Stable- og skille-geler (0,75 mM) inneholdt hhv. 4% og 10% polyacrylamid. Gelspenningen er 75 volt i 20 timer.

Proteiner separert ved hjelp av SDS-polyacrylamidgel-elektroforese ble videre elektroseparert (elektroblotted) på "Immobilon" (PVDF-membraner) levert av Millipore, katalog nr. IPVH3040. Elektroblotting av proteiner ble utført i det vesentlige som beskrevet av Matsudaira (J. Biol. Chem. 261,

s. 10035-10038, 1987). I korthet blir proteiner elektro-eluert fra SDS-polyacrylamidgel ved 30 volt i løpet av 15 timer. "Immobilon"-elektroeluatet blir derpå farget med Coomassie-blått for å fremkalle bånd av proteiner. Protein-båndene blir klippet direkte ut av fordelingsmembranen og

anbrakt i en gassfaseanalysator av modell 477A (Gas Phase Sequencer Model 477A) med et forkondisjoneringsfilter av polybren under den elektrofordelte prøven. Sekvenser-programmene og de anvendte reagenser er som levert fra fabri-kanten (Applied Biosystems). Frigjorte aminosyrederivater identifiseres gjennom et innkoblet HPLC-system.

Som tidligere nevnt, blir aktiviteten av vampyr-plasminogenaktivatorer dramatisk stimulert i nærvær av en fibrin-cofaktor. Den synes å være minst 90 ganger mer selek-tiv enn tPA overfor fibrinbundet plasminogen. Det andre "kringle"-doméne hos tPA inneholder en lysinbindende stilling som man antar spiller en avgjørende rolle for fibrinindusert stimulering av aktiviteten. Derimot avslører aminosyresekvensen i aktivatoren ifølge oppfinnelsen at dennes markerte fibrinselektivitet ikke sky.ldes nærværet av en region som ligner det andre ,,kringle"-domene hos tPA. Den manglende evne hos vampyr-plasminogenaktivatorer til å binde Lys-sepharose viser dessuten at nærvær av lysinbindende stilling ikke er årsak til plasminogenets fibrinspesifikke aktivitet.

"Kringle"-doménet hos aktivatorer ifølge oppfinnelsen fører til fibrin-indusert stimulering av aktivitet til tross for forskjellene i forhold til den andre "kringle"-region hos tPA.

Aktivatorene skiller seg også strukturelt fra tPA ved fravær av plasminsensitivt aktivt sete i vampyrenzymet.

Bat-PA-proteiner som beskrevet ovenfor, har vært definert ved hjelp av determinert DNA-gensekvensundersøkelse og deduktiv aminosyresekvensundersøkelse. Man vil forstå at det kan finnes naturlige alleliske variasjoner. Disse variasjoner kan bestå i én eller flere aminosyreforskjeller i totalsekvensen eller ved manglende aminosyrer, ved substitu-sjoner, innføringer, omdanninger eller addisjoner av én eller flere aminosyrer i sekvensen. Dessuten vil stillingen for og graden av glycosylering avhenge av vertcellemiljøets natur.

Terapeutisk behandling

Disse proteiner kan administreres på en hvilken som helst egnet måte som vil innføre dem i blodstrømmen i vesent-lig mengde. Man antar at intravenøs administrering er den foretrukne vei. Proteinene er oppløselige i vann og blir derfor effektivt gitt i oppløsning.

Som ett eksempel på anvendelsen gir man en egnet mengde proteiner renset ifølge oppfinnelsen, intravenøst til en hjertepasient. Egnede doser for å oppnå trombolyse er opptil 200 mg, fortrinnsvis 25 til 150 mg, og helst mellom 25 og 50 mg.

Proteinene kan også gis i ovennevnte doser ved flere bolusinjeksjoner i løpet av flere timer.

Proteinene kan gis sammen med plateaggregerings-inhibitorer for å gi den kombinerte virkning av trombolyse og blodplateaggregeringsinhibering. Slik samtidig administrering omfatter intravenøs administrering av blodplateaggregerings-inhibitorer i effektiv mengde, f.eks. en mengde som gir en konstant plasmakonsentrasjon på mellom 0,05 og 2 yuM.

Claims (1)

1. Fremgangsmåte for rensing av et plasminogenaktiverende protein med en molvekt under 50 000 dalton, karakterisert ved at man:

   (a) homogeniserer submandibulære kjertler fra vampyrflaggermus Desmodus rotundus til en blanding, sentrifugerer blandingen og danner en supernatantfraksjon, (b) klarer og konsentrerer supernatanten, (c) appliserer retentatet på en kationebytterkolonne av fosfocellulose og absorberer plasminogenaktivator en på kolonnen, (d) eluerer kolonnen til fraksjoner som inneholder plasminogenaktiverende proteiner, (e) slår sammen fraksjonene og appliserer dem på en affinltetskolonne med festnet Erythrlna trypsinInhibitor, (f) fraksjonerer plasminogenaktivatorene ved høy-trykksvæskekromatografi og (g) separerer plasminogenaktivatorene ved SDS-polyacrylamidgel-elektroforese.