JPH02504462A

JPH02504462A - ヒトｔ‐ＰＡ（ｕ‐ＰＡ）置換突然変異体タンパク質、その遺伝情報を指定する組み換えＤＮＡ、トランスフエクシヨンした宿主細胞、突然変異体タンパク質の調製および製剤学的組成物

Info

Publication number: JPH02504462A
Application number: JP63503616A
Authority: JP
Inventors: パネケク，ハンス
Priority date: 1987-04-29
Filing date: 1988-04-28
Publication date: 1990-12-20
Also published as: EP0366661A1; NL8701021A; WO1988008451A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】１０、請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載のヒトｔ−ＰＡ（ｕ−ＰＡ）置換突然変異体タンパク質およびｌまたは２以上の製剤学的に許容されうる担体、希釈剤および／まＩ；はアジュバントからなる、血液の凝固および／または線維素溶解に対する作用を有する製剤学的組成物。

明細書と）ｔ　−ＦＡ　（ｕ−ＰＡ）置換突然変異体タンパク質、その遺伝情報を指定する組み換えＤＮＡ、　　トランスフェクションした宿主細胞、突然変異体タンパク質の調製および製剤学的組成物本発明は、組み換えＤＮＡ分子の構成および宿主細胞における組み換えＤＮＡ分子の発現に関する。本発明は、また、糖タンパク質組織タイプのプラスミノゲンアクチベータ−（ｔ−ＦＡ）のセグメントからおよび糖タンパク質ウロキナーゼ（ｕ−ＰＡ）のセグメントから構成されＩ；、ヒト置換突然変異体タンパク質を調製する方法に関する。本発明は、さらに、抗血栓活性を有する製剤学的組成物に関する。

本発明の理論的概念、すなわち、ｔ−ＦＡ遺伝子の染色体の構造（エクソン−イントロンの分布）およびｔ−ＰＡタンパク質の推定される二次構造、ｔ−ＰＡの欠失、置換および突然変異の自律的構造および機能的ドメイン（ｄ　ｏｍａ　ｉ　ｎ　ｓ）についてのデータに基づく理論的概念は、先行の特許出願に既に記載されている（Ｈ，Ｐｎｎｅｋｏｅｋ　　ｅｔａ１８、欧州特許出願第８６２００２２３．５号−ｔ−ＰＡの欠失）。

ヒト糖タンパク質組織タイププラスミノゲンアクチベーター（ｔ　−ＦＡ）はセリンプロテアーゼであり、これは脈管の内皮細胞中でおよびまた種々の細胞系、例えば、ボウウェス黒色腫（Ｂｏｗｅｓ　　ｍｅｌａｎｏｍａ）細胞系中で合成される（Ｒｉｆｋｉｎ　　ｅｔ　　ａｌ、、１９７４；Ｒ４ｊｋａｎ　　ｅｔ　　ａｍ、１９８０）。ｔ−ＰＡは、血液凝固物を可溶化し、それゆえそれを除去するプロセスである、線維素溶解において重要な役割を演する。酵素ｔ−ＰＡは、酵素前駆体のプラスミノゲンの活性セリンプロテアーゼのプラスミンへの転化を触媒する。プラスミンは、血液凝固物中の最も重要なタンパク質成分、すなわち〜フィブリン、を溶解するために主要な役割をすると考えられる酵素である・フィブリンの不存在下では、ｔ−ＰＡは非常に低いプラスミノゲンアクチベーターの活性をもつだけであるが、アイプリンの存在下では、１−ＰＡの活性は１００〜１０００より大きい桁数で促進される。ｔ−ＰＡのこの性質のために、プラスミンは凝固物のフィブリン表面上で事実上広く発生し、そして循環におけるプラスミンの前身の形成は回避される。

このような観察は有用な抗血栓崩壊因子としてのｔ−ＰＡに注意を引き付けた。

しかしながら、ｔ−ＰＡをその天然の環境（血漿）から大規模で分離することは、その濃度が低い（約１ｎｇ／ｍＱ）ために、実ｊｔ的な実施および数学的理論学の問題に直面するであろう。組み換えＤＮＡ技術は比較的大量に産生ずるという回答をここで提供することができる。

事実、これらの技術により合成されるｔ−ＰＡは、心筋梗塞を有する患者の処置のために有用な調製物を表すことが示された。しかしながら、これらの研究におけるｔ−ＰＡの有効な投与量の静脈内投与は、比較的大量を必要とし、そして、多くの場合において、フィブリン以外の成分の分解および望ましくない出血の傾向に導く。抗血栓治療において大量のｔ−ＰＡの投与を必要とすることは、とくにｔ−ＰＡの生体内の急速な浄化（その半減期は数分である）に関係する。この現象は、ｔ−ＰＡが循環から除去される肝炎成分との相互作用（Ｅｍｅ　ｉ　ｓ　　ｅｔ　　ａｌ、、１９８５）およびセリンプロテアーゼ阻害因子、とくに内皮プラスミノゲンアクチベーター阻害因子ＦＡＩ−１との複合化により不活性化（ＳｐｒｅｎｇｅｒｓおよびＫｌｕｆｔ、１９８７）に帰属される。したがって、ｔ−ＦＡより有効な抗血栓崩壊活性示す、ｔ−ＰＡの分子変異型を關発することは、例えば、このような変異型がＦＡＩ−１より効率的に阻害されないｔ；めに、望ましい。このような変異型の構成およびそれらの性質を記載する前に、われわれはｔ−ＦＡの構造および生物学的性質を簡単に要約する。

ｔ−ＰＡは一本鎖から成る分子として合成され、そして単一のアルギニン−イソロイシンのペプチド結合を切断することによってプラスミンにより二本鎖から成る分子に転化することができる（Ｗａｌ１６ｎ　ａｔ　ａｌ、、１９８０）。二本鎖ｔ−ＦＡはアミノ末端の「重」鎖（Ｈ：３８ｋＤ）およびカルボキシ末端の「軽」鎖（Ｌ；３４ｋＤ）から成り、これらは単一のジサルファイド結合により一緒に保持される。培養したボウウェス黒色腫細胞のコンディショニングした培地から得られる精製した１　−ＰＡ調製物から出発して、完全なアミノ酸配列およびまたアスパラギン結合グルコキシル化の位置が決定され？：（Ｐｈｏｌ　　ｅｔ　　！Ｌ１．．１９８４）。

ｔ−ＰＡのための完全な遺伝情報を有する組み換えＤＮＡ分子（いわゆる全長のｔ−ＰＡコピーＤＮＡまたはｃＤＮＡ）の構成および分離は、最初に１９８３年に報告された（Ｐｅｎｎｉｃａ　　ｅｔ　　ａｌ、、１９８３）、）ランスフェクシ碧ンした組織培養細胞による生物学的に活性な組み換え体ｔ−ＰＡの産生は、また、報告された（Ｇｏｅｄｄｅｌｅ　ｔ　　ａ　１９．１９８３）ｏ前者の研究において、ｔ−ＰＡは５６２アミノ酸から成る、いわゆる前駆体タンパク質として合成されることが発見された。ボウウェス黒腫細胞からの自然ｔ−ＦＡのアミノ末端の決定は、ｔ−ＰＡが２つの自然変異型で発生することを示した（Ｐｏｈｌｅｔ　　ａｌ、、１９８４）、Ｓ変異型は５２７アミノ酸から成るが、Ｌ変異型は５３０アミノ酸から構成されている。結論すると、３２または３５アミノ酸のアミノ末端セグメントは前駆体タンパク質から切断されて、２つのタイプのｔ−ＦＡを発生させる。他のの性質がＳおよびＬ変異型に帰属するという指示は存在しない。

ｔ−ＰＡのアミノ酸配列と他の血漿タンパク質との間の相同性に基づいて、二次構造のモデルが提案された（Ｐｅｎｎｉｃａ　　ｅｔ　　ａｌ、、１９８３；Ｂａｎｙａｊ　　ｅｔ　　ａｌ、、１９８３）、このモデルにおいて、他の血漿タンパク質との相同性を示すいくつかの構造セグメントが組み立てられて、多分自律的構造ドメインから構成される、複合分子が形成される。染色体のｔ−ＦＡ遺伝子の構造の明瞭化（Ｎｙｅｔａｌ、、１９８４）は、この仮説のモデルを支持した。この研究において、提案されｔ；構造のドメインは、単一のエクソンによるか、あるいは隣接するエクソンの組により正確にエンコードされる。次いで、ｔ−ＦＡタンパク質のＨ鎖は次のようにして構成される（アミノ末端から）。

ａ、シグナルペプチド、次いで前配列（ｐｒｏ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、例えば、血清アルブミンのｐｒｅ−ｐｒｏ部分に類似するセグメント（ＰａｔｔｅｒｓｏｎおよびＧｅｌｌｅｒ％１９７７；Ｌａｗｎ　　ｅｔ　　ａｌｏ、１９８１）。

ｂ、いわゆる「フィンガー」　（Ｆ）ドメイン、これはフィブリノネクチンの記載された！晃フィンガーに対して相同性である（Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ　　ｅｔ　　ａｌ＋、１９８１；Ｐｅｔｅｒｓｅｎ　　ａｔ　　ａｌ、、１９８３）。

ｃ、「表皮増殖因子様Ｊ　　（ＥＧＦまたはｅ）ドメイン、これはヒトおよびマウスの両者のＥＧＦに対する類似性を示す（Ｓａｖａｇｅ　　ｅｔａｌ、、１９７２；ＧｒｅｇｏｒｙおよびＰｒｅｓｔｏｎ％１９７７）。

ｄ、２つのいわゆる「クリングル（ｋｒｉｎｇｌｅ）Ｊ　　ドメイン（Ｋｌおよびに２）、これは、なかでも、３つの「内部の」ジサルファイド結合の対応する位置により特徴づけられる。このクリングル構造は、プラスミノゲンについてすでに前に記載され、これは５つのこのような構造を有する（Ｓｏｔｔｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎ　　ｅｔ　　ａｌ、、１９７８）。

ｔ−ＰＡのカルボキシ末端のＬ鎖は、「トリプシン様の族」のセリンプロテアーゼとの相同性を示す。現在、われわれの実験室において、ｔ−ＰＡ分子のこの部分はプラスミノゲンアクチベーターの活性のための触媒の中心を含有し、そしてまたｔ−ＰＡの生理学的阻害因子、内皮プラスミノゲンアクチベーター阻害因子ＦＡＩ−１のｊ；めの主要な相互作用部位であることが示された（ＭａｃＤｏｎａｌｄ　　ｅｔ　　ａｌ、、１９８５；Ｖａｎ　　Ｚｏｎｎｅｖｅｌｄ　　ｅｔ　　ａｌ、、１９８６ａ）。

ｔ−ＰＡの二次構造についての上のモデルが示唆するように、提案された自律的構造は、また、自律的機能を表すことができるであろう。われわれの実験室において実施したは、この仮説に対する実質的な支持を与えｔ；（欧州特許出願第８６２００２２３．５号、Ｈ，Ｐａｎｎｅｋ。

ｅｋ　　ｅｔ　　ａｈ、ｔ−ＦＡの欠失；Ｖａｎ　　Ｚｏｎｎｅｖｅｌｄｅｔ　　ａｌ、、１９８６ｂ）、この研究において、ｔ−ＰＡ　　ｃＤＮＡの欠失突然変異体が構成され、そしてこのようなｔ−ＰＡ　　ｃＤＮＡによりエンコードされる突然変異体タンパク質は対応するｔ−ＰＡ　　ｃＤＮＡを使用するいわゆるマウスＬｔｋ細胞のトランス７エクシ２ンにより実質的に発現され、これからｃＤＮＡの定められた部分が欠失されている。この研究の結果が示すように、フィブリンの存在によるｔ　−ＰＡのプラスミノゲンアクチベーターの活性を高度に促進する可能性は、を−ＰＡ分子の２つの明確なドメイン、すなわち、フィンガードメインおよびクリングルドメインに２により仲介される。われわれは、まｆ：、ｔ−ＦＡ活性上の促進する作用を、また、上の２つの明確なドメインにより仲介されるｔ−ＰＡのフィブリン結合性質と関係づけることができた。

少なくともｔ−ＰＡタンパク質のＨ鎖は、自律的機能を有する構造んドメインから構成されると、われわれは結論することができる。この結論は、この分子の特異的性質を他の分子と組み合わせる可能性を打ち開き、これにより性質の新しい組み合わせが貯蔵されかつ機能的方法において発現される、新規な置換突然変異体を産生ずる。

本発明は、ｔ−ＦＡの置換突然変異体の遺伝情報を指定するｃＤＮＡの構成体に関して、ここでわれわれの実験室において構成されたｔ−ＰＡ　　ｃＤＮＡの一定部分がヒトウロキナーゼ（ｕ−ＰＡ）のいわゆるＢ鎖の遺伝情報を指定する（部分的）ｃＤＮＡの異なる部分と融合されている（Ｖｅｒｄｅ　　ｅｔ　　ａｌｏ、１９８４）ａ目的は、ｔ−ＦＡおよびｕ−ＰＡの両者の性質が発現されている、融合タンパク質の遺伝情報を指定する組み換えＤＮＡ分子を構成することである。ｔ−ＰＡのように、ウロキナーゼ（ｕ−ＰＡ）はプラスミノゲンアクチベーターであり、そして塚からか、あるいは種々の培養した細胞系のコンディジ１ニングされた培地から分離される。尿のｕ−ＰＡの２つの異なる形態、すなわち、高分子量（ＨＭＷ　　ｕ−ＰＡ；５４ｋＤ）および低分子量（ＬＭＷｕ−ＰＡ；３３ｋＤ）の形態が同定され、これらの両者はプラスミノゲンアクチベーターの活性を有する。ＬＭＷ　　ｕ−ＰＡはＨＭＷ　　ｕ−ＰＡのタンパク質分解生成物と見なされる。ＨＭＷ　　ｕ−ＰＡおよびＬＭＷ　　ｕ−ＦＡの両者のアミノ酸配列、およびまたアスパラギン結合グリコジル化部位は完全に説明された（ＧＱｎｚｌｅｒ　　ｅｔ　　ａｌ、、１９８２ａ；Ｇｕｎｚｌｅｒ　　ｅｔ　　ａｌ、、１９８２ｂ；５ｔｅｆｆｅｎｓ　　ｅｔ　　ａｌ、、１９８２）、ＨＭＷ　　ｕ−ＦＡは単一のジサルファイド結合により結合された２本鎖から成る。

アミノ末端鎖（Ａ鎖）は１５７残基（１−１５７）を含有し、そしてカルボキシ末端鎖（ＢｉＫ）は２５３アミノ酸（１５９−４１１）を含有する。ＬＭＷ　　ｕ−ＦＡは、また、ＨＭＷ　　ｕ−ＰＡと同一の方法でおよび同一の位置においてジサルファイド結合により結合された二本鎖から成る。アミン末端鎖（Ａ１）は２２残基（１３６ｎ−１５７）から成り、そしてカルボキシ末端Ｂ鎖はＨＭＷ　　ｕ−ＦＡのＢＭと同一である（１５９−４１１）。

ヒトｕ−ＰＡ（いわゆるｕ−ＰＡ　　ｃＤＮＡ）の完全な遺伝情報を有する組み換えＤＮＡ分子の構成および分離、および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｊａ　　ｃｏｌｉ）バクテリア中で合成され、ｕ−ＰＡ　　ｃＤＮＡを含有するプラスミドで形質転換された、生物学的に活性なｕ−ＰＡの発現は記載された（Ｈｅｙｎｅｋｅｒ　　ｅｔ　　ａｌ、、１９８３）。

全長のｕ−ＰＡ　　ｃＤＮＡのヌクレオチドｓｑはこれらの研究において決定されｔ；ので、アミノ酸配列はそれから誘導することができるであろうａ　ｕ　− Ｐ　Ａは４３１アミノ厳から成る前駆体分子として合成される。

多分シグナルペプチド機能を有する、２０アミノ酸のアミン末端セグメントは除去される。残りの４１１残基のアミノ酸配列は、尿から精製された、ｕ−ＦＡ調製物において決定末端配列に相当する（Ｇｔｉｎ　ｚ　１　ｅｌ　　ｅｔ　　ａｌ、、１９８２ａおよび１９８２ｂ：５ｔｅｆｆｅｎｓｅ　ｔ　　ａ　１０、ｌ　９８２）。

上の研究とは独立に、ブラシ（Ｂｌａｓｉ）および共同研究者ら（Ｖｅｒｄｅ　　ｅｔ　　ａｌ、、１９８４）は、少なくともヒトｕ−ＰＡのＢ鎖についての遺伝情報を有するｕ−ＰＡ　　ｃＤＮＡを構成した。この出願においてこの組み換えＤＮＡ分子を使用してｒｔ−ｐＡ置換突然変異体ｃＤＮＡＪを構成したが、他の部分はわれわれの実験室において構成した全長ｔ−ＰＡ　　ｃＤＮＡから誘導した（Ｖａｎ　　Ｚｏｎｎｅｖｅｌｄ　　ａｔ　　ａｌ、、１９８６ｂ）。ｒｕ −ＰＡ　　ｃＤＮＡＪ構成体（Ｖｅｒｄｅ　　ｅｔ　　ａｌ、、ｌ　９８４）は、このＤＮＡ中に存在する２つの（「添え継ぎされていない」）イントロンがまた存在するので、ｃＤＮＡから完全に構成されない。多分、この（部分的）　ｕ −ＰＡ　　ｃＤＮＡの構成における出発産生物は、なおイントロンを含むｍ　ＲＮ　Ａを含有するメツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）であった。ｕ−ＰＡ　　ｃＤＮＡ中のこれら２つのイントロンの存在は、発現の研究において、宿主細胞として真核生物まｔ；は真核生物の組織培養細胞を使用することを必要とする。

なぜなら、原核生物、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉはこれらのイントロンを対応するｍＲＮＡから排除しないからである。

ｔ−ＦＡタンパク質のように、ｕ−ＦＡタンパク質は、各々が自律的機能をはたす、ある数の明確なドメインから構成された分子と見なすことができる。ＨＭＷ　　ｕ−ＦＡおよびＬＭＷ　　ｕ−ＰＡの両者がプラスミノゲンアクチベーターの活性を有するという観察がら、Ｂ！ｌｌｉはｕ−ＰＡの触媒の中心を有すると結論することができる。この結論は、Ｂ鎖がトリプシン様セリンプロテアーゼの族と相同性を示すという観察と一致し、この結論は、また、ｔ−ＰＡのし鎖に関して引き出された。さらに、アミノＭｌから１３５までに及ぶアミノ末端断片（ＡＴＦと呼ぶ）は、単球細胞系の外膜上のレセプターへのＨＭＷ　　ｕ−ＰＡの結合において自律的機能を有することが決定された（Ｓｔｏｐｐｅｌｌｉ　　ｅｔ　　ａｌｏ、１９８５）。

ウロキナーゼ（ｕ−ＰＡ）を大規模に抗血栓崩壊物質として使用されて来た。しかしながら、ｕ−ＦＡはこのような使用をひどく妨害する性質を有する。ｔ−ＰＡと異なり、ｕ−ＰＡはフィブリンの不存在下に実質的なプラスミノゲンアクチベーターの活性を有する。この性質の結果、循環するプラスミノゲンおよびフィブリン結合プラスミノゲンの両者を生体内投与したとき、プラスミノゲンは区別されないでプラスミンに転化される。プラスミンの全身の形成はフイブリノゲンおよび血液凝固因子の因子Ｖおよび因子Ｖｌｌｌのタンパク質分解の分解に導き、多分重度の出血の合併症生ずる。

本発明において、２つの異なる分子（置換突然変異体ｃＤＮＡ）を構成し、そしてこれらを宿主細胞中で発現することに今回成功した。これらの組み換えＤＮＡ分子は、ベクタ一部分に加えて、ｔ−ＰＡのＨ鎖の最も重要な部分の遺伝情報を指定するＤＮＡ配列および少なくともＵ−ＰＡの完全なり鎖の遺伝情報を指定するＤＮＡ配列を含有する。この目的は、ｔ−ＰＡのプラスミノゲンアクチベーターの活性がクリングル２（Ｋ２）ドメインおよびフィンガー（Ｆ）　　ドメインとフィブリンとの相互作用により大きく促進されるという性質を、ｕ−ＦＡのＢ鏡上に位置する、ｕ−ＰＡのプラスミノゲンアクチベーターの活性に付加することである。これに関して、フィブリンの不存在下に、ｕ−ＰＡのグラスミノゲンアクチベーターの活性（「基本的活性」）はｔ−ＰＡの基本的活性よりかなり高いことを、もう一度、強調すべきである。

本発明は、さらに、それ自体既知の方法において、このような組み換えＤＮＡを使用してトランスフェクションされた宿主細胞を培養し、そしア宿主細胞により産生されたヒトｔ　−ＰＡ　（ｕ−ＰＡ）置換突然変異体を回収することからなる、ヒトｔ　−ＰＡ　（ｕ−ＰＡ）置換突然変異体タンパク質を調製する方法において具体化される。

生体外の寅験は、フィブリンの存在下に、これらのヒトｔ−ＰＡ（ｕ−ＰＡ）置換突然変異体タンパク質はｔ−ＰＡより活性なプラスミノゲンアクチベーターであり、そしてさらに、ｔ−ＰＡの生理学的阻害因子、すなわち、内皮プラスミノゲンアクチベーター阻害因子（ＦＡＩ−１）に対する感受性が低いことが示されＩ；。

本発明は、また、このような方法により産生されたヒトｔ−ｐＡ（ｕ−ＰＡ）置換突然変異体タンパク質からなる、血液凝固および／または線維素溶解に対する作用を有する製剤学的組成物、および、上に定義した組み換えＤＮＡ分子によるトランスフェクションの結果、ヒトｔ　−ｐＡ（ｕ−ＦＡ）置換突然変異体タンパク質を産生ずることができる宿主細胞において、具体化される。

ヒトｔ−ＰＡ　（ｕ−ＰＡ）置換突然変異体ｃＤＮＡを構成し、そして発現する方法を、詳細に説明する。これらの２つの突然変異体は、次ぎを考慮する方法で構成された：ａ）　アミノ酸の数（任意に１４残基）これらのアミノ酸はｔ−ＰＡのクリングル２（Ｋ２）をアルギニン−イソロイシンのペプチド結合から分離し、この結合はプラスミンにより破壊され、二本鎖ｔ−ＦＡを生ずる（Ｐｅｎｎｉｃａ　　ｅａ、１９８３）か、あるいはｂ）　アミノ酸の数（任意に２７残基）これらのアミノ酸はｕ−ＰＡの単一のクリングルリジン−イソロイシンのペプチド結合から分離し、この結合はプラスミンにより破壊され、二本鎖ｕ−ＦＡを生ずる（Ｈｅｙｎｅｋｅｒ　　ａｔ　　ａｌ、、１９８３）。

ｔ−ＰＡ置換突然変異体ｃＤＮＡの構成構成体の出発物質は２つの組み換えＤＮＡプラスミドであった。プラスミドｐＳＶ２／１−ＰＡはヒトｔ−ＰＡのための完全な遺伝情報（ＣＤＮＡ）を有し、そしてこのプラスミドのヌクレオチド配列は完全に決定された（ＭｕｌｌｉｇａｎおよびＢｅｒｇ％１９８１；Ｖａｎ　　Ｚ。

ｎｎｅｖｅｌｄ　　ｅｔ　　ａｔ、、１９８６ｂ）、さらに、われわれはプラスミドｐＨＵＫ−１を使用し、これは少なくともヒトｕ−ＦＡのＢ鎖の遺伝情報を指定する部分的ｃＤＮＡを含有する（Ｖｅｒｄｅ　　ａｔａｌ、、１９８４）、プラスミドｐＨＵＫ−１のＸクレオチド配列ハ、また、完全に決定された（ＯｋａｙａｍａおよびＢｅｒｇｓ　　１９８３；Ｖｅｒｄｅ　　ｅｔ　　ａｌ、、１９８４）。ｔ−ＰＡ　　ＣＤＮＡ中の制限部位の番号はペン二カ（Ｐｅｎｎｉｃａ）ら（１９８３）から取ったが、ｕ−ＰＡ　　ＤＮＡおよびＣＤＮＡ中の制限部位の番号はベルブ（Ｖｅｒｄｅ）ら（１９８４）から取った。

プラスミドｐＳＶ２／１−ＰＡのＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＰｓｔｌで消化し、その後位置１２７３においてＥｃｏＲＩのための制限部位を「切断」しない目的で、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩで部分的に消化した。この消化の結果、われわれはＥｃｏＲＩ　（位置８０１）からＰｓｔｌ（位置１３１２）のｔ−ＰＡ　　ｃＤＮＡセグメント（断片Ａ）に相当する制限断片を分離することができた。

プラスミドｐＨＵＫ−１のＤＮＡは、制限エンドヌクレアーゼＰｓｔ１およびＥｃｏＲＩで完全に消化された。この消化の結果、われわれはＰｓｔＩ（位置３８６）からＥｃｏＲＩ　（位置７２７）のｕ−ＰＡ　（ｃ）ＤＮＡセグメント（断片Ｂ）に相当する制限断片を分離することができた。

ベクターのＤＮＡは、Ｍ１３ｍｐ８の複製二本鎖の形態（ＶｉｅｉｒａおよびＭｅｓｓｉｎｇｘ　　１９８２）であり、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩで完全に消化された。ここで直線のベクターを断片ＡおよびＢと混合しそして、酵素ＤＮＡリガーゼにより、上の３つの成分から成る組み換えＤＮＡ構成体を調製し、ここでｔ−ＰＡのＰｓｔｌ末端（位置１３１２）はｕ−ＰＡのＰｓｔｌ末端（位置３８６）と融合し、モしてＥｃｏＲＩ末端（ｔ−ＰＡの位置８０１およびｕ −ＰＡの位置７２７）はＭ１３ｍｐ８の２つのＥｃｏＲＩ末端と融合している。

この構成体をＭ１３ｍｐ８／１−ＰＡ：　：ｕ−ＰＡと呼んだ。

バクテリオファージＭ１３ｍｐ８／１−ＰＡ：　：　ｕ−ＰＡのＤＮＡの一本鎖の形態から出発し、そしていわゆるｒアウトルーピング（ｏｕｔｌｏｏｐｉｎｇ）Ｊ方法（Ｋｒａｍｅｒ　　ｅｔ　　ａｌ、、ｌ　９８４）を使用して、２つの欠失突然変異体を前述の考慮に従って構成した。この目的で、２つのいわゆる「プライマー」を合成し、これらの各々は３６ヌクレオチドの長さを有する。このヌクレオチド配列を下に記載するニブライマーＩ　　５’　　ＧＡＴＧＴＧＣＣＣＴＣＣＴＧＣＴＣＣＣＡＧＴ（アミノ酸）　　　　　　　ＤＶＰＳＣ５ＱＧＴＧＧＣＣＡＡＡＡＧＡＣＴ　　３’ＧＱＫＴプライ？−ＩＩ　　５’　　ＧＡＴＧＴＧＣＣＣＴＣＣＴＧＣＴＣＣＧＧＡ（７ミ／酸）　　　　　　　　Ｄ　　　　Ｖ　　　Ｐ　　　Ｓ　　　ＣＳ　　　ＧＡＡＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＴＣＴ　　３’ＫＰＳＳ注：対応するアミノ酸は１文字のコードで示されている。

２つのプライマーの５°末端の半分（１８ヌクレオチド）はアミノ酸のアスパラギン酸（Ｄ）　、バリン（Ｖ）、プロリン（Ｐ）　、セリン（Ｓ）、システィン（Ｃ）およびセリン（Ｓ）の遺伝情報を指定するｔ　−ＰＡｃＤＮＡの塩基対９５８〜９７５に等しい。プライマー■の３′末端の半分は、アミノ酸のグルタミン（Ｑ）、システィン（Ｃ）、グリシン（Ｇ）、グルタミン（Ｇ）、リジン（Ｋ）およびスレオニン（Ｔ）の遺伝情報を指定するｕ−ＰＡ　　ＤＮＡの塩基対６７７〜６９８に相当する。

プライマー１１の３°末端の半分は、ｕ−ＰＡの塩基対６３８〜６５５に相当し、そしてアミノ酸のグリシン（Ｇ）、リジン（Ｋ）、リジン（Ｋ）、プロリン（Ｐ）、セリン（Ｓ）およびセリン（Ｓ）の遺伝情報を指定する。

バクテリオファージＭ１３ｍｐ８／１−ＰＡ：　：ｕ−ＦＡの一本鎖ＤＮＡがプライマー■またはプライマーＩＩとハイブリダイゼーシヨンし、引き続いて二本鎖のへテロ二重らせんを生体外で合成し、次いで適当なＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉバクテリアを形質転換する、ｒアウトループ」法を使用して、要求される欠失を実施した。この手順のため、セグメン）ｔ−ＰＡ　　ｃＤＮＡを欠失し、これは、なかでも、位置１２７３にＥｃｏＲＩ制限部位および位置１３１２にＰｓｔｌ制限部位を含有する。欠失したセグメントｕ−ＦＡは、なかでも、位置３８６にＰｓｔｌの制限部位を含有する。両者の構成体について、ここで、二本鋼の形態の突然変異体Ｍ１３ｍｐ８／１−ＰＡ：　：ｕ−ＰＡの精製後、所望の欠失を有するＥｃｏＲ１ｆｌｌｌ＠断片を分離することが可能である。プライマーＩを使用するとき、この断片の長さは２２２塩基である（融合断片Ａ）そしてプライマーＩＩを使用するとき、この断片は２６１塩基（７）長さである（融合断片Ｂ）。

構成体の次の工程において、融合断片は５′側において全長のｔ　−ＰＡ　　ｃＤＮＡからの隣接するｔ−ＰＡ　　ｃＤＮＡと融合し、そして３′側において融合断片はプラスミドｐＨＵＫ−１からの隣接するｕ　−ＦＡ（ｃ）ＤＮＡと融合する。この目的で、プラスミドｐＳＶ２／１−ＰＡのＤＮＡ（Ｖａｎ　　Ｚｏｎｎｅｖｅｌｄ　　ｅｔ　　ａｈ、１９８６ｂ）は制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩｊ；よびＥｃｏＲＩで完全に消化され、その結果われわれはｐＳＶ２／１−ＦＡのベクタ一部分上のＨｉｎｄｌｌＩ部位およびｔ−ＰＡ　　ｃＤＮＡ部分において位置８０１のＥｃｏＲ１部位から延びる制限断片を分離することができた。また、ｐＨＵＫ−ＩＤＮＡ（Ｖｅｒｄｅ　　ａｔ　　ａｌ、、１９８４）を制限エンドヌクレアーゼＰｓｔｌで完全に消化し、そして制限エンドヌクレアーゼＥＣ０ＲＩで部分的に消化して、位置１３６４におけるＥｃｏＲＩ制限部位の「切断」を回避した。このようにして、われわれは、ｐＨＵＫ−１上の、それぞれ、ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩのだめの位置７２７および１９６９に相当するＥｃｏＲＩ　　ｐ５１１断片を分離することができた。次の構成のために使用しＩ；ベクターはプラスミドｐＵｃＩ９であり、これハｆｌｉｌｌ限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄｌ１１８よびＰｓｔｌで消化した（Ｙａｎｊｓｃｈ−Ｐｅｒｏｎ　　　ａｔ　　　ａｌ、　、　１９８５ン。

融合断片Ａ（２２２塩基対；ＥｃｏＲ１末端）をｐＳＶ２／１−ＰＡからのＨｉｎｄｌ　Ｉ　Ｘ−ＥｃｏＲＩ断片、ｐＨＵＫ−１からのＥｃｏＲｌ−Ｐｓｔｌ断片および消化したベクターｐＬＪｃ１９と混合した。同一の方法で、融合断片Ｂ（２６１塩基対）を、別に、同一の３つの断片と混合した。結合およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ菌株ＤＨＩの形質転換（Ｍａｎｊａｔｉｓ　　ａｔ　　ａｌ−１１９８２）後、われわれは所望の２つの異なる組み換えＤＮＡプラスミドを分離することができた。これらのプラスミドをｐＵＣｌ　９／１−ＰＡ：　：　ｕ−ＰＡ−１およびｐＵｃ１９／１−ＰＡ：　：ｕ−ＰＡ−Ｉ　Ｉと呼んだ。

プラスミドｐＵｃ　１９／ｌ　−ＰＡ　：　：　ｕ−ＰＡ−ＩおよびｐＵｃ１９／１−ＰＡ：　：ｕ−ＦＡ−Ｉ　ＩのＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩで完全に消化し、そして制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで部分的に消化して、位置１６５４におけるｕ−ＰＡ　　ＤＮＡの部分におけるＢａｍ）１１部位の「切断」を回避した。このようにして、われわれは、プライマー！またはプライマー■！のいずれかでもとの「アウトルーピング」に関する２つのＨｉｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ−ＢａｍＨＩ断片を分離することができ、それらのＨｉｎｄ１１１ｉｉ１１＠部位はｐＳＶ２／１−ＦＡのベクタ一部分から由来し、モしてＢａｍ１（１制＠部位はベクターｐｕＣ１９のポリリンカ一部分から由来した。本質的に、ＨｉｎｄｌｌＩ−ＢａｍＨＩ断片は、ｔ−ＰＡのＨ鎖の最も重要な部分およびｕ−ＰＡのＢ１１１の遺伝情報を指定する、ｔ−ＰＡ　　ｃＤＮＡ間の融合を含有する（２つの断片の間の差は、プライマーＩＩを使用するとき、プライマー■を使用するときより１３だけ多いアミノ酸が存在すると、表される）。最後に、２つのＨｉｎｄｌｌＩ−ＢａｍＨＩ断片を別々に使用して、プラスミドｐＳＶ２／１−ＦＡ上の全長のｔ−ＰＡ　　ｃＤＮＡ部分を置換する。この目的で、プラスミドｐｓＶ２／１−ＰＡのＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｇｌＩＩで完全に消化し、そしてベクタ一部分を含有する断片を分離した。制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩＩは同一のＤＮＡ末端を発生するので、われわれは引き続いて消化したベクターをもつ上のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片を分離することができｔ；。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ　　ＤＨ２バクテリアの形質転換後、２つのタイプの組み換えＤＮＡプラスミドを分離し、そして精製した（Ｍａｎｉａｔｉｓ　　ｅｔ　　ａｌ、、１９８２）。これらの最終のプラスミドの関連する配列のヌクレオチド配列、ｐＳＶ２／１−ＰＡ：　：　ｕ−ＰＡ−１およびｐＳＶ２／１−ＰＡ：　：ｕ−ＰＡ −ＩＩと呼ぶ、はＤＮＡ配列決定（Ｓａｎｇｅｒ　　ｅｔ　　ａｌ、、１９７７）により完全に決定され、そしてｔ−ＰＡ　　ｃＤＮＡおよびＵ−ＰＡ　　（ｃ）ＤＮＡの関連する部分、およびまた対応するアミノ酸配列を添付第１図に示す。次の節における論考すべき突然変異体部分はｔ−ＰＡ：　：ｕ−ＰＡ−１およびｔ−ＰＡ：　：ｕ−ＰＡ−１１と呼び、そして、それぞれ、ｐＳＶ２／１−ＰＡ：：ｕ−ＰＡ−Ｉ　　ＤＮＡおよびｐＳＶ２／１−ＰＡ：：ｕ−ＰＡ−ＩＩ　　ＤＮＡによりエンコードされる。記載する構成の結果、最後に述べるプラスミドはプラスミドｐＨＵＫ−１から由来するｕ−ＦＡ部分中に１つのだけのイントロンを含有する。Ｅ、ｃｏｌｉ　　Ｋ１２菌株ＤＨＩ　　ｐＳＶ２／１−ＰＡ：：ｕ−ＰＡ−１１は、セントラール・ビューロウ・ブーア・シンメルカルチャーズ（Ｃｅｎｔｒａａｌ　　Ｂｕｒｅｕ　　ｖｏｏｒ　　ＳｃｈｉｍｍｅｌｃｕＩｔｕｒｅｓ）（ＣＢＳ）（オランダ国パーン）に１９８７年４月２８日に受託され、そして受は入れ番号ＣＢ５２９３．８７を付された。こうして入手可能とな一？Ｉｆ−このプラスミドから、より短いプラスミドｐｓＶ２／１−ＰＡ：　：　ｕ−ＰＡ−１を、例えば、アウトルーピング技術を経て容易に構成することができる。

マウス線維芽細胞系（マウスＬｔｋつをいわゆる「イスコブ（Ｉｓｃｉｖｅ）最小培地」中で培養し、これにペニシリン、ストレプトマイシンおよび１０％（Ｖ／ｖ）の胎児仔ウシ血清を添加した。これらの細胞のトランスフェクシ迎ンは記載されているように実施した（Ｌｏｐａｔａ　　ｅｔ　　ａｌ、、１９８６ｂ）。トランス７エクシ１ン後、細胞を上の培地中でインキュベーションしたが、胎児仔ウシ血清を添加しなかった。トランスフェクション後５日に、コンディショニングしｔ；培地を収穫し、次いでツイーン−２０を添加し、そしてアジ化ナトリウムを、それぞれ、０．０１％（ｖ／ｖ）および０．０２％（ｖ　／　ｖ　）の最終濃度に添加した。その後、コンディショニングした培地を５０ミリモルのリン酸ナトリウム（ｐＨ７，４）、０．０１％（Ｖ／Ｖ）のツイーン−８０および０．０２％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウムから成る緩衝液に対して４℃において１６時間透析した。次いで、上の方法で処理した調製物を４℃で貯蔵しｔ；。

コンディショニングした培地中の突然変異体タンパク質の濃度の決定分泌した突然変異体タンパク質ｔ−ＰＡ：　：　ｕ−ＰＡ−１，ｔ　−ＰＡ：：ｕ−ＰＡ− ＩＩ、およびまた組み換え体ｔ　−ＰＡ　（ｒ　ｔ−ＰＡ）の遺伝情報を指定するｐＳＶ２／１−ＰＡ　　ＤＮＡを使用する対照トランス７エクシ１ン後験の濃度を、免疫放射線測定法（ＩＲＭＡ）により決定した。ＩＨＭＡは、研究するすべてのタンパク賞中のｔ−ＦＡのクリングル１（Ｋｌ）の存在、およびＫｌに対して向けられた２つの異なるモノクローナル抗体の利用可能性に基づ＜　（Ｖａｎ　　Ｚｏｎｎｅｖｅ　１ｄ　　ｅｔ　　ａｌ、、１９８６ｃ）。これらの２つの抗体調製物はＣＬＢ−ｔ−ＰＡ７２およびＣＬＢ−ｔ−ＰＡ　　１６と呼ばれた（ＶａｎＺｏｎｎｅｖｅｌｄ　　ａｔ　　ａｌ、、１９８６ｃ）モノクローナル抗ｔ−ＰＡ抗体ＣＬＢ−ｔ−ＰＡ　　７２材料および方法ＤＮＡの分析ニプラスミドＤＮＡの分離、制限エンドヌクレアーゼで消化したＤＮＡのアガロースおよびポリアクリルアミドゲルの電気泳動による分析、「サザン」プロッティング、制限断片の分離、ＤＮＡの放射線標識つけ、「ニック翻訳」またはＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ、およびコロニーハイブリダイゼーションの技術は記載されているようにして実施した（Ｍａｎｉａｔｉｓ　　ｅｔ　　ａｌ、＋　１９８２）ｏＤＮＡ中の塩基の配列の決定（ＤＮＡの配列決定）はジデオキシ方法により実施した（Ｓａｎｇｅｒ　　ｅｔ　　ａｌ、、１９７７）。制限エンドヌクレアーゼおよび他の酵素は、二ニー・イングランド・バイオラプス（Ｎｅｗ　　ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）（米国マサチュセッツ州ペパーレイ）から購入し、そして放射線標識しｔ；ヌクレオチドはラジオケミカル・センター（Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　　Ｃｅｎｔｅｒ）（英国アマ−ジャム）から購入しｔ；。

里！培養細胞のトランスフェクション：トランスフェクションしたマウスＬｋｔ細胞により「一時的」発現を得る手順は、前に記載されているようにして実施し？：（Ｌｏｒａｒａｅｔ　　ａｌ、、１９８４；Ｖａｎ　　Ｚｏｎｎｅｖｅｌｄ　　ｅｔ　　ａｌ、、１９８６ｂ）。

ゼラチンープラスミノゲンのゲル電気泳動：ゼラチンおよびプラスミノゲンを含有するポリアクリルアミドゲルの調製、およびこれらのゲルによる試料の電気泳動の分析は前に記載されているようにして実施した（Ｖａｎ　　Ｚｏｎｎｅｖｅ　ｌｄ　　ｅｔ　　ａｌ、、１９８６　ｂ）。

フィブリンのオーバーレイ技術：プラスミノゲンアクチベーターの活性およびその活性に関連する分子量の決定は、前に記載されているように、ａｌの５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの電気泳動後、フィブリンオーバーレイ技術を使用して実施した（Ｇｒａｎａ　１　］　１−Ｐｉ　ｐｅ　ｒｎｏおよびＲｅ１ｃｈ、１９７８）。

プラスミノゲンアクチベーターの活性の決定：この決定において、プラスミンに対して特異的である、色素原基質Ｓ−２２５１を使用する。ｒｔ−ＰＡ、ポウウェス黒色腫ｔ−ＰＡおよび他のｔ−ＰＡ誘導体によるＧｌｕ−プラスミノゲンの活性化は、臭化シアンで処理したフイブリノゲンの分裂生成物の添加により大きく促進される。この最後の成分は「刺激体」と呼ばれる（Ｖｅｒｈｅｉｊｉｎｅ　ｔ　　ａ　１０．１９８２）。プラスミノゲンアクチベーターの活性がＰＡｌ −１との予備インキュベージ２ン後決定される場合、使用するＰＡｌ−１調製物は培養した脈管内皮細胞のコンディショニングした（血清不合）培地（濃度ＦＡＩ−１＝　２．４ｐｇ／ｍ（１）であるか、あるいは精製した調製物ＰＡＩ−１（１００，ｕｇ／ｍ１２　；Ｌａｍｂｅｒｓ　　ｅｔａｌ、、１９８７）である、２つの調製物は対応する結果を与えた。

他の材料ＨＭＷ　　ｕ−ＰＡ（二本鎖）はｇ、ガッサ−’−（Ｇａｓｓａｎｉ）博士（イタリー国ミラン、Ｌｅｐａｔｉｔ）から得た。ポウウェス黒色腫ｔ　−ｐＡ（二本鎖）は、バイオプール（Ｂｉｏｐｏｏｌ）（スウェーデン国つメア）から購入した。Ｇｌｕ−プラスミノゲン「刺激体」および色素原基質Ｓ−２２５１はカビビトルム（Ｋａｂ　ｉＶｉ　ｔ　ｒｕｍ）（スウェーデン国ストックホルム）から入手しＩ；。

表１一刺激体　　　　　　　　　　　十刺激体調製物　　　　Ｋｍ　　ｋ（ｃａｔ）　　ｋ（ｃａｔ）／Ｋｍ　　Ｋｒｎ　　　ｋ（ｅａｔ）　　ｋ（ｃａｔ）／Ｋｍｒｔ−ＰＡ　　　　　　　　　　＞５０　　　　０．４９　　　　　＜０．０１　　　　　０．０１６　　　０−３４　　　　　＞２１ｔ−ＰＡ：：ｕ−ＰＡ− １０，６１０，２５０，４１０，００５０，４５９０ｔ−ＰＡ：：ｕ−ＰＡ−１１０，８８０，３００，３４０，００４０，３９９８ＨＭＷｕ−ＰＡ　　　　２．２　０．６５　　０−２９　　　０．０７３　０．２６　　　３．６Ｋｍ値は μｍで与えである。ｋ（ｃａｔ）値は５ｅｃ−１で与えてあり、それゆえ商ｋ　（ｃ　ａ　ｔ）　／Ｋｍは次元μｍ−１°５ｅｃ−’である。

図面の説明第１図第１図は、それぞれ、ｔ−ＰＡ：　：　ｕ−ＦＡ−１（上）およびｔ−ＰＡ：　：ｕ−ＦＡ−１１（下）の分裂部分の遺伝情報を指定するｃ　ＤＮＡ区域のヌクレオチド配列を示す。また、ｔ−ＰＡ部分およびｕ−ＦＡ部分の対応するアミノ酸が示されている。ヌクレオチド配列より上の番号ｔ−ＰＡヌクレオチド配列（９５５など）およびｕ−ＰＡヌクレオチド配列（６７９など、６４０など）のそれに相当する。アミノ酸配列より下の番号は、ｔ−ＰＡアミノ酸配列（２５６など）およびｕ−ＰＡアミノ酸配列（１４７など、１３４など）のそれに相当する。下線をほどこしたヌクレオチド配列は、２つの突然変異体の構成に使用した合成プライマーを示す。

第２図ゼラチンープラスミノゲンゲル電気泳動。この分析の実施はこの明細書に記載されている。われわれは順次に分析した：１−　　ｉｎｇのボウウェス黒色腫ｔ− ＦＡ（対照）；２．　　Ｏ，ｌｎｇのボウウェス黒色腫ｔ−ＰＡ：３．　　ｌｎｇのｒｔ−ＰＡ；４．　０．ｉｎｇのｒｔ−ＰＡ；５、　０．ｉｎｇのｔ−ＰＡ：：ｕ−ＰＡ−Ｉ；６．　０．ｉｎｇのｔ−ＰＡ：：ｕ−ＦＡ−ＩＩ；７．　０．ｉｎｇのＨＭＷ　　ｕ−ＦＡ、この分析が示すように、この系におけるフィブリンの不存在下の、ｔ−ｐＡ置換突然変異体の活性は、ＨＭＷ　　ｕ−ＰＡに匹敵し、そして（自然）ポウウェス黒色腫ｔ−ＰＡまたはｒｔ−ＰＡのいずれよりも高い。それぞれ、ｔ−ＰＡおよびＨＭＷ　　ｕ−ＰＡの参照分子量７０．０００および５４．０００は、左側に示されている。

第３図５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの電気泳動後のフィブリン−オーバーレイ。この技術は材料および方法の節に記載されているが、詳細はこの明細書に記載されている。左から右に、われわれは順次に分析した：可能なＦＡ　Ｉ　−１とプラスミノゲンアクチペーターの１つの複合体の形成、ｔ−ＰＡ：　：ｕ−ＰＡ−１１，ＦＡＩ−１なしく分子量約７０，０ＱＱ）；　ｔ−ＰＡ：　：ｕ−ＦＡ−１１およびＦＡＩ−１（分子量〉７０゜０００）；　ｔ−ＦＡ、ＦＡＩ−１なしく分子量約７０．０００）；　ｒ　ｔ−ＦＡおよびＦＡＩ−１（分子量＞７０．０００）；ＨＭＷ　　ｕ−ＦＡ。

ＦＡＩ−１なしく分子量約５４．０００）；ＨＭＷ　　ｕ−ＰＡおよびＰＡｌ− １（分子量＞７０．０００）；培養しｔ；内皮細胞のコンディジ。

ニングした培地（ＥＣＣＭ）　、ＦＡＩ−１およびｔ−ＰＡの複合体を含有する；トランスフェクションしないマウスＬｔｋ−細胞のコンディショニングし！；培地を添加したＥＣＣＭ。

第４図（増加する量の）ＦＡＩ−１による種々のプラスミノゲンアクチベーターの活性の阻害の決定についての試験のデータは、この明細書中に広く記載されている。

参考文献Ｐａｎｎｅｋｏｅｋ　ｅｔ　ａｌ、、欧州特許出願９６２００２２３．５号−ｔ −ＰＡの欠失。

Ｒｉｆｋｉｎ　ａｔ　ａｌ−、Ｊ、Ｅｘｐ−Ｍｅｄ、１３９（１９７４）１３１７−１３２８゜Ｒｉｊｋｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｔｈｒｏｍｂ、Ｒｅｓ、１８（１９８０）８１５−８３０゜Ｖｅｒｓｔｒａｅｔｅ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｔｈｅ　Ｌａｎｃｅｔ　１（１９８５）８４２−８４７゜Ｗｉｌｌｉａｍｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃ１ｒｃｕｌａｔｉｏｎ　７２（１９８６）３３８−３４６゜Ｅｍｅｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｔｈｒｏｍｂ、Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ　５４（１９８５）６６１−６６４゜ＳｐｒｅｎｇｅｒｓおよびＫｌｕｆｔ、　Ｂｌｏｏｄ　６９（１９８７）３８１−３８７゜Ｗａｌ１６ｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｉｎ　Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ　（Ｊ、Ｆ、Ｄａｖｉｄｓｏｎ、　１Ｍ、Ｎｉ１ｓｓｏｎおよびＢ、Ａｓｔｅｄｔ、編）　Ｖｏｌ、５（１９８０）ＰＩ）、１６−２１．Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ　Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ、　Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ− Ｐｏｈｌ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２３（１９８４）３７０１−３７０７゜Ｐｅｎｎ１ｃａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ３０１（１９８３）２１４−２２０゜Ｇｏｅｄｄｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｐａｔｅｎｔ　０ｆｆｉｃｅ　（Ｌ０９３＋６１９．１９８３Ｂａｎｙａｉ　ａｔ　ａｌ、、　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、１６３（１９８３）３７−４１゜Ｎｙ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、８１（１９８４）５３５５−５３５９゜Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ８よびＧｅ１ｌｅｒ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、７４（１９７７）１２２０− １２２６゜Ｌａｗｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、９（１９８１）６１０３−６１１４゜Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５６（１９８１）６４５２−６４６２゜Ｐｅｔｅｒｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、８０（１９８３）１３７−１４１゜Ｓａｖａｇｅ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２４７（１９７２）７６１２−７６２１゜ＧｒｅｇｏｒｙおよびＰｒｅｓｔｏｎ、　Ｉｎｔ、Ｊ、Ｐｅｐｔ、　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｒｅｓｐ、９（１９７７）１０７−１１８゜５ｏｔｔｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎ　　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｉｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ　ａｎｄ　Ｔ■ ｒｏＩＩｌｂｏｌｙｓｉｓ（Ｊ、Ｆ、Ｄａｖｉｄｓｏｎ、　Ｒ，Ｍ、Ｒｏｖａｎ、　Ｍ、Ｍ、Ｓａｍａｍａ　８よびｐ、（、［１ｅｓｕｏｙｅｒｓ　、編）　Ｖｏｌ、３（１９７８）ｐｐ、１９１−２０９゜Ｒａｖｅｎ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ。

ＭａｃＤｏｎａｌｄ　ａｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ　４２（１９８６）５９−６７゜Ｖａｎ　Ｚｏｎｎｅｖｅｌｄ　ａｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｃｈｅｍ、　３２（１９８６ａ）１６９−１７８゜Ｖａｎ　Ｚｏｎｎｅｖｅｌｄ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、ＮａｔｌＡｃａｄ、Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、８３（１９８６ｂ）４６７０−１６７４K Ｖｅｒｄｅ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ−Ｓ −８１（１９８４）４７２７−４７３１）。

Ｇｕｎｚｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ’ｓ　Ｚ、Ｐｈｙｓｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、３６３（１９８２ａ）１３３−１４１K Ｇｔｉｎｚｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｈｏｐｐｅ−５ｅｙｌｅｒ’ｓ　Ｚ、Ｐｈｙｓｉｏｌ、Ｃｈａｍ、３６３（１９８２ｂ）１１５６−１P６５゜５ｔｅｆｆｅｎｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｈｏｐｐｅ−５ｅｙｌｅｒ’ｓ　Ｚ、Ｐｈｙｓｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、３６３（１９８２）１０４３−１０T ８゜Ｈｅｙｎｅｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｐａｔｅｎｔ　０ｆｆｉｃｅ　Ｏ，０９２，１８２，１９８３Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ２６、４３ｐ、　Ｉｎｔ、Ｃ１，Ｃｌ２Ｎ　１５１００；　Ａｐｐｌ、１９８３（Ａｐｒｉｌ１４）。

５ｔｏｐｐｅｌｌｉ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、８２（１９８５）４９３９−４９４３゜ＭｕｌｌｉｇａｎおよびＢｅｒｇ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、７８（１９８１）２０７２−２０７６゜０ｋａｙａｍａおよびＢｅｒｇ、Ｍｏｌ　、Ｃａｌ　１　、Ｂｉｏｌ−３（１９８３）２８０−２８９゜ＶｉｅｉｒａおよびＭｅｓｓｉｎｇ、　Ｇｅｎｅ１９（１９８２）２５９−２６８゜Ｋｒａｍｅｒ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５−１２（１９８４）９４４１−９４５６ −Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ　３３（１９８５）１０３−１１９゜Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓ■ ｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｎ、Ｙ、（１９８２）ｐｐ−１−５４５゜Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、７４（１９７７）５４６３−５４６７゜Ｌｏｐａｔａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１２（１９８４）５７０５−５７１７−Ｖａｎ　Ｚｏｎｎｅｖｅｌｄ　ｅｔａｌ、、　Ｔｈｒｏｍｂ、Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ　５７（１９８６ｃ）８２−８６−Ｖｅｒｈｅｉｊｅｎ　ａｔ　ａｌ、、　Ｔｈｒｏｍｂ、Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ４８（１９８２）２６ｆｒ２６９−Ｌｉｊｎｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１４４（１９８４）５４１−５４４゜Ｌｏｓｋｕｔｏｆｆ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、８０（１９８３）２９５６−２９６０゜Ｎｙ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、８３（１９８６）６７７６−６７８０゜Ｐａｎｎｅｋｏｅｋ　ｅｔ　ａｌ、、　ＥＭＢＯＪ、５（１９８６）２５３９−２５４４゜Ｇｉｎｓｂｕｒｇ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｃｌ１ｎ、１ｎｖｅｓｔ、７８（１９８６）１６７３−１６８０゜Ａｎｄｒｅａｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、２０９（１９８６）２１３−２１８゜Ｌｏｅｂｅｒｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｍｏ１ｅｃ、Ｂｉｏｌ、１７７（１９８４）５３１−５３６゜Ｃａｒｒｅｌｌ　８よびＢｏｓｗｅｌｌ、　Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ（Ａ、ＢａｒｒｅｌｌおよびＪ。

Ｓ、５ａｌｖｅｓｅｎ、ｇ）、　Ｅｌｓｅｖｉｅｒｓ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、　Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９８６）ｐｐ−４０３−４２０゜Ｇｒａｎｅｌ　１ｉ−ＰｉｐｅｒｎｏおよびＲｅ１ｅｈ、Ｊ、Ｅｅｐ、Ｍｅｄ、１４８（１９７８）２２３−２３４゜５ｃａｔｃｈａｒｄ、　Ａｎｎ、Ｎ、Ｙ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、５１（１９４９）６６０−６７２゜Ｌａｍｂｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ、（発行のため提出された）。

Φ　（ＱｗＬ・ｒｔＰＡ／ｕＰＡＩｌ　　　　ｒｔ−ＰＡ　　　ｕＰＡ　　　　−対照培地□抵抗活性％国際調査報告 ’−ＩＡ”ｔ”””’・ＰＣ’！’／ＮＬ８８１０００２０国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】１、ヒトｔ−ＰＡの一部分およびヒトｕ−ＰＡの一部分から構成され、前記ｔ− ＰＡ部分はＨ鎖３よび修飾Ｈ鎖を含み、そしてＬ鎖を本質的に欠き、そして前記ｕ−ＰＡ部分はＢ鎖を含み、そして本質的にＡ鎖を本質的に欠く、ヒトｔ−ＰＡ（ｕ−ＰＡ）置換突然変異体タンパク質。２、ｔ−ＰＡ部分は完全なＨ鎖から本質的に成る、請求の範囲第１項記載のヒトｔ−ＰＡ（ｕ−ＰＡ）置換突然変異体タンパク質。３、ｔ−ＰＡ部分は１または２以上のＫ２ドメインからなりそしてＨ鎖の１または２以上の他のドメインを欠き、および／または１または２以上のＦドメインからなりそしてＨ鎖の１または２以上の他のドメインを欠く、修飾Ｈ鎖から本質的になる請求の範囲第１項記載のヒトｔ−ＰＡ（ｕ−ＰＡ）置換突然変異体タンパク質。４、ヒトｔ−ＰＡ（ｕ−ＰＡ）置換突然変異体タンパク質ｔ−ＰＡ：ｕ−ＰＡ− Ｉおよびｔ−ＰＡ：：ｕ−ＰＡ−ＩＩ。５、請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載のヒトｔ−ＰＡ（ｕ−ＰＡ）置換突然変異体タンパク質の遺伝情報を指定する、ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ間二木鎖ＤＮＡの形態の組み換え遺伝情報。６、請求の範囲第５項記載の組み換え遺伝情報をその中に挿入して有する、適当なクローニングおよび／または発現ベクターからなる、組み換えクローニングおよび／または発現ベクター、例えば、プラスミド。７、組み換えプラスミドｐＵＣ１９／ｔ−ＰＡ：：ｕ−ＰＡ−Ｉ；ｐＵＣ１９／ｔ−ＰＡ：：ｕ−ＰＡ−ＩＩ；ｐｓＶ２／ｔ−ＰＡ：：ｕ−ＰＡ−Ｉ；およびｐＳＶ２／ｔ−ＰＡ：：ｕ−ＰＡ−ＩＩ。８、請求の範囲第５項記載の組み換え遺伝情報、とくに請求の範囲第６または７項記載の組み換えＤＮＡを使用して、形質転換した、例えば、トランスフエクションした、適当な宿主細胞を培養し、そして宿主細胞により産生されたヒトｔ− ＰＡ（ｕ−ＰＡ）置換突然変異体タンパク質を回収することからなる、請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載のヒトｔ−ＰＡ（ｕ−ＰＡ）置換突然変異体ダンバク質を調製する方法。９、請求の範囲第５項記載の組み換え遺伝情報、とくに請求の範囲第６または７項記載の組み換えＤＮＡを使用して、形質転換され、例えば、トランスフェクションされ、そして請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載のヒトｔ−ＰＡ（ｕ− ＰＡ）置換突然変異体タンパク質の遺伝情報を指定する組み換え遺伝情報を増殖および／または発現することができる、宿主細胞。１０、請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載のヒトｔ−ＰＡ（ｕ−ＰＡ）置換突然変異体タンパク質および１または２以上の製剤学的に許容されうる担体、希釈剤および／またはアジュバントからなる、血液の凝固および／または線維素溶解に対する作用を有する製剤学的組成物。