JPH04507347A

JPH04507347A - 活性化プロテインｃを生成するための細胞培養法

Info

Publication number: JPH04507347A
Application number: JP2512234A
Authority: JP
Inventors: カマー，アナー　アショク; フォスター，ドナルド　シー．
Original assignee: ザイモジェネティクス，インコーポレイティド
Priority date: 1989-08-11
Filing date: 1990-08-07
Publication date: 1992-12-24
Anticipated expiration: 2015-05-29
Also published as: IE902912A1; DE69004964D1; DK0485504T3; AU6295390A; DE69004964T2; IE66340B1; EP0485504A1; EP0485504B1; ATE97958T1; CA2064774A1; CA2064774C; ES2047946T3; JP3045307B2; WO1991002065A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ■プロティンＣを　するための　悴法伎五分立本発明は、一般的に血漿タンパク質及びそれらのタンパク質の生成方法、及びより特定には、ヒト活性化プロティンＣと同じ生物学的活性を実質的に有するタンパク質を生成するための細胞培養方法に関する。

１１辺１景プロティンＣは、血液凝集の調節及び不７ｈ−主での繊維素溶解性活性の生成に重要な役割を演じるセリンプロテアーゼのチモーゲン又は前駆体である。それは、ジスルフィド結合により一緒に保持されているＨ鎖（Ｍｒ＝４０．ＯＯＯ）及びＬ鎖（Ｍｒ＝２１，０００）を含んで成る二本鎖分子を発生するための相当のプロセッシングを受ける一末鎖ポリベブチドとして肝臓において合成される。循環性二本鎖中間体は、Ｈ鎖のアミノ末端から１２−残基ペプチド（活性化ペプチドとしても知られている）のトロンビン介在切断により、“′活性化プロティンＣ”　（ＡＰＣ）として知られる分子の生物学的活性形に転換される。切断反応は、トロンボモジュリン、すなわち内皮細胞補因子により盃／旦夾で増強される（Ｅｓｍｏｎ　ａｎｄ　Ｏｗｅｎ、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７８　：　２２４９〜２２５２、１９８１）。

プロティンＣは、それぞれグルタミン酸及びアスパラギン酸の翻訳後変性により形成される、γ−カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）の約９個の残基及びβ−ヒドロキシアスパラギン酸の１つの残基を含む糖タンパク質である。プロティンＣにおける特定のγ−カルボキシグルタミン酸残基の翻訳後変性は、ビタミンＫを必要とする。これらのまれなアミノ酸残基は、カルシウムイオンに結合し、そしてプロティンＣの生物学的活性のために必要とされる、プロティンＣとリン脂質との相互作用を担当するように思われる。

他のビタミンに一依存性血漿タンパク質、たとえば第■因子、第１Ｘ因子及び第Ｘ因子の凝集促進作用に対して対照的に、活性化プロティンＣは、限定されたタンパク質加水分解による第Ｖａ因子及び第■ａ因子の不活性化を通して凝集工程の調節物として作用する。ＡＰＣによる第Ｖａ及び第■ａ因子の不活性化は、酸性リン脂質及びカルシウムイオンに依存する。プロティンＳは、第Ｖａ因子のＡ、　Ｐ　Ｃ−触媒されたタンパク質加水分解を促進することによって、この活性を調節することが報告されている（ｔ４ａｌｋｅｒ、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５５　：５５２１〜５５２４．　１９８０）　。

プロティンＣはまた、組織タイプのプラスミノーゲン活性化因子の作用に包含されて来た（Ｋｉｓｉｅｌ　ａｎｄ　Ｆｕｊｉｋａｗａ、　Ｂｅｈｒｉｎ　Ｉｎ５ｔ、Ｍｉｔｌ、７３　：　２９〜４２．１９８３）　、犬へのウシＡＰＣの注入は、高められたプラスミノーゲン活性化因子活性をもたらす（Ｃａｍｐ　ａｎｄ　Ｅｓｍｏｎ、　Ｊ、Ｃｈｉｎ、ｒｎｖｅｓｔ、６８　：　１２２１〜１２２１Ｌ１９８１）　、他の研究者（Ｓａｋａｔａなど、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ旦　賂：　１１２１〜１１２５．１９８５）は、培養された内皮細胞へのＡＰＣの添加が、ウロキナーゼ関連及び組織タイププラスミノーゲン活性化因子の両者の活性の上昇に影響を及ぼす、ならし培地における繊維素溶解性活性の急速な投与量依存性上昇を導ひくことを示した。ＡＰＣ処理はまた、抗 −活性化因子の活性の投与量依存性上昇をもたらす。

実験証拠は、活性化されたプロティンＣが血栓症の処理に臨床的に有用であることを示す、ＡＰＣの使用は、プロティンＣの４７　ｔ？主活性化の必要性を回避し、従ってより早く作用する治療剤を提供する。

さらに、外因性活性化プロティンＣは、グラム陰性敗血症の凝固障害及び致死効果を妨げることを示された（Ｊａｙｌｏｒなど、、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、７９：　９１８〜９２５．１９８７）。比による研究から得られたデータは、活性化されたプロティンＣが敗血症に対する保護において天然の役割を演じる。

プロティンＣは、凝血因子濃縮物（Ｍａｒｌａｒなど−＋　Ｂｌｏｏｄ活性化されるが、しかしこれは複雑で、且つ高価な工程であり、そして得られた生成物は、感染性物質、たとえば肝炎ウィルス、サイトメガロウィルス又はヒト免疫欠損ウィルス（ＨＩＶ）により汚染され得る。つい最近、組換えＤＮＡ技法による活性化されたプロティンＣの生成方法が記載されている。Ｆｏｓｔｅｒなど、（ヨーロッパ特許出願ＥＰ２１５゜５４８）は、活性ペプチドのためのコード配列が欠失されているプロティンＣＤＮＡ配列によりトランスフェクトされた培養哺乳類細胞の使用による活性化プロティンＣの生成を開示する。Ｆｏｓｔｅｒなと、（ＥＰ２６６．１９０）は、変性された切断部位を有するＡＰＣ前駆体をコードするＤＮＡ配列を用いて、組換え活性化プロティンＣの生成を開示する。

遺伝子工学の使用により可能にされた活性化プロティンＣ生成の前進にもかかわらず、収量は低いままであり、そしてタンパク質は、生成工程の間、分解及び／又は不活性化を受ける。従って、損われていない生物学的に活性な活性化プロティンＣのより高いレベルで生成を可能にする方法の必要性が当業界において存在する。

発凱少皿玉手短に言及すれば、本発明は、活性化プロティンＣの生成方法を開示する。・その方法は一般的に、培養培地（該培地は０．１％よりも高くない血清を含む）において、活性化プロティンＣをコードするＤＮＡ配列に操作的に結合される転写プロモーターを含んで成る発現ベクターにより安定してトランスフェクトされた哺乳類細胞を培養し、そしてその細胞により生成された活性化プロティンＣを単離することを含んで成る。１つの態様において、培地は実質的に血清を含まない。

１つの観点において、ＤＮＡ配列は、活性化プロティンＣのＬ鎖とＨ鎖との間に、アミノ酸配列Ｒ，−Ｒ，−Ｒ，−Ｒ４Ｘ　Ｒ５Ｒ，６Ｒ？　Ｒ８（ここで個々のＲ８−Ｒ６は、リシン又はアルギニンであり、そしてＸは１〜１２個のアミノ酸のペプチド結合又はスペーサーペプチドである）をさらにコードする。

もう１つの観点において、ＤＮＡ配列は、活性化プロティンＣのＬ鎖とＨ鎖との間にアミノ酸配列、（Ｒ，）ｎ　−Ｒ２−Ｒ，−Ｒ，（ここで個々のＲ，、、Ｒ，、Ｒ，及びＲ４はＬｙ　３又はＡｒｇであり、そしてｎは０，１．２又は３である）をさらにコードする。

さらにもう１つの観点において、細胞は、サッカロマイセンスフエクトされる。

本発明の他の観点は、次の詳細な説明及び図面から明らかになるであろう。

図面の簡単な説明第１図は、完全なヒトプロティンＣのｃＤＮＡのヌクレオチド配列及びプロティンＣの推定されるアミノ酸配列を示す。

矢印は、連結するジペプチド及び活性化ペプチドの除去のための切断部位を示す。

第２図は、プロティンＣ発現ベクターｐ５９４を示す。使用される記号は、０− １．すなわち複製のアデノウィルス５起点；Ｅ、すなわちＳ　Ｖ　４．０エンハンサ−、ＭＬＰ、すなわちアデノウィルスの２つの後期プロモーター；　Ｌ　１ −３．すなわちアデノウィルス２トリバーテイト（３分節系）リーダ；　５　’ 　＋　すなわち５′スプライス部位；３′、すなわち３′スプライス部位；ｐ（Ａ）、すなわちポリアデニル化シグナルである。

第３図は、）−セレビシアエ　ＫＥＸ２遺伝子を含むプラスミドの構成を示す。

第４図は、血清の存在（レーン５〜７）又は不在（レーン９〜１１）下で増殖された細胞からの組換え活性化プロティンＣのゲル電気泳動を示す。レーン２ば、分子量マーカーである。

第５図は、プラスミドｐＺＭＢ−１及びｐＺＭＢ−２を示す。使用される記号は、ｎｅｏ、すなわちネオマイシン耐性遺伝子；ＳＶｔｅｒｍ、　すなわちＳＶ４０ターミネータ−；ＳＶ４０ｐｒｏｍ、すなわちＳＶ４０プロモーターである。

他の記号は第２図におけるように使用される。

第６図は、プラスミドｐＰｃ１６４５／２２９Ｒの構成を示す。ＤＨＦＲは、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子を示し；ＭＴ−１はマウスメタロチオネイン−１プロモータを示す。

他の記号は、第２及び５図におけるようにして使用される。

日を　するだめの　のし本発明を示す前、この後に使用される一定の用語の定義を示すことが、その理解を助けるであろう。

生惣ヱカ造性：生物学的環境（すなわち生物又はその不ｌビトロ　ファクシミル）において分子により行なわれる機能又は機能の組。タンパク質の生物学的活性は、触媒的及びエフェクター活性に分けられ得る。ビタミンに依存性血漿タンパク質の触媒活性は一般的に、基質の活性化又は不活性化をもたらす、他の血漿タンパク質の特異的タンパク質加水分解性切断を包含する。エフェクター活性は、カルシウム、リン脂質又は他の小さな分子、高分子、たとえばタンパク質、又は細胞への生物学的活性の分子の特異的結合を包含する。エフェクター活性は、時々、生理学的条件下で触媒活性を増強し、又はそのために不可欠である。

活性化されたプロティンＣに関して、生物学的活性は、その抗凝集性質により特徴づけられる。活性化されたプロティンＣは、酸性リン脂質及びカルシウムの存在下で第Ｖａ因子及び第■ａ因子を不活性化する。プロティンＳは、この機能の調節に包含されると思われる（Ｗａｌｋｅｒ、前記）。活性化プロティンＣの触媒活性は、Ｈ鎖にある。

ｍ二二中でも、プロモーター及びタンパク質の発現を促進する他の配列と共に、対称のタンパク質をコードするＤＮＡ配列（文はそのような配列のための挿入部位）を含むＤＮＡ分子。発現ベクターは、自律複製により又は宿主ゲノム中への組込みにより、宿主細胞におけるそれらの複製を提供する遺伝子情報をさらに含む。組換えＤＮＡのために通常使用される発現ベクターの例は、プラスミド及び一定のウィルスであり、但しそれらは両者の要素を含むことができる。

それらはまた、選択可能なマーカを含むことができる。

−してトランスフェクトされる：内因性ＤＮＡが細胞中に導入され、そしてその細胞がその内因性ＤＮＡを発現し、そしてそれらの子孫にそれらをバスすることができる条件。

安定トランスフェクションは一般的に、細胞を選択可能なマーカー（たとえば薬物耐性遺伝子）によりトランスフェクトし、そして選択的な圧力を適用することによって達成される。

安定してトランスフェクトされた細胞の集団（単一のトランスフェクトされた前駆体細胞に起因する）は、クローン的に同一である。外因性ＤＮＡは安定してトランスフェクトされた細胞の染色体中に組込まれ、又は染色体外で維持され得る。

対照的に、外因性ＤＮＡを一時的に発現する細胞は、そのＤＮＡを摂取しなかった細胞及びそれらの子孫にＤＮＡをバスすることができない細胞を含む混合された集団である。

本発明は、γ−カルボキシレート化され、そしてタンパク質を発現するためにトランスフェクトされた培養哺乳類細胞の使用を通して活性化プロティンＣの生物学的活性を有するタンパク質の製造方法を提供する。細胞は、活性化プロティンＣをコードするＤＮＡ配列に操作可能的に結合されるプロモーターを含んで成る発現ベクターによりトランスフェクトされる。トランスフェクトされた細胞は、最少量の血清を含み又は実質的に血清を含まないように調製された培地で培養され、そして活性化プロティンＣはその培地から単離される。

ヒトプロティンＣをコードするクローン化されたＤＮＡ配列は記載されている（Ｆｏｓｔｅｒ　ａｎｄ　Ｄａｖｉｅ、　Ｐｒｏｃ−Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓカ特許第４．７７５，６２４号）。ウシプロティンＣをコードするＣＤＮＡは、Ｌｏｎｇなど、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、１ＪＳＡ　□ξ１１　：　５６５３〜５６５６．１９８４により記載されている。一般的に、ｃＤＮＡ配列は、ＲＮＡプロセッシング及び減じられた発現レベルを回避するように誘導することができる介在配列の欠失により、本発明内での使用のために好ましい。プロティンＣをコードする相補的ＤＮＡは、標準の実験工程に従って肝臓細胞から調製されたライブラリーから得られる。しかしながら、適切なりＮＡ配列はまた、ゲノムクコーンから得られ又は従来の方法に従って始めから合成され得ることが理解されるであろう。一部のクローンが得られる場合、エンドヌクレアーゼ切断、連結及びルーブーアウト変異誘発のような技法を用いて、十分な長さのクローンを生成するために、読み枠を整合してそれらを連結することが必要である。

活性化プロティンＣを調製するために、クローン化されたＤＮＡ配列が変性され、活性化ペプチドをコードする部分が欠失され又は置換される。得られるＤＮＡ配列は、プレープロペプチド、プロティンＣのＬ鎖、プロセッシング部位及び活性化プロティンＣのＨｇをコードするであろう。ＤＮＡ配列は、Ｌ鎖とＨ鎖との間にスペーサーペプチドをさらにコードすることができる。１つの態様において、得られる配列は配列Ｌｙｓ−Ａｒｇにより連結されるプロティンＣのＬ及びＨ鎖をコードするであろう。本明細書に使用される場合、活性化プロティンＣのＬ鎖は、第１図に開示される配列又はそれに実質的に相同の配列、又はＣ−末端延長を有するそのような配列のアミノ酸１〜１４９を含むことが理解される。活性化プロティンＣのＨ鎖は、活性化ペプチドを含まない（すなわち第１図に示されるように、アミノ酸番号１７０でのロイシンから始まる）、二とが理解される。

好ましい態様において、ＤＮＡ配列は、Ｌ鎖とＨ鎖との間に新規切断部位を含むようにさらに変性される。切断部位は、アミノ酸配列（Ｒ１）、−Ｒ２−Ｒ，− Ｒ，（ここでＲ１−Ｒ４はリシン（Ｌｙｓ）又はアルギニン−ｅＡｒｇ）であり、そしてｎは０〜３の整数である）の形で存在することができる。特に好ましい配列は、Ａｒ　ｇ−Ａｒ　ｇ−Ｌｙ　５−Ａｒ　ｇ、Ｌｙ　Ｓ＝Ａ、、ｒ　ｇ− Ｌｙ　ｓ−Ａｒｇ及びＬｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇを包含する。他方、切断部位は、Ｒ１Ｒｚ　Ｒ３Ｒ４Ｘ　Ｒｓ　Ｒｂ　Ｒ？−Ｒ８（ここで個々のＲ，−Ｒ，はＬｙｓ又はＡｒｇであり、そしてＸは１〜１２個のアミノ酸のペプチド結合又はスペーサーペプチドである）の形のものであり得る。ここで有用なスペーサーペプチドは、アミノ酸配列Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｃ１ｕ−Ａｓ　ｐ　−Ｇ　ｌ　ｎ−Ｇ　１　ｎ−Ａｓ　ｐ−Ｇ　１　ｎ　−Ｖａ　ｌ　−Ａｓｐ−Ｐｒｏ、Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｉｎ　−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｉｎ、Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａ、ｓｐ−Ｇｉｎ。

Ａｓｐ−Ｇｉｎ、Ａｓｎ−１１ｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ、及びアミノ酸配列Ａｓｐ− Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−〇１ｎ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｃ；Ｉｎ−Ｖａ　ｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇを有する天然のプロティンＣ活性化ペプチドを包含する。切断部位変性の第３グループは、Ｌｙａ、Ａｒｇ及びＬｅｕから成る群から選択されたアミノ酸残基と天然のプロティンＣのアミノ酸残基１５４（Ｈｉｓ）との置換を包含し、一般式Ｙ−Ｚ−Ｒ，−Ｒ２（ここでＹはＬｙｓ、Ａｒｇ又はＬｅｕであり；Ｒ３及びＲ２はＬｙｓ又はＡｒｇであり；そしてＺはＬｙＳ又はＡｒｇ以外のアミノ酸、好ましくはＬｅｕであるンで表わされるプロセッシング部位配列を付与する。

ＤＮＡ配列の変性は、部位特異的変異誘発により得られる。

部位特異的変異誘発の技法は、当業界において良く知られており、そしてたとえばＺｕｌｌｅｒ　ａｎｄ　Ｓｍ１ｔｈ（用虹　３：４７９〜４８８．１９８４）により記載されているう他方、野生型プロティンＣ配列は、天然の活性化ペプチド配列、及び前記切断部位の１つを含む合成された活性化ペプチドに連結されるＨ鎖及びＬ鎖もコードする配列を除去するために酵素的に切断され得る。

当業界により理解されるように、本発明の方法はまた、活性化プロティンＣの変異体及び相同体を生成するためにも使用され得る。活性化プロティンＣの変異体及び相同体は、少々のアミノ酸変化を含むもの、たとえば遺伝的多型現象によるもの、及びアミノ酸がタンパク質の生物学的活性を実質的に変えないで付加され、欠失され、又は置換されているものを包含する。活性化プロティンＣ相同体は、ビタミンに一依存性血漿タンパク質第■因子、第１Ｘ因子、第Ｘ因子、プロトロンビン又はプロティンＳの１つのｇｌａｌミドメインり置換されたプロティンＣアミノ末端部分（ｇｌａｌミドメイン有するタンパク質をさらに包含する。

上記のように、本発明内に使用するためのＤＮＡ配列は、適切な後翻訳プロセッシング（たとえばグルタミン酸残基のγ−カルボキシル化）及び宿主細胞からの分泌を得るために、活性化プロティンＣ前駆体のアミノ末端でプレープロペプチドをコードするであろう。プレープロペプチドは、プロティンＣ又は他のビタミンに一依存性血漿タンパク質、たとえば第■因子、第１Ｘ因子、第Ｘ因子、プロトロンビン又はプロティンＳのペプチドであり得る。

次に、活性化プロティンＣをコードするＤＮＡ配列は、培養された哺乳類細胞をトランスフェクトするために使用される、適切な発現ベクター中に挿入される。

本発明の実施に使用するだめの発現ベクターは、クローン化された遺伝子又はｃＤＮＡの転写を方向づけることができるプロモーターを含むであろう。好ましいプロモーターは、ウィルスプロモーター及び細胞プロモーターを含む。ウィルスプロモーターは、ＳＶ４０プロモーター（Ｓａｂｒａｍａｎｉなど、、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ。

１　：　８５３〜８６４．１９８１）及びＣＭＶプロモーター（Ｂｏｓｈａｒｔなど、、釦旦　４１：５２１〜５３０．１９８５）を包含する。特に好ましいウィルスプロモーターは、アデノウィルス２からの主な後期プロモーターである（Ｋａｕｆｍａｎ　ａｎｄ　５ｈａｒｐ、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏ。

２　：　１３０４〜１３１９９．１９８２）。細胞プロモーターは、マウスカッパ遺伝子プロモーター（Ｂｅｒｇｍａｎなと、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵｓＡ　８］、　：　７０４１〜７０４５．１９８３）及びマウスＶ、プロモーター（Ｌｏｈなど、、領置　３３　：　８５〜９３．１９８３）を包含する。特に好ましい細胞プロモーターはメタロチオネイン−Ｉプロモーターである（Ｐａｌｎ＋ｉ　ｔｅｒなど、、５ｃｉｅｎｃ−ｐ　２２２　：　８０９〜８１４、１９８３）。発現ベクターはまた、プロモーターの下流に及び活性化プロティンＣ配列のための挿入部位の上流に又は活性化プロティンＣ配列自体内に位置する一組のＲＮＡスプライス部位を含むことができる。好ましいＲＮＡスプライス部位は、アデノウィルス及び／又は免疫グロブリン遺伝子から得られる。

その挿入部位の下流に位置するポリアデニル化シグナルは、また発現ベクターに含まれる。特に好ましいポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０からの前記又は後期ポリアデニル化シグナル（Ｋａｕｆｍａｎ　ａｎｄ　５ｈａｒｐ、前記）、アテノウィルス５２１ｂ領域又はヒト成長ホルモン遺伝子ターミネータ−からのポリアデニル化シグナル（ＤｅＮｏｔ。

など、Ｎａｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、９　：３７１９〜３７３０．１９８１）を包含する。

発現ベクターはまた、プロモーターとＲＮＡスプライス部位との間に位置する非コート′ウィルスリーダー配列、たとえばアデノウィルス２トリパーテイトリ〒ダー；及びエンハンサ−配列、たとえばＳＶ４０エンハンサ−及びアデノウィルスＶＡＲＮＡをコー　ドする配列を含むことができる。

クローン化されたＤＮＡ配列は、たとえばリン酸カルシウム介在のトランスフェクション（會１ｇ１ｅｒなど、、Ｃｅ１ｌ　１４−ニア２５〜７３２＋　１９７８　ｉ　Ｃｏｒｓａｒｏ　ａｎｄ　Ｐｅａｒｓｏｎ、　Ｓｏｍａｔｉｃ　Ｃｅ１ｌ　Ｇｅ培養された哺乳類細胞中に導入される。外因性ＤＮＡを発現型を付与する遺伝子（選択可能マーカー）が一般的に、対称の遺伝子又はｃＤＮＡと共に細胞中に導入される。好ましい選択可能マーカーは、薬物、たとえばネオマイシン、ヒグロマイシン及びメトトレキセートに対して耐性を付与する遺伝子を含む。

選択可能マーカーは、増幅できる選択可能マーカーであり得る。好ましい増幅できる選択可能マーカーは、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）配列である。

特に好ましい増幅可能マーカーは、Ｄ　ＨＦ　Ｒ’　ｃ　Ｄ　ＮＡ　（Ｓｉｍｏｎｓｅｎ　ａｎｄ　Ｌｅｖｉｎｓｏｎ、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、口ＳＡ　８０　：　２４９５〜２４９９゜１９８３）である。選択可能マーカーは、Ｔ　ｈ　ｉ　Ｉ　Ｌ　ｙ　（Ｍａｍｓａｌｉａｎ　Ｃｅ１ｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏ　、　Ｂｕｔｔｅｒｓｏｒｔｈ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、　Ｓｔａｎｅｈａｍ。

旧）により再調査されており、そして選択可能マーカーの選択は、当業者の熟練のレベル以内にある。

適切なマーカーは、対称の遺伝子と同時に、別々のプラスミドに基づいて細胞中に導入され得、又はそれらは同じプラスミド上に導入され得る。同じプラスミド上に、選択可能マーカー及び対称の遺伝子が異なったプロモーター又は同じプロモーターの制御下で存在する場合、後者の配置は、ジシストロン性メツセージを生成する。このタイプの構造体は当業界において知られている（たとえば、Ｌｅｖｉｎｓｏｎ　ａｎｄ　Ｓｉｍｏｎｓｅｎ、アメリカ特許第４，７１３，３３９号）。細胞中に導入される混合物に、″キャリヤーＤ　Ｎ　Ａ　”として知られてる追加のＤＮＡを添加することがまた好都合である。

細胞がＤＮＡを摂取した後、それらは、対称の遺伝子の発現を開始するために、適切な増殖培地中で典型的には１〜２日間、増殖せしめられる。本明細書に使用される場合、用語″′適切な増殖培地“″とば、栄養物及び細胞の増殖のために必要とされる他の成分を含む培地を意味する。培地は一般的に、炭素源、必須アミノ酸、必須糖、ビタミン、塩、リン脂質、タンパク譬及び成長因子を含む。次に、薬物選択が適用され、選択可能マーカーを適切な態様で発現する細胞の増殖が選択される。増幅可能な選択可能マーカーによりトランスフェクトされた細胞のためには、薬物濃度が、クローン化された配列の高められたコピー数を選択するために段階的な態様で高められ、それによって発現レベルが高められる。次に、安定してトランスフェクトされた細胞のクローンが、活性化プロティンＣの発現のためにスクリーンされる。

本発明に使用するための好ましい哺乳類細胞系は、ＣＯ３−１（ＡＴＣＣＧＲＬ　１６５０）、ＢＨＫ及び２９３（ＡＴＣＣＣＲＬ　１５７３　；　Ｇｒａｈａｍなど、、Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、３６　：　５９〜７２゜１．９７７）細胞系を包含する。好ましいＢＨＫ細胞系は、ｔｋ−ｔ　ｓ　１３ＢＨＫ細胞系（Ｗａｅｃｈｔｅｒ　ａｎｄ　Ｂａｓｅｒｇａ、＋　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、［ＪＳＡ　７９　：　１１０６〜１１１０．１９８）である。さらに、多くの他の細胞系、たとえばＲａｔ　Ｈｅｐ　Ｉ　（ＡＴＣＣＣＲＬ　１６００）、　ＲａｔＨｅｐＨ（ＡＴＣＣＣＲＬ　１５４８）、　ＴＣＭに（ＡＴＣＣＣＣＬ　１３９）、ヒト肺（八ＴＣＣＣＣＬ　７５．１）、ヒト肝癌（ＡＴＣＣＨＴＢ−５２）、　Ｈｅｐ　Ｇ２　（ＡＴＣＣＨＢ　８０６５）、　ＮＣＴＣ１４６９（ＡＴＣＣＣＣＬ　９．１．）及びＤＵＫＸ細胞（Ｕｒｌａｕｂａｎｄ　Ｃｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳ　７７　：　４２１６〜４２２０゜１９８０）が本発明内で使用され得る。

Ｌ鎖とＨ鎖との間のＬｙｓ−Ａｒｇジペプチドの後の切断による活性化プロティンＣ前駆体のプロセッシングは、Σ−−セレビシアエ　ＫＥＸ２遺伝子を宿主細胞中に導入することによって増強され得る。そのＫＥＸ２遺伝子は、二塩基性アミノ酸配列の後を切断するエンドペプチダーゼをコードする（Ｆａｌｌｅｒなど −＋　Ｌｅｖ＋ｅ出版者、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ　：　１９８６．　２７３〜２７８、１９８０）。従って、この遺伝子により安定してトランスフェクトされた培養哺乳類細胞系は、活性化プロティンＣを発現するために有用である。

好ましい態様において、活性化プロティンＣを発現するために安定してトランスフェクトされた哺乳類細胞が、血清含有培地（たとえば約１％〜約１０％の血清を含む培地）中で、ある期間、好ましくは集密度まで増殖され、次にＯ，１％以下の血清を含むように配合された培地に移される。本発明者は、培地からの血清の低下又は排除が安定してトランスフェクトされた細胞からの活性化プロティンＣの収率を高めることを発見した。種々の血清不含細胞培養培地が当業界において知られている（たとえば、Ｂａｒｎｅｓ　ａｎｄ　５ａｔｏ、Ｇｅｎ　荏：６４９〜６５６．１９８０　；Ｂａｒｎｅｓ、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉ　ｕｅｓ　５　：　５３４〜５４２、１９８７　；及びＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　Ｒｏｃｋｃｉｌｌｅ、　ＭＤのカタログを参照のこと）。培養培地はまた、多くの商業的供給者から入手できる。これに関する特に好ましい培養培地は、５０％ダルベツコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）、及び１酎のピルビン酸ナトリウム、２ｍＭのし一グルタミン、５０■／ｌのペニシリン、５０■／ｌのストレプトマイシン、１００■／１のネオマイシン、５ｍｇ／ｌのインシュリン、３ｘ／ｌのセレンｌＯ■／ｌのフェチュイン、２０■ ／１のトランスフェリン及び２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７，２）を含む５０％Ｈａｍ−Ｆ１２の混合物である。トランスフェリンは、ウシ血清アルブミン（Ｉｇ／ｌ）又は肉加水分解物（たとえば、ＰｒｉｍａＬｏｎｅ　ｐｔ、ｏ　、　５ｈｅｆｆｉｅｌｄ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、　Ｎｏｒｗｉｃｈ、ＮＹ　；２．５ｇ／Ｉ）により交換され得る。培地はまた、血清、好ましくはウシ胎児血清を０．１％まで含むことができる。好ましくは、培養培地はまた、γ−カルボキシグルタミン酸残基の形成を促進するためにビタミンＫを含む。５ｎｇ／ｄ〜５■ ／ｄの範囲でのビタミンにの濃度が十分であり、され、この間、培地は収穫され、そして活性化プロティンＣが単離される。次に細胞は、高レベルの血清を含む培地に戻され、そして増殖の再開を可能にされる。当業者により認識されるように、細胞は初め、血清を含まない培地で又は続いて血清の存在下で増殖せしめられる。

細胞は、一般的に当業界で使用される条件下で培養される。

これに関しては、好ましくは、細胞は、約６．８〜８．０、好ましくは約７．２のｐＨを維持する条件で、３６°Ｃ〜４０　’Ｃで培養される。そのｐＨは、当業界において知られている種々の緩衝液系の使用を通して維持され得る。好ましい緩衝液系は、ＣＯ□、好ましくは約−５％のＣＯ２を含む湿潤されたインキュベーター中において、炭酸水素緩衝液での細胞の培養を包含する。

本発明に従って生成された活性化プロティンＣは、抗−プロチインＣ抗体カラム上でのアフィニティークロマトグラフｒａ、２６）　：　１１０９７〜１１１０８．１９８６）ニよす記載サレテいルヨウにカルシウム依存性モノクローナル抗体の使用が特に好ましい。追加の精製が、従来の化学的精製手段、たとえば高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により達成され得る。

クエン酸バリウム沈殿を包含する精製の他の方法は、当業界において知られており、そして組換え活性化プロティンＣの精製に適用され得る。

本発明に従って生成された活性化プロティンＣは、一般的に、生理学的に許容できるキャリヤー又は希釈剤と組合して、局部的又は静脈内適用のための医薬組成物に使用され得る。

好ましいキャリヤー及び希釈剤は、塩溶液及び殺菌水を包含する。医薬組成物はまた、安定剤及びアジュバントも含むことができる。得られる水溶液は、使用のためにパッケージされ、又は無菌条件下で濾過され、そして凍結乾燥せしめられ、前記凍結乾燥された調製物は、投与の前、無菌水溶液と共に混合される。

次の例は、例示的であって、本発明を制限するものではない。

促制限エンドヌクレアーゼ及び他のＤＮＡ変性酵素（たとえばＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ、ウシアルカリホスファターゼ、ＤＮＡポリマラーター　（フレノウフラグメント）、Ｔ４ポリヌクレオチドリガーゼ）を、Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　（ＢＲＬ）及びＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　がら得、そして特にことわらない限り、製造業者により指図されるようにして使用した。

オリゴヌクレオチドを、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔ。

ｅｍｓ　Ｍｏｄｅｌ　３８０Ａ　ＤＮＡ合成機上で合成し、そして変性ゲル上でのポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した。Ｅ、コリ細胞を、Ｍａｎｉａｔｉｓなど、（封止ｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：　Ａ　ｔ、ａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ　＋　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｂ。

ｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　１９８２）により記載されているようにして形質転換した。Ｍ２Ｓ及びｐＵＳクローニングベクター及び宿主菌株を、ＢＲＬから得た。

勇−上ヒトプロティンＣをコードするＤＮＡ配置のクローニングヒトプロティンＣの一部をコードするｃＤＮＡを、Ｆｏｓｔｅｒ　ａｎｄ　Ｄａｖｉｅ（前記）により記載されているようにして調製した。簡単に言えば、λｇｔｌｌｃＤＮＡライブラリーを、従来の方法によりヒト肝臓ｍＲＮＡから調製した。クローンを、　＋２５１　３ラベルされたアフィニティー精製された、ヒトプロティンＣに対する抗体を用いてスクリーンし、そしてファージを、プレート溶解方法（Ｍａｎｉａｔｉｓなど、、　前記）により陰性クローンから調製し、続いて塩化セシウムグラジェントにゆだねた。ｃＤＮＡ挿入物を、ＥＣＯＲＩを用いて除去し、そしてプラスミドｐＵｃ９（Ｖｉｅｉｒａ　ａｎｄ　Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｇｅｎｅ　１９：　２５９〜２６８．１９８２）中にサブクローンした。制限フラグメントを、ファージベクターＭ１３ａ＋ｐｌＯ及びＭ　１３ｍｐｌ　ｌ　（Ｍｅｓｓｉｎ　、　Ｍｅｔｈ、ｉｎ　Ｅｎｚｌ状筺Ｌ１０１　：２０〜７７、１９８３）にサブクローンし、そしてジデオキシ方法（Ｓａｎｇｅｒなど、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７４　：　５４６３〜５４６７、１９７７）により配列決定した。ヒトプロティンＣの既知の一部の配列に対応するＤＮＡを含み（Ｋｉｓｉｅｌ、前記、１９７９）、そしてＬ鎖のアミノ酸６４で始まり、そしてＨ鎖を通して、そして３′非コード領域に延長するプロティンＣをコードしたクローンを選択した。このクローンをλＨＣ１３７５と命名した。アミノ酸２４からのプロティンＣをコードする第２ｃＤＮＡをまた同定した。大きなりローンからの挿入物をｐＵＣＱ中にサブクローンし、そしてそのプラスミドをｐＨＣ λ６Ｌとして命名した。このクローンは、プロティンＣの主要部分、たとえばＨ鎖コード領域、終結コドン及び３′非−コード領域をコードする。

λＨ（１３７５からのｃＤＮＡ挿入物を、ｒｘ−”ＰｄＮＴＰを用いてニックトランスレーシゴンし、そしてＷＯ２（顆すエ如」弧が１．６８：３８１〜３９５．１９７９）により変性されたようなりｅｎｔｏｎ　ａｎｃｌ　Ｄａｖｉｓ　（Ｓｃｉｅｎｃｅ　１５６　：　１８１〜１８２．１９７７）のプラークハイプリダイゼーシゴン方法を用いて、ファージλＣｈ　ａ　ｒ　ｏ　ｎ　４　Ａ　（Ｍａｎｉａｔｉｓなど、、１旦　１５：　６８７〜７０２゜１９７８）におけるヒトゲノムライブラリーをプローブするために使用した。陽性クローンを単離し、そしてプラーク精製した（Ｆｏｓｔｅｒなど＋Ｉ　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃｏｄ、Ｓｃｉ、、ＵＳＡ　８２：４６７３〜４６７７、１９８５．引用により本明細書に組込まれる）。陽性クローンから調製されたファージＤＮＡ　（Ｓｉｌｈａｖｙなど、１　ハヒ頁ｍｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　Ｇｅｎｅ　Ｆｕｓｉｏｎ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ。

１９８４）をＥｃｏＲＩ又はＢａ１Ｉ［により消化し、そしテソノゲノム挿入体を精製し、そしてｐＵＣ９にサブクローンした。

そのゲノム挿入体の制限フラグメントをＭ１３ベクター中にザブクローンし、そしてそれらの正体を確認し、そして全体の遺伝子のＤＮＡ配列を確立するために配列決定した。

ｐＨＣλ６ＬのｃＤＮＡ挿入体をニックトランスレーションし１そしてファージ λＣｈ　ａ　ｒ　ｏ　ｎ　４．　Ａライブラリーをプローブするために使用した。ｃＤＮＡの５′及び３′末端がら製造されるプローブにハイブリダイズした１つのゲノムクローンを同定した。このファージクローンをＥｃｏＲＩにより消化し、そしてプロティンＣ遺伝子の５′末端に対応する４、４ｋｂのフラグメントをＰＵＣ中にサブクローンした。得られる組換えプラスミドをｐＨｃＲ４，４として命名した。

完全なりＮＡ配列の分析は、ｐＨＣＲ４，４における挿入体が１２６３ｂｐのイントロンにより分離される７０及び１６７個の塩基対の２つのエキソンを含むことを示した。第１エキソンはアミノ酸−４２〜−１９をコードし２第２エキソンはアミノ酸−１９〜３７をコードする。配列分析は、全プロティンＣ遺伝子のＤＮＡ配列を確証した。

プロティンＣのプレープロペプチドのアミノ酸〜４２〜−１９に対応するエキソンを含むゲノムフラグメントを単離し、ニックトランスレーションし、そしてＨｅｐＧ２細胞からのｍＲＮＡを用いて、Ｇｕｂｌｅｒ　ａｎｄ　Ｈｏｆ　ｆｍａｎＣＧｅｎｅ　２５　：　２６３〜２６９．１９８３）の技法により構成されたｃＤＮＡライブラリーをスクリーンするためにプローブとして使用した。この細胞系は、ヒト肝細胞に由来し、そしてプロティンＣを合成することがこれまで示されている（Ｆａｉｒ　ａｎｄ　Ｂａｈｎａｋ、　Ｂｌｏｏｄ　６４　：　１９４〜２０４．１９８４）。ファージλｇｔｌｌのＥｃ　ｏＲ１部位中に挿入されたｃＤＮＡを含んで成る１０個の陽性クローンを単離し、そしてプロティンＣ遺伝子の５′非−コー・ド領域に対応するオリゴヌクレオチドプローブによりスクリーンした。１つのクローンがまた、このプローブに対して陽性であり、そしてその全体のヌクレオチド配列を決定した。そのｃ’　Ｄ　Ｎ　Ａは、７０ｂｐの５′未翻訳配列、ヒトプレープロープロティンＣのための全コード配列及び第２ポリアデニル化部位に対応する全３′非−コード領域を含んだ。

ｃＤＮＡ配列及び推定されるアミノ酸配列が第１図に示される。

プロティンＣをコードするｃＤＮＡ配列を、部位特異的変異誘発により変性し、活性化ペプチドをコードする部分を欠失せしめた。８２９として命名される、コードされたＡＰＣ前駆体のし鎖とＨ鎖との間の連結部のアミノ酸配列が、第１表に示される。次に、変性された配列を、ｔｋ−ｔｓｌ、３ＢＨＫ及び２９３細胞中にトランスフェクトし、そして安定してトランスフェクトされた細胞をスクリーンした。活性プロティンＣを、両細胞系からの培養培地サンプルに検出した。

玉上表一＠立′・　のアミノ　配置９ｉＴ ε−Ｋ　−に−Ｒ−５−Ｈ−Ｌ−Ｋ−Ｒ−Ｄ−Ｔ−Ｅ−Ｄ−ＣＩ−ε−Ｄ−Ｑ− Ｖ−Ｄ−Ｐ−Ｒ−ＬＡ−Ｄ−Ｅ−に−Ｋ−Ｒ−Ｓ−Ｈ−Ｌ−Ｋ−Ｒ−Ｌ−１−Ｄ −犯没Ｅ−に−、Ｋ−Ｒ−５−１１−Ｌ−Ｒ−Ｒ−Ｘ−Ｒ−Ｄ−Ｔ−Ｅ−Ｄ−Ｑ−Ｅ− Ｄ−Ｑ−Ｖ−Ｄ−Ｐ−Ｒ−Ｌ−Ｉ−Ｄ−Ｕ兆Ｅ−に−Ｋ−Ｒ−５−Ｈ−Ｌ−Ｒ−Ｒ−に−Ｒ−Ｌ−Ｉ−Ｄ−■旦Ｅ−に−Ｋ−Ｒ−Ｓ−Ｈ−Ｌ−Ｒ−Ｒ−に−Ｒ−Ｄ−Ｔ−Ｅ−Ｄ−Ｑ−Ｅ−Ｄ− Ｑ−Ｒ−Ｒ−に−Ｒ−Ｌ−１−Ｄ−Ｅ−に−Ｋ−Ｒ−Ｓ−Ｈ−Ｌ−Ｒ−Ｒ−に− Ｒ−Ｄ−Ｔ−Ｄ−（１−Ｒ−Ｒ−に−Ｒ−Ｌ−１−Ｄ−■屓Ｅ−に−Ｋ−Ｒ−５−Ｈ−Ｌ−Ｒ−Ｒ−に−Ｒ−Ｒ−Ｒ−に−Ｒ−Ｌｌ−Ｄ−Ｅ −に−Ｋ−Ｒ−５−Ｈ−Ｌ−Ｒ−Ｒ−に−Ｒ−Ｄ−Ｑ−Ｒ−Ｒ４−Ｒ−Ｌ−Ｉ− Ｄ−Ｅ−に−Ｋ−Ｒ−Ｌｌ−Ｄ− 刈りＥ−に−Ｒ−に−Ｒ−Ｌｌ−Ｄ− プロティンＣのｃＤＮＡを、ＥｃｏＲＩフラグメントとして単離し、そして公開されたヨーロッパ特許出願ＥＰ２６６゜１９０に開示されているようにしてベクターｐＤＸ中にクローン化した。組換えプラスミドを、制限分析によりスクリーンし、プロモーター要素に関して正しい配向でプロティンＣ挿入体を有するものを同定し、そしてプラスミドＤＮＡ　（ＰＤＸ／ＰＣとして命名された）を、正しいクローンから調製した。ｐＤＸ／ＰＣにおけるｃＤＮＡ挿入体は、５′非− コード領域におけるＡＴＧコドンを含むので（第１図を参照のこと）、特定オリゴヌクレオチド欠失変異誘発を、３個の塩基対を除去するためにｃＤＮＡに対して行なった。ｐ５９４として命名される得られたベクターは、アデノウィルス２主要後期プロモーターに操作可能的に結合されたプロティンＣｃＤＮＡを含む（第２図）。このベクターはまた、複製のアデノウィルス５′起点（０−１地図単位配列）、ＳＶ４０エンハンサ−、アデノウィルス２トリバーテイトリーダー、 −組のＲＮＡスプライス部位、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル及び選択可能マーカーとしてのジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子を含む。

活性化ペプチドをコードする配列を欠失するために、プラスミドＰ５９４を５ｓｔＩにより消化し、そして約８８０ｂｐのフラグメントを精製し、そしてＭ　１３　ｍｐ　１０　（Ｍｅｓｓｉｎｇ。

ル１煩匹↓１ユ１σ３朝−１削Ｌ：２０〜７８．１９８３）の５ｓｔＩ部位中に挿入した。１２個の活性化ペプチドコドンを、変異性オリゴヌクレオチドＺＣ８２９（５’　ＣＴＧ　ＡＡＡ　ＣＧＡＣＴＣＡＴＴ　ＣＡＴ　３１を用いて、特定オリゴヌクレオチド欠失変異誘発（Ｚｏｌｌｅｒ　ａｎｄ　Ｓｍ１ｔｈ、　ＤＮＡ　＋　３　：　４７９〜４８８．１９８４）により欠失せしめた。複製形ＤＮＡを変異体ファージクローンから調製し、そして５ｓｔＩにより消化した。

プロティンＣフラグメント（約８４０ｂｐ）を単離し、そして５ｓｔｌ−消化されたｐ５９４中に挿入した。得られたプラスミドを、ＢｇｌＩＩを用いての制限地図により、５ｓｔＩフラグメントの正しい配向についてスクリーンした。正しいプラスミドを選択し、そしてｐＰＣ８２９として命名した。プラスミドｐ　ＰＣ８２９をスクリーンし、所望するコード配列の存在を確証した。

プラスミドｐＰＣ８２９を、リン酸カルシウム同時沈殿法（Ｇｒａｈａｍ　ａｎｄ　Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｈ、亘μ壮邦ＪＬ５２　：　４５６〜４６７、１９７８）により、ｔｋ−ｔｓ１３ＢＨＫ細胞（プラスミドｐＳＶＤＨＦＲＴ（Ｌｅｅなと、、Ｎａｔｕｒｅ　２９４　：　２２８〜２３２．１９８２）を含む〕及び２９３細胞（ｐＫｏ−ｎｅｏを含む）中に同時トランスフェクトした。４８時間後、培養培地を収穫し、そしてｃＤＮＡクローン及び／又はプロティンＣのＨ鎖に対して向けられたモノクローナル抗体の初期同定に使用されるアフィニティー精製されたポリクローナル抗体を用いて、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）によりプロティンＣについてアッセイした。アフィニティー精製されたヒトプロティンＣに対する抗体（０゜ＩＭのＮａｚ　Ｃｏａｌ　（ｐＨ９゜６）において１００■／−〕を、９６−ウェルマイクロタイタープレートの個々のウェルに添加し、そしてプレートを４°Ｃで一晩インキユベートした。ウェルを、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（５ｎ＋Ｍのリン酸塩塑衝液、ｐＨ７゜５．０．１５ＭのＮａＣ１）により渡洗浄し、未結合抗体を除去し、そして１％のウシ血清アルブミン、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０のＰ　Ｂ　Ｓ　溶液１００Ｉと共に４°Ｃで一晩インキユベートした。プレートを、ＰＢＳにより数置すすぎ、空気乾燥せしめ、そして４”Ｃで貯蔵した。サンプルをアッセイするために、個々のサンプル１００ｐ１を、被覆されたウェルにおいて、３７°Ｃで１時間インキュベートし、そしてウェルをＰＢＳ中、０．０５％のＴｗｅｅｎ− ２０溶液によりすすいだ。次に、プレートを、１％ウシ血清アルブミン及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ中、プロティンＣ（３０ｎｇ／Ｉｌ！１りに対するビオチン−接合の羊ポリクローナル抗体と共に３７°Ｃで１時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳによりすすぎ、そして１％ウシ血清アルブミン及び０．０５％（ＤＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ中、アビジン接合のアルカリホスファターゼと共に３７°Ｃで１時間インキュベートした。

ウェルをＰＢＳによりすすぎ、そしてアルカリホスファターゼ活性を、ホスファターゼ基質（ＳｉｇｍａｌＯＯ；０．３ｍＭのＭｇＣｌ２を含む１０％のジェタノールアミン（ｐＨ９。

８）溶液中において６００ｘｒ／＋ｊり　１００ｔｄの添加により測定した。４０５ｎｍでの吸光度を、マイクロタイタープレートリーダー上で読み取った。結果は第２表に示される。同時に、培養物を、５００■／戚のＧ４１８（２９３細胞）又は２５０ｎＭのメトトレキセート（ｔｋ−ｔｓ　１３ＢＨＫ細胞）を含む培地中に１：５で分けた。

畢叉表２　ヒプロテインＣの−　・な　ＥＬＩＳＡ）ｌ］Ｌｉｉ　立上　のプロティンＣｎ　雁）ｔｋ−ｔｓ１３ＢＨＫ　２．　７選択培地の存在下で１０日間増殖した後、安定してトランスフェクトされたコロニーを、イムノフィルターアッセイ（ＭｃＣｒａｃｋｅｎ　ａｎｄ　Ｂｒｏｔｖｎ、　Ｂｉｏ　ハ１旦ｕ翌＋　８２〜８７＋　３月／４月、１９８４）により活性化プロティンＣ生成についてスクリーンした。プレートを、ＰＢＳ又は血清不含培地（ＤＭ　Ｅ　Ｍ　＋ＩＸＰＳＮ抗生物質混合物、５■／ｄのビタミンＫ）によりすすいだ。次に、Ｔｅｆｌｏｎ＠メツシュ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、　Ｌｏｓ　Ａｎｇｅｌｅｓ、　ＣＡ）を、細胞上に置いた。ニトロセルロースフィルターをＰＢＳ又は血清不合培地により適切に湿潤し、そしてメツシュ上に置いた。３７°Ｃでの４時間インキュベーションの後、フィルターを除き、そしてフィルター緩衝液（５０ｍＭのトリス、ｐＨ７，４，５ｎ＋ＭのＥＤＴＡ。

０．０５％のＮＤ−４０，１５０ｍＭのＮａＣ１，０，２５％のゼラチン）に室温で３０分間装いた。フィルターを、ビオチンによりラヘルされた羊抗−プロチインＣポリクローナル抗体（フィルター緩衝液においてｌ！！ｇ／ｄ）中において、振盪しながら室温で１時間インキュベートした。次にフィルターを同じ緩衝液により洗浄し、そしてアジピン接合のホースラディシュペルオキシダーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）（フィルター緩衝液によりｉ　：　１ｏｏｏに希釈されている）中において、振盪しながら室温で１時間インキュベートした。フィルターを５０１１ＩＭのトリス−ＨＣ１１ｐＨ７，４，５ｍＭのＥＤＴＡ、ＬＭのＮａＣ１，０，２５％のゼラチン、０．４％のサクロシル、０．０５％のＮＰ−４０、次に水により洗浄した。洗浄されたフィルターを、彩色試薬（６０■のＨＲＰ色進行試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、２０−のメタノール、５０ｍＭのトリス（ｐＨ７，４）１００ｄ中、Ｈ２０ｚｌＯＯＪｌ！、１．５０ｍＭのＮａＣ１）中でインキュベートした。その反応を、フィルターを水に移すことによって停止せしめた。

陽性コロニーを取り出し、そして選択培地（５０１ｔｇ／−のＧ４１８又は２５０ｎＭのメトトレキセートを適切に含む）中で１０日間増殖せしめた。培養培地を、クロモゲンアッセイによりＡＰＣ活性についてアッセイした。培地サンプルを、５０ｍＭのトリス（ｐＦ１７．５）中、０．２ｍＭの５ｐｅｃｔｒ。

ｚｙｍｅ　Ｐｃａ　（＾ｍｅｒｉｃａｎ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ　＃３３６）、１５０ｍＭのＮａＣ１の溶液１００Ｉ！１を含むマイクロタイターウェルに添加した。プレートを、３７°Ｃでインキュベートし、そしてＡ　４０　Ｓを種々の間隔で測定した。陽性の２９３細胞コロニーからの培地は、トランスフェクトされていない２９３細胞と共に同時期間（１０日）インキュベートされた対照培地の活性よりも高い活性を、ＡＰＣのためのクロモゲン基質により示した。

Ｂ、ｌシぐＰ−Ｃ↓０５Ｅロ生律底汲ユ○し阻切断部位配列Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇを有する活性化プロティンＣ前駆体をコードするＤＮＡ配列を、野生型プロティンＣ配列の変異誘発により構成した。得られた配列を１０５８として命名した。Ｌ鎖とＨ鎖との間の連結点でのこの前駆体のアミノ酸配列が第１表に示される。

プラスミドｐ５９４に存在するプロティンＣ配列を、１回の変異誘発で変性し、活性化ペプチドのためのコドンを欠失し、そしてプロセッシング部位でＡｒｇ− Ａｒｇコドンを挿入した。変異誘発は、Ｍ１３ｍｐＨ中にクローン化される、ｐ５９４からの８７０ｂｐの５ｓｔＩフラグメントに対して行なった。−末鎖鋳型ＤＮＡを単離し、そしてオリゴヌクレオチドＺＣ１０５８（５’ＣＧＣＡＣＴ　ＣＡＣＣＴＧＡＧＡ　ＡＧＡ　ＡＡＡ　ＣＧＡ　ＣＴＣＡＴＴ　ＧＡＴＧＧＧ　３’）及びＺＣ５５０（５’　ＴＣＣＣＡＧ　ＴＣＡ　ＣＧＡ　ＣＧＴ　３’）を用いて変異誘発した。

変異誘発された配列を、５ｓｔｌフラグメントとして複製形ＤＮＡから単離した。その変異誘発されたフラグメントを、５ｓｔＩ切断されたｐ５９４に連結し、発現ベクターｐＤＸ／ＰＣ１０５８を構成した。そのベクターを、リン酸カルシウム方法（Ｇｒａｈａｍ　ａｎｄ　ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ。

前記により記載されているような）により、ｐＳＶ２−Ｄ）ＴＦ　Ｒ（Ｓｕｂｒａｎａｎｉなど、、Ｍｏｌ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、上：　８５４〜８６４゜１９８１）を有するｔｋ”　ｔｓ１３ＢＨＫ細胞中に同時トランスフェクトした。そのトランスフェクトされた細胞を、１０％ウシ胎児血清、ＩＸＰＳＮ抗生′１ｙＪ質混合物（Ｇｉｂｃｏ　５００−５６４０）、２．０ｍＭのし一グルタミン及びビタミンＫ　（５ｇ／ｄ）を含むダルベツコの変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で増殖した。細胞を、２５０ｎＭのメトトレキセート（ＭＴＸ）中において１４日間選択した。タンパク質を、ヒトプロティンＣに対する羊ポリクローナル抗体７■をＣＮＢｒ−活性化セファロース４　Ｂ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｉｎｃ、、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ＋ＮＪ）２ｇにカップリングすることによって調製されたカラム上でのアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。

細胞培養培地をカラムに適用し、そしてカラムをＴＢＳ　（５０ｍＭのトリス、ｐＨ７，５，１５０ｍＭのＮａＣ１）１００ｄにより洗浄した。活性化プロティンＣを、３ＭのＫＳＣＮを含むＴＢＳにより又はｐＨ１１，５の緩衝液（２５ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ１１，５，０，２ＭのＮａＣｌ、２％のＴｗｅ　ｅｎ −８０，０，５％のＮａＮ５）により溶出した。

切なテスター細胞の層上でのα−因子ｈａｌｏの生成について、形質転換されたＫｅｘ２変異体細胞をスクリーンすることによって酵母ゲノムライブラリーから単離した。Ｋｅｘ２変異体のすべての報告された欠陥（接合、α−因子産生、キラー毒素の成熟及びホモ接合性二倍体株における胞子形成）を補足された１つのクローンを得た。その遺伝子を、酵母旦−ン化した。ｐ１５Ｌ５と命名された得られるプラスミドを、寄託番号第６７５６９号としてＡＴＣＣに寄託した。第３図に示されるように、ｐ１５１５をＨｉｎｄＩ［Ｉにより消化し、そして２．ｌｋｂのフラグメントを回収した。このフラグメントを、Ｈｉｎｄｌ［［により切断されたｐＵｃ１８に連結し、ｐＵＣ１８／ＫＥＸ２を構成した。次に、ＫＥＸ２フラグメント（２，１ｋｂ）を、前記プラスミドをＨｉｎｄｌＩＩにより一部、及びＢａｍＨＩにより完全に消化することによってｐＵｃ１８／ＫＥＸ２から単離した。次にＫＥＸ２配列の残りを、ｐ１５１５のＢａｍＨＩ＋ＨｉｎｄＩ［［消化物から０．４３ｋｂのフラグメントとして単離した。次に、２つのＫＥＸ２フラグメントを、ベクターＺ　ｅｍ２２　Ｂ及びＺｅｍ２２９のＢａｍＨＩ部位に連結した。（Ｚ　ｅｍ２２９は、マウスメタロチオネイン−■プロモーターとＳＶ４０転写ターミネータ−との間にクローン化されたＤＮＡの挿入のためのユニークなりａｍＨＩ部位を含むｐＵｃ１８基礎の発現ベクターである。このベクターはまた、ＳＶ４０初期プロモーター、マウスジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子及びＳＶ４０ターミネータ−を含んで成る発現単位を含む。Ｚ　ｅｍ２２８は、Ｚ　ｅｍ２２９に類似するが、しかしＤＨＦＲ遺伝子の代わりに耐ネオマイシン性遺伝子を含む。従って、Ｚ　ｅｍ２２８においては、挿入された遺伝子はメタロチオネイン−Ｉプロモーター及びＳＶ４０ターミネータ−の制御下に存在し、そしてそのベクターは抗生物質Ｇ４１８により選択され得る。）得られたプラスミドを、それぞれＫＥＸ／Ｚｅｍ２２８及びＫＥＸ２；／Ｚｅｍ２２９として命名した。

高いプロティンＣ産生ｐＤＸ／ＰＣ１０５８−トランスフェクトされたｔｋ−ｔ　ｓ　ｌ　３ＢＨＫクローン（ｐＤＸ／ＰＣ１０５８−３／／ＢＨＫ’）を、リン酸カルシウム法を用いて、ＫＥＸ２／Ｚｅｍ２２８によりトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、５００！！ｇ／ｄのＧ４１８及び２５０ｎＭのメトトレキセートにより選択した。

ＫＥＸ２−１０５８／／ＢＨＫとして命名された選択されたクローンを、１％のウシ胎児血清を含むシスティン不含ＤＭＥＭ　（Ｇｉｂｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、　ＮＹ）中において、２４時間、３５３−システィンによりパルス−ラベルした。

培養培地を集め、そしてプロティンＣに対するモノクローナル抗体による免疫沈殿により、−末鎖及び二本鎖プロティンＣの存在についてアッセイした。２００及び５０ｍの培地を、抗体ＬｏＪｔｇと共に組合し、そしてその混合物を３７° Ｃで１時間インキュベートした。１００Ｉ１１の５ｔａｐｈＡ細胞懸濁液（Ｐｈａｒｍｃｉａ、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪ）を添加し、そしてその混合物を３７°Ｃで１時間インキュベートした。細胞を遠心分離によりベレット化し、そしてそのペレットを、１％のβ−メルカプトエタノールを含むゲル緩衝液６０〃に再懸濁した。その懸濁液を３分間、１００°Ｃに加熱し、次に５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動せしめた。タンパク質を、オートラジオグラフィーにより可視化した。ＫＥＸ２−１０５８／／ＢＨＫクローンは、そのタンパク質の二本領形へのほぼ１００％の切断を示した。

ＫＥ、Ｘ２−１０５８＃３−５として命名された、安定してトランスフェクトされたＢＨＫクローン細胞系を、１０％のウシ胎児血清を含む培地中において、細胞工場（Ｋｕｎｃ、　Ｔｈｏｕｓａｎｄ　０ａｋｓ、　ＣＡ）で、５％のＣＯ２雰囲気下で３７°Ｃで増殖せしめ、次に１％の血清を含む培地中での増殖を可能にした。

ならし培地を、デカントすることによって除去し、そして細胞をＰＢ３５００ｄにより２度、洗浄した。その洗浄された細胞を、５０％のＤＭＥＭ、５０％のＨａｍ’　５Ｆ１２．１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、２ｍＭのし一グルタミン、ＩＸＰＳＮ抗生物質混合物（Ｇｉｂｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、５■／１のインシュリン、３硝／１のセレン、ＩＯ■／ｌのフェチュイン、２０■／ｌのトランスフェリン及び２５ｍＭのＨＥ　Ｐ　Ｅ　Ｓ　４％衝液（ｐＨ７，２）を含む血清不合培地に移した。すべての培地は、１　ｕｇ　／　ｄのビタミンＫを含んだ。

３〜４日の増殖の後、培地を収穫し、そして細胞を、１％の血清を含む培地に移した。

活性化プロティンＣを、ＰＣＬ−２−セファロースカラム上でのイムノアフィニティークロマトグラフィーにより、血清を含まない及び血清を含む培地から精製した。このカラムは、ＣＮＢ　ｒ−活性化セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ。

ＮＪ）にプロティンＣのＣａ　”結合し鎖に対して特異的なモノクローナル抗体（ＰＣＬ−２として命名される）をカップリングすることによって構成された。

ならし培地を濾過し、そして精製の前、Ａｍ１ｃｏｎ　ＤＣＩＯＬＩ縮機（Ａｍｉｃｏｎ。

Ｄａｎｖｅｒｓ、　ＭＡ）を用いて約９０倍に濃縮した。その濃縮されたサンプルを、１０ｍＭのＣａＣｌ２の存在下でカラムに適用した。カラムを、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１−　ＯＭのＮａＣ１、ｌｏｍＭのＣａ　Ｃ］、　２溶液（ｐＨ７，５）により洗浄した。

活性化プロティンＣを、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）中、１５ｍ門のＥＤＴＡ溶液によりカラムから溶出した。

血清を含まない培地及び１％の血清を含む培地中で培養された細胞により生成された活性化プロティンＡを、ＢＣＡ方法（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　ＧＯ，、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、　ＩＬ）を用いて定量化し　−た。タンパク質の生物学的活性を、基質とのプールされた正常な血漿によるＡＰＴＴの延長に従がえることによって、決定した。手短に言えば、ＡＰＴＴアッセイが、組換えＡＰＣの種々の希釈溶液（体積１００＃）と共に正常な血漿１００Ｉを３７°Ｃで５０秒間インキュベートし、続いて、Ａｃｔｉｎ　Ｆ　Ｓ　（Ｄａｄｅ、　Ｍｉａｍｉ、　ＦＬ）　１００　ｔｄと共に３７°Ｃで１００秒間インキュベートすることによって実施された。次に、２５ｍＦＩのＣａＣ１ｚｌＯＯ，Ｊを添加し、そして凝集時間を決定した。複数の測定の結果が第３表に示される。値は、２つの有効数字に完結されている。

１１人 ■えＡＰＣの、″＆ぎ′　、凝集時間（秒）上土笈皇滑　二胤違実験　２３４　３４５へ旦旦ユ１■Ｌ２０　７．６　９．０　５．０　１３　１５　１９８０　１８　２０　１９　３２’３７　３９タンパク質をまた、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｌａｅｍｍｌｉ、Ｎａｔｕｒｅ　２２７　：　６８０．１９７０）により特徴づけた。第４図に示されるように、血清を含まない培地で培養された細胞により生成された岨換え活性化プロティンＣは、約６８ｋＤａの分子量を有する種（レーン９〜１１）として主に存在する。対照的に、１％の血清の存在下で培養された細胞からのＡＰＣは、９３ｋＤ以上の分子量を有する種（レーン５〜７）の有意な量を含み、高分子１１ＡＰｃ−インヒビター複合体が血清の存在下で形成することを示唆する。

これらのデータは、血清を含まない培地における組換え活性化プロティンＣの生成が、従来レベルの血清の存在下での生成に比較して、損われていない、生物学的に活性なタンパク質の高収率をもたらすことを示唆する。

９６２　２ＭＢ−２からの１　ヒブロテイ詠ゴ≧λλ現プロティンＣのコード配列を変性し、アミノ酸１５３〜１６９を除去し、アミノ酸１５２と１７０との間にＬ鎖−Ｈ鎖連結部を有する活性化されたプロティンＣ前駆体をもたらした。この活性化プロティンＣ前駆体（１９６２として命名される）の配列は、第１表に示される。

特定オリゴヌクレオチド変異誘発、Ｍ１３ｍｐｌＯの５ｓｔＩ部位中に、適切な配向で挿入されたｐ５９４の５ｓｔＴフラグメントを含んで成る鋳型に対して行なった。−末鎖鋳型ＤＮＡを、５９４／ｍｐｌｏファージクローンから調製した。特定オリゴヌクレオチド変異誘発を、合成オリゴヌクレオチドＺＣ１９６２（５’　ＧＡＧ　ＡＡＧ　ＡＡＧ　ＣＧＣＣＴＣＡＴＴ　ＧＡＴ　ＧＧＧ　３’）及びＺＣ５５０を用いてその鋳型に対して行なった。陽性ファージクローンを、その変異誘発を確かめるために配列決定した。陽性ファージクローンを、１９６２として命名した。

複製形ＤＮＡを、ファージクローン１９６２から調製し、そして５ｓｔＩ及びＰｓｔｌにより消化し、約０．４ｋｂの変異誘発されたフラグメントを単離した。

プラスミドＰＣ２２９／９６２（例２Ｂ）を、ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔｌにより消化し、５６２ｂｐのプロティンＣフラグメントを単離した。７００ｂｐの５ｓｔｌ−ＥｃｏＲＩプロティン′Ｃフラグメントを、ＰＣｌ３６９／２２９Ｒ（Ｐ５９４プロティンＣコード配列を含むが、但しＬｙｓコドンにより置換されたＡｒｇ（残基１５７）コドンを有するＺｅｍ２２９Ｒ−基礎のプラスミド）から得た。プラスミドＺｅｍ２２９Ｒは、Ｚｅｍ２２９に類似するが、但し、Ｚｅｍ２２９に存在するＥｃｏＲＩ部位は、部分的消化により破壊され、ＤＮＡポリマラーター　（フレノウフラグメント）及びｄＮＴＰによる処理によりプラント末端化され、続いて再連結され、そしてユニークＥｃｏＲ１部位が、ＢａｍＨＩによる消化及びＢａｍＨＩ−Ｅｃ　ｏＲＩアダプターによる再連結によりＢａｍＨ１部位で創造された。

プラスミドｐＺＭＢ−２（第５図）を、ＥｃｏＲｌによる消化により線状化した。（プラスミドｐＺＭＢ−２はＺ　ｅｍ２２９Ｒに類似するが、しかしＳ　Ｖ　４．０エンハンサ−、アデノウィルス２主要後期プロモーター、アデノウィルス２トリバーテイトリーダー、及び５ｓｔＩ−ＨｉｎｄＩＩ［アダプターを用いてＭＴ−１プロモーターについて置換された５′及び３′スプライス部位を含む。

）ファージクローン１９６２からの約０．４ｋｂのＰｓｔｌ−３ｓｔｌフラグメント、Ｐｃ１８６９／２２９　Ｒからの７００ｂｐのＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩフラグメント、ＰＣ２２９／９６２からの５６２ｂｐの５ｓｔｌ−Ｅ部連結で連結した。正しい配向でその挿入体を有するプラスミドを、ｐ　ＰＣ１９６２／ＺＭＢ −２として命名した。

プラスミドｐＰＣ１９６２／ＺＭＢ−２を、リン酸カルシウム同時沈殿法により、ｔｋ−ｔ　ｓ　１３ＢＨＫ細胞中にトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、１０％のウシ胎児血清、ＩＸＰ’ＳＮ抗生物質混合物（Ｇｉｂｃｏ）、２、ＯｌＩＭのし一グルタミン及び５ｇ／ｄのビタミンＫを含むＤＭＥＭ中で増殖した。細胞を５００ｎＨのメトトレキセート中で１５日間選択し、そして得られたコロニーを、イムノフィルターアッセイによりスクリーンした。最っとも集中的に反応するコロニーを、シリンダークローニングにより取り出し、そしてそれぞれ１０ｃｍのプレート中で増殖した。培養物がほぼ集密性になる場合、プロティンＣの生成レベルを、ＥＬＩＳＡにより測定した。

高いプロティンＣ産生ｐＰｃ１９６２／ＺＭＢ−２）ランスフェクタントを、ＫＥＸ２／ＺＭＢ−１によりトランスフェクトした。（ＫＥＸ２／ＺＭＢ−１は、ユニークＥｃ　ｏＲ■部位でベクターＺＭＢ−１中に挿入されたＫＥＸ２コード配列を含んで成る。第５図に示されるように、ＺＭＢ−１は、ＺＭＢ−２に類似するが、しかしそれはＺｅｍ２２８Ｒから構成された。Ｚｅｍ２２８Ｒは、Ｚ　ｅ　ｍ、　２２９　Ｒの構成のために、上記のようにしてＺ　ｅｍ２２８から調製された。）同時トランスフェクトされた細胞を選択し、そして培地サンプルを集めた。活性化プロティンＣを、ｐＰｃ１９６２−ＫＥＸ２／ＺＭＢ−１１−ランスフェクト細胞からの培地サンプルに検出した。

Ｅ、ＰＣ１６４５Ｚｅｍ２２９Ｒの　びプロティンＣのＬ鎖とＨ鎖との間の結合部分でＡｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇプロセッシングシグナルを末端に有する８個のアミノ酸のスペーサーペプチドをコードするＤＮＡ配列（１６５４と命名された）は、第１表に示される。

変異体分子を、突然変異誘発性オリゴヌクレオチドＺＣ９６２（５’ＡＧＴ　ＣＡＣＣＴＣＡＧＡ　ＡＧＡ　ＡＡＡ　ＣＧＡ　ＧＡＣＡ３’）及びオリゴヌクレオチドＺＣ５５０（５’ＴＣＣＣＡＧ　ＴＣＡ　ＣＧＡ　ＣＧＴ　３’）を用いて、部位特異的変異誘発（Ｚｏｌｌｅｒ　ａｎｄ　Ｓｏ＋ｉｔｈ、　ＤＮＡ３　：　４７９〜４８８．１９８４により実質的に記載されているようにして）によりクローン化されたｃＤＮＡを変性することによって生成した。プラスミドｐ５９４を５ｓｔｌにより消化し、約ｓ’ｙｂｐのフラグメントをＭ１３ｍｐＨ中にクローン化し、そして−末鎖鋳型ＤＮＡを単離した。変異誘発の後、正しいクローンを配列決定することによって同定した。複製形ＤＮＡを単離し、そして５ｓｔｌにより消化し、変異誘発されたフラグメントを単離した。この変異誘発されたフラグメントを、２部連結で５ｓｔＩ切断されたＰ２Ｓ５に連結した。所望する配向で挿入された５ｓｔＩフラグメントを有するクローンを、制限酵素地図により同定した。得られた発現ベクターを、ｐＤＸ／ＰＣ９６２として命名した（第６図）。

プラスミドｐＤＸ／ＰＣ９６２を５ａｉｌ及び５ｓｔＩにより消化し、そして精製された７３０ｂｐのフラグメントを、５ａｌＩ及び５ｓｔｌによる消化により線状化されたＭ１３ｍｐＬｏ中に挿入した。合成オリゴヌクレオチドＺＣ１６４５（５’　ＧＡＡ　ＧＡＣＣＡＡ　ＡＣＡ　ＡＣＡ　ＡＡＡＣＧＧ　ＣＴＣＡＴＴ　ＧＡＴ　３’）及びＺＣ５５０を用いて、部位特異的インビトロ突然変異誘発（Ｚｏｌｌｅｒ　ａｎｄ　Ｓｍ１ｔｈ、前記）により一本鎖鋳型ＤＮＡを変異誘発した。変異体ファージクローンを、ジデオキシ−配列決定にゆだね、突然変異誘発を確証した。１６４５として命名された、確証された変異体ファージクローンからの複製形（ｒｆ）ＤＮＡを調製し、そして５ｓｔｌ及びＰｓｔＩにより消化し、４Ｌ１ｂｐのフラグメントを単離した。

プラスミドｐＤＸ／ＰＣ９６２をＥｃｏＲＩにより消化し、そしてプロティンＣフラグメントを回収した。このフラグメントを、オリゴヌクレオチドアダプターを通して、ホスファターゼ処理された、ＢａｍＨＩ−切断プラスミドＺｔｍ２２９に連結した。得られたプラスミドＰＣ２２９／９６２　（第６図）を、ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩにより消化し、５９２ｂｐのプロティンＣフラグメントを単離した。プラスミドＰＣ２２９／９６２をまた、ＥｃｏＲＩ及び５ｓｔＩにより消化し、７００ｂｐのプロティンＣフラグメントを単離した。１６４５ｒｆからの４１１ｂｐのプロティンＣフラグメント、ＰＣ２２９／９６２からの５９２ｂｐのプロティンＣフラグメント及び７ｏｏｂｐのプロティンＣフラグメントを、ＥＣ０ＲＩにより線状化され、そして自己連結を妨げるためにウシ腸ホスファターゼにより処理されたＺｅｍ２２９Ｒと共に４部連結で連結した。正しいプラスミドを選択し、そしてｐＰｃ１６４５／２２９Ｒ（第６図）と命名した。

プラスミドｐＰｃ１６４５／２２９Ｒを、リン酸カルシウム同時沈殿法（Ｇｒａｈａｍ　ａｎｄ　ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ、前記）により、ｔｋ−ｔｓ１３ＢＨＫ細胞中にトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、１廟のメトトレキセートによる選択にゆだね、そして培地をＥＬＩＳＡによりプロティンＣについてアッセイした。陽性クローンを、ｌＯ％ウシ胎児血清及び１声のメトトレキセートにより補充されたＤＭＥＭ中で、細胞が集密性に達するまで増殖せしめた。その集密性細胞を、１％ウシ胎児血清及び１オのメトトレキセートにより補充されたＤＭＥＭに移した。培地を７日間にわたって、１〜２日ごとに集め、そして−２０°Ｃで凍結した。その凍結された培地サンプルを融解し、そして０．　４５声のフィルターに通し、すべての細胞残骸を除去した。固体塩化カルシウムを添加し、５ｍＭの最終濃度にし、そして固体アジ化ナトリウムを添加し、０．０２％（重量／体積）の最終濃度にした。プロティンＣを、プロティンＣのカルシウム誘発配向に対して特異的なモノクローナル抗体カラムを用いて培地から精製した。処理された培地サンプルをカラムに適用し、そしてプロティンＣを、１０ｍＭのＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ　ヲ含ムＴＢＳにより溶出した。プロティンＣ濃度を、２８０ｎｍでの吸光度及びＥＬＩＳＡにより決定した。

ｐＰＣ１６４５／２２９Ｒ１−ランスフェクトされた細胞から生成された活性化プロティンＣを、クロモゲンアッセイを用いて、ＰＣ２２９／９６２プロティンＣの等量と比較した。

４０ｕＩのＴＢＳ＋ＥＤＴＡに希釈されたアフィニティー精製プロティンＣＩＩｒｇを、９６−ウェルプレートの個々のウェルに添加した。２１のＳｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ　Ｐｃａ　（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ　Ｉｎｃ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ＮＹ）　４０　ｔｉを個々のウェルに添加し、そして十分な色が展開するまで、３７°Ｃでインキュベートした。活性を、４０５ｎｍでの吸光度の上昇として測定した。その結果は、ｐＰｃ１６４５／２２９Ｒ−トランスフェクトされた細胞から生成された活性化プロティンＣが、ＰＣ２２９／９６２により生成されたプロティンＣよりも５〜１０％より活性的であることを示した。

Ｆ、且ヱ工１８」」ｌＣし２Ｌ艮叫構戒３−ｉｔ溌嬰１６４５　ＤＮＡ配列をさらに変性し、スペーサーペプチドの第１、第２、第７及び第８アミノ酸を除去した。−末鎖１６４５鋳型ＤＮＡを、合成オリゴヌクレオチドＺＣ１８８０（５’ ＡＡＡ　ＣＧＡ　ＧＡＣＡＣＡ　ＧＡＣＣＡＡｔｈ、前記）にゆだねた。陽性ファージクローンをジデオキシ配列決定にゆだね、変異誘発を確認した。陽性クローンを同定し、そして１８８０として命名した（第１表）。

クローン１８８０から調製された複製形ＤＮＡを、５ｓｔＩ及びＰｓｔＩにより消化し、約０５４ｋｂのフラグメントを単離した。プラスミドＰＣ２２９／９６２を、ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩにより消化し、５６２ｂｐのプロティンＣフラグメントを単離した。プラスミドＰＣ２２９／９６２をまた、ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩにより消化し、７ｏｏｂｐのプロティンＣフラグメントを単離した。１８８０−ｒｆからの４１１ｂｐのプロティンＣフラグメント、ＰＣ２２９／９６２及びＥｃｏＲＩ消化さたＺｅｍ２２９Ｒからの７００ｂｐ及び５６２ｂｐのフラグメントを、四部連結で連結した。正しいプラスミドを選択し、そしてｐＰｃ１８８０／２２９Ｒと命名した。

プラスミドｐＰｃ１８８０／２２９Ｒを、ｔｋ−ｔｓ１３ＢＨＫ細胞中にトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞からの培地サンプルの分析は、活性化されたプロティンＣが生成されたことを示した。

Ｇ、　ＰＣ１９５４２２９Ｒの　び■ １６４５１６４５配るスペーサーペプチドのためのコード配列を変更し、第２〜第７アミノ酸コドンを除去した。−末鎖１６４５鋳型ＤＮＡを調製し、そして合成オリゴヌクレオチドＺＣ１９５４（５’　ＧＡＧ　ＡＡＧ　ＡＡＡ　ＡＣＧＡＧＡ　ＣＣＡ　ＡＡＧ　ＡＡＧ　ＡＡＡ　ＡＣ３’）及びＺＣ５５０を用いて、インビトロで部位特異的変異誘発にゆだねた。陽性クローンを配列決定し、変異誘発を確証した。

陽性クローンを選択し、そして１９５４と命名した（第１表）。

複製形Ｉ）Ｎ　Ａを１９５４から調製し、そして５ｓｔｌ及びＰｓｔｌにより消化し、約４．ｏｏｂｐの変異誘発されたプロティンＣフラグメントを単離した。

プラスミドＰＣ２２９／９６２をＥｃｏＲＩ及びＰｓｔｌ並び５ｓｔｌ及びＥｃ　ｏＲ１により消化し、５６２ｂｐのＥｃ　ｏＲＩ−Ｐｓ　ｔ　１７ラグメント及び’ｒｏｏｂｐのプロティンＣフラグメントを単離した。１９５４ｒｆからの約０．４ｋｂのプロティンＣフラグメント、ＰＰＣ２２９／９６２及びＥＣ０ＲＩ−消化されたｐ　Ｚ　ｅｍ２２９Ｒからの７００ｂｐ及び５６２ｂｐのフラグメントを、四部連結により連結した。正しいプラスミドを選択し、そしてｐＰＣ１９５４／２２９Ｒと命名した。

プラスミドｐＰｃ１９５４／２２９Ｒを、リン酸カルシウム同時沈殿法（Ｇｒａｈａｍ　ａｎｄ　ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ、前記）により、ｊｋ−Ｌｓ１３ＢＨＫ細胞中にトランス１６４５配列におけるスペーサーペプチドのためのコード配列を変性し、第１〜第８アミノ酸コドンを除去し、１６４５に存在するＡｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇアミノ酸コドンの第１及び第２組間での融合をもたらした。コードされたタンパク質のＬ−Ｈ鎖連結でのアミノ酸配列（１９５３と命名された）を、第１表に示す。

一本鎖１６４５鋳型ＤＮＡを、合成オリゴヌクレオチドＺＣ１９５３（５’　ＡＣＣＴＣＡ　ＧＡＡ　ＧＡＡ　ＡＡＣＧＡＡ　ＧＡＡ　ＧＡＡ　ＡＡＣＧＧＣＴＣＡ　Ｔ３’）及びＺＣ５５０を用いて、インビトロでの部位特異的変異誘する。陽性クローンを選択し、そして１９５３と命名する。

複製形ＤＮＡをクローン１９５３から調製し、そしてＳｓｔ■及びＰｓｔＩにより消化し、約０．４ｋｂの変異誘発されたプロティンＣフラグメントを単離する。プラスミドＰＣ２２９／９６２を、ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔｌ又は５ｓｔｌ及びＥｃｏＲＴにより消化し、５６２ｂｐのＥｃｏＲＩ−Ｐｓ　ｔ　Ｉフラグメント及び７ｏｏｂｐのプロティンＣフラグメントを単離する。Ｌ９５３ｒｆからの約４００ｂｐのプロティンＣフラグメント、ＰＣ２２９／９６２及びＥＣ０ＲＩ消化されたＺｅｍ２２９Ｒからの７００ｂｐ及び５６２ｂｐフラグメントを、四部連結により連結する。正しいプラスミドを選択し、そしてｐＰＣ１９５３／２２９Ｒと命名する。

プラスミドｐＰｃ１９５３／２２９Ｒを、リン酸カルシウム同時沈殿法（Ｇｒａｈａｍ　ａｎｄ、ｖａｎ　ｄ、ｅｒ　Ｅｂ、前記）によりｋｔ−ｔｓ１３ＢＨＫ細胞中にトランスフェクトする。細胞を選択し、そして活性化されたプロティンＣの生成についてアッセイする。

１、　ＰＣ２０４３ＺＭＢ−２の活性化されたプロティンＣ前駆体を構成し、ここで活性化ペプチドをコードする配列を除去し、そしてＡｒｇコドンを天然のプロティンＣのアミノ酸コドン１５０と１５１との間に挿入する。コードされたタンパク質のＬ−Ｈ鎖連結部でのアミノ酸配列（２０４３と命名された）は、第１表に示される。

一本鎖鋳型ＤＮＡを、ファージクローン１９６２から調製し、そして合成オリゴヌクレオチドＺＣ２０４３（５’　ＡＧＣＣＧＧ　ＡＴＧ　ＣＡＧ　ＡＡＧ　ＡＧＧ　ＡＡＧ　ＣＡを、確証されたファージクローンから調製し、そしてＰｓｔＩ及び５ｓｔｌにより消化し、約０．　４ｋｂの変異誘発されてフラグメントを単離した。プラスミドＰＣ２２９／９６２を、ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔｌ並びに５ｓｔｌ及びＥｃｏＲＩにより消化する。得られる５６２ｂｐのＥｃ　ｏＲＩ−Ｐｓ　ｔ　Ｉ及び７００ｂｐの−ＥｃｏＲＩ−３ｓｔｌプロティンＣフラグメントを回収する。０．４ｋｂのＰｓ　ｔ　ｌ−３ｓ　ｔＩフラグメントヲ、５６２ｂｐ（７）ＥｃｏＲｒ−ＰｓｔＩ７ラグメント、７００ｂｐのＳｓ　ｔ　Ｉ−Ｅｃ　ｏＲＩフラグメント及び線状化されたＺＥＢ−２と四部連結により連結する。

正しい配向で挿入体を含むプラスミドを、ｐＰｃ２０４３／ＺＭＢ−２と命名する。

プラスミドｐ　ＰＣ２０４３／ＺＭＢ−２を、ｔｋ−ｔｓ１３ＢＨＫ細胞中にトランスフェクトする。トランスフェクトされた細胞を、活性化されたプロティンＣの生成についてアッセイする。

本発明の特定の態様が例示目的のために記載されて来たが、前記から、種々の変性が、本発明の範囲内で行なわれ得る。

従って、本発明は、制限的ではない。

にＧＣＴＧＴＣＡＴＧ　ＧＣＧＧＣＡＧｕＣＧＧＣＧＡＡＣ丁ＴＧ　ＣＡＧＴＡＴＣＴＣＣＡＣＧＡＣＣＣＧＣＣＣＣＴＧＴＧＣＣＡＧ　ＴfＣＣＴＣＣＡＦＩＧ、　ｌ　ＣＱＮ”ＩＣＨｌｎｄＩｌ［ＦＩＧ、５ＦＴＩ（ｒ、、、Ｇ国際調査報告、ｎ＋ｐ、ｐｍｏｎｒ＋　ｈｕｇｌ、ｔｒ、。ｐ　ｓ。ＰＣＴ／ＵＳ　９０１０４４］、９国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．活性化プロテインＣの生成方法であって：活性化されたプロテインＣをコードするＤＮＡ配列に操作的に連結された転写プロモーターを含んで成る発現ベクターにより安定してトランスフェクトされた哺乳類細胞を、０．１％よりも高くない血清を含む培養培地中で培養し；そして前記細胞により生成される活性化プロテインＣを単離することを含んで成る方法。
２．前記培地が血清を実質的に含まない請求の範囲第１項記載の方法。
３．前記細胞が子供のハムスターの腎細胞である請求の範囲第１項記載の方法。
４．前記ＤＮＡ配列が、前記活性化されたプロテインＣのし及びＨ鎖の間でアミノ酸配列Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｘ−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−Ｒ８（ここで個々のＲ１〜Ｒ８はリシン又はアルギニンであり、そしてＸは１〜１２個のアミノ酸のペプチド結合又はスペーサーペプチドである）をさらにコードする請求の範囲第１項記載の方法。
５．前記ＤＮＡ配列が、アミノ酸配列（Ｒ１）ｎ−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４（ここでＲ１，Ｒ２，Ｒ３及びＲ４の個々はＬｙｓ又はＡｒｇであり、そしてｎは０，１，２又は３である）を、前記活性化されたプロテインＣのし及びＨ鎖間でさらにコードする請求の範囲第１項記載の方法。
６．前記ＤＮＡ配列が、前記活性化されたプロテインＣのし及びＨ鎖間でアミノ酸配列Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇをコードする請求の範囲第５項記載の方法。
７．前記細胞が、サッカロマイセスセレビソアエＫＥＸ２の遺伝子を発現するために、さりにトランスフェクトされる請求の範囲第１項記載の方法。
８．前記培養培地がビタミンＫをさらに含んで成る請求の範囲第１項記載の方法。
９．活性化プロテインＣの生成方法であって：活性化されたプロテインＣをコードするＤＮＡ配列に操作的に連結された転写プロモーターを含んで成る発現ベクターにより安定してトランスフェクトされた哺乳類細胞を、血清を実質的に含まない培養培地で培養し（ここで、前記ＤＮＡ配列は、前記活性化されたプロテインＣのし及びＨ鎖間にアミノ酸配列Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇをさらにコードし、そして前記細胞はサッカロマイセスセレビソアエＫＥＸ２遺伝子を発現するためにさらにトランスフェクトされている）；そして前記細胞により生成された活性化プロテインＣを単離することを含んで成る方法。
１０．前記細胞が子供のハムスターの腎細胞である請求の範囲第９項記載の方法。
１１．請求の範囲第１項記載の方法により生成された活性イヒプロテインＣ。