JP2688407B2 - ヒトプロテインｃの製造方法 - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】この発明は一般に、血漿蛋白
質及びそれらをコードするＤＮＡ配列に関し、そしてさ
らに詳しくはヒト−プロテインＣと実質的に同じ構造及
び／又は活性を有する蛋白質の発現に関する。 【０００２】 【従来の技術】プロテインＣは、インビボにおける血液
凝固の制御及びフィブリン溶解活性の発生において重要
な役割を演ずるセリンプロテアーゼのチモーゲン（ｚｙ
ｍｏｇｅｎ）又は前駆体である。これは肝臓内で単鎖ポ
リペプチドとして合成され、この単鎖ポリペプチドはか
なりのプロセシングを受けて、ジスルフィド結合により
一体化されたヘビー鎖（Ｍｒ＝４０，０００）及びライ
ト鎖（Ｍｒ＝２１，０００）から成る２本鎖分子とな
る。循環する２本鎖中間体が、ヘビー鎖のアミノ末端か
らの１２−残基ペプチドのスロンビン介在開裂により、
“活性化されたプロテインＣ”（ＡＰＣ）として知られ
ている生物学的に活性な形態の分子に転換される。この
開裂反応は、インビボにおいて、内皮細胞コファクター
であるスロンボモジュリン（ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌ
ｉｎ）により増強される（Esmon 及びOwen，Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８；２２４９
−２２５２，１９８１）。 【０００３】プロテインＣはビタミンＫ−依存性グリコ
プロテインであって、約９残基のγ−カルボキシグルタ
ミン酸（Ｇｌａ）及び１当量のβ−ヒドロキシアスパラ
ギン酸を含有し、これらはそれぞれグルタミン酸残基及
びアスパラギン酸残基の翻訳後修飾によって形成され
る。プロテインＣ中の特定のγ−カルボキシグルタミン
酸残基の翻訳後形成はビタミンＫを必要とする。これら
の異常なアミノ酸残基はカルシウムイオンに結合し、そ
してこの蛋白質とホスホリピドとの相互作用を担当する
と信じられ、この相互作用はプロテインＣの生物学的活
性を必要とする。 【０００４】他のビタミンＫ−依存性血漿蛋白質、例え
ばファクターVII 、ファクターIX、及びファクターＸの
凝固促進作用と異り、活性化されたプロテインＣは限定
された蛋白質分解によるファクターＶａおよびファクタ
ーVIIIａの不活性化を介して凝固過程の制御物質として
機能する。プロテインＣによるファクターＶａ及びVIII
への不活性化は酸性ホスホリピド及びカルシウムイオン
の存在に依存する。プロテインＳはＡＰＣにより触媒さ
れるファクターＶａの蛋白質分解を促進することにより
この活性を制御することが報告されている（Walker，
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：５５２１−５５２
４，１９８０）。 【０００５】プロテインＣはまた、組織型プラスミノー
ゲンアクチベーターの作用と関連付けられている（Kisi
el及びFujikawa，Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｉｎｓｔ．Ｍｉｔ
ｔ．７３：２９−４２，１９８３）。ウシＡＰＣのイヌ
への注入はプラスミノーゲンアクチベーター活性の増加
をもたらす（Comp及びEsmon ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅ
ｓｔ．６８：１２２１−１２２８，１９８１）。最近の
研究（Sakata等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，８２：１１２１−１１２５，１９８５）は
培養された内皮細胞へのＡＰＣの添加が条件調節された
培地中でのフィブリン溶解活性の急速で投与量依存的な
増加を導き、細胞によるウロキナーゼ関連及び組織型プ
ラスミノーゲンアクチベーターの両者の活性の増加を反
映することを示している。 【０００６】先天性のプロテインＣ欠損は再発性血栓性
疾患と関連し（Broekmans 等、Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍ
ｅｄ．３０９：３４０−３４４，１９８３；及びSeligs
ohn等，Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１０：５５９
−５６２，１９８４）、そして遺伝子的不調又は外傷、
例えば肝臓病又は外科手術から生ずるであろう。この状
態は一般に経口抗凝固剤により治療される。プロテイン
Ｃ含有正常血漿の注入によっても有利な結果が得られた
（Gardiner及びGriffin ，Prog .in Hematology, Brow
n, Grune 及びStratton編、ニューヨーク、１３：２５
６−２７８を参照のこと）。さらに、若干の研究者は、
プロテインＣの抗凝固活性が血栓性不調、例えば静脈血
栓症の治療において有用であることを見出している（Ｗ
Ｏ８５／００５２１）。世界の幾つかの地域で、１６，
０００の個体中およそ１個体がプロテインＣ欠損を示す
ことが予想される。さらに、プロテインＣの完全な欠損
は新生児においては致命的である。 【０００７】 【発明が解決しようとする課題】天然プロテインＣは凝
因子濃縮物から（Marlar等、Ｂｌｏｏｄ，５９：１０６
７−１０７２）又は血漿から（Kisiel、前掲）精製する
ことができるが、出発材料の限定された入手可能性及び
血漿中でのプロテインＣの低い濃度のために、この方法
は複雑で高価な方法である。従って、ヒト血液に由来す
る生成物の療法的使用は、例えば肝炎ウイルス、サイト
メガロウイルス、又は後天性免疫不全症候群（ＡＩＤ
Ｓ）の原因剤による病気の伝染の危険を有する。血栓性
疾患の治療におけるプロテインＣの臨床的適用の可能性
の観点から、プロテインＣ及び活性化されたプロテイン
Ｃの有用な量の製造が明らかに重要である。 【０００８】 【課題を解決するための手段】要約すれば、この発明
は、ヒト−プロテインＣ又は活性化されたヒト−プロテ
インＣと実質的に同じ構造及び／又は生物学的活性を有
する蛋白質をコードするＤＮＡ配列を開示する。さら
に、この発明は、哺乳類宿主細胞ＤＮＡに組み込まれる
ことができ、プロモーター、及びこれに続きその下流に
あるヒト−プロテインＣ又は活性化されたヒト−プロテ
インＣと実質的に同じ構造及び／又は活性を有する蛋白
質をコードするヌクレオチド配列を含有し、このヌクレ
オチド配列の転写が前記プロモーターにより指令される
発現ベクターを開示する。このヌクレオチド配列に続き
その下流にポリアデニレーションシグナルが存在する。
１つの具体例においては、この発現ベクターは、前記ヌ
クレオチド配列とポリアデニレーションシグナルとの間
に位置する選択マーカーを含有し、この選択マーカーの
転写は前記プロモーターにより指令される。発現ベクタ
ーはまた１セットのＲＮＡスプライシング部位を含有す
ることができる。 【０００９】この発明の関連する観点は、活性化された
ヒト−プロテインＣと実質的に同じ生物学的活性を活性
化後に有する蛋白質を発現するためにトランスフェクト
された哺乳類細胞を開示する。この哺乳類細胞は哺乳類
宿主細胞ＤＮＡに組み込まれ得る発現ベクターによりト
ランスフェクトされ、この発現ベクターは、プロモータ
ー、並びにこれに続きその下流に存在する、ヒト−プロ
テインＣと実質的に同じ構造及び／又は活性を有する蛋
白質をコードするヌクレオチド配列を含有する。１つの
具体例において、選択マーカーが細胞に導入され、そし
て安定にトランスフェクトされた細胞が選択される。活
性化されたヒト−プロテインＣと実質的に同じ生物学的
活性を有する蛋白質を発現するために形質転換された哺
乳類細胞も開示される。 【００１０】この発明の他の観点は、活性化されたヒト
−プロテインＣと実質的に同じ生物学的活性を活性化後
に有する蛋白質の製造方法を開示する。この方法は、
（ａ）ヒト−プロテインＣと実質的に同じ構造及び／又
は活性を有する蛋白質をコードする配列を含んで成る発
現ユニットを哺乳類宿主細胞に導入し；（ｂ）この哺乳
類宿主細胞を適当な培地中で増殖せしめ；そして（ｃ）
前記発現ユニットによりコードされておりそして前記哺
乳類宿主細胞によって生産された蛋白質生成物を単離す
ることを含んで成る。この方法によって製造された蛋白
質生成物も開示される。活性化されたヒト−プロテイン
Ｃと実質的に同じ構造及び／又は生物学的活性を有する
蛋白質の製造方法も開示される。 【００１１】この発明において記載される蛋白質は、血
液凝固の制御を含む活性療法物質として使用することが
できる。さらに、これらの蛋白質は、適当な医薬組成物
を提供するために生理的に許容される担体及び／又は稀
釈剤と混合することができる。この発明の他の観点は、
詳細な記載及び図面への言及によって明らかになるであ
ろう。 【００１２】 【発明の実施の形態】この発明を記載するに先立って以
下に使用する用語の定義を記載するのが発明の理解のた
めに有用であろう。生物学的活性 ：生物学的内容物（すなわち生物体又はイ
ンビトロ模倣物）中の分子により行われる１つの機能又
は１セットの機能である。蛋白質の生物学的活性は触媒
活性とエフェクター活性とに分けることができる。ビタ
ミンＫ−依存性血漿蛋白質の触媒活性は基質の活性化又
は不活性化をもたらす他の血漿蛋白質基質の特異的蛋白
質分解的開裂を含む。エフェクター活性は生物学的に活
性な分子のカルシウムもしくは他の小分子への、大分
子、例えば蛋白質への、又は細胞への特異的結合を含
む。エフェクター活性はしばしば生理的条件下での触媒
活性を増強し、又はそのために必須である。 【００１３】プロテインＣについては、生物学的活性は
その抗凝固性及びフィブリン溶解性により特徴付けられ
る。プロテインＣは、活性化された場合、ホスホリピド
及びカルシウムの存在下でファクターＶａ及びファクタ
ーVIIIａを不活性化する。プロテインＳはこの機能の制
御に関与するようである（Walker、前掲）。活性化され
たプロテインＣはまたフィブリン溶解を増強し、この効
果はプラスミノーゲンアクチベーター阻害物質のレベル
を低下せしめることにより介在されると信じられる（va
n Hinsbergh 等、Ｂｌｏｏｄ ６５：４４１−４５１，
１９８５）。後でさらに十分に記載するように、プロテ
インＣ遺伝子のエクソンVII 及びVIIIによりコードされ
るプロテインＣのその部分はその触媒活性を主として担
当するであろう。 【００１４】プレ−プロペプチド：幾つかの蛋白質のア
ミノ末端に存在し、そして一般にトランスロケーション
中にその蛋白質から開裂されるアミノ酸配列である。プ
レ−プロペプチドはその蛋白質を細胞の分泌経路に向け
る配列（シグナル配列）を含んで成り、そして疎水性ア
ミノ酸のコアの存在により特徴付けられる。これらはま
たプロセシングシグナルを含む。この明細書において使
用する場合、“プレ−プロペプチド”なる語はまた天然
プレ−プロペプチドの部分を意味する。 【００１５】“発現ユニット”：注目の蛋白質をコード
する主たるヌクレオチド配列を、該主たるヌクレオチド
配列の転写を指令しそして制御する他のヌクレオチド配
列と共に含んで成るＤＮＡ構成である。発現ユニットは
少なくとも、前記の主たるヌクレオチド配列、並びに該
主たるヌクレオチド配列の上流に位置しそして作用可能
に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）連結されているプロモーター配
列及び下流に位置するポリアデニレーションシグナルか
ら成る。発現の効率を増強するために追加の遺伝子要素
が含まれることもできる。 【００１６】発現ベクター：特に、注目の蛋白質をコー
ドするＤＮＡ配列をプロモーター及び該蛋白質の発現を
促進するための他の配列と共に含有するＤＮＡ分子であ
る。発現ベクターはさらに、宿主細胞中でのその複製を
もたらす遺伝情報を含有する。組換ＤＮＡのために一般
に使用される発現ベクターの例はプラスミド及び幾つか
のウイルスである。但し、発現ベクターはこれら両者の
要素を含有することもできる。これらはまた選択マーカ
ーを含有することができる。 【００１７】前記のごとく、プロテインＣは肝臓におい
て生産され、そしてその生合成のためにビタミンＫを要
求する。ビタミンＫは、ライト鎖のアミノ末端領域中の
特定のγ−カルボキシグルタミン酸の形成のために必要
である。これらのアミノ酸残基は翻訳後修飾によって形
成され、そしてホスホリピドへのカルシウム介在結合の
ために必要とされる。さらに、プロテインＣは、やはり
翻訳後修飾によって形成される１個のβ−ヒドロキシア
スパラギン酸を含有する。しかしながら、このアミノ酸
残基の役割は知られていない。 【００１８】プロテインＣの活性が特定のグルタミン酸
残基のγ−カルボキシル化を含む翻訳後修飾に依存し、
そして特定のアスパラギン酸残基のヒドロキシル化にも
依存するかもしれないという事実があれば、微生物中で
のプロテインＣのクローニング及び発現を介して活性な
生成物が生成することはできそうにない。従って、この
発明は、γ−カルボキシル化されており、そして活性化
されたヒト−プロテインＣの生物学的活性を活性化後に
有する蛋白質を、永久的に該蛋白質を発現するようにト
ランスフェクトされた哺乳類細胞を用いて製造する方法
を提供する。この発明はさらに、γ−カルボキシル化さ
れておりそして活性化を必要としないで、活性化された
ヒト−プロテインＣの生物学的活性を有する蛋白質を製
造する方法を提供する。 【００１９】ウシ−プロテインＣのライト鎖及びヘビー
鎖は配列決定されている（Fernlund及びStenflo ，Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７：１２１７０−１２１７
９，１９８２；及びStenflo 及びFernlund，Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７：１２１８０−１２１９０，１
９８２）。ヒト−プロテインＣの単離及び特徴付けはKi
siel，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，６４：７６１−
７６９，１９７９により記載されている。アミノ末端ア
スパラギン酸残基を除き、ヒト−プロテインＣのヘビー
鎖のアミノ末端配列はウシの蛋白質のヘビー鎖中に存在
する最初の８個のアミノ酸と異る。 【００２０】ヒトの酵素及びウシの酵素の両者の抗凝固
活性は高度に種特異的であることが見出された。種特異
性はプロテインＳにより介在されると信じられる（Walk
er，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．２２：３２１−３２７，１
９８１）。しかしながら、ヒト及びウシの蛋白質は相互
に、並びにプロスロンビン、ファクターVII 、ファクタ
ーIX及びファクターＸを包含する他のビタミンＫ−依存
性血漿蛋白質と、かなりの全体的構造的類似性を示す。
類似性は、ライト鎖中のＧｌａ残基の存在及びヘビー鎖
中の活性部位セリン、並びにライト鎖のアミノ末端領域
中の他のアミノ酸配列の類似を包含する。 【００２１】この発明においては、λｇｔＩ１ ｃＤＮ
Ａライブラリーをヒト肝臓ｍＲＮＡから調製した。次
に、このライブラリーをヒト−プロテインＣに対する
125Ｉラベル化抗体を用いてスクリーニングした。抗体
反応性クローンをさらに、λｇｔＩ１ベクター中でのβ
−ガラクトシダーゼとプロテインＣとの融合蛋白質の合
成について分析した。クローンの１つが抗体プローブと
の強いシグナルを与え、そして約１４００bpの挿入部を
含有することが見出された。ＤＮＡ挿入部のＤＮＡ配列
分析により、Fernlund及びStenflo （Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．，２５７：１２１７０−１２１７９；Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７：１２１８０−１２１９０）
により決定されたウシ−プロテインＣの大部分と高度に
相同性を示す予想通りのアミノ酸配列が示された。 【００２２】ＤＮＡ挿入部は、ライト鎖のアミノ酸６４
から始まり、完全なヘビー鎖コード領域を含み、そして
終止コドンに進む、プロテインＣのコード領域のほとん
どを含んでいた。さらに、ヘビー鎖の終止コドンに続
き、３′非コード配列の２９４塩基対及び９塩基対のポ
リ（Ａ）テイルが存在した。プロセシング及びポリアデ
ニレーションシグナルＡ−Ａ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ａがこのｃ
ＤＮＡ挿入部中のポリ（Ａ）テイルから１３塩基対上流
に存在した。この配列は、２個の可能性あるポリアデニ
レーション部位の１つであった。 【００２３】ｃＤＮＡ配列はまた位置１５６−１５７に
ジペプチドＬｙｓ−Ａｒｇを含有していた。これはヘビ
ー鎖からライト鎖を隔離し、そして蛋白質分解的開裂に
よるプロセシングの過程で除去され、２本鎖分子の分泌
をもたらす。スロンビンによる活性化の際、ヒト−プロ
テインＣのヘビー鎖はアルギニン−１６９とロイシン−
１７０の間で開裂され、活性化ペプチドをもたらす（図
２）。 【００２４】同様の方法により、プレ−プロペプチド及
びプロテインＣの初めの２３個のアミノ酸のためのコー
ド配列を欠く第２のｃＤＮＡを単離した。このｃＤＮＡ
をハイブリダイゼーションプローブとして用い、コード
配列の残りをλシャロン４Ａ中のヒトゲノムＤＮＡライ
ブラリーから得た（Fosterなど．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４６７３〜４６
７７，１９８５）。プロテインＣ遺伝子のためのオーバ
ーラップ挿入部を含む、３種の異なるλシャロンファー
ジを単離した。 【００２５】３種のファージクローン上のエクソンの位
置を、上記の１４００bpのｃＤＮＡから製造されたプロ
ーブを用いる、これらのクローンの消化物のサザンブロ
ットハイブリダイゼーションによって決定した。これら
のクローン中のゲノムＤＮＡ挿入部を、単一の及び二重
の制限酵素による消化、及びこれに続くアガロースゲル
電気泳動、サザンブロッティング及びヒトプロテインＣ
のためにｃＤＮＡに由来する放射性標識された５′及び
３′プローブに対するハイブリダイゼーションによっ
て、図５に示されるようにマッピングした。 【００２６】ＤＮＡ配列決定研究を、チェインターミネ
ーター法（dideoxy chain-termination method）を用い
て行なった。図６〜図９に示されるように、ヒト−プロ
テインＣのための遺伝子のヌクレオチド配列は、およそ
１１kbのＤＮＡにわたる。これらの研究はさらに、４２
個のアミノ酸の潜在的なプレ−プロペプチドを表わす。
−１〜−２０の領域におけるウシ−プロテインＣのプレ
−プロペプチドとの相同性に基づいて、位置−１０のＡ
ｌａ残基の後のプレプロ配列がシグナルペプチダーゼに
よって開裂されるらしい。成熟タンパク質へのプロセシ
ングは、アミノ末端のプロペプチドを除去するために残
基−１の後の、並びにＬ鎖及びＨ鎖を連結するＬｙｓ−
Ａｒｇジペプチドを除去するために残基１５５及び１５
７での追加のタンパク分解性開裂を含む。この最終プロ
セシングは、１５５個のアミノ酸のＬ鎖及び２６２個の
アミノ酸のＨ鎖をもたらす。 【００２７】プロテインＣの遺伝子は、２５〜８８５ヌ
クレオチドのサイズ範囲の８個のエクソン、及び９２〜
２６６８ヌクレオチドのサイズ範囲の７個のイントロン
から成る。エクソンＩ及びエクソンIIの一部は、４２個
のアミノ酸のプレ−プロペプチドをコードする。エクソ
ンIIの残る部分、エクソンIII 、エクソンIV、エクソン
Ｖ及びエクソンVIの一部はプロテインＣのＬ鎖をコード
する。エクソンVIの残る部分、エクソンVII 及びエクソ
ンVIIIはプロテインＣのＨ鎖をコードする。ヒト−プロ
テインＣのアミノ酸配列及びＤＮＡ配列は図２〜図４に
示されている。 【００２８】プロテインＣのための遺伝子中のイントロ
ンの位置は、種々の機能ドメインの間に主として存在す
る。エクソンIIは、プレ−プロペプチドの高度に保存さ
れた領域及びγ−カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）ド
メインにわたる。エクソンIII は、Ｇｌａ及び成長因子
ドメインを連結する８個のアミノ酸を含む。エクソンIV
及びＶはそれぞれ、潜在的な成長因子ドメインを表わ
し、他方エクソンVIは、活性化ペプチドを含む連結領域
を包含する。エクソンVII 及びVIIIは、すべてのセリン
プロテアーゼに典型的な触媒ドメインを包含する。 【００２９】ヒト−プレプロプロテインＣのためのアミ
ノ酸配列及び仮の構造が図１０に示されている。プロテ
インＣはＬｙｓ−Ａｒｙジペプチドなしに示されてお
り、このジペプチドはＬ鎖及びＨ鎖を連結するものであ
る。７個のイントロン（Ａ〜Ｇ）の位置は実線によって
示されている。既知のタンパク分解性開裂部位の両端に
存在するアミノ酸は円で囲んである。◆は、潜在的な炭
水化物結合部位を示す。Ｌ鎖、活性化ペプチド及びＨ鎖
中の第１のアミノ酸は番号１から始まる。この番号は図
２〜図４及び図６〜図９に示される番号とは異なる。炭
水化物の付着部位は、図１０の番号スキームに従えば、
Ｌ鎖中の残基９７及びＨ鎖中の残基７９，１４４及び１
６０に位置する。炭水化物部分は、Ａｓｎに共有結合さ
れる。ほとんどの場合、炭水化物の付着環境は、Ａｓｎ
−Ｘ−Ｓｅｒ又はＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ（ここでＸ−は任
意のアミノ酸である）によって表わされ得る。 【００３０】上に示されるように、プロテインＣは、凝
固過程において調節の役割を演ずる。エクソンVII 及び
VIIIによってコードされる触媒ドメインは、一定の血漿
タンパク質（すなわち、因子Ｖａ及びVIIIａ）を特異的
に開裂するセリンプロテアーゼ活性を有し、それらの活
性化又は不活性化をもたらす。この選択的タンパク分解
の結果、プロテインＣは抗凝固活性及びフィブリン溶解
活性を示す。ゲノムクローン中の介在配列の存在のため
に、ゲノム配列及びｃＤＮＡ配列を単に連結し、完全な
コード配列を提供することは、許容できる発現ユニット
を構成するために十分ではない。従って、ゲノムクロー
ンを用いて発現ユニットを構成する場合、下にさらに十
分に記載されている理由のために、これらの介在配列を
削除することが必要である。 【００３１】５′コード領域はまた、他の方法によって
も得ることができ、そしてそれ故に、介在配列を削除す
る必要性がないであろう。５′コード領域は、既存のｃ
ＤＮＡ又はゲノムクローンに由来するプローブを用いて
の追加のライブラリーを検索することによって得ること
ができる。この方法を用いて、完全な長さのｃＤＮＡを
単離した。さらに、ビタミンＫ−依存性血漿タンパク質
のアミノ末端部分は、それらの各自のカルシウム結合活
性を担当する。この機械的類似性の結果として、これら
の分子のカルシウム結合ドメインを取り換えることがで
き、そして結果として生じる分子の触媒ドメインに特徴
的な活性をなお保持することができる。たとえば、１９
８５年４月１７日に出願されたアメリカ特許出願番号第
７２４，３１１号に記載されているように、IX因子のア
ミノ−末端部分（カルシウム結合ドメイン）を、アミノ
酸３６でVII 因子に連結し、VII 因子の活性を有するタ
ンパク質を得ることができる。 【００３２】VII 因子、IX因子、Ｘ因子、プロトロンビ
ン及びプロテインＳは、このアミノ−末端配列の相同性
をプロテインＣと共有する。従って、これらの任意のタ
ンパク質のための遺伝子の５′−コード領域を含むクロ
ーン化された配列を、プロテインＣの遺伝子の対応する
配列と交換することができる。さらに、適切なコード配
列を、いくつかのビタミンＫ依存性血漿タンパク質の既
知のアミノ酸配列又はこの明細書に開示されているゲノ
ムプロテインＣのエクソンの配列に基づいて合成するこ
とができる。合成ヌクレオチド配列を製造するための技
法は当業界において良く知られている。たとえば、オー
バーラップするオリゴヌクレオチドのセットを合成し、
そして対にアニーリングしてオーバーラップする接着末
端を有する二重鎖断片を得ることができる。次に、これ
らの断片を任意の制限と同様に連結することができるで
あろう。次に、この得られる合成断片を、便利な制限部
位においてｃＤＮＡに連結する。この結合配列を、必要
な場合、オリゴヌクレオチド指令突然変異誘発によって
変形することができる。 【００３３】完全なコード配列を代表するクローンを得
た場合、必要ならば、その適切な領域を連結し、目的と
するコード配列を形成することができる。１又は複数の
ライブラリーから得られた断片を適切な制限エンドヌク
レアーゼにより切断し、そして正しい方向に酵素により
一緒に連結する。断片及び特定の選択された制限エンド
ヌクレアーゼに依存して、欠失突然変異誘発の“ループ
アウト”（ｌｏｏｐｏｕｔ）方法により又は制限エンド
ヌクレアーゼによる開裂及び突然変異誘発の組み合せに
より不所望のＤＮＡ配列を除去することが必要であろ
う。そのようにして得られた配列は、好ましくは、連続
するオープンリーディングフレームの形で存在すべきで
ある。 【００３４】すなわち、高等な真核生物の遺伝子に一般
的に見出される介在配列（イントロン）を欠くべきであ
る。クローン化された遺伝子中でのイントロンの存在
は、その遺伝子配列が哺乳類宿主細胞中に導入される場
合、ｍＲＮＡの異常なスプライシング及び／又は遺伝子
発現の低下した効率又は増幅に基づく不安定性を導びく
場合がある。このコード配列は、本発明に従って生成さ
れたプロテインＣの正しいプロセシング及び分泌を促進
するために、さらにプレ−プロペプチドをコードするこ
とが好ましい。このプレ−プロペプチドは、プロテイン
Ｃ又は他の分泌されるプロテイン、たとえばIX因子、VI
I 因子又はプロスロンビンのそれであることができる。 【００３５】いくつかの環境下で、活性なプロテインＣ
を直接的に生成することが望ましく、それによって、イ
ンビトロ又はインビボのいづれかでタンパク質生成物を
活性化する必要性が除去されるであろう。プロテインＣ
の成熟及び活性化に関与する開裂部位は既知である（Fo
ster及びDavie 、前記）。ＡＰＣをコードする配列を、
オリゴヌクレオチド指令欠失突然変異誘発により活性化
ペプチドをコードする領域を削除することによって構成
することができる。次に、この得られるタンパク質は、
分泌経路のタンパク分解プロセシングによって活性化さ
れるであろう。次に、プロテインＣ又は活性化されたプ
ロテインＣのためのコード配列を適切な発現ベクターに
導入し、今度はこれを哺乳類細胞系をトランスフェクト
するために用いる。 【００３６】本発明の実施において使用するための発現
ベクターは、哺乳類細胞中に導入された外来性遺伝子の
転写を指令することができるプロモーターを含むであろ
う。ウィルスプロモーターは、転写を指令する効率のた
めに好ましい。特に好ましいプロモーターは、アデノウ
ィルス２からの主要後期プロモーター（ｍａｊｏｒｌａ
ｔｅ ｐｒｏｍｏｔｏｒ）である。そのような発現ベク
ターはまた、好ましくは、プロモーターから下流であっ
てプロテインＣ配列のための挿入部位から上流に、又は
プロテインＣ配列それ自体内に位置するＲＮＡスプライ
ス部位のセットを含むであろう。好ましいＲＮＡスプラ
イス部位は、アデノウィルス遺伝子及び／又は免疫グロ
ブリン遺伝子から得ることができる。 【００３７】また、挿入部位の下流に位置するポリアデ
ニル化シグナルを、発現ベクター中に含む。ウィルスの
ポリアデニル化シグナル、たとえばＳＶ４０からの初期
又は後期ポリアデニル化シグナル又はアデノウィルス５
ＥＴｂ領域からのアデニル化シグナルが特に好ましい。
特に好ましい態様においては、発現ベクターはまた、非
コードウィルス性リーダー配列、たとえばプロモーター
及びＲＮＡスプライス部位の間に位置するアデノウィル
ス２の３分節系リーダーを含む。好ましいベクターはま
た、エンハンサー配列、たとえばＳＶ４０のエンハンサ
ー、及びアデノウィルスＶＡ ＲＮＡをコードする配列
を含むことができる。 【００３８】次に、クローン化された遺伝子配列を、リ
ン酸カルシウム介在トランスフェクションによって、培
養された哺乳類細胞中に導入することができる（Wigler
など．，Ｃｅｌｌ １４：７２５，１９７８；Graham及
びVan cler Eb ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２；４５６，１
９７３）。ＤＮＡ及びリン酸カルシウムから沈降物が形
成され、そしてこの沈降物が細胞に適用される。細胞の
いくらかは、ＤＮＡを取り込み、そして数日間それを細
胞内に保持する。これらの細胞の少部分（典型的には、
１０-4）は、ゲノム中にＤＮＡを組込む。これらの組込
み体を同定するために、選択可能な表現型（選択マーカ
ー）を与える遺伝子を、一般的に、注目の遺伝子と一緒
に細胞中に導入する。好ましい、選択マーカーは、薬
剤、たとえばネオマイシン、ヒグロマイシン、又はメト
トレキセートに対して耐性を与える遺伝子を含む。選択
マーカーを、注目の遺伝子と同時に、別のプラスミド上
で細胞中に導入することができ、又はそれらを、同じプ
ラスミド上で導入することができる。 【００３９】同じプラスミド上で導入される場合、選択
マーカー及び注目の遺伝子は異なるプロモーター又は同
じプロモーターの制御下に存在することができる。１つ
の態様においては、選択マーカーを、プロテインＣをコ
ードする配列を含む同じプラスミド上に、両配列が同じ
プロモーターによって制御されるように配置する（ジシ
ストロン性メッセージとして知られている配置）。この
タイプの構成物は当業界において既知である（たとえ
ば、ヨーロッパ特許公開第１１７，０５８号）。“キャ
リアーＤＮＡ”として知られている追加のＤＮＡを、細
胞中に導入される混合物中に添加することもまた有利で
あろう。細胞がＤＮＡを取り込んだ後、しばらくの間、
典型的には１〜２日間増殖を許容し、注目の遺伝子の発
現を始める。次に、安定した状態で選択マーカーを発現
する細胞の増殖のためについて選択するために薬物選択
を適用する。そのような細胞のクローンを、プロテイン
Ｃの発現についてスクリーンすることができる。 【００４０】組み込まれた遺伝子配列のコピ数を、一定
の選択マーカー（たとえば、メトトレキセートに対して
耐性を与えるジヒドロホレートレダクターゼ）を用いる
ことによって増幅を介して増加せしめることができる。
選択マーカーを、注目の遺伝子と一緒に細胞中に導入
し、そして薬物による選択を行なう。次に、薬物の濃度
をしだいに増し、そしておのおのの段階で耐性の細胞を
選択する。クローン化された配列の増加したコピー数に
ついて選択することによって、コードされたタンパク質
の発現レベルを実質的に増大することができる。本発明
により製造されたプロテインＣを、Kisiel及びDavie
（前記）の方法の変法によって精製することができる。
プロテインＣを含む培地をクエン酸ナトリウム及び塩化
バリウムと混合し、そして沈降物を集める。その沈降物
を洗浄し、再溶解し、そして硫酸アンモニウムにより再
沈降せしめ、次にリン酸ナトリウム−ベンズアミジン中
に溶解し、透析し、そしてＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ
Ａ−５０カラムにかける。プロテインＣを含有するピ
ーク（プロスロンビンもまた含んでいる）を、さらに、
ヘパリン−アガロース上でのアフィニティークロマトグ
ラフィー（Comp及びEsmon ，Ｂｌｏｏｄ ５４：１２７
２，１９７９）又は免疫吸着法によって精製する。 【００４１】本発明により製造されたプロテインＣを、
Ｈ鎖のアミノ末端からの活性化ペプチドの除去によって
活性化することができる。活性化を、α−スロンビン
（Marlarなど．，Ｂｌｏｏｄ ５９：１０６７〜１０７
２，１９８２）、トリプシン（Marlarなど．，前記）、
又はＲｕｓｓｅｌｌのマムシの毒のＸ因子活性剤を用い
て行なうことができる。次の例を要約すれば、例１はヒ
ト−プロテインＣをコードするＤＮＡ配列のクローニン
グを記載する。例２は、例１中で単離された配列からの
プロテインＣのための完全な長さのコード配列の造成法
を記載する。例３は、プロテインＣ ＤＮＡのための発
現ベクターの造成法を記載する。例４は、トランスフェ
クトされた哺乳類細胞を用いてのプロテインＣの製造を
記載する。例５は、プロテインＣをコードする完全な長
さのｃＤＮＡ及びトランスフェクトされた哺乳類細胞中
でのその発現を記載する。 【００４２】例 他に断らない限りは、ベテスダ・リサーチ・ラボラトリ
ーズ（Bethesda Research Laboratories ; BRL）および
ニュー・イングランド・バイオラブス（New England Bi
olabs ）から得た制限エンドヌクレアーゼおよび他のＤ
ＮＡ修飾酵素〔例えば、Ｔ4 ポリヌクレオチドキナー
ゼ、子牛アルカリホスファターゼ、クレノー（Ｋｌｅｎ
ｏｗ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ4 ポリヌクレオチドリガ
ーゼ）を製造業者による指示の通りに使用する。 【００４３】オリゴヌクレオチドは、アプライド・バイ
オシステムズ・モデル３８０Ａ ＤＮＡ合成材（Applie
d Biosystems Model 380A DNA synthesizer ）で合成し
変成ゲル上でのポリアクリルアミドゲル電気泳動によっ
て精製することができる。イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）
細胞は、マニアチス（Maniatis）等〔モレキュラー・ク
ローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecula
r Cloning : A Laboratory Manual ）、コールド・スプ
リング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor
Laboratory)、１９８２年〕によって記載されている如
くに形質転換することができる。Ｍ１３およびｐＵＣク
ローニングベクターおよび宿主株はＢＲＬから得た。 【００４４】例１．ヒト−プロテインＣをコードするＤ
ＮＡ配列のクローニング ヒト−プロテインＣの一部をコードするｃＤＮＡはフォ
スター（Foster）およびダヴィー(Davie）（前掲）によ
って記載されているように調製した。簡単に言えば、常
法によってヒト−肝臓ｍＲＮＡからλｇｔＩ１ ｃＤＮ
Ａライブラリーを調製した。クローンは、ヒト−プロテ
インＣに対する、 125Ｉ−ラベルしたアフィニティー精
製抗体を用いてスクリーニングし、ファージは、平板リ
セート（ｌｙｓａｔｅ）法〔マニアチス（Maniatis）
等、前掲〕、それに続く塩化セシウムグラジエントでの
バンド形成によってポジティヴクローンから調製した。 【００４５】ｃＤＮＡ挿入部は、ＥｃｏＲＩを用いて取
り出し、プラスミドｐＵＣ９中にサブクローン化した
〔ヴィエイラ（Vieira）およびメッシング(Messing）、
ジーン（Ｇｅｎｅ）１９：２５９〜２６８頁、１９８２
年〕。制限断片をファージベクターＭ１３ｍｐ１０およ
びＭ１３ｍｐ１１中にサブクローン化し〔メッシング(M
essing）、メス イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈ．
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）１０１：２０〜７７頁、
１９８３年〕、ジデオキシ法〔サンガー（Sanger）等、
プロク・ナトル アカド サイ．ＵＳＡ（Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ）７４：５４６３〜
５４６７頁、１９７７年〕によって配列決定した。 【００４６】ヒト−プロテインＣの既知の配列〔キシエ
ル（Kisiel）、前掲〕に担当し、そしてライト鎖のアミ
ノ酸６４で始まりヘビー鎖を通って３′非コード領域に
伸びているプロテインＣをコードするＤＮＡを含有する
クローンを選択した。このクローンをλＨＣ１３７５と
名付けた。アミノ酸２４からプロテインＣをコードする
第２のｃＤＮＡクローンを同定した。このクローンから
の挿入部をｐＵＣ９中にサブクローン化し、このプラス
ミドをｐＨＣ ６Ｌと名付けた（図１）。このクローン
は、ヘビー鎖コード領域、終止コドンおよび３′非コー
ド領域を含むプロテインＣの主たる部分をコードする。 【００４７】λＨＣ１３７５からのｃＤＮＡ挿入部をα
−32Ｐ ｄＮＴＰを用いてニックトランスレーション
し、これを用いてウー(Woo）によって改変された〔メ
ス．イン．エンザイモロジー（Ｍｅｔｈ．ｉｎ Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ）６８：３８１〜３９５頁、１９７９
年〕、ベントン（Benton）およびデイヴィス（Davis)の
プラークハイブリダイゼーション法（サイエンス １９
６：１８１〜１８２頁、１９７７年）により、ファージ
λシャロン４Ａ中のヒト−ゲノムライブラリーをプロー
ブした〔マニアチス（Maniatis）等、セル（Ｃｅｌｌ）
１５：６８７〜７０２頁、１９７８年〕。ポジティブク
ローンを単離しプラーク精製した〔フォスター（Foste
r）等、プロク．ナトル．アカド．サイ．ＵＳＡ（Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）８２：４
６７３〜４６７７頁、１９８５年、参考に引用〕。 【００４８】ポジティブクローンから調製したファージ
ＤＮＡ〔シルハヴィー(Silhavy）等、エクスペリメンツ
・ウィズ・ジーン・フュージョン（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎ
ｔｓｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎ）中、コールド
・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring
Harbor Laboratory)、１９８４年〕をＥｃｏＲＩまたは
ＢｇｌIIで消化し、ゲノム挿入部を精製してｐＵＣ９内
にサブクローン化した。挿入制限断片をＭ１３ベクター
内にサブクローン化し、配列を決定してその同一性を確
認して完全な遺伝子のＤＮＡ配列を確立した。 【００４９】ｐＨＣλ６ＬのｃＤＮＡ挿入部をニックト
ランスレーションし、これを用いてファージλシャロン
４Ａライブラリーをプローブした。ｃＤＮＡの５′およ
び３′末端から調製したプローブにハイブリダイズする
１個のゲノムクローンを同定した。このファージクロー
ンをＥｃｏＲＩで消化して、プロテインＣ遺伝子の５′
末端に対応する４．４kb断片をｐＵＣ９中にサブクロー
ン化した。得られた組換プラスミドをｐＨＣＲ４．４と
名付けた。完全ＤＮＡ配列分析によって、ｐＨＣＲ４．
４中の挿入部が１２６３bp（塩基対）のイントロンによ
って分離される７０〜１６７bpのエクソンを２つ含んで
いることが示された。第１のエクソンはアミノ−４２〜
−１９をコードし、第２のエクソンはアミノ酸−１９〜
３７をコードする。配列分析によって、完全プロテイン
Ｃ遺伝子のＤＮＡ配列が確認された。上記したように、
次には、ゲノムクローンを用いて本発明において使用す
るのに満足なコード配列を造成するために、イントロン
を除去することが必要である。 【００５０】例２．プロテインＣの完全長コード配列の
造成 プレ−プロペプチドを包含するプロテインＣの完全長コ
ード配列を、ｃＤＮＡ及びゲノムクローンの適当な断片
を結合せしめることによって造成した。これは、イント
ロンをゲノムクローン（ｐＨＣＲ４．４）から取り除
き、そして融合されたエクソンの都合の良い制限部位で
ｃＤＮＡ（ｐＨＣλ６Ｌから）に結合させることによっ
て達成した。次いで、所望とするゲノム：ｃＤＮＡ結合
を、オリゴヌクレオチド指令欠失突然変異誘発によって
不所望の配列をループ・アウトさせることによって形成
した。 【００５１】プラスミドｐＨＣλ６Ｌは、ｐＵＣ９のＥ
ｃｏＲＩ部位においてクローニングされたプロテインＣ
部分的ｃＤＮＡを含有していた（図１）。ｃＤＮＡ挿入
部を２個の断片としてサブクローニングし、ゲノムクロ
ーンからの最も５′−側のコード領域に結合させるため
のそれを調製した。プラスミドｐＨＣλ６ＬをＥｃｏＲ
Ｉ及びＳａｌＩで消化し、そして次に反応混合物をフェ
ノール及びＣＨＣｌ3で抽出し、エタノールで沈澱させ
た。得られたＤＮＡ断片を連結緩衝液中で再懸濁させ、
そしてＴ4 ＤＮＡリガーゼを添加した。 【００５２】連結混合物を１５℃で１４時間にわたって
インキュベートした。Ｅ．コリＪＭ８３の形質転換のた
めに連結混合物のアリコートを使用し、そしてＸ−ｇａ
ｌ含有ＬＢ寒天上に細胞をプレートした。白色のコロニ
ーを選び出し、そしてプラスミドＤＮＡを調製した。こ
のＤＮＡを制限酵素消化によって分析し、よってｃＤＮ
Ａの３′部分（約１４５０bp挿入部）及びｃＤＮＡの
５′部分（約６５bp挿入部）を含有するクローンを同定
した。これらのクローンを、それぞれｐ９Ｃ３′及びｐ
９Ｃ５′として表示する（図１１）。 【００５３】ｃＤＮＡから失われている５′コード領域
は、ゲノムクローンｐＨＣＲ４．４のエクソンＩ及びII
中に含まれている。このプラスミドは、約４４００塩基
対（bp）の挿入部を含有しており、そしてイントロンＢ
中に位置するＥｃｏＲＩ部位のところでその３′末端上
で終端している。コード配列をｐＨＣＲ４．４から除去
するため、プラスミドをＰｓｔＩ及びＥｃｏＲＩで消化
し、そして得られた断片をアガロースゲル電気泳動法に
よって分離した。エクソンＩ及びIIを含有する約２５４
０bpの断片をゲルから単離し、そしてＣＴＡＢで抽出し
た(Langridgeら、Ａｎａｌｙｔ．Ｂｔｏｃｈｅｍ．１０
３；２６４，１９８０）。この断片、５′Ｐ−Ｒと呼
ぶ、をｐＵＣ９中にサブクローニングしてプラスミドｐ
５′Ｐ−Ｒを製造した（図１２）。 【００５４】ｐ５′Ｐ−Ｒ中のイントロン（イントロン
Ａと呼ぶ）を２段階法で除去した（図１２）。プラスミ
ドをＡｐａＩで消化したところ、イントロン内のユニー
ク部位で切断がおこり、３′オーバーハング末端が残留
した。次いで、線状化したプラスミドをＢａｌ３１エキ
ソヌクレアーゼ又はＴ4 ポリマーゼで処理して約４００
bpをそれぞれの末端から除去し、そして得られた断片末
端をＳ１ヌクレアーゼで平滑末端化した。この線状化プ
ラスミドをリガーゼで再環化し、そしてＥ．コリＪＭ８
３の形質転換のために使用した。プラスミドＤＮＡを抽
出し、そしてイントロンＡ中のＳｍａＩ及びＳｓｔＩ制
限部位の存在に関して分析し、また、３００〜４００bp
に減らしたＳｍａＴ−ＳｓｔＴ断片を有するプラスミド
を選び出し、ｐ５′ＰΔａＲと表示した。 【００５５】イントロンＡの残りを、Zoller及びSmith
（Manual for Advanced Techniquesin Molecular Cloni
ng Course, Cold Spring Harbor Laboratory, 1983)に
より２プライマー法に関して記載されるのと本質的に同
様にしてオリゴヌクレオチド指令欠失突然変異誘発によ
って除去した。ｐ５′ＰΔａＲをＰｓｔＩ及びＥｃｏＲ
Ｉで消化し、そしてプロテインＣ断片を、ＰｓｔＩ及び
ＥｃｏＲＩで消化したＭ１３ｍｐ９中にサブクローニン
グした。正鎖ファージＤＮＡを鋳型として調製し、そし
てオリゴヌクレオチドｍｕｔ−１（第１表）にアニール
した。この突然変異誘発オリゴヌクレオチドは、連結さ
れるべきエクソンＩ及びII配列に対して相補的な配列を
含有する。Ｍ１３ユニバーサル配列プライマーを同じ鋳
型上で３′〜ｍｕｔ−１にアニールした。このプライマ
ーをＴ4 リガーゼの存在においてＤＮＡポリメラーゼＩ
（Ｋｌｅｎｏｗ断片）及びヌクレオシドトリホスフェー
トを使用して延長した。 【００５６】得られた２デュプレックスＤＮＡ環をＥ．
コリＪＭ１０３に形質転換し、そして得られたプラーク
を厳密なハイブリダイゼーション条件の下で、３２ｐ−
標識された突然変異誘発オリゴヌクレオチドをプローブ
として使用して、スクリーニングした。ポジティブプラ
ークからのＤＮＡを単離し、そしてオリゴヌクレオチド
プライマー１（第１表）を使用して配列決定した。この
プライマーはエクソンII中にプライムし、欠失連結をま
たぐＤＮＡ配列の決定が可能になった。エクソンＩ及び
IIの正しいインフレーム融合を有する分子が選らばれ
た。ＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ断片を、Ｍ１３の複製形か
ら、制限エンドヌクレアーゼ消化およびアガロースゲル
電気泳動によって単離し、そしてｐＵＣ９中にサブクロ
ーニングしてプラスミドｐ５′Ｉ−IIを作製する（図１
２）。 【００５７】図１３に示すとおり、ｃＤＮＡに５′コー
ド領域を連結するために、ｐ５′Ｉ−IIの約１２７７bp
ＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ断片を、プラスミドのＰｓｔＩ＋
ＥｃｏＲＩ消化から単離し、アガロースゲル電気泳動に
よって精製する。６５bpの最も５′側のｃＤＮＡ断片を
ｐ９Ｃ５′のＳａｌＩ＋ＥｃｏＲＩ消化物から単離し、
アクリルアミドゲル上の電気泳動で精製する。２つの断
片をそれらのＥｃｏＲＩ末端で連結し、得られる約１３
３０bpのＰｓｔＩ−ＳａｌＩ断片をＰｓｔＩ＋ＳａｌＩ
−消化Ｍ１３ｍｐ９中へサブクローニングする（図１
３）。正鎖ファージＤＮＡを、オリゴヌクレオチド指令
欠失変異誘発用の鋳型として作製する。オリゴヌクレオ
チドｍｕｔ−２（表１）をこの鋳型にアニールし、オリ
ゴヌクレオチドｍｕｔ−３（表１）を第２プライマーと
して上流にアニールする。このプライマーを前記のよう
に延長する。 【００５８】オリゴヌクレオチドｍｕｔ−２は、アミノ
酸２３〜２６をコードするエクソンII配列をコドン２７
でｃＤＮＡへ融合させることを指令する。第２プライマ
ー（ｍｕｔ−３）は、翻訳開始点から３５bp上流にＥｃ
ｏＲＩ部位を導入する。得られるファージをＮｃｏＩ及
びＸｈｏＩ部位の不存在及び導入されたＥｃｏＲＩ部位
の存在についてスクリーニングする。望ましい制限パタ
ーンを示すファージＤＮＡを、プライマー２（表１）を
使用して配列決定し、エクソンIIとｃＤＮＡとの間の正
しい連結の存在を確認する。正しい配列をもつファージ
ＤＮＡを選択し、５′をコード領域を含んでなるＰｓｔ
Ｉ−ＳａｌＩ断片を、Ｍ１３組換えファージの複製形か
ら単離する。この断片をアガロースゲル電気泳動によっ
て精製し、ＰｓｔＩ及びＳａｌＩにより消化されたｐＵ
Ｃ９へ挿入してプラスミドｐＣ５′ｅｎｄを作製する。 【００５９】図１４に示すとおり、プラスミドｐＣ５′
ｅｎｄをＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで消化し、５′プロ
テインＣ断片をアガロースゲル電気泳動およびＣＴＡＢ
抽出によって精製する。ｃＤＮＡの残りを、ＳａｌＩ−
ＥｃｏＲＩ断片としてｐ９Ｃ３′から単離する。２個の
断片を、ＥｃｏＲＩで消化したｐＵＣ９へ、３方連結に
より導入する。連結混合物を使用してＥ．コリＪＭ８３
を形質転換し、その細胞をＬＢ＋Ｘ−ｇａｌ上にプレー
トし、プラスミドＤＮＡを白色コロニーから単離する。
得られるプラスミドをｐＭＭＣと称する。これは、約１
５００bpＥｃｏＲＩ断片上にヒト−プロテインＣの完全
なコード配列を含んでいる。 【００６０】 【表１】 【００６１】例３．プロテインＣの発現ベクターの造成 ｐＭＭＣからプロテインＣコード挿入部をＥｃｏＲＩ断
片として取り出し、適当な哺乳類細胞発現ベクターに挿
入する。典型的なベクターはｐＤ７であり、ＳＶ４０エ
ンハンサーとアデノウイルス２主要後期プロモーターと
３分節リーダーを含む。 【００６２】プラスミドｐＤ７はプラスミドｐＤＨＦＲ
IIIから作成された（Berkner およびSharp ，Ｎｕｃ．
Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１３，８４１〜８５７頁，１９８
５年）。ｐＤＨＦＲ III中のＤＨＥＲ配列のすぐ上流の
ＰｓｔＩ部位をＢｃｌＩ部位に変換した。これは１００
μｌの緩衝液Ａ（１０mMのトリス（ｐＨ８），１０mMの
ＭｇＣｌ2 ，６mMのＮａＣｌ，７mMのβ−ＭＳＨ）中で
１０μｇのプラスミドを５ユニットのＢｓｔＩで１０分
間３７℃にて消化して行なった。ＤＮＡをフェノール抽
出し、ＥｔＯＨ沈澱し、１０mMのｄＣＴＰと１６ユニッ
トのＴ４ＤＮＡポリメラーゼを含む緩衝液Ｂ（５０mMの
トリス（ｐＨ８），７mMのＭｇＣｌ2 ，７mMのβ−ＭＳ
Ｈ）４０μｌに再懸濁し、そして１２０℃で６０分間イ
ンキュベートした。 【００６３】ＥｔｏＨ沈澱の後に、ＤＮＡを４００ユニ
ットのＴ４ポリヌクレオチドリガーゼを含む緩衝液Ｃ
（１０mMのトリス（ｐＨ８），１０mMのＭｇＣｌ2 ，１
mMのＤＴＴ，１．４mMのＡＴＰ）１４μｌ中で２．５μ
ｇのキナーゼ処理したＢＣｌＩリンカーに連結した。フ
ェノール抽出とＥｔＯＨ沈澱の後、ＤＮＡを１２０μｌ
の緩衝液Ｄ（７５mMのＫＣｌ，６mMのトリス（ｐＨ７．
５），１０mMのＭｇＣｌ 2 ，１mMのＤＴＴ）に再懸濁
し、８０ユニットのＢｃｌＩで５０℃にて６０分間消化
し、それからアガロース中で電気泳動させた。 【００６４】そのゲルらＦｏｒｍIII プラスミドＤＮＡ
（１０μｇ）を単離し、５０ユニットのＴ４ポリヌクレ
オチドリガーゼを含む緩衝液Ｃ１０μｌ中で２時間１２
℃にて連結させ、それを用いてＥ．Ｃｏｌｉ ＨＢ１０
１を形質転換した。ポジティブコロニーを迅速ＤＮＡ調
製分析法で特定し、ポジティブコロニーから調製したプ
ラスミドＤＮＡ（ｐＤＨＦＲ′と呼ぶ）をｄＡＭ- Ｅ．
コリに形質転換した。 【００６５】ｐＤＨＦＲ′（１５μｇ）およびｐＳＶ４
０（ｐＭＬ−１のＢａｍＨＩ部位にクローニングしたＢ
ａｍＨＩ消化ＳＶ４０ＤＮＡ）（２５μｇ）２５ユニッ
トのＢｃｌＩを含む緩衝液Ｄ１００μｌ中で６０分間５
０℃にて開裂した後、５０ユニットのＢａｍＨＩを添加
し、６０分間３７℃でさらにインキュベートして、プラ
スミドｐＤ２′を作成した。ＤＮＡ断片をアガロースゲ
ル電気泳動法で分離し、４．９kbのｐＤＨＦＲ′断片と
０．２kbＳＶ４０断片を単離した。これらの断片（２０
０ngのｐＤＨＦＲ′ＤＮＡと１００ngのＳＶ４０ＤＮ
Ａ）を１００ユニットＴ４ポリヌクレオチドリガーゼを
含む緩衝液Ｃ１０μｌ中で４時間１２℃にてインキュベ
ートし、得られる造成体（ｐＤ２′）を用いてＥ．コリ
ＲＲＩを形質転換した。 【００６６】プラスミドｐＤ２′をｐＢＲ３２２領域の
“ポイゾン”配列を除去して変形した（Lusky 及びBotc
han ，Ｎａｔｕｒｅ ２９３，７９〜８１頁，１９８１
年）。プラスミドｐＤ２′（６．６μｇ）およびプラス
ミドｐＭＬ−１（Lusky およびBotchan ，前掲）（４μ
ｇ）を夫夫１０ユニットのＥｃｏＲＩおよびＮｒｕＩを
含む緩衝液Ａ５０μｌ中で２時間３７℃にてインキュベ
ートした後、アガロースゲル電気泳動を行なった。１．
７kbのｐＤ２′断片と１．８kbのｐＭＬ−１断片を単離
し、それら（各５０ng）を１００ユニットのＴ４ポリヌ
クレオチドリガーゼを含む緩衝液２０μｌ中で２時間１
２℃にて相互に連結した後、Ｅ．コリＨＢ１０１に形質
転換した。所望の造成物（ｐＤ２と呼ぶ）を含むコロニ
ーを迅速調製分析法で特定した。次に、１０μｇのｐＤ
２を５０μｌの緩衝液Ａ中で夫々２０ユニットのＥｃｏ
ＲＩおよびＢｇｌIIで２時間３７℃にて消化した。ＤＮ
Ａをアガロース中で電気泳動させ、所望の、ｐＢＲ３２
２，３′スプライス部位、およびポリＡ配列を含む２．
８kb断片（断片Ｃ）を単離した。 【００６７】ｐＤ３を造成するのに用いる残りの断片を
作成するために、ｐＤＨＦＲ IIIを変形してＳａｃII
（ＳｓｔII）部位をＨｉｎｄ III部位またはＫｐｎＩ部
位に変換した。１０μｇのｐＤＨＦＲ IIIを２０ユニッ
トのＳｓｔIIで２時間３７℃にて消化した後フェノール
抽出およびエタノール沈澱を行なった。再懸濁したＤＮ
Ａを１０mMのｄＣＴＰと１６ユニットのＴ４ＤＮＡポリ
メラーゼを含む緩衝液Ｂ１００μｌ中で６０分間１２℃
にてインキュベートし、フェノール抽出し、透析し、そ
してエタノール沈澱した。ＤＮＡ（５μｇ）を４００ユ
ニットのＴ４ＤＮＡリガーゼを含む緩衝液２０μｌ中で
１０時間１２℃にて、５０ngのキナーゼ処理したＨｉｎ
ｄ IIIリンカーまたはＫｐｎＩリンカーと連結し、フェ
ノール抽出し、そしてエタノール沈澱した。 【００６８】５０μｌの緩衝液Ａに再懸濁後、得られる
プラスミドを適当であれば５０ユニットのＨｉｎｄ III
またはＫｐｎＩで消化し、アガロース中で電気泳動させ
た。ゲルから単離したＤＮＡ（２５０ng）を４００ユニ
ットのＴ４ＤＮＡリガーゼを含む緩衝液Ｃ３０μｌ中で
４時間１２℃にて連結し、それを用いてＥ．コリＲＲＩ
を形質転換した。得られるプラスミドはｐＤＨＦＲ III
（Ｈｉｎｄ III）およびｐＤＨＦＲ III（ＫｐｎＩ）と
指称した。ｐＤＨＦＲ III（ＫｐｎＩ）から、ＢｇｌII
およびＫｐｎＩで消化した後アガロースゲル電気泳動し
て７００bpＫｐｎＩ−ＢｇｌII断片（断片Ａ）を精製し
た。 【００６９】以下のようにしてＳＶ４０エンハンサー配
列をｐＤＨＦＲ III（Ｈｉｎｄ IIIに挿入した。５０μ
ｇのＳＶ４０ＤＮＡを５０ユニットのＨｉｎｄ IIIを含
む緩衝液Ａ１２０μｌ中で２時間３７℃にてインキュベ
ートし、Ｈｉｎｄ IIIＣＳＶ４０断片（５０８９−９６
８bp）をゲル精製した。プラスミドｐＤＨＦＲ III（Ｈ
ｉｎｄ III）（１０μｇ）を２５０ngの仔ウシ腸ホスフ
ァターゼで１時間３７℃にて処理し、フェノール抽出
し、そしてエタノール沈澱した。線状のプラスミド（５
０ng）を１６μｌの緩衝液Ｃ中で２００ユニットのＴ４
ポリヌクレオチドリガーゼを用いて３時間１２℃にて２
５０ngのＨｉｎｄ IIIＣＳＶ４０と連結し、Ｅ．ｃｏｌ
ｉ ＨＢ１０１に形質転換した。 【００７０】ｐＤ３の最終造成のため、断片Ａと断片Ｂ
（各５０ng）を２００ユニットのＴ４ポリヌクレオチド
リガーゼを用いて４時間１２℃にて１０ngの断片Ｃと連
結し、そしてＥ．コリＲＲＩのトランスフェクションを
行なった。迅速調製分析法でポジティブコロニーを検出
し、ｐＤ３の大規模調製を行なった。プラスミドｐＤ３
を、ＢｃｌＩ挿入部位をＥｃｏＲＩ部位に変換してプロ
テインＣ配列の挿入を受容するように変形する。第１
に、ｐＤ３のアデノウイルス５０−１マップユニット配
列の最左端に存在するＥｃｏＲＩ部位を、それを慣用の
リンカー手法でＢａｍＨＩ部位に変換して除去すること
が必要である。すなわち、プラスミドをＥｃｏＲＩで消
化し、線状化したＤＮＡをＴ４ポリメラーゼおよび４種
全部のデオキシヌクレオチドトリホスフェートで処理し
て平滑末端を形成する。 【００７１】次にプラスミドをＢａｍＨＩ部位を含むオ
クトヌクレオチドに連結し、ＤＮＡをＢａｍＨＩで消化
して余剰のリンカーを除去し、そして哺乳類細胞発現配
列を含む断片をＰＭＬ−１のＢａｍＨＩ部位にクローニ
ングする。得られるプラスミドをＥ．コリＨＢ１０１に
形質転換し、プラスミドＤＮＡを調製し、正しい変換体
を選別する。同様な仕方でＢｃｌＩ部位を適当なオクト
ヌクレオチドリンカーを用いてＥｃｏＲＩ部位に変換す
る。得られるベクターはｐＤ７として知られる。次にｐ
ＭＭＣからの１．５kbのプロテインＣＥｃｏＲＩ断片を
ｐＤ７のＥｃｏＲＩ部位に挿入して発現ベクターｐＤ７
Ｃ（図１５）を作成する。 【００７２】ｐＤ５を用いることにより、ポリシストロ
ンメッセージからのタンパクＣ配列の発現を可能にする
ベクターを造成する。該ｐＤ５は５′非コード領域の大
部分を欠如しているＤＨＦＲコード配列を含有するｐＤ
３に類似したプラスミドである。ＤＨＦＲ配列を更に変
形し、メトトレキセートに対するその結合親和性を減少
する。ベクターｐＤ５はｐＤ３について記載した方法と
同様の方法で造成され、そしてこれはＢａｍＨＩ部位が
異種性ＤＮＡの挿入部位である点およびＳＶ４０ポリア
デニレーションシグナルを含有するＢｃｌＩ−ＢａｍＨ
ＩＳＶ４０断片がレイトオリエンテーション（ｌａｔｅ
ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）にある点においてのみｐＤ
３と異っている。 【００７３】ＤＨＦＲ配列は、最初にＰｓｔＩおよびＳ
ｓｔＹでｐＤＨＦ IIIを消化し次いで４００bpＤＨＦＲ
断片を単離することにより変形される。これはＭＩファ
ージベクター中でクローン化され次いでシモンセンおよ
びレビンソンにより記載される如く（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８０：２４９５−２４９
９，１９８３）突然変異誘発される。誘発はＤＨＦＲ配
列中、１個の塩基対変化をもたらす。次いで変化させた
断片をｐＤＨＦＲ IIIに再挿入しプラスミドｐＤＨＦr
III を得る。 【００７４】次いでＤＨＦＲ配列の５′非コード領域を
除去する。プラスミドｐＤＨＦＲrIIIをＦｎｕ４ＨＩ
（これは、約２０の部位でプラスミドを切断する）で開
裂し、次いでＴ４ＤＮＡポリメラーゼ及び全ての４種類
のデオキシヌクレオチドトリホスフェートで処理するこ
とにより平滑末端を生じさせる。ＢａｍＨＩリンカーを
末端に結合させ、次いで混合物をＢａｍＨＩおよびＮｃ
ｏＩで消化させる。ＤＨＦＲr ｃＤＮＡを含む０．６kb
ＢａｍＨＩ−ＮｃｏＩ断片を単離する。 【００７５】プラスミドｐＤＨＦＲ IIIをＮｃｏＩおよ
びＢａｍＨＩで消化し次いでＳＶ４０ポリアデニレーシ
ョンシグナルを含む０．２kb断片を単離する。次いで、
アーリーオリエンテーション（ｅａｒｌｙ ｏｒｉｅｎ
ｔａｔｉｏｎ）においてポリアデニル化シグナルをＤＨ
ＦＲr 断片に結合させる。ＢａｍＨＩで消化後、生成す
るＢａｍＨＩ断片をｐＤ５のＢａｍＨＩ部位に挿入し、
次いで連結混合物を、Ｅ．コリ−ＨＢ１０１を形質転換
するために用いる。プラスミドＤＮＡを調製し次いで制
限エンドヌクレアーゼ消化によりスクリーンする。Ａｄ
２主要後期プロモーターから転写のため正しい配向でＤ
ＨＦＲr 挿入部を有するプラスミドをｐＤ５（ＤＨＦＲ
r ）と命名する。 【００７６】プラスミドｐＤ５（ＤＨＦＲr ）を用いて
プロテインＣを発現するため、ｐＭＭＣをＥｃｏＲＩで
消化し次いで１．５kbプロテインＣ断片を単離する。Ｅ
ｃｏＲＩ末端を、リンカーの付加によりＢｃｌＩ末端に
変換する。プラスミドｐＤ５（ＤＨＦＲr ）をＢａｍＨ
Ｉで部分消化してＤＨＦＲr 配列の５′末端でそれを解
裂させ次いでプロテインＣ断片に結合させる。プラスミ
ドＤＮＡを正しい方向性およびプロテインＣ断片の挿入
部についてスクリーニングする。ｐＤ５（ｐｃ−ＤＨＦ
Ｒr ）と命名した生成ベクターを図１６に示す。 【００７７】例４．トランスフェクトされた哺乳動物細
胞におけるプロテインＣの発現 小ハムスターの腎臓細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ１
０）を、記載されるのと本質的に同じ方法でｐＤ７Ｃを
用いてトランスフェクトする（ウイグラー等、Ｃｅｌｌ
１４；７２５，１９７８；カルサロおよびピアリン、
Somatic Cell Genetics ７：６０３，１９８１；および
Graham and Van der Eb, Virology ５２：４５６，１９
７３）。細胞を６０mm組織培養ペトリ皿内のダルベッコ
培地（１０％の熱不活性化ウシ胎児血清が加えられ更に
グルタミンおよびペニシリン−ストレプトマイシンが補
足されている）中、３７℃，５％ＣＯ2 でコンフルエン
シー２０％に増殖させる。合計１０μｇのＤＮＡをトラ
ンスフェクトするため用いる。 【００７８】１個の６０mm皿：３．７５μｇのｐＤ７
Ｃ，１．２５μｇのｐｋｏ−ｎｅｏ（Southern and Ber
g, J. Mol. Appl. Genet １：３２７−３４１，１９８
２）および５μｇのサケ精子ＤＮＡ。ＤＮＡを０．３Ｍ
のＮａＯＡｃおよび７５％エタノール中で沈澱させ、７
０％エタノールで洗浄し次いで２０μｌの１０mMトリス
−ＨＣｌ（ｐＨ８）および１ｍＭＥＤＴＡ中に再溶解す
る。ＤＮＡを水４４０μｌ、並びに２８０mMのＮａＣ
ｌ，１．５mMのＮａＨＰＯ4 ，１２mMのデキストロース
および５０mMのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．１２）の５００μ
ｌと一緒にする。２５０mMのＣａＣｌ2 ６０μｌを上記
混合物に滴加し次いで溶液を室温で３０分間放置する。 【００７９】次いで溶液を細胞に添加し、細胞を４時間
３７℃に戻す。培地を除去し次いで血清を含有するダル
ベッコ培地の２０％ＤＭＳＯ５mlを２分間室温で添加す
る。直ちに培地を２回交換して皿を洗浄し、次いで新鮮
な培地で一夜インキュベートする。ＤＮＡを添加後、２
４時間目に培地を除去し次いで選択培地（血清を含有す
るダルベッコ培地中、１０mg／mlのＧ４１８，４９８μ
／mg、ギブコ）を添加する。約１０〜１３日後、ｐｋｏ
−ｎｅｏ遺伝子を組み入れてＧ４１８に対して耐性の細
胞を代表する個々のクローンを、９６個のウェルを有す
るプレートに移し次いでプロテインアッセイのため１０
％ウシ胎児血清を加えたダルベッコ培地中で増殖させ
る。 【００８０】プロテインＣの分析のため、培地を遠心分
離することにより細胞および細胞破片を分離し、次いで
プロテインＣポリペプチドおよび生物活性について分析
する。細胞をトリプシンを用いて皿から取り出し、新鮮
な培地で洗浄し、遠心分離し更に−２０℃で凍結させ
る。分析用に細胞ペレットをＰＢＳ中で解凍し、ペレッ
ト化し、次いで０．２５％トリトンＸ−１００を含有す
るＰＢＳ中に再懸濁させる。サンプルを希釈し次いでポ
リペプチドおよび活性を分析する。 【００８１】プロテインＣについてのＥＬＩＳＡは次の
ように行う。ヒトプロテインＣ（０．１ＭＮａ2 ＣＯ3
中５nl／ml，ｐＨ９．６）に対する抗体（モノクローナ
ルもしくはポリクローナル）２００μｌを、９６個のウ
ェルを有するプレートの各ウェル中で２時間３７℃でイ
ンキュベートする。次いでウェルをＰＢＳ中、２２０μ
ｌの、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および０．０
５％トウィーン２０と共に３７℃で２時間インキュベー
トする。プレートを水で洗い、風乾し、４℃で保存す
る。サンプルを分析するため、２００μｌのサンプルを
抗体でコートされたウェル中で、室温にて１時間インキ
ュベートする。 【００８２】次いでウェルを０．０５％トウィーン２０
を含有するＰＢＳ２００μｌで４回洗浄する。５６mg／
ｌのＭｇＣｌ2 を含有するｐＨ９．８のジエタノールア
ミン緩衝液（１ｌ当たり９６ml）に溶解した２００μｌ
のｐ−ニトロフェニルホスフェート（３０mg）をウェル
に添加する。酵素反応を３７℃で行ない次いで黄色の展
開を、ＥＬＩＳＡプレート読みとり器を用い４０５nmで
監視する。キーゼルおよびデビー（Ｍｅｔｈ．ｉｎ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ８０：３２０−３３２，１９８
１）により記載される如く、スロンビンによりプロテイ
ンＣを活性化した後、血漿のカオリン−セファリン凝固
時間を延長させるその能力により、該プロテインＣ生物
活性を分析する。 【００８３】例５．プロテインＣをコードする完全長ｃ
ＤＮＡの発現 Ａ．ｃＤＮＡの単離 プロテインＣのプレ−プロペプチド（図６のエクソン
１）のアミノ酸−４２〜１９に相当するエクソンを含む
ゲノムフラグメントを単離し、ニック翻訳し、Gublerお
よびHoffman の技法（Ｇｅｎｅ２５：２６３〜２６９，
１９８３年）によりｍＲＮＡを用いて、ＨＥＰＧ２細胞
から造成されたｃＤＮＡライブラリーをスクリーニング
するためのプローブとして用いた。このセルラインは、
ヒト肝細胞から誘導されたもので、プロテインＣを合成
することが予め示されたものであった（FairおよびBahn
ak，Ｂｌｏｏｄ ６４：１９４〜２０４，１９８４
年）。 【００８４】ファージｇｔ１１のＥｃｏＲＩ部位内に挿
入されたｃＤＮＡを含む１０のポジティブクローンを単
離し、プロテインＣ遺伝子の５′非コード領域に対応す
るオリゴヌクレオチドプローブによりスクリーニングし
た。１のクローンもこのプローブによりポジティブであ
り、その全ヌクレオチド配列を決定した。このｃＤＮＡ
は７０bpの５′非翻訳配列、ヒト−プレプロプロテイン
Ｃに対する全コード配列、および第２ポリアデニレーシ
ョン部位（図２〜図４）に対応する全３′非コード領域
を含んでいた。 【００８５】Ｂ．発現ベクター造成 プロテインＣｃＤＮＡの発現がベクターｐＤＸ中で達成
された。このベクターは、ｐＤ３（例３に記載）および
ｐＤ３′即ちＳＶ４０ポリアデニレーションシグナル
（即ち、ＳＶ４０ＢａｍＨＩ〔２５３３bp〕〜ＢｃｌＩ
〔２７７０bp〕断片）がレートオリエンテーションにあ
ることを除いてｐＤ３と同一のベクターから誘導され
た。従って、ｐＤ３′は遺伝子挿入部位としてＢａｍ部
位を含む。 【００８６】ｐＤＸを成生するために、ｐＤ３′中のＥ
ｃｏＲＩ部位を、ＥｃｏＲＩ開裂、Ｓ１ヌクレアーゼと
のインキュベーション、および引続くＢｃｌＩリンカー
による連結により、ＢｃｌＩ部位に変形した。ポジティ
ブに同定されたコロニーからＤＮＡを調断し、変化した
制限部位を含む１．９kbＸｈｏＩ−Ｐｓｔ断片をアガロ
ースゲル電気泳動により調製した。第２の変形において
は、遺伝子を発現ベクター中に挿入するための位置とし
てＥｃｏＲＩ部位を形成するために、ＢｃｌＩ開裂ｐＤ
３をキナーゼ処理されたＥｃｏＲＩ−ＢｃｌＩアダプタ
ー（オリゴヌクレオチドＺＣ５２５，５′ＧＧＡＡＴＴ
ＣＴ３′、およびＺＣ５２６，５′ＧＡＣＡＧＡＡＴＴ
ＣＣ３′から造成）と連結した。 【００８７】ポジティブコロニーを制限エンドヌクレア
ーゼ分析により同定し、これからのＤＮＡを用いて変形
制限部位を含む２．３kbＸｈｏＩ−Ｐｓｔ断片を単離し
た。上記の２つのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼとも
にインキュベートし、Ｅ．コリＨＢ１０１に形質転換
し、制限分析によりポジティブコロニーを同定した。次
いで、ｐＤＸと呼ばれる、かかるＤＮＡの調製を行っ
た。このプラスミドは外来性遺伝子の挿入のためのユニ
ークＥｃｏＲＩ部位を含む。 【００８８】次に、プロテインＣｃＤＮＡをＥｃｏＲＩ
断片としてｐＤＸ中に挿入した。組換プラスミドを制限
分析によりスクリーニングしてプロモーター要素に対し
て正しい方向のプロテインＣ挿入部を有するプラスミド
を同定し、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＸ／ＰＣと表示され
る）を正しいクローンから調製した（図１７）。ｐＤＸ
／ＰＣ中のｃＤＮＡ挿入部は５′非コード領域中にＡＴ
Ｇコドンを含むから（図２）、トランスフェクションお
よび発現実験の前にｃＤＮＡに対して欠失変異誘発が行
われた。３塩基対の欠失がオリゴヌクレオチド指令変異
誘発の標準操作に従って行われた。変形ｃＤＮＡを含む
ｐＤＸにもとづくベクターをｐ５９４と表示した。 【００８９】Ｃ．ｃＤＮＡ発現 プラスミドｐ５９４を燐酸カルシウム沈澱によりＣＯＳ
細胞中にトランスフェクトした。４時間後に、新たな培
地（５μｇ／mlのビタミンＫを補充）を添加した。適当
な時間（通常４８または７２時間）で、培地を収得し、
細胞を回収し、溶解した。 【００９０】培地又は細胞抽出物中に分泌されたプロテ
インＣを、ＥＬＩＳＡにより、ｃＤＮＡクローンの初期
同定に用いたのと同一のアフィニティー精製したポリク
ローナル抗体を用いて、分析した。分析の結果（第２
表）は、プロテインＣが実験サンプル中で合成されてお
り、トランスフェクトされた細胞から容易に分泌された
ことを示しており、プロテインＣの約９０％が培地中に
認められた。組換蛋白のγ−カルボキシル化の程度を評
価するために、培地のサンプルをクエン酸バリウム沈澱
即ち血漿からγ−カルボキシル化蛋白のみを選択的に沈
澱させるプロセス（Bajaj 他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２５６：２５３〜２５９，１９８１年）に付した。
抗原物質の７０％以上をクエン酸バリウムにより沈澱さ
せることができた。 【００９１】組換プロテインＣを、その凝固を引き延ば
す能力を測定することにより、抗凝固性活性の分析に付
した。透析した培地サンプルをＰｒｏｔａｃ Ｃ （Ａ
ｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｉｃａ）により処理して
プロテインＣを活性化した。次に、サンプルをインビト
ロークロッティングアッセイ (Sugo他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２６０：１０４５３，１９８５年）に付し、
クロッティング時間を測定した。組換物質の活性は、天
然産のプロテインＣのそれと本質的に同一であることが
認められた。 【００９２】 【表２】 【００９３】以上の説明から、説明のためにこの明細書
においては本発明の特定の態様を記述したけれども、本
発明の精神と範囲から逸脱することなく、種々の変更が
なされ得るということが理解されるであろう。従って、
本発明は、特許請求の範囲による場合を除いては、限定
して理解されるべきものではない。
質及びそれらをコードするＤＮＡ配列に関し、そしてさ
らに詳しくはヒト−プロテインＣと実質的に同じ構造及
び／又は活性を有する蛋白質の発現に関する。 【０００２】 【従来の技術】プロテインＣは、インビボにおける血液
凝固の制御及びフィブリン溶解活性の発生において重要
な役割を演ずるセリンプロテアーゼのチモーゲン（ｚｙ
ｍｏｇｅｎ）又は前駆体である。これは肝臓内で単鎖ポ
リペプチドとして合成され、この単鎖ポリペプチドはか
なりのプロセシングを受けて、ジスルフィド結合により
一体化されたヘビー鎖（Ｍｒ＝４０，０００）及びライ
ト鎖（Ｍｒ＝２１，０００）から成る２本鎖分子とな
る。循環する２本鎖中間体が、ヘビー鎖のアミノ末端か
らの１２−残基ペプチドのスロンビン介在開裂により、
“活性化されたプロテインＣ”（ＡＰＣ）として知られ
ている生物学的に活性な形態の分子に転換される。この
開裂反応は、インビボにおいて、内皮細胞コファクター
であるスロンボモジュリン（ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌ
ｉｎ）により増強される（Esmon 及びOwen，Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８；２２４９
−２２５２，１９８１）。 【０００３】プロテインＣはビタミンＫ−依存性グリコ
プロテインであって、約９残基のγ−カルボキシグルタ
ミン酸（Ｇｌａ）及び１当量のβ−ヒドロキシアスパラ
ギン酸を含有し、これらはそれぞれグルタミン酸残基及
びアスパラギン酸残基の翻訳後修飾によって形成され
る。プロテインＣ中の特定のγ−カルボキシグルタミン
酸残基の翻訳後形成はビタミンＫを必要とする。これら
の異常なアミノ酸残基はカルシウムイオンに結合し、そ
してこの蛋白質とホスホリピドとの相互作用を担当する
と信じられ、この相互作用はプロテインＣの生物学的活
性を必要とする。 【０００４】他のビタミンＫ−依存性血漿蛋白質、例え
ばファクターVII 、ファクターIX、及びファクターＸの
凝固促進作用と異り、活性化されたプロテインＣは限定
された蛋白質分解によるファクターＶａおよびファクタ
ーVIIIａの不活性化を介して凝固過程の制御物質として
機能する。プロテインＣによるファクターＶａ及びVIII
への不活性化は酸性ホスホリピド及びカルシウムイオン
の存在に依存する。プロテインＳはＡＰＣにより触媒さ
れるファクターＶａの蛋白質分解を促進することにより
この活性を制御することが報告されている（Walker，
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：５５２１−５５２
４，１９８０）。 【０００５】プロテインＣはまた、組織型プラスミノー
ゲンアクチベーターの作用と関連付けられている（Kisi
el及びFujikawa，Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｉｎｓｔ．Ｍｉｔ
ｔ．７３：２９−４２，１９８３）。ウシＡＰＣのイヌ
への注入はプラスミノーゲンアクチベーター活性の増加
をもたらす（Comp及びEsmon ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅ
ｓｔ．６８：１２２１−１２２８，１９８１）。最近の
研究（Sakata等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，８２：１１２１−１１２５，１９８５）は
培養された内皮細胞へのＡＰＣの添加が条件調節された
培地中でのフィブリン溶解活性の急速で投与量依存的な
増加を導き、細胞によるウロキナーゼ関連及び組織型プ
ラスミノーゲンアクチベーターの両者の活性の増加を反
映することを示している。 【０００６】先天性のプロテインＣ欠損は再発性血栓性
疾患と関連し（Broekmans 等、Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍ
ｅｄ．３０９：３４０−３４４，１９８３；及びSeligs
ohn等，Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１０：５５９
−５６２，１９８４）、そして遺伝子的不調又は外傷、
例えば肝臓病又は外科手術から生ずるであろう。この状
態は一般に経口抗凝固剤により治療される。プロテイン
Ｃ含有正常血漿の注入によっても有利な結果が得られた
（Gardiner及びGriffin ，Prog .in Hematology, Brow
n, Grune 及びStratton編、ニューヨーク、１３：２５
６−２７８を参照のこと）。さらに、若干の研究者は、
プロテインＣの抗凝固活性が血栓性不調、例えば静脈血
栓症の治療において有用であることを見出している（Ｗ
Ｏ８５／００５２１）。世界の幾つかの地域で、１６，
０００の個体中およそ１個体がプロテインＣ欠損を示す
ことが予想される。さらに、プロテインＣの完全な欠損
は新生児においては致命的である。 【０００７】 【発明が解決しようとする課題】天然プロテインＣは凝
因子濃縮物から（Marlar等、Ｂｌｏｏｄ，５９：１０６
７−１０７２）又は血漿から（Kisiel、前掲）精製する
ことができるが、出発材料の限定された入手可能性及び
血漿中でのプロテインＣの低い濃度のために、この方法
は複雑で高価な方法である。従って、ヒト血液に由来す
る生成物の療法的使用は、例えば肝炎ウイルス、サイト
メガロウイルス、又は後天性免疫不全症候群（ＡＩＤ
Ｓ）の原因剤による病気の伝染の危険を有する。血栓性
疾患の治療におけるプロテインＣの臨床的適用の可能性
の観点から、プロテインＣ及び活性化されたプロテイン
Ｃの有用な量の製造が明らかに重要である。 【０００８】 【課題を解決するための手段】要約すれば、この発明
は、ヒト−プロテインＣ又は活性化されたヒト−プロテ
インＣと実質的に同じ構造及び／又は生物学的活性を有
する蛋白質をコードするＤＮＡ配列を開示する。さら
に、この発明は、哺乳類宿主細胞ＤＮＡに組み込まれる
ことができ、プロモーター、及びこれに続きその下流に
あるヒト−プロテインＣ又は活性化されたヒト−プロテ
インＣと実質的に同じ構造及び／又は活性を有する蛋白
質をコードするヌクレオチド配列を含有し、このヌクレ
オチド配列の転写が前記プロモーターにより指令される
発現ベクターを開示する。このヌクレオチド配列に続き
その下流にポリアデニレーションシグナルが存在する。
１つの具体例においては、この発現ベクターは、前記ヌ
クレオチド配列とポリアデニレーションシグナルとの間
に位置する選択マーカーを含有し、この選択マーカーの
転写は前記プロモーターにより指令される。発現ベクタ
ーはまた１セットのＲＮＡスプライシング部位を含有す
ることができる。 【０００９】この発明の関連する観点は、活性化された
ヒト−プロテインＣと実質的に同じ生物学的活性を活性
化後に有する蛋白質を発現するためにトランスフェクト
された哺乳類細胞を開示する。この哺乳類細胞は哺乳類
宿主細胞ＤＮＡに組み込まれ得る発現ベクターによりト
ランスフェクトされ、この発現ベクターは、プロモータ
ー、並びにこれに続きその下流に存在する、ヒト−プロ
テインＣと実質的に同じ構造及び／又は活性を有する蛋
白質をコードするヌクレオチド配列を含有する。１つの
具体例において、選択マーカーが細胞に導入され、そし
て安定にトランスフェクトされた細胞が選択される。活
性化されたヒト−プロテインＣと実質的に同じ生物学的
活性を有する蛋白質を発現するために形質転換された哺
乳類細胞も開示される。 【００１０】この発明の他の観点は、活性化されたヒト
−プロテインＣと実質的に同じ生物学的活性を活性化後
に有する蛋白質の製造方法を開示する。この方法は、
（ａ）ヒト−プロテインＣと実質的に同じ構造及び／又
は活性を有する蛋白質をコードする配列を含んで成る発
現ユニットを哺乳類宿主細胞に導入し；（ｂ）この哺乳
類宿主細胞を適当な培地中で増殖せしめ；そして（ｃ）
前記発現ユニットによりコードされておりそして前記哺
乳類宿主細胞によって生産された蛋白質生成物を単離す
ることを含んで成る。この方法によって製造された蛋白
質生成物も開示される。活性化されたヒト−プロテイン
Ｃと実質的に同じ構造及び／又は生物学的活性を有する
蛋白質の製造方法も開示される。 【００１１】この発明において記載される蛋白質は、血
液凝固の制御を含む活性療法物質として使用することが
できる。さらに、これらの蛋白質は、適当な医薬組成物
を提供するために生理的に許容される担体及び／又は稀
釈剤と混合することができる。この発明の他の観点は、
詳細な記載及び図面への言及によって明らかになるであ
ろう。 【００１２】 【発明の実施の形態】この発明を記載するに先立って以
下に使用する用語の定義を記載するのが発明の理解のた
めに有用であろう。生物学的活性 ：生物学的内容物（すなわち生物体又はイ
ンビトロ模倣物）中の分子により行われる１つの機能又
は１セットの機能である。蛋白質の生物学的活性は触媒
活性とエフェクター活性とに分けることができる。ビタ
ミンＫ−依存性血漿蛋白質の触媒活性は基質の活性化又
は不活性化をもたらす他の血漿蛋白質基質の特異的蛋白
質分解的開裂を含む。エフェクター活性は生物学的に活
性な分子のカルシウムもしくは他の小分子への、大分
子、例えば蛋白質への、又は細胞への特異的結合を含
む。エフェクター活性はしばしば生理的条件下での触媒
活性を増強し、又はそのために必須である。 【００１３】プロテインＣについては、生物学的活性は
その抗凝固性及びフィブリン溶解性により特徴付けられ
る。プロテインＣは、活性化された場合、ホスホリピド
及びカルシウムの存在下でファクターＶａ及びファクタ
ーVIIIａを不活性化する。プロテインＳはこの機能の制
御に関与するようである（Walker、前掲）。活性化され
たプロテインＣはまたフィブリン溶解を増強し、この効
果はプラスミノーゲンアクチベーター阻害物質のレベル
を低下せしめることにより介在されると信じられる（va
n Hinsbergh 等、Ｂｌｏｏｄ ６５：４４１−４５１，
１９８５）。後でさらに十分に記載するように、プロテ
インＣ遺伝子のエクソンVII 及びVIIIによりコードされ
るプロテインＣのその部分はその触媒活性を主として担
当するであろう。 【００１４】プレ−プロペプチド：幾つかの蛋白質のア
ミノ末端に存在し、そして一般にトランスロケーション
中にその蛋白質から開裂されるアミノ酸配列である。プ
レ−プロペプチドはその蛋白質を細胞の分泌経路に向け
る配列（シグナル配列）を含んで成り、そして疎水性ア
ミノ酸のコアの存在により特徴付けられる。これらはま
たプロセシングシグナルを含む。この明細書において使
用する場合、“プレ−プロペプチド”なる語はまた天然
プレ−プロペプチドの部分を意味する。 【００１５】“発現ユニット”：注目の蛋白質をコード
する主たるヌクレオチド配列を、該主たるヌクレオチド
配列の転写を指令しそして制御する他のヌクレオチド配
列と共に含んで成るＤＮＡ構成である。発現ユニットは
少なくとも、前記の主たるヌクレオチド配列、並びに該
主たるヌクレオチド配列の上流に位置しそして作用可能
に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）連結されているプロモーター配
列及び下流に位置するポリアデニレーションシグナルか
ら成る。発現の効率を増強するために追加の遺伝子要素
が含まれることもできる。 【００１６】発現ベクター：特に、注目の蛋白質をコー
ドするＤＮＡ配列をプロモーター及び該蛋白質の発現を
促進するための他の配列と共に含有するＤＮＡ分子であ
る。発現ベクターはさらに、宿主細胞中でのその複製を
もたらす遺伝情報を含有する。組換ＤＮＡのために一般
に使用される発現ベクターの例はプラスミド及び幾つか
のウイルスである。但し、発現ベクターはこれら両者の
要素を含有することもできる。これらはまた選択マーカ
ーを含有することができる。 【００１７】前記のごとく、プロテインＣは肝臓におい
て生産され、そしてその生合成のためにビタミンＫを要
求する。ビタミンＫは、ライト鎖のアミノ末端領域中の
特定のγ−カルボキシグルタミン酸の形成のために必要
である。これらのアミノ酸残基は翻訳後修飾によって形
成され、そしてホスホリピドへのカルシウム介在結合の
ために必要とされる。さらに、プロテインＣは、やはり
翻訳後修飾によって形成される１個のβ−ヒドロキシア
スパラギン酸を含有する。しかしながら、このアミノ酸
残基の役割は知られていない。 【００１８】プロテインＣの活性が特定のグルタミン酸
残基のγ−カルボキシル化を含む翻訳後修飾に依存し、
そして特定のアスパラギン酸残基のヒドロキシル化にも
依存するかもしれないという事実があれば、微生物中で
のプロテインＣのクローニング及び発現を介して活性な
生成物が生成することはできそうにない。従って、この
発明は、γ−カルボキシル化されており、そして活性化
されたヒト−プロテインＣの生物学的活性を活性化後に
有する蛋白質を、永久的に該蛋白質を発現するようにト
ランスフェクトされた哺乳類細胞を用いて製造する方法
を提供する。この発明はさらに、γ−カルボキシル化さ
れておりそして活性化を必要としないで、活性化された
ヒト−プロテインＣの生物学的活性を有する蛋白質を製
造する方法を提供する。 【００１９】ウシ−プロテインＣのライト鎖及びヘビー
鎖は配列決定されている（Fernlund及びStenflo ，Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７：１２１７０−１２１７
９，１９８２；及びStenflo 及びFernlund，Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７：１２１８０−１２１９０，１
９８２）。ヒト−プロテインＣの単離及び特徴付けはKi
siel，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，６４：７６１−
７６９，１９７９により記載されている。アミノ末端ア
スパラギン酸残基を除き、ヒト−プロテインＣのヘビー
鎖のアミノ末端配列はウシの蛋白質のヘビー鎖中に存在
する最初の８個のアミノ酸と異る。 【００２０】ヒトの酵素及びウシの酵素の両者の抗凝固
活性は高度に種特異的であることが見出された。種特異
性はプロテインＳにより介在されると信じられる（Walk
er，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．２２：３２１−３２７，１
９８１）。しかしながら、ヒト及びウシの蛋白質は相互
に、並びにプロスロンビン、ファクターVII 、ファクタ
ーIX及びファクターＸを包含する他のビタミンＫ−依存
性血漿蛋白質と、かなりの全体的構造的類似性を示す。
類似性は、ライト鎖中のＧｌａ残基の存在及びヘビー鎖
中の活性部位セリン、並びにライト鎖のアミノ末端領域
中の他のアミノ酸配列の類似を包含する。 【００２１】この発明においては、λｇｔＩ１ ｃＤＮ
Ａライブラリーをヒト肝臓ｍＲＮＡから調製した。次
に、このライブラリーをヒト−プロテインＣに対する
125Ｉラベル化抗体を用いてスクリーニングした。抗体
反応性クローンをさらに、λｇｔＩ１ベクター中でのβ
−ガラクトシダーゼとプロテインＣとの融合蛋白質の合
成について分析した。クローンの１つが抗体プローブと
の強いシグナルを与え、そして約１４００bpの挿入部を
含有することが見出された。ＤＮＡ挿入部のＤＮＡ配列
分析により、Fernlund及びStenflo （Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．，２５７：１２１７０−１２１７９；Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７：１２１８０−１２１９０）
により決定されたウシ−プロテインＣの大部分と高度に
相同性を示す予想通りのアミノ酸配列が示された。 【００２２】ＤＮＡ挿入部は、ライト鎖のアミノ酸６４
から始まり、完全なヘビー鎖コード領域を含み、そして
終止コドンに進む、プロテインＣのコード領域のほとん
どを含んでいた。さらに、ヘビー鎖の終止コドンに続
き、３′非コード配列の２９４塩基対及び９塩基対のポ
リ（Ａ）テイルが存在した。プロセシング及びポリアデ
ニレーションシグナルＡ−Ａ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ａがこのｃ
ＤＮＡ挿入部中のポリ（Ａ）テイルから１３塩基対上流
に存在した。この配列は、２個の可能性あるポリアデニ
レーション部位の１つであった。 【００２３】ｃＤＮＡ配列はまた位置１５６−１５７に
ジペプチドＬｙｓ−Ａｒｇを含有していた。これはヘビ
ー鎖からライト鎖を隔離し、そして蛋白質分解的開裂に
よるプロセシングの過程で除去され、２本鎖分子の分泌
をもたらす。スロンビンによる活性化の際、ヒト−プロ
テインＣのヘビー鎖はアルギニン−１６９とロイシン−
１７０の間で開裂され、活性化ペプチドをもたらす（図
２）。 【００２４】同様の方法により、プレ−プロペプチド及
びプロテインＣの初めの２３個のアミノ酸のためのコー
ド配列を欠く第２のｃＤＮＡを単離した。このｃＤＮＡ
をハイブリダイゼーションプローブとして用い、コード
配列の残りをλシャロン４Ａ中のヒトゲノムＤＮＡライ
ブラリーから得た（Fosterなど．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４６７３〜４６
７７，１９８５）。プロテインＣ遺伝子のためのオーバ
ーラップ挿入部を含む、３種の異なるλシャロンファー
ジを単離した。 【００２５】３種のファージクローン上のエクソンの位
置を、上記の１４００bpのｃＤＮＡから製造されたプロ
ーブを用いる、これらのクローンの消化物のサザンブロ
ットハイブリダイゼーションによって決定した。これら
のクローン中のゲノムＤＮＡ挿入部を、単一の及び二重
の制限酵素による消化、及びこれに続くアガロースゲル
電気泳動、サザンブロッティング及びヒトプロテインＣ
のためにｃＤＮＡに由来する放射性標識された５′及び
３′プローブに対するハイブリダイゼーションによっ
て、図５に示されるようにマッピングした。 【００２６】ＤＮＡ配列決定研究を、チェインターミネ
ーター法（dideoxy chain-termination method）を用い
て行なった。図６〜図９に示されるように、ヒト−プロ
テインＣのための遺伝子のヌクレオチド配列は、およそ
１１kbのＤＮＡにわたる。これらの研究はさらに、４２
個のアミノ酸の潜在的なプレ−プロペプチドを表わす。
−１〜−２０の領域におけるウシ−プロテインＣのプレ
−プロペプチドとの相同性に基づいて、位置−１０のＡ
ｌａ残基の後のプレプロ配列がシグナルペプチダーゼに
よって開裂されるらしい。成熟タンパク質へのプロセシ
ングは、アミノ末端のプロペプチドを除去するために残
基−１の後の、並びにＬ鎖及びＨ鎖を連結するＬｙｓ−
Ａｒｇジペプチドを除去するために残基１５５及び１５
７での追加のタンパク分解性開裂を含む。この最終プロ
セシングは、１５５個のアミノ酸のＬ鎖及び２６２個の
アミノ酸のＨ鎖をもたらす。 【００２７】プロテインＣの遺伝子は、２５〜８８５ヌ
クレオチドのサイズ範囲の８個のエクソン、及び９２〜
２６６８ヌクレオチドのサイズ範囲の７個のイントロン
から成る。エクソンＩ及びエクソンIIの一部は、４２個
のアミノ酸のプレ−プロペプチドをコードする。エクソ
ンIIの残る部分、エクソンIII 、エクソンIV、エクソン
Ｖ及びエクソンVIの一部はプロテインＣのＬ鎖をコード
する。エクソンVIの残る部分、エクソンVII 及びエクソ
ンVIIIはプロテインＣのＨ鎖をコードする。ヒト−プロ
テインＣのアミノ酸配列及びＤＮＡ配列は図２〜図４に
示されている。 【００２８】プロテインＣのための遺伝子中のイントロ
ンの位置は、種々の機能ドメインの間に主として存在す
る。エクソンIIは、プレ−プロペプチドの高度に保存さ
れた領域及びγ−カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）ド
メインにわたる。エクソンIII は、Ｇｌａ及び成長因子
ドメインを連結する８個のアミノ酸を含む。エクソンIV
及びＶはそれぞれ、潜在的な成長因子ドメインを表わ
し、他方エクソンVIは、活性化ペプチドを含む連結領域
を包含する。エクソンVII 及びVIIIは、すべてのセリン
プロテアーゼに典型的な触媒ドメインを包含する。 【００２９】ヒト−プレプロプロテインＣのためのアミ
ノ酸配列及び仮の構造が図１０に示されている。プロテ
インＣはＬｙｓ−Ａｒｙジペプチドなしに示されてお
り、このジペプチドはＬ鎖及びＨ鎖を連結するものであ
る。７個のイントロン（Ａ〜Ｇ）の位置は実線によって
示されている。既知のタンパク分解性開裂部位の両端に
存在するアミノ酸は円で囲んである。◆は、潜在的な炭
水化物結合部位を示す。Ｌ鎖、活性化ペプチド及びＨ鎖
中の第１のアミノ酸は番号１から始まる。この番号は図
２〜図４及び図６〜図９に示される番号とは異なる。炭
水化物の付着部位は、図１０の番号スキームに従えば、
Ｌ鎖中の残基９７及びＨ鎖中の残基７９，１４４及び１
６０に位置する。炭水化物部分は、Ａｓｎに共有結合さ
れる。ほとんどの場合、炭水化物の付着環境は、Ａｓｎ
−Ｘ−Ｓｅｒ又はＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ（ここでＸ−は任
意のアミノ酸である）によって表わされ得る。 【００３０】上に示されるように、プロテインＣは、凝
固過程において調節の役割を演ずる。エクソンVII 及び
VIIIによってコードされる触媒ドメインは、一定の血漿
タンパク質（すなわち、因子Ｖａ及びVIIIａ）を特異的
に開裂するセリンプロテアーゼ活性を有し、それらの活
性化又は不活性化をもたらす。この選択的タンパク分解
の結果、プロテインＣは抗凝固活性及びフィブリン溶解
活性を示す。ゲノムクローン中の介在配列の存在のため
に、ゲノム配列及びｃＤＮＡ配列を単に連結し、完全な
コード配列を提供することは、許容できる発現ユニット
を構成するために十分ではない。従って、ゲノムクロー
ンを用いて発現ユニットを構成する場合、下にさらに十
分に記載されている理由のために、これらの介在配列を
削除することが必要である。 【００３１】５′コード領域はまた、他の方法によって
も得ることができ、そしてそれ故に、介在配列を削除す
る必要性がないであろう。５′コード領域は、既存のｃ
ＤＮＡ又はゲノムクローンに由来するプローブを用いて
の追加のライブラリーを検索することによって得ること
ができる。この方法を用いて、完全な長さのｃＤＮＡを
単離した。さらに、ビタミンＫ−依存性血漿タンパク質
のアミノ末端部分は、それらの各自のカルシウム結合活
性を担当する。この機械的類似性の結果として、これら
の分子のカルシウム結合ドメインを取り換えることがで
き、そして結果として生じる分子の触媒ドメインに特徴
的な活性をなお保持することができる。たとえば、１９
８５年４月１７日に出願されたアメリカ特許出願番号第
７２４，３１１号に記載されているように、IX因子のア
ミノ−末端部分（カルシウム結合ドメイン）を、アミノ
酸３６でVII 因子に連結し、VII 因子の活性を有するタ
ンパク質を得ることができる。 【００３２】VII 因子、IX因子、Ｘ因子、プロトロンビ
ン及びプロテインＳは、このアミノ−末端配列の相同性
をプロテインＣと共有する。従って、これらの任意のタ
ンパク質のための遺伝子の５′−コード領域を含むクロ
ーン化された配列を、プロテインＣの遺伝子の対応する
配列と交換することができる。さらに、適切なコード配
列を、いくつかのビタミンＫ依存性血漿タンパク質の既
知のアミノ酸配列又はこの明細書に開示されているゲノ
ムプロテインＣのエクソンの配列に基づいて合成するこ
とができる。合成ヌクレオチド配列を製造するための技
法は当業界において良く知られている。たとえば、オー
バーラップするオリゴヌクレオチドのセットを合成し、
そして対にアニーリングしてオーバーラップする接着末
端を有する二重鎖断片を得ることができる。次に、これ
らの断片を任意の制限と同様に連結することができるで
あろう。次に、この得られる合成断片を、便利な制限部
位においてｃＤＮＡに連結する。この結合配列を、必要
な場合、オリゴヌクレオチド指令突然変異誘発によって
変形することができる。 【００３３】完全なコード配列を代表するクローンを得
た場合、必要ならば、その適切な領域を連結し、目的と
するコード配列を形成することができる。１又は複数の
ライブラリーから得られた断片を適切な制限エンドヌク
レアーゼにより切断し、そして正しい方向に酵素により
一緒に連結する。断片及び特定の選択された制限エンド
ヌクレアーゼに依存して、欠失突然変異誘発の“ループ
アウト”（ｌｏｏｐｏｕｔ）方法により又は制限エンド
ヌクレアーゼによる開裂及び突然変異誘発の組み合せに
より不所望のＤＮＡ配列を除去することが必要であろ
う。そのようにして得られた配列は、好ましくは、連続
するオープンリーディングフレームの形で存在すべきで
ある。 【００３４】すなわち、高等な真核生物の遺伝子に一般
的に見出される介在配列（イントロン）を欠くべきであ
る。クローン化された遺伝子中でのイントロンの存在
は、その遺伝子配列が哺乳類宿主細胞中に導入される場
合、ｍＲＮＡの異常なスプライシング及び／又は遺伝子
発現の低下した効率又は増幅に基づく不安定性を導びく
場合がある。このコード配列は、本発明に従って生成さ
れたプロテインＣの正しいプロセシング及び分泌を促進
するために、さらにプレ−プロペプチドをコードするこ
とが好ましい。このプレ−プロペプチドは、プロテイン
Ｃ又は他の分泌されるプロテイン、たとえばIX因子、VI
I 因子又はプロスロンビンのそれであることができる。 【００３５】いくつかの環境下で、活性なプロテインＣ
を直接的に生成することが望ましく、それによって、イ
ンビトロ又はインビボのいづれかでタンパク質生成物を
活性化する必要性が除去されるであろう。プロテインＣ
の成熟及び活性化に関与する開裂部位は既知である（Fo
ster及びDavie 、前記）。ＡＰＣをコードする配列を、
オリゴヌクレオチド指令欠失突然変異誘発により活性化
ペプチドをコードする領域を削除することによって構成
することができる。次に、この得られるタンパク質は、
分泌経路のタンパク分解プロセシングによって活性化さ
れるであろう。次に、プロテインＣ又は活性化されたプ
ロテインＣのためのコード配列を適切な発現ベクターに
導入し、今度はこれを哺乳類細胞系をトランスフェクト
するために用いる。 【００３６】本発明の実施において使用するための発現
ベクターは、哺乳類細胞中に導入された外来性遺伝子の
転写を指令することができるプロモーターを含むであろ
う。ウィルスプロモーターは、転写を指令する効率のた
めに好ましい。特に好ましいプロモーターは、アデノウ
ィルス２からの主要後期プロモーター（ｍａｊｏｒｌａ
ｔｅ ｐｒｏｍｏｔｏｒ）である。そのような発現ベク
ターはまた、好ましくは、プロモーターから下流であっ
てプロテインＣ配列のための挿入部位から上流に、又は
プロテインＣ配列それ自体内に位置するＲＮＡスプライ
ス部位のセットを含むであろう。好ましいＲＮＡスプラ
イス部位は、アデノウィルス遺伝子及び／又は免疫グロ
ブリン遺伝子から得ることができる。 【００３７】また、挿入部位の下流に位置するポリアデ
ニル化シグナルを、発現ベクター中に含む。ウィルスの
ポリアデニル化シグナル、たとえばＳＶ４０からの初期
又は後期ポリアデニル化シグナル又はアデノウィルス５
ＥＴｂ領域からのアデニル化シグナルが特に好ましい。
特に好ましい態様においては、発現ベクターはまた、非
コードウィルス性リーダー配列、たとえばプロモーター
及びＲＮＡスプライス部位の間に位置するアデノウィル
ス２の３分節系リーダーを含む。好ましいベクターはま
た、エンハンサー配列、たとえばＳＶ４０のエンハンサ
ー、及びアデノウィルスＶＡ ＲＮＡをコードする配列
を含むことができる。 【００３８】次に、クローン化された遺伝子配列を、リ
ン酸カルシウム介在トランスフェクションによって、培
養された哺乳類細胞中に導入することができる（Wigler
など．，Ｃｅｌｌ １４：７２５，１９７８；Graham及
びVan cler Eb ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２；４５６，１
９７３）。ＤＮＡ及びリン酸カルシウムから沈降物が形
成され、そしてこの沈降物が細胞に適用される。細胞の
いくらかは、ＤＮＡを取り込み、そして数日間それを細
胞内に保持する。これらの細胞の少部分（典型的には、
１０-4）は、ゲノム中にＤＮＡを組込む。これらの組込
み体を同定するために、選択可能な表現型（選択マーカ
ー）を与える遺伝子を、一般的に、注目の遺伝子と一緒
に細胞中に導入する。好ましい、選択マーカーは、薬
剤、たとえばネオマイシン、ヒグロマイシン、又はメト
トレキセートに対して耐性を与える遺伝子を含む。選択
マーカーを、注目の遺伝子と同時に、別のプラスミド上
で細胞中に導入することができ、又はそれらを、同じプ
ラスミド上で導入することができる。 【００３９】同じプラスミド上で導入される場合、選択
マーカー及び注目の遺伝子は異なるプロモーター又は同
じプロモーターの制御下に存在することができる。１つ
の態様においては、選択マーカーを、プロテインＣをコ
ードする配列を含む同じプラスミド上に、両配列が同じ
プロモーターによって制御されるように配置する（ジシ
ストロン性メッセージとして知られている配置）。この
タイプの構成物は当業界において既知である（たとえ
ば、ヨーロッパ特許公開第１１７，０５８号）。“キャ
リアーＤＮＡ”として知られている追加のＤＮＡを、細
胞中に導入される混合物中に添加することもまた有利で
あろう。細胞がＤＮＡを取り込んだ後、しばらくの間、
典型的には１〜２日間増殖を許容し、注目の遺伝子の発
現を始める。次に、安定した状態で選択マーカーを発現
する細胞の増殖のためについて選択するために薬物選択
を適用する。そのような細胞のクローンを、プロテイン
Ｃの発現についてスクリーンすることができる。 【００４０】組み込まれた遺伝子配列のコピ数を、一定
の選択マーカー（たとえば、メトトレキセートに対して
耐性を与えるジヒドロホレートレダクターゼ）を用いる
ことによって増幅を介して増加せしめることができる。
選択マーカーを、注目の遺伝子と一緒に細胞中に導入
し、そして薬物による選択を行なう。次に、薬物の濃度
をしだいに増し、そしておのおのの段階で耐性の細胞を
選択する。クローン化された配列の増加したコピー数に
ついて選択することによって、コードされたタンパク質
の発現レベルを実質的に増大することができる。本発明
により製造されたプロテインＣを、Kisiel及びDavie
（前記）の方法の変法によって精製することができる。
プロテインＣを含む培地をクエン酸ナトリウム及び塩化
バリウムと混合し、そして沈降物を集める。その沈降物
を洗浄し、再溶解し、そして硫酸アンモニウムにより再
沈降せしめ、次にリン酸ナトリウム−ベンズアミジン中
に溶解し、透析し、そしてＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ
Ａ−５０カラムにかける。プロテインＣを含有するピ
ーク（プロスロンビンもまた含んでいる）を、さらに、
ヘパリン−アガロース上でのアフィニティークロマトグ
ラフィー（Comp及びEsmon ，Ｂｌｏｏｄ ５４：１２７
２，１９７９）又は免疫吸着法によって精製する。 【００４１】本発明により製造されたプロテインＣを、
Ｈ鎖のアミノ末端からの活性化ペプチドの除去によって
活性化することができる。活性化を、α−スロンビン
（Marlarなど．，Ｂｌｏｏｄ ５９：１０６７〜１０７
２，１９８２）、トリプシン（Marlarなど．，前記）、
又はＲｕｓｓｅｌｌのマムシの毒のＸ因子活性剤を用い
て行なうことができる。次の例を要約すれば、例１はヒ
ト−プロテインＣをコードするＤＮＡ配列のクローニン
グを記載する。例２は、例１中で単離された配列からの
プロテインＣのための完全な長さのコード配列の造成法
を記載する。例３は、プロテインＣ ＤＮＡのための発
現ベクターの造成法を記載する。例４は、トランスフェ
クトされた哺乳類細胞を用いてのプロテインＣの製造を
記載する。例５は、プロテインＣをコードする完全な長
さのｃＤＮＡ及びトランスフェクトされた哺乳類細胞中
でのその発現を記載する。 【００４２】例 他に断らない限りは、ベテスダ・リサーチ・ラボラトリ
ーズ（Bethesda Research Laboratories ; BRL）および
ニュー・イングランド・バイオラブス（New England Bi
olabs ）から得た制限エンドヌクレアーゼおよび他のＤ
ＮＡ修飾酵素〔例えば、Ｔ4 ポリヌクレオチドキナー
ゼ、子牛アルカリホスファターゼ、クレノー（Ｋｌｅｎ
ｏｗ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ4 ポリヌクレオチドリガ
ーゼ）を製造業者による指示の通りに使用する。 【００４３】オリゴヌクレオチドは、アプライド・バイ
オシステムズ・モデル３８０Ａ ＤＮＡ合成材（Applie
d Biosystems Model 380A DNA synthesizer ）で合成し
変成ゲル上でのポリアクリルアミドゲル電気泳動によっ
て精製することができる。イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）
細胞は、マニアチス（Maniatis）等〔モレキュラー・ク
ローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecula
r Cloning : A Laboratory Manual ）、コールド・スプ
リング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor
Laboratory)、１９８２年〕によって記載されている如
くに形質転換することができる。Ｍ１３およびｐＵＣク
ローニングベクターおよび宿主株はＢＲＬから得た。 【００４４】例１．ヒト−プロテインＣをコードするＤ
ＮＡ配列のクローニング ヒト−プロテインＣの一部をコードするｃＤＮＡはフォ
スター（Foster）およびダヴィー(Davie）（前掲）によ
って記載されているように調製した。簡単に言えば、常
法によってヒト−肝臓ｍＲＮＡからλｇｔＩ１ ｃＤＮ
Ａライブラリーを調製した。クローンは、ヒト−プロテ
インＣに対する、 125Ｉ−ラベルしたアフィニティー精
製抗体を用いてスクリーニングし、ファージは、平板リ
セート（ｌｙｓａｔｅ）法〔マニアチス（Maniatis）
等、前掲〕、それに続く塩化セシウムグラジエントでの
バンド形成によってポジティヴクローンから調製した。 【００４５】ｃＤＮＡ挿入部は、ＥｃｏＲＩを用いて取
り出し、プラスミドｐＵＣ９中にサブクローン化した
〔ヴィエイラ（Vieira）およびメッシング(Messing）、
ジーン（Ｇｅｎｅ）１９：２５９〜２６８頁、１９８２
年〕。制限断片をファージベクターＭ１３ｍｐ１０およ
びＭ１３ｍｐ１１中にサブクローン化し〔メッシング(M
essing）、メス イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈ．
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）１０１：２０〜７７頁、
１９８３年〕、ジデオキシ法〔サンガー（Sanger）等、
プロク・ナトル アカド サイ．ＵＳＡ（Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ）７４：５４６３〜
５４６７頁、１９７７年〕によって配列決定した。 【００４６】ヒト−プロテインＣの既知の配列〔キシエ
ル（Kisiel）、前掲〕に担当し、そしてライト鎖のアミ
ノ酸６４で始まりヘビー鎖を通って３′非コード領域に
伸びているプロテインＣをコードするＤＮＡを含有する
クローンを選択した。このクローンをλＨＣ１３７５と
名付けた。アミノ酸２４からプロテインＣをコードする
第２のｃＤＮＡクローンを同定した。このクローンから
の挿入部をｐＵＣ９中にサブクローン化し、このプラス
ミドをｐＨＣ ６Ｌと名付けた（図１）。このクローン
は、ヘビー鎖コード領域、終止コドンおよび３′非コー
ド領域を含むプロテインＣの主たる部分をコードする。 【００４７】λＨＣ１３７５からのｃＤＮＡ挿入部をα
−32Ｐ ｄＮＴＰを用いてニックトランスレーション
し、これを用いてウー(Woo）によって改変された〔メ
ス．イン．エンザイモロジー（Ｍｅｔｈ．ｉｎ Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ）６８：３８１〜３９５頁、１９７９
年〕、ベントン（Benton）およびデイヴィス（Davis)の
プラークハイブリダイゼーション法（サイエンス １９
６：１８１〜１８２頁、１９７７年）により、ファージ
λシャロン４Ａ中のヒト−ゲノムライブラリーをプロー
ブした〔マニアチス（Maniatis）等、セル（Ｃｅｌｌ）
１５：６８７〜７０２頁、１９７８年〕。ポジティブク
ローンを単離しプラーク精製した〔フォスター（Foste
r）等、プロク．ナトル．アカド．サイ．ＵＳＡ（Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）８２：４
６７３〜４６７７頁、１９８５年、参考に引用〕。 【００４８】ポジティブクローンから調製したファージ
ＤＮＡ〔シルハヴィー(Silhavy）等、エクスペリメンツ
・ウィズ・ジーン・フュージョン（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎ
ｔｓｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎ）中、コールド
・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring
Harbor Laboratory)、１９８４年〕をＥｃｏＲＩまたは
ＢｇｌIIで消化し、ゲノム挿入部を精製してｐＵＣ９内
にサブクローン化した。挿入制限断片をＭ１３ベクター
内にサブクローン化し、配列を決定してその同一性を確
認して完全な遺伝子のＤＮＡ配列を確立した。 【００４９】ｐＨＣλ６ＬのｃＤＮＡ挿入部をニックト
ランスレーションし、これを用いてファージλシャロン
４Ａライブラリーをプローブした。ｃＤＮＡの５′およ
び３′末端から調製したプローブにハイブリダイズする
１個のゲノムクローンを同定した。このファージクロー
ンをＥｃｏＲＩで消化して、プロテインＣ遺伝子の５′
末端に対応する４．４kb断片をｐＵＣ９中にサブクロー
ン化した。得られた組換プラスミドをｐＨＣＲ４．４と
名付けた。完全ＤＮＡ配列分析によって、ｐＨＣＲ４．
４中の挿入部が１２６３bp（塩基対）のイントロンによ
って分離される７０〜１６７bpのエクソンを２つ含んで
いることが示された。第１のエクソンはアミノ−４２〜
−１９をコードし、第２のエクソンはアミノ酸−１９〜
３７をコードする。配列分析によって、完全プロテイン
Ｃ遺伝子のＤＮＡ配列が確認された。上記したように、
次には、ゲノムクローンを用いて本発明において使用す
るのに満足なコード配列を造成するために、イントロン
を除去することが必要である。 【００５０】例２．プロテインＣの完全長コード配列の
造成 プレ−プロペプチドを包含するプロテインＣの完全長コ
ード配列を、ｃＤＮＡ及びゲノムクローンの適当な断片
を結合せしめることによって造成した。これは、イント
ロンをゲノムクローン（ｐＨＣＲ４．４）から取り除
き、そして融合されたエクソンの都合の良い制限部位で
ｃＤＮＡ（ｐＨＣλ６Ｌから）に結合させることによっ
て達成した。次いで、所望とするゲノム：ｃＤＮＡ結合
を、オリゴヌクレオチド指令欠失突然変異誘発によって
不所望の配列をループ・アウトさせることによって形成
した。 【００５１】プラスミドｐＨＣλ６Ｌは、ｐＵＣ９のＥ
ｃｏＲＩ部位においてクローニングされたプロテインＣ
部分的ｃＤＮＡを含有していた（図１）。ｃＤＮＡ挿入
部を２個の断片としてサブクローニングし、ゲノムクロ
ーンからの最も５′−側のコード領域に結合させるため
のそれを調製した。プラスミドｐＨＣλ６ＬをＥｃｏＲ
Ｉ及びＳａｌＩで消化し、そして次に反応混合物をフェ
ノール及びＣＨＣｌ3で抽出し、エタノールで沈澱させ
た。得られたＤＮＡ断片を連結緩衝液中で再懸濁させ、
そしてＴ4 ＤＮＡリガーゼを添加した。 【００５２】連結混合物を１５℃で１４時間にわたって
インキュベートした。Ｅ．コリＪＭ８３の形質転換のた
めに連結混合物のアリコートを使用し、そしてＸ−ｇａ
ｌ含有ＬＢ寒天上に細胞をプレートした。白色のコロニ
ーを選び出し、そしてプラスミドＤＮＡを調製した。こ
のＤＮＡを制限酵素消化によって分析し、よってｃＤＮ
Ａの３′部分（約１４５０bp挿入部）及びｃＤＮＡの
５′部分（約６５bp挿入部）を含有するクローンを同定
した。これらのクローンを、それぞれｐ９Ｃ３′及びｐ
９Ｃ５′として表示する（図１１）。 【００５３】ｃＤＮＡから失われている５′コード領域
は、ゲノムクローンｐＨＣＲ４．４のエクソンＩ及びII
中に含まれている。このプラスミドは、約４４００塩基
対（bp）の挿入部を含有しており、そしてイントロンＢ
中に位置するＥｃｏＲＩ部位のところでその３′末端上
で終端している。コード配列をｐＨＣＲ４．４から除去
するため、プラスミドをＰｓｔＩ及びＥｃｏＲＩで消化
し、そして得られた断片をアガロースゲル電気泳動法に
よって分離した。エクソンＩ及びIIを含有する約２５４
０bpの断片をゲルから単離し、そしてＣＴＡＢで抽出し
た(Langridgeら、Ａｎａｌｙｔ．Ｂｔｏｃｈｅｍ．１０
３；２６４，１９８０）。この断片、５′Ｐ−Ｒと呼
ぶ、をｐＵＣ９中にサブクローニングしてプラスミドｐ
５′Ｐ−Ｒを製造した（図１２）。 【００５４】ｐ５′Ｐ−Ｒ中のイントロン（イントロン
Ａと呼ぶ）を２段階法で除去した（図１２）。プラスミ
ドをＡｐａＩで消化したところ、イントロン内のユニー
ク部位で切断がおこり、３′オーバーハング末端が残留
した。次いで、線状化したプラスミドをＢａｌ３１エキ
ソヌクレアーゼ又はＴ4 ポリマーゼで処理して約４００
bpをそれぞれの末端から除去し、そして得られた断片末
端をＳ１ヌクレアーゼで平滑末端化した。この線状化プ
ラスミドをリガーゼで再環化し、そしてＥ．コリＪＭ８
３の形質転換のために使用した。プラスミドＤＮＡを抽
出し、そしてイントロンＡ中のＳｍａＩ及びＳｓｔＩ制
限部位の存在に関して分析し、また、３００〜４００bp
に減らしたＳｍａＴ−ＳｓｔＴ断片を有するプラスミド
を選び出し、ｐ５′ＰΔａＲと表示した。 【００５５】イントロンＡの残りを、Zoller及びSmith
（Manual for Advanced Techniquesin Molecular Cloni
ng Course, Cold Spring Harbor Laboratory, 1983)に
より２プライマー法に関して記載されるのと本質的に同
様にしてオリゴヌクレオチド指令欠失突然変異誘発によ
って除去した。ｐ５′ＰΔａＲをＰｓｔＩ及びＥｃｏＲ
Ｉで消化し、そしてプロテインＣ断片を、ＰｓｔＩ及び
ＥｃｏＲＩで消化したＭ１３ｍｐ９中にサブクローニン
グした。正鎖ファージＤＮＡを鋳型として調製し、そし
てオリゴヌクレオチドｍｕｔ−１（第１表）にアニール
した。この突然変異誘発オリゴヌクレオチドは、連結さ
れるべきエクソンＩ及びII配列に対して相補的な配列を
含有する。Ｍ１３ユニバーサル配列プライマーを同じ鋳
型上で３′〜ｍｕｔ−１にアニールした。このプライマ
ーをＴ4 リガーゼの存在においてＤＮＡポリメラーゼＩ
（Ｋｌｅｎｏｗ断片）及びヌクレオシドトリホスフェー
トを使用して延長した。 【００５６】得られた２デュプレックスＤＮＡ環をＥ．
コリＪＭ１０３に形質転換し、そして得られたプラーク
を厳密なハイブリダイゼーション条件の下で、３２ｐ−
標識された突然変異誘発オリゴヌクレオチドをプローブ
として使用して、スクリーニングした。ポジティブプラ
ークからのＤＮＡを単離し、そしてオリゴヌクレオチド
プライマー１（第１表）を使用して配列決定した。この
プライマーはエクソンII中にプライムし、欠失連結をま
たぐＤＮＡ配列の決定が可能になった。エクソンＩ及び
IIの正しいインフレーム融合を有する分子が選らばれ
た。ＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ断片を、Ｍ１３の複製形か
ら、制限エンドヌクレアーゼ消化およびアガロースゲル
電気泳動によって単離し、そしてｐＵＣ９中にサブクロ
ーニングしてプラスミドｐ５′Ｉ−IIを作製する（図１
２）。 【００５７】図１３に示すとおり、ｃＤＮＡに５′コー
ド領域を連結するために、ｐ５′Ｉ−IIの約１２７７bp
ＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ断片を、プラスミドのＰｓｔＩ＋
ＥｃｏＲＩ消化から単離し、アガロースゲル電気泳動に
よって精製する。６５bpの最も５′側のｃＤＮＡ断片を
ｐ９Ｃ５′のＳａｌＩ＋ＥｃｏＲＩ消化物から単離し、
アクリルアミドゲル上の電気泳動で精製する。２つの断
片をそれらのＥｃｏＲＩ末端で連結し、得られる約１３
３０bpのＰｓｔＩ−ＳａｌＩ断片をＰｓｔＩ＋ＳａｌＩ
−消化Ｍ１３ｍｐ９中へサブクローニングする（図１
３）。正鎖ファージＤＮＡを、オリゴヌクレオチド指令
欠失変異誘発用の鋳型として作製する。オリゴヌクレオ
チドｍｕｔ−２（表１）をこの鋳型にアニールし、オリ
ゴヌクレオチドｍｕｔ−３（表１）を第２プライマーと
して上流にアニールする。このプライマーを前記のよう
に延長する。 【００５８】オリゴヌクレオチドｍｕｔ−２は、アミノ
酸２３〜２６をコードするエクソンII配列をコドン２７
でｃＤＮＡへ融合させることを指令する。第２プライマ
ー（ｍｕｔ−３）は、翻訳開始点から３５bp上流にＥｃ
ｏＲＩ部位を導入する。得られるファージをＮｃｏＩ及
びＸｈｏＩ部位の不存在及び導入されたＥｃｏＲＩ部位
の存在についてスクリーニングする。望ましい制限パタ
ーンを示すファージＤＮＡを、プライマー２（表１）を
使用して配列決定し、エクソンIIとｃＤＮＡとの間の正
しい連結の存在を確認する。正しい配列をもつファージ
ＤＮＡを選択し、５′をコード領域を含んでなるＰｓｔ
Ｉ−ＳａｌＩ断片を、Ｍ１３組換えファージの複製形か
ら単離する。この断片をアガロースゲル電気泳動によっ
て精製し、ＰｓｔＩ及びＳａｌＩにより消化されたｐＵ
Ｃ９へ挿入してプラスミドｐＣ５′ｅｎｄを作製する。 【００５９】図１４に示すとおり、プラスミドｐＣ５′
ｅｎｄをＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで消化し、５′プロ
テインＣ断片をアガロースゲル電気泳動およびＣＴＡＢ
抽出によって精製する。ｃＤＮＡの残りを、ＳａｌＩ−
ＥｃｏＲＩ断片としてｐ９Ｃ３′から単離する。２個の
断片を、ＥｃｏＲＩで消化したｐＵＣ９へ、３方連結に
より導入する。連結混合物を使用してＥ．コリＪＭ８３
を形質転換し、その細胞をＬＢ＋Ｘ−ｇａｌ上にプレー
トし、プラスミドＤＮＡを白色コロニーから単離する。
得られるプラスミドをｐＭＭＣと称する。これは、約１
５００bpＥｃｏＲＩ断片上にヒト−プロテインＣの完全
なコード配列を含んでいる。 【００６０】 【表１】 【００６１】例３．プロテインＣの発現ベクターの造成 ｐＭＭＣからプロテインＣコード挿入部をＥｃｏＲＩ断
片として取り出し、適当な哺乳類細胞発現ベクターに挿
入する。典型的なベクターはｐＤ７であり、ＳＶ４０エ
ンハンサーとアデノウイルス２主要後期プロモーターと
３分節リーダーを含む。 【００６２】プラスミドｐＤ７はプラスミドｐＤＨＦＲ
IIIから作成された（Berkner およびSharp ，Ｎｕｃ．
Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１３，８４１〜８５７頁，１９８
５年）。ｐＤＨＦＲ III中のＤＨＥＲ配列のすぐ上流の
ＰｓｔＩ部位をＢｃｌＩ部位に変換した。これは１００
μｌの緩衝液Ａ（１０mMのトリス（ｐＨ８），１０mMの
ＭｇＣｌ2 ，６mMのＮａＣｌ，７mMのβ−ＭＳＨ）中で
１０μｇのプラスミドを５ユニットのＢｓｔＩで１０分
間３７℃にて消化して行なった。ＤＮＡをフェノール抽
出し、ＥｔＯＨ沈澱し、１０mMのｄＣＴＰと１６ユニッ
トのＴ４ＤＮＡポリメラーゼを含む緩衝液Ｂ（５０mMの
トリス（ｐＨ８），７mMのＭｇＣｌ2 ，７mMのβ−ＭＳ
Ｈ）４０μｌに再懸濁し、そして１２０℃で６０分間イ
ンキュベートした。 【００６３】ＥｔｏＨ沈澱の後に、ＤＮＡを４００ユニ
ットのＴ４ポリヌクレオチドリガーゼを含む緩衝液Ｃ
（１０mMのトリス（ｐＨ８），１０mMのＭｇＣｌ2 ，１
mMのＤＴＴ，１．４mMのＡＴＰ）１４μｌ中で２．５μ
ｇのキナーゼ処理したＢＣｌＩリンカーに連結した。フ
ェノール抽出とＥｔＯＨ沈澱の後、ＤＮＡを１２０μｌ
の緩衝液Ｄ（７５mMのＫＣｌ，６mMのトリス（ｐＨ７．
５），１０mMのＭｇＣｌ 2 ，１mMのＤＴＴ）に再懸濁
し、８０ユニットのＢｃｌＩで５０℃にて６０分間消化
し、それからアガロース中で電気泳動させた。 【００６４】そのゲルらＦｏｒｍIII プラスミドＤＮＡ
（１０μｇ）を単離し、５０ユニットのＴ４ポリヌクレ
オチドリガーゼを含む緩衝液Ｃ１０μｌ中で２時間１２
℃にて連結させ、それを用いてＥ．Ｃｏｌｉ ＨＢ１０
１を形質転換した。ポジティブコロニーを迅速ＤＮＡ調
製分析法で特定し、ポジティブコロニーから調製したプ
ラスミドＤＮＡ（ｐＤＨＦＲ′と呼ぶ）をｄＡＭ- Ｅ．
コリに形質転換した。 【００６５】ｐＤＨＦＲ′（１５μｇ）およびｐＳＶ４
０（ｐＭＬ−１のＢａｍＨＩ部位にクローニングしたＢ
ａｍＨＩ消化ＳＶ４０ＤＮＡ）（２５μｇ）２５ユニッ
トのＢｃｌＩを含む緩衝液Ｄ１００μｌ中で６０分間５
０℃にて開裂した後、５０ユニットのＢａｍＨＩを添加
し、６０分間３７℃でさらにインキュベートして、プラ
スミドｐＤ２′を作成した。ＤＮＡ断片をアガロースゲ
ル電気泳動法で分離し、４．９kbのｐＤＨＦＲ′断片と
０．２kbＳＶ４０断片を単離した。これらの断片（２０
０ngのｐＤＨＦＲ′ＤＮＡと１００ngのＳＶ４０ＤＮ
Ａ）を１００ユニットＴ４ポリヌクレオチドリガーゼを
含む緩衝液Ｃ１０μｌ中で４時間１２℃にてインキュベ
ートし、得られる造成体（ｐＤ２′）を用いてＥ．コリ
ＲＲＩを形質転換した。 【００６６】プラスミドｐＤ２′をｐＢＲ３２２領域の
“ポイゾン”配列を除去して変形した（Lusky 及びBotc
han ，Ｎａｔｕｒｅ ２９３，７９〜８１頁，１９８１
年）。プラスミドｐＤ２′（６．６μｇ）およびプラス
ミドｐＭＬ−１（Lusky およびBotchan ，前掲）（４μ
ｇ）を夫夫１０ユニットのＥｃｏＲＩおよびＮｒｕＩを
含む緩衝液Ａ５０μｌ中で２時間３７℃にてインキュベ
ートした後、アガロースゲル電気泳動を行なった。１．
７kbのｐＤ２′断片と１．８kbのｐＭＬ−１断片を単離
し、それら（各５０ng）を１００ユニットのＴ４ポリヌ
クレオチドリガーゼを含む緩衝液２０μｌ中で２時間１
２℃にて相互に連結した後、Ｅ．コリＨＢ１０１に形質
転換した。所望の造成物（ｐＤ２と呼ぶ）を含むコロニ
ーを迅速調製分析法で特定した。次に、１０μｇのｐＤ
２を５０μｌの緩衝液Ａ中で夫々２０ユニットのＥｃｏ
ＲＩおよびＢｇｌIIで２時間３７℃にて消化した。ＤＮ
Ａをアガロース中で電気泳動させ、所望の、ｐＢＲ３２
２，３′スプライス部位、およびポリＡ配列を含む２．
８kb断片（断片Ｃ）を単離した。 【００６７】ｐＤ３を造成するのに用いる残りの断片を
作成するために、ｐＤＨＦＲ IIIを変形してＳａｃII
（ＳｓｔII）部位をＨｉｎｄ III部位またはＫｐｎＩ部
位に変換した。１０μｇのｐＤＨＦＲ IIIを２０ユニッ
トのＳｓｔIIで２時間３７℃にて消化した後フェノール
抽出およびエタノール沈澱を行なった。再懸濁したＤＮ
Ａを１０mMのｄＣＴＰと１６ユニットのＴ４ＤＮＡポリ
メラーゼを含む緩衝液Ｂ１００μｌ中で６０分間１２℃
にてインキュベートし、フェノール抽出し、透析し、そ
してエタノール沈澱した。ＤＮＡ（５μｇ）を４００ユ
ニットのＴ４ＤＮＡリガーゼを含む緩衝液２０μｌ中で
１０時間１２℃にて、５０ngのキナーゼ処理したＨｉｎ
ｄ IIIリンカーまたはＫｐｎＩリンカーと連結し、フェ
ノール抽出し、そしてエタノール沈澱した。 【００６８】５０μｌの緩衝液Ａに再懸濁後、得られる
プラスミドを適当であれば５０ユニットのＨｉｎｄ III
またはＫｐｎＩで消化し、アガロース中で電気泳動させ
た。ゲルから単離したＤＮＡ（２５０ng）を４００ユニ
ットのＴ４ＤＮＡリガーゼを含む緩衝液Ｃ３０μｌ中で
４時間１２℃にて連結し、それを用いてＥ．コリＲＲＩ
を形質転換した。得られるプラスミドはｐＤＨＦＲ III
（Ｈｉｎｄ III）およびｐＤＨＦＲ III（ＫｐｎＩ）と
指称した。ｐＤＨＦＲ III（ＫｐｎＩ）から、ＢｇｌII
およびＫｐｎＩで消化した後アガロースゲル電気泳動し
て７００bpＫｐｎＩ−ＢｇｌII断片（断片Ａ）を精製し
た。 【００６９】以下のようにしてＳＶ４０エンハンサー配
列をｐＤＨＦＲ III（Ｈｉｎｄ IIIに挿入した。５０μ
ｇのＳＶ４０ＤＮＡを５０ユニットのＨｉｎｄ IIIを含
む緩衝液Ａ１２０μｌ中で２時間３７℃にてインキュベ
ートし、Ｈｉｎｄ IIIＣＳＶ４０断片（５０８９−９６
８bp）をゲル精製した。プラスミドｐＤＨＦＲ III（Ｈ
ｉｎｄ III）（１０μｇ）を２５０ngの仔ウシ腸ホスフ
ァターゼで１時間３７℃にて処理し、フェノール抽出
し、そしてエタノール沈澱した。線状のプラスミド（５
０ng）を１６μｌの緩衝液Ｃ中で２００ユニットのＴ４
ポリヌクレオチドリガーゼを用いて３時間１２℃にて２
５０ngのＨｉｎｄ IIIＣＳＶ４０と連結し、Ｅ．ｃｏｌ
ｉ ＨＢ１０１に形質転換した。 【００７０】ｐＤ３の最終造成のため、断片Ａと断片Ｂ
（各５０ng）を２００ユニットのＴ４ポリヌクレオチド
リガーゼを用いて４時間１２℃にて１０ngの断片Ｃと連
結し、そしてＥ．コリＲＲＩのトランスフェクションを
行なった。迅速調製分析法でポジティブコロニーを検出
し、ｐＤ３の大規模調製を行なった。プラスミドｐＤ３
を、ＢｃｌＩ挿入部位をＥｃｏＲＩ部位に変換してプロ
テインＣ配列の挿入を受容するように変形する。第１
に、ｐＤ３のアデノウイルス５０−１マップユニット配
列の最左端に存在するＥｃｏＲＩ部位を、それを慣用の
リンカー手法でＢａｍＨＩ部位に変換して除去すること
が必要である。すなわち、プラスミドをＥｃｏＲＩで消
化し、線状化したＤＮＡをＴ４ポリメラーゼおよび４種
全部のデオキシヌクレオチドトリホスフェートで処理し
て平滑末端を形成する。 【００７１】次にプラスミドをＢａｍＨＩ部位を含むオ
クトヌクレオチドに連結し、ＤＮＡをＢａｍＨＩで消化
して余剰のリンカーを除去し、そして哺乳類細胞発現配
列を含む断片をＰＭＬ−１のＢａｍＨＩ部位にクローニ
ングする。得られるプラスミドをＥ．コリＨＢ１０１に
形質転換し、プラスミドＤＮＡを調製し、正しい変換体
を選別する。同様な仕方でＢｃｌＩ部位を適当なオクト
ヌクレオチドリンカーを用いてＥｃｏＲＩ部位に変換す
る。得られるベクターはｐＤ７として知られる。次にｐ
ＭＭＣからの１．５kbのプロテインＣＥｃｏＲＩ断片を
ｐＤ７のＥｃｏＲＩ部位に挿入して発現ベクターｐＤ７
Ｃ（図１５）を作成する。 【００７２】ｐＤ５を用いることにより、ポリシストロ
ンメッセージからのタンパクＣ配列の発現を可能にする
ベクターを造成する。該ｐＤ５は５′非コード領域の大
部分を欠如しているＤＨＦＲコード配列を含有するｐＤ
３に類似したプラスミドである。ＤＨＦＲ配列を更に変
形し、メトトレキセートに対するその結合親和性を減少
する。ベクターｐＤ５はｐＤ３について記載した方法と
同様の方法で造成され、そしてこれはＢａｍＨＩ部位が
異種性ＤＮＡの挿入部位である点およびＳＶ４０ポリア
デニレーションシグナルを含有するＢｃｌＩ−ＢａｍＨ
ＩＳＶ４０断片がレイトオリエンテーション（ｌａｔｅ
ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）にある点においてのみｐＤ
３と異っている。 【００７３】ＤＨＦＲ配列は、最初にＰｓｔＩおよびＳ
ｓｔＹでｐＤＨＦ IIIを消化し次いで４００bpＤＨＦＲ
断片を単離することにより変形される。これはＭＩファ
ージベクター中でクローン化され次いでシモンセンおよ
びレビンソンにより記載される如く（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８０：２４９５−２４９
９，１９８３）突然変異誘発される。誘発はＤＨＦＲ配
列中、１個の塩基対変化をもたらす。次いで変化させた
断片をｐＤＨＦＲ IIIに再挿入しプラスミドｐＤＨＦr
III を得る。 【００７４】次いでＤＨＦＲ配列の５′非コード領域を
除去する。プラスミドｐＤＨＦＲrIIIをＦｎｕ４ＨＩ
（これは、約２０の部位でプラスミドを切断する）で開
裂し、次いでＴ４ＤＮＡポリメラーゼ及び全ての４種類
のデオキシヌクレオチドトリホスフェートで処理するこ
とにより平滑末端を生じさせる。ＢａｍＨＩリンカーを
末端に結合させ、次いで混合物をＢａｍＨＩおよびＮｃ
ｏＩで消化させる。ＤＨＦＲr ｃＤＮＡを含む０．６kb
ＢａｍＨＩ−ＮｃｏＩ断片を単離する。 【００７５】プラスミドｐＤＨＦＲ IIIをＮｃｏＩおよ
びＢａｍＨＩで消化し次いでＳＶ４０ポリアデニレーシ
ョンシグナルを含む０．２kb断片を単離する。次いで、
アーリーオリエンテーション（ｅａｒｌｙ ｏｒｉｅｎ
ｔａｔｉｏｎ）においてポリアデニル化シグナルをＤＨ
ＦＲr 断片に結合させる。ＢａｍＨＩで消化後、生成す
るＢａｍＨＩ断片をｐＤ５のＢａｍＨＩ部位に挿入し、
次いで連結混合物を、Ｅ．コリ−ＨＢ１０１を形質転換
するために用いる。プラスミドＤＮＡを調製し次いで制
限エンドヌクレアーゼ消化によりスクリーンする。Ａｄ
２主要後期プロモーターから転写のため正しい配向でＤ
ＨＦＲr 挿入部を有するプラスミドをｐＤ５（ＤＨＦＲ
r ）と命名する。 【００７６】プラスミドｐＤ５（ＤＨＦＲr ）を用いて
プロテインＣを発現するため、ｐＭＭＣをＥｃｏＲＩで
消化し次いで１．５kbプロテインＣ断片を単離する。Ｅ
ｃｏＲＩ末端を、リンカーの付加によりＢｃｌＩ末端に
変換する。プラスミドｐＤ５（ＤＨＦＲr ）をＢａｍＨ
Ｉで部分消化してＤＨＦＲr 配列の５′末端でそれを解
裂させ次いでプロテインＣ断片に結合させる。プラスミ
ドＤＮＡを正しい方向性およびプロテインＣ断片の挿入
部についてスクリーニングする。ｐＤ５（ｐｃ−ＤＨＦ
Ｒr ）と命名した生成ベクターを図１６に示す。 【００７７】例４．トランスフェクトされた哺乳動物細
胞におけるプロテインＣの発現 小ハムスターの腎臓細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ１
０）を、記載されるのと本質的に同じ方法でｐＤ７Ｃを
用いてトランスフェクトする（ウイグラー等、Ｃｅｌｌ
１４；７２５，１９７８；カルサロおよびピアリン、
Somatic Cell Genetics ７：６０３，１９８１；および
Graham and Van der Eb, Virology ５２：４５６，１９
７３）。細胞を６０mm組織培養ペトリ皿内のダルベッコ
培地（１０％の熱不活性化ウシ胎児血清が加えられ更に
グルタミンおよびペニシリン−ストレプトマイシンが補
足されている）中、３７℃，５％ＣＯ2 でコンフルエン
シー２０％に増殖させる。合計１０μｇのＤＮＡをトラ
ンスフェクトするため用いる。 【００７８】１個の６０mm皿：３．７５μｇのｐＤ７
Ｃ，１．２５μｇのｐｋｏ−ｎｅｏ（Southern and Ber
g, J. Mol. Appl. Genet １：３２７−３４１，１９８
２）および５μｇのサケ精子ＤＮＡ。ＤＮＡを０．３Ｍ
のＮａＯＡｃおよび７５％エタノール中で沈澱させ、７
０％エタノールで洗浄し次いで２０μｌの１０mMトリス
−ＨＣｌ（ｐＨ８）および１ｍＭＥＤＴＡ中に再溶解す
る。ＤＮＡを水４４０μｌ、並びに２８０mMのＮａＣ
ｌ，１．５mMのＮａＨＰＯ4 ，１２mMのデキストロース
および５０mMのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．１２）の５００μ
ｌと一緒にする。２５０mMのＣａＣｌ2 ６０μｌを上記
混合物に滴加し次いで溶液を室温で３０分間放置する。 【００７９】次いで溶液を細胞に添加し、細胞を４時間
３７℃に戻す。培地を除去し次いで血清を含有するダル
ベッコ培地の２０％ＤＭＳＯ５mlを２分間室温で添加す
る。直ちに培地を２回交換して皿を洗浄し、次いで新鮮
な培地で一夜インキュベートする。ＤＮＡを添加後、２
４時間目に培地を除去し次いで選択培地（血清を含有す
るダルベッコ培地中、１０mg／mlのＧ４１８，４９８μ
／mg、ギブコ）を添加する。約１０〜１３日後、ｐｋｏ
−ｎｅｏ遺伝子を組み入れてＧ４１８に対して耐性の細
胞を代表する個々のクローンを、９６個のウェルを有す
るプレートに移し次いでプロテインアッセイのため１０
％ウシ胎児血清を加えたダルベッコ培地中で増殖させ
る。 【００８０】プロテインＣの分析のため、培地を遠心分
離することにより細胞および細胞破片を分離し、次いで
プロテインＣポリペプチドおよび生物活性について分析
する。細胞をトリプシンを用いて皿から取り出し、新鮮
な培地で洗浄し、遠心分離し更に−２０℃で凍結させ
る。分析用に細胞ペレットをＰＢＳ中で解凍し、ペレッ
ト化し、次いで０．２５％トリトンＸ−１００を含有す
るＰＢＳ中に再懸濁させる。サンプルを希釈し次いでポ
リペプチドおよび活性を分析する。 【００８１】プロテインＣについてのＥＬＩＳＡは次の
ように行う。ヒトプロテインＣ（０．１ＭＮａ2 ＣＯ3
中５nl／ml，ｐＨ９．６）に対する抗体（モノクローナ
ルもしくはポリクローナル）２００μｌを、９６個のウ
ェルを有するプレートの各ウェル中で２時間３７℃でイ
ンキュベートする。次いでウェルをＰＢＳ中、２２０μ
ｌの、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および０．０
５％トウィーン２０と共に３７℃で２時間インキュベー
トする。プレートを水で洗い、風乾し、４℃で保存す
る。サンプルを分析するため、２００μｌのサンプルを
抗体でコートされたウェル中で、室温にて１時間インキ
ュベートする。 【００８２】次いでウェルを０．０５％トウィーン２０
を含有するＰＢＳ２００μｌで４回洗浄する。５６mg／
ｌのＭｇＣｌ2 を含有するｐＨ９．８のジエタノールア
ミン緩衝液（１ｌ当たり９６ml）に溶解した２００μｌ
のｐ−ニトロフェニルホスフェート（３０mg）をウェル
に添加する。酵素反応を３７℃で行ない次いで黄色の展
開を、ＥＬＩＳＡプレート読みとり器を用い４０５nmで
監視する。キーゼルおよびデビー（Ｍｅｔｈ．ｉｎ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ８０：３２０−３３２，１９８
１）により記載される如く、スロンビンによりプロテイ
ンＣを活性化した後、血漿のカオリン−セファリン凝固
時間を延長させるその能力により、該プロテインＣ生物
活性を分析する。 【００８３】例５．プロテインＣをコードする完全長ｃ
ＤＮＡの発現 Ａ．ｃＤＮＡの単離 プロテインＣのプレ−プロペプチド（図６のエクソン
１）のアミノ酸−４２〜１９に相当するエクソンを含む
ゲノムフラグメントを単離し、ニック翻訳し、Gublerお
よびHoffman の技法（Ｇｅｎｅ２５：２６３〜２６９，
１９８３年）によりｍＲＮＡを用いて、ＨＥＰＧ２細胞
から造成されたｃＤＮＡライブラリーをスクリーニング
するためのプローブとして用いた。このセルラインは、
ヒト肝細胞から誘導されたもので、プロテインＣを合成
することが予め示されたものであった（FairおよびBahn
ak，Ｂｌｏｏｄ ６４：１９４〜２０４，１９８４
年）。 【００８４】ファージｇｔ１１のＥｃｏＲＩ部位内に挿
入されたｃＤＮＡを含む１０のポジティブクローンを単
離し、プロテインＣ遺伝子の５′非コード領域に対応す
るオリゴヌクレオチドプローブによりスクリーニングし
た。１のクローンもこのプローブによりポジティブであ
り、その全ヌクレオチド配列を決定した。このｃＤＮＡ
は７０bpの５′非翻訳配列、ヒト−プレプロプロテイン
Ｃに対する全コード配列、および第２ポリアデニレーシ
ョン部位（図２〜図４）に対応する全３′非コード領域
を含んでいた。 【００８５】Ｂ．発現ベクター造成 プロテインＣｃＤＮＡの発現がベクターｐＤＸ中で達成
された。このベクターは、ｐＤ３（例３に記載）および
ｐＤ３′即ちＳＶ４０ポリアデニレーションシグナル
（即ち、ＳＶ４０ＢａｍＨＩ〔２５３３bp〕〜ＢｃｌＩ
〔２７７０bp〕断片）がレートオリエンテーションにあ
ることを除いてｐＤ３と同一のベクターから誘導され
た。従って、ｐＤ３′は遺伝子挿入部位としてＢａｍ部
位を含む。 【００８６】ｐＤＸを成生するために、ｐＤ３′中のＥ
ｃｏＲＩ部位を、ＥｃｏＲＩ開裂、Ｓ１ヌクレアーゼと
のインキュベーション、および引続くＢｃｌＩリンカー
による連結により、ＢｃｌＩ部位に変形した。ポジティ
ブに同定されたコロニーからＤＮＡを調断し、変化した
制限部位を含む１．９kbＸｈｏＩ−Ｐｓｔ断片をアガロ
ースゲル電気泳動により調製した。第２の変形において
は、遺伝子を発現ベクター中に挿入するための位置とし
てＥｃｏＲＩ部位を形成するために、ＢｃｌＩ開裂ｐＤ
３をキナーゼ処理されたＥｃｏＲＩ−ＢｃｌＩアダプタ
ー（オリゴヌクレオチドＺＣ５２５，５′ＧＧＡＡＴＴ
ＣＴ３′、およびＺＣ５２６，５′ＧＡＣＡＧＡＡＴＴ
ＣＣ３′から造成）と連結した。 【００８７】ポジティブコロニーを制限エンドヌクレア
ーゼ分析により同定し、これからのＤＮＡを用いて変形
制限部位を含む２．３kbＸｈｏＩ−Ｐｓｔ断片を単離し
た。上記の２つのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼとも
にインキュベートし、Ｅ．コリＨＢ１０１に形質転換
し、制限分析によりポジティブコロニーを同定した。次
いで、ｐＤＸと呼ばれる、かかるＤＮＡの調製を行っ
た。このプラスミドは外来性遺伝子の挿入のためのユニ
ークＥｃｏＲＩ部位を含む。 【００８８】次に、プロテインＣｃＤＮＡをＥｃｏＲＩ
断片としてｐＤＸ中に挿入した。組換プラスミドを制限
分析によりスクリーニングしてプロモーター要素に対し
て正しい方向のプロテインＣ挿入部を有するプラスミド
を同定し、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＸ／ＰＣと表示され
る）を正しいクローンから調製した（図１７）。ｐＤＸ
／ＰＣ中のｃＤＮＡ挿入部は５′非コード領域中にＡＴ
Ｇコドンを含むから（図２）、トランスフェクションお
よび発現実験の前にｃＤＮＡに対して欠失変異誘発が行
われた。３塩基対の欠失がオリゴヌクレオチド指令変異
誘発の標準操作に従って行われた。変形ｃＤＮＡを含む
ｐＤＸにもとづくベクターをｐ５９４と表示した。 【００８９】Ｃ．ｃＤＮＡ発現 プラスミドｐ５９４を燐酸カルシウム沈澱によりＣＯＳ
細胞中にトランスフェクトした。４時間後に、新たな培
地（５μｇ／mlのビタミンＫを補充）を添加した。適当
な時間（通常４８または７２時間）で、培地を収得し、
細胞を回収し、溶解した。 【００９０】培地又は細胞抽出物中に分泌されたプロテ
インＣを、ＥＬＩＳＡにより、ｃＤＮＡクローンの初期
同定に用いたのと同一のアフィニティー精製したポリク
ローナル抗体を用いて、分析した。分析の結果（第２
表）は、プロテインＣが実験サンプル中で合成されてお
り、トランスフェクトされた細胞から容易に分泌された
ことを示しており、プロテインＣの約９０％が培地中に
認められた。組換蛋白のγ−カルボキシル化の程度を評
価するために、培地のサンプルをクエン酸バリウム沈澱
即ち血漿からγ−カルボキシル化蛋白のみを選択的に沈
澱させるプロセス（Bajaj 他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２５６：２５３〜２５９，１９８１年）に付した。
抗原物質の７０％以上をクエン酸バリウムにより沈澱さ
せることができた。 【００９１】組換プロテインＣを、その凝固を引き延ば
す能力を測定することにより、抗凝固性活性の分析に付
した。透析した培地サンプルをＰｒｏｔａｃ Ｃ （Ａ
ｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｉｃａ）により処理して
プロテインＣを活性化した。次に、サンプルをインビト
ロークロッティングアッセイ (Sugo他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２６０：１０４５３，１９８５年）に付し、
クロッティング時間を測定した。組換物質の活性は、天
然産のプロテインＣのそれと本質的に同一であることが
認められた。 【００９２】 【表２】 【００９３】以上の説明から、説明のためにこの明細書
においては本発明の特定の態様を記述したけれども、本
発明の精神と範囲から逸脱することなく、種々の変更が
なされ得るということが理解されるであろう。従って、
本発明は、特許請求の範囲による場合を除いては、限定
して理解されるべきものではない。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１はｐＨＣλ６Ｌ中のプロテインＣｃＤＮＡ
の部分的制限地図である。コード領域が中空箱により示
されている。 【図２】図２はプロテインＣｃＤＮＡの上流部分のヌク
レオチド配列及びプロテインＣのＮ−末端側の推定され
るアミノ酸配列を示す。矢印は連結（ｃｏｎｎｅｃｔｉ
ｎｇ）ジペプチドの除去及びペプチドの活性化のための
開裂部位を示す。 【図３】図３はプロテインＣｃＤＮＡの下流部分のヌク
レオチド配列及びプロテインＣの下流部分の推定される
アミノ酸配列を示す。 【図４】図４はプロテインＣｃＤＮＡの３′−非翻訳部
分のヌクレオチド配列を示す。 【図５】図５はヒト−プロテインＣをコードするゲノム
ＤＮＡの制限酵素地図を示す。線の下の数値は長さをキ
ロベース（kb）で示す。 【図６】図６はヒト−プロテインＣ遺伝子のエクソン及
びイントロンを含むゲノム配列を示す。矢じりはイント
ロン−エクソン・スプライシング連結部を示す。 【図７】図７はヒト−プロテインＣ遺伝子のエクソン及
びイントロンを含む完全ゲノム配列を示す。矢じりはイ
ントロン−エクソン・スプライシング連結部を示す。黒
のヒシ型印は潜在的な炭水化物付加部位を示す。 【図８】図８はヒト−プロテインＣ遺伝子のエクソン及
びイントロンを含むゲノム配列を示す。矢じりはイント
ロン−エクソン・スプライシング連結部を示す。黒のヒ
シ形印は潜在的な炭水化物付加部位であり；斜下向きの
太い矢印は連結（ｃｏｎｎｅｃｔｉｎｇ）ジペプチドの
プロセシングのための可能性のある開裂部位であり；下
向きの細い矢印はプロテインＣが活性化されたプロテイ
ンＣに転換される場合のヘビー鎖中の開裂部位である。 【図９】図９はヒト−プロテインＣ遺伝子のエクソン及
びイントロンを含む完全ゲノム配列を示す。矢じりはイ
ントロン−エクソン・スプライシング連結部を示す。
３′末端のＡ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ａ及びＡ−Ａ−Ｔ−Ａ
−Ａ−Ａのポリアデニレーション又はプロセシング配列
箱に囲まれており、黒のヒシ形印は潜在的な炭水化物付
加部位であり；黒い小円は、ポリアデニレーション部位
である。 【図１０】図１０はヒト−プロテインＣの構造の概略の
二次元モデルを示す。 【図１１】図１１はプロテインＣの部分的ｃＤＮＡクロ
ーンの５′及び３′部分のサブクローニングを示す。 【図１２】図１２は、エクソンＩとエクソンIIとの連結
をもたらす、ゲノムクローンからのイントロンＡの除去
を示す。 【図１３】図１３は第１図のｃＤＮＡ挿入部の最も５′
側部分へのエクソンＩ及びIIの融合を示す。 【図１４】図１４はプロテインＣのための完全コード配
列を含んで成るプラスミドの造成を示す。 【図１５】図１５は発現ベクターｐＤ７Ｃを示す。使用
されている記号は、ｏｒｉアデノウイルス５０−１マッ
プユニット配列であり；ＥはＳＶ４０エンハンサーであ
り；Ａｄ２ＭＬＰはアデノウイルス２主要後期プロモー
ターであり；Ｌ１−３はアデノウイルス２−３分節系
（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダーであり；５′ｓｓは
５′スプライシング部位であり；３′ｓｓは３′スプラ
イシング部位であり；ｐＡはＳＶ４０初期ポリアデニレ
ーションシグナルであり；そして△はｐＢＲ３２２の
“ポイゾン”（ｐｏｉｓｏｎ）配列の除去領域である。 【図１６】図１６は発現ベクターｐＤ５（ＰＣ−ＤＨＦ
Ｒr ）を示す。ＤＨＦＲr はメトトレキセート耐性変異
ジヒドロフォレートラダクターゼ遺伝子配列を示し；ｐ
ＡはＳＶ４０後期ポリアデニレーションシグナルを示
す。他の記号は図１２に関して記載した通りである。 【図１７】図１７は発現ベクターｐＤＸ／ｐＣを示す。
使用されている記号は図１６に関して記載した通りであ
る。
の部分的制限地図である。コード領域が中空箱により示
されている。 【図２】図２はプロテインＣｃＤＮＡの上流部分のヌク
レオチド配列及びプロテインＣのＮ−末端側の推定され
るアミノ酸配列を示す。矢印は連結（ｃｏｎｎｅｃｔｉ
ｎｇ）ジペプチドの除去及びペプチドの活性化のための
開裂部位を示す。 【図３】図３はプロテインＣｃＤＮＡの下流部分のヌク
レオチド配列及びプロテインＣの下流部分の推定される
アミノ酸配列を示す。 【図４】図４はプロテインＣｃＤＮＡの３′−非翻訳部
分のヌクレオチド配列を示す。 【図５】図５はヒト−プロテインＣをコードするゲノム
ＤＮＡの制限酵素地図を示す。線の下の数値は長さをキ
ロベース（kb）で示す。 【図６】図６はヒト−プロテインＣ遺伝子のエクソン及
びイントロンを含むゲノム配列を示す。矢じりはイント
ロン−エクソン・スプライシング連結部を示す。 【図７】図７はヒト−プロテインＣ遺伝子のエクソン及
びイントロンを含む完全ゲノム配列を示す。矢じりはイ
ントロン−エクソン・スプライシング連結部を示す。黒
のヒシ型印は潜在的な炭水化物付加部位を示す。 【図８】図８はヒト−プロテインＣ遺伝子のエクソン及
びイントロンを含むゲノム配列を示す。矢じりはイント
ロン−エクソン・スプライシング連結部を示す。黒のヒ
シ形印は潜在的な炭水化物付加部位であり；斜下向きの
太い矢印は連結（ｃｏｎｎｅｃｔｉｎｇ）ジペプチドの
プロセシングのための可能性のある開裂部位であり；下
向きの細い矢印はプロテインＣが活性化されたプロテイ
ンＣに転換される場合のヘビー鎖中の開裂部位である。 【図９】図９はヒト−プロテインＣ遺伝子のエクソン及
びイントロンを含む完全ゲノム配列を示す。矢じりはイ
ントロン−エクソン・スプライシング連結部を示す。
３′末端のＡ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ａ及びＡ−Ａ−Ｔ−Ａ
−Ａ−Ａのポリアデニレーション又はプロセシング配列
箱に囲まれており、黒のヒシ形印は潜在的な炭水化物付
加部位であり；黒い小円は、ポリアデニレーション部位
である。 【図１０】図１０はヒト−プロテインＣの構造の概略の
二次元モデルを示す。 【図１１】図１１はプロテインＣの部分的ｃＤＮＡクロ
ーンの５′及び３′部分のサブクローニングを示す。 【図１２】図１２は、エクソンＩとエクソンIIとの連結
をもたらす、ゲノムクローンからのイントロンＡの除去
を示す。 【図１３】図１３は第１図のｃＤＮＡ挿入部の最も５′
側部分へのエクソンＩ及びIIの融合を示す。 【図１４】図１４はプロテインＣのための完全コード配
列を含んで成るプラスミドの造成を示す。 【図１５】図１５は発現ベクターｐＤ７Ｃを示す。使用
されている記号は、ｏｒｉアデノウイルス５０−１マッ
プユニット配列であり；ＥはＳＶ４０エンハンサーであ
り；Ａｄ２ＭＬＰはアデノウイルス２主要後期プロモー
ターであり；Ｌ１−３はアデノウイルス２−３分節系
（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダーであり；５′ｓｓは
５′スプライシング部位であり；３′ｓｓは３′スプラ
イシング部位であり；ｐＡはＳＶ４０初期ポリアデニレ
ーションシグナルであり；そして△はｐＢＲ３２２の
“ポイゾン”（ｐｏｉｓｏｎ）配列の除去領域である。 【図１６】図１６は発現ベクターｐＤ５（ＰＣ−ＤＨＦ
Ｒr ）を示す。ＤＨＦＲr はメトトレキセート耐性変異
ジヒドロフォレートラダクターゼ遺伝子配列を示し；ｐ
ＡはＳＶ４０後期ポリアデニレーションシグナルを示
す。他の記号は図１２に関して記載した通りである。 【図１７】図１７は発現ベクターｐＤＸ／ｐＣを示す。
使用されている記号は図１６に関して記載した通りであ
る。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所
Ａ６１Ｋ 38/46 Ａ６１Ｋ 37/54
(72)発明者 マーク ジェイ．マーレイ
アメリカ合衆国，ワシントン 98102,
シアトル，イレブンス アベニュ イー
スト 2211
(72)発明者 キャスリーン エル．バーグナー
アメリカ合衆国，ワシントン 98199,
シアトル，トゥエンティセカンド アベ
ニュ ウエスト 3032
(72)発明者 ドナルド シー．フォスター
アメリカ合衆国，ワシントン 98105,
シアトル，１，ノースイースト ボート
ストリート 1400
(72)発明者 アール ダブリュ．デイビー
アメリカ合衆国，ワシントン 98004,
ベレブ，ノースイースト トゥエンティ
セカンド プレイス 9010
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．活性なヒトプロテイン−Ｃの製造方法であって、次
のアミノ酸配列： 【化１】【化２】をコードするＤＮＡを含んで成る発現ユニットにより形
質転換された哺乳類宿主細胞を培養し、該培養物から活
性なヒトプロテイン−Ｃを採取することを特徴とする方
法。
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|---|---|---|---|
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| US766109 | 1985-08-15 | ||
| US749600 | 1985-08-15 | ||
| US06/766,109 US4968626A (en) | 1985-08-15 | 1985-08-15 | DNA sequence coding for protein C |
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|---|---|
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|---|---|---|---|
| JP61151303A Expired - Lifetime JP2614848B2 (ja) | 1985-06-27 | 1986-06-27 | ヒト―プロテインｃをコードする遺伝子 |
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|---|---|---|---|
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| CA1332049C (en) * | 1988-10-07 | 1994-09-20 | Eli Lilly And Company | Eukaryotic expression |
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| JP2774163B2 (ja) * | 1989-11-14 | 1998-07-09 | 帝人株式会社 | ヒトプロテインｃ様活性を有する蛋白 |
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| US5270178A (en) * | 1990-02-23 | 1993-12-14 | Eli Lilly And Company | Vectors and compounds for expression of zymogen forms of human protein C |
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