NO305660B1 - DNA-sekvens som koder for et human-aktivert protein C, rekombinant ekspresjonsvektor som omfatter DNA-sekvensen, pattedyrceller transfektert med ekspresjonsvektoren og fremgangsmÕte for fremstilling av human-aktivert protein C - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører hovedsakelig plasmaproteiner og DNA-sekvenser som koder for dem, og mer spesifikt ekspresjon av proteiner som har så å si samme struktur og/eller aktivitet som humant protein C.

Protein C er et zymogen eller en forløper for serin-protease som spiller en viktig rolle i reguleringen av blodkoagulering og dannelse av fibrinolytisk aktivitet in vivo. Det blir syntetisert i leveren som et enkeltkjede-polypeptid som undergår betraktelig prosessering for å gi opphav til et tokje-det molekyl som omfatter tunge (mv = 40 000) og lette (mv = 21 000) kjeder som holdes sammen ved en disulfidbinding. Det sirkulerende to-kjede intermediat blir omdannet til den biologisk aktive form av molekylet, kjent som "aktivert protein C" (APC), ved dens trombinformidlede spalting av et 12-rest peptid fra aminoterminus av den tunge kjeden. Avspaltningsreaksjonen blir utført in vivo ved trombomodulin, en endotelcelle-kofaktor (Esmon og Owen, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 78: 2249 - 2252, 1981).

Protein C er et vitamin K-avhengig glykoprotein som inneholder ca. ni rester av ykarboksyglutaminsyre (Gla) og én ekvivalent av beta-hydroksyasparaginsyre som blir dannet ved post-translasjonale modifikasjoner av henholdsvis glutaminsyre-og asparaginsyre-rester. Den post-translasjonale dannelse av spesifikke gamma-karboksyglutaminsyrerester i protein C krever vitamin K. Disse uvanlige aminosyrerester binder seg til kalsiumioner og er trodd å være ansvarlige for interaksjonen av proteinet med fosfolipid, som kreves for den biologiske virkning av protein C.

I kontrast til den koaguleringsfremmende virkning av andre vitamin K-avhengige plasmaproteiner, slik som faktor VII, faktor IX og faktor X, virker aktivert protein C som en regulator for koaguleringsprosessen gjennom inaktivering av faktor Va og faktor Villa ved begrenset proteolyse. Inaktiveringen av faktor Va og Villa ved protein C er avhengig av tilstedeværelsen av sure fosfolipider og kalsiumioner. Protein S er blitt rap-portert å regulere denne aktivitet ved å aksellerere den AP<2-katalyserte proteolyse av faktor Va (Walker, J. Biol. Chem. - 255: 5521 - 5524, 1980).

Protein C er også blitt implisert i virkningen av vevstype plasminogenaktivator (Kisiel og Fujikawa, Behring Inst. Mitt. 73: 29 - 42, 1983). Infusjon av bovin-APC i hunder resulterer i økt plasminogenaktivator-aktivitet (Comp og Esmon,

J. Clin. Invest. 68: 1221 - 1228, 1981). Nylige studier (Sakata et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 82: 1121 - 1125, 1985) har vist at tilsetning av APC til dyrkede endotelceller fører til en hurtig, doseavhengig økning i fibrinolytisk aktivitet i det kondisjonerte medium, hvilket gjenspeiler økning i aktiviteten av både urokinase-relaterte og vevstype-plasminogenaktivatorer av cellene. APC-behandling resulterer også i en doseavhengig nedgang i antiaktivatoraktivitet.

Nedarvet protein C-mangel er assosiert med tilbakevendende trombotisk sykdom (Broekmans et al., New Eng. J. Med. 309: 340 - 344, 1983; og Seligsohn et al., New Eng. J. Med. 310: 559 -

562, 1984) og kan resultere fra genetisk forstyrrelse eller

fra skade, slik som leversykdom eller kirurgi. Denne tilstand behandles generelt med orale antikoagulanter. Fordelaktige virkninger er også oppnådd gjennom infusjon av protein C-inneholdende normal plasma (se Gardiner og Griffin i Prog. in Hemato-logy, ed. Brown, Grune & Stratton, NY, 13: 265 - 278). I tillegg har noen forskere oppdaget at anti-koagulantaktiviteten av protein C er anvendbar i behandling av trombotiske forstyrrelser, slik som venøs trombose (WO 85/00521). I noen deler av verden er det estimert at ca. 1 pr. 16 000 individer viser protein C-mangel. Videre er en total mangel på protein C fatal i nyfødte.

Mens naturlig protein C kan renses fra sammenklumpingsfak-tor-konsentrater (Marlar et al., Blood 59: 1067 - 1072) eller fra plasma (Kisiel, ibid), er det en kompleks og dyr prosess, delvis på grunn av den begrensede tilgjengelighet av startmate-riale og den lave konsentrasjon av protein C i plasma. Videre medfører den terapeutiske anvendelse av produktene fått fra humant blod, risikoen for sykdomsoverføring ved f.eks. hepatitt-virus, cytomegalovirus, eller det agens som forårsaker ervervet immunmangelsyndrom (AIDS). I lys av protein C's kliniske an-vendbarhet i behandling av trombotiske forstyrrelser er produksjonen av anvendbare mengder av protein C og aktivert proteii C klart uvurderlig. -

I korthet beskriver den foreliggende oppfinnelse en DNA-sekvens som koder for humant aktivert protein C kjennetegnet ved karakteristikken i krav 1. I tillegg beskriver den foreliggende oppfinnelse en ekspresjonsvektor som er i stand til å integrere seg i pattedyr-vertscelle-DNA, inkludert en promoter fulgt i nedstrøms-retning av en nukleotidsekvens som koder for humant aktivert protein C, idet transkripsjon av nukleotidsekvensen dirigeres av promoteren. Nukleotidsekvensen følges i nedstrømsretning av et polyadenyleringssignal. I én utgave inkluderer ekspresjonsvektoren en selekterbar markør lokalisert mellom nukleotidsekvensen og polyadenyleringssignalet, idet transkripsjon av den selekterbare markør dirigeres av promoteren. Ekspresjonsvektoren kan også inkludere et sett av RNA-koblingssteder.

Et relatert aspekt av den foreliggende oppfinnelse vedrører pattedyrceller transfektert til å uttrykke et protein som har den samme biologiske virkning som humant aktivert protein C. Patte-dyrcellene blir transfektert med en ekspresjonsvektor som er i stand til å integrere seg i pattedyrvertscelle-DNA, idet ekspresjonsvektoren inkluderer en promotor fulgt i nedstrømsretning av en nukleotidsekvens som koder for et protein som har i det vesentlige samme struktur og/eller virkning som humant protein C. I én utgave blir en selekterbar markør også innført i cellene og stabilt transfekterte celler velges. Pattedyrceller transfektert til å uttrykke et protein som i det vesentlige har den samme biologiske virkning som humant aktivert protein C, er også beskrevet.

Et videre aspekt av den foreliggende oppfinnelse vedrører en metode for produksjon av et protein som har den samme biologiske virkning som humant aktivert protein C. Fremgangsmåten omfatter (a) innføring i en pattedyrvertscelle av en ekspresjonsenhet som omfatter en sekvens som koder for et protein som i det vesentlige har den samme struktur og/eller virkning som humant aktivert proteir C, eventuelt ytterligere innføring i vertscellen av en selekterbar markør, sammen med ekspresjonsenheten; (b) dyrking av nevnte pattedyrvertscelle i et passende medium; og (c) isolering av proteinproduktet kodet for ved nevnte ekspresjonsenhet og produsert av nevnte pattedyrvertscelle. Proteinproduktet produsert i henhold til denne fremgangsmåten er også beskrevet.

Proteinene som fremstilles ifølge den foreliggende oppfinnelse, ka brukes som aktive terapeutiske stoffer, inkludert regulering av blodkoagulering. Videre kan disse proteiner kombineres med en fysiologisk akseptabel bærer og/eller et fortynningsmiddel for å gi egnede farmasøytiske sammensetninger.

Andre aspekter av oppfinnelsen vil vise seg ved referanse til den detaljerte beskrivelse og vedheftede tegninger. FIG. 1 er et delvis restriksjonskart av protein C cDNA i pHCx6L. Det kodende område er angitt ved et åpent felt. FIG. 2 illustrerer nukleotidsekvensen av det fullstendige protein C cDNA og den utledede aminosyresekvens av protein C. Piler angir spaltningssteder for fjerning av det sammenbindende dipeptid og aktive-ringspeptid. FIG. 3 illustrerer et restriksjonsenzymkart for det genomiske DNA som koder for humant protein C. Tall nedenfor linjen angir lengden i kilobaser (kb). FIG. 4 illustrerer den fullstendige genomiske sekvens,

inkludert eksoner og introner av det humane protein C-gen. Pilhoder angir intron-ekson koblingsforbin-delser. Polyadenylerings- eller prosesseringssekven-ser av A-T-T-A-A-A og A-A-T-A-A-A ved 3'-enden er merket med en mørk firkant, , potensielle karbo-hydrattilheftningssteder; & , tilsynekommende spaltningssteder for prosessering av det forbindende dipeptid; 4" , sete for spalte i den tunge kjeden når protein C omdannes til aktivert protein C; , steder for polyadenylering.

FIG. 5 illustrerer en skjematisk todimensjonal modell for

strukturen av humant protein C.

FIG. 6 illustrerer subkloningen av 5'-og 31-delene av en

protein C partiell cDNÅ-klon.

FIG. 7 illustrerer fjerningen av intron A fra den genom±T=ke klon, hvilket resulterer i fusjon av ekson I og

II.

FIG. 8 illustrerer fusjonen av ekson I og II til 5'-ende-delen av det cDNA-innfelte stykke av fig. 1. FIG. 9 illustrerer konstruksjonen av et plasmid som omfat ter den fullstendige kodesekvens for protein C. FIG. 10 illustrerer ekspresjonsvektor pD7C. Symboler anvendt er ori, adenovirus 5 0-1 kartenhetsekvens; E, SV40-fremmer; Ad2MLP, adenovirus 2 hoved-senpromotor;

L 1-3, adenovirus 2 tredelt leder; 5'ss, 5' koblingssted; 3'ss, 3' koblingssted; pA, SV40 tidlig polyadenyleringssignal; og A, det deleterte område av de pBR322 "gift"-sekvenser.

FIG. 11 illustrerer ekspresjonsvektoren pD5(PC-DHFR<r>).

DHFR<r>betegner metotreksat-resistent mutant dihydrofolat reduktase-gensekvensen, pA betegner SV40 sen-polyadenyleringssignalet. Andre symboler anvendt er som beskrevet for fig. 7.

FIG. 12 illustrerer ekspresjonsvektoren pDX/PC. Symboler som er anvendt, er som beskrevet for fig. 11.

Før vi fremsetter oppfinnelsen, kan det være til hjelp

for forståelse av denne å fremsette definisjoner av noen uttrykk som skal brukes heretter.

Biologisk virkning: En funksjon eller sett av funksjoner utført av et molekyl i en biologisk sammenheng (dvs. i en organisme eller en in vitro faksimile). Biologiske virkninger av proteiner kan deles inn i katalytiske og effektorvirkninger. Katalytiske virkninger av vitamin K-avhengige plasmaproteiner involverer generelt den spesifikke proteolytiske spaltning av andre plasmaproteiner, hvilket resulterer i aktivering eller deaktivering av substratet. Effektor-virkninger inkluderer spesifikk binding av det biologiske aktive molekyl til kalsium eller andre små molekyler, til makromolekyler slik som proteiner, eller til celler. Effektor-virkning forøker ofte eller er nødvendig for katalytisk virkning under fysiologiske betingelser.

For protein C er biologisk virkningkarakterisert ved

dens antikoagulerende og fibrinolytiske egenskaper. Protein C inaktiverer, når det er aktivert, faktor Va og faktor Villa i nærvær av fosfolipid og kalsium. Protein S viser seg å være-1 involvert i reguleringen av dennes funksjon (Walker, ibid). Aktivert protein C øker også fibrinolyse, en effekt som antas å være forårsaket av senkning av nivåer av plasminogenaktivator-inhibitorer (van Hinsbergh et al., Blood 65: 444 - 451, 1985).

Som mer utførlig beskrevet nedenfor, er den delen av protein

C som kodes for av ekson VII og VIII av protein C-genet, primært ansvarlig for dets katalytiske virkninger.

Pre- pro- peptid: En aninosyre-sekvens som forekommer ved aminoterminus av noen proteiner og generelt spaltes fra proteinet under translokasjon. Pre-pro-peptider omfatter sekvenser som dirigerer proteinet inn i sekresjonsveien i cellen (signalsek-venser) og erkarakterisert vedtilstedeværelsen av en kjerne av hydrofobe aminosyrer. De kan også omfatte prosesserings-signaler. Som anvendt her kan betegnelsen "pre-pro-peptid"

også bety en del av det naturlige forekommende pre-pro-peptid.

Ekspresjonsenhet: En DNA-konstruksjon som omfatter en primær nukleotidsekvens som koder for et protein av interesse, sammen med andre nukleotidsekvenser som dirigerer og kontrollerer transskripsjonen av den primære nukleotidsekvens. En ekspresjonsenhet består av i det minste den primære nukleotidsekvens og en promotorsekvens lokalisert i oppstrømsretning fra og på en anvendbare måte bundet til den primære nukleotidsekvens og et polyadenyleringssignal lokalisert i nedstrømsretning. Tilleggs-genetiske elementer kan også være inkludert for å øke effektivi-teten av ekspresjon. Disse elementer inkluderer fremmersekven-ser, ledere og mRNA-koblingssteder.

Ekspresjonsvektor: Et DNA-molekyl som inneholder, bl.a. en DNA-sekvens som koder for et protein av interesse, sammen med en promotor og andre sekvenser som forenkler ekspresjon av proteinet. Ekspresjonsvektorer inneholder videre genetisk informa-sjon som sørger for at de blir replisert i en vertcelle. Eksempler på ekspresjonsvektorer som vanligvis brukes for rekombinant DNA, er plasmider og noen viruser, selv om de kan inneholde elementer av begge. De kan også inkludere en selekterbar markør.

Som nevnt ovenfor produseres protein C i lever og krever vitamin K til sin biosyntese. Vitamin K er nødvendig for dan-nelsen av spesifikke gamma-karboksyglutaminsyrerester i det aminoterminale område av den lette kjede. Disse aminosyreraster dannes ved en post-translasjonal modifikasjon, og trengs for* kalsiumformidlet binding til fosfolipid. I tillegg inneholder protein C en beta-hydroksyasparaginsyrerest som også er dannet i en post-translasjonal modifikasjon. Imidlertid er rollen

av denne aminosyrerest ikke kjent.

Gitt det faktum at virkningen av protein C er avhengig

av post-translasjonale modifikasjoner som involverer gamma-karboksylering av spesifikke glutaminsyrerester, og også kan være avhengig av hydroksylering av en spesifikk asparaginsyrerest,

er det usannsynlig at et aktivt produkt kunne produseres gjennom kloning og ekspresjon av protein C i en mikroorganisme.

Følgelig gir den foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for produksjon av et protein som er gamma-karboksylert og har den biologiske virkning av humant aktivert protein C

gjennom anvendelse av pattedyrceller transfektert til permanent å uttrykke proteinet.

Lette og tunge kjeder av bovint protein C er blitt sekvensdannet (Fernlund og Stenflo, J. Biol. Chem. 257: 12170 - 12179, 1982; og Stenflo og Fernlund, J. Biol. Chem. 257: 12180 - 12190, 1982). Isolering og karakterisering av humant protein C er blitt beskrevet av Kisiel, J. Clin. Invest. 64: 761 - 769, 1979. Med unntak av den aminoterminale asparaginsyrerest, er den amino-terminale sekvens av den tunge kjede av humant protein C forskjellig fra de første 18 aminosyrer funnet i den tunge kjede av det bovine protein. De antikoagulerende aktiviteter av både de humane og bovine enzymer ble funnet å være høyt artsspesifikke. Artsspesifisitet er trodd å være formidlet av protein S (Walker, Thromb. Res. 22: 321 - 327, 1981). Imidlertid viser de humane

og bovine proteiner betraktelig total strukturell homologi med hverandre og med andre vitamin K-avhengige plasmaproteiner, inkludert protrombin, faktor VII, faktor IX og faktor X. Likhe-ter inkluderer tilstedeværelsen av Gla-rester i den lette kjede og det-aktive sete serin i den tunge kjede, såvel som at annen aminosyresekvenshomologi i det aminoterminale område av den lette kjede.

I den foreliggende oppfinnelse ble en xgtl1 cDNA-samling fremstilt fra human lever RNA. Denne samling ble så klassifisert med<125>I-merket antistoff mot humant protein C. Antistoffreaktive kloner ble videre analysert for syntese av et fusjonsprotein av jS-galaktosidase og protein C i Agtll-vektoren.

Én av klonene ga et sterkt signal med antistoffprøven

og ble funnet å inneholde et innfelt stykke på omtrent 1400 bp. DNA-sekvensanalyse av det DNA-innfelte stykke åpenbarte en for-utsagt aminosyresekvens som viser en høy grad av homologi med hoveddeler av det bovine protein C, som bestemt av Fernlund og Stenflo (J. Biol. Chem. 257: 12170 - 12179; J. Biol. Chem. 257: 12180 - 121 90) .

Det DNA-innfelte stykke inneholdt majoriteten av det kodende område for protein C som begynner med aminosyre 64 i den lette kjede, inkludert hele det tunge kjede-kodende område,

og videre til termineringskodon. Videre, idet vi følger stopp-kodon av den tunge kjede, var det 294 basepar av 3'-ikke-kodende sekvens og en poly (A)-hale på 9 basepar. Prosesseringen eller polyadenyleringssignal A-A-T-A-A-A var tilstede 13 basepar i oppstrømsretning fra poly (A)-halen i denne cDNA-innfelte stykke. Denne sekvens var ett av to potensielle polyadenyleringssteder.

cDNA-sekvensen inneholdt også dipeptidet Lys-Arg i posisjon 156 - 157, som separerer den lette kjede fra den tunge kjede og fjernes under prosessen ved proteolytisk spaltning som resulterer i sekresjon av det tokjedede molekyl. Ved aktivering av trombin, blir den tunge kjede av humant protein C spaltet mellom arginin-169 og leucin-170, hvilket frigjør aktiveringspeptidet (fig. 2).

Ved en lignende metode ble et annet cDNA som manglet den kodende sekvens for pre-pro-peptidet og de første 23 aminosyrer av protein C, isolert. Ved å bruke dette cDNA som hybridise-ringsprøve fikk man resten av den kodende sekvens fra en human genom DNA-samling i X Charon 4A (Foster et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 82: 4673 - 4677, 1985). Tre forskjellige X Charon 4A-fager ble isolert, som inneholdt overlappende innfelte stykker for protein C-genet.

Posisjonene av eksoner på de tre fag-klonene ble bestemt ved Southern blot-hybridisering av produkter fra behandlingen

av disse kloner med prøver laget fira 1400 bp cDNA beskrevet ovenfor. De genomiske DNA-innfelte stykker i disse kloner bie kartlagt med enkel og dobbel restriksjonsenzym-spalting fulgt

av agarose-gel-elektroforese, Southern blotting og hybridisering til radiomerkede 5'- og 3'-prøver fått fra cDNA for humant protein C, som vist i fig.. 3.

DNA-sekvensdannende studier ble utført ved å bruke dide-oksy kjede-terminerings-metoden. Som vist i fig. 4 spenner nukleotidsekvensen for genet for humant protein C over ca. 11 kb av DNA. Disse studier åpenbarte videre et potensielt pre-pro-peptid på 4 2 aminosyrer. Basert på homologi med pre-pro-peptidet av bovint protein C i området -1 til -20, er det sannsynlig at pre-pro-sekvensen blir spaltet ved hjelp av en signal-pepti-dase fulgt av Ala-resten ved posisjon -10. Prosessering til det modne protein involverer tilleggs-proteolytisk spalting etter rest -1 for å fjerne det amino-terminale propeptid, og ved rest 155 og 157 for å fjerne Lys-Arg dipeptidet som forbinder de lette og tunge kjeder. Denne slutt-prosessering gir en lett kjede på 155 aminosyrer og en tung kjede på 262 aminosyrer .

Protein C-genet er sammensatt av 8 eksoner som varierer

i størrelse fra 25 til 885 nukleotider, og 7 introner som varierer i størrelse fra 92 til 2668 nukleotider. Ekson I og en del av ekson II koder for 42 aminosyre-pre-pro-peptidet. Den gjenværende del av ekson II, ekson III, ekson IV, ekson V og en del av ekson VI koder for den lette kjede av protein C. Den gjenværende del av ekson VI, ekson VII og ekson VIII koder for den tunge kjede av protein C. Aminosyren og DNA-sekvenser for et cDNA som koder for humant protein C, er vist i fig. 2.

Lokaliseringen av intronene i genet for protein C er primært mellom forskjellige funksjonelle områder. Ekson II spenner over det høyt konserverte område av pre-pro-peptidet og gamma-karboksyglutaminsyre (Gla)-området. Ekson III inkluderer et strekk på åtte aminosyrer som forbinder Gla og vektfaktorom-råder. Ekson IV og V representerer hver et potensielt vektfak-torområde, mens ekson VI dekker et forbindende område som inklu-, derer aktiveringspeptidet. Ekson VII og VIII dekker det katalytiske område som er typisk for alle serin-proteaser.

Aminosyresekvensen og den tentative struktur for humant pre-pro-protein C er vist i fig. 5. Protein C er vist uten Lys-Arg-dipeptidet, som forbinder de lette og tunge kjeder. Lokaliseringen av de sju introner (A til G) er angitt ved mørke - staver. Aminosyrer som flankerer kjente proteolytiske spaltningssteder, er omsirklet. ^ betegner potensielle karbohydrat-bindingssteder. Den første aminosyre i den lette kjede, aktive ringspeptidet og den tunge kjede starter med nummer 1. Denne nummerering er forskjellig fra den som er vist i fig. 2 og 4.

Karbohydrat-tilheftningssteder er lokalisert ved rest

97 i den lette kjede og rest 79, 144 og 160 i den tunge kjede,

i henhold til nummererings-skjemaet i fig. 5. Karbohydrat-halv-delen er kovalent bundet til Asn. I majoriteten av tilfeller kan karbohydrat-tilheftningsmiljøet representeres ved Asn-X-Ser eller Asn-X-Thr, hvor X = enhver aminosyre.

Som nevnt ovenfor spiller protein C en regulatorisk rolle

i koaguleringsprosessen. Det katalytiske område, kodet for av ekson VII og VIII, har serin protease-aktivitet som spesifikt spalter visse plasmaproteiner (dvs. faktor Va og Villa), hvilket resulterer i deres aktivering eller deaktivering. Som resultat av denne selektive proteolyse viser protein C antikoagulerende ' og fibrinolytiske aktiviteter.

På grunn av tilstedeværelse av intervenerende sekvenser

i den genomiske klon, er bare forening av de genomiske og cDNA-sekvenser for å gi en fullstendig kodesekvens, ikke tilstrekke-lig for konstruksjon av en akseptabel ekspresjonsenhet. Det er derfor nødvendig å deletere disse intervenerende sekvenser av grunner som er mer fullstendig beskrevet nedenfor, hvis en genomisk klon anvendes til å konstruere ekspresjonsenheten.

Det 5<1->kodende område kan også fås ved alternative metoder og kan følgelig eliminere behovet for å deletere intervenerende sekvenser. Det 5'-kodende område kan fås ved å bruke prøver fått fra de eksisterende cDNA eller genomiske kloner for å under-søke tilleggs-samlinger. Ved denne metode ble en fullengde-cDNA isolert. Videre er de amino-terminale deler av de vitamin K-avhengige plasmaproteiner ansvarlige for deres henholdsvise kalsiumbindende virkninger. Det er blitt funnet at som et resultat av denne funksjonelle homologi kan de kalsiumbindende områder av disse molekyler bli byttet om og fortsatt opprettholde den virkning som er spesifikk for det katalytiske område av det resulterende molekyl. For eksempel, som beskrevet i US patent-søknad nr. 724 311, innlevert 17. april 1985, kan den aminoterminale del (kalsiumbindende område) av faktor IX bli forent med faktor VII ved aminosyre 36 til å produsere et protein som har virkningen av faktor VII. Faktor VII, faktor IX, faktor X, protrombin og protein S deler denne aminoterminale sekvenshomo- logi med protein C. Følgelig kunne en klonet sekvens som omfatter det 5'-kodende område av genet for ethvert av disse proteiner substitueres for den tilsvarende sekvens av protein C-genet.

I tillegg kan egnede kodende sekvenser syntetiseres, basert

på de kjente aminosyresekvenser av flere av de vitam K-avhengige plasmaproteiner eller på sekvensen av de genomiske protein C-eksoner som er beskrevet her. Teknikker for produksjon av syntetiske nukleotidsekvenser er vel kjent innen faget. For eksempel kan et sett av overlappende oligonukleotider syntetiseres og varmebehandles i par til å gi dobbeltstrengede fragmenter med overlappende kohesive termini. Disse fragmenter blir så ligert som et restriksjonsfragment ville bli det. Det resulterende syntetiske fragment blir så ligert til cDNA ved et passende restriksjonssete. Koblingssekvensen kan modifiseres som nødvendig med oligonukleotid-dirigert mutagenese.

Når man har fått kloner som representerer hele kodesekvensen, kan de passende områder forenes, som nødvendig for å danne den ønskede kodende sekvens. Fragmenter oppnådd fra én eller flere samlinger blir avkuttet med passende restriksjonsendonukleaser og ført sammen enzymatisk i den riktige orientering. Avhengig av fragmentene og de spesielle valgte restriksjonsendonukleaser kan det være nødvendg å fjerne uønskede DNA-sekvenser gjennom en "avsløyfings"-prosess av delesjonsmutagenese eller gjennom en kombinasjon av restriksjonsendonuklease-spalting og mutagenese. Sekvensen som oppnås på denne måte bør fortrinnsvis være i form av en kontinuerlig åpen kodelese-ramme, dvs.

at den mangler de intervenerende sekvenser (introner) som generelt finnes i høyere eukaryotiske gener. Tilstedeværelsen av introner i klonede gener kan føre til avvikende kobling av budbringer-RNA og/eller redusert effektivitet av gen-ekspresjon eller ustabilitet ved forøkning når gensekvensen blir innført i en pattedyrvertscelle. Det er foretrukket at denne kodesekvens videre koder for et pre-pro-peptid for å forenkle god prosessering og sekresjon av protein C. Pre-pro-peptidet kan være av protein C eller et annet utskilt protein, som faktor IX, faktor VII elier protrombin.

Under noen omstendigheter kan det være ønskelig å

produsere aktivt protein C direkte, -for derved å fjerne behovet fc

å aktivere proteinproduktet enten in vitro eller in vivo. Spalt-ningsstedene involvert i modningen og aktiveringen av protein C er kjent (Foster og Davie, ibid). En sekvens som koder for APC kan konstrueres ved å deletere område som koder for aktive-ringspeptidene gjennom oligonukleotid dirigert delesjonsmutagenese. Det resulterende protein vil så aktiveres ved proteolytisk prosessering i sekresjonsveien.

Den kodende sekvens for protein C eller aktivert protein

C blir så innført i en egnet ekspresjonsvektor som i neste om-gang brukes til å transfektere en pattedyrcellelinje. Ekspresjonsvektorer for anvendelse i utførelsen av den foreliggende oppfinnelse vil omfatte en promotor som er i stand til å diri-gere transskripsjonen av et fremmed gen introdusert i en patte-dyrcelle. Virale promotorer er foretrukket pga. deres effektivitet i dirigering av transkripsjon. En spesielt foretrukket promotor er hoved-sen-promotoren fra adenovirus 2. Slike ekspresjonsvektorer vil også fortrinnsvis inneholde et sett av RNA-koblingssteder lokalisert i nedstrømsretning fra promotoren og oppstrømsretning fra innføringsstedet for protein C-sekvensen eller i selve protein C-sekvensen. Foretrukne RNA-koblingssteder kan fås fra adenovirus og/eller immunoglobulin-gener.

Også inneholdt i ekspresjonsvektorene er et polyadenyleringssignal, lokalisert i nedstrømsretning fra innføringsstedet. Virale polyadenyleringssignaler er spesielt foretrukne, slik

som de tidlige eller sene polyadenyleringssignaler fra SV40

eller polyadenyleringssignalet fra adenovirus 5 Elb-området.

I en spesielt foretrukket utgave inkluderer ekspresjonsvekto-

ren også en ikke-kodende viral ledersekvens, slik som den adenovirus 2 tredelte leder, lokalisert mellom promotoren og RNA-koblingsstedene. Foretrukne vektorer kan også inkludere enhancer-sekvenser, slik som SV4 0-enhanceren og sekvenser som koder for adenovirus VA RNA.

Klonede gensekvenser kan innføres i dyrkede pattedyr-

celler ved f.eks. kalsiumfosfat-formidlet transfeksjon iwigiei et al., Cell 14: 725, 1978; Corsaro og Pearson, Somatic Cell— Genetics 7: 603, 1981; Graham og Van der Eb, Virology 52: 456, 1973). Et presipitat dannes fra DNA og kalsiumfosfat, og dette presipitat blir tilført til cellene. Noen av cellene tar opp DNA og beholder det innenfor cellen i flere dager. En liten

-4

fraksjon av disse celler (typisk 10 ) integrerer DNA inn i genomet. For å identifisere disse integranter blir et gen som overfører en selekterbar fenotype (en selekterbar markør) generelt innført i cellene sammen med genet av interesse. Foretrukn-selekterbare markører inkluderer som overfører resistens mot medisiner, slik som neomycin, hygromycin og metotreksat. Selekterbare markører kan innføres i cellen på et separat plasmid samtidig som genet&v interesse, eller de kan innføres på det samme plasmid. Hvis på det samme plasmid kan den selekterbare markør og genet av interesse være under kontroll av forskjellige promotorer eller den samme promotor. I én utgave plasseres den selekterbare markør på samme plasmid som sekvensen som koder for protein C, slik at begge sekvenser kontrolleres av den samme promotor, et arrangement som er kjent som et dicistronisk budskap. Konstruksjoner av denne type er kjent innen fagområdet (f.eks. europeisk patent kontor publikasjon 117 058). Det kan også være fordelaktig å tilsette tilleggs-DNA, kjent som "bærer-DNA" til blandingen som innføres i cellene. Etter at cellene har tatt opp DNA, tillates de å vokse over en tidsperiode, typisk 1 til 2 dager, for å begynne å uttrykke genet av interesse. Medisinseleksjon blir så anvendt for å selektere for vekst av celler som uttrykker den selekterbare markør på en stabil måte. Kloner av slike celler kan klassifiseres for ekspresjon av protein C.

Kopiantallet av den integrerte gensekvens kan økes gjennon forøkning ved å bruke spesielle selekterbare markører (f.eks. dihydrofolat-reduktase, som overfører resistens mot metotreksat) Den selekterbare markør blir innført i cellene sammen med genet av interesse, og medisinseleksjon blir anvendt. Medisinkonsen-trasjonen blir så økt på en trinnvis måte, med seleksjon av resistente celler ved hvert trinn. Ved å selektere for økt kopiantall av klonede sekvenser, kan ekspresjonsnivåer av det kodede'protein økes i vesentlig grad.

Protein C produsert i henhold til den foreliggende oppfinnelse kan renses ved en modifikasjon av Kisiel og Davie (ibid-)-. Medium som inneholder protein C, blir blandet med natriumcitrat og bariumklorid, og presipitatet oppsamlet. Presipitatet vaskes løses igjen og presipiteres igjen med ammoniumsulfat, løses så

i natriumfosfat-benzamidin, dialyseres og tilføres til en DEAE-

Sephadex A-50-kolonne. Den protein C-inneholdende topp, som også inneholder protrombin, blir videre renset ved affinitets-kromatografi på heparin-agarose (Comp. og Esmon, Blood 54: 1272, 1979) eller ved immunoabsorpsjon.

Protein C kan aktiveres ved fjerning av aktiveringspeptidet fra aminoterminus av den tunge kjede. Aktivering kan oppnås ved å bruke a-trombin (Marlar et al., Blood 59; 1067 - 1072, 1982), trypsin (Marlar et al., ibid), eller Russells slange venom faktor X aktivator (Kisiel, ibid).

For å summere eksemplene som følger, beskriver eksempel

1 kloningen av DNA-sekvenser som koder for humant protein C. Eksempel 2 beskriver konstruksjonen av en fullengde kodende sekvens for protein C fra sekvensene isolert i eksempel 1. Eksempel 3 beskriver konstruksjonen av ekspresjonsvektorer for protein C-DNA. Eksempel 4 beskriver produksjonen av protein C ved å bruke transfekterte pattedyrceller. Eksempel 5 beskriver et fullengde-cDNA som koder for protein C, og dets ekspresjon i transfekterte pattedyrceller.

EKSEMPLER

Man fikk restriksjonsendonukleaser og andre DNA-modifika-sjonsenzymer (f.eks. polynukleotid-kinase, kalve-alkalinsk fosfatase, Klenow DNA-polymerase, polynukleotid-ligase) fra Bethesda Research Laboratories (BRL) og New England Biolabs og de ble brukt som angitt av forhandleren, med mindre annet er nevnt.

Oligonukleotider kan syntetiseres på en Applied Biosystems Model 380 A DNA synthesizer og renses ved polyakrylamid-gelelek-troforese på denaturerende geler. E. coli-celler kan transfor-meres som beskrevet av Maniatis et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). Man fikk M13 og pUC-kloningsvektorer og vertstammer fra BRL:

EKSEMPEL 1

Kloning av DNA- sekvenser som koder for humant protein C

En cDNA-koding for en del av humant protein C ble fremstilt som beskrevet av Foster og Davie (ibid). I korte trekk ble enXgt11 cDNA-samling fremstilt fra human-lever-mRNA ved konven- sjonelle metoder. Kloner ble klassifisert ved å bruke 125-j.-merket affinitets-renset antistoff mot humant protein C, og fag ble fremstilt fra positive kloner ved platelysatmetoden (Maniatis et al., ibid), etterfulgt av bånddannelse på en ce-siumklorid-gradient. De cDNA-innfelte stykker ble fjernet ved å bruke Eco RI og subklonet inn i plasmid pUC9 (Vieira og Mes-sing, Gene 19: 259 - 268, 1982). Restriksjonsfragmenter ble subklonet i fagvektorer M13mp10 og M13mp11 (Mesing, Meth. in Emzymology 101: 20 - 77, 1983) og sekvensert ved dideoksy-metoden (Sanger et al., Proe. Nati. Acad. Sei USA 74: 5463 - 5467, 1977) . En klon ble selektert som inneholdt DNA som tilsvarte den kjente sekvens av humant protein C (Kisiel, ibid) og kodet for protein C ved å begynne ved aminosyre 64 av den lette kjede og gå videre gjennom den tunge kjede og inn i det 3'-ikkekodende område. Denne klone ble betegnetXHC1375. En annen cDNA-klone kodet for protein C fra aminosyre 24, ble identifisert. Det innfelte stykke fra denne klone ble subklonet inn i pUC9 og plasmidet betegnet pHV 6L (fig. 1). Denne klone koder for en hoveddel av protein C, inkludert det tunge kjede-kodende område, termineringscodon og 3<1->ikke-kodende område.

Det cDNA-innfelte stykke fra AHC1375 ble nikk-translatert ved å bruke a-32p dNTP og brukt til å undersøke en humangenomisk samling i fag X Charon 4A (Maniatis et al., Cell 15; 687 - 702, 1978) ved å bruke plakk-hybridiseringsprosedyren av Benton og Davis (Science 196: 181 - 182, 1977) som modifisert av Woo (meth. in Enzymology 68: 381 - 395, 1979). Positive kloner ble isolert og plakk-renset (Foster et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 82: 4673 - 4677, 1985, som referert til her). Fag

DNA fremstilt fra positive kloner (Silhavy et al., i Experiments with Gene Fusion, Cold Spring Harbor Laboratory, 1984) ble spaltet med Eco RI eller Bgl II og de genomiske innfelte stykker renset og subklonet i pUC9. Innfelte restriksjonsfragmenter ble subklonet inn i M13 vektorer og sekvensdannet for å bekrefte deres identitet og opprette DNA-sekvensen av hele genet.

Det cDNA-innfelte stykke av pHCX6L ble nikk-translatert

og brukt til å undersøke fag x Charon 4A-samlingen. En genomisk klone ble identifisert, som hybridiserte til prøver laget fra 5'- og 3'-endene av cDNA. Denne fagklon ble fordøyd med

Eco RI og et 4,4 kb fragment, hvilket tilsvarer 5'-enden av protein C-genet, ble subklonet inn i pUC9. Det resulterende rekombinante plasmid ble betegnet pHCR4.4. Fullstendig DNA-sekvensanalyse åpenbarte at det innfelte stykke i pHCR4.4 in-kluderte to eksoner på 70 og 167 basepar adskilt ved en intron på 1263 bp. Det første ekson koder for aminosyrer -42 til -19; det andre koder for aminosyrer -19 til 37. Sekvensanalyse bekreftet DNA-sekvensen av hele protein C-genet.

Som nevnt ovenfor er det så nødvendig å fjerne intronet for å bruke en genomisk klon for å konstruere en akseptabel kodende sekvens for anvendelse i den foreliggende oppfinnelse.

EKSEMPEL 2

Konstruksjon av en fullengde- kodende sekvens for protein C

En fullengde-kodende sekvens for protein C, inkludert pre-pro-peptidet, konstrueres ved å forene de passende fragmenter av cDNA og de genomiske kloner. Dette utføres ved å fjerne intronet fra den genomiske klon (pHCR4.4) og forene de sammen-smeltede eksoner til cDNA (fra pHCx6L) ved passende restriksjonssteder. Den ønskede genomiske:cDNA-kobling blir så dannet ved å "sløyfe ut" uønskede sekvenser ved oligonukleotidrettet deles jonsmutagenese.

Plasmid pHCX6L inneholder protein C partiell cDNA klonet

i Eco RI-sete av pUC9 (fig. 1). Det cDNA-innfelte stykke subklones i to fragmenter for å forbedre det for å forenes til det 5'-ende kodende område fra den genomiske klon. Plasmid pHCX6L blir fordøyd med EcoRI og Sal I, og reaksjonsblanding gen blir så ekstrahert med fenol og CHCl^og etanol-presipitért. Det resulterende DNA-fragmentet blir resuspendert i ligerings-buffer, og T. DNA-ligase blir tilsatt. Ligeringsblandingen blir inkubert ved 15°C i 14 timer. En alikot av ligeringsblandingen blir brukt til å transformere E. coli JM83, og cellene blir platet ut på LB-agar som inneholder X-gal. Hvite kolonier selekteres, og plasmid DNA fremstilles. DNA blir analysert ved restriksjonsenzym-spalting for å identifisere kloner som inneholder 3'-delen av cDNA (ca. 1450 bp innfelt stykke) og 5'delen av cDNA (ca. 65 bp innfelt stykke). Disse kloner betegnes henholdsvis p9C3' og p9C5<1>, (fig. 6).

Det 5' kodende område som mangler fra cDNA, inneholdes i ekson I og II av den genomiske klon pHCR4.4. Dette plasmid inneholder et innfelt stykke på ca. 4400 basepar og slutter på dets 3'-ende ved Eco RI-sete lokalisert i intron B.

For å fjerne den kodende sekvens fra PHCR4.4, blir plasmidet spaltet med Pstl og Eco RI, og de resulterende fragmenter separeres ved elektroforese i en agarosegel. Det ca. 2540 bp fragment som inneholder ekson I og II, isoleres fra gelen og ekstraheres med CTAB (Langridge, et al., Analyt. Biochem.

103: 264, 1980). Dette fragment, betegnet 5'P-R, blir subklonet inn i pUC9 for å produsere plasmid 5'P-R (fig. 7).

Intronet i p5'P-R (betegnet intron A) blir fjernet i en totrinnsprosess (fig.7).Plasmidet blir fordøyd med Apa I,

som spalter ved et unikt sete i intronet og etterlater 3' over-hengende ender. Det lineariserte plasmid blir så behandlet med Bal 31 eksonuklease eller polymerase for å fjerne ca. 400 bp fra hver ende, og de resulterende fragmentender blir gjort butte med S1 nuklease. Det lineariserte plasmid blir så resirkulert med ligase og brukt til å transformere E. coli JM83. Plasmid DNA blir ekstrahert og analysert for tilstedeværelse av Sma I

og Sst I restriksjonssteder i intron A, og et plasmid som har et Sma I-Sst I fragment redusert til 300 - 400 bp blir valgt og betegnet p5'PAaR.

Resten av intron A fjernes ved oligonukleotid-dirigert delesjonsmutagenese, hovedsakelig som beskrevet av Zoller og Smith (Manual for Advanced Techniques in Molecular Cloning Course Cold Spring Harbor Laboratory, 1983) for to-primer-metoden. p5'PAaR blir spaltet med Pst I og Eco RI, og protein C-fragmentet blir subklonet inn i Pst I + Eco RI-spaltet M13mp9. Pluss streng fag DNA blir fremstilt som templat og varmebehandlet til oligonukleotid mut-1 (tabell 1). Dette mutagene oligoriuk-leotid omfatter sekvenser som er komplementære til ekson I og II sekvensene som skal forenes. M13 universal sekvensdannende primer blir varmebehandlet3'til mut-1 på samme templat. Primerene blir utvidet ved å bruke DNA polymerase I (Klenow-fragment) og nukleosid-trifosfater i tilstedeværelse av T^-ligase. De resulterende dupleks DNA-sirkler blir transformert til EJT coli MJ103, og de resulterende plakk klassifisert under strenge

32

hybridiseringsbetingelser ved a bruke det P-merkede mutagene oligonukleotid som prøve. DNA fra positive plaque blir isolert og sekvensdannet ved å bruke oligonukleotidprimer-1 (tabell 1),

som primerdannes i ekson II, hvilket tillater bestemmelse av-DNA-sekvensen over delesjons-krysningspunktet. Et molekyl som har den korrekte fusjon av ekson I og II innen rammen, blir selektert. Pstl-EcoRI-fragmentet isoleres fra den M13 replikative form ved restriksjonsendonuklease-fordøyd og agarosegel-elektroforese og subklones inn i pUC9 for å produsere plasmid p5'I-II (fig. 7).

Idet vi referer til fig. 8 for å forene det 5<1->kodende område til cDNAyblir det ca. 1377 bp Pst I-Eco RI-fragment av

p5'I-II isolert fra et Pst I + Eco RI spaltet stykke av plasmidet og renset ved agarosegel-elektroforese. 65 bp 5'-ende cDNA-fragmentet isoleres fra et Sal I + Eco RI-fordøyd stykke av p9C5' og renset ved elektroforese på en akrylamidgel. De to fragmenter blir ligert ved sine Eco RI-termini, og det resulterende ca. 1330 bp Pst I-Sal I fragment blir subklonet inn i Pst I + Sal I-digestert Ml3mp9 (fig. 8). Plusstrengfag DNA blir fremstilt som templat for oligonukleotid-rettet delesjonsmutagenese. Oligonukleotid mut-2 (tabell 1) blir varmebehandlet til templatet, og oligonukleotid mut-3 (tabell 1) blir varmebehandlet i oppstrøms retning som sekundær primer. Primerene blir utstrakt som beskrevet ovenfor. Oligonukleotid mut-2 dirigerer fusjonen av ekson II-sekvenser som koder for aminosyrer 23 - 26 til cDNA ved kodon 27. Den sekundære primer (mut-3)

introduserer et Eco RI-sete 3 5 bp i oppstrøms retning fra starten av translasjonen. Den resulterende fag blir klassifisert for fraværet av Nco I og Xho I-steder og for tilstedeværelse av det introduserte Eco RI-sete. Fag DNA som viser det ønskede restriksjonsmønster blir sekvensert ved å bruke primer-2 (tabell 1) for å verifisere tilstedeværelsen av den riktige forbindelse mellom ekson II og cDNA: Fag DNA med den korrekte sekvens blir selektert, og Pst I-Sal I fragmentet som inkluderer det 5'-kodende område, blir isolert fra den replikative form av den M13-rekombinante fag. Fragmentet blir renset ved agarosegel-elektroforese og innført i Pst I + Sal I-spaltet pUC9 for å produsere plasmid pC5'-ende.

Idet vi refererer til"fig. 9 blir plasmid pC5'-ende fordøyd med EcoRI og Sal I, og 5'-protein C-fragmentet blir renset ved agarosegel-elektroforese og ekstraksjon med CTAB. Resten av cDNA blir isolert som et Sal I - Eco RI-fragment fra p9C3'. De to fragmenter blir forenet i en tredelsligering tii-Eco RI-digestert pUC9. Ligeringsblandingen brukes til å transformere E. coli JM83, cellene blir platet på LB + X-gal, og plasmid DNA isoleres fra hvite kolonier. Det resulterende plasmid betegnes pHMC. Det inneholder den fullstendige kodende sekvens for humant protein C på et ca. 1500 bp Eco RI-fragment.

EKSEMPEL 3

Konstruksjon av ekspresjonsvektorer for protein C

Det protein C-kodende innfelte stykke fjernes fra pMMC

som et Eco RI-fragment og innføres i en passende pattedyrcelle-ekspresjonsvektor. Et eksempel på en vektor er pD7, som omfatter SV4 0-enhancer og adenovirus 2 hoved-sen-promotor og den tredelte leder.

Plasmid pD7 blir dannet fra plasmid pDHFRIII (Berkner

og Sharp, Nuc. Acids. Res. 13: 841 - 857, 1985). Pst I-sete i umiddelbar oppstrøms-retning fra DHFR-sekvensen i pDHFRIII

ble omdannet til et Bel I-sete ved å fordøye 10/xg plasmid

med 5 enheter av Pst I i 10 minutter ved 37°C i 100^1 buffer A (10 mM Tris pH 8, 10 mM MgCl2, 6 mM NaCl, 7 mM e-MSH). DNA ble fenolekstrahert, EtOH-persipitert og resuspendert i 40/xi"

•buffer B (50 mM Tris pH 8, 7 mM MgCl2, 7 mM e-MSH), som inneholdt 10 mM dCTP og 16 enheter T^DNA-polymerase og inkubert ved 12°C i 60 minutter. Etter EtOH-presipitering ble DNA ligert til 2,5 >g kinabehandlede Bel I-linkere i 14 ul buffer C (10 mM Tris pH 8, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1,4 mM ATP) som inneholdt

400 enheter T4polynukléotid-ligase i 12 timer ved 12°C. Eirter fenolekstrahering og EtOH-persipitering ble DNA resuspendert i 120 fil buffer D (75 mM KC1, 6 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl2,

ImM DTT), spaltet med 80 enheter Bel I i 60 minutter ved 50°C,

så kjørt på elektroforese gjennom agarose. Form III plasmid - DNA (10 |ag) ble isolert fra gelen, og ligert i 10 ul buffer C som inneholdt 50 enheter T. polynukleotidligase i 2 timer ved 12°C, og brukt til å transformere E. coli HB101. Positive kolonier ble identifisert ved hurtig DNA-fremstillingsanalyse, og plasmid DNA (betegnet pDHFR<1>) fremstilt fra positive kolonier, ble transformert inn i dAM E. coli.

Plasmid pD2<1>ble så dannet ved å spalte pDHFR' (15 ug)

og pSV40 (hvilket omfatter Bam HI-digestert SV40 DNA klonet inn i Bam HI-sete av pML-1) (25/xg) i100 fil buffer D med 25 enheter Bel I i 60 minutter ved 50°C, etterfulgt av tilsetning av 50 enheter Bam HI og tilleggsinkubering ved 37°C i 60 minutter. DNA-fragmenter ble løst ved agarosegel-elektroforese,

og 4,9 kb pDHFR'-fragmentet og 0,2 kb SV40-fragment ble isolert. Disse fragmenter (200 ng pDHFR' DNA og 100 ng SV40 DNA) ble inkubert i 10 ul buffer C som inneholdt 100 enheter polynukleotid ligase i 4 timer ved 12°C, og den resulterende konstruksjon (pD2') ble brukt til å transformere E. coli RRI.

Plasmid pD2<1>ble modifisert ved å deletere "gift"-sekvensene i pBR 322-området (Lusky og Botchan, Nature 293: 79 - 81, 1981). Plasmid pD2' (6,6 ug) og pML-1 (Lusky og Botchan, ibid)

(4 ug) ble inkubert i 50 ul buffer A med 10 enheter av hver av Eco RI og Nru I i 2 timer ved 37°C, fulgt av agarosegel-elektroforese. 1,7 kb pD2'-fragmentet og 1,8 kb pML-1-fragmentet ble isolert og ligert sammen (50 ng hver) i 20 ul buffer C som inneholdt 100 enheter T^-polynukleotid ligase i 2 timer ved 12°C, fulgt av transformering til E. coli HB101. Kolonier som inneholdt den ønskede konstruksjon (betegnet pD2) ble identifisert ved hurtig-f remstillingsanalyse. 10/xg av pD2 ble så spaltet

med 20 enheter hver av Eco RI og Bgl II i 50 ul buffer A i 2 timer ved 37°C. DNA ble kjørt på elektroforese gjennom agarose, og det ønskede 2,8 kb fragment (fragment C) som omfatter pBR322, 3'-koblingssete av poly A-sekvenser, ble isolert.

For å danne de gjenværende fragmenter brukt i konstruksjon av pD3, ble pDHFR III modifisert til å omdanne Sac II (Sst ir3-sete til enten et Hind III eller Kpn I-sete. 10 fig pDHFR III-ble spaltet med 20 enheter Sst II i 2 timer ved 37°C, etterfulgt av fenolekstraksjon og etanolpresipitering. Resuspendert DNA ble inkubert i 100 ul buffer B som inneholdt 10 mM dCTP og 16 enheter T4DNA-polymerase i 60 minutter ved 12°C, fenoleks trahert, dialysert og etanolpresipitert./DNA (5 fxg) ble ligert med 50 ng kinabehandlet Hind III eller Kpn I-linkere i 20 til buf: C som inneholdt 400 enheter T4DNA ligase i 10 timer ved 12°C, fenolekstrahert og etanolpresipitert. Etter resuspensjon i 50 ( il buffer A ble de resulterende plasmider spaltet med 50 enheter Hind III eller Kpn I, som passende, og kjørt på elektroforese gjennom agarose. Gel-isolert DNA 8250 ng) ble ligert

i 30 ul buffer C som inneholdt 400 enheter DNA ligase i 4 timer ved 12°C og brukt til å transformere E. coli RRI. De resulterende plasmider ble betegnet pDHFR III (Hind III) og pDHFR III (Kpn I). Et 700 bp Kpn I-Bgl II-fragment (fragment A) ble så

renset "fra pDHFR III (Kpn I) ved spalting med Bgl II og Kpn I fulgt av agarosegel-elektroforese.

SV4 0-enhancersekvensen ble innfelt inn i pDHFR III (Hind III) som følger: 50ug SV40 DNA ble inkubert i ?20 ul buffer A med 50 enheter Hind III i 2 timer ved 37°C,og Hind III C SV40-fragmentet (5089-968 bp) ble gelrenset. Plasmid pDHFR III (Hind III) (10 ug) ble behandlet med 250 ng kalve-intestinal-fosfatase i 1 time ved 37°C, fenolekstrahert og etanolpresipitert. Det lineariserte plasmid (50 ng) ble ligert med 250 ng Hind III C SV40 i 16 ul buffer C i 3 timer ved 12°C ved å bruke 200 enheter T4 polynukleotid ligase og transformert inn i E. coli HB101. Et 700 bp Eco RI-Kpn I fragment (fragment B) ble så isolert

fra dette plasmid.

For sluttkonstruksjonen av pD3, ble fragmenter A og B

(50 ng hver) ligert med 10 ng fragment C med 200 enheter polynukleotid ligase i 4 timer ved 12°C, fulgt av transfeksjon av E. coli RRI. Positive kolonier ble påvist ved hurtig fremstillingsanalyse , og en stor-skala fremstilling av pD3 ble foretatt.

Plasmid pD3 modifiseres til å godta innføring av protein C-sekvensen ved omdannelse av Bel I-innføringssitus til et

Eco RI-situs. Det er først nødvendig å fjerne Eco RI-situs tilstede i pD3 i den venstre terminus av adenovirus 5 0-1 kartenhet

. sekvenser ved å omdanne det til et Bam HI-sete via konvensjo^-nelle linkerende prosedyrer. I korte trekk blir plasmidet fordøyd med Eco RI og det lineariserte DNA behandlet med T4DNA polymerase og alle fire deoksynukleotid-trifosfatert for å danne butte termini. Plasmidet blir så ligert til oktonukleotider som omfatter Bam HI-restriksjonssete, DNA spaltet med Bam HI

for å fjerne overskudd av linkere, og fragmentet som omfatter-pattedyrcelle-ekspresjonssekvenser blir klonet inn i Bam HI-situs av pML-1. Det resulterende plasmid blir transformert inn i E. coli HB101, og plasmid DNA blir fremstilt og klassifisert for deri korrekte omdannelse. På lignende måte blir Bel I-sete omdannet til et Eco RI-sete ved å bruke passende oktonukleotid-linkere. Den resulterende vektor er kjent som pD7. 1,5 kb protein C Eco RI-fragmentet fra pMMC blir så innført i Eco RI-sete av pD7 for å produsere ekspresjonsvektoren pD7C (fig. 10).

En vektor som muliggjør ekspresjon av protein C-sekvensen fra et polycistronisk budskap blir konstruert ved å bruke pD5, et plasmid som er likt pD3, som inneholder en DHFR-kodende sekvens som mangler det meste av det 5'-ikke-kodende område. DHFR-sekvensen blir videre modifisert til å redusere dets bindings-affinitet til metotreksat.

Vektor pD5 blir konstruert ved en metode som er analog

med den som er beskrevet for pD3, og er forskjellige fra pD3 bare i det at et Bam HI-sete er sete for innføring av heterolog DNA, og at Bel I-Bam HI SV40-fragmentet som inneholder SV40 polyadenyleringssignalet, er i den senere orientering.

DHFR-sekvensen modifiseres ved først å spalte pDHFR III

med Pst I og Sst I og isolere 400 bp DHFR-fragmentet. Denne blir subklonet i en M13 fagvektor og mutagenisert som beskrevet av Simonsen og Levinson (Proe. Nati. Acad. Sei. USA 80: 2495 - 2499, 1983). Mutagenese resulterer i en enkelt baseparforandring i DHFR-sekvensen. Det forandrede fragment blir så gjeninnført mn i pDHFR III for a o produsere plasmid pDHFR rIII.

Det 5' ikke-kodende område av DHFR-sekvensen blir så fjernet. Plasmid pDHFR<r>III blir spaltet med Fnu 4HI, som kutter plasmidet på ca. 20 steder, så behandlet med T. DNA-polymerase og alle fire deoksynukleotid-trifosfater for å danne butte termini. Bam HI-linkere blir ligert til endene, og blandingen

blir digestert med Bam HI og Nco I. Et 0,6 kb Bam HI-Nco I-fragment som omfatter DHFR<r>cDNA blir isolert. Plasmid pDHFRIII blir spaltet med Nco I og Bam HI, og 0,2 kb-fragmentet somJi omfatter SV40 polyadenyleringssignalet, isoleres, Polyadeny-le-" ringssignalet, i den tidligere orientering, blir så ligert til DHFR<r->fragmentet. Etter fordøying med Bam HI blir så det resulterende Bam HI-fragment innført inn i Bam HI-sete av pD5

og ligeringsblandingen brukt til å transformere E. coli HB101.

Plasmid DNA blir fremstilt og klassifisert ved restriksjons- _ endonuklease-spalting. Et plasmid som har det DHFR<r->innfelte stykke i den korrekte orientering for transkripsjon fra Ad2 hoved sen-promotor, blir betegnet pD5(DHFR<r>).

For å uttrykke protein C ved å bruke plasmid pD5(DHFR<r>), blir pMMC digestert med Eco RI, og 1,5 kb protein C-fragmentet blir isolert. Eco RI-termini blir omdannet til Bel I-termini ved linkering. Plasmid pD5(DHFR<r>) blir delvis digestert med Bam HI for å spaltet det ved 5'-enden av DHFR<r->sekvensen og

blir ligert til protein C-fragmentet. Plasmid DNA blir klassifisert for den riktige orientering og innføring av protein C-fragmentet. Den resulterende vektor, betegnet pD5(PC-DHFR<r>),

er illustrert i fig. 11.

EKSEMPEL 4

Ekspresjon av protein C i transfekterte pattedyrceller

Babyhamster-nyre (BHK)-celler (American Type Culture Collection tilgangsnr. CCL10) blir transfektert med pD7C hovedsakelig som beskrevet (Wigler et al., Cell 14: 725, 1978; Corsarc og Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603, 1981; og Graham og Van der Eb, Virology 52: 456, 1973). Cellene blir dyrket ved 37°C, 5% C02i Dulbeccos medium (pluss 10% varmeinaktivert føtalt kalveserum og suplementert med glutamin og penicillin-streptomy-cin) i 60 mm vevskultur Petri-skåler til en konfluent på 20%. En total mengde på 10ug DNA blir brukt til å transfektere én

60 mm skål: 3,75 ug av pD7C, 1,25 ug av pKO-neo (Southern og Berg, J. Mol. Appl. Genet 1: 327 - 341, 1982) og 5 ug av lakse-spermie DNA. DNA blir presipitert i 0,3 M NaOAc, 75% etanol, renset med 70% etanol og gjenoppløst i 20 pl 10 mM Tris-HCl pH8, 1 mM EDTA. DNA blir kombinert med 440 ul H20 og 500 ul 280 mM NaCl, 1,5 mM NaHP04, 12 mM dekstrose, 50 mM HEPES pH 7,12. 60 ul av 250 mM CaCl2blir tilsatt dråpevis til blandinger ovenfor, og man lar løsningen stå ved romtemperatur i 30 minutter. Løsningen blir så tilsatt til cellene, og cellene blir returnert til 37°C i 4 timer. Mediet blir fjernet og 5 ml 2QS

DMSO i Dulbeccos med serum blir tilsatt i 2 minutter ved romtemperatur. Skålen blir så vasket fort med 2 forandringer av mediur og inkubert i ferskt medium over natten. 24 timer etter tilset-ningen av DNA blir mediet fjernet, og selektivt medium (10 mg/ml G418, 498 u/mg, Gibco, i Dulbeccos med serum) tilsatt. Etter-ca. 10 - 13 dager, blir individuelle kloner, som representerer celler som har inkorporert pKO-neo-genet og således er resistente mot G418, overført til 96-brønnplater og dyrket for proteinassays i Dulbeccos pluss 10% føtalt kalveserum.

For å bestemme for protein C, blir mediet separert fra cellene og cellulære rester ved sentrifugering, og bestemt for protein C polypeptid og biologisk aktivitet. Cellene blir fjernet fra platene med trypsin, vasket med ferskt medium, sentri-fugert og frosset ved -20°C. For assay blir cellepellets løst opp i PBS, pelletert og resuspendert i PBS som inneholder 0,25% Triton X-100. Prøver blir fortynnet og bestemt for polypeptid og aktivitet.

ELISA for protein C gjøres som følger: 200 ul av antistoff (monoklonalt eller polyklonalt) mot humant protein C (5 ul/ml i 0,1 M Na2CO^pH 9,6) blir inkubert i hver brønn av en 96-brønn mikrotiterplate 2 timer ved 37°C. Brønnene blir så inkubert med 220 ul av 1% bovint serumalbumin (BSA) og 0,05% Tween 20

i PBS pH 7,2 i 2 timer ved 37°C. Platene blir vasket med H20, lufttørket og lagret ved 4°C. Til assayprøver blir 200 ul prøver inkubert i 1 time ved romtemperatur i de antistoffbelagte brøn-ner. Brønnene blir så renset i fire timer med 200 ul PBS som inneholder 0,05% Tween 20. Brønnene blir så inkubert i 1 time ved romtemperatur med 200 ul av en IgG-fraksjon av kanin polyklonalt antiserum mot protein C (5 ug/ml i PBS som inneholder 1% BSA og 0,05% Tween 20). Dette etterfølges av inkubering med geite-anti-kanin-IgG koblet til alkalinsk fosfatase. Brøn-nene blir så vasket 4 ganger med PBS som inneholder 0,05% Tween 20. Til brønnene blir det tilsatt 200 ul p-nitrofenylfosfat

(30 mg) løst i dietanolaminbuffer (96 ml pr. liter) pH 9,8 som inneholder 56 mg/l MgC^. Enzymreaksjonen gjøres ved 37°C, og utviklingen av en gul farve blir målt ved 405 nm ved å bruke en ELISA plateavleser.

Protein Cs biologiske virkning blir målt ved hjelp av dets evne til å forlenge kaolin-cefalin-sammenklumpningstid av plasma etter aktivering ved trombin som beskrevet av Kisiei og Davie (Meth. in Enzymology 80: 320 - 332, 1981).

EKSEMPEL 5

Ekspresjon av et fullengde- cDNA- kodende protein C

A. Isolering av cDNA

Et genomisk fragment som inneholder et ekson som tilsvarer aminosyrene -42 til -19 av pre-pro-peptidet (ekson 1 i fig.

4) av protein C ble isolert, nikk-translatert og brukt som en prøve for å klassifisere en cDNA-samling konstruert ved hjelp av teknikken til Gubler og Hoffman (Gene 25: 263 - 269, 1983) ved å bruke mRNA fra HEPG2-celler. Denne cellelinje fikk man fra humane hepatocytter og ble tidligere vist å syntetisere protein C (Fair og Bahnak, Blood 64: 194- 204, 1984). Ti positive kloner som omfattet cDNA innført i Eco RI-sete av fagXgt11 ble isolert og klassifisert med en oligonukleotidprøve

som tilsvarte det 5' ikke-kodende område av protein C-genet.

En klon var også. positiv med denne prøve, og hele dens nukleotidsekvens ble bestemt. cDNA inneholdt 70 bp av 5' utranslatert sekvens, hele kodesekvensen for human pre-pro-protein C, og hele det 3<1>ikke-kodende område som tilsvarer det andre polyadenylerings-sete (fig. 2).

B. Ekspresjonsvektorkonstruksjon

Ekspresjon av protein C cDNA ble oppnådd i vektor pDX. Denne vektor fikk man fra pD3 (beskrevet i eksempel 3 ovenfor) og pD3', en vektor identisk med pD3 med unntak av at SV4 0 polyadenyleringssignalet (dvs. SV40 BamHI (2533 bp) til Bc1l (2770 bp)-fragmentet) er i den sene orientering. Således inneholder pD3' et Bam HI-sete som sete for geninnføring.

For å danne pDX ble Eco RI-sete i pD3' omdannet til et_ Bell sete ved Eco RI-spalting, inkubering med Sl nuklease og påfølgende ligering med Bel I linkere. DNA ble fremstilt fra

en positivt identifisert koloni, og 1,9 kb Xho I-Pst I-fragmentet som inneholdt det forandrede restriksjonssete var blitt fremstilt via agarosegel-elektroforese. I en annen modifise-ring ble Bel I-spaltet pD3 ligert med. kinasebehandlede Eco RI-Bcl I-adaptorer (konstruert fra oligonukleotider ZC 525, 5'SGAA-TTCT3<1>; og ZC526, 5'GATCAGAATTCC3') for å danne et Eco RI-sete som posisjonen for innføring av et gen inn i ekspresjonsvektoren. Positive kolonier ble identifisert ved hjelp av restriksjonsendo-nukleaseanalyse, og DNA fra dette ble brukt til å isolere et

2,3 kb Xho I-Pst I-fragment som inneholdt det modifiserte restriksjonssete. De to ovenfor beskrevne DNA-fragmenter ble inkubert sammen med T4 DNA-ligase, transformert inn i E. coli HB10J og positive kolonier ble identifisert ved restriksjons-analyse. En fremstilling av slik DNA, betegnet pDX, ble så foretatt. Dette plasmid inneholder et unikt Eco RI-sete for innføring av fremmede gener.

Protein C-cDNA ble så innført i pDX som et Eco RI-fragment. Rekombinante plasmider ble klassifisert ved hjelp av restrik-sjonsanalyse for å identifisere de som har protein C innført i den riktige orientering med hensyn til promotor-elementene,

og plasmid DNA (betegnet pDX/PC) ble fremstilt fra en korrekt klon (fig. 12). Fordi det cDNA innførte stykke i pDX/PC inneholder et ATG-kodon i det5'ikke-kodende område (se fig. 2)

ble delesjonsmutagenese utført på cDNA før transfeksjon og eks-presjonseksperimenter. Deles jon av de tre basepar ble utført i henhold til standardprosedyrer for oligonukleotid-dirigert mutagenese. Den pDX-baserte vektor som inneholdt den modifiserte cDNA, ble betegnet p594.

C. cDNA-ekspresjon

Plasmid p594 ble transfektert inn i COS-celler ved kalsi-umf osf at-presipitering . Fire timer senere ble ferskt kulturme-dium (tilsatt 5 ug/ml vitamin K) tilsatt. Ved passende tidspunk-ter (vanligvis 48 eller 72 timer), ble kulturmediet høstet,og cellene ble samlet og lysert.

Protein C utskilt i kulturmediet eller celle-ekstraktene, ble bestemt ved ELISA ved å bruke det samme affinitets-rensede polyklonale antistoff som ble brukt i startidentifiseringen av cDNA-klonene. Resultater av bestemmelsene (tabell 2) viste at protein C ble syntetisert i de eksperimentelle prøver og lett ble utskilt fra de transfekterte celler, med ca. 90% av protein C funnet i kulturmediet.

For å undersøke graden av gamma-karboksylering av det rekombinante protein ble prøver av kulturmediet utsatt for barri-umcitrat-presipitasjon, en prosess som selektivt presipiterer_ bare gamma-karboksylerte proteiner fra plasma (Baja et al.,

J. Biol. Chem. 256; 253 - 259, 1981). Over 70% av det antigene materialet kunne presipiteres med bariumcitrat.

Det rekombinante protein C ble bestemt for antikoagule— rende virkning ved måling av dets evne til å forlenge koagule-ring. Dialyserte mediaprøver ble behandlet med Protac C (American Diagnostica) for å aktivere protein C. Prøvene ble så

tilsatt til en in vitro sammenklumpingsassay (Sugo et al.,

J. Biol. Chem. 260: 10453, 1985) og sammenklumpingstiden ble målt. Aktiviteten av det rekombinante materiale ble vist å være hovedsakelig den samme som den i naturlig forekommende protein C.

Claims (7)

1. DNA-sekvens som koder for et human-aktivert protein C,karakterisert vedat DNA-sekvensen ikke inkluderer en sekvens som koder for 12-aminosyre-aktiveringspeptidet som er vist i figur 2, idet det aktiverte protein C har en aminosyresekvens som er vist i figur 2, og at proteinet eventuelt ytterligere omfatter en aminoterminal kalsiumbindende domene av et protein valgt fra gruppen som består av faktor VII, faktor IX, faktor X og protrombin.

2. Rekombinant ekspresjonsvektor som omfatter en DNA-sekvens som koder for et human-aktivert protein C,karakterisert vedat DNA-sekvensen ikke inkluderer en sekvens som koder for 12-aminosyre-aktiveringspeptidet som er vist i figur 2, idet det aktiverte protein C har en aminosyresekvens som er vist i figur 2.

3. Ekspresjonsvektor med evne til integrering i pattedyr-vertscelle-DNA,karakterisert vedat ekspresjonsvektoren inkluderer en promoter fulgt nedstrøms av en nukleotidsekvens i henhold til krav 2, hvor nukleotidsekvensen følges nedstrøms av et polyadenyleringssignal, hvor transkripsjon av nukleotidsekvensen er dirigert av promoteren.

4. Fremgangsmåte for fremstilling av human-aktivert protein C,karakterisert vedat den omfatter å innføre i en pattedyrvertscelle en ekspresjonsenhet som omfatter en sekvens i henhold til krav 1, som koder for et human-aktivert protein C; å eventuelt ytterligere innføre i vertscellen, sammen med ekspresjonsenheten, en selekterbar markør, å dyrke pattedyrvertscellen i et passende medium som inneholder vitamin K; og å isolere det proteinprodukt som kodes av nevnte ekspresjons enhet og er produsert av nevnte pattedyrvertscelle.

5. Fremgangsmåte som angitt i krav 4, karakterisert vedat ekspresjonsenheten inneholdes på en ekspresjonsvektor med evne til integrering i pattedyrvertscelle-DNA, idet ekspresjonsvektoren inkluderer en promoter fulgt nedstrøms av en nukleotidsekvens som koder for human-aktivert protein C, idet nukleotidsekvensen følges nedstrøms av et polyadenyleringssignal, hvor transkripsjon av nukleotidsekvensen følges nedstrøms av et polyadenyleringssignal, hvor transkripsjon av nukleotidsekvensen blir dirigert av promoteren.

6. Fremgangsmåte som angitt i krav 4, karakterisert vedat pattedyrvertscellen er en nyrecelle fra en hamsterunge eller en COS-celle.

7. Pattedyrceller,karakterisert vedat de er transfektert med en ekspresjonsvektor i henhold til krav 2 eller 3, for å uttrykke human-aktivert protein C.