DK175574B1 - DNA-sekvens, der koder for et specifikt protein, rekombinantvektor, der omfatter sekvensen, og celler, der er transficerede til ekspression af proteinet, samt fremgangsmåde til fremstilling af proteinet - Google Patents

Description

DK 175574 B1

Opfindelsen angår generelt DNA-sekvenser, som koder for human protein C, samt rekombinante ekspressionsvektorer omfattende denne sekvens og en fremgangsmåde til fremstilling af human aktiveret protein C.

5 Protein C er et zymogen, eller forstadie, af en serinprotease, som spiller en vigtig rolle i reguleringen af blodkoagulering og udvikling af fibrinolytisk aktivitet in vivo. Det syntetiseres i leveren som et enkeltkædet polypeptid, der undergår betragtelig bearbejdning (processing) til dannelse af et tokædet molekyle omfattende en tung kæde (mofekylvægt 40.000) og en let kæde 10 (molekylvægt 21.000) holdt sammen af en disulfidbinding. Den cirkulerende tokæde-holdige mellemform omdannes til den biologisk aktive form af molekylet, kendt som “aktiveret protein C” (APC) ved den thrombin-formidlede fraspaltning af et 12 aminosyrer langt peptid fra den aminotermi-nale ende af den tunge kæde. Fraspaltningsreaktionen forøges in vivo af 15 thrombomodulin, en cofaktor fra endothelceller (Esmon og Owen, Proc. Natl.Acad.Sci. USA 78: 2249-2252, 1981).

Protein C er et vitamin K-afhængigt glycoprotein, som indeholder ca. 9 rester af gamma-carboxyglutaminsyre (Gla) og et ækvivalent af beta-20 hydroxyasparaginsyre, som dannes ved modifikationer af glutaminsyrerester henholdsvis asparaginsyrerester efter translation. Dannelsen af specifikke gamma-carboxyglutaminsyrerester i protein C efter translation kræver vitamin K. Disse usædvanlige aminosyrerester bindes til caiciumioner, og det formodes, at de er ansvarlige for proteinets interaktion med phospholipid, som 25 er nødvendig for protein C’s biologiske aktivitet.

I modsætning til den koaguleringsfremmende virkning hos andre vitamin K-afhængige plasmaproteiner, såsom faktor VII, faktor IX og faktor X, virker aktiveret protein C som en regulator af koagulationsprocessen ved inaktiver-30 ing af faktor Va og faktor Villa ved begrænset proteolyse. Protein C’s inaktivering af faktor Va og Villa er afhængig af tilstedeværelsen af sure phosphol-ipider og caiciumioner. Det er blevet rapporteret, at protein S regulerer denne DK 175574 B1 2 aktivitet ved at accelerere den APC-katalyserede proteolyse af faktor Va (Walker, J.Biol.Chem. 255: 5521-5524, 1980).

Protein C har også være inddraget i virkningen af vævstype-5 plasminogenaktivator (Kisiel og Fujikawa, Behring Inst.Mitt., 73: 29-42, 1983). Infusion af bovin APC i hunde resulterer i forøget plasminogenaktiva-toraktivitet (Comp og Esmon, J . Clin. Invest., 68: 1221-1228, 1981). Nylige undersøgelser (Sakata et al., Proc.Natl. Acad.Sci.USA 82, 1121-1125, 1985) har vist, at tilsætningen af APC til dyrkede endothelceller fører til en hurtig, 10 dosisafhængig forøgelse af fibrinolytisk aktivitet i det konditionerede medium, hvilket afspejler cellernes forøgede aktivitet af både den urokinase-relaterede plasminogenaktivator og vævstype-plasminogenaktivatoren. APC-behandiing resulterer også i en dosisafhængig nedsættelse af antiaktivatoraktivitet.

15 Nedarvet protein C-mangel er forbundet med tilbagevendende thrombotiske sygdomme (Broekmans et al., New Ena. J. Med. 309, 340-344, 1983, og Seligsohn et al., New Eng. J. Med. 310, 559-562, 1984) og kan stamme fra genetiske forstyrrelser eller fra trauma, såsom leversygdomme eller operation. Denne tilstand behandles almindeligvis med orale antikoagulerende 20 midler. Der er opnået gavnlig effekt ved infusion af protein C-holdig normalplasma (se Gardiner og Griffin i Prog, in Hematotoov, red. Brown, Grune & Stratton, NY., 13, 265-278). Ydermere har nogle forskere opdaget, at protein C’s antikoagulerende aktivitet er nyttig ved behandling af thrombotiske sygdomme, såsom venethrombose (WO 85/00521). I nogle dele af verdenen 25 har man vurderet, at ca. 1 ud af 16.000 individer udviser protein C mangel. Ydermere er total mangel på protein C fatal for nyfødte.

Skønt naturlig protein C kan oprenses fra størkningsfaktorkoncentrater (Mar-lar et al., Blood 59:1067-1072) eller fra plasma (Kisiel, se ovenfor), er det en 30 kompleks og dyr proces, delvis på grund af den begrænsede tilgængelighed af udgangsmaterialet og den lave koncentration af protein C i plasma. Ydermere er den terapeutiske anvendelse af produkter hidrørende fra human blod forbundet med risiko for sygdomsoverførsel af f.eks. hepatitisvirus, cyto- DK 175574 B1 3 megalovirus eller den sygdomsfremkaldende faktor i erhvervet im-munmangelsyndrom (AIDS). I lyset af protein C’s kliniske anvendelighed ved behandling af thrombotiske sygdomme, er fremstillingen af brugbare mængder protein C og aktiveret protein C klart af uvurderlig betydning.

5 I korte træk angår opfindelsen en DNA-sekvens, som koder for et protein, der efter aktivering ved proteolytisk bearbejdning I secernereingsbanen resulterer I et human aktiveret protein C, ejendommeligt ved, at DNA-sekvensen ikke indeholder en sekvens, der koder for det 12 aminosyre lange aktiveringspep-10 tid som vist i Fig. 2 og at det aktiverded protein C har en aminosyresekvens som vist i Fig. 2. Endvidere angår opfindelsen en rekombinant ekspressionsvektor, der omfatter DNA-sekvensen som beskrevet ovenfor. Ydermere angår opfindelsen en ekspressionsvektor, som er i stand til at integrere i pat-tedyrværtscelle-DNA, hvilken vektor indeholder en promoter, der neden-15 strøms er efterfulgt af en nukleotidsekvens, hvorhos transkriptionen af nuk-leotidsekvensen er styret af promotoren. Nukleotidsekvensen er neden-strøms efterfulgt af et polyadenyleringssignal.

I et beslægtet aspekt angår opfindelsen pattedyrsværtsceller, der er transfi-20 ceret med en ekspressionsvektor til ekspression af human aktiveret protein C.

I et yderligere aspekt angår opfindelsen en fremgangsmåde til fremstilling af humn aktiveret protein C. Fremgangsmåden omfatter, (a) at en ekspression-25 senhed, som omfatter en sekvens, der koder for et protein, som efter aktivering ved intracellulær proteolytisk bearbejdning resulterer I et human aktiveret protein C, indføres i en pattedyrværtscelle, (b) at pattedyrværtscellen dyrkes i et hensigtsmæssigt medium der indeholder vitamin K, og (c) at det proteinprodukt, der kodes fra denne ekspressionsenhed, og som produceres af pat-30 tedyrværtscellen, isoleres.

Andre aspekter ved opfindelsen vil tydeligt fremgå af den detaljerede beskrivelse og den tilhørende tegning.

DK 175574 B1 4

Fig. 1 er et udsnit af et restriktionskort for protein C-cDNA i pHCA6L. Det kodende område er angivet af en åben kasse.

5 Fig.2 viser nukleotidsekvensen af det fulde protein C-cDNA og den deducerede aminosyresekvens af protein C. Pile angiver spaltningssteder til fjernelse af forbindelsesdipeptidet og det aktiverende peptid.

Fig.3 viser et restriktionsenzymkort af det genom-DNA, som koder for human 10 protein C. Tallene under linien angiver længde i kilobaser (kb).

Fig.4 viser den fulde genomsekvens, inklusiv exonområder og intronområder, af det humane protein C-gen. Pilehoveder angiver intron-exon-splejsningssteder. Polyadenylerings- eller bearbejdningssekvensene A-T-T-15 A-A-A og A-A-T-A-A-A i 3’-enden er indrammet. ♦, potentielle kulhydratfastgørelsessteder; O tilsyneladende spaltningssteder for bearbejdning af for-bindeisesdipeptid; f, spaltningssted i den tunge kæde, når protein C omdannes til aktiveret protein C; · polyadenyleringssteder.

20 Fig.5 viser en skematisk, todimensional model for strukturen af human protein C.

Fig.6 viser subkloningen af 5’- og 3-delene af en cDNA-klon, der indeholder dele af protein C.

25

Fig.7 viser fjernelsen af intran A fra genomklonen, hvilket resulterer i fusionen af exonområderne I og II.

Fig.8 viser fusionen af exonområderne I og II til den del af cDNA-indføjelsen i 30 fig.1, som ligger nærmest 5’-enden.

Fig.9 viser konstruktionen af et plasmid, der indeholder den fuldstændige kodesekvens for protein C.

DK 175574 B1 5

Fig.10 viser ekspressionsvektoren pD7C. De anvendte symboler er: ori, adenovirus 5 sekvens med kortenheden 0-1; E: SV40 forstærker; Ad2MLP, adenovirus 2's sene hovedpromoter; L 1-3, adenovirus 2's tredelte leder; 5'ss: 5’-5 splejsningssted; 3’ss: 3’-splejsningssted; pA: SV40’s tidlige polyadenyler-ingssignal og Δ: det fjernede område af pBR322 "gift”-sekvenserne.

Fig.11 viser ekspressionsvektoren PD5(PC-DHFR). DHFR betegner den methotrexat-resistente dihydrofolatreduktasegenmutantsekvens; pA betegner 10 SV40’s sene polyadenyleringssignal.

DK 175574 B1 6

Andre anvendte symboler er som beskrevet for fig.7.

Fig. 12 viser ekspressionsvektoren pDX/PC. De anvendte symboler er som beskrevet for fig. 11.

5 Før opfindelsen beskrives, kan det for at forstå denne være nyttigt at give en definition af visse termer, der anvendes herefter.

Biologisk aktivitet: En funktion eller et sæt af funktioner udført af et molekyle i 10 en biologisk sammenhæng (dvs, i en organisme eller i en in vitro kopi heraf). Proteinernes biologiske aktivitet kan inddeles i katalytiske aktiviteter og effektoraktiviteter. De vitamin K afhængige plasmaproteiners katalytiske aktivitet involverer almindeligvis deri specifikke proteolytiske spaltning af andre plasmaproteiner, hvilket resulterer i aktivering eller deaktivering af 15 substratet. Effektoraktiviteter inkluderer specifik binding af det biologisk aktive molekyle til calcium eller andre små molekyler, til makromolekyler, såsom proteiner, eller til celler. Effektoraktivitet forøger ofte eller er essentiel for katalytisk aktivitet under fysiologiske betingelser.

20 For protein C er biologisk aktivitet karakteriseret ved dets antikoagulerende og fibrinolytiske egenskaber. Når protein C er aktiveret, inaktiverer det faktor Va og faktor Villa i nærværelse af phospholipid og calcium. Protein S synes at være involveret i regulationen af denne funktion (Walker, se ovenfor). Aktiveret protein C forøger også fibrinolyse, en effekt, som formodes at for-25 midies via sænkningen af niveauer af plasminogenaktivatorinhibitorer (van Hinsbergh et al., Blood 65: 444-451, 1985). Som beskrevet i yderligere detaljer nedenfor er den del af protein C, som kodes af exonområderne VII og VIII i protein C-genet, primært ansvarlig for dets katalytiske aktiviteter.

30 Præ-propeotid: En aminosyresekvens, som forekommer i den aminotermi-nale ende af nogle proteiner, og som almindeligvis fraspaltes fra proteinet under translokation. Præ-propeptider omfatter sekvenser, der styrer proteinet ind i cellens secerneringsbane, (signalsekvenser) og er karakteriseret af DK 175574 B1 7 tilstedeværelsen af en kerne af hydrofobe aminosyrer. De kan også indeholde bearbejdningssignaler. Sådan som udtrykket "præ-propeptid” anvendes her, kan det også betyde en del af det naturligt forekommende præ-propeptid.

5

Ekspressionsenhed: En DNA-konstruktion omfattende en primær nukleotid-sekvens, der koder for et protein af interesse, sammen med andre nukleotid-sekvenser, som dirigerer og styrer transkriptionen af den primære nukieotid-sekvens. En ekspressionsenhed består mindst af den primære nukleotidsek-10 vens og en promotersekvens anbragt opstrøms den primære nukteotidsek-vens og i funktionsdygtig forbindelse med denne samt et polyadenylerings-signal anbragt nedenstrøms. Yderligere genetiske elementer kan også være inkluderet for at forøge ekspressionens virkningsfuldhed. Disse elementer inkluderer forstærkersekvenser, ledersekvenser og mRNA-splejsningssteder.

15

Ekspressionsvektor: Et DNA-molekyle, som bl.a. indeholder en DNA-sekvens, der koder for et protein af interesse, sammen med en promoter og andre sekvenser, som letter ekspressionen af proteinet. Ekspressionsvektorer indeholder ydermere genetisk information, som sørger for deres replika-20 tion i en værtscelle. Eksempler på ekspressionsvektorer, som det er almindeligt at anvende til rekombinant DNA, er plasmider og visse vira, skønt vektorerne kan indeholde elementer fra begge. De kan også indeholde en selek-terbar markør.

25 Som anført ovenfor produceres protein C i leveren og kræver vitamin K for dets biosyntese. Vitamin K er nødvendig for dannelsen af specifikke γ-carboxyglutaminsyrerester i det aminoterminale område af den lette kæde.

Disse aminosyrerester dannes ved en modifikation efter translation og er nødvendige for calcium-formidlet binding til phospholipid. Ydermere inde-30 holder protein C en β-hydroxyasparaginsyrerest, som også dannes ved en modifikation efter translation. Disse aminosyreresters rolle kendes imidlertid ikke.

DK 175574 B1 8 På baggrund af den kendsgerning, at aktiviteten af protein C er afhængig af modifikationer efter translation, modifikationer, som involverer gammacar-boxylering af specifikke glutaminsyrerester, og som også kan være afhængige af hydroxyleringen af en specifik asparaginsyrerest, er det usand-5 synligt, at der vil blive produceret et aktivt produkt ved kloningen og ekspressionen af protein C i en mikroorganisme.

Opfindelsen tilvejebringer følgelig en fremgangsmåde til fremstilling af et protein, som er gamma-carboxyleret og ved aktivering har human aktiveret pro-10 tein C’s biologiske aktivitet, ved hvilken fremgangsmåde der anvendes pattedyrceller transficeret til permanent ekspression af proteinet.

De lette og tunge kæder af bovin protein C er blevet sekventeret (Fernlund og Stenflo, J.Biol.Chem. 257: 12170-12179, 1982 samt Stenflo og Fernlund, 15 J.Biol. Chem. 257: 12180-12190, 1982). Isolering og karakterisering af human protein C er blevet beskrevet af Kisiel, J.Clin.Invest. 64: 761-769, 1979.

Med undtagelse af den aminoterminale asparaginsyrerest er den aminoter-minale sekvens af den tunge kæde hos human protein C forskellig fra de første 18 aminosyrer fundet i den tunge kæde fra bovinproteinet. De antikoagul-20 erende aktiviteter hos både de humane og bovine enzymer fandtes at være meget artsspecifikke. Artsspecificitet formodes at være formidlet af protein S (Walker, Thromb.Res. 22: 321-327, 1981). Humane og bovine proteiner udviser imidlertid en betragtelig samlet strukturel homologi med hinanden og andre vitamin K-afhængige plasmaproteiner, inklusiv prothrombin, faktor Vil, 25 faktor IX og faktor X. Lighederne omfatter tilstedeværelsen af Gla-resterne i den lette kæde og serin i det aktive site i den tunge kæde, såvel som anden aminosyresekvenshomologi i det aminoterminale område af den lette kæde.

I forbindelse med opfindelsen blev der fremstillet et Agtll-cDNA bibliotek ud 30 fra human lever-mRNA. Dette bibliotek blev screenet med 125l-mærket antistof mod human protein C. De antistofreaktive kloner blev yderligere analyseret for syntese af et fusionsprotein af β-galactosidase og protein C i Ågtll-vektoren.

DK 175574 B1 9

En af klonerne gav et stærkt signal med antistofproben, og den viste sig at indeholde et indsat stykke på ca. 1400 bp. DNA-sekvensanalyse af det indsatte DNA-stykke viste en forudsagt aminosyresekvens, hvilket viser en høj 5 grad af homologi med vigtige dele af bovin protein C, som bestemt af Fernlund og Stenflo (J.Biol.Chem. 257: 12170-12179; J.Biol.Chem. 257: 12180-12190).

DNA-ind.føjelsen indeholdt hoveddelen af det kodende område for protein C 10 begyndende med aminosyre 64 i den lette kæde og inkluderende det kodende område for hele den tunge kæde og fortsættende til termineringsko-deordet. Efter stopkodeordet for den tunge kæde var der ydermere 294 basepar af ikke-kodende 3’-sekvens og en poly(A)-hale af 9 basepar. Bearbejdningssignalet eller polyadenyleringssignalet A-A-T-A-A-A fandtes 13 15 basepar opstrøms for poly{A)-halen i denne cDNA-indføjelse. Denne sekvens var en af de to potentielle polyadenyleringssteder.

cDNA-sekvensen indeholder også dipeptidet Lys-Arg ved position 156-157, som skiller den lette kæde fra den tunge kæde og fjernes under modning-20 sprocessen ved proteolytisk spaltning, som resulterer i secernering af det tokædeholdige molekyle. Ved aktivering med thrombin, spaltes den tunge kæde af human protein C mellem arginin-169 og leucin 170, hvilket frigør aktiveringspeptidet (fig.2).

25 På lignende måde blev en anden cDNA, som manglede den kodende sekvens for præ-propeptidet og de første 23 aminosyrer i protein C, isoleret. Ved at anvende denne cDNA som en hybridiseringsprobe, blev resten af den kodende sekvens opnået ud fra et human genom-DNA bibliotek i λ Charon 4A (Foster et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 82: 4673-4677, 1985). Der blev isol-30 eret 3 forskellige λ Charon 4A fager, som indeholdt overlappende tilføjelser for protein C genet.

DK 175574 B1 10

Positionerne for exonområderne på de tre fagkloner biev bestemt ved hjælp af Southern-blot-hybridisering af fordøjelser af disse kloner ved hjælp af prober fremstillet ud fra det 1400 bp lange cDNA beskrevet ovenfor. Genom-DNA-indføjelserne i disse kloner blev kortlagt ved hjælp af enkelt- og 5 dobbeltrestriktionsenzymfordøjelse efterfulgt af agarosegelelektroforese, Southern-blotting og hybridisering til radioaktivt mærkede 5’- og 3’-prober hidrørende fra cDNA’et for human protein C, som vist på fig.3.

Der blev udført DNA-sekventeringsundersøgelser under anvendelse af dide-10 oxykædetermineringsmetoden. Som vist på fig.4 strækker nukleotidsekven-sen for genet for human protein C sig over ca. 11 kb DNA. Disse undersøgelser afslørede endvidere et potentielt præpropeptid på 42 aminosyrer. Baseret på homologi med præ-propeptidet fra bovin protein C i området -1 til -20 er det sandsynligt, at præprosekvensen spaltes af en βίοι 5 nalpeptidase efter Ala-resten ved position -10. Bearbejdning til det modne protein involverer yderligere proteolytisk spaltning efter aminosyreresten -1 til fjernelse af det aminoterminale propeptid og ved aminosyreresteme 155 og 157 til fjernelse af Lys-Arg-dipeptidet, som forbinder de lette og tunge kæder.

Denne sidste bearbejdning giver en let kæde på 155 aminosyrer og en tung 20 kæde på 262 aminosyrer.

Protein C-genet er sammensat af 8 exonområder, som omfatter fra 25 til 885 nukleotider, og 7 intronområder, som omfatter fra 92 til 2668 nukleotider.

Exon I og en del af exon II koder for det 42 aminosyrer lange præ-propeptid.

25 Den resterende del af exon II, exon III, exon IV, exon V og en del af exon VI koder for den lette kæde af protein C. Den resterende del af exon VI, exon VII og exon VIII koder for den tunge kæde af protein C. Aminosyre- og DNA-sekvenserne for en cDNA, der koder for human protein C, vises på fig.2.

30 Intronområderne i genet for protein C er primært anbragt mellem forskellige funktionelle domæner. Exon II strækker sig over det meget konserverede område af præ-propeptidet og domænet med γ-carboxyglutaminsyre (Gla).

Exon III inkluderer en strækning med 8 aminosyrer, som forbinder Gla- og DK 175574 B1 11 vækstfaktordomænerne. Exonområderne IV og V repræsenterer hver et potentielt vækstfaktordomæne, medens exon VI dækker et forbindelsesområde, som inkluderer aktiveringspeptidet. Exonområderne VII og VIII dækker det katalytiske domæne, som er typisk for alle serinproteaser.

5

Aminosyresekvensen og den tentative struktur for human præproprotein C vises på fig.5. Protein C vises uden Lys-Arg-dipeptidet, som forbinder den lette og tunge kæde. Lokaliseringen af de 7 intronområder (A til G) er angivet med optrukne streger. Aminosyrer, som flankerer kendte proteolytiske spalt-10 ningssteder, er omgivet af en cirkel. ♦ angiver potentielle kulhydratbindingssteder. Den første aminosyre i den lette kæde, aktiveringspeptidet, og den tunge kæde starter med nummer 1. Denne nummerering adskiller sig fra den, der er vist på figurerne 2 og 4.

15 Kulhydratbindingsstederne er lokaliseret ved aminosyrerest 97 i den lette kæde og aminosyreresterne 79, 144 og 160 i den tunge kæde ifølge den nummerering, der er anvendt på fig. 5. Kulhydratenheden bindes covalent til Asn. I langt de fleste tilfælde kan omgivelserne omkring kulhydratbindingsstedet angives ved Asn-X-Ser eller Asn-X-Thr, hvor X er lig med en hvilken 20 som helst aminosyre.

Som anført ovenfor spiller protein C en regulatorisk rolle i koaguleringsprocessen. Det katalytiske domæne, der kodes af exonområderne VII og VIII, har serinproteaseaktivitet, som specifikt spalter visse plasmaproteiner (dvs, fak-25 torer Va og Villa), hvilket resulterer i aktivering eller deaktivering heraf. Som følge af denne selektive proteolyse udviser protein C antikoaguleringsaktivitet og fibrinolytisk aktivitet.

På grund af tilstedeværelsen af intervenerende sekvenser i genomklonen er 30 en ren og skær sammenknytning af genomklonen og cDNA-sekvenserne til tilvejebringelse af en fuldt kodende sekvens ikke tilstrækkelig til at konstruere en acceptabel ekspressionsenhed. Det er derfor nødvendigt at fjerne disse intervenerende sekvenser af grunde, som skal beskrives i større detaljer ne- DK 175574 B1 12 denfor, hvis der anvendes en genomklon til at konstruere ekspressionsenheden.

Det 5’-kodende område kan også opnås ved alternative metoder, og som 5 følge heraf eliminere behovet for at fjerne intervenerende sekvenser. Det 5’-kodende område kan opnås ved at anvende prober hidrørende fra det eksisterende cDNA eller genomkloner til probering af yderligere genbiblioteker.

Ved denne metode blev der isoleret et cDNA i fuld længde. Ydermere er de aminoterminale dele af de vitamin K-afhængige plasmaproteiner ansvarlige 10 for deres respektive calciumbindingsaktiviteter. Det har som følge af denne funktionelle homologi vist sig, at de calciumbindende domæner af disse molekyler kan ombyttes og stadig bevare aktiviteten specifikt for det katalytiske domæne i det fremkomne molekyle. Som det f.eks. er beskrevet i US patentansøgning 724.311, indleveret 17. april 1985, kan den aminoterminale 15 del (det calciumbindende domæne) af faktor IX forbindes med faktor VII ved aminosyre 36 til dannelse af et protein, der har faktor Vlls aktivitet. Faktor VII, faktor IX, faktor X, prothrombin og protein S deler denne aminoterminale sekvenshomologi med protein C. Som følge heraf kan en klonet sekvens omfattende det 5-kodende område af genet for et hvilket som helst af disse pro-20 teiner indsættes i stedet for den tilsvarende sekvens i protein C-genet. Yderligere egnede kodesekvenser kan syntetiseres på basis af de kendte amino-syresekvenser for adskillige vitamin K-afhængige plasmaproteiner eller på basis af sekvensen af de her viste protein C-exongenomområder. Metoder til fremstilling af syntetiske nukleotidsekvenser er velkendte. Der kan f.eks.

25 syntetiseres et sæt af overlappende oligonukleotider, og de kan få lov at danne par til dannelse af dobbeltstrengede fragmenter med overlappende “klæbrige” ender. Disse fragmenter ligeres derefter, som alle andre restriktionsfragmenter ville blive det. Det fremkomne, syntetiske fragment ligeres derefter til cDNA’et på et hensigtsmæssigt restriktionssted. Forbindelsessek-30 vensen kan modificeres efter behov ved hjælp af oligonukleotidstyret mutagenisering.

DK 175574 B1 13 Når der er opnået kloner, som repræsenterer hele den kodende sekvens, kan de korrekte områder knyttes sammen efter behov til frembringelse af den ønskede kodende sekvens. Fragmenter opnået fra et eller flere genbiblioteker kan åbnes med hensigtsmæssige restriktionsendonukleaser og knyttes 5 sammen enzymatisk i den korrekte orientering. Afhængig af fragmenterne og de valgte specielle restriktionsendonukleaser kan det være nødvendigt at fjerne uønskede DNAsekvenser ved en mutagenisering, hvor en “udsløjfet” sekvens fjernes, eller ved en kombination af restriktionsendonukleasespalt-ning og mutagenisering. Den således opnåede sekvens bør fortrinsvis være i 10 form af en kontinuerlig, åben læseramme, dvs, at den mangler de intervenerende sekvenser (intronområder), som almindeligvis findes i højere eukaryoti-ske gener. Tilstedeværelsen af intronområder i klonede gener kan føre til afvigende splejsning af mRNA og/eller reduceret genekspressionsvirknings-fuldhed eller ustabilitet ved amplifikation, når gensekvensen indføres i en pat-15 tedyrværtscelle. Det foretrækkes, at denne kodende sekvens yderligere ko der for et præpropeptid for at lette den korrekte bearbejdning under modning og secernering af det protein C, der frembringes i overensstemmelse med den foreliggende opfindelse. Præ-propeptidet kan være det for protein C eller et andet secerneret protein, såsom faktor IX, faktor VII eller prothrombin.

20

Under visse omstændigheder kan det være ønskeligt at fremstille aktivt protein C direkte, hvorved man fjerner behovet for at aktivere proteinproduktet enten jn vitro eller in vivo. De spaltningssteder, som er involveret i modningen og aktiveringen af protein C, er kendte (Foster og Davie, se ovenfor). En 25 sekvens, som koder for APC, kan konstrueres ved at fjerne det område, der koder for aktiveringspeptider, ved oligonukleotidstyret deletionsmutageniser-ing. Det fremkomne protein vil derefter blive aktiveret ved proteolytisk bearbejdning i secemeringsbanen.

30 Den kodende sekvens for protein C eller aktiveret protein C indsættes derefter i en hensigtsmæssig ekspressionsvektor, som igen anvendes til at transfi-cere en pattedyrcellelinie. Ekspressionsvektorer til brug ved udøvelse af opfindelsen vil omfatte en promoter, som er i stand til at styre transkriptionen DK 175574 B1 14 tionen af et fremmed gen, som indføres i en pattedyrcelle. Virale promotorer foretrækkes på grund af deres effektivitet ved styring af transkription. En specielt foretrukken promoter er den sene hovedpromotor fra adenovirus 2. Sådanne ekspressionsvektorer vil også fortrinsvis indeholde et sæt af RNA-5 splejsningssteder anbragt nedenstrøms promotoren og opstrøms indsættelsesstedet for protein C-sekvensen eller i selve protein C-sekvensen. Foretrukne RNA-splejsningssteder kan opnås fra adenovirus og/eller immu-noglobulingener. I ekspressionsvektorerne findes også et polyadenylerings-signal anbragt nedenstrøms indsættelsesstedet for protein C. Der foretræk-10 kes navnlig virale poiyadenyleringssignaler, såsom de tidlige eller sene polyadenyleringssignaler fra SV40 eller polyadenyleringssignalet fra adenovirus 5 Elb-området. I en speciel foretrukken udføretsesform omfatter ekspressionsvektoren også en ikke-kodende viral ledersekvens, såsom den tredelte adenovirus 2 leder, anbragt mellem promotoren og RNA-15 splejsningsstederne. Foretrukne vektorer kan også indeholde forstærkersekvenser, såsom SV40-forstærkeren og de sekvenser, der koder for adenovirus VA-RNA’er.

Klonede gensekvenser kan derefter indføres i dyrkede pattedyrceller ved 20 f.eks. calciumphosphatformidlet transfektion (Wigler et al., Cell 14: 725, 1978; Corsaro og Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603, 1981; Graham og van der Eb, Virology 52: 456, 1973). Der dannes et præcipitat af DNA’et og calciumphosphat, og cellerne udsættes for dette præcipitat. Nogle af cellerne optager DNA’et og holder det inden i cellen i adskillige dage. En lille fraktion 25 af disse celler (typisk 10'4) integrerer DNA’et i genomet. For at kunne identificere disse integrerede stykker indføres sædvanligvis et gen, som giver en selekterbar fænotype (en selekterbar markør) i cellerne sammen med det gen, der har interesse. Foretrukne, selekterbare markører indbefatter gener, som giver resistens mod medikamenter, såsom neomycin, hygromycin og 30 methotrexat. Selekterbare markører kan indføres i cellen på et separat plasmid på samme tidspunkt som det gen, der har interesse, eller de kan indføres på det samme plasmid. Hvis den selekterbare markør og genet af interesse sidder på samme plasmid, kan de være under styring af forskellige DK 175574 B1 15 promotorer eller af den samme promoter. I én udførelsesform er den selek-terbare markør anbragt på det samme plasmid som den sekvens, der koder for protein C, således at begge sekvenser styres af den samme promoter; en udformning, som kaldes et dicistronisk budskab. Der kendes konstruktioner 5 af denne type (f.eks. publikation nr. 117.058 fra det europæiske patentkontor). Det kan også være en fordel at tilføre yderligere DNA, kendt som “bæ-rer-DNA”, til den blanding, som indføres i cellerne. Efter at cellerne har taget DNA’et op, får de lov til at vokse et stykke tid, typisk 1-2 dage, for at begynde ekspression af det gen, der har interesse. Selektion ved hjælp af 10 medikamentet anvendes derefter for at selektere for vækst af celler, som udtrykker den selekterbare markør på en stabil måde. Kloner af sådanne celler kan screenes for ekspression af protein C.

Kopiantallet af den integrerede gensekvens kan forøges ved amplifikation 15 under anvendelse af visse selekterbare markører (f.eks. dihydrofolatreduk-tase, som giver resistens mod methotrexat). Den selekterbare markør indføres i cellerne sammen med det gen, som er af interesse, og selektion ved hjælp af medikamentet udføres. Koncentrationen af medikamentet forøges derefter trinvis, idet der udføres selektion af resistente celler på hvert trin.

20 Ved at selektere for forøget kopiantal af klonede sekvenser kan ekspressionsniveauer af det kodede protein forøges væsentligt.

Protein C fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse kan oprenses ved en modifikation af metoden beskrevet af Kisiel og Davie (se ovenfor). Medium 25 indeholdende protein C blandes med natriumcitrat og bariumchlorid, og præcipitatet opsamles. Præcipitatet vaskes, genopløses og genpræcipiteres med ammoniumsulfat, hvorefter det opløses i natriumphosphat-benzamidin, dialyseres og sættes på en DEAE-Sephadex A-50-søjle. Den protein C-holdige top, som også indeholder prothrombin, oprenses yderligere ved af-30 finitetskromatografi på heparin-agarose (Comp og Esmon, Blood. 54; 1272, 1979) eller ved immunoadsorption.

DK 175574 B1 16

Protein C fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse kan aktiveres ved at fjerne aktiveringspeptidet fra den aminoterminale ende af den tunge kæde. Aktivering kan opnås ved at anvende α-thrombin (Marlar et al., Blood, 59: 1067-1072, 1982), trypsin (Marlar et al., se ovenfor) eller Russelfs faktor X 5 aktiverende slangegift (Kisiel, se ovenfor).

I oversigt omfatter de efterfølgende eksempler følgende. Eksempel 1 beskriver kloningen af DNA-sekvenser, som koder for human protein C. Eksempel 2 beskriver konstruktionen af en kodende sekvens i fuld længde for 10 protein C ud fra de sekvenser, der er isoleret i eksempel 1. Eksempel 3 beskriver konstruktionen af ekspressionsvektorer for protein C-DNA. Eksempel 4 beskriver produktionen af protein C under anvendelse af transficerede pattedyrceller. Eksempel 5 beskriver en cDNA i fuld længde, som koder for protein C, samt dens ekspression i transficerede pattedyrceller.

15

Eksempler

Restriktionsendonukleaser og andre DNA-modificerende enzymer (f. eks. T4-polynukleotid kinase, alkalisk kalvephosphatase, Klenow-DNA-polymerase, 20 T4-polynukleotidligase) blev opnået fra Bethesda Research Laboratories (BRL) og New England Biolabs og blev anvendt som anført af producenterne med mindre andet angives.

Oligonukleotider kan syntetiseres på et “Applied Biosystems Model 380 A” -25 DNA-syntetiseringsapparat og kan oprenses ved poly-acrylamidgelelektroforese på denaturende geler. E.coli. -celler kan transformeres, som beskrevet af Maniatis et a!., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). M13- og pUC- kloningsvektorer og værtsstammer blev opnået fra BRL.

30

Eksempel 1

Kloning af DNA-sekvenser. som koder for human protein C

DK 175574 B1 17

Et cDNA, som koder for en del af human protein C, blev fremstillet som beskrevet af Foster og Davie (se ovenfor). I korthed blev et Agt11-cDNA-bibliotek fremstillet ud fra human lever mRNA ved traditionelle metoder. Kloner blev 5 screenet under anvendelse af 125l-mærket, affinitetsoprenset antistof mod human protein C, og fager blev fremstillet ud fra positive kloner ved pladelys-atmetoden (Maniatis et al., se ovenfor), efterfulgt af bånddannelse på en cæsiumchloridgradient. De i cDNA indsatte stykker blev fjernet ved hjælp af Eco RI og subklonet i plasmid pUC9 (Vieira og Messing, Gene 19: 259-268, 10 1982). Restriktionsfragmenter blev subklonet i fagvektorerne M13mp10 og M13mp11 (Messing, Meth. in Enzymoloqy 101: 20-77, 1983) og blev sek-venteret ved hjælp af dideoxymetoden (Sanger et al., Proc. Natl. Acad.Sci, USA 74: 5463-5467, 1977). Der blev selekteret en klon, som indeholdt DNA svarende til den kendte sekvens for human protein C (Kisiel, se ovenfor) og 15 som koder for protein C begyndende med aminosyre 64 i den lette kæde og strækkende sig gennem den tunge kæde og ind i det ikke-kodende 3'-område. Denne klon blev betegnet ?JHC1375. Der blev identificeret en anden cDNA-klon, som koder for protein C fra aminosyre 24. Det indsatte stykke fra denne klon blev subklonet i pUC9, og plasmidet blev betegnet pHC 6L (fig.1).

20 Denne klon koder for en hoveddel af protein C inkluderende området med den tunge kæde, termineringskodeordet og det ikke-kodende 3’-område.

cDNA-indføjelsen fra AHC1375 blev nick-translateret under anvendelse af a-32P dNTP’er og blev anvendt til at undersøge et humant genombibliotek i fag 25 A Charon 4A (Maniatis et al., Cell 15: 687-702, 1978) under anvendelse af plaquehybridiseringsmetoden beskrevet af Benton og Davis (Science 196: 181-182, 1977) og modificeret af Woo (Meth. in Enzymoloqy 68: 381-395, 1979). Positive kloner blev isoleret og plaque-oprenset (Foster et al.,

Proc. Natl .Acad.Sci. USA 82: 4673-4677, 1985, som her inkorporeres som 30 reference). Fag-DNA, som var fremstillet ud fra positive ktoner (Silhavy et al., i Experiments with Gene Fusion, Cold Spring Harbor Laboratory, 1984) blev fordøjet med Eco RI eller Bgl II, og genomtilføjelserne blev oprenset og subklonet i pUC9. De indsatte restriktionsfragmenter blev subklonet i M13- DK 175574 B1 18 vektorer, og blev sekventeret for at bekræfte deres identitet og fastslå DNA-sekvensen af hele genet.

cDNA-indføjelsen i pHCX6L blev nick-translateret og anvendt til at undersøge 5 fag λ Charon 4A-biblioteket. Der blev identificeret en genomklon, som hybrid-iserede med prober fremstillet ud fra 5’- og 3’-enderne af cDNA’et. Denne fagklon blev fordøjet med Eco RI, og et 4,4 kb langt fragment svarende til 5’-enden af protein C-genet blev subklonet i pUC9. Det fremkomne rekombi-nantplasmid blev betegnet pHCR4.4. Fuld DNA-sekvensanalyse afslørede, at 10 indføjelsen i pHCR4.4 omfattede to exonområder på 70 og 167 basepar adskilt af et intronområde på 1263 bp. Det første exonområde koder for ami-nosyrerne -42 til -19; det andet koder for aminosyrerne -19 til 37. Sekvensanalyse bekræftede DNA-sekvensen af hele protein C genet.

15 Som anført tidligere er det derefter nødvendigt at fjerne intronområdet for at anvende genomklonen til at konstruere en acceptabel kodesekvens til anvendelse ved den foreliggende opfindelse.

Eksempel 2 20

Konstruktion af en kodende sekvens for protein C i fuld længde

Et kodende sekvens for protein C i fuld længde inkluderende præ-propeptidet konstrueredes ved at sammenføje de rigtige fragmenter af cDNA’et og ge-25 nomklonerne. Dette opnåedes ved at fjerne intronområdet fra genomklonen (pHCR4.4) og sammenføje de fusionerede exonområder med cDNA’et (fra pHCA6L) ved hensigtsmæssige restriktionssteder. Den ønskede ge-nonrcDNA-forbindelse blev derefter frembragt ved at uønskede sekvenser blev fjernet under udsløjfning i oligonukleotidstyret mutagenisering.

Plasmid pHCA6L indeholder cDNA, som koder for en del af protein C, og som er klonet i Eco Rl-stedet af pUC9 (figur 1). cDNA indføjelsen blev subklonet i to fragmenter, for at gøre det klart til et blive knyttet sammen med det 30 DK 175574 B1 19 det kodende område nærmest 5’-enden fra genomklonen. Plasmid pHCA6L blev fordøjet med Eco RI og Sal I, og reaktionsblandingen ekstraheredes derefter med phenol og CHCI3 og præcipiteredes med ethanol. De fremkomne DNA-fragmenter blev resuspenderet i ligeringspuffer, og der blev tilsat 5 T4-DNA-ligase.

Ligeringsblandingen inkuberedes ved 15°C i 14 timer. En delmængde af ligeringsblandingen blev anvendt til at transformere E.coli JM83, og cellerne blev udpladet på LB-agar indeholdende X-gal. Der udvalgtes hvide kolonier, og 10 der fremstilledes plasmid-DNA. DNA’et blev analyseret ved restriktionsen-zyrnfordøjelse for at identificere kloner indeholdende 3’-delen af cDNA’et (et indsat stykke på ca. 1450 bp) og 5'-delen af cDNA’et (et indsat stykke på ca.

65 bp). Disse kloner blev betegnet p9C3’ henholdsvis p9C5’ (figur 6).

15 Det 5’-kodende område, som mangler i cDNA’et, findes i exonområderne I og II i genomklonen pHCR4.4. Dette plasmid indeholder en indføjelse på ca.

4400 basepar og slutter i 3’-enden med et Eco Ri-sted anbragt i intronom-råde B.

20 For at fjerne de kodende sekvenser fra pHCR4.4, blev plasmidet fordøjet med Pst I og Eco RI, og de fremkomne fragmenter blev separeret ved elek-troforese i en agarosegel. Det ca. 2540 bp lange fragment indeholdende exonområderne I og II blev isoleret fra gelen og ekstraheret med CTAB (Lan-gridge et al., Anatyt.Biochem. 103: 264, 1980). Dette fragment, betegnet 5’P-25 R, blev subklonet i pUC9 til frembringelse af plasmid p5’P-R (figur 7).

Intronområdet i p5’P-R (betegnet intran A) blev fjernet ved en to-trinsproces (fig.7). Plasmidet blev fordøjet med Apal, som spalter ved et unikt sted i intronområdet og efterlader 3’-fremstikkende ender. Det lineariserede plasmid 30 blev derefter behandlet med Bal 31-exonuklease eller T4-polymerase for at fjerne ca. 400 bp fra hver ende, og de fremkomne fragmentender blev gjort stumpe ved hjælp af S1-nuklease. Det lineariserede plasmid blev igen omdannet til cirkel-form ved hjælp af ligase og anvendt til at transformere E.coli DK 175574 B1 20 JM83. Plasmid-DNA blev ekstraheret og analyseret for tilstedeværelse af Sma I- og Sst l-restriktionssteder i intron A, og et plasmid med et Sma l-Sst I-fragment reduceret til 300-400 bp udvalgtes og betegnedes p5'PAaR.

5 Resten af intron A fjernedes ved oligonukleotidstyret deletions-mutagenisering, stort set som beskrevet af Zoller og Smith (Manual for Advanced Techniques in Molecular Cloning Course, Cold Spring Harbor Laboratory 1983) for to-primermetoden. pS’PAaR fordøjedes med Pst I og Eco RI, og protein C-fragmentet blev subklonet i M13mp9 fordøjet med Pst I og Eco 10 RI. Plus-streng-fag-DNA blev fremstillet som template og blev annealet til oligonukleotid mut-1 (tabel 1). Dette mutagene oligonukleotid omfattede sekvenser, som var komplementære til sekvenserne i exonområderne I og II, som skal føjes sammen. Den M13-universelle sekvensprimer annealedes 3’ for mut-1 på den samme template. Primerne blev forlænget under an-15 vendelse af DNA-polymerase I (Klenow fragment) og nukleosidtriphosphater i nærværelse af T4-ligase. De fremkomne, dobbeltstrengede DNA-cirkler blev transformeret ind i E.coli JM103, og de fremkomne plaques blev screenet under stringente hybridiseringsbetingelser under anvendelse af det 32P-mærkede mutantoligonukleotid som probe. DNA fra positive plaque blev isol-20 eret og sekventeret under anvendelse af oligonukleotidprimer-1 (tabel 1), som fungerer som primer i exon II, hvilket gør det muligt at bestemme DNA-sekvensen tværs over deletionsforbindelsesstedet. Et molekyle, hvor fusionen af exon-områderne I og II er i korrekt læseramme, udvalgtes. Pst I-Eco Rl-fragmentet isoleredes fra den replikative form af M13 ved restriktion-25 sendonuklease-fordøjelse og agarosegelelektroforese og blev subklonet i pUC9 til dannelse af et plasmid ρ5Ί-ΙΙ (figur 7).

Der henvises nu til figur 8. For at knytte det 5’-kodende område til cDNA’et blev det ca. 1277 bp lange Pst Ι-Eco Rl-fragment fra p5’l-ll isoleret fra en 30 fordøjelse af plasmidet med Pst I og Eco RI, og det blev oprenset ved agarosegelelektroforese. Det 65 bp lange cDNAfragment, som er mest 5’, blev isoleret fra en fordøjelse af p9C5’ med Sal I og Eco RI og blev oprenset ved elektroforese på en acrylamidgel. De to fragmenter blev ligeret ved deres DK 175574 B1 21

Eco Rl-ender, og det fremkomne ca. 1330 bp Pst l-Sal l-fragment blev sub-klonet i M13mp9 fordøjet med Pst I og Sal I (figur 8). Plus-streng-fag-DNA blev fremstillet som template for oligonukleotidstyret deletionsmutagenise-ring. Oligonukleotid mut-2 (tabel 1} blev annealet til templaten, og 5 oligonukleotid-mut-3 (tabel 1) blev annealet opstrøms som anden primer. Primerne blev forlænget som ovenfor beskrevet. Oligonukleotid mut-2 styrer fusionen af exon-ll sekvenser, som koder for aminosyrerne 23-26, til cDNA’et ved codon 27. Den anden primer (mut-3) introducerer et Eco Rl-genkendelsessted 35 bp opstrøms starten af translation. Den fremkomne fag 10 blev screenet for fravær af Nco I- og Xho l-genkendelsessteder og for tilstedeværelsen af det indførte Eco Rl-genkendelsessted. Fag-ONA, som viser det ønskede restriktionsmønster, blev sekventeret under anvendelse af primer-2 (tabel 1) for at bekræfte tilstedeværelsen af den korrekte forbindelse mellem exon II og cDNA’et. Fag-DNA med den korrekte sekvens udvalgtes, 15 og Pst 1-Sal 1-fragmentet omfattende det 5-kodende område blev isoleret fra den replikative form af M13-rekombinantfagen. Fragmentet blev oprenset ved agarosegelelektroforese og indsat i pUC9 fordøjet med Pst I og Sal I til frembringelse af plasmid pC5’-ende.

20 Der henvises til fig.9. Plasmid pC5’-ende blev fordøjet med Eco RI og Sal I, og protein C-5’-fragmentet blev oprenset ved agarosegelelektroforese og ekstraheret med CTAB. Resten af cDNA’et blev isoleret som et Sal I - Eco Rl-fragment fra p9C3’. De to fragmenter blev knyttet sammen i en 3-parts ligering til pUC9 fordøjet med Eco RI. Ligeringsblandingen blev anvendt til at 25 transformere E.coli JM83, cellerne blev udpladet på LB + X-gal, og plasmid-DNA blev isoleret fra hvide kolonier. Det fremkomne plasmid blev betegnet pMMC. Det indeholder den fuldstændige kodende sekvens for human protein C på et ca. 1500 bp langt Eco Rl-fragment.

30

Tabel I

Oligonukleotid Sekvens DK 175574 B1 22 mut-1 3'CGA GGA G AA CTG AGT CAC AA5' mut-2 3CTG AAG CTC CTC CGG TTC CTT TAA5' mut-3 5'GGA GGA ATT CTG AGC3 5 primer-1 5 TTT G CG GAT CCG CAG3 primer-2 5CGA CGT GCT TGG ACC3'

Eksempel 3

10 Konstruktion af ekspressionsvektorer for protein C

Den protein C kodende indføjelse blev fjernet fra pMMC som et Eco Rl-fragment og blev indsat i en hensigtsmæssig pattedyrcelle-ekspressionsvektor. Et eksempel på en sådan vektor er pD7, som omfatter 15 SV40~forstærkeren og den sene hovedpromotor samt den tredelte leder fra adenovirus 2.

Plasmid pD7 fremstilles ud fra plasmid pDHFR-lll (Berkner og Sharp, NUC.

Acids. Res. 13: 841 -857, 1985). Pstl-genkendelsesstedet umiddelbart op-20 strøms DHFR-sekvensen i pDHFR-lll blev omdannet til et Bel I-genkendelsessted ved at fordøje 10 pg af plasmidet med 5 enheder af Pst I i 10 minutter ved 37°C i 100 pi buffer A (10 mM Tris pH 8, 10 mM MgCb, 6 mM NaCI, 7 mM β-MSH). DNA’et blev phenolekstraheret, EtOH-præcipiteret og resuspenderet i 40 μΙ buffer B (50 mM Tris pH 8, 7 mM MgCh, 7 mM β-25 MSH) indeholdende 10 mM dCTP og 16 enheder T^DNA-polymerase og blev inkuberet ved 12°C i 60 minutter. Efter EtOH-præcipitering blev DNA'et ligeret til 2,5 pg kinasebehandlet Bel l-linkere i 14 pi puffer C (10 mM Tris pH 8, 10 mM MgCI2, 1 mM DTT, 1,4 mM ATP) indeholdende 400 enheder T4-polynukleotidligase i 12 timer ved 12°C. Efter phenolekstraktion og EtOH-30 præcipitering blev DNA’et resuspenderet i 120 pi puffer D (75 mM KCI, 6 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCb, 1 mM DTT), fordøjet med 80 enheder Bel I i 60 minutter ved 50°C, og derefter underkastet elektroforese gennem agarose.

Form III plasmid DNA (10 pg) blev isoleret fra gelen og ligeret i 10 pi buffer C

DK 175574 B1 23 indeholdende 50 enheder T4 polynukleotidligase i 2 timer ved 12°C og anvendt til at transformere E.coli HB101. Positive kloner blev identificeret ved hurtig DNA-præparationsanalyse, og plasmid DNA (betegnet pDHFR’) fremstillet ud fra positive kolonier blev transformeret ind i dAM' E.coli.

5

Plasmid pD2’ blev derefter fremstillet ved at spalte pDHFR’ (15 pg) og pSV40 (omfattende Barn Hl-ford øjet SV40-DNA klonet i Barn Hl-genkendelsestedet i pML-1) (25 pg) i 100 pi puffer D med 25 enheder Bel I i 60 minutter ved 50°C efterfulgt af tilsætningen af 50 enheder Barn Hl og 10 yderligere inkubering ved 37°C i 60 minutter. DNA-fragmenter blev adskilt ved agarosegelelektroforese og det 4,9 kb lange pDHFR’-fragment og det 0,2 kb lange SV40-fragment blev isoleret. Disse fragmenter (200 ng pDHFR’-DNA og 100 ng SV40 DNA) blev inkuberet i 10 pi puffer C indeholdende 100 enheder T4-polynukleotidligase i 4 timer ved 12°C, og den fremkomne kon-15 struktion (pD2') blev anvendt til at transformere E.coli RR1.

Plasmid pD2’ blev modificeret ved at fjerne “gift”-sekvenserne i pBR322-området (Lusky og Botchan, Nature, 293: 79-81, 1981). Plasmider pD2’ (6,6 pg) og pML-1 (Lusky og Botchan, se ovenfor) (4 pg) blev inkuberet i 50 pi 20 puffer A med 10 enheder af hver af Eco RI og Nrul i 2 timer ved 37°C efterfulgt af agarosegelelektroforese. Det 1,7 kb lange pD2’-fragment og det 1,8 kb lange pML-1 fragment blev isoleret og ligeret sammen (50 ng af hver) i 20 pi puffer C indeholdende 100 enheder T4-polynukleotidligase i 2 timer ved 12°C efterfulgt af transformation i E.coli HB101. Kolonier indeholdende den 25 ønskede konstruktion (betegnet pD2) blev identificeret ved en hurtig præparationsanalyse. 10 pg pD2 blev derefter fordøjet med 20 enheder af hver af Eco RI og Bgt II i 50 pi puffer A i 2 timer ved 37°C. DNA’et blev underkastet elektroforese gennem agarose, og det ønskede 2,8 kb lange fragment (fragment C) omfattende pBR322, 3'-splejsningsstedet og poly-A-30 sekvenser blev isoleret.

For at frembringe de resterende fragmenter, som anvendes i konstruktionen af pD3, blev pDHFR-lll modificeret for at omdanne Sac II (Sst II) - DK 175574 B1 24 genkendelsesstedet til enten et Hind III- eller Kpn Igenkendelsessted. 10 pg pDHFR-lll blev fordøjet med 20 enheder Sst II i 2 timer ved 37°C, efterfulgt af phenolekstraktion og ethanolpræcipitering. Resuspenderet DNA blev inkuberet i 100 pi puffer B indeholdende 10 mM dCTP og 16 enheder T4-5 DNA-polymerase i 60 minutter ved 12°C, phenolekstraheret, dialyseret og ethanolpræcipiteret. DNA (5 pg) blev ligeret med 50 ng kinasebehandlede Hind lll-eller Kpn l-linkere i 20 pi puffer C indeholdende 400 enheder T4-DNA-ligase i 10 timer ved 12°C, phenolekstraheret og ethanolpræcipiteret. Efter resuspension i 50 pi puffer A blev de fremkomne plasmider fordøjet med 50 10 enheder Hind III eller Kpn I, afhængig af den anvendte linker, og blev underkastet elektroforese gennem agarose. Gelisoleret DNA (250 ng) blev ligeret i 30 pi puffer C indeholdende 400 enheder T4-DNA-ligase i 4 timer ved 12°C og anvendt til at transformere E.coli RRI. De fremkomne plasmider blev betegnet pDHFR-lll (Kind-lli) og pDHFR-lll (Kpn-I). Et 700 bp langt Kpn I -Bgl 15 11-fragment (fragment A) blev derefter oprenset fra pDHFR-lll (Kpn I) ved fordøjelse med Bgl II og Kpn I efterfulgt af agarosegelelektroforese.

SV40-forstærkersekvensen blev indsat i pDHFR-lll (Hind III) på følgende måde: 50 pg SV40-DNA blev inkuberet i 120 pi puffer A med 50 enheder 20 Hind III i 2 timer ved 37°C, og Hind III C SV40 fragmentet (5089-968 bp) blev geloprenset. Plasmid pDHFR-lll (Hind III) (10 pg) blev behandlet med 250 ng kalvetarmphosphatase i 1 time ved 37°C, blev phenolekstraheret og ethanolpræcipiteret. Det lineariserede plasmid (50 ng) blev ligeret med 250 ng Hind III C SV40 i 16 pi puffer C i 3 timer ved 12°C under anvendelse af 200 enhe-25 der T4-polynukleotidligase og transformeret i E.coli HB101. Et 700 basepar langt Eco RI - Kpn l-fragment (fragment B) blev derefter isoleret fra dette plasmid.

Til den endelige konstruktion af pD3 blev fragmenter A og B (50 ng af hver) 30 ligeret med 10 ng fragment C med 200 enheder T4-poly-nukieotidligase i 4 timer ved 12°C, efterfulgt af transficering af E.coli RRI. Positive kloner blev påvist ved hurtig præparationsanalyse, og pD3 blev fremstillet ved præparation i stor skala.

DK 175574 B1 25

Plasmid pD3 blev modificeret til at acceptere indførelsen af protein C-sekvensen ved at omdanne Bel l-indføjelsesstedet ti! et Eco Rl-sted. Det er nødvendigt først at fjerne det Eco Rl-genkendelsessted, som er til stede i 5 pD3 ved den ende, der er længst til venstre i adenovirus 5 sekvenserne med kortenheden 0-1 ved at omdanne det til et Barn Hl-genkendelsessted ved hjælp af traditionelle procedurer under anvendelse af linkere. I korthed blev plasmidet fordøjet med Eco RI, og det lineariserede DNA blev behandlet med T4-DNA-polymerase og alle fire deoxynukieotidtriphosphater til frembringelse 10 af stumpe ender. Plasmidet blev derefter ligeret til octonukleotider omfattende Barn Hl-restriktionsstedet, DNA’et blev fordøjet med BamHI til fjernelse af overskydende linkere, og fragmentet omfattende patte-dyrcelleekspressionssekvenserne blev klonet i Barn Hl-genkendelsesstedet i pML-1. Det fremkomne plasmid blev transformeret i E.coli H6101, og plasmid 15 DNA blev fremstillet og screenet for den korrekte omdannelse. På lignende måde omdannes Bel l-genkendelsesstedet til et Eco Rl-genkendelsessted under anvendelse af passende octonukleotidlinkere. Den fremkomne vektor er kendt som pD7. Det 1,5 kb lange protein C Eco Rl-fragment fra pMMC indsættes derefter i Eco Rl-genkendelsesstedet i pD7 til frembringelse af ek-20 spressionsvektoren pD7C (figur 10).

En vektor, som muliggør ekspression af protein C-sekvensen for et polycis-tronisk budskab, blev konstrueret ved at anvende pD5, et plasmid, som ligner pD3, og som indeholder et DHFR-kodende område, der mangler det meste 25 af det ikke-kodende 5'-område. DHFRsekvensen blev yderligere modificeret ved at reducere dets bindingsaffinitet til methotrexat.

Vektoren pD5 blev konstrueret ved en metode, som er analog med den metode, der er beskrevet for pD3, og adskiller sig kun fra pD3 ved, at et Barn Hl-30 genkendelsessted er det sted, hvor heterologe OMA’er indføres, og at det Bel I - Barn Hl SV40-fragment, som indeholder SV40-polyadenyleringssignalet, er i den sene orientering.

DK 175574 B1 26 DHFR-sekvensen blev modificeret ved først at fordøje pDHFR-lll med Pst I og Sst I og isolere det 400 bp lange DHFR-fragment. Dette blev subklonet i en M13-fagvektor og mutageniseret som beskrevet af Simonsen og Levinson (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2495-2499, 1983). Mutageniseringen re-5 suiterede i et enkelt baseparskift i DHFR-sekvensen. Det ændrede fragment genindsattes derefter i pDHFR-lll til frembringelse af plasmidet PDHFR III.

Det ikke-kodende 5’-område af DHFR-sekvensen fjernedes derefter. Plasmid PDHFRrHI blev derefter spaltet med Fnu 4H1, som skærer plasmidet på ca.

10 20 steder. Det blev derefter behandlet med T4-DNA-polymerase og alle fire deoxynukleotidtriphosphater til frembringelse at stumpe ender. Barn Hl-linkere ligeres til enderne, og blandingen blev fordøjet med Barn Hl og Ncol.

Et 0,6 kb langt Bam Hl -Ncol-fragment omfattende DH FRr-cDNAIet blev isoleret. Plasmid pDHFR-lll blev fordøjet med Nco I og Bam Hl, og det 0,2 kb 15 lange fragment indeholdende SV40-polyadenyteringssignalet blev isoleret. Polyadenyleringssignalet, i den tidlige orientering, blev derefter ligeret til DHFRr-fragmentet. Efter fordøjelse med BamHI blev det fremkomne Bam Hl-fragment derefter indsat i Bam Hl-genkendelsesstedet i pD5, og ligeringsblandingen blev anvendt til at transformere E.coli HB101. Plasmid DNA blev 20 fremstillet og screenet ved restriktionsendonukleasefordøjelse. Et plasmid med DHFRr-indføjelsen i den korrekte orientering til transkription fra den sene Ad2-hovedpromoter blev betegnet pD5(DH FRr).

For at udtrykke protein C under anvendelse af plasmid PD5(DHFRr) blev 25 pMMC fordøjet med Eco RI, og det 1,5 kb lange protein C fragment blev isoleret. Eco Rl-enderne blev omdannet til Bel l-ender ved at anvende linkere. Plasmid PD5(DHFRr) blev delvis fordøjet med Bam Hl til spaltning af dette ved 5’-enden af DHFRr-sekvensen og blev ligeret til protein C-fragmentet. Plasmid-DNA blev screenet for den korrekte orientering og indsættelse af 30 protein C-fragmentet. Den fremkomne vektor, betegnet pD5(PC-DHFRr), er vist på figur 11.

Eksempel 4 DK 175574 B1 27

Ekspression af protein C i transficerede pattedvrceller

Babyhamsternyreceller (BHK-celler) (American Type Culture Collection de-5 poneringsnummer CCL10) blev transficeret med pD7C stort set som beskrevet (Wigler et al., Cell 14: 725, 1978; Corsaro og Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603, 1981; og Graham og van der Eb, Virology 52: 456, 1973). Cellerne blev dyrket ved 37°C, 5% CO2 i Dulbecco’s medium (plus 10% var-meinaktiveret føtal kalveserum og suppleret med glutamin og penicillin-10 streptomycin) i 60 mm vævsdyrknings-Petriskåle til en 20% sammenløbning.

Ialt 10 pg DNA blev anvendt til at transficere en 60 mm skål: 3,75 pg pD7C, 1,25 pg pKO-neo (Southern og Berg, J.Mol.Appt.Genet, 1: 327-341,1982) og 5 pg laksesperm-DNA. DNA’erne blev præcipiteret i 0,3 M NaOAc, 75% ethanol, blev skyllet med 70% ethanol og genopløst i 20 pi 10 mM Tris-HCI 15 pH 8, i mM EDTA. DNA’et blev blandet med 440 pi H20 og 500 pi 280 mM NaCI, 1,5 mM NaHP04, 12 mM dextrose, 50 mM HEPES pH 7,12. 60 pi 250 mM CaCl2 blev dråbevis tilsat til ovennævnte blanding, og opløsningen fik lov til at henstå ved stuetemperatur i 30 minutter. Opløsningen blev derefter tilsat til cellerne, og cellerne blev igen inkuberet ved 37°C i 4 timer. Mediet blev 20 fjernet, og 5 ml 20% DMSO i Dulbecco’s medium med serum blev tilsat i 2 minutter ved stuetemperatur. Skålen blev derefter vasket hurtigt med 2 skift af medier og inkuberet i frisk medium natten over. 24 timer efter tilsætningen af DNA’et blev mediet fjernet, og der blev tilsat selektivt medium (10 mg/ml G418, 498 u/mg, Gibco, i Dulbecco’s medium med serum). Efter 10-13 dage 25 blev individuelle kloner, som repræsenterede celler, der havde inkorporeret pKO-neo-genet og således er resistente over for G418, overført til plader med 96 brønde og dyrket til protein-analyse i Dulbecco’s medium plus 10% føtal kalveserum.

30 For at analysere for protein C blev mediet adskilt fra cellerne og cellerester ved centrifugering, og det blev analyseret for protein C polypeptid og biologisk aktivitet. Cellerne blev fjernet fra pladerne med trypsin, vasket med frisk medium, centrifugeret og frosset ved -20°C. Til analyse blev cellepelleterne DK 175574 B1 28 optøet i PBS, bundfældet og resuspenderet i PBS indeholdende 0,25% Triton X-100. Prøverne blev fortyndet og analyseret for polypeptid og aktivitet.

ELISA for protein C udførtes på følgende måde: 200 pi antistof (monoklonalt 5 eller polyklonalt) mod human protein C (5 pl/ml i 0,1 M Na2C03 pH 9,6) blev inkuberet i hver brønd i en mikrotiterplade med 96 brønde i 2 timer ved 37°C. Brøndene blev derefter inkuberet med 220 pi 1% bovin serumalbumin (BSA) og 0,05% Tween 20 i PBS pH 7,2 i 2 timer ved 37°C. Pladerne blev skyllet med H20, lufttørret og opbevaret ved 4°C. Til analyse af prøver blev 200 pi 10 prøver inkuberet i time ved stuetemperatur i antistofbelagte brønde. Brøndene blev derefter skyllet 4 gange med 200 pi PBS indeholdende 0,05 % Tween 20. Brøndene blev derefter inkuberet i i time ved stuetemperatur med 200 pi af en IgG-fragtion af polyklonalt kaninantiserum mod protein C (5 pg/ml i PBS indeholdende 1% BSA og 0,05% Tween 20). Dette blev efter-15 fulgt af inkubering med gede-antistof mod kanin-lgG koblet til alkalisk phosphatase. Brøndene blev derefter skyllet 4 gange med PBS indeholdende 0,05% Tween 20. Til brøndene tilsattes 200 pi p-nitrophenylphosphat (30 mg) opløst i diethanolaminpuffer (96 ml per liter) pH 9,8 indeholdende 56 mg/l MgCb. Enzymreaktionen udførtes ved 37°C, og udviklingen af en gul 20 farve blev målt ved 405 nm under anvendelse af en ELISA-pladeaflæser.

Biologisk aktivitet af protein C blev målt ved dens evne til at forlænge kaolin-cephalin-størkningstiden af plasma efter aktivering med thrombin som beskrevet af Ktsiel og Davie (Meth.in Enzvmotoqy 80: 320-332, 1981).

25

Eksempel 5

Ekspression af et cDNA i fuld længde, som koder for protein C.

30 A. Isolering af cDNA. Et genomfragment indeholdende et exonområde svarende til aminosyrerne -42 til -19 af præpropeptidet (exon I i fig.4) af protein C blev isoleret, nick-translateret og anvendt som en probe til at screene et cDNA-bibliotek konstrueret ved metoden beskrevet af Gubier og Hoffman DK 175574 B1 29 (Gene 25: 263-269, 1983) under anvendelse af mRNA fra HEPG2-celler.

Denne cellelinie hidrørte fra human hepatocytter, og det var tidligere blevet vist, at den syntetiserede protein C (Fair og Bahnak, Blood 64: 194-204, 1984). 10 positive kloner indeholdende cDNA indføjet i Eco Rl-genkendelses-5 stedet i fag gtll blev isoleret og screenet med en oligonukleotidprobe svarende til det ikke-kodende 5’-område af protein C-genet. En klon var også positiv med denne probe og hele dens nukleotidsekvens blev bestemt. cDNA’et indeholdt 70 basepar af ikke-translateret 5’-sekvens, hele den kodende sekvens for human præproprotein C og hele det ikke-kodende 3’-10 område svarende til det andet potyadenyleringssted (fig.2).

B. Ekspressionsvektorkonstruktion

Ekspression af protein C-cDNA blev opnået i vektoren pDX. Denne vektor 15 hidrørte fra pD3 (beskrevet i eksempel 3 ovenfor) og p03’, en vektor identisk med pD3 med undtagelse af, at SV40-poly-adenyleringssignalet (dvs. fragmentet fra SV40 Bam HI til Bel I Barn Hl-genkendetsessted som det sted, hvor gen-indføjelse finder sted.

20 Til frembringelse af pDX blev Eco Rl-genkendelsesstedet i pD3’ omdannet til et Bel l-genkendelsessted ved Eco Rl-spaitning, inkubering med Si-nuklease og efterfølgende ligering med Bel l-linkere. DNA blev fremstillet ud fra en positivt identificeret koloni, og det 1,9 kb lange Xho I - Pst l-fragment indeholdende det ændrede restriktionssted blev fremstillet ved agarosegelelektro-25 forese. I en anden modifikation blev det Bel I spattede pD3 ligeret med kinasebehandlede Eco RI - Bel 1-adaptorer, (konstrueret ud fra oligonukleo-tider ZC525, 5’GGAATTCT3’; og ZC526, 5'GATCAGAATTCC3’) for at frembringe et Eco Rl-genkendelsessted, som stedet til indsættelse af et gen i ekspressionsvektoren. Positive kloner blev identificeret ved restriktions-30 endonukleaseanalyse, og DNA fra dette blev anvendt til at isolere et 2,3 kb langt Xho I - Pst l-fragment indeholdende det modificerede restriktionssted.

De to ovenfor beskrevne DNA-fragmenter blev inkuberet sammen med T4-DNA-ligase, transformeret i E.coli HB101, og positive kolonier blev identifi- 30 DK 175574 B1 æret ved restriktionsanalyse. En præparation af sådan DNA, kaldet pDX, blev derefter fremstillet. Dette plasmid indeholdt et unikt Eco R l-gen kendelsessted til indsættelse af fremmede gener.

5 Protein C-cDNA’et blev derefter indføjet i pDX som et Eco RI fragment. Re-kombinantplasmider blev screenet ved restriktionsanalyse til at identificere dem, der har protein C-indføjelsen i den korrekte orientering med hensyn til promoterelementerne, og plasmid-DNA {betegnet pDX/PC) blev fremstillet ud fra en korrekt klon (fig.12). Fordi cDNA-indføjelsen i pDX/PC indeholdt en 10 ATG-codon i det ikkekodende 5’-område (se figur 2), blev der udført dele-tionsmutagenisering på cDNA’et før forsøgene med transficering og ekspression. Fjernelse af de 3 basepar blev udført i overensstemmelse med standardprocedure for oligonukleotid styret mutagemsering. Den pDX-baserede vektor indeholdende det modificerede cDNA blev betegnet p594.

15 C. cDNA-ekspression COS-celler blev transficeret med plasmid p594 ved calcium-phosphatpræcipitering. 4 timer senere blev der tilsat frisk dyrkningsmedium 20 (suppleret med 5 pg/ml vitamin K). På passende tidspunkter (sædvanligvis 48 eller 72 timer) blev dyrkningsmediet høstet, og cellerne blev opsamlet og lyseret.

Protein C secerneret i dyrkningsmediet eller celleekstrakterne blev analyseret 25 ved ELISA under anvendelse af det samme affinitetsoprensede polyklonale antistof, som blev anvendt til den oprindelige identifikation af cDNA-klonerne. Analyseresultaterne (tabel 2) viste, at protein C blev syntetiseret i forsøgsprøverne og blev let secerneret fra de transficerede celler, idet ca. 90 % af protein C blev fundet i dyrkningsmediet.

For at vurdere gamma-carboxyleringsgraden af det rekombinerede protein blev prøver af dyrkningsmediet udsat for bariumcitratpræcipitering, en fremgangsmåde, som selektivt præcipiterer kun gamma-carboxylerede pro- 30 DK 175574 B1 31 teiner fra plasma (Bajaj et al., J.Biol.Chem. 256: 253-259, 1981). Over 70 % af det antigene materiale kunne præcipiteres med bariumcitrat.

Det rekombinerede protein C blev analyseret for antikoaguleringsaktivitet ved 5 at måle dets evne til at forlænge koagulering. Dialyserede medieprøver blev behandlet med Protac C (American Diagnostica) for at aktivere protein C. Prøverne blev derefter tilsat til et in vitro koaguleringsassay (Sugo et al., J.Biol.Chem. 260: 10453, 1985) og koaguleringstiden blev målt. Det rekombinerede materiales aktivitet viste sig at være stort set den samme som ak-10 tiviteten af naturligt forekommende protein C.

Tabel 2

Forbigående ekspression og secernering af protein C i COS-celler 15 ng ng

protein C protein C

Plasmid i medier celleekstrakt % secerneret

Ingen 0 0 NA

p594 165 20 89% 20

Af det ovennævnte vil det fremgå, at skønt specifikke udførelsesformer for opfindelsen er blevet beskrevet med det formål at illustrere opfindelsen, kan adskillige modifikationer foretages uden at afvige fra opfindelsens ånd og 25 rækkevidde. Opfindelsen er følgelig kun begrænset af de tilhørende krav.

Claims (8)

1. DNA-sekvens, der koder for et protein, der efter aktivering ved proteolytisk 5 bearbejdning i secerneringsbanen resulterer i et human aktiveret protein C, kendetegnet ved, at DNA-sekvensen ikke indeholder en sekvens, der koder for det 12 aminosyre lange aktiveringspeptid som vist i Fig. 2, og at det aktiverede protein G har en aminosyresekvens som vist i Fig. 2.

2. Rekombinant ekspressionsvektor, der omfatter en DNA-sekvens, som ko der for et protein, der efter aktivering ved proteolytsik bearbejdning i secerneringsbanen resulterer i et humant aktiveret protein C, kendetegn et ved, at DNA-sekvensen ikke indeholder en sekvens, der koder for det 12 aminosyre lange aktiveringspeptid vist i Fig. 2, og at det aktiverede protein C 15 har en aminosyresekvens som vist i Fig. 2.

3. Ekspressionsvektor, der er i stand til at integrere med pattedyrsværtscelle-DNA, kendetegnet ved, at ekspressionsvektoren indeholder en promoter efterfulgt nedenstrøms af en nukleotidsekvens ifølge krav 2, og at nuk- 20 leotidsekvensen nedenstrøms efterfølges af et polyadenyleringssignal, hvori transskriptionen af nukleotidsekvensen styres af promotoren.

4. Fremgangsmåde til fremstilling af human aktiveret protein C, der omfatter: - indføring i en pattedyrsværtscelle af en ekspressionsenhed omfat- 25 tende en sekvens ifølge krav 1, der koder for et protein, som efter ak tivering ved intracellulær proteolytisk bearbejdning resulterer i et humant aktiveret protein C, - dyrkning af nævnte pattedyrsværtscelle i et egnet medium, der indeholder vitamin K, og 30. isolering af proteinproduktet, som ekspressionsenheden koder for og som produceres af pattedyrsværtsceilen. DK 175574 B1

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, der yderligere omfatter indføring af en se-lekterbar markør i værtscellen med ekspressionsenheden.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 4, ifølge hvilken ekspressionsenheden er in-5 deholdt på en ekspressionsvektor, der er i stand til at integrere i et pattedyrs- værtscelle-DNA, kendetegnet ved, at ekspressionsvektoren indeholder en promoter, efterfulgt nedenstrøms af en nukleotidsekvens, der koder for human aktiveret protein C, og at nukleotidsekvensen nedenstrøms efterfølges af et polyadenyleringssignal, hvori transkription af nukleotidsekvensen 10 styres af promotoren.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at pattedyrsværtscellen er en babyhamsternyrecelle eller en COS celle.

8. Pattedyrsværtscelle, der er transficeret med en ekspressionsvektor ifølge krav 2 eller krav 3 til ekspression af human aktiveret protein C.