JP2774163B2

JP2774163B2 - ヒトプロテインｃ様活性を有する蛋白

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Publication number: JP2774163B2
Application number: JP1293885A
Authority: JP
Inventors: 雅彦鈴木; 健司若林; 芳彦鷲見; 弥太郎市川
Original assignee: Teijin Ltd
Current assignee: Teijin Ltd
Priority date: 1989-11-14
Filing date: 1989-11-14
Publication date: 1998-07-09
Anticipated expiration: 2013-07-09
Also published as: JPH03155782A; WO1991007484A1

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は、ヒトプロテインＣ様活性を有する蛋白に関
するものである。さらに詳しくは抗凝固剤または線溶促
進剤として使用し得るヒトプロテインＣ様活性を有する
蛋白に関するものである。

ここで、本明細書において、アミノ酸配列はIUPAC−I
UB生化学委員会（CBN）で採用された方法により略記す
るものとし、たとえば下記の略号を用いる。

Ala Ｌ−アラニン Arg Ｌ−アルギニン Asn Ｌ−アスパラギン Asp Ｌ−アスパラギン酸 Cys Ｌ−システイン Gln Ｌ−グルタミン Glu Ｌ−グルタミン酸 Gly グリシン His Ｌ−ヒスチジン Ile Ｌ−イソロイシン Leu Ｌ−ロイシン Lys Ｌ−リジン Met Ｌ−メチオニン Phe Ｌ−フェニルアラニン Pro Ｌ−プロリン Ser Ｌ−セリン Thr Ｌ−スレオニン Trp Ｌ−トリプトファン Try Ｌ−チロシン Val Ｌ−バリンまた、DNAの配列はそれを構成する各デオキシリボヌ
クレオチドに含まれる塩基の種類で略記するものとし、
たとえば下記の略号を用いる。

Ａアデニン（デオキシアデニル酸を示す。）Ｃシトシン（デオキシシチジル酸を示す。）Ｇグアニン（デオキシグアニル酸を示す。）Ｔチミン（デオキシチミジル酸を示す。）［従来技術］プロテインＣは血漿セリンプロテアーゼ前駆体の一種
であって、血小板や血管内皮細胞の表面で、トロンビン
とそのレセプターであるトロンボモジュリンとの複合体
による限定分解を受けて活性化され、セリンプロテアー
ゼである活性化プロテインＣ（以下APC）という）に変
換される、APCは血液凝固系の活性化第５因子および活
性化第８因子を選択的に分解することによって抗凝固活
性を発揮する。この活性はプロテインＳによって増強さ
れることが知られている。また、APCは組織プラスミノ
ーゲンアクチベータの阻害剤であるPAI−１を切断する
ことにより、線溶促進活性をもつと考えられている。

ヒトプロテインＣのアミノ酸配列については既に、Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA,82,4673−4677（1985）等で明ら
かなように、Glaドメインおよびエピダーマルグロース
ファクター（EGF）様ドメインをアミノ末端側に有する
軽鎖（分子量約21,000）と活性化ペプチドおよび触媒ド
メインからなる重鎖（分子量約41,000）とがジスルフィ
ド結合したもの（２本鎖型）である。

具体的にはヒトプロテインＣは図１に示すように軽鎖
は、アミノ末端Alaからカルボキシル末端のLeuまで155
個のアミノ酸からなり、重鎖はアミノ末端のAspからカ
ルボキシル末端のProまで262個のアミノ酸からなってお
り、軽鎖と重鎖は細胞中で（H₂N−）軽鎖−Lys−Arg−
重鎖（−COOH）の形で生合成され、細胞から分泌される
過程でLys−Argが切断され、２本鎖化される。軽鎖と重
鎖とは、軽鎖のアミノ末端から141番目のCysと重鎖のア
ミノ末端から120番目のCysとの間でＳ−Ｓ結合で結合し
ている。

ヒトプロテインＣからAPCへの変換は、ヒトプロテイ
ンＣの重鎖のアミノ末端（以下、Ｎ末という）から12番
目のアミノ酸から重鎖のＮ末のアミノ酸までの活性化ポ
リペプチドが除去されることによって行われる。従っ
て、APCのアミノ酸配列はヒトプロテインＣのアミノ酸
配列において、ヒトプロテインＣのアミノ酸配列から、
重鎖のＮ末から12番目のアミノ酸から重鎖のＮ末のアミ
ノ酸までのすべてを除いたものである。

軽鎖については、アミノ末端側の構造はGlaドメイン
およびEGF様ドメインが存在しているので重要である
が、そのカルボキシル末端側、特に重鎖と結合している
141番目のCys以降カルボキシル末端側のアミノ酸の活性
に及ぼす影響等に関して明らかではない。

［発明の目的］そこで本発明者らは蛋白質工学の技術を用いてヒトプ
ロテインＣのアミノ酸配列の改変を行い、軽鎖のカルボ
キシル末端を順次欠いたヒトプロテインＣまたは活性化
ヒトプロテインＣ様蛋白を得ることができ、本発明に到
達した。

［発明の構成］すなわち本発明は、基本的に天然型のヒトプロテイン
Ｃの構造を有する蛋白であり、該蛋白の軽鎖におけるア
ミノ末端から141番目〜カルボキシル末端のアミノ酸配
列が、次の（１）〜（７）のいずれかのアミノ酸配列で
あることを特徴とする、ヒトプロテインＣ様活性を有す
る蛋白に関するものである。

（１） Cys−Gly−Arg−Pro−Trp−Lys−Arg （２） Cys−Gly−Arg−Pro−Trp−Lys （３） Cys−Gly−Arg−Pro−Trp （４） Cys−Gly−Arg−Pro （５） Cys−Gly−Arg （６） Cys−Gly （７） Cys 本発明の種々のアミノ酸配列を有する蛋白は、それぞ
れ天然型ヒトプロテインと同様の性質、活性を有してい
る。

ここで天然型ヒトプロテインＣと同様の性質として
は、例えば、本発明で得られた蛋白をプロテインＣ活性
化酵素で処理することにより、抗凝固活性、線溶促進活
性、アミダーゼ活性等を有するようになること等が挙げ
られる。

すなわち、本発明で得られた天然型ヒトプロテインＣ
と同様の性質を有している蛋白は、天然型ヒトプロテイ
ンＣと同じくプロテインＣ活性化酵素で処理することに
より天然型APC様蛋白に変換される。ここでプロテイン
Ｃ活性化酵素としては、トロンビン、トロンビン−トロ
ンボモジュリン複合体、蛇毒等が挙げられる。また重鎖
アミノ末端に存在する12アミノ酸からなるアクティベー
ションペプチドをあらかじめ欠失させておくことによ
り、直接活性化ヒトプロテインＣと同様の性質、活性を
有した蛋白を発現させることもまた可能である。

また、APC活性としては、前述したとおり、凝固系の
活性化第５因子および活性化第８因子を選択的に分解す
る抗凝固活性、並びに組成プラスミノーゲンアクチベー
ターの阻害剤であるPAI−１と反応してPAI−１を失活さ
せることに起因する線溶促進活性等が挙げられる。

本発明において、本発明の蛋白をコードするDNA配列
とは、それを含有するプラスミドを宿主に導入し、培養
せしめたときに、本発明の性質を有する蛋白が結果的に
発現されるDNA配列であればよく、その中間に構造遺伝
子以外の他の遺伝子（例えばイントロン）が介在してい
てもよい。

本発明の蛋白をコードするDNA断片は、宿主ベクター
系に応じて適当の選ばれた発現用ベクターに組み込まれ
る。そのような発現ベクターの具体例としては、アデノ
ウイルスMLP主要後期プロモーター、SV40初期プロモー
ター、SV40後期プローモーター、マウスメタロチオネイ
ン１・プロモーター、MMTV（マウス乳頭腫ウイルスのプ
ロモーター）、RSV（ラウス肉腫ウイルスプロモータ
ー）等を有するプラスミドベクターあるいはBovineパピ
ローマウイルス等のウイルス由来のベクター等が用いら
れる。

前記DNA断片のかかるベクターへの組み込みはそれ自
体既知の方法で行うことができ、例えばMiura O.et a
l.,J.Clin.Invest.83,1598−1604（1989）等の文献に記
載の方法によって行うことができる。

一方、宿主用の動物細胞としてはヒトまたはヒト以外
の動物細胞のいずれであってもよく、例えばCHO,C127,B
HK,Cos1,Cos7,LM,NIH3T3,293,HeLa等があげられ、中で
もCHO,BHK,293が好ましい。

上記発現型ベクターのこれら細胞へのトランスフェク
ションも、また当該分野でよく知られたそれ自体公知の
方法によって行うことができ、例えばSpandidos D.A.an
d Wilkie N.M.,Expression of Exogenous DNA in Mamma
lian Cells,Ed.Hames B.D.and Higgins S.J.Transcript
ion and Translation,IRL Press,Oxford,pp1−48等の文
献記載の方法によって行うことができる。

かくして得られる形質転換細胞は、それぞれの細胞に
適合した条件下に常法で培養し、その培養液から目的と
する本発明の蛋白を回収することができる。

本発明の蛋白の定量法は特開昭61−283868号公報によ
って示された方法を用いることができる。この方法によ
れば、GlaをもつヒトプロテインＣおよび／または活性
化ヒトプロテインＣ様活性を有する蛋白（以下、ヒトプ
ロテインＣ誘導体という）のみを測定することもでき
る。

本発明のヒトプロテインＣ誘導体の精製には、バリウ
ム吸着法、イオン交換クロマトグラフィー法を含む天然
型ヒトプロテインＣの精製法を応用することができる
が、カルシウムイオンによるGlaドメインのコンホメー
ション変化を認識する抗ヒトプロテインＣモノクローナ
ル抗体を使用したアフィニティカラムクロマトグラフィ
ーを用いるのが特に好ましい（特開昭64−85091号公報
参照）。この方法は、Glaを有するヒトプロテインＣ誘
導体のみを精製できる点と、EDTAという温和な溶離剤が
使える点で優れた方法である。

本発明のヒトプロテインＣ誘導体の活性は、あらかじ
め蛇毒（プロタック、アメリカンダイアグノスチカ社
製）で活性化して合成基質（PCa、アメリカンダイアグ
ノスチカ社製）の切断活性で調べた。本発明のヒトプロ
テインＣ誘導体は触媒ドメインについては天然型と同一
であるので、合成基質切断活性をもって、本来の活性で
ある抗凝固活性、線溶促進活性を表わすことができる。

［実施例］本発明の実施例では、次の方法を用いた。

DNAの切断１μｇのプラスミドDNAまたはM13ファージのレプリカ
ティブ・フォーム（RF）DNAまたDNA切断の切断は、10μ
の緩衝液中、４〜10単位の制限酵素を用い、メーカー
により指定された温度で２時間保つことにより行った。
緩衝液は、制限酵素に付属のものを用いた。

DNA断片のアガロースゲルからの回収制限酵素で切断したDNA断片は、サブマリン型電気泳
動槽を用いた0.8％アガロースゲル電気泳動で分離し
た。目的のDNA断片を含むアガロースゲルを切り出し、G
ENECLEAN（Bio 101社）を用いて回収した。方法は添付
の説明書に従った。

DNA断片の結合 DNAライゲーションキット（宝酒造）を用いて行っ
た。方法は、添付の説明書に従った。

大腸菌の形質転換大腸菌HB101株のコンピテントセル（宝酒造）に、20
μ以下のDAN溶液を加え、１時間氷上に置いた。次に4
2℃の水浴に１分間つけたあと、再び氷上に５分間置い
た。これを1mlのＬ−ブロスに加え、１時間振盪培養し
た後、その一部（50〜300μ）を、アンピシリンプレ
ート（Ｌ−ブロス、寒天15g/、アンピシリン50μg/m
l）にまいて一晩37℃で培養し、コロニーを作らせた。

プラスミドDNAの小スケール調製アルカリ溶菌法（『Molecular Cloning』（T.Maniati
s,Cold Spring Harbor Laboratory,1982）P368参照）に
よる調製を行った。必要に応じて前述の『GENECLEAN』
による精製を行った。

プラスミドDNAの大スケール調製アルカリ溶菌法（『Transcription and Translatio
n』（B.D.Hames,IRL press,1984）P8参照）およびCsCl
平衡密度勾配遠心法によって行った。ここで、超遠心用
ローターは日立製RP−67VFバーチカルローターを用い
た。またCsClの除去は透析によらず、TE（10mM Tris−H
Cl pH8.0,1mM EDTA）で４倍で稀釈後、エタノール沈澱
をすることで代えた。

DNAの塩基配列の決定ダイデオキシ・チェーン・ターミネーション（dideox
y chain termination）法を用いた。反応に用いた試薬
は宝酒造の『７−deaza・シークエンスキット』のもの
を使用した。操作手順はそれに添付された説明書に従っ
た。ラベルには³⁵s−dCTPαＳ（400Ci/mmol,アマシャム
社）を用いた。電気泳動は６％アクリルアミドの0.3mm
厚のゲルを使用し、泳動後乾燥してからオートラジオグ
ラフィーにかけた。用いたテンペレートDNAは、ヒトプ
ロテインC cDNAの改変操作後は一本鎖DNAを用いたが、
それ以外では２本鎖のプラスミドをアルカリ変性後、中
和したものを用いた。その際の手順は『ベクターDNA』
（榊佳之、講談社、1986）P67に記載の方法によった。
またプライマーは、調べたい部分の近傍の配列18塩基分
を化学合成し、それを精製して用いた。

DNA断片の化学合成およびその精製 DNA断片は、アプライド・バイオシステムズ社製380A
型DNA合成装置で合成する。その精製は同社製「オリゴ
ヌクレオチド精製カートリッジ」に添付の説明書に従っ
て行うことができる。

実施例ヒトプロテインＣ誘導体発現ベクターpDX−PCLCΔ14,
pDX−PCLCΔ12,pDX−PCLCΔ８の作製ヒトプロテンＣ軽鎖カルボキシル末端を欠失させた蛋
白の発現ベクターpDX−PCLCΔ14,pDX−PCLCΔ12,pDX−P
CLCΔ８は図２に示す方法に従って作製した。

まず合成DNA Ａおよび合成DNA Ｂとして下記の合成
DNAを用いた。

［pDX−PCLCΔ14作製の場合］合成DNA Ａとして下記の合成DNA PCL1Aを用いた。

合成DNA Ｂとして下記の合成DNA PCL1Bを用いた。

［pDX−PCLCΔ12作製の場合］合成DNA Ａとして下記の合成DNA PCL2Aを用いた。

合成DNA Ｂとして下記の合成DNA PCL2Bを用いた。

［pDX−PCLCΔ８作製の場合］合成DNA Ａとして下記のDNA PCL3Aを用いた。

合成DNA Ｂとして下記のDNA PCL3Bを用いた。

合成DNA Ａを２μｇ含む溶液20μと合成DNA Ｂを
２μｇ含む溶液20μとを混合し、10Xキナーゼ溶液
（0.5M Tris−HCl pH7.6,0.1M MgCl₂,50mMジチオスレイ
トール（Dithio−threitol）、1mMスペルミジン、1mM E
DTA）10μと、蒸留水48μを加えT4ポリヌクレオチ
ドキナーゼ（ベーリンガーマンハイム製）２μ（20単
位）を加えて37℃で30分間インキュベートした。その
後、反応液を90℃に加熱し、室温まで徐々に冷却して、
２本の合成DNAをアニールさせた。この液に3M酢酸カリ
ウム溶液を10μ加え、さらにエタノール250μを加
え−70℃で20分冷却後15,000回転／毎分で遠心し、DNA
をエタノール沈殿させた。約800μのエタノールで沈
殿をリンスした後、50μの10mM Tris−HCl pH7.6,1mM
EDTA溶液に溶解した。

一方、天然型のヒトプロテインＣ発現ベクターpDX−P
C594 10μｇを制限酵素Hind IIIとSac IIとで完全消化
し、0.8％アガロースゲル電気泳動をおこない、最も大
きなDNAフラグメント１をゲルから回収した。このDNAフ
ラグメント１の３μｇを30μの10mM Tris−HCl pH7.6
EDTA溶液に溶解した。

別にpDX−PC594 10μｇを制限酵素Hind IIIとPst Iと
で完全消化し、0.8％アガロースゲル電気泳動をおこな
い、２番目に小さなDNAフラグメント２をゲルから回収
した。このDNAフラグメント２の１μｇを30μの10mM
Tris−HCl pH7.6,1mM EDTA溶液に溶解した。

次に合成DNA Ａと合成DNA Ｂとをアニールさせた溶
液１μと、フラグメント１の溶液１μと、フラグメ
ント２の溶液１μとを混合し、宝酒造製ライゲーショ
ンキットのＡ液18μおよびＢ液３μを加え16℃で45
分反応させた。反応液５μを、宝酒造製HB101コンピ
テントセル液100μに加え、42℃で１分間加温した後3
00μのＬ−Brothを加え30分間37℃でインキュベート
した後100μg/mlのアンピシリンを含んだ1.5％アガープ
レートにまいて37℃で12時間培養してトランスフォーム
された大腸菌クローンを得た。このクローンからプラス
ミドDNAを小スケール調製し、得られたプラスミドの制
限酵素マップを作製して、各々pDX−PCLCΔ14,pDX−PCL
CΔ12,pDX−PCLCΔ８に相当するヒトプロテインＣ誘導
体発現ベクターを得た。

なお得られた発現ベクターは大スケール調製し、発現
に用いた。

なお、pDX/PCベクターについては、Foster,D.C.et a
l.,Biochemistry 26,7003−7011（1987）に記載されて
おり、さらに、Busby,S.et al.,Nature 316,271−273
（1985）、およびBarkner,K.L.et al.,Nuc.Acids Res.1
3,841,857（1985）にpDX/PCを構成するDNA機能部分に関
して述べられている。

ここでAmp^rはアンピシリン耐性遺伝子である。

全体の構造については第３図を参照。

実施例２ヒトプロテンインＣ誘導体の発現 BHK−21細胞（ATCC CCL−10）をファルコン3025シャ
ーレを用い、30mlの10％FCS−eRDF中で培養した。ほぼ
コンフルエントになったシャーレ５枚分の細胞をトリプ
シン処理ではがし、PBS（−）30mlの中に懸濁したもの
を1000rpm室温で５分間遠心し、上清を除いた。再度30m
lのPBS（−）に懸濁し、1000rpm室温で５分間遠心し、
上清を除いたものを0.3mlのPBS（−）に懸濁した。一方
ヒトプロテインＣ誘導体発現ベクター32μｇはあらかじ
め1.5mlエッペンドルフチューブの中でエタノール沈澱
することにより滅菌しておき、15000rpm10分間遠心後、
無菌的に上清を除き、PBS（−）0.2mlに溶解した。これ
を上記のBHK細胞の懸濁液と合わせて（ほぼ0.8mlとな
る）バイオラッド社『GENE PULSER』用キュベット（0.8
ml）に入れ、軽く振盪して混和した。バイオラッド社
『GENE PULSER』を用い、1200V,25μF 1回の条件でエレ
クトロポレーションを行った。すみやかに細胞懸濁液を
ファルコン2059チューブに移し、4.2mlの10％FCS−eRDF
−２μg/mlビタミンK1を滴下しながらゆるやかに振盪
し、希釈した。これを30mlの10％FCS−eRDF−２μg/ml
ビタミンK1を入れたファルコン3025シャーレ５枚に1ml
づつ加え、希釈した。これをCO₂インキュベーターで24
時間培養後、30mlのPBS（−）で２回よく洗い、ITES−e
RDF−２μg/mlビタミンK1の無血清培地をシャーレ当り3
0ml加え、さらに48時間培養した。（ITES:9μg/mlイン
スリン、10μg/mlトランスフェリン、10μＭエタノール
アミン２×10^-8Mセレナイト、eRDF;極東製薬製）培養上清を回収し、アミコン社YM10メンブレンを用い
た限外過法により、150mlの培養上清を2ml程度まで濃
縮した。さらにアミコン社セントリコン10を用いて約18
0μになるまで濃縮を行った。これに1mlのTBS（50mM
Tris−HCl pH7.4,0.15M NaCl）を加え、再び約180μ
まで濃縮した。

培養上清および濃縮液６μを１％BSA−TBSで120μ
に希釈し、ELISA法でその中のヒトプロテインＣ誘導
体の濃度およびGlaをもつヒトプロテインＣ誘導体の濃
度を測定した。プレート側のモノクローナル抗体はJTC4
（重鎖認識）を用い、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HR
PO）標識抗体としてJTC1（Glaドメイン認識、Glaをもつ
ヒトプロテインＣ誘導体の測定用）またはJTC5（活性化
ペプチド認識、ヒトプロテインＣ誘導体全体の測定用）
を用いた。これらのモノクローナル抗体は『Journal of
Biological Chemistry』Wakabayashi,K.,261,11097（1
986）に記載のものである。培養上清中のヒトプロテイ
ンＣ誘導体の量を表２に、濃縮液中のヒトプロテイン誘
導体の量を表３に記した。

実施例３ヒトプロテインＣ誘導体の合成基質切断活性実施例２で得られたGlaをもつヒトプロテインＣ誘導
体のうちpDX−PCLCΔ８ベクターによる蛋白（PCΔ
８）、pDX−PCLCΔ12ベクターによる蛋白（PCΔ12）、
およびpDX−PCLCΔ14ベクターによる蛋白（PCΔ14）を
0.1％BSA−TBS（50mM Tris−HCl pH7.4,0.15M NaCl）で
希釈して12.5,25,50,100,200ng/50μの溶液とし、こ
れに1V/mlのProtac（アメリカンダイアグノスチカ
社）を40μ加え、37℃で1.5時間インキュベーション
した。

活性化後0.1％BSA−TBS（pH7.4）で希釈し、各々12.
5,25,50,100,200ng/50μとした。希釈後50μのサン
プルと20μのPCa（PAC活性測定用合成基質；アメリカ
ンダイアグノスティカ社製）−C,30μの0.1％BSA−TB
S（pH7.4）を加え、その直後と、37℃でインキュベート
し、10分後とに、405nmにおける吸光度（A₄₀₅）を測定
した。その結果を表４に示す。

実施例４ヒトプロテインＣ誘導体の抗凝固活性実施例２で得られたGlaをもつヒトプロテインＣ誘導
体のうちPCΔ8,PCΔ12,およびPCΔ14を0.1％BSA−TBS
（50mM Tris−HCl pH7.4,0.15M NaCl）で希釈して12.5,
25,50,100,200ng/50μの溶液とし、これに1Vmlのプロ
タック（アメリカンダイアグノスチカ社）40μ加え、
37℃で1.5時間保ち、活性化ヒトプロテインＣ誘導体と
した。これを希釈して、12.5,25,50,100,200ng/50μ
0.1％BSA−TBS（pH7.4）とした。37℃に２分間保った10
0μのシスメックス・コントロール血漿Ｉに、このサ
ンプルと、50μのシスメックスAPTT試薬を加えて攪拌
し、37℃に２分間保ったのち、100μの25mM CaCl₂を
加えて攪拌し、シメックスCA−100型血液凝固分析器でA
PTTを測定した。天然型の活性化ヒトプロテインＣと比
較した結果を表５に示す。

【図面の簡単な説明】

第１図は、天然のヒトプロテインＣのアミノ酸の一次構
造を示す。第２図は本発明のヒトプロテインＣおよび／
または活性型プロテインＣ様活性を有する蛋白の発現ベ
クターの製造方法を示す。第３図は発現ベクターの全体
的構造を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者市川弥太郎東京都日野市旭が丘４丁目３番２号帝人株式会社東京研究センター内 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 9/64 C12N 15/57 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】基本的に天然型のヒトプロテインＣの構造
を有する蛋白であり、該蛋白の軽鎖におけるアミノ末端
から141番目〜カルボキシル末端のアミノ酸配列が、次
の（１）〜（７）のいずれかのアミノ酸配列であること
を特徴とする、ヒトプロテインＣ様活性を有する蛋白。（１）Cys−Gly−Arg−Pro−Trp−Lys−Arg （２）Cys−Gly−Arg−Pro−Trp−Lys （３）Cys−Gly−Arg−Pro−Trp （４）Cys−Gly−Arg−Pro （５）Cys−Gly−Arg （６）Cys−Gly （７）Cys
【請求項２】請求項１記載の蛋白をコードするDNA。
【請求項３】請求項２に記載のDNA配列を有するヒトプ
ロテインＣ様活性を有する蛋白の発現ベクター。
【請求項４】請求項３に記載の発現ベクターによりトラ
ンスフェクトされている細胞。