JP2000508532A

JP2000508532A - プロリル―４―ヒドロキシラーゼのα２サブユニット、および該サブユニットをコードするプロリル―４―ヒドロキシラーゼ核酸配列およびその製造方法

Info

Publication number: JP2000508532A
Application number: JP9536215A
Authority: JP
Inventors: アイ．キヴィリッコ，カリ; エイ．ピーラジャニエミ，タイナ; アイ．ヘラアコスキー，タルジャ; ピー．アンヌネン，ピア; ケイ．ニッシ，リトヴァ; ケー．ノケライネン，ミンナ
Original assignee: ファイブローゲン，インコーポレーテッド
Priority date: 1996-04-10
Filing date: 1997-03-18
Publication date: 2000-07-11
Also published as: BR9708564A; KR20000005374A; AU727281B2; AU2333897A; US5928922A; CA2251757A1; EP0904399A4; US20020177203A1; EP0904399A1; IL126512A0; CN1221456A; WO1997038121A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、プロリル-4-ヒドロキシラーゼのαサブユニットの新規なイソ型、これら新規なタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列、およびこの種のタンパク質の生産方法に関するものである。

Description

【発明の詳細な説明】プロリル-4-ヒドロキシラーゼのα２サブユニット、および該サブユニットをコードするプロリル-4-ヒドロキシラーゼ核酸配列およびその製造方法１．序論本発明はプロリル-4-ヒドロキシラーゼの新規αサブユニット、その誘導体、プロリル-4-ヒドロキシラーゼの新規α２サブユニットをコードするポリヌクレオチド配列の同定および特性決定、並びにかかる新規ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用法および作製法に関する。また本発明は、本発明のプロリル-4 -ヒドロキシラーゼの新規ヒト・αサブユニットの使用を含んでなることを特徴とする、活性のある(1)プロリル-4-ヒドロキシラーゼまたはその誘導体および(2 )コラーゲンの組換え体の作製に関する。さらに詳細には、本発明は、「α２サブユニット」と称されるプロリル-4-ヒドロキシラーゼのαサブユニットの新規イソ型をコードするポリヌクレオチドおよびその誘導体、かかるイソ型または関連誘導体の作製法、並びに組換えコラーゲンの製造におけるこれらタンパク質およびポリヌクレオチドの使用に関する。２．背景コラーゲンに関する総合的な情報コラーゲン原繊維：プロテオグリカン凝集体および糖タンパク質は、それらの集合体として、圧迫ならびに間接結合の際に生じる張力および剪断力に耐える軟骨細胞外マトリックスの重要な構成要素である。HeinegardおよびOldberg（1989）FASEB J．3:2042-2051;MayneおよびBrewton ，Cartilage Degradation:Basic and Clinical Aspects（Woessner，J.F.および Howell，D.S.編）Marcel Dekker，Inc.，New York，pp.81-108(1993)。軟骨マトリックス遺伝子、もしくはこれら種々のマトリックス構成要素の生合成、組み立てまたはそれらの間の相互作用に影響を及ぼす酵素をコードする遺伝子における突然変異は、軟骨マトリックスの分解および正常な軟骨機能の喪失の一因であると考えられる。コラーゲンの生産におけるプロリル-4-ヒドロキシラーゼの役割：プロリル-4- ヒドロキシラーゼはあらゆるコラーゲンの合成において極めて重要な役割を果たす。具体的には、該酵素は、-Xaa-Pro-Bly-配列中のプロリン残基をヒドロキシル化することにより、コラーゲンおよび関連タンパク質中の4-ヒドロキシプロリンの形成を触媒する。これら4-ヒドロキシプロリン残基は、新たに合成されるコラーゲンポリペプチド鎖の三重らせん分子へのフォールディングに必須である。脊椎動物プロリル-4-ヒドロキシラーゼは、αサブユニットが触媒部位のほとんどの部分に寄与するα２β２四量体である。Kivirikkoら，(1989)FASEB J．3 ，1609-1617;Kivirikkoら，(1990)Ann．N.Y．Acad．Sci．580，132-142;Kivirik koら，(1992)，Post Translational Modifications of Proteins,編Harding，J. J.& Crabbe，M.J.C．(CRC，Boca Raton，FL)，pp.1-51を参照。βサブユニットは多くの供給源からクローニングされており(同上:さらに、NoivaおよびLennatz ，(1992)J．Biol．Chem．267:6447-49;Freedmanら，(1994)Trends Biochem．Sci ．19:331-336も参照)、酵素タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ(Pihlajaniemi ら，(1987)EMBO J．6:643-649;Kojvuら，(1987)J．Biol．Chem．262:6447-49)、細胞性甲状腺ホルモン結合タンパク質(Chengら，(1987)J．Biol．Chem．262:112 21-27)、ミクロソームトリアシルグリセロール転移タンパク質の小サブユニット (Wetterauら，(1990)J．Biol．Chem．265:9800-07)、および種々のペプチドと特殊に結合する小胞体内腔ポリペプチド(Freedman，前掲;Noivaら，(1991)J．Biol ．Chem．266:19645-649;Noivaら，(1993)J．Biol．Chem．268:19210-217)と同一である、極めてユニークな多機能性ポリペプチドであることが判明している。触媒として重要なαサブユニット（α１サブユニットと称する）は、ヒト(Hel aakoskiら，(1989)Proc．Natl．Acad．Sci．(USA)86:4392-96)、ニワトリ(Bassu kら，(1989)Proc．Natl．Acad．Sci．(USA)86:7382-886)、およびCaenorhab dit is elegans［Veijolaら，(1994)J．Biol．Chem．269:26746-753］からクローニングされており、そのＲＮＡ転写物は２つの連続する相同な71bpのエキソンによってコードされる配列を含む選択的スプライシングを受けることが示されている (Helaakoski，前掲;Helaakoskiら，(1994)J．Biol．Chem．269:27874-854)。α ２サブユニットと称される第二のαサブユニットがこれまでにマウスから得られている。Helaakoskiら，(1995)Proc．Natl．Acad．Scl．(USA)92:4427-4431。３．発明の概要本発明はプロリル-4-ヒドロキシラーゼのヒトαサブユニットのヒト・イソ型のクローニングおよび特性決定に関する。さらに詳細には、本発明は、α２サブユニットと称されるプロリル-4-ヒドロキシラーゼのαサブユニットのヒト・サブユニットのイソ型、およびそれらをコードするポリヌクレオチド配列に関する。また本明細書には、プロリル-4-ヒドロキシラーゼのα２サブユニット、プロリル-4-ヒドロキシラーゼおよびコラーゲンを生産する方法であって、該プロリル-4-ヒドロキシラーゼが本発明のα２サブユニットを含んでなり、かつ該コラーゲンがかかるプロリル-4-ヒドロキシラーゼによりその好ましい形態へとプロセッシングされることを特徴とする前記方法が記載される。本発明によれば、請求のプロリル-4-ヒドロキシラーゼのα２サブユニットのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の何れを用いても、ヒト・プロリル-4-ヒドロキシラーゼの発現を指示する組換え分子を作製することができる。さらに本発明は、プロリル-4-ヒドロキシラーゼのα２サブユニットのコード配列を使用して、適当な宿主細胞を形質転換するのに使用し得る発現ベクターを生産することに関する。次いで、本発明の宿主細胞を誘導してコード配列を発現させ、それによりプロリル-4-ヒドロキシラーゼのα２サブユニットを、もしくはさらに一般的にはプロリル-4-ヒドロキシラーゼのβサブユニットと組み合わせて生産する。４．詳説な説明本発明はプロリル-4-ヒドロキシラーゼのヒト・α２サブユニットおよびプロリル-4-ヒドロキシラーゼのこれらα２サブユニットおよびその誘導体をコードする核酸配列に関する。本発明により、請求のプロリル-4-ヒドロキシラーゼのヒト・α２サブユニットのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の何れを用いてもプロリル-4-ヒドロキシラーゼの発現を指示する組換え分子を作製することができる。プロリル-4-ヒドロキシラーゼのこれらα２サブユニットを使用および作製方法も本発明の範囲内にある。ａ．定義「プロリル-4-ヒドロキシラーゼのα２サブユニット」とは、単一の遺伝子によりコードされる場合のプロリル-4-ヒドロキシラーゼのαサブユニットのヒト・イソ型、並びに欠失誘導体、保存的置換体などを含む誘導体をいう。「活性ヒト・プロリル-4-ヒドロキシラーゼ」とは、プロリル-4-ヒドロキシラーゼα₂β₂四量体を含んでなるタンパク質複合体をいい、組換えにより作製されてもよい。「ストリンジェントな条件」とは、本明細書で用いる場合、(1)洗浄に低イオン強度および高温、例えば50℃にて0.015M NaCl／0.0015Mクエン酸ナトリウム／ 0.1%SDSを用いるか、(2)ハイブリダイゼーション中、ホルムアルデヒドのごとき変性剤、例えば42℃にて750mM NaCl、75mMクエン酸ナトリウムを含む0.1%ウシ血清アルブミン／0.1%フィコール／0.1%ポリビニルピロリドン／50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.5)を含む50%（容量／容量）ホルムアルデヒドを用いるか、もしくは(3)42℃にて50%ホルムアミド、5x SSC(0.75M NaCl，0.075Mクエン酸ナトリウム)、5xデンハート溶液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ(50g/ml)、0.1％SDS、および10%硫酸デキストランを用い、洗浄を42℃にて0.2ｘ SSCおよび0.1%SDS中で行うハイブリダイゼーション条件をいう。プロリル-4-ヒドロキシラーゼに関して用いる場合の「精製された」とは、示された分子が他の生物学的高分子（例えばポリヌクレオチド、タンパク質）の実質的不在下に存在することを示す。「精製された」とは、本明細書で用いる場合、好ましくは、存在する示された生物学的高分子は少なくとも95重量％、さらに好ましくは少なくとも99.8重量％であることを意昧する（しかし、水、緩衝液および他の低分子、特に1000ダルトンより小さい分子量を有する分子は存在してもよい）。「単離された」とは、本明細書で用いる場合、そのタンパク質の供給源に存在する他のタンパク質からだけではなく、他のタンパク質から分離されたタンパク質分子をいい、好ましくは（存在する場合には）溶媒、緩衝液、イオン、または同溶液に通常存在する他の成分のみの存在下で見出されるタンパク質をいう。「単離された」および「精製された」とは、それらの天然の供給源に存在するタンパク質を包含しない。ｂ．図面の簡単な説明図１は、マウス・プロリル-4-ヒドロキシラーゼのα(2)サブユニットに対するヌクレオチド（配列番号１）および推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄおよび２Ｅは、ｃＤＮＡクローンから誘導した場合のヒト・プロリル-4-ヒドロキシラーゼのα(2)サブユニットに対するヌクレオチド（配列番号３）および推定アミノ酸配列（配列番号４）を示す。図２Ａは特に、１〜378位の全てにおけるヌクレオチド（配列番号５）の同定結果を示し、さらに（矢印により示された）エキソン２、３および４のパラメーターを同定するものである。図２Ｂは特に、379〜864位の全てにおけるヌクレオチド（配列番号６）の同定結果を示し、さらに（矢印により示された）エキソン５および６のパラメーターを同定するものである。図２Ｃは特に、865〜1350位の全てにおけるヌクレオチド（配列番号７）の同定結果を示し、さらに（矢印により示された）エキソン７、８、９、１０および１１のパラメーターを同定するものである。図２Ｄは特に、1351〜1890位の全てにおけるヌクレオチド（配列番号８）の同定結果を示し、さらに（矢印により示された）エキソン１２、１３、１４、１５および１６のパラメーターを同定するものである。図２Ｅは特に、1891〜2207位の全てにおけるヌクレオチド（配列番号９）の同定結果を示す。図３は、（図２で同定された）エキソン２およびフランキングイントロン配列に対するヌクレオチド（配列番号１０）および推定アミノ酸配列（配列番号１１）を示す。図４は、（図２で同定された）エキソン３およびフランキングイントロン配列に対するヌクレオチド（配列番号１２）および推定アミノ酸配列（配列番号１３）を示す。図５は、（図２で同定された）エキソン４およびフランキングイントロン配列に対するヌクレオチド（配列番号１４）および推定アミノ酸配列（配列番号１５）を示す。図６は、（図２で同定された）エキソン５およびフランキングイントロン配列に対するヌクレオチド（配列番号１６）および推定アミノ酸配列（配列番号１７）を示す。図７は、（図２で同定された）エキソン６およびフランキングイントロン配列に対するヌクレオチド（配列番号１８）および推定アミノ酸配列（配列番号１９）を示す。図８Ａおよび８Ｂは、（図２で同定された）エキソン７およびフランキングイントロン配列に対するヌクレオチド（配列番号２０）および推定アミノ酸配列（配列番号２１）を示す。図８Ａは特に、1〜480位の全てにおけるヌクレオチド（配列番号２２）の同定結果を示す。図８Ｂは、481位〜該エキソンの３’末端におけるヌクレオチド（配列番号２３）の同定結果を示す。図９Ａ、９Ｂ、９Ｃおよび９Ｄは、（図２で同定された）エキソン８およびフランキングイントロン配列に対するヌクレオチド（配列番号２４）および推定アミノ酸配列（配列番号２５）を示す。図９Ａは特に、1〜480位の全てにおけるヌクレオチドの同定結果（配列番号２６）を示す。図９Ｂは特に、481〜1140位の全てにおけるヌクレオチドの同定結果（配列番号２７）を示す。図９Ｃは特に、1141−1800位の全てにおけるヌクレオチドの同定結果（配列番号２８）を示す。図９Ｄは特に、1801〜該イントロンの３’末端におけるヌクレオチドの同定結果（配列番号２９）を示す。ｃ．本発明のプロリル-4-ヒドロキシラーゼのα２サブユニットの発現 (1)コード配列本発明によれば、適当な宿主細胞内で、プロリル-4-ヒドロキシラーゼのαサブユニットのヒト・イソ型、またはその機能的均等体をコードするポリヌクレオチド配列を用いて、プロリル-4-ヒドロキシラーゼのヒト・α２サブユニットまたはその誘導体、およびプロリル-4-ヒドロキシラーゼのα２サブユニット、またはその機能的均等体を含んでなるプロリル-4-ヒドロキシラーゼの発現を指示する組換えＤＮＡ分子を作製することができる。また、かかる配列のプロリル-4 -ヒドロキシラーゼのα２サブユニット、並びに、かかるポリヌクレオチドまたはそれらの相補体の少なくとも一部と選択的にハイブリダイズする他のポリヌクレオチドも、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、サザンおよびノーザンブロット分析などに使用することができる。遺伝コードに固有の縮重のため、実質的に同一のまたは機能的に同等のアミノ酸配列をコードする他の核酸配列を、プロリル-4-ヒドロキシラーゼタンパク質のα２サブユニットのクローニングおよび発現のための本発明の実施に用いてもよい。かかる核酸配列には、ストリンジェントな条件下でプロリル-4-ヒドロキシラーゼ配列の適当なα２サブユニットとハイブリダイズすることができるものが含まれる。本発明に用いてもよい改変型核酸配列には、結果として同一のまたは機能的に同等の遺伝子産物をコードする配列が生じる異なる核酸残基の欠失、付加あるいは置換が含まれる。該核酸産物自身は、プロリル-4-ヒドロキシラーゼ配列のα ２サブユニット内にアミノ酸残基の欠失、付加あるいは置換を含み、これは結果としてサイレント変異を生じ、かくして機能的に同等なαサブユニットが生じる。かかるアミノ酸置換は、関連残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性および／または両親媒性における類似性に基づいて行われ得る。例えば、負電荷を有するアミノ酸としてはアスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられ、正電荷を有するアミノ酸としはリシンおよびアルギニンが挙げられ、電荷を持たない極性へッド基を有し、同等の親水価を持つアミノ酸としては下記：ロイシン、イソロイシン、バリン：グリシン、アラニン；アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；フェニルアラニン、チロシンが挙げられる。限定されるものではないが、その遺伝子産物のプロセッシングおよび発現を修飾する改変を始めとする種々の末端についてプロリル-4-ヒドロキシラーゼ・コード配列のα２サブユニットを改変するため、本発明の核酸配列を遺伝子工学的に操作してもよい。例えば、天然ヒト分泌シグナルの代わりに選択的分泌シグナルを置換してもよいし、さらに／もしくは当該技術分野で公知の技術、例えば、位置指定突然変異誘発、新しい制限部位の挿入、グリコシル化パターンの変更、リン酸化などを用いて、突然変異を誘発してもよい。別法として非ヒト細胞における発現の場合、本発明のプロリル-4-ヒドロキシラーゼをコードするポリヌクレオチドは、特定の宿主生物のコドン選択によりよく適合するように修飾してもよい。本発明のもう一つの実施態様では、当該技術分野で周知の化学的方法を用いて、本発明のプロリル-4-ヒドロキシラーゼのα２サブユニットのコード配列を全て、または部分的に合成することができる。例えば、Caruthersら，Nuc．Acids res．Symp．Ser．7:215-233(1980);CreaおよびHorn，Nuc．Acids Res．9(10):23 31(1980);MatteucciおよびCaruthers，Tetrahedron Letters 21:719(1980);並びにChowおよびKempe，Nuc．Acids Res．9(12):2807-2817(1981)を参照。別法として、化学的方法を用いて該タンパク質自身を生産し、少なくとも部分的に所望の α２サブユニットアミノ酸配列を合成することができる。例えば、ペプチドを固相法によって合成し、その樹脂から切り離し、次いで分取高速液体クロマトグラフィーによって精製することができる（例えば、Creighton，Proteins Structur es And Molecular Principles，W.H．Freemanおよび共同研究者，N.Y.，pp．50- 60(1983)を参照）。該合成ペプチドの組成はアミノ酸分析または配列決定により確認すればよい（例えば、エドマン分解法、Creighton，Proteins，Structures and Molecular Princioles，W.H．Freemanおよび共同研究者，N.Y.，pp.34-49(1 983)を参照）。本発明のプロリル-4-ヒドロキシラーゼのα２サブユニットを発現させるために、プロリル-4-ヒドロキシラーゼのα２サブユニットまたは機能的同等体をコードするヌクレオチド配列を適当な発現ベクター（すなわち挿入されたコード配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含むベクター）中に挿入する。 (2)発現系当業者に周知の方法を用いて、プロリル-4-ヒドロキシラーゼ、および適当な転写／翻訳調節シグナルに対する配列をコードするプロリル-4-ヒドロキシラーゼのα２サブユニットを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、in vitro組換えＤＮＡ法、合成法およびin vivo組換えが含まれる。例えば、Maniatisら，Molecular Cloning A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y．(1989)およびAusubelら，Current protocols in Mol ecular Biology，Greene Publishing Associates and Wiley Interscience，N.Y ．(1989)に記載の技術を参照。種々の宿主−発現ベクター系を利用して、プロリル-4-ヒドロキシラーゼのα ２サブユニットのコード配列を発現させることができる。限定されるものではないが、これらにはプロリル-4-ヒドロキシラーゼのα２サブユニットのコード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換させた細菌のごとき微生物：プロリル-4-ヒドロキシラーゼのα２サブユニットのコード配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換させた酵母；プロリル-4-ヒドロキシラーゼのα２サブユニットをコードする配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV；タバコモザイクウイルス、TMV）を感染させるか、またはプロリル-4-ヒドロキシラーゼのα２サブユニットのコード配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Tiプラスミド）で形質転換させた植物細胞系；もしくは適当なベクター、好ましくはセムリキ森林ウイルスを感染させた動物細胞系が含まれる。さらに、所望の酵素産物をトランスジェニック非ヒト動物の乳汁から回収できるトランスジェニック非ヒト動物内で、本発明のプロリル-4-ヒドロキシラーゼのα２サブユニットを発現させてもよい。これらの系の発現エレメントはそれらの強度および特異性が異なる。利用する宿主／ベクター系に応じて、構成的プロモーターおよび誘導的プロモーターを含む多くの適切な転写および翻訳エレメントの何れかを発現ベクターに用いてよい。例えば、細菌系でのクローニングの場合は、バクテリオファージλのpL、plac、ptrp、ptac（ptrp−lacハイブリッドプロモーター）などのごとき誘導的プロモーターを使用でき：昆虫細胞系でのクローニングの場合は、バキュロウイルスポリヘドロンプロモーターのごときプロモーターを使用でき：植物細胞系でのクローニングの場合は、植物細胞のゲノムから誘導したプロモーター（例えば、熱ショックプロモーター：RUBISCOの小サブユニットに対するプロモーター：クロロフィルa/b結合タンパク質に対するプロモーター）、または植物ウイルスから誘導されたプロモーター（例えば、CaMV の３５ＳＲＮＡプロモーター；TMVのコートタンパク質プロモータ一）を使用でき；哺乳動物細胞系でのクローニングの場合は、哺乳動物細胞のゲノムから誘導したプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）、または哺乳類ウイルスから誘導したプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；種痘ウイルス7.5Kプロモーター）が使用でき；プロリル-4-ヒドロキシラーゼＤＮＡのα２サブユニットの多重コピーを含む細胞系を作製する場合は、SV40、 BPVおよびEBVに基づくベクターを適当な選択マーカーと共に使用できる。細菌系では、発現されたプロリル-4-ヒドロキシラーゼのα２サブユニットの使用目的に応じて、多くの発現ベクターを有利に選択することができる。例えば、本発明のポリペプチドを大量に生産する場合、容易に精製される高レベルのタンパク質産物の発現を指示するベクターが望ましいであろう。かかるベクターとしては限定されるものではないが、ハイブリッドAS-lac Zタンパク質が生産されるようにポリペプチドコード配列がlac Zコーディング領域を有するフレーム内のベクターに連結されてよい大腸菌(E．coli)発現ベクターpUR278(Rutherら，EM BO J．2:1791(1983))、pINベクター(InouyeおよびInouye，Nucleic Acids Res． 13:3101-3109(1985);Van HeekeおよびSchuster，J．Biol．Chem．264:5503-5509 (1989))などが挙げられる。またpGEXベクターを用いてグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)を伴うタンパク質として外来ポリペプチドを発現させてもよい。一般に、かかるタンパク質は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズへの吸着、それに続く遊離グルタチオンの存在下での溶出によって溶解した細胞から容易に精製することができる。該pGEXベクターはトロンビンまたはXa因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計され、その結果クローニングされた対象のポリペプチドをGST部分から遊離させることができる。好ましい発現系は酵母発現系である。酵母では、構成的プロモーターまたは誘導的プロモーターを含有する多くのプロモーターを使用できる。総説としては、 Current Protocols in Molecular Biology，第2巻,編Ausubelら，Greene Publi sh．Assoc．& Wiley Interscience，第13章(1988);Grantら，Expression and Se cretion Vectors for Yeast，in Methods in Enzymology，編WuおよびGrossman ，Acad．Press，N.Y．153:516-544(1987);Glover，DNA Cloning，第II巻，IRL P ress，Wash.，D.C.，第3章(1986);Bitter，Heterologous Gene Expression in Y east，Methods in Enzymology，編BergerおよびKimmel，Acad．Press，N.Y．152 :673-684(1987);およびThe Moleculer Biology of the Yeast Saccharomyces，編Strathernら，Cold Spring Harbor Press，第IおよびII巻(1982)を参照。本発明のタンパク質のクローニングおよび発現に有用な特に好ましい系では、酵母ピヒア(Pichia)由来の宿主細胞を用いる。ピヒア・パストリス(Pichia past oris)のごとき非サッカロミセス(Saccaromyces)酵母の種は、操作のスケールアップの際に、高収率の組換えタンパク質の産生において特別の利点を有すると思われる。さらに、Pichla発現キットがInvltrogen Corporationから市販されている(San Diego，CA)。 Pichia pastorisのごときメチロトローフ酵母には多くのメタノール応答遺伝子が存在し、各々の発現はメタノール応答調節領域（プロモーターともいう）によって制御されている。かかるメタノール応答プロモーターの何れもが本発明の実施における使用に適している。特異的調節領域の例としては、Pichia pastori s AOX1由来の一級アルコールオキシダーゼ遺伝子に対するプロモーター、P．pas toris AOX2由来の二級アルコールオキシダーゼ遺伝子に対するプロモーター、P ．pastoris由来のジヒドロキシアセトンシンターゼ遺伝子(DAS)に対するプロモーター、p．pastoris由来のP40遺伝子に対するプロモーター、P．pastoris由来のカタラーゼ遺伝子に対するプロモーターなどが挙げられる。 Pichia pastorisにおける典型的な発現は、厳格に調節されたAOX1遺伝子由来のプロモーターにより得られる。Ellisら，Mol．Cell．Biol．5:1111(1985)および米国特許第4,855,231号を参照。このプロモーターは、培養物にメタノールを付加した後、誘導して高レベルの組換えタンパク質を生産することができる。同細胞の後続の操作により、組換えコラーゲンタンパク質が本発明のプロリル-4- ヒドロキシラーゼによって適切にヒドロキシル化される条件下で、本明細書に記載された本発明のプロリル-4-ヒドロキシラーゼのα２サブユニットに対する遺伝子の発現を達成し、その結果、折りたたまれて、原繊維の形成におけるコラーゲンの正常な生物学的機能に必要とされる安定したらせん構造になる。もう一つの特に好ましい酵母発現系では、メチロトローフ酵母ハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)を使用する。メタノール中で増殖させると、メタノール代謝の重要な酵素、すなわちMOX（メタノールオキシダーゼ）、DAS（ジヒドロキシアセトンシンターゼ）およびFMHD（蟻酸エステルデヒドロゲナーゼ）の誘導が生じる。全細胞タンパク質の30-40%までがこれらの酵素で構成される可能性がある。MOX、DASおよびFMDH産生をコードする遺伝子は、メタノール中での増殖により誘導され、かつグルコース中での増殖により抑制される極めて強力なプロモーターにより制御される。これら３種のプロモーターの何れかまたは全てを用いて、H．polymorphaの異種核酸配列の高レベルの発現を得ることができる。本発明のプロリル-4-ヒドロキシラーゼのα２サブユニットをコードする核酸配列は、誘導性H．polymorphaプロモーターの制御下で、発現ベクター中へクローニングされる。その産物の分泌が所望される場合は、Ｓ・セレビシエ(S.cer evisiae)プレプロー接合因子α１のごとき酵母における分泌に関するシグナル配列をコードするポリヌクレオチドを、本発明のプロリル-4-ヒドロキシラーゼの α２サブユニットに対するコード配列と同じ読み取り枠で融合させる。該発現ベクターは好ましくは、URA3またはLEU2のごとき栄養要求性マーカー遺伝子を含み、これを用いて栄養要求性宿主の欠損を補足することができる。次いで、当業者に公知の技術を用い、該発現ベクターを用いてH．Polymorpha 宿主細胞を形質転換させる。H．polymorpha形質転換の興昧深く有用な特性は、ゲノム中へ100コピーまでの発現ベクターを自発的に組み込むということである。ほとんどの場合において、組み込まれたＤＮＡは頭−尾配列を示す多量体を形成する。組み込まれた外来ＤＮＡは、いくつかの組換え系統において非選択条件下でさえ有糸分裂に対して安定であることが示されている。多数のコピーを組み込むというかくのごとき現象に、さらに本系の高生産能が加わる。植物発現ベクターを使用する場合、本発明のα２サブユニットをコードする配列の発現は多くのプロモーターの何れかにより誘導してよい。例えば、CaMVの３５ＳＲＮＡおよび１９ＳＲＮＡプロモーター(Brissonら，Nature 310:511-5 14(1984))、またはTMVのコートタンパク質プロモーター(Takamatsuら，EMBO J． 6:307-311 (1987))のごときウイルスプロモーターを使用してもよいし、別法として、RUBISCOの小サブユニット(Coruzziら，EMBO J．3:1671-1680(1984);Brogl ieら，Science 224:838-843(1984))、または熱ショックプロモーター、例えば大豆hsp17.5-Eもしくはhsp17.3-B(Gurleyら，Mol．Cell．Blol．6:559-565(1986)) のごとき植物プロモーターをしてもよい。これら構築体は、Tiプラスミド、Riプラスミド、植物ウイルスベクター、直接的ＤＮＡ形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどを用いて、植物細胞中へと導入することができる。かかる技術の総説としては、例えば、WelssbachおよびWelssbach，Meth ods for Plant Molecular Biology，Academic Press，NY，第VIII章,421-463頁( 1988);並びにGriersonおよびCorey，Plant Molecular Biology，第2版，Blackie ，London，第7-9章(1988)参照。本発明のプロリル-4-ヒドロキシラーゼのα２サブユニットを発現するのに使用することができた別の発現系として昆虫系がある。かかる系の１つでは、オートグラファ・カリフォルニカ(Autographa californica)核多角体病ウイルス(AcN PV)をベクターとして用いて外来遺伝子を発現させる。該ウイルスはスポドプテラ・フルギペルダ(Spodopter frugiperda)細胞内で増殖する。本発明のプロリル -4-ヒドロキシラーゼのα２サブユニットに対するコード配列をウイルスの非必須領域（例えばポリヘドロン遺伝子）中へクローニングして、AcNPVプロモーター（例えばポリヘドロンプロモーター）の制御下に置けばよい。プロリル-4-ヒドロキシラーゼコード配列のα２サブユニットを首尾よく挿入すれば、結果としてポリヘドロン遺伝子が不活性され、妨害されない組換えウイルス（すなわち、ポリヘドロン遺伝子によりコードされたタンパク質性外被を欠くウイルス）が生産されるであろう。次いで、これら組換えウイルスを用いて、そこで挿入した遺伝子が発現されるSpodoptera frugiperda細胞を感染させる（例えば、Smithら， J．Viol．46:584(1983);Smith，米国特許第4,215,051号参照）。哺乳類宿主細胞では、多くのウイルスベースの発現系が利用できる。アデノウイルスを発現ベクターとして用いる場合、本発明のプロリル-4-ヒドロキシラーゼのα２サブユニットのコード配列をアデノウイルス転写／翻訳調節複合体、例えば、後期プロモーターおよび三部分リーダー配列に連結すればよい。次いでこの遺伝子を、in vitroまたはin vivo組換えによりアデノウイルスゲノム内へ挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域E1またはE2）内に挿入すれば、その結果、生存可能であり、かつ感染宿主内でポリペプチドを発現することができる組換えウイルスが得られよう（例えば、LoganおよびShenk ，Proc．Natl．Acad．Scl．(USA)81:3655-3656(1984)を参照）。また、種痘7.5K プロモーターを用いてもよい（例えば、Mackettら，Proc．Natl．Acad．Sci．(U SA)79:7415-7419(1982);Mackettら，J．Virol．49:857-864(1984);Panicaliら， Proc．Natl．Acad．Sci．79:4927-4931(1982)を参照）。また、特定の開始シグナルも、挿入されたプロリル-4-ヒドロキシラーゼコード配列の有効な翻訳に必要とされる。これらシグナルにはATG開始コドンおよび隣接配列が含まれる。固有の開始コドンおよび隣接配列を含む全ポリペプチド遺伝子が適当な発現ベクターに挿入される場合には、付加的な翻訳調節シグナルを必要としないと考えられる。しかしながら、コード配列の一部だけが挿入される場合では、ATG開始コドンを含む外生の翻訳調節シグナルが提供されなければならない。さらに、全挿入部の翻訳を確実にするためには、該開始コドンがプロリル-4-ヒドロキシラーゼコード配列のα２サブユニットのリーディングフレームと読み枠が合っていなければならない。これら外生の翻訳調節シグナルおよび開始コドンは、天然および合成双方の種々の起源とするものであってよい。発現効率は適当な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを包含することにより助長される（Bittnerら，Methods in Enzymol．153:516-544(1987)参照）。本発明のプロリル-4-ヒドロキシラーゼのα２サブユニットの組換え体生産のための１つの好ましい発現系はトランスジェニック非ヒト動物にあり、所望のポリペプチドはそのトランスジェニック動物の乳汁から回収できる。かかかる系は、本発明のα２サブユニットをコードするＤＮＡ配列を、乳腺での発現を果たし得るプロモーターおよび他の必要なまたは任意の調節配列に作動可能なように連結することにより構築される。同様に、特に米国出願番号08/037,728号で開示されたごとき、標的乳汁タンパク質産生乳腺細胞で作動可能な適切な発現系を用いて、必要なまたは任意の翻訳後酵素を標的細胞内で同時に産生させてもよい。乳汁中での発現のためには、プロモーターが、α-S1-カゼインまたはβ-ラクトグロブリンのごとき豊富な乳汁特異的タンパク質の１つから選択されることが好ましいであろう。例えば、α-S1-カゼインの５’および３’調節配列がヒト・ラクトフェリンｃＤＮＡの発現のために首尾よく用いられており、また同様に、 β-ラクトグロブリンプロモーターはヒツジ乳汁産生細胞におけるヒト・アンチトリプシン遺伝子断片の発現を果たしている。Wrightら，Biotechnology 9:830- 833(1991)。トランスジェニック・ヤギでは、ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーターの発現にホエー酸プロモーターが用いられ、その結果、該トランスジェニック体の乳汁中にヒト組織プラスミノーゲンアクチベーターが分泌される。Eb ertら，Biotechnology 9:835-838(1991)。かかる発現系を用いて、本発明のポリペプチドを乳汁中へ分泌する動物が得られる。当業者に周知の手法を用いて、所望のプロリル-4-ヒドロキシラーゼ鎖をコードする遺伝子を、選択された動物種の乳房細胞で機能する適切な調節配列に簡単に連結することができる。プロリル -4-ヒドロキシラーゼのα２サブユニットをコードする遺伝子のための発現系も同様に構築される。本発明のプロリル-4-ヒドロキシラーゼは分泌タンパク質として発現することが好ましい。該タンパク質の発現のために用いられる遺伝子工学的に作製した細胞が非ヒト宿主細胞である場合、プロリル-4-ヒドロキシラーゼタンパク質のヒト・分泌シグナルペプチドを、宿主細胞の分泌ターゲッティング機構によりさらに効果的に認識される別の分泌シグナルペプチドで置換することがしばしば有利である。適当な分泌シグナル配列は、哺乳類遺伝子の最適な真菌類発現を得る際に特に重要である。例えば、メチロトローフ酵母では、リーディングフレーム内 S．cerevislae α-接合因子プレープロ配列をコードするＤＮＡ配列をコード配列のアミノ終結末端に挿入すればよい。αMFプレープロ配列はαMF前駆体分子中に含まれるリーダー配列であり、タンパク質分解プロセッシングおよび分泌に必要なlys-argコード化配列を含む（例えば、Braleら，Proc．Nat'l．Acad．Sci． USA，81:4542(1984)参照）。また、好ましくは、一般にPCT出願第PCT/US92/05061(WO93/07889)に記載されたごとくに、本発明のプロリル-4-ヒドロキシラーゼのα２サブユニットをプロリル-4-ヒドロキシラーゼおよび／またはコラーゲンのβサブユニットと共に宿主細胞により同時に発現させて、その結果、α₂β₂プロリル-4-ヒドロキシラーゼ四量体が形成されて、この酵素が発現されたコラーゲン中で4-ヒドロキシプロリンの形成を触媒するようになる。別法として、挿入された配列の発現をモジュレートするか、またはその遺伝子産物を所望の特異的様式で修飾もしくはプロセッシングする宿主細胞系統が選択されてもよい。タンパク質産物のかかる修飾（例えば、グリコシル化）およびプロセッシング（例えば、切断）は、該タンパク質の機能にとって重要であると考えられる。異なる宿主細胞はタンパク質の翻訳後プロセッシングおよび修飾に関して特徴的かつ特異的なメカニズムを持つ。適当な細胞系または宿主系を選択して、発現した外来タンパク質の正確な修飾およびプロセッシングを確実にすることができる。この目的のために、適切な一次転写物のプロセッシング、その遺伝子産物のグリコシル化およびリン酸化ための細胞性機構を有する真核宿主細胞が用い得る。かかる哺乳類宿主細胞としては、限定されるものではないが、CHO、V ERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、WI38などが挙げられる。さらに、宿主細胞を遺伝子工学的に作製して種々の酵素を発現させ、コラーゲン分子の適切なプロセッシングを確実にすることができる。例えば、プロリル-4-ヒドロキシラーゼに対する遺伝子（すなわち、プロリル-4-ヒドロキシラーゼのαサブユニットをコードする遺伝子およびプロリル-4-ヒドロキシラーゼのβサブユニットをコードする遺伝子）を、宿主細胞でコラーゲン遺伝子と共に同時発現させてもよい。組換えタンパク質を長期間、高収率で生産するためには、安定した発現が好ましい。例えば、本発明のプロリル-4-ヒドロキシラーゼのα２サブユニットを安定して発現する細胞系を遺伝子工学的に作製すればよい。宿主細胞は、ウイルス性の複製起点を含む発現ベクターを用いるのではなく、適当な発現調節エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）によって制御されるα２サブユニットをコードするＤＮＡおよび選択可能マーカーで形質転換させることができる。外来ＤＮＡの導入に続き、遺伝子工学的に作製した細胞を富化培地で１−２日間増殖させ、次いで選択培地に切り替える。組換えプラスミド中の選択マーカーはその選択に対する耐性を与え、しかも細胞がそれらの染色体に安定に組み込まれ、増殖して、さらに次にはクローニングされて細胞系間に広がり得るフォーカスを形成するのを可能にする。この方法はプロリル-4-ヒドロキシラーゼの所望のα２サブユニットを発現する細胞系を遺伝子工学的に作製するのに有利に使用することができる。多くの選抜系が使用でき、例えば、限定されるものではないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(Wiglerら，Cell 11:223(1997))、ヒポキサンチン− グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(SzybalskaおよびSzybalski，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 48:2026(1962))およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Lowyら，Cell 22:817(1980))を含む遺伝子がそれぞれtk￣,hgprt ￣またはaprt￣細胞で用いられる。また、メトトレキセート耐性を与えるdhfr(W iglerら，Natl．Acad．Sci．USA 77:3567(1980);O'Hareら，Proc．Natl．Acad． Scl．USA 78:1527(1981));ミコフェノール酸耐性を与えるgpt(MulliganおよびBe rg，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 78:2072(1981));アミノグリコシドG-418耐性を与えるneo(Colberre-Garapinら，J．Mol．Blol．150:1(1981));およびハイグロマイシン耐性を与えるhygro(Santerreら，Gene 30:147(1984))に対する選択の基礎として代謝拮抗物質耐性を使用することができる。最近、さらに別の選択遺伝子、すなわち、細胞がトリプチファンの代わりにインドールを利用できるようにするtrpB;細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用できるようにするh isD(HartmanおよびMulligan，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85:8047(1988));およびオルニチンデカルボキシラーゼインヒビター、2-（ジフルオロメチル）-DL- オルニチン、DFMO耐性を与えるODC（オルニチンデカルボキシラーゼ）(McConlog ue L.，In:Current Communication in Molecular Biology，Cold Spring Harbor Laboratory編(1987))について記載されている。ｄ．本発明のα２サブユニットタンパク質を発現するトランスフェクション体または形質転換体の同定および発現したタンパク質の精製コード配列を含み、かつ生物学的に活性な遺伝子産物を発現する宿主細胞は、少なくとも４つの一般的アプローチ：(a)ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション；(b)「マーカー」遺伝子機能の存在または不在；(c)宿主細胞におけるα２サブユニットｍＲＮＡ転写物の発現によって測定される転写レベルの評価；および(d)イムノアッセイによって、またはその生物学的活性によって測定される遺伝子産物の検出；によって同定され得る。第一のアプローチでは、発現ベクターに挿入された酵素コード配列の存在は、プロリル-4-ヒドロキシラーゼコード配列のα２サブユニット、もしくはその一部または誘導体の各々と相同なヌクレオチド配列を含んでなるプローブを用いてＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションによって検出することができる。第二のアプローチでは、組換え発現ベクター/宿主系を特定の「マーカー」遺伝子機能（例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質耐性、メトトレキセート耐性、形質転換表現型、バキュロウイルスにおける閉塞体形成など）の存在または不在に基づいて同定および選択することができる。例えば、α２サブユニットコード配列がベクターのマーカー遺伝子配列内に挿入されれば、プロリル-4-ヒドロキシラーゼのα２サブユニットのコード配列を含有する組換え細胞は、該マーカー遺伝子機能の不在により同定できる。あるいは、α２サブユニットコード配列の発現を制御するために用いられる同一の、または異なるプロモーターの制御下で、マーカー遺伝子をα２サブユニット配列と一列に配置することができる。誘導または選択に応じた該マーカーの発現は、α２サブユニットコード配列の発現を示す。第三のアプローチでは、α２サブユニットコーディング領域の転写活性は、ハイブリダイゼーションアッセイによって評価することができる。例えば、α２サブユニットコード配列またはその特定部分と相同なプローブを用いるノーザンブロットによって、ＲＮＡを単離、分析することができる。あるいはまた、宿主細胞の全核酸を抽出し、かかるプローブとのハイブリダイゼーションについてアッセイすることができる。第四のアプローチでは、例えば、ウエスタンブロットや、放射線免疫沈降、酵素結合イムノアッセイのごときイムノアッセイなどによって、酵素産物の発現を免疫学的に評価するとことができる。培養培地中に分泌される本発明の発現酵素は、例えば、クロマトグラフィーによって均質になるよう精製される。１つの実施態様において、プロリル-4-ヒドロキシラーゼタンパク質の組換えα２サブユニットは、サイズ排除クロマトグラフィーにより精製する。しかしながら、イオン交換クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィーなどの当該技術分野で公知の他の精製技術を用いることもできる。５．実施例本発明は下記の実施例を参照してさらに理解されよう。これら実施例は、単に本発明を例示するものである。実施例１：ｃＤＮＡクローンの単離 MacNeilら，(1993)J．Immnol．151:6913-23に記載されたごとくに、BT14.1と称されるマウス・α２サブユニットのｃＤＮＡクローンは、胸腺に共通の抗原１をコードするｃＤＮＡをプローブとして用いることにより、λgt10(Clontech)中のBALB/ｃマウス脳ｃＤＮＡライブラリーから得た。このBT14.1クローンはヒトおよびニワトリのプロリル-4-ヒドロキシラーゼαサブユニットと高度な相同性を有していた。しかしながら、ｃＤＮＡクローンBT14.1は該ポリペプチドのＮ末端領域をコードする配列は含んでいなかった。従って、これをプローブとして用いて、マウス脳および骨格筋ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。 600,000の組換え体の中から４つの陽性クローンを得た。そのうち２つ、M1およびM4は同一であることが判明し、一方、M2は欠失を有し、M3は２つの無関係なインサートを含んでいた。クローンM1を用いて、λgt10(Clontech)中のマウス骨格筋ｃＤＮＡライブラリー1.6x10⁶プラークをスクリーニングした。１つの陽性クローンM6を得た。このクローンをさらに特性決定したところ、BT14.1に含まれていることが判明した。M1およびBT14.1の５’最末端は同一の内部EcoRI位置に（図１で示された配列の220ヌクレオチド位に）存在していた。この５’最末端クローンをM1を用いて単離して、マウス骨格筋ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、１つの陽性クローンM6を得た。以下の実施例２に示すごとくに、組み合わせにおいて考えられるｃＤＮＡクローンはマウスα２サブユニットの全コーディング領域にわたる。次いで、Helaakoskiら，(1989)Proc．Natl．Acad．Sci．(USA)86:4392-96に記載されたごとくに、α１サブユニットに対するヒトｃＤＮＡクローンPA-49を用いて3T3繊維芽細胞λgt11ｃＤＮＡライブラリー(Clontech)をスクリーニングすることにより、マウスα１サブユニットのｃＤＮＡクローンを単離し、600,000 のプラークから８つの陽性クローンを得た。これらのクローンのうち３つ、MA3、MA4およびMA7を単離し、配列決定した。これらのクローンのヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列は、ヒトおよびニワトリのプロリル-4-ヒドロキシラーゼαサブユニットのそれと有意な類似性を示した。これらのクローンのうち２つ、MA3およびMA4は、選択的にスプライシングを受けるエキソン10配列を含むヒトｍＲＮＡのマウス対応物に相当することが判明し、一方、M7はエキソン９配列を含んでいた。これらのｃＤＮＡクローンはｍＲＮＡの５’最末端を含んでいなかった。このｃＤＮＡ誘導アミノ酸配列とヒトおよびニワトリα１サブユニットのそれとの比較から、該ｃＤＮＡクローンは全プロセッシングポリペプチドを含むが、５’非翻訳領域またはシグナルペプチドのＮ末端半分に相当する配列は含んでいないことが示唆される。GenBankデータベース受け入れ番号Ul6l62参照。実施例２：ヌクレオチド配列決定、配列分析、およびノーザンブロット分析実施例１に記載のクローンのヌクレオチド配列を、Sangerら(1977)，Proc．Na tl．Acad．Sci．(USA)74:5463-67に記載されているジデオキシヌクレオチド・チェーンターミネーション法によりＴ７ＤＮＡポリメラーゼ(Pharmacia)を用いて決定した。Applied Biosystems ＤＮＡ合成装置（Department of Biochemistry ，University of Oulu）で合成したベクター特異的または配列特異的プライマーを用いた。DNASISおよびPROSISバージョン6.00配列分析用ソフトウエア(Pharmac ia)、ANTHEPROT［Deleageら(1988)Comput．Appl．Blosci．4:351-356に開示］、 Wisconsin Genetics Computer Groupパッケージバージョン８（1994年９月）およびBOXSHADE（Kay Hofmann，Bioinformatics Group， Institut Suisse de Recherches Experimentales sur le Cancer Lausanne， Switzerland）を用いて、配列データを計算した。このｃＤＮＡクローンは、対応するｍＲＮＡではない2168を含み、537aa(アミノ酸)のポリペプチドをコードする（図１）。推定ポリペプチドのN末端に想定シグナルペプチドが存在し、von Hejne（1986）Nucleic Acid Res．14:4683-90の計算パラメーターに基づけば、成熟α２サブユニットの最も可能性の高い最初のアミノ酸はトリプトファンであり、このことは、シグナル配列の大きさが19aaであること、および処理したα２サブユニットの大きさが518aaであることを意味する。処理ペプチドの分子量は59,000である。ｃＤＮＡクローンはまた、それぞれ150bpおよび407bpの５’側および３’側非翻訳配列も含む（図１）。３’側の非翻訳配列は、標準的なポリアデニル化シグナルを含んでおり、このシグナルの 12ヌクレオチド下流には15ヌクレオチド位置のポリ（Ａ）テイルが結合している。マウスα２およびマウスα１ポリペプチドは同様の大きさであり、ヒトα１ポリペプチドの場合のようにα２ポリペプチドがトリプトファン残基から始まり、 α１がヒスチジン残基から始まると仮定した場合には、α２は518アミノ酸であり、α１は517アミノ酸である。処理したヒトα１サブユニットは517個のアミノ酸を含み、ニワトリα１サブユニットは516個のアミノ酸を含むが（Bassukら，前掲,に記載）、一方、処理したＣ．エレガンス(C．elegans)αサブユニットはさらに長く542個のアミノ酸を含み（Veljolaら，前掲）、この相違は主に、該ポリペプチドのC末端において32個のアミノ酸が延長されているためである（図２）。マウスα２およびα１サブユニットは、アスパラギン結合オリゴ糖に対する２つの可能性のある付着部位を含む。α２サブユニットの-Asn-Leu-Ser-および-As n-Glu-Thr-の配列の位置を図１に示す。ヒト、マウスおよびニワトリのα１サブユニットならびにＣ．エレガンスαサブユニットに存在する5個のシステイン残基の位置は全てα２サブユニットでは保存されているが、C.エレガンスの場合、 α１サブユニットの４番目と５番目のシステインの間に追加のシステインを含む。興味深いことには、これらのシステイン残基の位置は、マウスα１サブユニットおよびＣ．エレガンスαサブユニットでは、保存されているアミノ酸の伸長も分断されている部位にある。マウスα２サブユニットとマウスα１サブユニットとの間の全体のアミノ酸配列の同一性および類似性はそれぞれ63％および83％であり、マウスα２サブユニットとＣ．エレガンスαサブユニットとの間ではそれぞれ41％および67％であり、これらはマウスα１サブユニットとＣ．エレガンスαサブユニットとの間とほぼ同じである（43％の同一性および67％の類似性）。しかしながら、同一性は均等に分布しておらず、Ｃ末端ドメイン内で最も高く、この部分はα１サブユニットの触媒として重要な部分に該当すると考えられている［同上;Myllylaら，(199 2)Biochem．J．286:923-927］。マウスα１サブユニット中の残基412および483 である２つのヒスチジン（図２）は、プロリル-4-ヒドロキシラーゼのFe²⁺結合部位に含まれると示唆されており（26）、これらは両方とも保存され、共にその保存されたＣ末端ドメイン内に位置する。各種マウス組織から単離されたサンプル当たり２μgのポリ（Ａ）’ＲＮＡを含むマウス多種組織(multitissue)ノーザンブロット（Clontech）を製造業者の説明書で推奨されているストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせた。用いたプローブは³²Ｐ標識ｃＤＮＡクローンBT14.1またはMA7であった。両方のタイプのαサブユニットｍＲＮＡの発現パターンは非常に類似していることが判明し、ハイブリダイゼーションシグナルの強度は心臓、肺および脳において最も高かった。α２サブユニットｍＲＮＡの大きさは2.4kbであった。マウスα１サブユニットは、少なくとも心臓、脳および肺において２つのｍＲＮＡ転写物を有することが判明し、より強いシグナルは3.4kbにあり、より弱いシグナルは4.3kbにあった。実施例３：細胞培養および組換えバキュロウイルスの作製 α２ポリペプチドがプロリル-4-ヒドロキシラーゼのαサブユニット、プロリル-3-ヒドロキシラーゼまたは特定の他の2-オキソグルタル酸ジオキシゲナーゼのサブユニットに該当するか否かについては最初は不明であったので、昆虫細胞内で組換えポリペプチドを発現させて、その機能を解明した。具体的には、スポドピエラ・フルギペルダ(Spodopiera frugiperda)Sf⁹の昆虫細胞を、10％ウシ胎児血清（GIBCO）を補充したTNM-FH培地（Sigma）で27℃にて培養した。発現のためのα(11)サブユニットｃＤＮＡを構築するために、クローンBT14.1をBamHI およびEcoRIの制限酵素で消化して、塩基対592〜2168を含む断片を得た。M6のλ ＤＮＡから５’断片を増幅させた。使用したプライマーは、ｃＤＮＡ特異的な、人工的NotI部位を含むM3PH（5'-AAGTTGCGGCCGCGAGCA TCAGCAAGGTACTGC-3'）（配列番号30）、および天然のBamHI部位を含むM65’PCR（5'-TGTCCGGATCCAGTTTGTAC GTGTC-3'）（配列番号31）であった。ＰＣＲはTaqポリメラーゼ（Promega）の供給元の推奨する条件下で行い、反応は以下のようにして27サイクル行った：変性を94℃で１分、アニーリングを66℃で１分、伸長を72℃で３分。生成物をNotIおよびBamHI制限酵素で消化して、伸長型である塩基対120〜591の断片を得た。次にこれら２つのNotI-BamHIおよびBamHI-EcoRI断片をpBluescriptベクター（Stra tagene）にクローニングし、その構築物をNotIおよびEcoRVで消化し、得られた断片をバキュロウイルス・トランスフアーベクタ一pVL1392のNotI-SmaI部位に連結した（但し、該ベクターは、LuckowおよびSummers（1989）Virology 170:31-3 9に記載の方法に従って得た）。BaclulGoldトランスフェクション・キット（Pha rMingen）を用いて、pVI構築物を修飾オートグラファ・カリフォルニカ(Autogra pha californica)核多角体病ウイルスＤＮＡと共にSf9昆虫細胞に同時トランスフェクトした。得られたウイルスのプールを４日後に回収し、増幅し、プラーク精製した。MalitschekおよびSchartl（1991）BioTechniques 11:177-178に記載されているＰＣＲをベースとする方法により組換えウイルスをチェックした。実施例４：組換えタンパク質の発現および分析マウスα２サブユニットをコードする組換えバキュロウイルスを作製し、これを用いてヒトPDI／βサブユニットを含むかまたは含まないＳ．フルギペルダ(S ．frugiperda)昆虫細胞に感染させた（但し、該昆虫細胞は多重度５で感染させた）。酵素四量体を製造するために、ヒトα59 １（Vuoriら，前掲,を参照）またはマウスα２ウイルスとPDI／βウイルス（同上）とを１：１または２：１の割合で用いた。感染の72時間後に細胞を回収し、0.01Mトリス（pH7.8）／0.1M NaCl／0.1Mグリセリン／10μMジチオトレイトール／0.1％Triton X-100中でホモジナイズし、遠心分離機にかけた。得られた上清をSDS／８％PAGEまたは非変性7 .5％PAGEで分析し、酵素活性についてアッセイした。細胞ペレットを１％SDSにさらに可溶化し、0.1％Triton X-100に可溶性で１％SDSに可溶性のタンパク質を、プロリル-4-ヒドロキシラーゼのα１サブユニットの減少下でSDS／PAGEで分析した［Veijolaら，前掲；Vuoriら，前掲；Johnら(1993)EMBO J．12:1587-95］。このポリペプチドは不溶性の凝集体を形成し、組換えマウスα２サブユニットを細胞ホモジネートから効率的に抽出するのには１％SDSを使用することが必要であった。実施例５：酵素活性アッセイプロリル-4-ヒドロキシラーゼ活性は、2-オキソＨ¹⁴Ｃ-グルタル酸の脱カルボキシル化をベースとする方法（KivirrikoおよびMyllyla（1982）Methods Enzymo l．82:245-304に開示）によりアッセイした。Ｋ_m値は、Myllylaら(1977)Eur．J ．Biochem．80:349-357に記載されているように、他の基質の濃度を一定に維持しながら固定濃度の第2の基質の存在下で１つの基質の濃度を様々に変えることにより求めた。マウス−ヒトII型またはヒトI型酵素を含有する細胞ホモジネートからの0.1％ Triton X-100抽出物を、2-オキソ［Ｉ¹⁴Ｃ］グルタル酸のヒドロキシル化と組合せた脱カルボキシル化をベースとするアッセイ（KivirikkoおよびMyllyla、前掲）により、プロリル-4-ヒドロキシラーゼ活性について分析した。両者の活性は非常に類似していた。マウス／ヒト２型酵素の活性がプロリル-4-ヒドロキシラーゼ活性であることを示すために、反応後に（Pro-Pro-gly）₁₀基質中の4-ヒドロキシプロリンの量を求めた。それらの値から、２型および１型酵素は非常に類似する挙動を示すこと、そして２型酵素の活性はまさにプロリル-4-ヒドロキシラーゼ活性であることが示された。表Ｉに示すように、Fe²⁺、2-オキソグルタル酸およびアスコルビン酸についてのＫ_m値およびピリジン-2,4-ジカルボン酸（2-オキソグルタル酸に対しては、競合阻害剤として作用する）についてのKi値は同様に、２つの酵素に対して非常に近いものであった。表Ｉヒト１型およびマウス／ヒト２型プロリル-4-ヒドロキシラーゼ四量体の補基質およびペプチド基質に対するＫ_m値および特定の阻害剤に対するＫ_i値＊ＩＣ₅₀として求めた値注目すべきことには、これらの値は、２型酵素がポリ（L-プロリン）により非常に高濃度においてのみ阻害されたという点ではっきりと異なっていた。これは、ポリ（L-プロリン）が、研究を行った全ての脊椎動物源に由来する１型プロリル-4-ヒドロキシラーゼに対しては十分に認められた有効な競合阻害剤であり、ポリ（L-プロリン）が、研究を行った全ての植物のプロリル-4-ヒドロキシラーゼに対しては有効なポリペプチド基質であるからである。そのような知見は予想外であった。したがって、各種プロリル-4-ヒドロキシラーゼのペプチド結合部位の構造間には明瞭な差異が存在すると思われるが、この点については現在のところ詳細なデータは得られていない。実施例６：マウスα２サブユニットおよび活性マウスα２PDI／β酵素四量体の昆虫細胞における発現マウスα２サブユニットとヒトPDI／βサブユニットとの会合(association)が達成できるかどうかを調べるために、昆虫細胞を、２つのポリペプチドをコードする２つの組換えウイルスで同時感染させた。ハイブリッドタンパク質を形成し、これは非変性条件下で行われたPAGEによって示されるように0.1％Triton X-10 0を含む緩衝液に可溶性であった。単独で発現させたマウスα２サブユニットからは、同じ条件下で抽出可能な組換えタンパク質（本明細書中では１型四量体と呼ぶ）は得られず、このことは、ハイブリッドタンパク質がα₂β₂四量体（２型四量体と呼ぶ）である可能性があることを示している。α２およびα１サブユニットとPDI／βサブユニットが会合して四量体となる点において違いは全く見られなかった。形成されたハイブリッドタンパク質がヒトPDI／βサブユニットを含むことを証明するために、ウエスタンブロッティングを行った。マウスα２サブユニットをヒトPDI／βサブユニットと共に発現させた場合、タンパク質複合体はPDI／βサブユニットを含んでいた。実施例７：ヒトα２サブユニット遺伝子の単離および配列決定先に特性決定されたヒト・プロリル-4-ヒドロキシラーゼαサブユニットｃＤＮＡ配列に対応する³²Ｐ標識しニックトランスレーションしたＰＣＲ断片を含むプローブを用いて、ヒト肺繊維芽細胞ゲノムライブラリー［λFIXベクター（Str atagene）でクローニングした］およびヒト第5染色体ライブラリー［λベクター Charon40（ATCC）でクローニングした］をスクリーニングした。ヒト肺繊維芽細胞ライブラリーとヒト第5染色体ライブラリーの両方から選られる陽性のクローンを同定し、単離し、サザンブロッティングで分析した。さらに分析するために、適切な断片をpSP72ベクター（Promega）にサブクローニングした。ヒト肺繊維芽細胞ゲノムライブラリーから５つの陽性のクローン（GL-2、GL-5 、GL-20、GL-141およびGL-142と命名）が得られた。これらのクローンの中の２つGL-2およびGL-141は同一であった。プロリル-4-ヒドロキシラーゼのα２サブユニットをコードする遺伝子の５’末端および３’末端の遺伝子に対応するクローンは得られなかった。ヒト第5染色体ライブラリーを、２つの別のプローブを用いて２回スクリーニングした。第１のプローブは、プロリル-4-ヒドロキシラーゼのα２サブユニットの先に特性決定されたｃＤＮＡ配列の５’末端に対応するものであった。第2 のプローブは、同じｃＤＮＡ配列の３’末端に対応するものであった。GL-3、GL -4、GL-9、GL-11、GL-11BおよびGL-156を含む幾つかの陽性クローンが得られた。GL-3、GL-4、GL-9およびGL-11Bは該タンパク質の５’末端に対応していた。タンパク質クローンGL-11AおよびGL-156の３’末端に対応するGL-11AおよびGL-156 は同一であることがわかった。上記遺伝子に対応する誘導配列は大きさが30kbよりも大きく、15のエキソンを含んでいる。単独でタンパク質配列をコードするエキソンは54〜240塩基対と様々であり、イントロンは241〜少なくとも3200塩基対と様々である（図２〜９参照）。 α１サブユニットの遺伝子配列と比較したところ、α２サブユニットのたった１つのエキソンがα１サブユニット遺伝子の２つの互いに排他的なスプライスエキソンに対応している（α１サブユニット遺伝子のEXON9）。推定アミノ酸配列は既知のα(1)サブユニットに対して63％の相同性がある。実施例８：プロリル-4-ヒドロキラーゼのヒトα２サブユニットの昆虫細胞における発現実施例３、４および６の方法を用いて、プロリル-4-ヒドロキシラーゼのα２サブユニットのイソ型を発現させ、分析した。昆虫細胞における発現データから、該α２サブユニットのイソ型がヒトβサブユニットと共に活性２型プロリル-4 -ヒドロキシラーゼα₂β₂四量体を形成することが示された。上記の記載から、本明細書中に示し記載したもの以外にも本発明の種々の改変が当業者には明らかであろう。そのような改変は添付の請求の範囲の範疇内であるとする。さらに、ヌクレオチドに対して与えられる全ての塩基対の大きさが近似的なものであり説明のために用いられていると理解すべきである。本明細書中に引用されている全ての参考文献はそれらの全文を参考として本明細書に組み入れるものとする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＣＣ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:01） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者ヘラアコスキー，タルジャアイ. フィンランド国エフアイエヌ―90560 オウルタイイリッジェ 17 ビー 15 (72)発明者アンヌネン，ピアピー. フィンランド国エフアイエヌ―90230 オウルバルリンクジャ１シー 34 (72)発明者ニッシ，リトヴァケイ. フィンランド国エフアイエヌ―90100 オウルバイッキーラ２ビー 236 (72)発明者ノケライネン，ミンナケー. フィンランド国エフアイエヌ―90570 オウルカレルボンティエ５ディー11

Claims

【特許請求の範囲】１．プロリル-4-ヒドロキシラーゼのαサブユニットのヒト・イソ型からなるポリペプチド。２．プロリル-4-ヒドロキシラーゼのαサブユニットがα２サブユニットである、請求項１に記載のポリペプチド。３．前記ポリペプチドのアミノ酸配列が、 (a)配列番号３のアミノ酸配列、 (b)配列番号３のアミノ酸配列の断片をコードするアミノ酸配列、または (c)配列番号３のアミノ酸配列の誘導体をコードするアミノ酸配列、を含んでなる、請求項２に記載のポリペプチド。４．プロリル-4-ヒドロキシラーゼのヒトα２サブユニットをコードするヌクレオチド配列を含んでなるヌクレオチド配列。５．前記ヌクレオチド配列が、 (a)配列番号３のヌクレオチド配列、 (b)ストリンジェントな条件下で配列番号３の配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列、または (c)(a)もしくは(b)のヌクレオチド配列に対して縮重しているヌクレオチド配列、を含んでなる、請求項４に記載のヌクレオチド配列。６．請求項４に記載のヌクレオチド配列を含有する発現ベクター。７．プロリル-4-ヒドロキシラーゼのβサブユニットをコードするヌクレオチド配列をさらに含有する、請求項６に記載の発現ベクター。８．請求項４に記載のヌクレオチド配列を含有する発現ベクターで感染、形質転換またはトランスフェクションされた宿主細胞。９．プロリル-4-ヒドロキシラーゼのβサブユニットをコードするヌクレオチド配列を含有する発現ベクターでさらに感染、形質転換まだはトランスフェクションされている、請求項８に記載の宿主細胞。 10．コラーゲンをコードするヌクレオチド配列を１以上含有する発現ベクターでさらに感染、形質転換またはトランスフェクションされている、請求項８に記載の宿主細胞。 11．昆虫細胞、酵母、細菌細胞、植物細胞または哺乳動物細胞よりなる群から選択される、請求項８に記載の宿主細胞。 12．プロリル-4-ヒドロキシラーゼのα２サブユニットの生産方法であって、 (a)プロリル-4-ヒドロキシラーゼのα２サブユニットをコードするヌクレオチド配列を含有する発現ベクターで感染、形質転換またはトランスフェクションされた宿主細胞を培養し、 (b)プロリル-4-ヒドロキシラーゼのα２サブユニットを単離する、ことを含んでなる方法。 13．プロリル-4-ヒドロキシラーゼの生産方法であって、 (a)(i)プロリル-4-ヒドロキシラーゼのα２サブユニットをコードするヌクレオチド配列を含有する発現ベクターと、(ii)プロリル-4-ヒドロキシラーゼのβ サブユニットをコードするヌクレオチド配列を含有する発現ベクターとで感染、形質転換またはトランスフェクションされた宿主細胞を、α₂β₂四量体を形成する条件下で培養し、 (b)該α₂β₂四量体を単離する、ことを含んでなる方法。