KR20000005374A - 프로릴-4-하이드록실라제 α2 소단위, 이를 인코드하는 서열 및이를 생산하는 방법 - Google Patents

프로릴-4-하이드록실라제 α2 소단위, 이를 인코드하는 서열 및이를 생산하는 방법

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KR20000005374A
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카리 아이. 키비리코
타이나 에이. 피할자니에미
타르자 아이. 헬라코스키
피아 피. 안-누넨
리트바 케이. 니시
미나 케이. 노겔라넨
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네프 토마스
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Abstract

본 발명은 프로릴-4-하이드록실라제 α 소단위의 신규한 동소체, 이와 같은 신규한 단백질을 인코드하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 이와 같은 단백질을 만드는 방법에 관계한다.

Description

프로릴-4-하이드록실라제 α2 소단위, 이를 인코드하는 서열 및 이를 생산하는 방법
콜라겐에 대한 일반적인 정보
콜라겐 섬유, 프로테오글리칸 응집체 및 당단백질은 연골 세포외 매트릭스의 주요 성분으로써 집합적으로 관절운동 시에 발생하는 압박, 신장 및 전단력에 저항을 한다(Heinegard and Oldberg (1989) FASEB J. 3:2042-2051; Mayne and Brewton, Cartilage Degradation: Basic and Clinical Aspects (Woessner, J.F. and Howell, D.S., eds.) Marcel Dekker, Inc., New York, pp. 81-108 (1993). 이와 같은 다양한 매트릭스 성분의 생합성, 합체 또는 성분간의 상호작용에 영향을 주는 효소를 인코드하는 연골 매트릭스 유전자에 돌연변이가 있는 경우에 연골 매트릭스의 분해 및 정상적인 연골 기능을 상실하게 된다.
콜라겐 생산에서 프로릴-4-하이드록실라제의 기능
프로릴-4-하이드록실라제는 모든 콜라겐 합성에 중요한 역할을 한다. 특히, -Xaa-Pro-Bly-서열에 있는 프롤린 잔기의 하이드록실화에 의해 콜라겐과 관련 단백질에서 4-하이드록시프롤린의 형성을 효소가 촉매한다. 이와 같은 4-하이드록시프롤린 잔기는 새로 합성된 콜라겐 폴리펩티드 사슬을 3중-나선 분자로 폴딩하는데 필수적이다.
척추동물의 프로릴-4-하이드록실라제는 α2β24량체로써 α소단위는 촉매부위의 대부분을 차지한다(Kivirikko, et al., (1989) FASEB J. 3, 1609-1617; Kivirikko, et al., (1990) Ann. N.Y. Acad. Sci. 580, 132-142; Kivirikko, et al., (1992), Post Translational Modifications of Proteins, eds. Harding, J.J. & Crabbe, M.J.C. (CRC, Boca Raton, FL), pp. 1-51. β소단위는 다양한 원으로부터 클론되었고(Noiva1 and Lennatz, (1992) J. Biol. Chem. 267:6447-49; Freedman, et al., (1994) Trends Biochem. Sci. 19:331-336)), 효소 단백질 디설파이드-이소메라제(Pihlajaniemi, et al. (1987) EMBO J. 6:643-649; Kojvu, et al., (1987) J. Biol. Chem. 262:6447-49); 세포 흉선 호르몬-결합 단백질(Cheng, et al., (1987) J. Biol. Chem. 262:11221-27); 마이크로좀 트리아실글리세롤 전이 단백질(Wetterau, et al., (1990) J. Biol. Chem. 265:9800-07); 다양한 펩티드에 유일하게 결합하는 내질 세망 루미날 폴리펩티드(Freedman, supra; Noiva et al.,(1991) J. Bio. Chem. 266:19645-649; Noiva et al.,(1993) J. Niol. Chem. 268:19210-217)와 동일한 매우 특이한 다기능성 폴리펩티드임이 밝혀졌다.
α1 소단위로 지칭하는 촉매적으로 중요한 α 소단위는 사람(Helaakoski et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 86:4392-96); 병아리(Bassuk, et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 86:7382-886); 카에노르하비디티스 엘레간스(Caenorhabditis elegans)(Veijola et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:26746-753)로부터 클론하였고 이의 RNA 전사체는 두 개의 연속하는 동질성 71-bp 엑손 (Helaakoski, supra; Helaakoski, et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:27847-854)가 인코드된 서열로 잘라지게 된다. α2 소단위로 지칭되는 두 번째 α 소단위는 쥐에서 이미 수득하였다(Helaakoski et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 92:4427-4431.
발명의 요약
본 발명은 사람 프로릴-4-하이드록실라제 α 소단위 동소체를 클로닝하고 특징을 조사하는 것에 관계한다. 좀 더 구체적으로는 본 발명은 α2로 지칭된 프로릴-4-하이드록실라제 α 소단위의 사람 소단위 동소체와 이들을 인코드하는 폴리뉴클레오티드 서열에 관계한다. 여기에서는 또한 프로릴-4-하이드록실라제, 프로릴-4-하이드록실라제와 콜라겐의 α2 소단위를 생산하는 방법에 대해 상술하고 있는데 이때 프로릴-4-하이드록실라제는 본 발명의 α2 소단위로 구성되고 상기 콜라겐은 이와 같은 프로릴-4-하이드록실라제에 의해 적절한 형으로 프로세스된다. 본 발명에 따르면, 청구하는 프로릴-4-하이드록실라제의 α2 소단위의 아미노산 서열을 인코드하는 임의 뉴클레오티드 서열을 이용하여 사람 프로릴-4-하이드록실라제를 발현하는 재조합 분자를 만들 수 있다.
본 발명은 또한 적절한 숙주 세포로 형질변환시키는데 이용할 수 있는 발현 벡터를 만들기 위해 프로릴-4-하이드록실라제의 α2 소단위의 코딩 서열을 이용한다. 본 발명의 숙주세포를 유도하여 코딩 서열을 발현시켜 프로릴-4-하이드록실라제의 α2 소단위를 만들고, 좀더 일반적으로는 β소단위와 복합된 프로릴-4-하이드록실라제를 만든다.
본 발명은 신규한 프로릴-4-하이드록실라제 α 소단위와 이의 변이체의 동정 및 특성조사, 프로릴-4-하이드록실라제의 α2 소단위를 인코드하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 이와 같은 신규한 폴리뉴클레오티드와 폴리펩티드를 만드는 방법과 이를 이용하는 방법에 관계한다. 본 발명은 활성이 있는 (1) 프로릴-4-하이드록실라제 또는 이의 변이체 및 (2) 본 발명에 따른 사람의 프로릴-4-하이드록실라제 α 소단위로 구성된 콜라겐의 재조합 생산에 관계한다.
본 발명은 좀더 구체적으로는 "α2 소단위"로 지칭한 프로릴-4-하이드록실라제 α 소단위의 신규한 동소체 및 이의 변이체를 인코드하는 폴리뉴클레오티드에 관게하고, 이와 같은 동소체 또는 연관 유도체를 만드는 방법 및 재조합 콜라겐을 생산하는데 이와 같은 단백질 및 폴리뉴클레오티드를 이용하는 방법에 관계한다.
도 1은 쥐의 프로릴-4-하이드록실라제 α(2) 소단위의 뉴클레오티드(SEQ ID No.1; 서열 1)과 유추한 아미노산 서열(SEQ ID No;2)를 제시한 것이다.
도 2a, 2b, 2c, 2d, 2e는 cDNA 클론에서 유도된 것으로 사람 프로릴-4-하이드록실라제 α(2) 소단위의 뉴클레오티드(SEQ ID No.3; 서열 3)과 유추한 아미노산 서열(SEQ ID No;4)를 제시한 것이다.
도 2a는 1부터 378까지의 엑손 2, 3, 4를 포함하는(화살표로 표시함)뉴클레오티드(SEQ ID No;5; 서열 5)를 제시하고 이들의 파라메터를 확인한다.
도 2b는 379부터 864까지의 엑손 5, 6을 포함하는(화살표로 표시함)뉴클레오티드(SEQ ID No;6; 서열 6)를 제시하고 이들의 파라메터를 확인한다.
도 2c는 865부터 1350까지의 엑손 7, 8, 9, 10, 11을 포함하는(화살표로 표시함)뉴클레오티드(SEQ ID No;7; 서열 7)를 제시하고 이들의 파라메터를 확인한다.
도 2d는 1351부터 1890까지의 엑손 12, 13, 14, 15, 16를 포함하는(화살표로 표시함)뉴클레오티드(SEQ ID No;8; 서열 8)를 제시하고 이들의 파라메터를 확인한다.
도 2e는 1891부터 2207까지의 뉴클레오티드(SEQ ID No;9; 서열 9)를 제시하고 이들의 파라메터를 확인한다.
도 3은 엑손 2(도 2에서 확인함)와 인접하는 인트론 서열의 뉴클레오티드(SEQ ID No;10, 서열 10)와 유추한 아미노산 서열(SEQ ID No;11, 서열 11)을 제시한다.
도 4은 엑손 3(도 2에서 확인함)와 인접하는 인트론 서열의 뉴클레오티드(SEQ ID No;12, 서열 12)와 유추한 아미노산 서열(SEQ ID No;13, 서열 13)을 제시한다.
도 5는 엑손 4(도 2에서 확인함)와 인접하는 인트론 서열의 뉴클레오티드(SEQ ID No;14, 서열 14)와 유추한 아미노산 서열(SEQ ID No;15, 서열 15)을 제시한다.
도 6은 엑손 5(도 2에서 확인함)와 인접하는 인트론 서열의 뉴클레오티드(SEQ ID No;16, 서열 16)와 유추한 아미노산 서열(SEQ ID No;17, 서열 17)을 제시한다.
도 7은 엑손 6(도 2에서 확인함)와 인접하는 인트론 서열의 뉴클레오티드(SEQ ID No;18, 서열 18)와 유추한 아미노산 서열(SEQ ID No;19, 서열 19)을 제시한다.
도 8a와 8b는 엑손 7(도 2에서 확인함)와 인접하는 인트론 서열의 뉴클레오티드(SEQ ID No;20, 서열 20)와 유추한 아미노산 서열(SEQ ID No;21, 서열 21)을 제시한다.
도 8a는 1부터 480까지의 뉴클레오티드(SEQ ID No;22, 서열 22)를 나타내고
도 8b는 481부터 엑손의 3'-단부까지의 뉴클레오티드(SEQ ID No;23. 서열 23)을 나타낸다.
도 9a, 9b, 9c, 9d는 엑손 8(도 2에서 확인함)와 인접하는 인트론 서열의 뉴클레오티드(SEQ ID No;24, 서열 24)와 유추한 아미노산 서열(SEQ ID No;25, 서열 25)을 제시한다.
도 9a는 1부터 480까지의 뉴클레오티드(SEQ ID No;26, 서열 26)를 나타내고;
도 9b는 481부터 1140까지의 뉴클레오티드(SEQ ID No;27, 서열 27)를 나타내고;
도 9c는 1141부터 1800까지의 뉴클레오티드(SEQ ID No;28, 서열 28)를 나타내고;
도 9d는 1801부터 엑손의 3'-단부까지의 뉴클레오티드(SEQ ID No;29. 서열 23)을 나타낸다.
본 발명은 사람의 프로릴-4-하이드록실라제 α2 소단위와 프로릴-4-하이드록실라제의 α2 소단위와 이들의 유도체를 인코드하는 핵산 서열에 관계한다. 본 발명에 따르면, 청구하고 있는 사람의 프로릴-4-하이드록실라제 α2 소단위의 아미노산 서열을 인코드하는 임의 뉴클레오티드 서열을 이용하여 프로릴-4-하이드록실라제를 직접 발현할 수 있는 재조합 분자를 만든다. 또한 본 발명의 범위에는 프로릴-4-하이드록실라제 α2 소단위를 만들고 이용하는 방법이 포함된다.
A. 정의
"프로릴-4-하이드록실라제 α2 소단위"는 단일 유전자에 의해 인코드된 사람의 프로릴-4-하이드록실라제 α 소단위의 동소체와 결손 유도체, 보존성 치환체를 포함하는 유도체를 포함한다.
"활성이 있는 사람의 프로릴-4-하이드록실라제"는 단백질 복합체로써 프로릴-4-하이드록실라제 α2β24량체로 구성되고 이는 재조합에 의해서 생산될 수 있다.
여기에서 언급한 하이브리드 조건에서 "엄격한 조건"이란 (1) 세척시에 낮은 이온 강도와 고온을 이용하고 가령, 50℃에서 0.015M NaCl/0.0015 M 시트레이트 나트륨/0.1% SDS; (2) 하이브리드하는 동안에 포름아미드와 같은 변성제를 이용하는데 가령, 50%(v/v) 포름아미드와 0.1% 소 혈청 알부민/0.1% Ficoll/0.1% 폴리비닐피롤리돈/50mM 인산 나트륨 완충액 pH 6.5+750mM NaCl, 75mM 시트레이트 나트륨 42℃; (3) 50% 포름아미드, 5x SSC(0.75M NaCl, 0.075M 시트레이트 나트륨) 5x Denhardt's 용액, 초음파파쇄된 연어 정자 DNA(50g/㎖), 0.1% SDS, 10% 덱스트란 설페이트 42℃, 42℃에서 0.2x SSC와 0.1% SDS로 세척한다.
프로릴-4-하이드록실라제에 연관하여 "정제된"이란 지적한 분자가 다른 생물학적 거대분자 가령, 폴리뉴클레오티드, 단백질 등을 포함하지 않는다는 것을 말한다. 여기에서 사용된 "정제된"이란 적절하게는 지적한 생불학적 거대분자가 중량의 적어도 95%, 더욱 적절하게는 적어도 99.8%(wt)를 말한다(단, 물, 완충액 및 다른 작은 분자 특히, 분자량이 1000달톤이하인 분자는 존재할 수 있다).
단백질 분자를 언급하면서 "분리된"이란 용어는 단백질원료에 있는 다른 단백질로부터 분리한 단백질 뿐만 아니라 용매, 완충액, 이온 또는 동일한 용액에 있을 수 있는 다른 성분에서 발견되는 단백질로부터 분리된 것을 말한다. "분리된" 또는 "정제된"는 이들의 천연 원료에 있는 단백질을 포함하지는 않는다.
본 발명의 프로릴-4-하이드록실라제 α2 소단위의 발현
(1) 코딩 서열
본 발명에 따르면, 사람의 프로릴-4-하이드록실라제 α2 소단위 동소체 또는 이의 기능적인 등가체를 인코드하는 폴리뉴클레오티드 서열을 이용하여 사람의 프로릴-4-하이드록실라제 α2 소단위를 적절한 숙주세포에서 직접 발현할 수 있는 재조합 DNA 분자를 만드는데, 이때 프로릴-4-하이드록실라제는 프로릴-4-하이드록실라제의 α2 소단위 또는 이의 기능적 등가체로 구성된다. 프로릴-4-하이드록실라제 α2 소단위 및 이와 같은 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 상보체의 일부분에 선택적으로 하이브리드할 수 있는 다른 폴리뉴클레오티드의 서열은 핵산 하이브리드반응 검사, 서던 및 노던 블랏 분석등에 이용한다.
유전자 암호가 원래 축중성질을 가지기 때문에, 실제 동일한 또는 기능적으로 등가의 아미노산 서열을 인코드하는 다른 핵산 서열을 본 발명을 실행하는데 이용하여 프로릴-4-하이드록실라제 α2 소단위의 클로닝과 발현을 시킬 수 있다. 이와 같은 핵산 서열에는 엄격한 조건하에 프로릴-4-하이드록실라제 α2 소단위에 하이브리드할 수 있는 것들도 포함된다.
본 발명에는 또 다른 서열이 포함되는데 여기에는 결손, 추가 또는 다른 핵산으로 치환된 핵산 서열을 포함하는데 이와 같은 결손, 추가 치환되어도 동일한 또는 기능적으로 등가의 유전자 산물을 만든다. 핵산 생성물 자체에 프로릴-4-하이드록실라제 α2 소단위내에 있는 아미노산 잔기의 결손, 추가 및 치환되어 침묵돌연변이가 되어 기능적으로 등가의 α2 소단위를 생성하게 된다. 이와 같은 아미노산 치환체는 관련된 아미노산의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및 양쪽성 성질의 유사성에 기초하여 이루어진다. 가령, 음전하를 뛴 아미노산에는 아스파르트산과 글루타민산을 포함하고; 양전하를 뛴 아미노산에는 리신, 아르기닌을 포함하고; 전하를 띄지 않는 유사한 친수성 값을 가지는 극성 머리기가 있는 아미노산은 다음과 같이 나눌 수 있다; 루이신, 이소루이신, 발린; 글리신, 알라닌; 아스파라진, 글루타민; 세린, 트레오닌; 페닐알라닌, 티로신.
본 발명의 핵산 서열을 만들어 다양한 단부를 가지는 변이체의 프로릴-4-하이드록실라제 α2 소단위를 만들 수 있는데 이는 프로세싱 및 유전자 생성물의 발현을 변경시키는 변화 등을 포함한다. 가령, 또 다른 분비 시그날을 사람의 고유 분지 시그날에 대체시키거나 부위-직접적인 돌연변이와 같은 공지의 기술을 이용하여 돌연변이를 만들어 새로운 제한효소 절단부위를 삽입함으로써 글리코실화반응, 포스포릴화반응 등을 변경시킨다.
또한, 사람이 아닌 세포에서 발현할 때, 본 발명의 프로릴-4-하이드록실라제를 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 변형시켜 특정 숙주 유기체의 선호적인 코드에 적응하도록 한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서는 공지의 화학적인 방법을 이용하여 본 발명의 프로릴-4-하이드록실라제 α2 소단위의 코딩 서열의 일부 또는 전부를 합성한다(Caruthers et al., Nuc. Acids Res. Symp. Ser. 7:215-233 (1980); Crea and Horn, Nuc. Acids Res. 9(10):2331 (1980); Matteucci and Caruthers, Tetrahedron Letters 21:719 (1980); and Chow and Kempe, Nuc. Acids Res. 9(12):2807-2817 (1981). 또는 화학적 방법을 이용하여 단백질 자체를 만들 수 있는데 적어도 부분적으로 원하는 α2 소단위 아미노산 서열을 합성할 수 있다. 가령, 고형상 기술에 의해 펩티드를 합성하고, 수지에서 분리하여, 준비한 HPLC에의해 정제한다(Creighton, Proteins Structures And Molecular Principles, W.H. Freeman and Co., N.Y., pp. 50-60 (1983). 합성된 펩티드의 조성은 아미노산 분석 또는 서열화에 의해 확인할 수 있다(Edman degradation procedure; see Creighton, Proteins, Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman and Co., N.Y., pp. 34-49 (1983).
본 발명의 프로릴-4-하이드록실라제 α2 소단위를 발현시키기 위해서는 프로릴-4-하이드록실라제 α2 소단위를 인코드하는 핵산 서열 또는 이의 기능적인 등가체를 적절한 발현 벡터에 삽입하고, 이때 벡터는 삽입된 코딩 서열의 전사 및 해독을 위한 필수 성분을 포함한다.
(2) 발현 시스템
본 기술분야에 공지의 방법을 이용하여 프로릴-4-하이드록실라제와 적절한 전사/해독 조절 시그날에 대한 프로릴-4-하이드록실라제 α2 소단위 코딩 서열을 포함하는 발현 벡터를 만든다. 이 방법에는 in vitro 재조합 DNA 기술, 합성기술 및 in vivo 재조합 기술 등을 포함한다(Maniatis et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989) and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989).
프로릴-4-하이드록실라제 α2 소단위의 코딩 서열을 발현시키는데에는 다양한 숙주-발현 벡터 시스템을 이용할 수 있다. 여기에는 프로릴-4-하이드록실라제 α2 소단위의 코딩 서열을 포함하는 재조합 박테리오파아지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질변환된 박테리아와 같은 미생물; 프로릴-4-하이드록실라제 α2 소단위의 코딩 서열을 포함하는 재조합 이스트 벡터로 형질변환된 이스트; 프로릴-4-하이드록실라제 α2 소단위의 코딩 서열을 포함하는 재조합 바이러스 발현 벡터(가령, 베큘로바이러스)에 형질 감염된 곤충 세포 시스템; 프로릴-4-하이드록실라제 α2 소단위의 코딩 서열을 포함하는 재조합 바이러스 발현 벡터(가령, 양배추 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV)에 형질감염된 식물 또는 프로릴-4-하이드록실라제 α2 소단위의 코딩 서열을 포함하는 재조합 플라스미드 발현 벡터(가령, Ti 플라스미드)에 형질감염된 식물; 또는 적절한 벡터 가령, 세미리키 포르세트 바이러스(semliki forest virus)에 감염된 동물 세포 시스템을 포함하나 이에 국한시키지 않는다.
또는 유전자 전이된 사람이 아닌 동물에서 프로릴-4-하이드록실라제 α2 소단위를 발현시킬 수 있는데, 이때 원하는 효소 생성물은 유전자전이된 동물의 젖에서 회수할 수 있다. 이와 같은 시스템의 발현 요소들은 이들의 강도 및 특이성이 다양하다. 이용되는 숙주/벡터 시스템에 따라, 구성 프로모터 또는 유도성 프로모터를 포함하는 적절한 전사 및 해독 요소들중 임의의 것을 이용한다. 가령, 박테리아 시스템에 클로닝하였을 경우에, 박테리오파아지 λ의 pL, plac, ptrp, ptac(ptrp-lac 하이브리드 프로모터) 및 이와 유사한 유도성 프로모터를 이용하고; 곤충 세포 시스템에 클로닝할 경우에, 베큘로바이러스 폴리헤드론 프로모터와 같은 프로모터를 이용하고; 식물 세포 시스템에 클로닝하였을 경우에 식물 세포 게놈으로부터 유도된 프로모터(가령, 열 쇼크 프로모터; RUBISCO의 소단위 프로모터; 클로로필 a/b 결합 단백질의 프로모터) 또는 식물 바이러스(가령, CaMV의 35S RNA 프로모터; TMV의 피복 단백질 프로모터)를 이용할 수 있고; 포유류 세포 시스템에 클로닝하였을 경우에 포유류 세포의 게놈에서 유도한 프로모터(가령, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유류 바이러스에서 유도한 프로모터(가령, 아데노바이러스 후기 프로모터; 벡시니아 바이러스 7.5K 프로모터)를 이용할 수 있고; 프로릴-4-하이드록실라제 DNA α2 소단위 다수 복사체를 포함하는 세포주를 만들 때에는 SV40-, BPV- 및 EBV-계 벡터를 적절한 선택성 표식과 함께 이용할 수 있다.
박테리아 시스템에서 발현된 프로릴-4-하이드록실라제 α2 소단위의 원하는 용도에 따라 다수의 발현 벡터에서 선택할 수 있다. 가령, 다량의 폴리펩티드를 생산하고자 할 경우에, 바로 정제할 수 있는 단백질 생성물 다량을 직접 발현할 수 있는 벡터가 바람직하다. 이와 같은 벡터에는 대장균(E. coli) 발현 벡터 pUR278(Ruther et al., EMBO J. 2:1791(1983))을 포함하는데, 이때 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 lac Z 코딩 부분과 함께 벡터에 결찰시켜 하이브리드 AS-lac Z 단백질을 반든다; pIN 벡터(Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109 (1985); Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 264:5503-5509 (1989). pGEX 벡터는 글루타티온 S-트란스퍼라제(GST)와 같은 단백질로써 외부 폴리펩티드를 발현시키는데 이용한다. 일반적으로, 이와 같은 단백질은 가용성이고 글루타티온-아가로즈 비드에 흡착시키고 글루타티온 존재 하에 용출시켜 용해된 세포로부터 용이하게 분리할 수 있다. pGEX 벡터에는 트롬빈 또는 인자 Xa 프로테아제 절단 부위를 가지도록 만들어 원하는 클론된 폴리펩티드를 GST에서 방출하도록 한다.
적절한 발현 시스템은 이스트 발현 시스템이다. 이스트에서는 구조 또는 유도성 프로모터를 포함하는 다수의 벡터를 이용할 수 있다(참고 Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Ed. Ausubel et al., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, Ch. 13 (1988); Grant et al., Expression and Secretion Vectors for Yeast, in Methods in Enzymology, Ed. Wu & Grossman, Acad. Press, N.Y. 153:516-544 (1987); Glover, DNA Cloning, Vol. II, IRL Press, Wash., D.C., Ch. 3 (1986); and Bitter, Heterologous Gene Expression in Yeast, Methods in Enzymology, Eds. Berger & Kimmel, Acad. Press, N.Y. 152:673-684 (1987); and The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Eds. Strathern et al., Cold Spring Harbor Press, Vols. I and II (1982).
본 발명의 단백질의 클로닝과 발현에 유용한 특히 적절한 시스템은 이스트의 피키아(Pichia)를 숙주세포로 이용하는 것이다. 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)와 같은 사카로마이세스계가 아닌 이스트 종은 대규모로 재조합 단백질을 만들 때 수득률이 많다는 장점이 있다. 또한, 피키아(Pichia) 발현 키트는 Invitrogen Corporation(San Diego, CA)에서 구할 수 있다.
피키아 파스토리스(Pichia pastoris)와 같은 메틸요구성 이스트에서 메탄올 반응성 유전자가 다수 있는데 이들의 발현은 메탄올 반응성 조절 부위(프로모터)에의해 조절된다. 이와 같은 임의 메탄올 반응성 프로모터는 본 발명을 실행하는데 유용하다. 특정 조절 부위의 예로는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) AOX1의 제 1 알코올 산화효소 유전자의 프로모터, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) AOX2의 제 2 알코올 산화효소 유전자의 프로모터, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)의 디하이드록시아세톤 합성 효소(DAS) 유전자의 프로모터, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)의 P40의 프로모터, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)의 촉매효소 유전자의 프로모터 등을 포함한다.
매우 엄격하게 제어된 AOX1의 프로모터에의해 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)에서 일반적으로 발현시킬 수 있다(Ellis et al., Mol. Cell, Biol. 5:1111 (1985) and U.S. Patent No. 4,855,231. 이와 같은 프로모터를 유도하여 배양물에 메탄올을 첨가한 후에 재조합 단백질을 다량 생산할 수 있다. 동일한 세포를 연속하여 조절함으로써 여기에서 상술하고 있는 프로릴-4-하이드록실라제 α2 소단위에 대한 유전자를 발현시킬 수 있는데 이때 조건은 본 발명의 프로릴-4-하이드록실라제에 의해 재조합 콜라겐 단백질이 적절하게 하이드록실화되어 섬유를 만드는데 콜라겐의 정상적인 생물학적 기능에 요구되는 안정한 나선으로 폴딩할 수 있는 조건하에 발현된다.
또 다른 적절한 이스트 발현 시스템은 메틸요구성 이스트 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)를 이용하는 것이다. 메탄올에서 생장시키면, 메탄올 대사에 중요한 효소 즉 MOX(메탄올 산화효소), DAS(디하이드록시아세톤 합성효소), FMHD(개미산 탈수소효소)를 유도하게 된다. 이들 효소들은 총 세포 단백질의 최고 30-40%로 구성된다. MOX, DAS, FMDH 생산을 인코드하는 유전자는 메탄올하에서는 생장이 유도되고 포도당하에서는 생장이 억제되는 매우 강력한 프로모터에 의해 조절을 받는다. 이들 세 가지 프로모터 또는 임의 프로모터를 이용하여 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)에서 이질성 핵산 서열을 다량 발현시킬 수 있다. 본 발명의 프로릴-4-하이드록실라제 α2 소단위를 인코드하는 핵산 서열은 유도성 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha) 프로모터의 조절하에 적절한 발현 벡터에 클론시킨다. 생성물의 분지가 바람직한 경우에, 이스트에서 분비를 위한 시그날 서열을 인코드하는 폴리펩티드 가령, S. 세르비시에(S. cerevisiae) prepro-메이팅 인자 α1을 본 발명의 프로릴-4-하이드록실라제 α2 소단위의 코딩 서열과 동일한 프레임에 융합시킨다. 발현 벡터에는 적절하게는 URA3 또는 LEU2와 같은 영양 요구성 표식 유전자를 포함할 수 있는데 이는 영양요구성 숙주의 결함을 보충할 수 있다.
그다음 발현 벡터를 이용하여 당 분야에 공지의 기술을 이용하여 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha) 숙주세포를 형질 변환시킬 수 있다. 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)형질변환의 흥미롭고 유익한 특징은 게놈 안으로 발현 벡터를 최고 100개까지 자발적으로 삽입할 수 있다는 것이다. 대부분의 경우에 통합된 DNA는 머리-꼬리 배열을 나타내는 다량체를 형성한다. 삽입된 외부 DNA는 여러 가지 재조합 균주에서 비록 비선택적인 조건하에서도 유사분열에 안정한 것으로 나타났다. 이와 같은 여러 복사체를 삽입하는 현상은 시스템의 높은 생산성에 도움이 된다.
식물 발현 벡터를 이용한 경우에 본 발명의 α2 소단위를 인코드하는 서열의 발현은 임의 다수의 프로모터에 의해 이루어질 수 있다. 가령, CaMV의 35S RNA와 19S RNA 프로모터(Brisson et al., Nature 310:511-514 (1984)와 TMV의 피복 단백질 프로모터(Takamatsu et al., EMBO J. 6:307-311 (1987)와 같은 바이러스 프로모터를 이용할 수 있고; 또는 RUBISCO 소단위(Coruzzi et al., EMBO J. 3:1671-1680 (1984); Broglie et al., Science 224:838-843 (1984) 또는 열 쇼크 프로모터 가령, 콩 hsp17.5-E 또는 hsp17.3-B(Gurley et al., Mol. Cell. Biol. 6:559-565 (1986)와 같은 식물 프로모터를 이용할 수 있다. 이와 같은 구조는 Ti 플라스미드, Ri 프랄스미드, 식물 바이러스 벡터, 직접 DNA 형질도입, 마이크로인젝션, 전기천공 등을 이용하여 식물 세포안으로 유도할 수 있다(이와 같은 기술은 다음의 문헌 참조 Weissbach & Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Section VIII, pp. 421-463 (1988); and Grierson & Corey, Plant Molecular Biology, 2d Ed., Blackie, London, Ch. 7-9 (1988).
본 발명의 프로릴-4-하이드록실라제 α2 소단위를 발현시키는데 이용할 수 있는 또 다른 발현 시스템으로는 곤충 시스템이 있다. 이와 같은 시스템의 하나로, 외부 유전자를 발현시키는 벡터로 오토그라파 칼리포니카(Autographa californica) 핵 폴리히드로시스 바이러스(AcNPV)를 이용한다. 이 바이러스는 스포도프테라 푸루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포에서 생장한다. 본 발명의 프로릴-4-하이드록실라제 α2 소단위의 코딩 서열을 AcNPV 프로모터(가령 폴리헤드론 프로모터)의 제어하에서 바이러스의 비필수 부분(가령 폴리헤드론 유전자)에 클론시킨다. 프로릴-4-하이드록실라제 α2 소단위 코딩 서열을 성공적으로 삽입하면 폴리헤드론 유전자가 비활성화되고 닫히지 않은 재조합 바이러스(이는 폴리헤드론 유전자에의해 인코드되는 단백질로된 피복체가 없는 바이러스를 말함)가 생산된다. 이와 같은 재조합 바이러스를 이용하여 스포도프테라 푸루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포에 감염시키고 이 세포 안에서 삽입된 유전자가 발현된다(Smith et al., J. Virol. 46:584 (1983); Smith, U.S. Patent No. 4,215,051).
포유류 숙주세포에서, 다수의 바이러스계 발현 시스템을 이용할 수 있다. 아데노바이러스를 발현 벡터로 이용할 경우에 본 발명의 프로릴-4-하이드록실라제 α2 소단위의 코딩 서열을 아데노바이러스의 전사/해독 조절 복합체 가령, 후기 프로모터와 세 가지부분으로된 리더 서열에 결찰시킨다. 이 유전자를 그 다음 in vitro 또는 in vivo 재조합에 의해 아데노바이러스 게놈 안에 삽입한다. 바이러스 게놈의 비필수 부분(가령, E1 또는 E3 부분)에 삽입시키면 감염된 숙주에서 폴리펩티드를 발현시킬 수 있는 재조합 바이러스를 만든다(Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81:3655-3659 (1984). 또는 백시니아 7.5K 프로모터를 이용할 수 있다(Mackett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79:7415-7419 (1982); Mackett et al., J. Virol. 49:857-864 (1984); Panicali et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 79:4927-4931 (1982).
삽입된 프로릴-4-하이드록실라제 코딩 서열을 효과적으로 해독하기 위해서는 특정 개시 시그날이 필요하다. 이와 같은 시그날에는 ATG 코돈과 인접 서열을 포함한다. 고유의 개시 코돈과 인접 서열을 포함하는 전체 폴리펩티드 유전자의 경우에는 추가로 해독 조절 시그날이 필요하지는 않는다. 그러나, 코딩 서열의 일부분만을 삽입하는 경우에 ATG 개시 코돈을 포함하는 외부의 해독 조절 시그날이 제공되어야 한다. 또한, 전체 삽입체의 해독을 확실하게 하기 위해서는 개시 코돈이 프로릴-4-하이드록실라제 α2 소단위의 리딩 프레임에 있어야 한다. 이와 같은 외부 해독 조절 시그날과 개시 코돈은 천연 및 합성된 다양한 기원으로부터 얻을 수 있다. 적절한 전사 강화 요소, 전사 종료요소 등을 포함하는 경우에 발현의 효율을 강화시킬 수 있다(Bittner et al., Methods in Enzymol. 153:516-544 (1987).
본 발명의 프로릴-4-하이드록실라제 α2 소단위의 재조합에 의한 생산을 위한 한가지 적절한 발현 시스템은 유전자 전이된 사람이 아닌 동물인데, 이때 원하는 폴리펩티드는 유전자 전이된 동물의 젖에서 회수할 수 있다. 이와 같은 시스템은 표유류 선(腺)에서 발현에 영향을 줄 수 있는 선택적인 또는 다른 요구성 조절 서열에 본 발명의 α2 소단위를 인코드하는 DNA 서열에 연결하여 만든다. 유사하게, 요구성 또는 선택성 해독후 효소는 표적 세포에서 동시에 생산할 수 있는데 이때 미국 특허 08/037,728에서 상술하는 것과 같이 표적 우유 단백질을 만드는 포유류 선 세포에서 작용할 수 있는 적절한 발현 시스템을 이용한다.
우유에서 발현을 시키기 위해서는 선택된 프로모터는 알파 S1-카제인 또는 β-갈락토글로블린과 같은 풍부한 우유-특이적 단백질 중에 하나이다. 가령, 알파 S1-카제인의 5'와 3' 조절 서열을 사람 락토페린 cDNA의 발현에 성공적으로 이용하였고 유사하게, β-락토글로블린 프로모터가 양의 우유를 생산하는 세포에 사람 안티트립신 유전자 단편을 발현시키는데 영향을 주었다(Wright et al., Biotechnology 9:830-833 (1991). 유전자전이된 염소에서, 사람 조직 플라스미노겐 활성물질을 발현시키는데 유장 산 프로모터를 이용하여 유전자 전이된 동물의 우유에서 사람 조직 플라스미노겐 활성물질이 분비되게 하였다(Ebert et al., Biotechnology 9:835-838 (1991). 이와 같은 발현 시스템을 이용하면, 우유로 본 발명의 폴리펩티드를 분비하는 동물을 얻을 수 있다. 당분야에 공지된 기술을 이용하면, 원하는 프로릴-4-하이드록실라제 사슬을 인코드하는 유전자를 선택한 동물 종의 포유류 세포에서 기능을 하는 적절한 조절 서열에 간단하게 결찰시킬 수 있다. 프로릴-4-하이드록실라제 α2 소단위를 인코드하는 유전자의 발현 시스템을 비슷하게 만들 수 있다.
적절하게는, 본 발명의 프로릴-4-하이드록실라제는 분비된 단백질이다. 단백질의 발현을 위해 유전공학적으로 조작된 세포는 사람이 아닌 숙주세포인 경우 사람의 프로릴-4-하이드록실라제 단백질의 분비 시그날 펩디트를 숙주세포의 표적을 분비하는 기작에 더욱 효과적으로 인지되는 또 다른 분비 시그날 펩티드로 대체하는 것이 유리하다. 적절한 분비 시그날 서열은 특히 포유류 유전자가 곰팡이의 발현을 최적화하는데 중요하다. 가령, 메틸요구성 이스트에서 S. 세르비시에(S. cerevisiae) α-메이팅 인자 pre-pro서열의 프레임을 인코드하는 DNA 서열을 코딩 서열의 아미노 단부에 삽입시킬 수 있다. αMF pre-pro 서열은 αMF 전구체 분자에 포함된 리더 서열이고 여기에는 단백질분해성 프로세싱 및 분비에 필수적인 lys-arg 인코딩 서열을 포함한다(Brake et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci USA, 81:4642 (1984).
또한, PCT 출원 PCT/US92/09061(WO 93/07889)에 상술한 바와 같이, 적절하게는 본 발명의 프로릴-4-하이드록실라제 α2 소단위는 프로릴-4-하이드록실라제 β 소단위 또는 콜라겐과 동시에 숙주세포에의해 발현되는데 α2β2프로릴-4-하이드록실라제 4량체가 형성되고 이 효소는 발현된 콜라겐에서 4-하이드록시프롤린의 형성을 촉진시킨다.
또는, 숙주세포 균주는 삽입된 서열의 발현을 조절하는 또는 원하는 특정 방식으로 유전자 생성물을 수정 및 프로세싱하는 것에 따라 선택할 수 있다. 단백질 생성물의 이와 같은 변형(가령, 글리코실화반응) 및 프로세싱(가령, 절단)은 단백질의 기능에 상당히 중요하다. 단백질의 해독후 프로세싱 및 변형은 숙주세포마다 다른 독특한 기작을 가진다. 적절한 숙주세포주 또는 숙주 시스템을 선택하여 발현된 외부 단백질의 정확한 변형 및 프로세싱을 하게 한다. 이를 위해, 유전자 생성물의 1차 전사체의 적절한 프로세싱, 글리코실화반응 및 포스포릴화반응을 위한 세포 기작을 가지는 진핵 숙주 세포를 이용할 수 있다. 이와 같은 포유류 숙주세포에는 CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, WI38 등을 포함하나 이에 한정시키지는 않는다. 또한, 숙주세포를 조작하여 콜라겐 분자의 적절한 프로세싱을 할 수 있도록 다양한 효소를 발현시킨다. 가령, 프로릴-4-하이드록실라제 유전자(가령, 프로릴-4-하이드록실라제 α 소단위를 인코드하는 유전자와 프로릴-4-하이드록실라제 β 소단위를 인코드하는 유전자)를 숙주세포에서 콜라겐과 함께 발현시킬 수 있다.
장시간, 재조합 단백질을 다량 생산하기 위해서는 안정된 발현이 바람직하다. 가령, 본 발명의 프로릴-4-하이드록실라제 α2 소단위를 안정하게 발현하는 세포주를 만든다. 바이러스 복제 원점을 포함하는 발현 벡터를 이용하는 대신에,적절한 발현 조절 원소(가령, 프로모터, 인헨서, 서열, 전사 종료물질, 폴리아데닐화 부위등)의해 조절 하에 적절한 선택 표식이 있는 α2 소단위를 인코드하는 DNA를 숙주세포에 형질도입시킨다. 외부 DNA를 유도한 후에, 조작된 세포는 풍부한 배지에서 1-2일간 생장시킨 다음 선택성 배지로 옮긴다. 재조합 플라스미드에 있는 선택성 표식은 선택에 대해 저항성을 부여하여 세포가 플라스미드를 이들의 염색체 안으로 안정하게 삽입시키도록 하고 초점을 형성시켜 클론시키고 세포주로 확장시킬수 있게 한다. 이 방법을 이용하면 원하는 프로릴-4-하이드록실라제 α2 소단위를 발현시키는 세포주를 만들 수 있다.
다수의 선택 시스템을 이용할 수 있는데 예를 들면, 허피스 심플렉스 바이러스 티미딘 라이나제(Wigler et al., Cell 11:223 (1977); 하이포산틴-구아닌 포스포리보실트란스퍼라제(Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026 (1962)와 아데닌 포스포리보실트란스퍼라제(Lowy et al., Cell 22:817 (1980)는 각각 tk-, hgprt-또는 aprt-세포를 이용한다. 또한, 메토트렉세이트에 저항성을 제공하는 dhfr(Wigler et al., Natl. Acad. Sci. USA 77:3567 (1980); O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072 (1981); 미코페놀산에 저항성을 제공하는 gpt(Mulliagn & Berg. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072 (1981);아미노글리코시드 G-418에 대한 저항성을 제공하는 neo(Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150:1 (1981); 하이그로마이신에 대한 저항성을 제공하는 hygro(Santerre et al., Gene 30:147 (1984)에대한 선택을 위한 기초로 항대사물질 저항성을 이용한다. 최근에는, 추가로 선택성 유전자에 대해 설명을 하고 있는데; trpB는 프립토판 대신에 인돌을 세포가 이용하는 것이고; hisD는 히스티딘 대신에 히스티놀을 세포가 이용하는 것이고(Hartmna & Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci USA 85:8047 (1988); ODC(오르니틴 데카복시라제)은 오르니틴 데카복시라제 저해물질, 2-(디플로로메틸)-DL-오르니틴, DMFO(McConlogue L., In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed. (1987)에 저항성을 준다.
본 발명의 α2 소단위를 발현시키는 형질변환체 또는 형질감염체의 확인 및 발현된 단백질의 정제
코딩 서열을 포함하고 생물학적으로 활성이 있는 유전자 생성물을 발현시키는 숙주세포는 다음과 같이 적어도 4가지 방법에 의해 확인할 수 있다;(a) DNA-DNA 또는 DNA-RNA 하이브리드반응; (b) "표식" 유전자 기능의 존재 유무; (c) 숙주세포에서 α2 mRNA 전사체의 발현에 의해 측정하는 전사 수준을 평가; (d) 면역검사 또는 이의 생물학적 활성에 의해 측정하는 유전자 생성물의 감지.
제 1 방법에서, 발현 벡터에 삽입된 효소를 인코드하는 서열이 존재하는 가는 프로릴-4-하이드록실라제 α2 소단위 또는 이의 일부 또는 이의 유도체에 동질인 핵산 서열로 구성된 프로브를 이용하여 DNA-DNA 또는 DNA-RNA 하이브리드반응에 의해 감지할 수 있다.
제 2 방법에서, 특정 "표시" 유전자 기능이 있는지 또는 없는지(가령, 티미딘 카이나제 활성, 항생제에 대한 저항성, 메토트렉세이트에 대한 저항성, 형질변환 표현형, 베큘로바이러스에서 합체 형성 등)에 따라 재조합 발현 벡터/숙주 시스템을 확인하고 선택할 수 있다. 가령, α2 소단위 코딩 서열이 벡터의 표식 유전자내에 삽입되었다면 프로릴-4-하이드록실라제 α2 소단위의 코딩 서열을 포함하는 재조합 세포는 표식 유전자 기능이 없는 것으로 확인할 수 있다. 또는, 표식 유전자가 α2 소단위 코딩 서열의 발현을 조절하는데 이용되는 동일한 또는 다른 프로모터의 조절하에 α2 소단위 서열에 나란히 위치할 수 있다. 유도 또는 선택에 반응하여 표식의 발현되면 α2 소단위 코딩 서열이 발현되었음을 나타낸다.
제 3 방법에서, α2 소단위 부위의 전사 활성은 하이브리드반응 검사에 의해 평가할 수 있다. 가령, RNA를 분리하여 α2 소단위 코딩 서열 또는 이의 특정 부분에 동질한 프로브를 이용하여 노던 블랏에 의해 분석한다. 또는 숙주세포의 전체 핵산을 추출하여 이와 같은 프로브에 대해 하이브리드 반응을 시킨다.
제 4 방법에서, 효소 생성물의 발현은 웨스턴 블랏, 방사능면역침전법, 효소-연결된 면역검사와 같은 면역검사에의해 평가할 수 있다.
배양 배지로 분비되는 본 발명의 발현된 효소는 크로마토그래피 등을 이용하여 균질하게 정제할 수 있다. 한 구체예에서, 크기 압출 크로마토그래피를 이용하여 프로릴-4-하이드록실라제 α2 소단위 단백질을 정제하였다. 그러나, 본 기술분야에 공지된 다른 기술을 이용할 수 있는데 가령 이온 교환 크로마토그래피 역상 크로마토그래피를 포함하나 이에 국한시키지 않는다.
본 발명은 다음의 실시예를 참고로 하면 이해하기가 더욱 용이하나 이와 같은 실시예는 본 발명의 예시한 것에 불과하다.
실시예 1; 쥐 cDNA 클론의 분리
BT14.1이라고 지칭한 쥐 α2 소단위의 cDNA 클론은 MacNeil et al., (1993) J. Immunol. 151:6913-23에서 설명하는 티민 공유 항원을 인코드하는 cDNA을 프로브로 이용하여 BALB/c 쥐의 뇌 cDNA 라이브러리 λgt10(Clontech)에서 수득하였다. BT14.1 클론은 사람과 병아리의 프로릴-4-하이드록실라제 α 소단위에 동질성이 매우 크다. 그러나 cDNA 클론 BT14.1에는 폴리펩티드의 N-단부 부분을 인코드하는 서열이 없다. 따라서 쥐 뇌와 골근육 cDNA 라이브러리를 스크린하는데 프로브로 이용한다.
600,000 재조합체가운데, 4개의 양성 클론을 수득하였다. 이들중 두 개 M1, M4는 동일한 것으로 나타났고 M2는 결손이 있었고, M3는 두 개의 무관한 삽입체를 가지는 것으로 나타났다. 클론 M1을 이용하여 λgt10(Clontech)에서 쥐 골근육 cDNA 라이브러리 1.6X106플락을 스크린하였다. 한 개의 양성 클론 M6을 얻었다. 이 클론의 특징을 조사하였고, BT14.1에 포함된다는 것을 밝혔다. M1과 BT14.1의 5' 단부는 동일한 내부 EcoR1 부위(도 1에 나타낸 서열의 뉴클레오티드 220위치)에 있다. M1을 이용하여 맨 끝에 있는 5' 클론을 분리하여 쥐 골근육 cDNA 라이브러리를 스크린하고 한 개의 양성 클론, M6를 수득하였다. 하기(실시예 2)에서 제시한 바와 같이, cDNA 클론은 쥐 α2 소단위의 전체 코딩 부분을 포함한다.
쥐 α1 소단위의 cDNA 클론을 3T3 섬유아세포 λgt11 cDNA 라이브러리(Clontech)를 스크리닝하여 α1 소단위용 사람 cDNA 클론 PA-49와 함께 분리하여(Helaakoski et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 86:4392-96) 600,000 클론중에서 8개의 양성 클론을 분리하였다.
이들 클론중 세 개 MA3, MA4, MA7을 분리하여 서열화시킨다. 클론의 뉴클레오티드 서열과 유추한 아미노산 서열을 보면 사람과 병아리의 프로릴-4-하이드록실라제 α 소단위의 서열과 상당히 유사한 것을 알 수 있다. 클론중 두 개 MA3, Ma4는 다르게 절단된 엑손 10 서열을 포함하는 사람 mRNA에 대한 쥐의 상반부분을 나타내고 반면에, MA7은 엑손 9의 서열을 포함한다. cDNA 클론에는 mRNA의 5'단부를 포함하지는 않는다. 사람과 병아리의 α1 소단위의 아미노산 서열과 cDNA 유도된 아미노산 서열을 비교하면 cDNA 클론이 전체 프로세스된 폴리펩티드를 포함하나 시그날 펩티드의 N-단부 절반에 상응하는 서열 또는 5' 해독 안된 부분을 포함하지는 않는다(GenBank database, Accession No. U16162).
실시예 2; 뉴클레오티드 서열화, 서열 분석 및 노던 블랏 분석
실시예 1에 상술한 클론의 뉴클레오티드 서열은 Sanger et al., (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 74:5463-67에서 상술하는 것과 같은 디데옥시뉴클레오티드 사슬 종료반응 방법에 따라 T7 DNA 중합효소(Pharmacia)를 이용하여 결정한다. Applied Biosystems DNA 합성기(Department of Biochemistry, University od Oulu)에서 합성한 벡터-특이적 또는 서열-특이적 프라이머를 이용하였다. 서열 데이터를 편집하기 위해 DNASIS, PROSIS version 6.00 서열 분석 소프트웨어(Pharmacia), ANTHEPROT(Deleage et al., (1988) Comput. Appl. Biosci. 4:351-356), Wisconsin Genetics Computer Group package version 8(September 1994), BOXSHADE(Kay Hofmann, Bioinformatics Group, Institut Suisse de Recherches Experimentales sur le Cancer Lausanne, Switzerland)를 이용하였다.
cDNA 클론은 이에 상응하는 mRNA의 전부가 아닌 2168를 포함하고 537-aa 폴리펩티드를 인코드한다(도 1). 가상 시그날 펩티드가 유추한 폴리펩티드의 N 단부에 위치하고 von Hejne(1986) Nucleic Acid Res. 14:4683-90의 컴퓨터 변수에 기초하면 성숙한 α2 소단위의 가장 처음 아미노산은 트립토판으로써 이는 시그날 서열의 크기가 19aa이고 프로세스된 α2 소단위의 크기는 518aa이라는 것을 의미한다. 프로세스된 폴리펩티드의 분자량은 59,000이다. 3' 해독 안된 서열에는 정규적인 폴리아데닐화 시그날을 포함하고 그 다음에는 12개 뉴클레오티드가 있고 15개 뉴클레오티드가 위치한 폴리(A)꼬리가 하류에 이어진다.
쥐 α2와 쥐 α1 폴리펩티드는 크기가 비슷하고, α2는 518개 아미노산이고, α1은 517개 아미노산으로 α2 폴리펩티드는 트립토판 잔기로 시작하고 α1은 사람 α1 폴리펩티드와 같이 히스티딘 잔기로 시작한다. 프로세스된 사람 α1 소단위에는 517개 아미노산을 포함하고 병아리 α1 소단위에는 516개 아미노산을 가지고(Bassuk et al., supra) 반면에 프로세스된 C. 엘레간스(C. elegans) α 소단위는 조금 더 긴 542aa을 가지는데(Veijola, et al., supra), 이와 같은 차이는 주로 폴리펩티드의 C-단부에 32aa으로된 연장된 부분이 존재하기 때문이다(도 2).
쥐 α2와 α1 소단위에는 아스파라진-연결된 올리고사카라이드가 부착할 수 있는 부위를 두 개 포함하는데; 도 1에는 α2 소단위의 -Asn-Leu-Ser-와 -Asn-Glu-Thr-위치를 나타내었다. 사람, 쥐, 병아리 α1 소단위와 C. 엘레간스(C. elegans) α 소단위에 있는 5개의 시스테인 잔기 위치가 α2 소단위에서 모두 보존되어 있으나 후자에는 α1 소단위의 4번째와 5번째 사이에 추가로 시스테인을 포함한다. 흥미로운 것은, 이것은 쥐 α1과 C. 엘레간스(C. elegans) α 소단위에 보존된 아미노산길이가 있는 부위에 위치한다.
쥐 α2와 쥐 α1 소단위 사이에 전제 아미노산 서열 동일성 및 유사성은 각각 63%와 83%이고, 쥐 α2와 C. 엘레간스(C. elegans) α 소단위간에 동일성 및 유사성은 41%와 67%로써, 거의 대부분이 쥐 α1과 C. 엘레간스(C. elegans) α 소단위간에 것(43%, 67%)과 동일하다. 동일성이 균질하게 분포되어 있지는 않지만 C-단부 도메인에 최대로 존재하고 이는 α1 소단위의 촉매작용에 있어 중요한 부위를 나타내는 것이다(Myllyla et al., (1992) Biochem. J. 286:923-927). 프로릴-4-하이드록실라제(26)의 Fe2+결합부위로 보이는 쥐 α1 소단위(도 2)의 두 개의 히그티딘 잔기 412, 483은 보존된 것으로 보존된 C-단부 도메인내에 모두 위치한다.
다양한 쥐 조직으로 부터 분리한 샘플당 폴리(A)' RNA 2㎍을 포함하는 쥐 다중 조직 노던 블랏(Clontech)를 제조업자의 지시에 따라 제시한 엄격한 조건하에 하이브리드한다. 이용된 프로브는32P 라벨된 cDNA 클론 BT14.1 또는 MA7이다.
α소단위 mRNA의 두 가지 형태의 발현 패턴은 배우 유사한 것으로 밝혀졌고, 하이브리드반응의 강도는 심장, 폐, 뇌에서 최대로 나타났다. α2 소단위 mRNA의 크기는 2.4kb이다. 쥐의 α1 소단위는 심장, 죄, 폐에서 적어도 두 가지 mRNA 전사체를 포함하는 것으로 밝혀졌다; 가장 강한 시그날은 3.4kb에서 나타나고 가장 약한 스그날은 4.3kb에서 나타났다.
실시예 3; 세포 배양과 제조합 베큘로바이러스 생성
α2 폴리펩티드가 프로릴-4-하이드록실라제 α 소단위, 프로릴-3-하이드록실라제의 소단위 또는 일부 다른 2-옥소글루타레이트 디옥시게나제를 나타내는지를 초기에는 알지 못하였기 때문에, 재조합 폴리펩티드를 곤충 세포에 발현시켜 이의 기능을 밝혔다. 특히, 스포도프테라 푸루기페르다(Spodoptera frugiperda) Sf9곤충 세포는 10% 태아 송아지 혈청(GIBCO)가 보충된 TNM-FM 배지(sigma)에서 27℃ 배양시켰다. 발현을 위한 α(11)-소단위 cDNA를 작제하기 위해 클론 BT141.1을 BamH1과 EcoRi 제한 효소로 절단하여 bp 592-2168을 포함하는 단편을 만든다. 5'단편은 M6의 λDNA로부터 증식시킨다. 사용된 프라이머는 인위적인 Not I 부위를 포함하는 cDNA 특이적 M3PH(5'-AAGTTGCGGCCGCGAGCATCAGCAAGGTACTGC-3')(SEQ ID No;30, 서열 30), 천연 BamHI 부위를 포함하는 M65'PCR(5'-TGTCCGGATCCAGTTTGTACGTGTC-3')이다. PCR은 Taq 폴리메라제(Promega)의 공급업자가 추천하는 조건하에서 실행하고, 반응은 다음과 같은 과정을 27회 반복한다; 1분간 94℃에서 변성, 1분간 66℃에서 어닐링, 3분간 72℃에서 연장. 생성물은 NotI과 BamHI 제한효소로 절단하여 bp 120 내지 591까지의 단편을 얻는다. 두 개의 Not I- BamHI 단편과 BamHI-EcoRI 단편을 pBluescript(Stratagene) 벡터에 결찰시키고, 구조체는 NotI과 EcoRV로 절단한다음 생성된 단편은 베큘로바이러스 전달 벡터 pVL1392의 Not I-Sma I 부위에 결찰시키고 이때 벡터는 Luckow and Summers, (1989) Virology 170:31-39에 상술한 방법에따라 수득하였다. pVI 구조를 BaclulGold 형질감염 키트(PharMingen)를 이용하여 변형된 오토그라파 칼리포니카(Autographa californica) 핵 폴리히드로시스 바이러스(AcNPV)와 함께 Sf9 곤충 세포에 공동 형질 감염시킨다. 생성된 바이러스 집합체를 4일 후에 수득하여 플락을 정제한다. 재조합 바이러스는 PCR-계 방법을 이용하여 점검한다(Malitschek and Schartl (1991) BioTechniques 11:177-178).
실시예 4; 재조합 단백질의 발현 및 분석
쥐 α2 소단위를 코딩하는 재조합 베큘로바이러스를 만들고 이를 이용하여 사람 PDI/β 소단위 유무에 관계없이 스포도프테라 푸루기페르다(Spodoptera frugiperda)에 형질 감염시키는데 이때 곤충 세포는 5배정도 많이 감염된다. 4량체 효소를 생산하기 위해서, 사람 α59 1(Vuori et al., supra) 또는 쥐 α2 변이체와 PDI/β 바이러스(id.)를 1:1 또는 2:1 비율로 이용한다. 세포는 감염후 72시간 뒤에 수득하고 0.01M 트리스, pH 7.8/0.1M NaCl/0.1M 글리신/10μM 디티오트레톨/0/1% 트리톤 X-100으로 균질화시키고 원심 분리한다. 생성된 상청액은 SDS/8% PAGE 또는 변성 안된 7.5% PAGE에 의해 분석하고 효소 활성을 점검한다. 세포 펠렛은 1% SDS에 용해시키고 0.1% 트리톤 X-100 가용성 및 1%SDS-가용성 단백질은 프로릴-4-하이드록실라제 α1 소단위를 환원시키는 조건하에 SDS/PAGE에 의해 분석한다(Veijola et al., supra;Vuori, et al., supra; John, et al. (1993) EMBO J. 12:1587-95). 폴리펩티드는 불용성 응집체를 형성하고, 세포 균질체로부터 재조합 쥐 α2 소단위의 효과적인 추출을 위해서는 1% SDS를 이용해야 한다.
실시예 5; 효소 활성 검사
프로릴-4-하이드록실라제 활성은 Kivirriko and Myllyla, supra에 상술된 것과 같이 2-옥소H14C-글루타레이트의 데카복실화에 기초한 방법을 이용하여 검사한다. Km 값은 한가지 기질의 농도는 변화시키지 않으면서 다른 한 가지 기질의 농도를 변화시키면서 얻는다(Myllyla et al., (1977) Eur. J. Biochem. 80:349-357).
쥐-사람 타입 II 또는 사람 타입 I 효소중 어느 하나를 포함하는 세포 균질물로부터 0.1% 트리톤 X-100 추출물을 2-옥소[114C]글루타레이트(Kivirikko and Myllyla, supra)의 하이드록실화-결합된 데카복실화에 기초한 검사로 프로릴-4-하이드록실라제 활성에 대해 분석하였다. 두 가지에 대해 활성이 유사하였다.
쥐/사람 타입 2 효소의 활성이 프로릴-4-하이드록실라제 활성이라는 것을 보이기 위해 (Pro-Pro-Gly)10기질에 있는 4-하이드록시프롤린의 양을 반응후에 측정한다. 값을 보면 타입 2와 타입 1 효소는 매우 유사하고 타입 2 효소의 활성이 프로릴-4-하이드록실라제의 활성이다. Fe2+, 2-옥소글루타레이트와 아스코르베이트의 Km값과 2-옥소글루타레이트의 경쟁적인 저해물질로 작용을 하는 피리딘-2,4-디카르복실레이트의 Ki값은 두 가지 효소에서 배우 비슷하였다(표 1 참조).
사람 타입 1과 쥐/사람 타입 2 프로릴-4-하이드록실라제의 특정 방해물질의 Ki값과 공동기질과 펩티드 기질의 Km값
공동기질, 기질 또는 방해물질 상수 Km또는 Ki, μM
α1 2β2 α2 2β2
Fe2+ Km 4 4
2-옥소글루타레이트 Km 22 12
아스코르베이트 Km 330 340
(Pro-Pro-Gly) Km 18 45
Poly(t-proline), Mt7000 Ki 0.5 300*
Poly(t-proline), Mt44,000 Ki 0.02 30*
피리딘-2, 4-디카복실레이트 Ki 2 1
* 값은 IC50으로 측정한 것임
분명한 것은 값이 상당히 차이가 난다는 것인데, 타입 2 효소는 매우 높은 농도에서만 폴리(L-프롤린)에 의해 방해를 받는다. 폴리(L-프롤린)는 매우 잘 인지되기 때문에, 모든 척추동물 원으로부터 수득한 타입 1 프로릴-4-하이드록실라제의 효과적인 경쟁적 방해물질에 대해 연구를 하였고 폴리(L-프롤린)이 연구한 모든 식물 프로릴-4-하이드록실라제에 대해 효과적인 폴리펩티드 기질이었다. 이와 같은 발견은 기대이상이었다. 따라서, 분명하게 차이가 나는 것은 다양한 프로릴-4-하이드록실라제의 펩티드 결합 부위의 구조에 있는 것이나 이것에 대해 현재 이용할 수 있는 상세한 자료는 없다.
실시예 6; 곤충 세포에서 쥐 α2 소단위와 활성 쥐 α2 PDI/β 효소 4량체의 발현
쥐 α2 소단위와 사람 PDI/β 소단위사이에 연합이 이루어지는 지를 연구하기 위해 곤충 세포에 두 개의 폴리펩티드를 인코드하는 두 가지 재조합 바이러스를 감염시켰다. 하이브리드 단백질이 형성되고 이는 변성 안된 조건에서 PAGE에서 볼 수 있는 것과 같이 0.1% 트리톤 X-100을 포함하는 완충액에 용해될 수 있다. 유일하게 발현된 쥐 α2 소단위는 동일한 조건하에 임의 추출가능한 재조합 단백질을 제공하지 못하였고(이하 타입 1 4량체라고 칭함), 이는 하이브리드 단백질은 α2β24량체(이하 타입 2 4량체라 칭함)인 것을 암시한다. 형성된 하이브리드 단백질에 사람 PDI/β 소단위가 포함되었음을 보기 위해 웨스턴 블랏을 시행한다. 쥐 α2 소단위는 사람 PDI/β 소단위와 함께 발현되기 때문에 단백질 복합체에는 PDI/β소단위를 포함한다.
실시예 7; 사람 α2 소단위 유전자의 분리와 서열화
사람 폐 섬유아세포 게놈 라이브러리(람다 FIX 벡터(Stratagene)에 클론된)와 사람 염색체 5 라이브러리(람다 벡터 Charon 40(ATCC)에 클론된)는 이미 특징을 조사한 사람 프로릴-4-하이드록실라제 α 소단위 cDNA 서열에 상응하는32P-라벨된 니크(nick)-해독된 PCR 단편으로 구성된 프로브로 스크리닝한다.
사람 폐 섬유아세포 라이브러리와 사람 염색체 5 라이브러리로부터 수득한 양성 클론을 확인하고 분리하고 서든 불랏에 의해 분석한다. 적절한 단편은 추가 분석을 위해 pSP72 벡터(Promega)에 서브클론시킨다.
5개의 양성 클론 즉, GL-2, GL-5, GL-20, GL-140, GL-142를 사람 폐 섬유아세포 라이브러리로부터 수득하였다. 이들 클론중 두 가지 GL-2와 GL-141은 동일하였다. 프로릴-4-하이드록실라제 α2 소단위의 α2 소단위를 인코드하는 유전자의 5'와 3' 단부에 상응하는 클론은 얻지 못하였다.
사람 염색체 5 라이브러리는 두 가지 별도 프로브를 이용하여 2번 스크리닝한다. 첫째 프로브는 이미 특징을 조사한 프로릴-4-하이드록실라제 α2 소단위의 cDNA 서열에 상응한다. 두 번째 프로브는 동일한 cDNA 서열의 3'-단부에 상응한다. 몇 가지 양성 클론을 수득하였는데 단백질의 5'-단부에 상응하는 GL-3, GL-4, GL-9, GL-11, GL-11B, and GL-156. GL-3, GL-4, GL-9 and GL-11B. 단백질 클론 Gl-11A와 GL-156의 3'-단부에 상응하는 GL-11A와 GL-156은 동일하였다.
유전자에 상응하는 유도된 서열은 크기가 30kb이상이고 이는 15엑손으로 구성된다. 순수한 단백질 서열로 구성된 엑손은 크기가 54 내지 240염기로 다양하고 인크론은 241 내지 적어도 3200 염기쌍으로 다양하다(도 2-9 참조).
α1 소단위용 유전자 서열과 비교할 때, α2 소단위중 한 개 엑손이 α1 소단위 유전자의 두 가지 돌연변이된 절단 엑손에 상응한다(α1 소단위의 엑손 9).
유추된 아미노산 서열은 공지의 α(1) 소단위에 63% 정도가 유사하다.
실시예 8; 곤충 세포에서 프로릴-4-하이드록실라제의 사람 α2 소단위의 발현
실시예 3, 4, 6의 방법을 이용하여 프로릴-4-하이드록실라제의 α-2 소단위를 발현시키고 분석하였다. 곤충 세포에 있는 발현 데이터로 α2 소단위는 사람 β 소단위와 활성 타입 2 프로릴-4-하이드록실라제 α2β24량체를 형성한다는 것을 알 수 있다.
여기에서 상술하고 있는 것에 추가로 다양한 변화가 있을 수 있음을 당업자는 인지할 것이다. 이와 같은 변화는 본 발명의 범위에 속한다. 뉴클레오티드의 모든 염기쌍 크기는 대략적인 것이고 이는 설명을 위해 개재된 것이다.
여기에서 언급한 모든 참고문헌은 전부 참고로 제공한다.
서열표 리스트
(1)일반정보
(i)출원인; 케비리코 카리
피할자니에미, 타이나 에이
(ii) 발명의 명칭; 프로릴-4-하이드록실라제 α2 소단위, 이를 인코드하는 서열 및 이를 생산하는 방법
(iii) 서열의 수; 31
(iv) 통신 주소
(A) 주소: 페니 앤드 애드몬드
(B) 거리 : 더 어메리카스 오브 에브뉴 1155
(C) 도시 : 뉴욕
(D) 주 : 뉴욕주
(E) 나라 : USA
(F) 우편코드 : 10036
(v) 컴퓨터 판독 형태
(A)매체형태;플로피 디스크
(B)컴퓨터;IBM PC 호환성
(C)작동시스템;PC-DOS/MS-DOS
(D)소프트웨어;PatentIn Release #1.0, Version #1.30(EPO)
(vi) 현재 출원 데이터
(A) 출원번호; US에서 할당
(B) 출원일자; 1996년 3월 28일
(C) 분류
(viii) 대리인 정보
(A) 이름; 할루인 알버트 피.
(B) 등록번호; 25,227
(C) 서류 번호; 8389-041
(ix) 통신 정보
(A) 전화번호; 415-854-3660
(B) 팩스번호; 415-854-3694
(C) 텔렉스; 66141 PENNIE
(2)서열 1에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 2168bp
(B)형태;핵산
(C)가닥; 모름
(D)위상; 모름
(ii)분자형; cDNA
(ix) 특징
(A) 이름; CDS
(B) 위치; 151..1761
(xi)서열 1
(2)서열 2에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 537 아미노산
(B)형태; 아미노산
(D)위상;선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 2
(2)서열 3에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 2207bp
(B)형태;핵산
(C)가닥; 모름
(D)위상; 모름
(ii)분자형; cDNA
(ix) 특징
(A) 이름; CDS
(B) 위치; 1..2205
(xi)서열 3
(2)서열 4에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 735 아미노산
(B)형태; 아미노산
(D)위상;선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 4
(2)서열 5에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 378bp
(B)형태;핵산
(C)가닥; 모름
(D)위상; 모름
(ii)분자형; cDNA
(xi)서열 5
(2)서열 6에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 486bp
(B)형태;핵산
(C)가닥; 모름
(D)위상; 모름
(ii)분자형; cDNA
(xi)서열 6
(2)서열 7에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 486bp
(B)형태;핵산
(C)가닥; 모름
(D)위상; 모름
(ii)분자형; cDNA
(xi)서열 7
(2)서열 8에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 540bp
(B)형태;핵산
(C)가닥; 모름
(D)위상; 모름
(ii)분자형; cDNA
(xi)서열 8
(2)서열 9에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 317bp
(B)형태;핵산
(C)가닥; 모름
(D)위상; 모름
(ii)분자형; cDNA
(xi)서열 9
(2)서열 10에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 375bp
(B)형태;핵산
(C)가닥; 모름
(D)위상; 모름
(ii)분자형; cDNA
(xi)서열 10
(2)서열 11에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 125 아미노산
(B)형태; 아미노산
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 11
(2)서열 12에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 200bp
(B)형태;핵산
(C)가닥; 모름
(D)위상; 모름
(ii)분자형; cDNA
(ix) 특징
(A) 이름; CDS
(B) 위치; 1..198
(xi)서열 12
(2)서열 13에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 66 아미노산
(B)형태; 아미노산
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 13
(2)서열 14에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 330bp
(B)형태;핵산
(C)가닥; 모름
(D)위상; 모름
(ii)분자형; cDNA
(ix) 특징
(A) 이름; CDS
(B) 위치; 1..330
(xi)서열 14
(2)서열 15에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 110 아미노산
(B)형태; 아미노산
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 15
(2)서열 16에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 369bp
(B)형태;핵산
(C)가닥; 모름
(D)위상; 모름
(ii)분자형; cDNA
(ix) 특징
(A) 이름; CDS
(B) 위치; 1..369
(xi)서열 16
(2)서열 17에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 123 아미노산
(B)형태; 아미노산 서열
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 17
(2)서열 18에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 309bp
(B)형태;핵산
(C)가닥; 모름
(D)위상; 모름
(ii)분자형; cDNA
(ix) 특징
(A) 이름; CDS
(B) 위치; 1..309
(xi)서열 18
(2)서열 19에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 103 아미노산
(B)형태; 아미노산 서열
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 19
(2)서열 20에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 509bp
(B)형태;핵산
(C)가닥; 모름
(D)위상; 모름
(ii)분자형; cDNA
(ix) 특징
(A) 이름; CDS
(B) 위치; 1..507
(xi)서열 20
(2)서열 21에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 169 아미노산
(B)형태; 아미노산
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 21
(2)서열 22에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 480bp
(B)형태;핵산
(C)가닥; 모름
(D)위상; 모름
(ii)분자형; cDNA
(xi)서열 22
(2)서열 23에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 29bp
(B)형태;핵산
(C)가닥; 모름
(D)위상; 모름
(ii)분자형; cDNA
(xi)서열 23
(2)서열 24에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 2121bp
(B)형태;핵산
(C)가닥; 모름
(D)위상; 모름
(ii)분자형; cDNA
(ix) 특징
(A) 이름; CDS
(B) 위치; 1..2121
(xi)서열 24
(2)서열 25에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 707 아미노산
(B)형태; 아미노산
(D)위상; 선형
(ii)분자형; 단백질
(xi)서열 25
(2)서열 26에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 478bp
(B)형태;핵산
(C)가닥; 모름
(D)위상; 모름
(ii)분자형; cDNA
(xi)서열 26
(2)서열 27에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 660bp
(B)형태;핵산
(C)가닥; 모름
(D)위상; 모름
(ii)분자형; cDNA
(xi)서열 27
(2)서열 28에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 660bp
(B)형태;핵산
(C)가닥; 모름
(D)위상; 모름
(ii)분자형; cDNA
(xi)서열 28
(2)서열 29에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 323bp
(B)형태;핵산
(C)가닥; 모름
(D)위상; 모름
(ii)분자형; cDNA
(xi)서열 29
(2)서열 30에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 33bp
(B)형태;핵산
(C)가닥; 모름
(D)위상; 모름
(ii)분자형; DNA
(xi)서열 30
(2)서열 31에 대한 정보
(i)서열특징
(A)길이; 25bp
(B)형태;핵산
(C)가닥; 모름
(D)위상; 모름
(ii)분자형; DNA
(xi)서열 31

Claims (13)

  1. 사람의 프로릴-4-하이드록실라제 α 소단위의 동소체로 구성된 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  2. 제 1 항에 있어서 프로릴-4-하이드록실라제 α 소단위는 α2 소단위인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  3. 제 2 항에 있어서, 폴리펩티드의 아미노산 서열은
    (a) 서열 3(SEQ ID No;3)으로 된 아미노산 서열;
    (b) 서열 3(SEQ ID No;3)으로 된 단편을 인코드하는 아미노산 서열;
    (c) 서열 3(SEQ ID No;3)으로 된 유도체를 인코드하는 아미노산 서열;로 구성된 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  4. 사람 프로릴-4-하이드록실라제 α2 소단위를 인코드하는 핵산 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 뉴클레오티드 서열.
  5. 제 4 항에 있어서 뉴클레오티드 서열은
    (a) 서열 3(SEQ ID No;3)의 뉴클레오티드 서열;
    (b) 엄격한 조건하에서 서열 3(SEQ ID No;3)에 하이브리드할 수 있는 뉴클레오티드 서열;
    (c) (a) 또는 (b)의 뉴클레오티드 서열로 축중할 수 있는 뉴클레오티드 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 뉴클레오티드 서열.
  6. 제 4 항에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  7. 제 6 항에 있어서, 벡터는 프로릴-4-하이드록실라제 β소단위를 인코드하는 뉴클레오티드 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 뉴클레오티드 서열.
  8. 제 4 항에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성된 발현 벡터에 의해 형질변환된, 감염된 또는 형질감염된 것을 특징으로 하는 숙주세포.
  9. 제 8 항에 있어서, 숙주세포는 프로릴-4-하이드록실라제 β소단위를 인코드하는 뉴클레오티드 서열로 구성된 발현 벡터에 의해 추가로 형질변환, 감염, 형질감염된 것을 특징으로 하는 숙주세포.
  10. 제 8 항에 있어서 숙주세포는 콜라겐을 인코드하는 하나이상의 뉴클레오티드 서열로 구성된 발현 벡터에 의해 추가로 형질변환, 감염, 형질감염된 것을 특징으로 하는 숙주세포.
  11. 제 8 항에 있어서 숙주세포는 곤충 세포, 이스트, 박테리아 세포, 식물 세포 또는 포유류 세포로 구성된 집단에서 선택되는 것을 특징으로 하는 숙주세포.
  12. 프로릴-4-하이드록실라제 α2 소단위를 만드는 방법에 있어서,
    (a) 프로릴-4-하이드록실라제 α2 소단위를 인코드하는 뉴클레오티드 서열로 구성된 발현 벡터로 형질변환, 감염 또는 형질 감염된 숙주세포를 배양하고;
    (b) 프로릴-4-하이드록실라제 α2 소단위를 분리하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 프로릴-4-하이드록실라제 α2 소단위를 만드는 방법에 있어서,
    (a) α2β24량체를 형성하는 조건하에서 (i)프로릴-4-하이드록실라제 α2 소단위를 인코드하는 뉴클레오티드 서열로 구성된 발현 벡터와 (ii) 프로릴-4-하이드록실라제 β 소단위를 인코드하는 뉴클레오티드 서열로 구성된 발현 벡터로 형질변환, 감염 또는 형질 감염된 숙주세포를 배양하고;
    (b) α2β24량체를 분리하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
KR1019980708096A 1996-04-10 1997-03-18 프로릴-4-하이드록실라제 α2 소단위, 이를 인코드하는 서열 및이를 생산하는 방법 KR20000005374A (ko)

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