JPH05276961A - 心臓のアデニリルシクラーゼのクローニングおよび特性決定 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 心臓のアデニリルシクラーゼのクローニング
及び特性決定を行なう。 【構成】 心臓のアデニリルシクラーゼと呼ぶ新規なエ
フェクター酵素をエンコードするＤＮＡ配列、及びその
ＤＮＡ配列によりエンコードされる心臓のアデニリルシ
クラーゼのアミノ酸配列。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、心臓のアデニリルシクラーゼと
呼ぶ新規な酵素をエンコードするＤＮＡ配列に関する。
本発明は、また、そのＤＮＡ配列によりエンコードされ
る心臓のアデニリルシクラーゼのアミノ酸配列に関す
る。

【０００２】シグナルの形質導入経路は３つの段階に細
分割される。第１はレセプターによりリガンドの認識で
ある。第２は「形質導入」タンパク質によるシグナルの
伝導および増幅である。最終の段階はエフェクター酵素
による第２メッセンジャーの発生である。

【０００３】アデニリルシクラーゼは、種々のホルモン
−レセプター系にカップリングするエフェクター酵素、
例えば、カテコールアミンおよびＡＣＴＨである。カテ
コールアミンレセプターおよびその形質導入タンパク質
（Ｇ−タンパク質）は、それらのｃＤＮＡのクローニン
グ以来、よく特性決定されてきている。しかしながら、
アデニリルシクラーゼについては比較的わずかしか知ら
れていない。

【０００４】いったんこのようなホルモンがレセプター
へ結合すると、それはＧタンパク質、すなわち、ヘテロ
トリメルグアニンヌクレオチド結合性調節タンパク質を
活性化する（ａ、ｂ、ｑ）。活性化されたＧ−タンパク
質は、ＧＤＰとＧＴＰとの交換、ならびにｂｑサブユニ
ットから解離を引き出す。ａ−サブユニットのＧＴＰ結
合形態はアデニリルシクラーゼを刺激し、これは環状Ａ
ＭＰをＡＴＰから発生する。環状ＡＭＰ、第２メッセン
ジャー、は、タンパク質キナーゼを包含する種々のタン
パク質活性化する。

【０００５】次いでタンパク質キナーゼは他のタンパク
質をリン酸化し、こうしてシグナルの形質導入のカスケ
ードを開始する。活性化の他のタイプは、ことに神経組
織における、細胞内カルシウム濃度の増加による。消極
後、カルシウムの流入はカルモジュリン、すなわち、細
胞内カルシウム結合性タンパク質、の活性化を引き出
す。活性化されたカルモジュリンはアデニリルシクラー
ゼに結合しそしてそれを活性化することが示された（引
用文献１）。

【０００６】いくつかの論文は種々のアデニリルシクラ
ーゼを示唆した。フォルスコリン結合親和クロマトグラ
フィーを使用して、単一クラスの酵素タンパク質がウシ
の脳から精製された（２、３）。この精製された調製に
対してレイズされたモノクローナル抗体は、脳の中の大
きさが異なる他の形態のタンパク質を認識した。生化学
的特性はこれらの２つが異なる型のアデニリルシクラー
ゼであることを示した。一方はカルモジュリン感受性
（ＣａＭ感受性）であり、そして他方はＣａＭ不感受性
である。この研究（２）は、１つの組織の中に２つのタ
イプのアデニリルシクラーゼが存在し、そしてこれらの
タイプが同一抗体により認識されうる同一ドメインを共
有することを示した。

【０００７】他の論文はアデニリルシクラーゼの多様性
の遺伝学的証拠を提出した（４）。連想的学習を遮断す
るドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌｌａ）におけるＸ
連鎖した劣性突然変異はアデニリルシクラーゼのＣａＭ
感受性を欠如したが、フッ化物またはＧＴＰに対する反
応性を有した。これが示唆するように、ＣａＭ感受性シ
クラーゼ遺伝子はＸ−染色体の中に位置し、これはＣａ
Ｍ不感受性アデニリルシクラーゼ遺伝子と区別される。

【０００８】３つの異なるｃＤＮＡはそれまで哺乳動物
の組織からクローニングされてきた。これらはＩ型（脳
型（５））；ＩＩ型（肺型（６））；およびＩＩＩ型
（臭覚型（７））と表示された。Ｉ型およびＩＩＩ型の
ｃＤＮＡ配列は発表された。これらのｃＤＮＡによりコ
ードされるアデニリルシクラーゼは、長さが１０００ア
ミノ酸より大きいタンパク質である。トポグラフィー的
に、すべての型は類似する。すべては大きい細胞質ルー
プに関連する２つの６−トランスメンブレンドメインを
有する。細胞質ループのアミノ酸配列は異なる型のシク
ラーゼの間に保存される。

【０００９】これらのアデニリルシクラーゼのメッセー
ジの組織の分布は、ノザンブロッティングの研究におい
て示されるように、よく区別される。Ｉ型は脳において
のみ発現され、ＩＩ型は肺および脳において発現され、
そしてＩＩＩ型は臭覚組織においてほとんど発現され、
脳におけるその発現はわずかである。こうして、アデニ
リルシクラーゼはむしろ組織特異的方法で分布される。
アデニリルシクラーゼが本来同定された組織の１つは心
臓の組織であるという事実にかかわらず、３つの既知の
型のいずれも心臓組織の中で発現されることが示されて
きていない。

【００１０】ある形態のアデニリルシクラーゼは、ま
た、心臓の中に存在すること（８）、そして心臓からの
シクラーゼは脳からのシクラーゼに対してレイズされた
モノクローナル抗体により認識されること（９）が記載
された。アデニリルシクラーゼの３つのクローニングさ
れた型がそれらの大きい細胞質ループ中の保存されたア
ミノ酸配列を有することが与えられると、心臓からのシ
クラーゼはこの領域において配列相同性を共有する。こ
うして、脳からのアデニリルシクラーゼｃＤＮＡを使用
することによって、心臓からアデニリルシクラーゼのク
ローンを得ることを試みることができる。しかしなが
ら、アデニリルシクラーゼが心臓組織からクローニング
または発現されたということは報告されていない。

【００１１】本発明の出発点は、心臓の中のアデニリル
シクラーゼが脳からのそれと有意の相同性を共有し、そ
して脳のシクラーゼからのプローブを使用してスクリー
ニングできという仮定である。心臓の中のアデニリルシ
クラーゼは、心不全の発生に関係することが示された
（１０）。これが示唆するように、それは心臓の機能に
関係する。

【００１２】本発明によれば、新規な型のアデニリルシ
クラーゼのｃＤＮＡはイヌの心臓のライブラリーからク
ローニングされる。この新規なアデニリルシクラーゼは
心臓のアデニリルシクラーゼ（Ｂ型）と呼ぶ。この心臓
のアデニリルシクラーゼは１１６５アミノ酸から構成さ
れている。他の形態（Ａ型）の心臓のアデニリルシクラ
ーゼは、１０１９アミノ酸から構成され、この出願人に
係る同時継続出願第０７／７５１，４６０号、１９９１
年８月２９日提出、の主題である。

【００１３】このＢ型の心臓のアデニリルシクラーゼ
は、主として心臓において、ならびに脳において発現さ
れるが、他の組織においてより少ない程度に発現され
る。

【００１４】Ｂ型のシクラーゼは、ＣＭＴ細胞を使用し
て一時的発現系においてｃＤＮＡから翻訳される。ＣＭ
Ｔは、メタロチオネインプロモーターにより推進された
Ｔ−抗原遺伝子で安定に形質転換された、サル腎臓細胞
系である。このシクラーゼはフォルスコリンにより刺激
され、このフォルスコリンはアデニリルシクラーゼ活性
を心臓において刺激することが知られている（１０）。

【００１５】このＢ型の心臓のアデニリルシクラーゼの
構造はアデニリルシクラーゼの他の型のものに類似す
る。それは大きい細胞質ループに関連する領域をスパニ
ングする６−トランスメンブレンのモチーフを含有す
る。心臓のアデニリルシクラーゼのＡおよびＢ型のアミ
ノ酸配列の全体の相同性は６４％である。それらのアミ
ノ酸配列はトランスメンブレン部分におけるより細胞質
部分において相同性である。Ｂ型の心臓のアデニリルシ
クラーゼは心臓機能の調節に関係することができる。特
記しない限り、この出願の残部はＢ型のシクラーゼに関
する；Ａ型は前述の同時継続出願に記載されている。

【００１６】新規な心臓のアデニリルシクラーゼを同定
および分離する方法は、イヌの心臓のｃＤＮＡライブラ
リーの構成およびスクリーニングで開始する。

【００１７】イヌの心臓の左心室の組織をｍＲＮＡ源と
して使用する。ライブラリーは、記載されているように
（１２）、オリゴ−ｄＴプライマーを使用してｇｇｔ１
０ファージ中で調製する。ｇｇｔ１０ライブラリーの一
次スクリーニングはおだやかな洗浄（より低いストリン
ジェントの条件）で実施する。ほぼ２×１０⁶プラーク
を最初にライブラリーからスクリーニングする。予備ハ
イブリダイゼーションは、３０％のホルムアミド、５×
ＳＳＣ、５×デンハルト（Ｄｅｎｈａｒｄｔ）溶液、２
５ミリモルのＮａＰＯ₄（ｐＨ６．５）、０．２５ｍｇ
／ｍｌの子ウシ胸腺ＤＮＡおよび０．１％のドデシル硫
酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含有する溶液中で４２℃にお
いて少なくとも２時間実施する。次いで、ハイブリダイ
ゼーションを同一溶液中で４２℃において実施する。Ｉ
型アデニリルシクラーゼｃＤＮＡからの９７０塩基対
（ｂｐ）のＡａｔＩ−ＨｉｎｃＩＩ断片をプローブとし
て使用する。この断片は、アデニリルシクラーゼの他の
従来知られている型（７）に対して有意の相同性を有す
る、アデニリルシクラーゼの第１細胞質ドメインをエン
コードする。

【００１８】プローブはマルチ−プライマー−ランダム
標識つけ法により³²Ｐ−ｄＣＴＰで放射線標識した。１
８時間ハイブリダイゼーションした後、ブロットを増加
するストリンジェントの条件下に洗浄し、次いでラジオ
オートグラフィーにかける。クローンの中のインサート
の大きさは５．４ｋｂ（キロ塩基）である。

【００１９】次の工程はクローンの中のインサートから
の全長のｃＤＮＡ配列を確認することである。イヌの心
臓のライブラリーからのすべての陽性のクローンをプラ
スミドｐＵＣ１８の中にクローニングした。制限地図を
作った後、それらをさらにサブクローニングし、そして
汎用プライマーまたは合成したオリゴマーで配列決定す
る。いくつかの断片について、エキソヌクレアーゼＩＩ
Ｉ消化により１系列の欠失を作った後、配列決定を実施
する。配列決定はセクエナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）
（１３）またはＴａｑポリメラーゼ（１４）により少な
くとも２回２方向に実施する。いくつかのＧＣに富んだ
区域において、配列決定は７％のポリアクリルアミド、
８モルの尿素および２０％のホルムアミドを含有するゲ
ルを使用して実施する。

【００２０】＃２７と表示するクローンはとくに興味あ
ることが発見された。クローン＃２７の全体の解読部分
を配列決定した後、それはその３’末端にポリアデニル
化シグナルをもつ５．４ｋｂのインサートを含有するこ
とが発見された（図１）。しかしながら、それは保存さ
れたコンセンサス配列をもつＡＴＧを含有し、これは翻
訳を開始する好適な関係を提供する（１５）。

【００２１】したがって、クローン＃１７からの５’Ｅ
ｃｏＲＩ−ＳｐｈＩ断片をプローブとして、ライブラリ
ーを再スクリーニングする。＃６と表示するクローンは
クローン＃２７と８００塩基についてオーバーラッピン
グし、そしてｃＤＮＡ配列を追加の４４１ｂｐだけ上流
に伸長する。全体のインサートを配列決定した後、保存
されたコザク（Ｋｏｚａｋ）コンセンサス配列をもつＡ
ＴＧはその５’末端に見いだされた（矢印、図１）。３
４９５塩基のこのオープンリーディングフレームはＴＡ
Ｇ、翻訳停止コドンまで読む（図１乃至図７）。こうし
て、クローン＃２７および＃６は、心臓のアデニリルシ
クラーゼのＡ型よりも１４７塩基だけ長い、１１６５ア
ミノ酸のタンパク質をエンコードする。ｃＤＮＡの全体
の解読部分およびその予測されたアミノ酸配列を示す
（図２乃至図７）（ＳＥＱ ＩＤＮＯ：１）。

【００２２】クローン＃６（ＥｃｏＲＩ−ＳｐｈＩ）お
よび＃２７（ＳｐｈＩ−ＳｓｐＩ）からの４．０ｋｂの
ＥｃｏＲＩ−ＳｓｐＩ断片は、ｐｃＤＮＡａｍｐ（アン
ピシリン耐性遺伝子をｐｃＤＮＡ１の中に導入すること
によって形成した、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ）から入手した）。生ずる発現ベクターは、全長の
ｃＤＮＡを含有し、ｐｃＤＮＡａｍｐ／２７−６と表示
する。ＤＨ５アルファと表示するＥ．ｃｏｌｉ菌株の中
に挿入された、この発現ベクターの試料は、特許手続き
の目的のための微生物の寄託の国際的認識についてのブ
ダベスト条約の規定に従い、アメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクション（ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔ
ｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）米国
マリイランド州２０８５２ロックビレ）に寄託され、そ
して受け入れ番号ＡＴＣＣ６８８２６を与えられた。

【００２３】この心臓のアデニリルシクラーゼの生産
は、確立された組み換えＤＮＡ法を使用して、適当な発
現系中で心臓のアデニリルシクラーゼｃＤＮＡをクロー
ニングおよび発現させることによって達成される。心臓
のアデニリルシクラーゼの生産は、心臓のアデニリルシ
クラーゼｃＤＮＡを任意の適当な発現ベクターの中に組
み込み、引き続いて適当な宿主細胞をベクターで形質転
換することによって達成することができる；あるいは、
宿主細胞の形質転換はベクターを使用しないで裸のＤＮ
Ａにより直接達成することができる。真核生物細胞また
は原核生物細胞による心臓のアデニリルシクラーゼの生
産は本発明により考えられる。適当な真核生物細胞の例
は、哺乳動物細胞、植物細胞、酵母菌細胞および昆虫細
胞を包含する。同様に、適当な原核生物細胞は、Ｅ．ｃ
ｏｌｉに加えて、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔ
ｉｌｉｓ）を包含する。

【００２４】他の適当な発現ベクターを、また、使用す
ることができ、そして宿主細胞の選択に基づいて選択さ
れる。例えば、バクテリア細胞の形質転換における使用
に適当な多数のベクターはよく知られている。例えば、
プラスミドおよびバクテリオファージ、例えば、ｇファ
ージは、バクテリアの宿主、とくにＥ．ｃｏｌｉのため
に最も普通に使用されている。哺乳動物および昆虫の両
者の細胞において、外因性ＤＮＡの発現を得るためにウ
イルスのベクターが頻繁に使用されている。とくに、哺
乳動物細胞をＳＶ４０またはポリオーマウイルスで普通
に形質転換され、そして培養中の昆虫細胞はバキュロウ
イルスの発現ベクターで形質転換することができる。酵
母菌のベクター系は酵母菌の動原体のプラスミド、酵母
菌エピソームのプラスミドおよび酵母菌の組み込みプラ
スミドを包含する。

【００２５】また、本発明の実施は図２乃至図７におい
て定められる心臓のアデニリルシクラーゼｃＤＮＡの正
確な配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）の使用に限定され
ない。この配列に対する修飾、例えば、欠失、挿入、あ
るいは生ずるタンパク質分子のサイレントの変化を生成
する配列中の置換が、また、考えられる。例えば、所定
の部位に化学的に同等のアミノ酸を生成するｃＤＮＡ配
列の変更が考えられる；こうして、アミノ酸のアラニ
ン、すなわち、疎水性アミノ酸のためのコドンを他の疎
水性残基、例えば、グリシンをエンコードするコドンと
置換することができるか、あるいはより疎水性の残基、
例えば、バリン、ロイシンまたはイソロイシンで置換す
ることができる。同様に、１つの陰性に帯電した残基を
他のもので置換させる、例えば、アスパラギン酸をグル
タミン酸で置換させるか、あるいは１つの陽性に帯電し
た残基を他のもので置換させる、例えば、リジンをアル
ギニンで置換させる変化は、また、生物学的に同等の産
生物を生産することを期待することができる。

【００２６】タンパク質分子のＮ末端またはＣ末端の部
分の変更を生ずるヌクレオチドの変化は、これらの領域
が通常生物学的活性に関係しないので、タンパク質の活
性をしばしば変更しない。また、配列の中に存在するシ
ステインの１または２以上を排除することが望ましいこ
とがある。なぜなら、システインの存在は、タンパク質
が組み換え的に生産されるとき、マルチマーの望ましく
ない形成を生じ、これにより精製および結晶化のプロセ
スを複雑にすることがあるからである。

【００２７】提案された修飾の各々、ならびにエンコー
ドされた産生物の生物学的活性の決定または保持は、こ
の分野における日常の技量の範囲内によく入る。したが
って、句「心臓のアデニリルシクラーゼのｃＤＮＡ配
列」または「心臓のアデニリルシクラーゼの遺伝子」を
この明細書または特許請求の範囲において使用すると
き、生物学的に同等の心臓のアデニリルシクラーゼのタ
ンパク質の生産を生ずる、すべてのこのような修飾およ
び変化を包含することが理解されるであろう。また、他
の哺乳動物の種における対応する配列を包含することが
理解される。とくに、高いストリンジェンシーのサザン
ハイブリダイゼーションの条件、例えば、マニアチス
（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら（１６）に記載されている条件
下に、それとのハイブリダイゼーションを可能とするよ
うに、図２乃至図７の配列の十分に反復するＤＮＡ配列
を本発明は包含する。

【００２８】このような発現の実施例において、２０ｍ
ｇの精製したプラスミドｐｃＤＮＡａｍｐ／２７−６を
サルの腎臓のＣＭＴ細胞の中に、グールブ（Ｇｏｏｌｕ
ｂ）ら（１７）の変更した方法により、トランスフェク
ションする。簡単に述べると、細胞をイーグル培地のダ
ルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）の変更、１０％の胎児仔
ウシ血清、２ミリモルのグルタミン、４．５ｍｇ／ｍｌ
のグルコース、１０ｍｇ／ｍｌの硫酸ストレプトマイシ
ンおよび６０ｍｇ／ｍｌのペニシリンＫの中で８０％の
全面成長に成長させる。ＰＢＳで２回洗浄した後、０．
５ｍｌのトリプシン溶液を添加する。細胞を１０分間イ
ンキュベーションし、そして４００ｍｇ／ｍｌのＤＥＡ
Ｅデキストランおよび０．１ミリモルのクロロクインを
含有する４ｍｌのＤＭＥＭの中に再懸濁した２０ｍｇの
精製したプラスミドを添加する。細胞を４時間インキュ
ベーションし、次いで１０％のＤＭＳＯのショックを２
分間実施する。ＰＢＳで２回洗浄した後、ＤＭＥＭ中に
１０％の胎児仔ウシ血清（ＦＣＳ）、２ミリモルのグル
タミン、４．５ｇ／ｍｌのグルコース、２ミリモルのペ
ニシリンおよびストレプトマイシン、および１ミリモル
のＣｄＣｌ₂を含有するインキュベーション培地を添加
する。プレートを３７℃において７２時間インキュベー
ションした後、収穫する。

【００２９】このアデニリルシクラーゼのタンパク質
は、１１６５アミノ酸から構成され、カイト−ドーリト
ル（Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ）の方法（１１）に
より２次構造について分析する（図８）。ソフトウェ
ア、マクベクター（ＭａｃＶｅｃｔｏｒ）３．５（ＩＢ
Ｉ、コネチカット州ニューヘブン）を使用してヒドロパ
シーのプロットを作成し、これによりこの心臓のアデニ
リルシクラーゼの膜関係構造を同定する。カイト（Ｋｙ
ｔｅ）およびドーリトル（Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ）の方法
を７ウィンドウの大きさで使用する。

【００３０】図８に示すように、１２のピークに番号を
付す。これらのピークはトランスメンブレンのスパニン
グ領域を表す。これらの結果が示唆するように、この心
臓のアデニリルシクラーゼは１２のトランスメンブレン
のスパニング領域、ならびに中央および末端に位置する
大きい細胞質ループを有する。トランスメンブレン位置
において、第５の細胞外ループは最大である（第９と第
１０のトランスメンブレンのスパンの間）。

【００３１】Ｎ末端テイルの１５０アミノ酸が細胞質の
中に位置し、次いで１５４アミノ酸の６−トランスメン
ブレン領域（アミノ酸位置１５１−３０４）。次いで細
胞質ドメインの３６３アミノ酸（３０５−６６７）が位
置し、次いで２４２アミノ酸の第２の６−トランスメン
ブレンスパニングドメイン（６６８−９０９）が位置
し、引き続いて２５６アミノ酸の他の細胞質ドメイン
（９１０−１１６５）が位置する。こうして、それは反
復した形態の６−トランスメンブレンのスパニング領域
および大きい疎水性細胞質ドメインを作る。

【００３２】図９、心臓のアデニリルシクラーゼのＢ型
およびＡ型の間のＤＮＡのドットマトリックスの比較、
に示すように、２つの大きい疎水性細胞質ループは互い
との７２〜８０％の相同性を示す。２つのトランスメン
ブレンのスパニング部分の間の相同性は、また、高い
（４４−４５％）。

【００３３】こうして、これらの２つの心臓のシクラー
ゼは明瞭に互いに区別されるが、他の型のシクラーゼ、
例えば、Ｉ型およびＩＩＩ型とより非常に高い相同性を
有する。したがって、これらの心臓のアデニリルシクラ
ーゼを全体のアデニリルシクラーゼの族の新しいサブク
ラスとしてカテゴリー化することは合理的である。２つ
の心臓のシクラーゼの間の唯一の明確な差は、Ａ型がＮ
末端の細胞質ドメインを欠如するが、Ｂ型は長さが１５
０アミノ酸のこのようなドメインを有することである。

【００３４】このタンパク質の膜関連二次構造（図８の
結果に基づく）を哺乳動物のアデニリルシクラーゼの異
なる型（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ型および心臓の型）の間によ
く保存される。それらのすべては、６−トランスメンブ
レンのスパニング領域の存在により中断された、２つの
大きい細胞質のループを有する。異なる型のアデニリル
シクラーゼの間の相同性は細胞質部分の中にのみ保存さ
れるが、他の部分は構造的に類似する。さらに、同一の
アデニリルシクラーゼタンパク質において、２つの細胞
質部分の間の相同性はまた維持される。これが示唆する
ように、細胞質部分は遺伝子の重複の結果である。

【００３５】心臓におけるアデニリルシクラーゼの活性
のレベルは心不全の発生と相関関係をもつことが示唆さ
れる。非欠損のない心臓におけるそれと比較して欠損の
ある心臓においてシクラーゼ活性は有意に減少する（１
０、１８、１９、２０）。これらの論文は、シグナルの
形質導入経路における末梢の調節、すなわち、シクラー
ゼのレベルにおける調節が存在することを示唆してい
る。事実、心臓におけるアデニリルシクラーゼの活性の
減少は心不全の発生における主要な因子であることがあ
る。こうして、本発明の新規な心臓のアデニリルシクラ
ーゼを使用して、そのシクラーゼの活性を刺激する化合
物についてスクリーニングする。

【００３６】この心臓のアデニリルシクラーゼの生化学
的性質を、ＣＭＴ細胞（ＣＯＳ細胞の誘導体）を使用す
る一時的発現系において検査する。ＣＭＴ細胞はゲノム
の中のメタロチオネインプロモーターにより推進される
Ｔ−抗原を含有する。こうして、培地の中の重金属で誘
発することによって、ＣＭＴ細胞はＣＯＳ細胞より多く
のＴ−抗原を生産することができる。全体の解読配列を
含有するアデニリルシクラーゼｃＤＮＡの４．０ｋｂの
断片を前述のｐｃＤＮＡａｍｐプラスミドの中に挿入す
る。

【００３７】心臓のアデニリルシクラーゼｃＤＮＡを有
する発現ベクターｐｃＤＮＡａｍｐでトランスフェクシ
ョンした膜のアデニリルシクラーゼ活性を次のようにし
てアッセイする。トランスフェクションしたＣＭＴ細胞
をＰＢＳで２回洗浄し、そして氷上の５０ミリモルのト
リス（ｐＨ８．０）、１ミリモルのＥＤＴＡ、１０ミリ
モルのＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオライ
ド）、１００Ｕのロイペプチンおよび５０Ｕの卵白トリ
プシン阻害因子（ＥＴＩ）を含有する３ｍｌの冷たい緩
衝液の中にかき落として入れる。膜をポリトロン（Ｐｏ
ｌｙｔｒｏｎ^R）の中で均質化し（１０秒間６に設定す
る）、そして４℃において８００×で１０分間遠心す
る。さらに、上澄み液を１０×ｇで４℃において４分間
遠心する。生ずる沈澱物を５０ミリモルのトリス（ｐＨ
８．０）、１ミリモルのＥＤＴＡ、１ミリモルのＰＭＳ
Ｆ、５０Ｕのロイペプチンおよび５０ＵのＥＴＩの中に
５ｍｇ／ｍｌの濃度に再懸濁させる。この粗製の膜溶液
をアデニリルシクラーゼのアッセイに使用する。

【００３８】アデニリルシクラーゼのアッセイはサロモ
ン（Ｓａｌｏｍｏｎ）の方法（２１）により実施する。
簡単に述べると、ＣＭＴ細胞からの粗製の膜を１ミリモ
ルのリン酸クレアチン、８ｍｇ／ｍｌのクレアチンホホ
キナーゼ、４ミリモルのＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、２
ミリモルのＭｇＣｌ₂、０．１ミリモルのｃ−ＡＭＰ、
０．１ミリモルのＡＴＰ、および³²Ｐ−ＡＴＰ（０．５
〜５ｍＣｉ／アッセイ管）を含有する溶液の中に再懸濁
させる。反応混合物を３７℃において３０分間インキュ
ベーションし、そして反応を１００ｍｌの２％のダウリ
ル硫酸ナトリウムの添加により停止させる。カラムから
の回収をモニターするために、³Ｈ標識ｃ−ＡＭＰを使
用する。環状ＡＭＰをドウウェクス（Ｄｏｗｅｘ）およ
びアルミナのカラムを通過させることによってＡＴＰか
ら分離し、そして放射能をシンチレーションカウターに
よりカウントする。使用した膜のタンパク質濃度をブラ
ッドッフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）法（２２）によ
り、標準としてウシ血清アルブミンを使用して測定す
る。

【００３９】トランスフェクションしないＣＭＴ細胞か
らの膜を対照として使用する。アデニリルシクラーゼ活
性のアッセイの結果を表１に示す：

【００４０】

【表１】 表１ 基底＊ ＮａＦ＊ ＧＴＰｑＳ＊ フォルスコリン＊ 対照 4±0.7 17±3 30±5 61±11 トランスフェ クションした 9±1 46±5 114±12 223±27 ＊対照＜トランスフェクションした、ｐ＜０．０５、対照（ｎ＝６）、トランスフェクションした（ｎ＝８） このｃＤＮＡにより発現されたアデニリルシクラーゼ
は、１０ミリモルのフッ化物、１００ミリモルのＣＴＰ
ｑＳおよび１００ミリモルのフォルスコリンにより良好
に刺激される。それは対照により２．７、３．８および
３．７倍多い刺激を示す。値は±標準偏差で示す。

【００４１】トランスフェクションした細胞の中のアデ
ニリルシクラーゼの基底活性の増加は、また、観測され
る。これは心臓の組織において見られる高い基底シクラ
ーゼ活性と一致する。

【００４２】心臓のアデニリルシクラーゼ（Ｂ型）の組
織の分布を明瞭にするために、ノザンブロッティングを
種々の組織からのｍＲＮＡを使用して実施する。メッセ
ンジャーＲＮＡをグアニジウムナトリウム（２０）およ
びオリゴ−ｄＴのカラムを使用して種々のイヌ組織（心
臓、脳、精巣、骨格筋、腎臓および肺）から精製する。
５ｍｇのｍＲＮＡを各アッセイのために使用する（ブロ
ットのレーン当たり）。

【００４３】ブロットを５０％のホルムアミド、５×Ｓ
ＳＣ、５×デンハルト（Ｄｅｎｈａｒｄｔ）溶液、２５
ミリモルのＮａＰＯ₄（ｐＨ６．５）、０．２５ｍｇ／
ｍｌの子ウシ胸腺ＤＮＡおよび０．１％のＳＤＳを含有
する溶液の中で４２℃において２時間インキュベーショ
ンした後、プローブを添加する。アデニリルシクラーゼ
ｃＤＮＡのクローン＃２７からの全体の５．４ｋｂのＣ
ＤＮＡ断片をプローブとして使用する。プローブは³²Ｐ
−ｄＣＴＰを使用してマルチプライマーランダム標識つ
け法により作る。ハイブリダイゼーションは４２℃にお
いて１８時間実施し、次いでストリンジェントの増加す
る条件下に洗浄する。次いで、ブロットをオートラジオ
グラフィーにかける。

【００４４】ノザンブロット分析の結果を図１０に描写
し、これらの結果が示唆するように、メッセージは心臓
において、ならびに脳において、最も豊富であるが、他
の組織、例えば、精巣、骨格筋、腎臓および肺における
発現は非常に少ない。

【００４５】クローン＃２７からの断片とハイブリダイ
ゼーションするメッセージの単一のクラスは６ｋｂの大
きさであり、Ａ型のシクラーゼについてのｃＤＮＡを含
有するクローン＃１１３のメッセージ（５および７ｋ
ｂ）と明瞭に区別される。

【００４６】引用文献 １、サルター（Ｓａｌｔｅｒ）、Ｒ．Ｓ．、ｅｔ ａ
ｌ．、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２５６、９８３０−
９８３３（１９８１）。

【００４７】２、プフェウッファー（Ｐｆｅｕｆｆｅ
ｒ）、Ｅ．、ｅｔ ａｌ．、ＥＭＢＯＪ．、４、３６７
５−３６７９（１９８５）。

【００４８】３、モルナー（Ｍｏｌｌｎｅｒ）、Ｓ．、
ｅｔ ａｌ．、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイ
オケミストリー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、１
９５、２８１−２８６（１９９１）。

【００４９】４、リビングストーン（Ｌｉｖｉｎｇｓｔ
ｏｎｅ）、Ｍ．Ｓ．、ｅｔ ａｌ．、細胞（Ｃｅｌ
ｌ）、３７、２０５−２１５（１９８５）。

【００５０】５、クルピンスキー（Ｋｒｕｐｉｎｓｋ
ｉ），Ｊ．、ｅｔ ａｌ．、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ）、２４４、１５５８−１５６４（１９８９）。

【００５１】６、タング（Ｔａｎｇ）、Ｗ−Ｔ、ｅｔ
ａｌ．、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２６６、８５９５
−８６０３（１９９１）。

【００５２】７、バカルヤー（Ｂａｋａｌｙａｒ）、
Ｈ．Ａ．およびリード（Ｒｅｅｄ）、Ｒ．Ｒ．、サイエ
ンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２５０、１４０３−１４０６
（１９９０）。

【００５３】８、プフェウッファー（Ｐｆｅｕｆｆｅ
ｒ）、Ｅ．、ｅｔ ａｌ．、プロシーディングス・オブ
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ、８２、
３０８６−３０９０（１９８５）。

【００５４】９、モルナー（Ｍｏｌｌｎｅｒ）、Ｓ．お
よびプフェウッファー（Ｐｆｅｕｆｆｅｒ）、Ｔ．、ヨ
ーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー
（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、１７１、２６５−
２７１（１９８８）。

【００５５】１０、チェン（Ｃｈｅｎ）、Ｌ．、ｅｔ
ａｌ．、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティ
ゲーション（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．）、８７、
２９３−２９８（１９９１）。

【００５６】１１、カイト（Ｋｙｔｅ）、Ｊ．およびド
ーリトル（Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ）、Ｒ．Ｆ．、ジャーナ
ル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ．）、１５７、１０５−１３２（１９８２）。

【００５７】１２、ワトソン（Ｗａｔｓｏｎ）、Ｃ．
Ｊ．およびジャクソン（Ｊａｃｋｓｏｎ）、Ｊ．Ｆ．、
ＤＮＡのクローニング：実際のアプローチ（ＤＮＡ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａ
ｃｈ）、グロウバー（Ｇｌｏｖｅｒ）、Ｄ．Ｍ．編、Ｖ
ｏｌ．１、ｐｐ．７９−８８（１９８５）。

【００５８】１３、テイバー（Ｔａｂｏｒ）、Ｓ．およ
びリチャードソン（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ）、Ｃ．
Ｃ．、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ、８４、４７６７−４７７１
（１９８７）。

【００５９】１４、インニス（Ｉｎｎｉｓ）、Ｍ．
Ａ．、ｅｔ ａｌ．、プロシーディングス・オブ・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ、８５、９４３
６−９４４０（１９８８）。

【００６０】１５、コザク（Ｋｏｚａｋ）、Ｍ．、ジャ
ーナル・オブ・セル・バクテリオロジー（Ｊ．Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌ．）、１０８、２２９−２４１（１９８
９）。

【００６１】１６、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、
ｅｔ ａｌ．、分子クローニング：実験室のマニュアル
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、コールド・スプリング
・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、（１９８
２）。

【００６２】１７、グーラブ（Ｇｏｏｌｕｂ）、Ｅ．
Ｉ．、ｅｔ ａｌ．、核酸の研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、１７、４９０２（１９
８９）。

【００６３】１８、ロベレチト（Ｒｏｂｂｅｒｅｃｈ
ｔ）、Ｐ．、ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒ
ｍａｃｏｌ．３０、３８５−３８７（１９８１）。

【００６４】１９、チャテライン（Ｃｈａｔｅｌａｉ
ｎ）、Ｐ．、ｅｔ ａｌ．、ヨーロピアン・ジャーナル
・オブ・ファーマコロジー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａ
ｃｏｌ．）、７２、１７−２５（１９８１）。

【００６５】２０、パーマー（Ｐａｌｍｅｒ）、Ｇ．
Ｃ．およびグリーンバーグ（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ）、
Ｓ．、ファーマコロジー（Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇ
ｙ）、１９、１５６−１６２（１９７９）。

【００６６】２１、サロモン（Ｓａｌｏｍｏｎ）、
Ｙ．、Ａｄｖ．Ｃｙｃｌｉｃ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
Ｒｅｓ．、１０、３５−５５（１９７９）。

【００６７】２２、ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒ
ｄ）、Ｍ．、アナリティカル・バイオケミストリー（Ａ
ｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、７３、２４８（１９７
６）。

【００６８】２３、チョムクジンスキー（Ｃｈｏｍｃｚ
ｙｎｓｋｉ）、Ｐ．およびサッチ（Ｓａｃｃｈｉ）、
Ｎ．、アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａ
ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、１６２、１５６−１５９（１
９８７）。

【００６９】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１ 配列の型：核酸 配列の長さ：３７２１塩基対 鎖：一本鎖 トポロジー：直線

【００７０】

【化１】

【００７１】

【化２】

【００７２】

【化３】

【００７３】

【化４】

【００７４】

【化５】

【００７５】

【化６】

【００７６】

【化７】

【００７７】

【化８】

【００７８】

【化９】

【００７９】

【化１０】

【００８０】

【化１１】

【００８１】

【化１２】

【００８２】本発明の主な特徴および態様は、次の通り
である。

【００８３】１、そのヌクレオチド配列の実質的な部分
として、図２乃至図７に描写する配列、またはその一部
分、あるいは生物学的に活性な心臓のアデニリルシクラ
ーゼをエンコードする、前記配列の生物学的同等の配列
を有する、精製および分離された遺伝子。

【００８４】２、上記第１項記載の遺伝子を発現ベクタ
ーの中に組み込み、宿主細胞を前記ベクターで形質転換
し、そして形質転換された宿主細胞を遺伝子の発現を生
ずる条件下に培養する、ことからなる、心臓のアデニリ
ルシクラーゼを産生する方法。

【００８５】３、発現ベクターはバクテリア、ウイル
ス、酵母菌、昆虫または哺乳動物の細胞系からなる、上
記第２項記載の方法。

【００８６】４、発現ベクターはｐｃＤＮＡａｍｐ／２
７−６である、上記第３項記載の方法。

【００８７】５、上記第１項記載の遺伝子を含む発現ベ
クター。

【００８８】６、前記ベクターはバクテリア、ウイル
ス、酵母菌、昆虫または哺乳動物の細胞系からなる、上
記第５項記載の発現ベクター。

【００８９】７、プラスミドである、上記第６項記載の
発現ベクター。

【００９０】８、ｐｃＤＮＡａｍｐ／２７．６である、
上記第７項記載の発現ベクター。

【００９１】９、上記第１項記載の遺伝子を組み込んだ
発現ベクターで形質転換された宿主細胞（ＡＴＣＣ ６
８８２６）。

【００９２】１０、ｐｃＤＮＡａｍｐ／２７−６で形質
転換されたＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５アルファ菌株である、
上記第９項記載の細胞。

【００９３】１１、そのアミノ酸配列の実質的な部分と
して、図２乃至図７に描写する配列、またはその一部
分、あるいは心臓のアデニリルシクラーゼの生物学的活
性を保持する、前記配列の生物学的同等の配列を有す
る、精製および分離された心臓のアデニリルシクラー
ゼ。

【図面の簡単な説明】

【図１】心臓のアデニリルシクラーゼ（Ｂ型）の部分的
制限地図およびｃＤＮＡのクローンを描写する。パネル
ＡはアデニリルシクラーゼｃＤＮＡの部分的制限地図を
描写する。解読部分はボックスで囲まれており、そして
斜線を施したボックスはポリアデニル化部位を示す。Ｎ
はＮａｒＩ制限部位であり、ＳはＳｐｈＩであり、ＳＳ
はＳｓｐＩでありそしてＰはＰｓｔＩである；ＡＴＧは
翻訳開始コドンを示し、そしてＴＡＧは翻訳停止コドン
を示す。パネルＢは、イヌの心臓のｇｇｔ１０ライブラ
リーから得られた、番号６および２７の２つのｃＤＮＡ
のクローンを描写する。

【図２】心臓のアデニリルシクラーゼのＤＮＡおよび予
測されるアミノ酸配列を描写する。全体の解読配列、な
らびに５’および３７非翻訳配列が示されている。全体
の配列決定はセクエナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）また
はＴａｑポリメラーゼを使用してジデオキシ配列決定に
より２回２方向に実施される。矢印はオープンリーディ
ングフレームの中の可能な翻訳開始部位（ＡＴＧ）を示
す。このＡＴＧは大部分の保存されたコザク（Ｋｏｚａ
ｋ）コンセンサス配列により達成される。

【図３】心臓のアデニリルシクラーゼのＤＮＡおよび予
測されるアミノ酸配列を描写する。全体の解読配列、な
らびに５’および３７非翻訳配列が示されている。全体
の配列決定はセクエナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）また
はＴａｑポリメラーゼを使用してジデオキシ配列決定に
より２回２方向に実施される。矢印はオープンリーディ
ングフレームの中の可能な翻訳開始部位（ＡＴＧ）を示
す。このＡＴＧは大部分の保存されたコザク（Ｋｏｚａ
ｋ）コンセンサス配列により達成される。

【図４】心臓のアデニリルシクラーゼのＤＮＡおよび予
測されるアミノ酸配列を描写する。全体の解読配列、な
らびに５’および３７非翻訳配列が示されている。全体
の配列決定はセクエナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）また
はＴａｑポリメラーゼを使用してジデオキシ配列決定に
より２回２方向に実施される。矢印はオープンリーディ
ングフレームの中の可能な翻訳開始部位（ＡＴＧ）を示
す。このＡＴＧは大部分の保存されたコザク（Ｋｏｚａ
ｋ）コンセンサス配列により達成される。

【図５】心臓のアデニリルシクラーゼのＤＮＡおよび予
測されるアミノ酸配列を描写する。全体の解読配列、な
らびに５’および３７非翻訳配列が示されている。全体
の配列決定はセクエナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）また
はＴａｑポリメラーゼを使用してジデオキシ配列決定に
より２回２方向に実施される。矢印はオープンリーディ
ングフレームの中の可能な翻訳開始部位（ＡＴＧ）を示
す。このＡＴＧは大部分の保存されたコザク（Ｋｏｚａ
ｋ）コンセンサス配列により達成される。

【図６】心臓のアデニリルシクラーゼのＤＮＡおよび予
測されるアミノ酸配列を描写する。全体の解読配列、な
らびに５’および３７非翻訳配列が示されている。全体
の配列決定はセクエナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）また
はＴａｑポリメラーゼを使用してジデオキシ配列決定に
より２回２方向に実施される。矢印はオープンリーディ
ングフレームの中の可能な翻訳開始部位（ＡＴＧ）を示
す。このＡＴＧは大部分の保存されたコザク（Ｋｏｚａ
ｋ）コンセンサス配列により達成される。

【図７】心臓のアデニリルシクラーゼのＤＮＡおよび予
測されるアミノ酸配列を描写する。全体の解読配列、な
らびに５’および３７非翻訳配列が示されている。全体
の配列決定はセクエナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）また
はＴａｑポリメラーゼを使用してジデオキシ配列決定に
より２回２方向に実施される。矢印はオープンリーディ
ングフレームの中の可能な翻訳開始部位（ＡＴＧ）を示
す。このＡＴＧは大部分の保存されたコザク（Ｋｏｚａ
ｋ）コンセンサス配列により達成される。

【図８】心臓のアデニリルシクラーゼのヒドロパシーの
プロットを描写する。マクベクター（ＭａｃＶｅｃｔｏ
ｒ）３．５のソフトウェアを使用して、心臓のアデニリ
ルシクラーゼの膜関係構造を分析する。カイト（Ｋｙｔ
ｅ）およびドーリトル（Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ）（１１）
を７のウィンドウの大きさで使用する。

【図９】心臓のアデニリルシクラーゼのＡ型およびＢ型
の間のＤＮＡのドットのマトリックスの比較を描写す
る。マクベクター（ＭａｃＶｅｃｔｏｒ）３．０のソフ
トウェアを使用して、６５％のストリンジェンシーおよ
び８のウィンドウの大きさで分析する。

【図１０】心臓のアデニリルシクラーゼｃＤＮＡからの
断片により種々のイヌの組織のノザンブロット分析を描
写する。レーンは次の通りである：Ｈ−心臓、Ｂ−脳、
Ｔ−精巣、Ｓ−骨格筋、Ｋ−腎臓、Ｌ−肺。標準（キロ
塩基（ｋｂ））はブロットの左にある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 そのヌクレオチド配列の実質的な部分と
   して、図２乃至図７に描写する配列、またはその一部
   分、あるいは生物学的に活性な心臓のアデニリルシクラ
   ーゼをエンコードする、前記配列の生物学的同等の配列
   を有する、精製および分離された遺伝子。
2. 【請求項２】 請求項１の遺伝子を発現ベクターの中に
   組み込み、宿主細胞を前記ベクターで形質転換し、そし
   て形質転換された宿主細胞を遺伝子の発現を生ずる条件
   下に培養する、ことからなる、心臓のアデニリルシクラ
   ーゼを産生する方法。
3. 【請求項３】 請求項１の遺伝子を含む発現ベクター。
4. 【請求項４】 請求項１の遺伝子を組み込んだ発現ベク
   ターで形質転換された宿主細胞（ＡＴＣＣ ６８８２
   ６）。
5. 【請求項５】 そのアミノ酸配列の実質的な部分とし
   て、図２乃至図７に描写する配列、またはその一部分、
   あるいは心臓のアデニリルシクラーゼの生物学的活性を
   保持する、前記配列の生物学的同等の配列を有する、精
   製および分離された心臓のアデニリルシクラーゼ。