JP3907247B2 - Ｔａｂ１蛋白質及びそれをコードするｄｎａ - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は形質転換増殖因子−β（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ −β；ＴＧＦβ）のシグナル伝達系の１員であるＴＡＢ１蛋白質、及びそれをコードする遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＴＧＦ−βは、細胞機能の多くの面を制御する多機能因子である。その一面として、ＴＧＦ−βは様々な傷害に伴う組織の修復及び再生を司る。
慢性化した傷害におけるＴＧＦ−β異常産生により、組織の修復、再生のバランスが崩れ病的な線維化が生ずることがある。ＴＧＦ−β産生のバランスが崩れた病態として、肝線維症が知られている。肝臓において、ＴＧＦ−βは線維化の原因となる細胞外マトリックス蛋白質の産生を亢進させ、細胞外マトリックス蛋白質分解酵素の合成を阻害および分解酵素の阻害物質を誘導することにより、肝線維症の主要な原因因子として働く。
【０００３】
ＴＧＦ−βのスーパーファミリーのメンバーのシグナル伝達系の１メンバーとして、マイトジエン−活性化プロテイン・キナーゼ・キナーゼ・キナーゼ（Ｍｉｔｏｇｅｎ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ Ｋｉｎａｓｅ Ｋｉｎａｓｅ；ＭＡＰＫＫＫ）系が知られている。
【０００４】
ＭＡＰＫ経路は受容体のシグナルを種々の作用に転換する保存された真核性シグナル伝達系であり、この系は３種類のプロテインキナーゼ、すなわち前記のＭＡＰＫＫＫ，ＭＡＰＫＫ及びＭＡＰＫを含んでおり、ＭＡＰＫはＭＡＰＫＫによるリン酸化により活性化され、ＭＡＫＫはＭＡＰＫＫＫにより活性化される（E. Nishidaら、Trends Biochem. Sci. Vol.18, p.128 (1993) ; K. J. Blu mer ら、前掲Vol.19, p.236 (1994) ; R.J.David、前掲Vol.19, p.470 (1994) ; C.J.Marchall, Cell, Vol.80, p.179 (1995))。
【０００５】
ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーのシグナル伝達系において機能するＭＡＰＫＫＫファミリーの１メンバーであるＴＡＫ１はK.Yamaguchi らにより同定された (K.Yamaguchi ら、Science, Vol.270, p.2008 (1995))。
ＴＧＦ−βは、細胞質側にセリン−及びスレオニン−特異的キナーゼドメインを含有する膜貫通蛋白質である１型及び２型ＴＧＦ−β受容体のヘテロマーコンプレックスを介してシグナルを伝達する（J.L.Wrana ら、Nature, Vol.370, p.341 (1994) ; D.M.Kingsleyら、Genes Dev., Vol.8, p.133 (1994))。しかしながらＴＧＦ−β受容体から下流のシグナル伝達機構は分子レベルにおいてほとんど知られていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明は、ＴＧＦ−β受容体のシグナル伝達系の新しく見出された１メンバーであるＴＡＢ１蛋白質及びそれをコードする遺伝子を提供しようとするものである。さらに、本発明はＴＧＦ−βシグナル伝達系阻害物質のスクリーニング方法を提供する。なお、ＴＡＢ１は、ＴＡＫ１に結合する蛋白質（ＴＡＫ１ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ）を意味する。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記の課題を解決するため、本発明は、配列番号：１に示すアミノ酸配列を有するＴＡＢ１蛋白質；配列番号：１に示すアミノ酸配列に対して、１又は複数のアミノ酸の置換、欠失及び／又は付加によって修飾されているアミノ酸配列を有し、且つＴＡＢ１蛋白質の生物学的性質を有する蛋白質；配列番号１に示すアミノ酸配列において５２番目のアミノ酸がアルギニンである蛋白質；配列番号：１に示すヌクレオチド配列を有するＤＮＡに対して６０℃、０．１×ＳＳＣ，０．１％ドデシル硫酸ナトリウムのハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡによりコードされており、且つＴＡＢ１蛋白質の生物学的活性を有する蛋白質；配列番号：１に示すアミノ酸配列において、アミノ酸位置２１位〜５７９位のアミノ酸から成るアミノ酸配列を有する蛋白質；並びに配列番号：１に示すアミノ酸配列において、アミノ酸位置４３７位〜５０４位の６８個のアミノ酸から成るアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。
【０００８】
本発明はまた、上記の蛋白質又はポリペプチドの製造方法において、該蛋白質又はポリペプチドをコードするＤＮＡを含んで成る発現ベクターにより形質転換された宿主を培養し、該培養物から該蛋白質又はポリペプチドを採取することを特徴とする方法を提供する。
本発明はまた、上記の蛋白質又はポリペプチドを哺乳類細胞において生成せしめる方法において、該蛋白質又はポリペプチドをコードするＤＮＡを哺乳動物細胞に導入することを特徴とする方法を提供する。
【０００９】
本発明はまた、前記の蛋白質又はポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含んで成る発現ベクター、及び該発現ベクターにより形質転換された宿主を提供する。
本発明はさらに、ＴＧＦ−βシグナル伝達系阻害物質のスクリーニング方法を提供する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明のＴＡＢ１蛋白質は、形質転換増殖因子−β（ＴＧＦ−β）のシグナル伝達経路においてＴＡＫ１に結合してＴＡＫ１を活性化する性質を有する。この性質及びその他の諸性質については実施例２〜４及び６〜１０に詳細に記載されている。
本発明のＴＡＢ１蛋白質は、実施例１及び５に記載する方法によりクローニングされたｃＤＮＡのヌクレオチド配列から推定されるアミノ酸配列（配列番号：１）を有する。
【００１１】
しかしながら、生物学的活性を有する蛋白質において、１又は複数のアミノ酸の置換、欠失及び／又は付加により修飾されたアミノ酸配列を有するものでも、生来の蛋白質が有する生物学的性質を保持することがよく知られている。従って、本発明は、配列番号：１に示すアミノ酸配列に対して１又は複数のアミノ酸の置換、欠失及び／又は付加により修飾されたアミノ酸配列を有し、且つＴＡＢ１の生物学的性質を有するものを含む。
その一態様として、配列番号１に示されるアミノ酸配列において５２番目のアミノ酸がアルギニンである蛋白質が挙げられる。
【００１２】
さらに、一旦特定の蛋白質をコードするＤＮＡがクローニングされれば、そのＤＮＡをプローブとして、例えばその蛋白質が得られた種の器官又は組織とは異る器官又は組織からのＤＮＡライブラリーあるいは他の種からのＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、同様の生物学的性質を有するがアミノ酸配列を異にする蛋白質をコードするＤＮＡが得られることも知られている。従って、本発明は、配列番号：１に示すヌクレオチド配列を有するＤＮＡに対して、例えば６０℃、０．１×ＳＳＣ，０．１％ドデシル硫酸ナトリウムのハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡによりコードされており、且つＴＡＢ１蛋白質の生物学的性質を有する蛋白質をも包含する。
【００１３】
本発明の修飾された蛋白質としては、例えば、配列番号：１のアミノ酸配列において、アミノ酸位置２１位〜５７９位のアミノ酸から成るアミノ酸配列を有する蛋白質が挙げられる。この蛋白質はＴＡＢ１蛋白質の生物学的性質を有している。また、本発明の修飾されたポリペプチドとして、配列番号：１に示すアミノ酸配列において、アミノ酸位置４３７位〜５０４位の６８個のアミノ酸から成るアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられる。このポリペプチドはＴＡＫ１に結合することによって、ＴＡＫ１のキナーゼ活性を活性化する性質を有する。さらに、本発明の修飾された蛋白質として、上記蛋白質又はポリペプチドが他の蛋白質と融合しており、かつＴＡＢ１の生物学的活性を有する蛋白質が挙げられる。
【００１４】
本発明の蛋白質又はポリペプチドは、例えば、ＴＧＦ−βのシグナル伝達系に重要なＴＡＫ１を活性化することによってＴＧＦ−βの生理機能をそれ自身で模倣できるほか、ＴＡＫ１と結合することを利用してＴＡＫ１とＴＡＢ１の結合を阻害し、細胞増殖抑制、免疫抑制、骨分化などの作用に対するアゴニストあるいはアンタゴニストとして働く物質のスクリーニング方法のために有用である。
【００１５】
本発明の蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば、配列番号：１に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡである。このようなＤＮＡは例えば、実施例１及び５に記載する方法により得ることができ、配列番号：１のヌクレオチド配列を有する。しかしながら、配列番号：１に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、必ずしも配列番号：１に示すヌクレオチド配列を有する必要はなく、同一のアミノ酸をコードする別のコドンから構成されていてもよい。例えば、配列番号：１に示すヒト由来のヌクレオチド配列を、細菌や酵母等の微生物において効率よく翻訳されるコドンを含むものに変えることができ、これは、例えばプライマーを用いる部位特定変異誘発等の周知技術を用いて行うことができる。
【００１６】
本発明の、配列番号：１に示すアミノ酸配列に対して、１又は複数のアミノ酸配列が置換、欠失及び／又は付加されているアミノ酸配列を有する蛋白質又はポリペプチドをコードするＤＮＡは、例えば、配列番号：１に示すヌクレオチド配列を有するＤＮＡを鋳型とし、部位特定変異誘発法、ＰＣＲ法等、それ自体周知の方法を用いて作製することができる。さらにまた、修飾されたアミノ酸配列を有する蛋白質の内、生来の蛋白質に比較して短縮された蛋白質又はポリペプチドをコードするＤＮＡは、例えば、生来のＤＮＡ、例えばｃＤＮＡに翻訳開始コドン及び／又は翻訳終止コドンを導入することによって得ることもできる。これらのコドンの導入は、例えば部位特定変異誘発、ＰＣＲ法等により行うことができる。あるいは、生来のＤＮＡ、例えばｃＤＮＡを適当な制限酵素により切断し、そして所望によりオリゴヌクレオチドを付加することによっても得られる。
【００１７】
本発明の配列番号：１に示すヌクレオチド配列を有するＤＮＡとハイブリダイズすることができ、且つＴＡＢ１の生物学的性質を有する蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば、実施例６に示す種々の組織又は器官、例えば心臓、脳、胎盤、肝臓、骨格筋、腎臓、すい臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、結腸、末梢血白血球等から調製したゲノミックＤＮＡライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーを、本発明の、例えば配列番号：１に示すヌクレオチド配列又はその部分をプローブとして用いて、スクリーニングすることにより行われる。上記のＤＮＡライブラリーは、ヒトに由来するもののみならず、他の動物、例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ブタ等に由来するものであってもよい。
【００１８】
本発明はまた、上記のＤＮＡを含んで成る発現ベクター及びそれにより形質転換された宿主に関する。発現ベクターは宿主により異る。本発明の宿主としては、原核生物及び真核生物のいずれも使用することができる。原核生物としては、細菌、例えばエシェリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属の微生物、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属微生物、例えばバシルス・ズブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、等が使用され、真核生物としては、下等真核生物、例えば糸状菌又は酵母が挙げられる。
【００１９】
糸状菌としては、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属微生物、例えばアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｉｚａｅ）等、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属微生物、等が挙げられ、酵母としては、例えばサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属微生物、例えばサッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等が挙げられる。
【００２０】
また、高等真核生物としては動植物細胞、例えば不滅化された動物培養細胞例、例えばＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３等が使用できる。また、昆虫細胞、例えばＳｆ９，Ｓｆ１２等も使用できる。
本発明の発現ベクターは、本願発明の蛋白質又はポリペプチドをコードするＤＮＡのほかに、上記の宿主において機能し得る発現制御配列、例えばプロモーターを含有する。
【００２１】
細菌、例えば大腸菌のプロモーターとしては、Ｔ３，Ｔ７等が使用でき、酵母のプロモーターとしては、例えば解糖系酵素の遺伝子のプロモーター、例えばＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ４プロモーター等が挙げられる。動物細胞用のプロモーターとしてはウイルス性プロモーター、例えばＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター等が挙げられる。
発現ベクターによる宿主の形質転換、宿主の培養、培養物からの本発明の蛋白質又はポリペプチドの採取・精製は、常法に従って行うことができる。例えば、培養物から蛋白質又はポリペプチドの単離・精製は、蛋白質又はポリペプチドを単離・精製するための常用手段、例えば硫酸アンモニウム沈澱法、ゲル濾過法、逆相ＨＰＬＣ等を単独で、又は組合わせて用いることができる。
【００２２】
本発明はさらに、ＴＧＦ−βシグナル伝達系阻害物質のスクリーニング方法に関する。ＴＡＢ１の生物学的活性を有する蛋白質とＴＡＫ１（K.Yamaguchi ら、Sceince,vol.270,p2008(1995))を発現する細胞にＴＧＦ−βシグナル伝達系阻害物質を含む試料を接触させるか又は導入し、次いでＴＡＫ１の活性を測定する。ＴＡＢ１の生物学的活性を有する蛋白質又はポリペプチドおよびＴＡＫ１は他の蛋白質との融合蛋白質でもよく、これらを発現する細胞は酵母あるいは哺乳類細胞である。このようなスクリーニング系は、実施例１，２，３，４，７，８および９に記載する方法により構築することができる。
【００２３】
構築したスクリーニング系へＴＧＦ−βシグナル伝達系阻害物質を含む試料を接触させるか又は導入し、ＴＡＫ１のキナーゼ活性を測定する。ＴＡＫ１のキナーゼ活性の測定方法は、ＴＡＫ１自身のキナーゼ活性を測定してもよいし、シグナル伝達系のＴＡＫ１の下流に存在しＴＡＫ１により活性化されるＭＡＰＫＫやＭＡＰＫのキナーゼ活性を測定してもよい。また、ＭＡＰＫ経路の標的遺伝子や標的遺伝子プロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子の活性、ｍＲＮＡ量又は遺伝子の表現型により測定することができる。
本発明のＴＧＦ−βシグナル伝達系阻害物質のスクリーニング方法によれば、ＴＧＦ−βの異常産生が関与する疾患の治療剤となり得る、ＴＡＢ１とＴＡＫ１の結合を阻害する物質をスクリーニングすることができる。
【００２４】
【実施例】
次に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
実施例１．
ＴＧＦ−βシグナル伝達において機能するＴＡＫ１−依存性経路を解析するため、酵母２−ハイブリッド系（S.Freldsら、Trend Genet. 10,286 (1994)) を用いて、ＴＡＫ１と直接相互作用する蛋白質を探索した。
【００２５】
まず、ＴＡＫ１遺伝子とＬｅｘＡ ＤＮＡ−結合ドメインをコードする遺伝子とを連結せしめることにより発現ベクターを作製した。ｐＬｅｘＡ−ＴＡＫ１ΔＮは、ｐＢＴＭ１１６（A.B.Vojtekら、Cell, Vol.74, p.205 (1993)) にフレームを合わせて挿入したＴＡＫ１ΔＮコード配列（K.Yamaguchi ら、Science, Vol.270, p.2008 (1995))を含有する。ヒト脳ｃＤＮＡライブラリー中にコードされており、ＴＡＫ１ΔＮと相互作用する蛋白質を同定するために酵母２−ハイブリッド系を使用した。
【００２６】
酵母ＨＩＳ３コード領域の上流にＬｅｘＡ蛋白質のための結合部位が配置されている一体化されたレポーター構成物を含有するサッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｌ４０株（ＬＹＳ２：：ＬｅｘＡ−ＨＩＳ３）において２つのハイブリッドを発現させた。２つのハイブリッド蛋白質が相互作用すれば、前記レポーター構成物のトランスアクチベーションが起こり、そして酵母はヒスチジンの非存在下（ＳＣ−Ｈｉｓ）で増殖することができる。
【００２７】
ＬｅｘＡ−ＴＡＫ１ΔＮ融合体は単独で、外部からのヒスチジンを必要としないで増殖を可能にするのに十分な量のＨＩＳ３の発現をもたらす。しかしながら、ＨＩＳ３遺伝子の産物であるイミダゾール・グリセロール・デヒドロケナーゼの化学阻害剤である４０mM ３−アミノトリオゾール（３−ＡＴ）の存在下で細胞を増殖せしめることによりヒスチジン栄養要求性を達成することができる（G.M.Kishore ら、Annu. Rev. Biochem. Vol.57, p.627 (1988)) 。
【００２８】
この誘引（ｂａｉｔ）プラスミドを、ＧＡＬ４活性化ドメイン（ＧＡＤ）をコードする遺伝子と連結させたヒト脳ｃＤＮＡ発現ライブラリークローンを含有する捕獲プラスミドと共に酵母を形質転換した。約１×１０6 個の形質転換体から、蛋白質をコードする陽性クローンＴＡＢ１ｃＤＮＡを得た。以後において、このＤＮＡ単離物により発現されるＧＡＤ融合蛋白質をＧＡＤ−ＴＡＢ１と称する。
【００２９】
実施例２．
ＴＡＢ１との相互作用を司るＴＡＫ１中の位置を決定するため、一連のＬｅｘＡ−ＴＡＫ１欠失キメラ体を２−ハイブリッド測定により試験した。ＬｅｘＡ ＤＮＡ−結合ドメインに融合した全長ＴＡＫ１又はその欠失構成物をコードする発現ベクターを、ｐＧＡＤ−ＴＡＢ１と共に、酵母レポーター株Ｌ４０に同時形質転換した。なお、ＴＡＫ１の各欠失構成物をコードするＤＮＡは全長ＴＡＫ１をコードするＤＮＡから作製した。
【００３０】
また、前記プラスミドｐＧＡＤ−ＴＡＢ１は、ＴＡＢ１ｃＤＮＡをｐＢＳ（W.O.Bullock ら、Biotechniques Vol.5,p.376(1987))のＥcoＲＩ部位にサブクローニングすることにより得たものである。このプラスミドにより発現される融合蛋白質間の相互作用が、４０mM ３−ＡＴを含有するＳＣ−Ｈｉｓ培地のプレート上で増殖する酵母株の能力により示される。この結果を図１に示す。この図中右側に、ＴＡＫ１又はその欠失体と、ＴＡＢ１とが相互作用した（＋）か、又はしなかった（−）かを示す。この結果から、ＴＡＢ１はＴＡＫ１のＮ−末端側ドメインと相互作用することが示された。
【００３１】
実施例３．
ＴＡＫ１と相互作用する蛋白質は上流の制御部及び下流の標的の両方を含む可能性がある。ＴＡＢ１がＴＡＫ１の活性化に役割を演ずるのであれば、それらの同時発現が酵母におけるＴＡＫ１の活性に影響を与えると予想される。本発明者らは、酵母フェロモン−誘導ＭＡＰＫ経路において哺乳類ＭＡＰＫＫＫ活性を測定するための系を開発している（K.Yamaguchi ら、Science, Vol.270, p.2008 (1995) ; K.Irieら、 Science, Vol.265 , p.1716 (1994))。ＴＡＫ１の活性化された形態（ＴＡＫ１ΔＮ）はＳｔｅ１１ ＭＡＰＫＫＫ活性を代替することができる。
【００３２】
すなわち、フェロモン−活性化ＭＡＰＫ径路はＳｔｅ１１，Ｓｔｅ７、及びＦｕｓ３又はＫｓｓ１キナーゼから成り、これらはそれぞれＭＡＰＫＫＫ，ＭＡＰＫＫ及びＭＡＰＫに対応する。これらの酵母プロテインキナーゼは次々に作用してシグナルを転写因子Ｓｔｅ１２に伝達し、このＳｔｅ１２はＦＵＳ１のごとき接合特異的（ｍａｔｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃ）遺伝子の転写を活性化する（I.Herskowitz, Cell, Vol.80, p.187 (1995) ; D.E.Levinら、Curr. Opin. Cell Biol., Vol.7, p.197 (1995) ; J.Schultz ら、Jr. Curr. Opin. Gene Dev., No.5, p.31 (1995)) 。
【００３３】
ＦＵＳ１ｐ：：ＨＩＳ３レポーター遺伝子は、ＨＩＳ３オープンリーディングフレームに連結されたＦＵＳ１上流活性化配列を含んで成り、そしてｈｉｓ３ΔＦＵＳ１ｐ：：ＨＩＳ３株におけるシグナル活性を、ＳＣ−Ｈｉｓ培地上で増殖する細胞の能力（Ｈｉｓ表現型）によりモニターすることを可能にする。
ｈｉｓ３Δｓｔｅ１１ΔＦＵＳ１ｐ：：ＨＩＳ３ＳＴＥ７P368（セリン−３６８におけるプロリン置換）株はＨｉｓ- 表現型を有する（K.Irieら、Science, Vol.265, p.1716 (1994))。
【００３４】
この株におけるＴＡＫ１ΔＮの発現がＨｉｓ+ 表現型をもたらす（K.Yamaguchi ら、Science, Vol.270, p.2008 (1995))。従って、ＴＡＫ１の活性化型はＳｔｅ７P368−依存的にＳｔｅ１１活性を代替することができる。しかしながら全長ＴＡＫ１の発現はｓｔｅ１１Δ変異を回復せず、酵母はＴＡＫ１のための仮定の活性化因子を有しないことが示唆される（K.Yamaguchi ら、Science, Vol.270, p.2008 (1995))。
【００３５】
酵母ＭＡＰＫ経路を用いて、ＧＡＤ−ＴＡＢ１構成物を、ＴＡＫ１の存在下でｓｔｅ１１Δ変異を補完するそれらの能力について試験した。すなわち、酵母ＳＹ１９８４−Ｐ株（ｈｉｓ３Δｓｔｅ１１ΔＦＵＳ１ｐ：：ＨＩＳ３ＳＴＥ７P368）を、ｐＮＶ１１−ＨＵ１１（ＴＡＫ１ΔＮ）＋ｐＧＡＤ１０（ＧＡＤ）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）；ｐＮＶ１１−ＨＵ１１Ｆ（ＴＡＫ１）＋ｐＧＡＤ１０；ｐＮＶ１１−ＨＵ１１Ｆ＋ｐＧＡＤ−ＴＡＢ１；又はｐＮＶ１１＋ｐＧＡＤ−ＴＡＢ１により形質転換し、そして形質転換体をＳＣ−Ｈｉｓプレート上にまき、そして３０℃にてインキュベートした。
【００３６】
なお、上記ＳＹ１９８４−Ｐ株は、ＳＹ１９８４株（ｈｉｓ３Δｓｔｅ１１ΔＦＵＳ１ｐ；；ＨＩＳ３）を、ＣＹＣ１プロモーターの制御のもとにＳＴＥ７P368を含有するプラスミドｐＮＣ３１８−ｐ３６８により形質転換したものである（K.Irieら、Science, Vol.265, p.1716 (1994))。また、上記プラスミドｐＮＶ１１−ＨＵ１１及びｐＮＶ１１−ＨＵ１１Ｆはそれぞれ、ＴＤＨ３プロモーターの制御のもとに短縮されたＴＡＫ１ΔＮ（アミノ酸２１−５７９）及び全長のＴＡＫ１を発現する（K.Yamaguchi ら、Science, Vol.270, p.2008 (1995))。
【００３７】
結果を図２に示す。左側のパネルは試験した酵母株がＴＡＫ１ΔＮ又はＴＡＫ１を発現したか否か、及びＧＡＤ−ＴＡＢ１が同時発現されたか否かを示す。右側のパネルはＳＣ−Ｈｉｓプレート上での細胞の増殖を示す。各パッチは独立した形質転換体についての結果を示す。
ＧＡＤ−ＴＡＢ１とＴＡＫ１の同時形質転換はＳｔｅ１１欠損を回復した。この結果は、ＴＡＢ１がＴＡＫ１の機能を増強することを示している。
【００３８】
実施例４．
ＴＡＢ１を発現する酵母においてＴＡＫ１活性が増加するか否かを決定するため、ヘマグルチニン（ＨＡ）−由来Ｃ−末端エピトープを担持するＴＡＫ１及び触媒的に不活性なＴＡＫ１変異体〔ＡＴＰ−結合部位の６３位のリジンがトリプトファンにより置換されたＴＡＫ１−Ｋ６３Ｗ（K.Yamaguchi ら、Science, Vol.270, p.2008 (1995) 〕の発現ＤＮＡベクターを、ＴＡＢ１遺伝子の非存在下又は存在下に酵母細胞に形質転換した。
【００３９】
ＨＡに対するモノクローナル抗体１２ＣＡ５により認識されるエピトープをコードするＤＮＡ配列をＴＡＫ１コード配列及びＴＡＫ１−Ｋ６３ＷのＣ−末端にフレームを合わせて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により連結した。すべての構成物はＴＤＨプロモーターから発現される。ＴＡＢ１発現プラスミドｐＧＡＰ−ＨＴＨ９ＭはＴＡＢ１のＣ−末端の６８アミノ酸を発現する。ＹＥｐＧＡＰ１１２はＴＤＨ３プロモーターを含有する多コピーＴＲＰ１プラスミドである〔H.Banno ら、Mol. Cell Biol. 13, 475 (1993)〕。
【００４０】
ＴＡＢ１のＣ−末端の６８アミノ酸のコード配列を、ＥCOＲＩ部位及びＡＴＣコドンを含有する５′−プライマー５′−ＧＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＣＧＧＣＡＡＡＧＣ−３′（配列番号：２）、並びにＳａｌＩ部位を含有する３′−プライマー−５′−ＧＧＧＴＣＧＡＣＴＡＣＧＧＴＧＣ−３′（配列番号：３）を用いるＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲにより生じた２４０bpのＥCOＲＩ−ＳａｌＩ断片をＹＥｐＧＡＰ１１２のＥCOＲＩ−ＳａｌＩギャップに挿入することによりｐＧＡＤ−ＨＴＨ９Ｍを生じさせた。
【００４１】
結果を図３に示す。前記のように酵母ＳＹ１９８４株を前記のＴＡＫ１−ＨＡをコードするプラスミド又はＴＡＫ１−Ｋ６３Ｗをコードするプラスミドにより形質転換し、さらにこの形質転換体に空ベクターＹＥｐＧＡＰ１１２（−）、又はＴＡＢ１をコードするｐＧＡＰ−ＨＴＨ９Ｍ（＋）を導入した。ＴＡＫ１−ＨＡ（−）又はＴＡＫ１−Ｋ６３Ｗ−ＨＡ（ＫＮ）を各細胞抽出物から免疫沈降せしめ、そして免疫沈降物をインビトロキナーゼ測定にかけた。具体的には、６０mlの酵母細胞培養物を６００nmでの光学密度０．８まで増殖せしめ、細胞溶解緩衝液（K.Irieら、Science, Vol.265, p.1716 (1994))により細胞抽出液を調製し、そして１００，０００ｇにて３０分間遠心分離した。
【００４２】
上清を、ＨＡに対する抗体との免疫沈降にかけた。すなわち、上清の１部分（３００μｌ）を２μｌの抗体及び９０μｌのプロテインＡ−セファロースと混合し、そして免疫複合体を細胞溶解緩衝液で３回洗浄し、そしてキナーゼ測定（K.Yamaguchi ら、Science, Vol.270, p.2008 (1995))に用した。ＨＡに対するモノクローナル抗体１２ＣＡ５による各免疫沈降物のイムノブロットの結果は、各サンプルにおいて、およそ同じ量のＴＡＫ１−ＨＡ又はＴＡＫ１−Ｋ６３Ｗ−ＨＡが回収されることを示した。これにより、ＴＡＢ１の発現がＴＡＫ１の発現量に影響しないことが示された。
【００４３】
免疫沈降したＴＡＫ１は組換えＸＭＥＫ２（ＳＥＫ１）を活性化する能力により測定し、該組換えＸＭＥＫ２（ＳＥＫ１）の活性は触媒的に不活性な（ＫＮ）ｐ３８（ＭＰＫ２）をリン酸化するその能力により測定した（K.Yamaguchi ら、Science, No.270, p.2008 (1995)) 。電気泳動の後、ＫＨ−ｐ３８（ＭＰＫ２）のリン酸化をオートラジオグラフィーにより検出した。酵素抽出物なしでは、キナーゼ測定値を示す抽出物はなかった。このレベルはＸＭＥＫ２のベース活性に相当する。実験は少なくとも３回行い、同様の結果を得た。
【００４４】
結果を図３に示す。ＴＡＫ１−ＨＡ及びＴＡＫ１−Ｋ３６Ｗ−ＴＡＫ１のキナーゼ測定の結果は、ＴＡＢ１がＴＡＫ１のキナーゼ活性を増加させたことを示した。この活性増加は、ＴＡＫ１−Ｋ６３ＷＫＮ及びＴＡＢ１を発現する細胞からの免疫複合体においては観察されず、観察されたキナーゼ活性はＴＡＫ１に由来することが示された。これらの結果が示すところによれば、ＴＡＢ１はＴＡＫ１の触媒ドメインに直接結合することによりＴＡＫ１のキナーゼ活性を活性化する。
【００４５】
実施例５．
ＴＡＢ１の全長コード配列を得るため、ヒト腎細胞ライブラリーを、前記の酵母２−ハイブリッド系から得られたＴＡＢ１のｃＤＮＡの部分配列をプローブとして用いてスクリーニングした。２個の独立のクローンが、Kozak のコンセスサスに一致する開始メチオニンコドンから始まる１個のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有する３．１kbのｃＤＮＡをもたらした。５′−ＲＡＣＥ−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｆｅｃｈ）を用いる５′ＲＡＣＥ法により５′−末端を決定した。
【００４６】
コード配列の仮定のＮ−末端におけるヌクレオチド配列（ＣＣＡＡＡＴＧＧ）はKozak コンセンサス（M.Kozak, J. Cell Biol. Vol.108, p.229 (1989)) に対応し、そしてその前にＡＴＧコドンは存在しない。
ＴＡＢ１のヌクレオチド配列をジデオキシヌクレオチド・チェイン・ターミネーション法により決定した。全長ＴＡＢ１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列からアミノ酸配列を推定した。その結果、１８５番目の塩基がシトシンであるクローンとアデニンであるクローンの二種が得られた。１８５番目がシトシンのクローンにおいては５２番目のアミノ酸がセリンを、１８５番目がアデニンのクローンにおいては５２番目のアミノ酸がアルギニンをコードしていた。
【００４７】
１８５番目のヌクレオチドがシトシンであるクローンのヌクレオチド配列を配列番号１に示し、そしてアミノ酸配列を図４および配列番号１に示す。また、１８５番目のヌクレオチドがアデニンであるクローンのヌクレオチド配列を配列番号４に示し、そしてアミノ酸配列を配列番号４に示す。
なお、１８５番目のヌクレオチドがシトシンのクローンのｃＤＮＡは、ｐＢＳのＥｃｏＲＩおよびＳｍａＩ部位にサブクローニングされプラスミドＴＡＢＩ−ｆ−４として作製され、１８５番目のヌクレオチドがアデニンのクローンのｃＤＮＡは、ｐＢＳのＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングされプラスミドｐＢＳ−ＴＡＢ１として作製された。
【００４８】
プラスミドｐＢＳ−ＴＡＢ１を含有する大腸菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＢＳ−ＴＡＢ１）と命名され、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−５５０８として１９９６年４月１９日に寄託された。また、プラスミドＴＡＢＩ−ｆ−４を含有する大腸菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α（ＴＡＢＩ−ｆ−４）と命名され、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−５５９９として１９９６年７月１９日に寄託された。
以下に示す実験については、配列番号：１に示すヌクレオチド配列を有するクローンを用いて行った。
【００４９】
図４において、ＡはＡｌａを、ＣはＣｙｓを、ｂはＡｓｐを、ＥはＧｌｕを、ＦはＰｈｅを、ＧはＧｌｙを、ＨはＨｉｓを、ＩはＩｌｅを、ＫはＬｙｓを、ＬはＬｅｕを、ＭはＭｅｔを、ＮはＡｓｎを、ＰはＰｒｏを、ＱはＧｌｎを、ＲはＡｒｇを、ＳはＳｅｒを、ＴはＴｈｒを、ＶはＶａｌを、ＷはＴｒｐを、そしてＹはＴｙｒをそれぞれ示す。酵母２−ハイブリッド系を用いて単離されたＧＡＤ−ＴＡＢ１中のＣ−末端の６８アミノ酸を箱で囲んである。
【００５０】
ＴＡＫ１のＮ−末端の配列は、ＴＡＫ１のこのセグメントへの類似下を示す領域を示すための配置で示される。ＴＡＫ１のアミノ酸に対して同じアミノ酸及び保存されているアミノ酸、それぞれ星印及び点で示す。
このＯＲＦから、いかなる既知蛋白質とも明瞭な類似性を有さず、そして生化学的機能を示すなんらのモチーフも含有しない５５kDa の分子サイズを有する５０４アミノ酸の蛋白質が予想された。
【００５１】
実施例６．
種々のヒト細胞におけるＴＡＢ１ ｍＲＮＡの発現のパターンをノーザンブロット分析により分析した。１６の組織から調製したｍＲＮＡによるヒト組織ブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を32Ｐ−標識化ＴＡＢ１ｃＤＮＡによりプローブし、そしてオートラジオグラフィーにかけた。この結果を図５に示す。各レーンは２μｇのｍＲＮＡを含有した。プローブはMultiprime labeling Kit (Amersham)を用いて〔α−32Ｐ〕−ｄＣＴＰで標識し、そしてH.Shibuya ら、Nature, Vol.357, p.700 (1992) に記載されているようにしてハイブリダイズさせた。試験したすべての組織から、約３．５kbの主たる転写物が検出された。
【００５２】
実施例７．
ＴＡＢ１とＴＡＫ１との会合が哺乳類細胞中で起こることを確認するため、ＨＡエピトープで標識されたＴＡＫ１（ＨＡ−ＴＡＫ１）（K.Yamaguchi ら、Science, Vol.270, p.2008 (1995))を生産する発現ベクター及びＭｙｃエピトープで標識されたＴＡＢ１（Ｍｙｃ−ＴＡＢ１）を生産する発現プラスミドにより、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１ネズミ骨芽細胞（S.Ohtaら、FEBS Lett., Vol.314, p.356 (1992))を一過性（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）にトランスフェクトした。後者のプラスミドは次のようにして得た。
【００５３】
全長ＴＡＢ１ｃＤＮＡを、Ｍｙｃに対するモノクローナル抗体９Ｅ１０により認識されるＭｙｃエピトープ（ＬＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮ）（アミノ酸配列の１文字表示）の６コピーを含有するｐＣＳ２ＭＴベクター（D.L.Tumer ら、Genes Dev., Vol.8, p.1434 (1994)) にサブクローニングした。得られるプラスミドｐＣＳ２ＭＴ・ＴＡＢ１においては、Ｍｙｃエピトープ標識はＴＡＢ１のＮ−末端に対応するＤＮＡ配列にフレームを合わせて連結されている。ｐＣＳＡ２ＭＴ−ＴＡＢ１をＢａｍＨＩ及びＸｂａＩにより消化した。断片を単離し、そして哺乳類発現ベクターｐＥＦのＥCOＲＩ−ＸｂａＩ部位に挿入した。このプラスミドは、ヒト伸長因子１α（ＥＦ１α）プロモーターからＴＡＢ１を発現させる。
【００５４】
細胞抽出物をＨＡに対するモノクローナル抗体１２ＣＡ５（図６のレーン２）、Ｍｙｃに対するモノクローナル抗体９Ｅ１０（図６のレーン３）、又は対照非免疫ＩｇＧ（図６のレーン４）との免疫沈降にかけた。免疫複合体を洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロースに移行せしめ、そしてＭｙｃに対する抗体（図６の上レーン）又はＨＡに対する抗体（図６の下レーン）を用いてイムノブロットした。
【００５５】
細胞抽出物はまた、イムノブロット分析に直接かけた（図６のレーン１）。図６に示すごとく、各免疫沈降においてかなりの量のＭｙｃ−ＴＡＢ１が検出され、ＴＡＫ１がＴＡＢ１と共免疫沈降し得ることが示された。免疫沈降した蛋白質をＨＡに対する抗体によりブロットする相互実験により、ＴＡＢ１とＴＡＫ１との会合が確認された。これらの実験は、ＴＡＢ１が、酵母におけると同様に哺乳類細胞中でもＴＡＫ１と会合し得ることを示すものである。
【００５６】
実施例８．
ＴＡＢ１の過剰発現が哺乳類細胞中でＴＡＫ１のキナーゼ活性を活性化し得るか否か検討した。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞をＭｙｃ−ＴＡＢ１の存在下（＋）又は非存在下（−）でＨＡ−ＴＡＫ１により一過性にトランスフェクトした。細胞を２０ng／mlのＴＧＦ−β１により１０分間処理し（＋）又は処理せず（−）、次に実施例３に記載したようにしてＨＡ−ＴＡＫ１を免疫沈降せしめ、そしてキナーゼ活性について測定した。すなわち、免疫沈降の一部分をＨＡに対する抗体によりイムノブロットした。結果を図７に示す。
【００５７】
活性は、刺激されていない細胞からのＨＡ−ＴＡＫ１の量に対する増加倍数として示し、３回以上の実験からの平均±ＳＥＭとして表わした（図７上段のグラフ）。ＨＡ−ＴＡＫ１はＫＨ−ｐ３８（ＭＰＫ２）を直接リン酸化しなかった（K.Yamaguchi ら、Science, Vol.270, p.2008 (1995))。中段パネルは、ＫＮ−ｐ３８（ＭＰＫ２）のリン酸化を表すオートラジオグラフである。下段パネルは、ＨＡに対するモノクローナル抗体１２ＣＡ５による各免疫沈降のイムノブロット分析を示し、各サンプルにおいて、およそ同じ量のＴＡＫ１−ＨＡが回収されたことを示している。中段及び下段のパネルに示すデーターは典型的な実験からのものである。
【００５８】
ＴＡＫ１免疫沈降物のインビトロキナーゼ測定が示すところによれば、ＴＧＦ−βの非存在下でさえＴＡＢ１によりトランスフェクトされた細胞においてＴＡＫ１活性が刺激された。ＴＡＢ１の過剰発現によるＴＡＫ１の活性化は、ＨＡ−ＴＡＫ１のみを発現するＴＧＦ−βで刺激された細胞において観察される活性化に匹敵した。
【００５９】
実施例９．
ＴＧＦ−βは、プラスミノーゲン活性化因子インヒビター−１（ＰＡＩ−１）をコードするｍＲＮＡの量を急速に増加せしめる（M.R.Keetonら、J. Biol. Chem., Vol.266, p.23048 (1991))。ＴＡＫ１の活性化形（ＴＡＫ１ΔＮ）の過剰発現により、ＴＧＦ−β−誘導性ｐＡＩ−１遺伝子プロモーターの制御下にあるルシフェラーゼ遺伝子を含有するレポーター遺伝子は構成的に活性化される（K.Yamaguchi ら、Science, Vol.270, p.2008 (1995))。ＴＡＢ１の過剰発現がルシフェラーゼレポーター遺伝子の活性化をもたらすか否かを試験した。
【００６０】
ＭｖｌＬｕ細胞を、レポータープラスミドｐ８００neoLUC (M.Abe ら、Analyt. Biochem., Vol.216, p.276 (1994))と、ＴＡＢ１発現プラスミドｐＥＦ−ＴＡＢ１又はＴＡＫ１をコードする発現プラスミド（K.Yamaguchi ら、Science, Vol.270, p.2008 (1995))とを用いて、リン酸カルシウム法（H.Shibuya ら、Nature, Vol.357, p.700 (1992))により一過性トランスフェクトした。なお、プラスミドｐＥＦ−ＴＡＢ１は、ＥＦ１αプロモーターの制御のもとに全長ＴＡＢ１コード配列を含有しており、ｐＥＦをＥCOＲＩにより開裂せしめそしてプラスミドＴＡＢＩ−ｆ−４からのＥCOＲＩ断片を挿入することにより作製したものである。
【００６１】
このプラスミドＴＡＢＩ−ｆ−４はｐＢＳのＥCOＲＩおよびＳｍａＩ部位にＴＡＢ１ｃＤＮＡをサブクローニングすることにより作製したものである。細胞を３０ng／mlのヒトＴＧＦ−β１と共に又はこれを伴わないで２０時間インキュベートし、抽出物を調製し、そしてルシフェラーゼの測定を行った（H.Shibuya ら、Mol. Cell Biol., Vol.14, p.5812 (1994)) 。ルシフェラーゼ活性はβ−ガラクトシダーゼの発現に基いて補正した。
【００６２】
すなわち、トランスフェクション効率を補正するため、ｐＸｅＸ−β−Ｇａｌベクター（A.D.Johnson ら、Gene, Vol.147, p.223 (1994))をすべてのルシフェラーゼレポーター実験において同時トランスフェクトした。β−ガラクトシダーゼの測定は、ルシフェラーゼ測定のために調製された細胞溶解物を用いて、製造者（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）の指示書に従って行った。ルシフェラーゼ活性は、ベクターによりトランスフェクトされた非刺激細胞の活性に対する増加倍数として示した。すべてのトランスフェクション及びルシフェラーゼ測定は少なくとも５回行い、各実験は３連とした。
【００６３】
結果を図８に示す。図中、ＫＮは触媒的に不活性なＴＡＫ１−Ｋ６３Ｗを示す。データーは、代表的な実験における３連の実験からのルシフェラーゼ活性の平均±ＳＥＭを示す。ＴＡＫ１と共にＴＡＢ１の過剰発現はＴＧＦ−βの非存在下でもレポーター遺伝子の発現を誘導したが、ＴＡＫ１又はＴＡＢ１のみの過剰発現はルシフェラーゼ活性の構成的量にほとんど影響を与えなかった。これらの研究は、ＴＡＢ１が哺乳類細胞においてＴＡＫ１の活性を増強することを示している。
【００６４】
ＴＡＫ１−Ｋ６３Ｗの変異体の過剰発現はＴＧＦ−βに刺激されたルシフェラーゼ活性を阻害したが（K.Yamaguchi ら、Science, Vol.270, p.2008 (1995))、これはおそらく経路中の必須要素を妨害する（ｓｅｑｕｅｓｔｅｒｉｎｇ）ためであろう。他方、ＴＡＢ１の過剰発現はＴＡＫ１−Ｋ６３Ｗの阻害効果を低減させ、ＴＡＢ１がＴＡＫ１−Ｋ６３Ｗの過剰発現により吸収される可能性を示唆する。
【００６５】
実施例１０．
ＴＡＢ１のＣ−末端の６８個のアミノ酸〔ＴＡＢ１（４３７−５０４）〕はＴＡＫ１に結合しそしてそれを活性化するために十分であり、ＴＡＢ１のＮ−末端ドメインがＴＡＢ１の機能における制御的役割を演ずることが示唆された。この可能性を試験するため、Ｃ−末端ＴＡＫ１結合ドメインを欠くＴＡＢ１の短縮形〔ＴＡＢ１（１−４１８）〕を作製した。ＭｖｌＬｕ細胞を、ｐ８００nedUC レポーターと、ＴＡＢ１（１−４１８）又はＴＡＢ１（全長）をコードする発現ベクターの図９に示す量とにより一過性にトランスフェクトし、そしてそれらをｐＥＦコントロールベクターにより補完した。
【００６６】
なお、ＴＡＢ１（１−４１８）をコードする発現ベクターは次のようにして作製した。プラスミドＴＡＢＩ−ｆ−４の１．３kbのＥCOＲＩ−ＨｉｎｃII断片（ＴＡＢ１のアミノ酸１−４１８のＮ−末端領域を含有する）をｐＫＴ１０ベクターにサブクローニングしてｐＫＴ１０−ＴＡＢ１（１−４１８）を作製した。ｐＥＦをＥCOＲＩ及びＳａｌＩにより開裂せしめ、そしてｐＫＳ１０−ＴＡＢ１（１−４１８）からのＥCOＲＩ−ＳａｌＩ断片を挿入することによりｐＥＦ−ＴＡＢ１（１−４１８）を作製した。
【００６７】
次に、細胞を３０ng／mlのＴＧＦ−β１と共に又はこれを伴わないで２０時間インキュベートし、そして細胞溶解物をルシフェラーゼ活性について測定した。数値は、ｐＥＦによりトランスフェクトされた対照細胞に対する誘導の倍数の％として示した。ＴＧＦ−βによるルシフェラーゼの非誘導（誘導倍数１）は０％に相当する。すべてのトランスフェクション及びルシフェラーゼの測定は少なくとも３回行い、各実験を３連とした。データーは、代表的な実験における３連の実験からのルシフェラーゼ活性の平均±ＳＥＭで示す。
【００６８】
結果を図９に示す。ＭｖｌＬｕ細胞でのＴＡＢ１（１−４１８）の過剰発現は、ＴＧＦ−β刺激により誘導されるレポーター遺伝子の活性を抑制した。従ってＴＡＢ１（１−４１８）はＴＧＦ−βにより誘導される遺伝子発現のドミナント−ネガティブインヒビターとして作用する。これらの結果は、ＴＡＢ１がＴＧＦ−βのシグナル伝達に関与することを示している。
【００６９】
ＴＡＢ１がＴＡＫ１の活性化を誘導するメカニズムとしては、ＴＡＫ１に結合するＴＡＢ１が活性化に必要なコンホーメーション変化を誘導することが考えられる。ＴＡＫ１のＮ−末端における２０アミノ酸の除去はプロテインキナーゼの構成的活性化をもたらすことから、Ｎ−末端ドメインが触媒ドメインを束縛してキナーゼ活性を阻害することが示唆される（K.Yamaguchi ら、Science, Vol.270, p.2008 (1995))。ＴＡＢ１はＴＡＫ１のこの負の制御ドメインをその触媒ドメインから解除するのかも知れない。ＴＡＫ１結合部位として機能するＴＡＢ１のＣ−末端は、ＴＡＫ１のＮ−末端に見出される領域と同様にセリン及びスレオニンリッチ領域を含有している。従って、ＴＡＢ１はＴＧＦ−βとＴＡＫ１ ＭＡＰＫＫＫとの間の重要なシグナル伝達中間体であろう。
【００７０】
【配列表】
【００７１】
【００７２】
【００７３】
【００７４】
【００７５】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＴＡＫ１蛋白質上の、ＴＡＢ１蛋白質が結合する領域を示す図である。斜線部分はＴＡＢ１の触媒領域を示す。
【図２】図２は、酵母におけるフェロモン活性化ＭＡＰＫ経路中のＳｔｅ１１欠損株におけるＴＡＫ１とＴＡＢ１との共存によるＳｔｅ１１欠損の補完を示す図であり、電気泳動の結果を示す図面代用写真である。
【図３】図３は、ＴＡＢ１がＴＡＫ１のを活性を増強することを示すイン・ビトロ実験の結果を示す図面代用写真である。
【図４】図４は、ＴＡＢ１のアミノ酸配列を示す。
【図５】図５は、種々の器官又は組織においてＴＡＢ１をコードするｍＲＮＡが発現されることを示す電気泳動図であり、図面に代る写真である。
【図６】図６は、哺乳類細胞中でＴＡＢ１とＴＡＫ１の会合が生ずることを示すイムノブロット図であり、図面代用写真である。
【図７】図７は、哺乳類細胞中で、ＴＡＢ１がＴＡＫ１のキナーゼ活性を増強することを示すグラフ（上）と、ＴＡＫ１及びＫＮ−ＭＰＫ２が同程度に生産されたことを示すブロット図であり、図面代用写真である。
【図８】図８は、ＴＧＦ−βにより刺激した哺乳類細胞において、ＴＡＫ１とＴＡＢ１の共存によりレポーターとしてのルシフェラーゼ遺伝子の発現が増強されることを示すグラフである。
【図９】図９は、Ｃ−末端が欠けたＴＡＢ１（ＴＡＢ１（１−４１８））がＴＧＦ−βにより誘導されるレポーターとしてのルシフェラーゼ遺伝子の発現を阻害することを示すグラフである。
【発明の属する技術分野】
本発明は形質転換増殖因子−β（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ −β；ＴＧＦβ）のシグナル伝達系の１員であるＴＡＢ１蛋白質、及びそれをコードする遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＴＧＦ−βは、細胞機能の多くの面を制御する多機能因子である。その一面として、ＴＧＦ−βは様々な傷害に伴う組織の修復及び再生を司る。
慢性化した傷害におけるＴＧＦ−β異常産生により、組織の修復、再生のバランスが崩れ病的な線維化が生ずることがある。ＴＧＦ−β産生のバランスが崩れた病態として、肝線維症が知られている。肝臓において、ＴＧＦ−βは線維化の原因となる細胞外マトリックス蛋白質の産生を亢進させ、細胞外マトリックス蛋白質分解酵素の合成を阻害および分解酵素の阻害物質を誘導することにより、肝線維症の主要な原因因子として働く。
【０００３】
ＴＧＦ−βのスーパーファミリーのメンバーのシグナル伝達系の１メンバーとして、マイトジエン−活性化プロテイン・キナーゼ・キナーゼ・キナーゼ（Ｍｉｔｏｇｅｎ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ Ｋｉｎａｓｅ Ｋｉｎａｓｅ；ＭＡＰＫＫＫ）系が知られている。
【０００４】
ＭＡＰＫ経路は受容体のシグナルを種々の作用に転換する保存された真核性シグナル伝達系であり、この系は３種類のプロテインキナーゼ、すなわち前記のＭＡＰＫＫＫ，ＭＡＰＫＫ及びＭＡＰＫを含んでおり、ＭＡＰＫはＭＡＰＫＫによるリン酸化により活性化され、ＭＡＫＫはＭＡＰＫＫＫにより活性化される（E. Nishidaら、Trends Biochem. Sci. Vol.18, p.128 (1993) ; K. J. Blu mer ら、前掲Vol.19, p.236 (1994) ; R.J.David、前掲Vol.19, p.470 (1994) ; C.J.Marchall, Cell, Vol.80, p.179 (1995))。
【０００５】
ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーのシグナル伝達系において機能するＭＡＰＫＫＫファミリーの１メンバーであるＴＡＫ１はK.Yamaguchi らにより同定された (K.Yamaguchi ら、Science, Vol.270, p.2008 (1995))。
ＴＧＦ−βは、細胞質側にセリン−及びスレオニン−特異的キナーゼドメインを含有する膜貫通蛋白質である１型及び２型ＴＧＦ−β受容体のヘテロマーコンプレックスを介してシグナルを伝達する（J.L.Wrana ら、Nature, Vol.370, p.341 (1994) ; D.M.Kingsleyら、Genes Dev., Vol.8, p.133 (1994))。しかしながらＴＧＦ−β受容体から下流のシグナル伝達機構は分子レベルにおいてほとんど知られていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明は、ＴＧＦ−β受容体のシグナル伝達系の新しく見出された１メンバーであるＴＡＢ１蛋白質及びそれをコードする遺伝子を提供しようとするものである。さらに、本発明はＴＧＦ−βシグナル伝達系阻害物質のスクリーニング方法を提供する。なお、ＴＡＢ１は、ＴＡＫ１に結合する蛋白質（ＴＡＫ１ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ）を意味する。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記の課題を解決するため、本発明は、配列番号：１に示すアミノ酸配列を有するＴＡＢ１蛋白質；配列番号：１に示すアミノ酸配列に対して、１又は複数のアミノ酸の置換、欠失及び／又は付加によって修飾されているアミノ酸配列を有し、且つＴＡＢ１蛋白質の生物学的性質を有する蛋白質；配列番号１に示すアミノ酸配列において５２番目のアミノ酸がアルギニンである蛋白質；配列番号：１に示すヌクレオチド配列を有するＤＮＡに対して６０℃、０．１×ＳＳＣ，０．１％ドデシル硫酸ナトリウムのハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡによりコードされており、且つＴＡＢ１蛋白質の生物学的活性を有する蛋白質；配列番号：１に示すアミノ酸配列において、アミノ酸位置２１位〜５７９位のアミノ酸から成るアミノ酸配列を有する蛋白質；並びに配列番号：１に示すアミノ酸配列において、アミノ酸位置４３７位〜５０４位の６８個のアミノ酸から成るアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。
【０００８】
本発明はまた、上記の蛋白質又はポリペプチドの製造方法において、該蛋白質又はポリペプチドをコードするＤＮＡを含んで成る発現ベクターにより形質転換された宿主を培養し、該培養物から該蛋白質又はポリペプチドを採取することを特徴とする方法を提供する。
本発明はまた、上記の蛋白質又はポリペプチドを哺乳類細胞において生成せしめる方法において、該蛋白質又はポリペプチドをコードするＤＮＡを哺乳動物細胞に導入することを特徴とする方法を提供する。
【０００９】
本発明はまた、前記の蛋白質又はポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含んで成る発現ベクター、及び該発現ベクターにより形質転換された宿主を提供する。
本発明はさらに、ＴＧＦ−βシグナル伝達系阻害物質のスクリーニング方法を提供する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明のＴＡＢ１蛋白質は、形質転換増殖因子−β（ＴＧＦ−β）のシグナル伝達経路においてＴＡＫ１に結合してＴＡＫ１を活性化する性質を有する。この性質及びその他の諸性質については実施例２〜４及び６〜１０に詳細に記載されている。
本発明のＴＡＢ１蛋白質は、実施例１及び５に記載する方法によりクローニングされたｃＤＮＡのヌクレオチド配列から推定されるアミノ酸配列（配列番号：１）を有する。
【００１１】
しかしながら、生物学的活性を有する蛋白質において、１又は複数のアミノ酸の置換、欠失及び／又は付加により修飾されたアミノ酸配列を有するものでも、生来の蛋白質が有する生物学的性質を保持することがよく知られている。従って、本発明は、配列番号：１に示すアミノ酸配列に対して１又は複数のアミノ酸の置換、欠失及び／又は付加により修飾されたアミノ酸配列を有し、且つＴＡＢ１の生物学的性質を有するものを含む。
その一態様として、配列番号１に示されるアミノ酸配列において５２番目のアミノ酸がアルギニンである蛋白質が挙げられる。
【００１２】
さらに、一旦特定の蛋白質をコードするＤＮＡがクローニングされれば、そのＤＮＡをプローブとして、例えばその蛋白質が得られた種の器官又は組織とは異る器官又は組織からのＤＮＡライブラリーあるいは他の種からのＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、同様の生物学的性質を有するがアミノ酸配列を異にする蛋白質をコードするＤＮＡが得られることも知られている。従って、本発明は、配列番号：１に示すヌクレオチド配列を有するＤＮＡに対して、例えば６０℃、０．１×ＳＳＣ，０．１％ドデシル硫酸ナトリウムのハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡによりコードされており、且つＴＡＢ１蛋白質の生物学的性質を有する蛋白質をも包含する。
【００１３】
本発明の修飾された蛋白質としては、例えば、配列番号：１のアミノ酸配列において、アミノ酸位置２１位〜５７９位のアミノ酸から成るアミノ酸配列を有する蛋白質が挙げられる。この蛋白質はＴＡＢ１蛋白質の生物学的性質を有している。また、本発明の修飾されたポリペプチドとして、配列番号：１に示すアミノ酸配列において、アミノ酸位置４３７位〜５０４位の６８個のアミノ酸から成るアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられる。このポリペプチドはＴＡＫ１に結合することによって、ＴＡＫ１のキナーゼ活性を活性化する性質を有する。さらに、本発明の修飾された蛋白質として、上記蛋白質又はポリペプチドが他の蛋白質と融合しており、かつＴＡＢ１の生物学的活性を有する蛋白質が挙げられる。
【００１４】
本発明の蛋白質又はポリペプチドは、例えば、ＴＧＦ−βのシグナル伝達系に重要なＴＡＫ１を活性化することによってＴＧＦ−βの生理機能をそれ自身で模倣できるほか、ＴＡＫ１と結合することを利用してＴＡＫ１とＴＡＢ１の結合を阻害し、細胞増殖抑制、免疫抑制、骨分化などの作用に対するアゴニストあるいはアンタゴニストとして働く物質のスクリーニング方法のために有用である。
【００１５】
本発明の蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば、配列番号：１に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡである。このようなＤＮＡは例えば、実施例１及び５に記載する方法により得ることができ、配列番号：１のヌクレオチド配列を有する。しかしながら、配列番号：１に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、必ずしも配列番号：１に示すヌクレオチド配列を有する必要はなく、同一のアミノ酸をコードする別のコドンから構成されていてもよい。例えば、配列番号：１に示すヒト由来のヌクレオチド配列を、細菌や酵母等の微生物において効率よく翻訳されるコドンを含むものに変えることができ、これは、例えばプライマーを用いる部位特定変異誘発等の周知技術を用いて行うことができる。
【００１６】
本発明の、配列番号：１に示すアミノ酸配列に対して、１又は複数のアミノ酸配列が置換、欠失及び／又は付加されているアミノ酸配列を有する蛋白質又はポリペプチドをコードするＤＮＡは、例えば、配列番号：１に示すヌクレオチド配列を有するＤＮＡを鋳型とし、部位特定変異誘発法、ＰＣＲ法等、それ自体周知の方法を用いて作製することができる。さらにまた、修飾されたアミノ酸配列を有する蛋白質の内、生来の蛋白質に比較して短縮された蛋白質又はポリペプチドをコードするＤＮＡは、例えば、生来のＤＮＡ、例えばｃＤＮＡに翻訳開始コドン及び／又は翻訳終止コドンを導入することによって得ることもできる。これらのコドンの導入は、例えば部位特定変異誘発、ＰＣＲ法等により行うことができる。あるいは、生来のＤＮＡ、例えばｃＤＮＡを適当な制限酵素により切断し、そして所望によりオリゴヌクレオチドを付加することによっても得られる。
【００１７】
本発明の配列番号：１に示すヌクレオチド配列を有するＤＮＡとハイブリダイズすることができ、且つＴＡＢ１の生物学的性質を有する蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば、実施例６に示す種々の組織又は器官、例えば心臓、脳、胎盤、肝臓、骨格筋、腎臓、すい臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、結腸、末梢血白血球等から調製したゲノミックＤＮＡライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーを、本発明の、例えば配列番号：１に示すヌクレオチド配列又はその部分をプローブとして用いて、スクリーニングすることにより行われる。上記のＤＮＡライブラリーは、ヒトに由来するもののみならず、他の動物、例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ブタ等に由来するものであってもよい。
【００１８】
本発明はまた、上記のＤＮＡを含んで成る発現ベクター及びそれにより形質転換された宿主に関する。発現ベクターは宿主により異る。本発明の宿主としては、原核生物及び真核生物のいずれも使用することができる。原核生物としては、細菌、例えばエシェリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属の微生物、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属微生物、例えばバシルス・ズブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、等が使用され、真核生物としては、下等真核生物、例えば糸状菌又は酵母が挙げられる。
【００１９】
糸状菌としては、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属微生物、例えばアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｉｚａｅ）等、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属微生物、等が挙げられ、酵母としては、例えばサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属微生物、例えばサッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等が挙げられる。
【００２０】
また、高等真核生物としては動植物細胞、例えば不滅化された動物培養細胞例、例えばＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３等が使用できる。また、昆虫細胞、例えばＳｆ９，Ｓｆ１２等も使用できる。
本発明の発現ベクターは、本願発明の蛋白質又はポリペプチドをコードするＤＮＡのほかに、上記の宿主において機能し得る発現制御配列、例えばプロモーターを含有する。
【００２１】
細菌、例えば大腸菌のプロモーターとしては、Ｔ３，Ｔ７等が使用でき、酵母のプロモーターとしては、例えば解糖系酵素の遺伝子のプロモーター、例えばＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ４プロモーター等が挙げられる。動物細胞用のプロモーターとしてはウイルス性プロモーター、例えばＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター等が挙げられる。
発現ベクターによる宿主の形質転換、宿主の培養、培養物からの本発明の蛋白質又はポリペプチドの採取・精製は、常法に従って行うことができる。例えば、培養物から蛋白質又はポリペプチドの単離・精製は、蛋白質又はポリペプチドを単離・精製するための常用手段、例えば硫酸アンモニウム沈澱法、ゲル濾過法、逆相ＨＰＬＣ等を単独で、又は組合わせて用いることができる。
【００２２】
本発明はさらに、ＴＧＦ−βシグナル伝達系阻害物質のスクリーニング方法に関する。ＴＡＢ１の生物学的活性を有する蛋白質とＴＡＫ１（K.Yamaguchi ら、Sceince,vol.270,p2008(1995))を発現する細胞にＴＧＦ−βシグナル伝達系阻害物質を含む試料を接触させるか又は導入し、次いでＴＡＫ１の活性を測定する。ＴＡＢ１の生物学的活性を有する蛋白質又はポリペプチドおよびＴＡＫ１は他の蛋白質との融合蛋白質でもよく、これらを発現する細胞は酵母あるいは哺乳類細胞である。このようなスクリーニング系は、実施例１，２，３，４，７，８および９に記載する方法により構築することができる。
【００２３】
構築したスクリーニング系へＴＧＦ−βシグナル伝達系阻害物質を含む試料を接触させるか又は導入し、ＴＡＫ１のキナーゼ活性を測定する。ＴＡＫ１のキナーゼ活性の測定方法は、ＴＡＫ１自身のキナーゼ活性を測定してもよいし、シグナル伝達系のＴＡＫ１の下流に存在しＴＡＫ１により活性化されるＭＡＰＫＫやＭＡＰＫのキナーゼ活性を測定してもよい。また、ＭＡＰＫ経路の標的遺伝子や標的遺伝子プロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子の活性、ｍＲＮＡ量又は遺伝子の表現型により測定することができる。
本発明のＴＧＦ−βシグナル伝達系阻害物質のスクリーニング方法によれば、ＴＧＦ−βの異常産生が関与する疾患の治療剤となり得る、ＴＡＢ１とＴＡＫ１の結合を阻害する物質をスクリーニングすることができる。
【００２４】
【実施例】
次に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
実施例１．
ＴＧＦ−βシグナル伝達において機能するＴＡＫ１−依存性経路を解析するため、酵母２−ハイブリッド系（S.Freldsら、Trend Genet. 10,286 (1994)) を用いて、ＴＡＫ１と直接相互作用する蛋白質を探索した。
【００２５】
まず、ＴＡＫ１遺伝子とＬｅｘＡ ＤＮＡ−結合ドメインをコードする遺伝子とを連結せしめることにより発現ベクターを作製した。ｐＬｅｘＡ−ＴＡＫ１ΔＮは、ｐＢＴＭ１１６（A.B.Vojtekら、Cell, Vol.74, p.205 (1993)) にフレームを合わせて挿入したＴＡＫ１ΔＮコード配列（K.Yamaguchi ら、Science, Vol.270, p.2008 (1995))を含有する。ヒト脳ｃＤＮＡライブラリー中にコードされており、ＴＡＫ１ΔＮと相互作用する蛋白質を同定するために酵母２−ハイブリッド系を使用した。
【００２６】
酵母ＨＩＳ３コード領域の上流にＬｅｘＡ蛋白質のための結合部位が配置されている一体化されたレポーター構成物を含有するサッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｌ４０株（ＬＹＳ２：：ＬｅｘＡ−ＨＩＳ３）において２つのハイブリッドを発現させた。２つのハイブリッド蛋白質が相互作用すれば、前記レポーター構成物のトランスアクチベーションが起こり、そして酵母はヒスチジンの非存在下（ＳＣ−Ｈｉｓ）で増殖することができる。
【００２７】
ＬｅｘＡ−ＴＡＫ１ΔＮ融合体は単独で、外部からのヒスチジンを必要としないで増殖を可能にするのに十分な量のＨＩＳ３の発現をもたらす。しかしながら、ＨＩＳ３遺伝子の産物であるイミダゾール・グリセロール・デヒドロケナーゼの化学阻害剤である４０mM ３−アミノトリオゾール（３−ＡＴ）の存在下で細胞を増殖せしめることによりヒスチジン栄養要求性を達成することができる（G.M.Kishore ら、Annu. Rev. Biochem. Vol.57, p.627 (1988)) 。
【００２８】
この誘引（ｂａｉｔ）プラスミドを、ＧＡＬ４活性化ドメイン（ＧＡＤ）をコードする遺伝子と連結させたヒト脳ｃＤＮＡ発現ライブラリークローンを含有する捕獲プラスミドと共に酵母を形質転換した。約１×１０6 個の形質転換体から、蛋白質をコードする陽性クローンＴＡＢ１ｃＤＮＡを得た。以後において、このＤＮＡ単離物により発現されるＧＡＤ融合蛋白質をＧＡＤ−ＴＡＢ１と称する。
【００２９】
実施例２．
ＴＡＢ１との相互作用を司るＴＡＫ１中の位置を決定するため、一連のＬｅｘＡ−ＴＡＫ１欠失キメラ体を２−ハイブリッド測定により試験した。ＬｅｘＡ ＤＮＡ−結合ドメインに融合した全長ＴＡＫ１又はその欠失構成物をコードする発現ベクターを、ｐＧＡＤ−ＴＡＢ１と共に、酵母レポーター株Ｌ４０に同時形質転換した。なお、ＴＡＫ１の各欠失構成物をコードするＤＮＡは全長ＴＡＫ１をコードするＤＮＡから作製した。
【００３０】
また、前記プラスミドｐＧＡＤ−ＴＡＢ１は、ＴＡＢ１ｃＤＮＡをｐＢＳ（W.O.Bullock ら、Biotechniques Vol.5,p.376(1987))のＥcoＲＩ部位にサブクローニングすることにより得たものである。このプラスミドにより発現される融合蛋白質間の相互作用が、４０mM ３−ＡＴを含有するＳＣ−Ｈｉｓ培地のプレート上で増殖する酵母株の能力により示される。この結果を図１に示す。この図中右側に、ＴＡＫ１又はその欠失体と、ＴＡＢ１とが相互作用した（＋）か、又はしなかった（−）かを示す。この結果から、ＴＡＢ１はＴＡＫ１のＮ−末端側ドメインと相互作用することが示された。
【００３１】
実施例３．
ＴＡＫ１と相互作用する蛋白質は上流の制御部及び下流の標的の両方を含む可能性がある。ＴＡＢ１がＴＡＫ１の活性化に役割を演ずるのであれば、それらの同時発現が酵母におけるＴＡＫ１の活性に影響を与えると予想される。本発明者らは、酵母フェロモン−誘導ＭＡＰＫ経路において哺乳類ＭＡＰＫＫＫ活性を測定するための系を開発している（K.Yamaguchi ら、Science, Vol.270, p.2008 (1995) ; K.Irieら、 Science, Vol.265 , p.1716 (1994))。ＴＡＫ１の活性化された形態（ＴＡＫ１ΔＮ）はＳｔｅ１１ ＭＡＰＫＫＫ活性を代替することができる。
【００３２】
すなわち、フェロモン−活性化ＭＡＰＫ径路はＳｔｅ１１，Ｓｔｅ７、及びＦｕｓ３又はＫｓｓ１キナーゼから成り、これらはそれぞれＭＡＰＫＫＫ，ＭＡＰＫＫ及びＭＡＰＫに対応する。これらの酵母プロテインキナーゼは次々に作用してシグナルを転写因子Ｓｔｅ１２に伝達し、このＳｔｅ１２はＦＵＳ１のごとき接合特異的（ｍａｔｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃ）遺伝子の転写を活性化する（I.Herskowitz, Cell, Vol.80, p.187 (1995) ; D.E.Levinら、Curr. Opin. Cell Biol., Vol.7, p.197 (1995) ; J.Schultz ら、Jr. Curr. Opin. Gene Dev., No.5, p.31 (1995)) 。
【００３３】
ＦＵＳ１ｐ：：ＨＩＳ３レポーター遺伝子は、ＨＩＳ３オープンリーディングフレームに連結されたＦＵＳ１上流活性化配列を含んで成り、そしてｈｉｓ３ΔＦＵＳ１ｐ：：ＨＩＳ３株におけるシグナル活性を、ＳＣ−Ｈｉｓ培地上で増殖する細胞の能力（Ｈｉｓ表現型）によりモニターすることを可能にする。
ｈｉｓ３Δｓｔｅ１１ΔＦＵＳ１ｐ：：ＨＩＳ３ＳＴＥ７P368（セリン−３６８におけるプロリン置換）株はＨｉｓ- 表現型を有する（K.Irieら、Science, Vol.265, p.1716 (1994))。
【００３４】
この株におけるＴＡＫ１ΔＮの発現がＨｉｓ+ 表現型をもたらす（K.Yamaguchi ら、Science, Vol.270, p.2008 (1995))。従って、ＴＡＫ１の活性化型はＳｔｅ７P368−依存的にＳｔｅ１１活性を代替することができる。しかしながら全長ＴＡＫ１の発現はｓｔｅ１１Δ変異を回復せず、酵母はＴＡＫ１のための仮定の活性化因子を有しないことが示唆される（K.Yamaguchi ら、Science, Vol.270, p.2008 (1995))。
【００３５】
酵母ＭＡＰＫ経路を用いて、ＧＡＤ−ＴＡＢ１構成物を、ＴＡＫ１の存在下でｓｔｅ１１Δ変異を補完するそれらの能力について試験した。すなわち、酵母ＳＹ１９８４−Ｐ株（ｈｉｓ３Δｓｔｅ１１ΔＦＵＳ１ｐ：：ＨＩＳ３ＳＴＥ７P368）を、ｐＮＶ１１−ＨＵ１１（ＴＡＫ１ΔＮ）＋ｐＧＡＤ１０（ＧＡＤ）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）；ｐＮＶ１１−ＨＵ１１Ｆ（ＴＡＫ１）＋ｐＧＡＤ１０；ｐＮＶ１１−ＨＵ１１Ｆ＋ｐＧＡＤ−ＴＡＢ１；又はｐＮＶ１１＋ｐＧＡＤ−ＴＡＢ１により形質転換し、そして形質転換体をＳＣ−Ｈｉｓプレート上にまき、そして３０℃にてインキュベートした。
【００３６】
なお、上記ＳＹ１９８４−Ｐ株は、ＳＹ１９８４株（ｈｉｓ３Δｓｔｅ１１ΔＦＵＳ１ｐ；；ＨＩＳ３）を、ＣＹＣ１プロモーターの制御のもとにＳＴＥ７P368を含有するプラスミドｐＮＣ３１８−ｐ３６８により形質転換したものである（K.Irieら、Science, Vol.265, p.1716 (1994))。また、上記プラスミドｐＮＶ１１−ＨＵ１１及びｐＮＶ１１−ＨＵ１１Ｆはそれぞれ、ＴＤＨ３プロモーターの制御のもとに短縮されたＴＡＫ１ΔＮ（アミノ酸２１−５７９）及び全長のＴＡＫ１を発現する（K.Yamaguchi ら、Science, Vol.270, p.2008 (1995))。
【００３７】
結果を図２に示す。左側のパネルは試験した酵母株がＴＡＫ１ΔＮ又はＴＡＫ１を発現したか否か、及びＧＡＤ−ＴＡＢ１が同時発現されたか否かを示す。右側のパネルはＳＣ−Ｈｉｓプレート上での細胞の増殖を示す。各パッチは独立した形質転換体についての結果を示す。
ＧＡＤ−ＴＡＢ１とＴＡＫ１の同時形質転換はＳｔｅ１１欠損を回復した。この結果は、ＴＡＢ１がＴＡＫ１の機能を増強することを示している。
【００３８】
実施例４．
ＴＡＢ１を発現する酵母においてＴＡＫ１活性が増加するか否かを決定するため、ヘマグルチニン（ＨＡ）−由来Ｃ−末端エピトープを担持するＴＡＫ１及び触媒的に不活性なＴＡＫ１変異体〔ＡＴＰ−結合部位の６３位のリジンがトリプトファンにより置換されたＴＡＫ１−Ｋ６３Ｗ（K.Yamaguchi ら、Science, Vol.270, p.2008 (1995) 〕の発現ＤＮＡベクターを、ＴＡＢ１遺伝子の非存在下又は存在下に酵母細胞に形質転換した。
【００３９】
ＨＡに対するモノクローナル抗体１２ＣＡ５により認識されるエピトープをコードするＤＮＡ配列をＴＡＫ１コード配列及びＴＡＫ１−Ｋ６３ＷのＣ−末端にフレームを合わせて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により連結した。すべての構成物はＴＤＨプロモーターから発現される。ＴＡＢ１発現プラスミドｐＧＡＰ−ＨＴＨ９ＭはＴＡＢ１のＣ−末端の６８アミノ酸を発現する。ＹＥｐＧＡＰ１１２はＴＤＨ３プロモーターを含有する多コピーＴＲＰ１プラスミドである〔H.Banno ら、Mol. Cell Biol. 13, 475 (1993)〕。
【００４０】
ＴＡＢ１のＣ−末端の６８アミノ酸のコード配列を、ＥCOＲＩ部位及びＡＴＣコドンを含有する５′−プライマー５′−ＧＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＣＧＧＣＡＡＡＧＣ−３′（配列番号：２）、並びにＳａｌＩ部位を含有する３′−プライマー−５′−ＧＧＧＴＣＧＡＣＴＡＣＧＧＴＧＣ−３′（配列番号：３）を用いるＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲにより生じた２４０bpのＥCOＲＩ−ＳａｌＩ断片をＹＥｐＧＡＰ１１２のＥCOＲＩ−ＳａｌＩギャップに挿入することによりｐＧＡＤ−ＨＴＨ９Ｍを生じさせた。
【００４１】
結果を図３に示す。前記のように酵母ＳＹ１９８４株を前記のＴＡＫ１−ＨＡをコードするプラスミド又はＴＡＫ１−Ｋ６３Ｗをコードするプラスミドにより形質転換し、さらにこの形質転換体に空ベクターＹＥｐＧＡＰ１１２（−）、又はＴＡＢ１をコードするｐＧＡＰ−ＨＴＨ９Ｍ（＋）を導入した。ＴＡＫ１−ＨＡ（−）又はＴＡＫ１−Ｋ６３Ｗ−ＨＡ（ＫＮ）を各細胞抽出物から免疫沈降せしめ、そして免疫沈降物をインビトロキナーゼ測定にかけた。具体的には、６０mlの酵母細胞培養物を６００nmでの光学密度０．８まで増殖せしめ、細胞溶解緩衝液（K.Irieら、Science, Vol.265, p.1716 (1994))により細胞抽出液を調製し、そして１００，０００ｇにて３０分間遠心分離した。
【００４２】
上清を、ＨＡに対する抗体との免疫沈降にかけた。すなわち、上清の１部分（３００μｌ）を２μｌの抗体及び９０μｌのプロテインＡ−セファロースと混合し、そして免疫複合体を細胞溶解緩衝液で３回洗浄し、そしてキナーゼ測定（K.Yamaguchi ら、Science, Vol.270, p.2008 (1995))に用した。ＨＡに対するモノクローナル抗体１２ＣＡ５による各免疫沈降物のイムノブロットの結果は、各サンプルにおいて、およそ同じ量のＴＡＫ１−ＨＡ又はＴＡＫ１−Ｋ６３Ｗ−ＨＡが回収されることを示した。これにより、ＴＡＢ１の発現がＴＡＫ１の発現量に影響しないことが示された。
【００４３】
免疫沈降したＴＡＫ１は組換えＸＭＥＫ２（ＳＥＫ１）を活性化する能力により測定し、該組換えＸＭＥＫ２（ＳＥＫ１）の活性は触媒的に不活性な（ＫＮ）ｐ３８（ＭＰＫ２）をリン酸化するその能力により測定した（K.Yamaguchi ら、Science, No.270, p.2008 (1995)) 。電気泳動の後、ＫＨ−ｐ３８（ＭＰＫ２）のリン酸化をオートラジオグラフィーにより検出した。酵素抽出物なしでは、キナーゼ測定値を示す抽出物はなかった。このレベルはＸＭＥＫ２のベース活性に相当する。実験は少なくとも３回行い、同様の結果を得た。
【００４４】
結果を図３に示す。ＴＡＫ１−ＨＡ及びＴＡＫ１−Ｋ３６Ｗ−ＴＡＫ１のキナーゼ測定の結果は、ＴＡＢ１がＴＡＫ１のキナーゼ活性を増加させたことを示した。この活性増加は、ＴＡＫ１−Ｋ６３ＷＫＮ及びＴＡＢ１を発現する細胞からの免疫複合体においては観察されず、観察されたキナーゼ活性はＴＡＫ１に由来することが示された。これらの結果が示すところによれば、ＴＡＢ１はＴＡＫ１の触媒ドメインに直接結合することによりＴＡＫ１のキナーゼ活性を活性化する。
【００４５】
実施例５．
ＴＡＢ１の全長コード配列を得るため、ヒト腎細胞ライブラリーを、前記の酵母２−ハイブリッド系から得られたＴＡＢ１のｃＤＮＡの部分配列をプローブとして用いてスクリーニングした。２個の独立のクローンが、Kozak のコンセスサスに一致する開始メチオニンコドンから始まる１個のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有する３．１kbのｃＤＮＡをもたらした。５′−ＲＡＣＥ−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｆｅｃｈ）を用いる５′ＲＡＣＥ法により５′−末端を決定した。
【００４６】
コード配列の仮定のＮ−末端におけるヌクレオチド配列（ＣＣＡＡＡＴＧＧ）はKozak コンセンサス（M.Kozak, J. Cell Biol. Vol.108, p.229 (1989)) に対応し、そしてその前にＡＴＧコドンは存在しない。
ＴＡＢ１のヌクレオチド配列をジデオキシヌクレオチド・チェイン・ターミネーション法により決定した。全長ＴＡＢ１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列からアミノ酸配列を推定した。その結果、１８５番目の塩基がシトシンであるクローンとアデニンであるクローンの二種が得られた。１８５番目がシトシンのクローンにおいては５２番目のアミノ酸がセリンを、１８５番目がアデニンのクローンにおいては５２番目のアミノ酸がアルギニンをコードしていた。
【００４７】
１８５番目のヌクレオチドがシトシンであるクローンのヌクレオチド配列を配列番号１に示し、そしてアミノ酸配列を図４および配列番号１に示す。また、１８５番目のヌクレオチドがアデニンであるクローンのヌクレオチド配列を配列番号４に示し、そしてアミノ酸配列を配列番号４に示す。
なお、１８５番目のヌクレオチドがシトシンのクローンのｃＤＮＡは、ｐＢＳのＥｃｏＲＩおよびＳｍａＩ部位にサブクローニングされプラスミドＴＡＢＩ−ｆ−４として作製され、１８５番目のヌクレオチドがアデニンのクローンのｃＤＮＡは、ｐＢＳのＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングされプラスミドｐＢＳ−ＴＡＢ１として作製された。
【００４８】
プラスミドｐＢＳ−ＴＡＢ１を含有する大腸菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＢＳ−ＴＡＢ１）と命名され、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−５５０８として１９９６年４月１９日に寄託された。また、プラスミドＴＡＢＩ−ｆ−４を含有する大腸菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α（ＴＡＢＩ−ｆ−４）と命名され、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−５５９９として１９９６年７月１９日に寄託された。
以下に示す実験については、配列番号：１に示すヌクレオチド配列を有するクローンを用いて行った。
【００４９】
図４において、ＡはＡｌａを、ＣはＣｙｓを、ｂはＡｓｐを、ＥはＧｌｕを、ＦはＰｈｅを、ＧはＧｌｙを、ＨはＨｉｓを、ＩはＩｌｅを、ＫはＬｙｓを、ＬはＬｅｕを、ＭはＭｅｔを、ＮはＡｓｎを、ＰはＰｒｏを、ＱはＧｌｎを、ＲはＡｒｇを、ＳはＳｅｒを、ＴはＴｈｒを、ＶはＶａｌを、ＷはＴｒｐを、そしてＹはＴｙｒをそれぞれ示す。酵母２−ハイブリッド系を用いて単離されたＧＡＤ−ＴＡＢ１中のＣ−末端の６８アミノ酸を箱で囲んである。
【００５０】
ＴＡＫ１のＮ−末端の配列は、ＴＡＫ１のこのセグメントへの類似下を示す領域を示すための配置で示される。ＴＡＫ１のアミノ酸に対して同じアミノ酸及び保存されているアミノ酸、それぞれ星印及び点で示す。
このＯＲＦから、いかなる既知蛋白質とも明瞭な類似性を有さず、そして生化学的機能を示すなんらのモチーフも含有しない５５kDa の分子サイズを有する５０４アミノ酸の蛋白質が予想された。
【００５１】
実施例６．
種々のヒト細胞におけるＴＡＢ１ ｍＲＮＡの発現のパターンをノーザンブロット分析により分析した。１６の組織から調製したｍＲＮＡによるヒト組織ブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を32Ｐ−標識化ＴＡＢ１ｃＤＮＡによりプローブし、そしてオートラジオグラフィーにかけた。この結果を図５に示す。各レーンは２μｇのｍＲＮＡを含有した。プローブはMultiprime labeling Kit (Amersham)を用いて〔α−32Ｐ〕−ｄＣＴＰで標識し、そしてH.Shibuya ら、Nature, Vol.357, p.700 (1992) に記載されているようにしてハイブリダイズさせた。試験したすべての組織から、約３．５kbの主たる転写物が検出された。
【００５２】
実施例７．
ＴＡＢ１とＴＡＫ１との会合が哺乳類細胞中で起こることを確認するため、ＨＡエピトープで標識されたＴＡＫ１（ＨＡ−ＴＡＫ１）（K.Yamaguchi ら、Science, Vol.270, p.2008 (1995))を生産する発現ベクター及びＭｙｃエピトープで標識されたＴＡＢ１（Ｍｙｃ−ＴＡＢ１）を生産する発現プラスミドにより、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１ネズミ骨芽細胞（S.Ohtaら、FEBS Lett., Vol.314, p.356 (1992))を一過性（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）にトランスフェクトした。後者のプラスミドは次のようにして得た。
【００５３】
全長ＴＡＢ１ｃＤＮＡを、Ｍｙｃに対するモノクローナル抗体９Ｅ１０により認識されるＭｙｃエピトープ（ＬＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮ）（アミノ酸配列の１文字表示）の６コピーを含有するｐＣＳ２ＭＴベクター（D.L.Tumer ら、Genes Dev., Vol.8, p.1434 (1994)) にサブクローニングした。得られるプラスミドｐＣＳ２ＭＴ・ＴＡＢ１においては、Ｍｙｃエピトープ標識はＴＡＢ１のＮ−末端に対応するＤＮＡ配列にフレームを合わせて連結されている。ｐＣＳＡ２ＭＴ−ＴＡＢ１をＢａｍＨＩ及びＸｂａＩにより消化した。断片を単離し、そして哺乳類発現ベクターｐＥＦのＥCOＲＩ−ＸｂａＩ部位に挿入した。このプラスミドは、ヒト伸長因子１α（ＥＦ１α）プロモーターからＴＡＢ１を発現させる。
【００５４】
細胞抽出物をＨＡに対するモノクローナル抗体１２ＣＡ５（図６のレーン２）、Ｍｙｃに対するモノクローナル抗体９Ｅ１０（図６のレーン３）、又は対照非免疫ＩｇＧ（図６のレーン４）との免疫沈降にかけた。免疫複合体を洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロースに移行せしめ、そしてＭｙｃに対する抗体（図６の上レーン）又はＨＡに対する抗体（図６の下レーン）を用いてイムノブロットした。
【００５５】
細胞抽出物はまた、イムノブロット分析に直接かけた（図６のレーン１）。図６に示すごとく、各免疫沈降においてかなりの量のＭｙｃ−ＴＡＢ１が検出され、ＴＡＫ１がＴＡＢ１と共免疫沈降し得ることが示された。免疫沈降した蛋白質をＨＡに対する抗体によりブロットする相互実験により、ＴＡＢ１とＴＡＫ１との会合が確認された。これらの実験は、ＴＡＢ１が、酵母におけると同様に哺乳類細胞中でもＴＡＫ１と会合し得ることを示すものである。
【００５６】
実施例８．
ＴＡＢ１の過剰発現が哺乳類細胞中でＴＡＫ１のキナーゼ活性を活性化し得るか否か検討した。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞をＭｙｃ−ＴＡＢ１の存在下（＋）又は非存在下（−）でＨＡ−ＴＡＫ１により一過性にトランスフェクトした。細胞を２０ng／mlのＴＧＦ−β１により１０分間処理し（＋）又は処理せず（−）、次に実施例３に記載したようにしてＨＡ−ＴＡＫ１を免疫沈降せしめ、そしてキナーゼ活性について測定した。すなわち、免疫沈降の一部分をＨＡに対する抗体によりイムノブロットした。結果を図７に示す。
【００５７】
活性は、刺激されていない細胞からのＨＡ−ＴＡＫ１の量に対する増加倍数として示し、３回以上の実験からの平均±ＳＥＭとして表わした（図７上段のグラフ）。ＨＡ−ＴＡＫ１はＫＨ−ｐ３８（ＭＰＫ２）を直接リン酸化しなかった（K.Yamaguchi ら、Science, Vol.270, p.2008 (1995))。中段パネルは、ＫＮ−ｐ３８（ＭＰＫ２）のリン酸化を表すオートラジオグラフである。下段パネルは、ＨＡに対するモノクローナル抗体１２ＣＡ５による各免疫沈降のイムノブロット分析を示し、各サンプルにおいて、およそ同じ量のＴＡＫ１−ＨＡが回収されたことを示している。中段及び下段のパネルに示すデーターは典型的な実験からのものである。
【００５８】
ＴＡＫ１免疫沈降物のインビトロキナーゼ測定が示すところによれば、ＴＧＦ−βの非存在下でさえＴＡＢ１によりトランスフェクトされた細胞においてＴＡＫ１活性が刺激された。ＴＡＢ１の過剰発現によるＴＡＫ１の活性化は、ＨＡ−ＴＡＫ１のみを発現するＴＧＦ−βで刺激された細胞において観察される活性化に匹敵した。
【００５９】
実施例９．
ＴＧＦ−βは、プラスミノーゲン活性化因子インヒビター−１（ＰＡＩ−１）をコードするｍＲＮＡの量を急速に増加せしめる（M.R.Keetonら、J. Biol. Chem., Vol.266, p.23048 (1991))。ＴＡＫ１の活性化形（ＴＡＫ１ΔＮ）の過剰発現により、ＴＧＦ−β−誘導性ｐＡＩ−１遺伝子プロモーターの制御下にあるルシフェラーゼ遺伝子を含有するレポーター遺伝子は構成的に活性化される（K.Yamaguchi ら、Science, Vol.270, p.2008 (1995))。ＴＡＢ１の過剰発現がルシフェラーゼレポーター遺伝子の活性化をもたらすか否かを試験した。
【００６０】
ＭｖｌＬｕ細胞を、レポータープラスミドｐ８００neoLUC (M.Abe ら、Analyt. Biochem., Vol.216, p.276 (1994))と、ＴＡＢ１発現プラスミドｐＥＦ−ＴＡＢ１又はＴＡＫ１をコードする発現プラスミド（K.Yamaguchi ら、Science, Vol.270, p.2008 (1995))とを用いて、リン酸カルシウム法（H.Shibuya ら、Nature, Vol.357, p.700 (1992))により一過性トランスフェクトした。なお、プラスミドｐＥＦ−ＴＡＢ１は、ＥＦ１αプロモーターの制御のもとに全長ＴＡＢ１コード配列を含有しており、ｐＥＦをＥCOＲＩにより開裂せしめそしてプラスミドＴＡＢＩ−ｆ−４からのＥCOＲＩ断片を挿入することにより作製したものである。
【００６１】
このプラスミドＴＡＢＩ−ｆ−４はｐＢＳのＥCOＲＩおよびＳｍａＩ部位にＴＡＢ１ｃＤＮＡをサブクローニングすることにより作製したものである。細胞を３０ng／mlのヒトＴＧＦ−β１と共に又はこれを伴わないで２０時間インキュベートし、抽出物を調製し、そしてルシフェラーゼの測定を行った（H.Shibuya ら、Mol. Cell Biol., Vol.14, p.5812 (1994)) 。ルシフェラーゼ活性はβ−ガラクトシダーゼの発現に基いて補正した。
【００６２】
すなわち、トランスフェクション効率を補正するため、ｐＸｅＸ−β−Ｇａｌベクター（A.D.Johnson ら、Gene, Vol.147, p.223 (1994))をすべてのルシフェラーゼレポーター実験において同時トランスフェクトした。β−ガラクトシダーゼの測定は、ルシフェラーゼ測定のために調製された細胞溶解物を用いて、製造者（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）の指示書に従って行った。ルシフェラーゼ活性は、ベクターによりトランスフェクトされた非刺激細胞の活性に対する増加倍数として示した。すべてのトランスフェクション及びルシフェラーゼ測定は少なくとも５回行い、各実験は３連とした。
【００６３】
結果を図８に示す。図中、ＫＮは触媒的に不活性なＴＡＫ１−Ｋ６３Ｗを示す。データーは、代表的な実験における３連の実験からのルシフェラーゼ活性の平均±ＳＥＭを示す。ＴＡＫ１と共にＴＡＢ１の過剰発現はＴＧＦ−βの非存在下でもレポーター遺伝子の発現を誘導したが、ＴＡＫ１又はＴＡＢ１のみの過剰発現はルシフェラーゼ活性の構成的量にほとんど影響を与えなかった。これらの研究は、ＴＡＢ１が哺乳類細胞においてＴＡＫ１の活性を増強することを示している。
【００６４】
ＴＡＫ１−Ｋ６３Ｗの変異体の過剰発現はＴＧＦ−βに刺激されたルシフェラーゼ活性を阻害したが（K.Yamaguchi ら、Science, Vol.270, p.2008 (1995))、これはおそらく経路中の必須要素を妨害する（ｓｅｑｕｅｓｔｅｒｉｎｇ）ためであろう。他方、ＴＡＢ１の過剰発現はＴＡＫ１−Ｋ６３Ｗの阻害効果を低減させ、ＴＡＢ１がＴＡＫ１−Ｋ６３Ｗの過剰発現により吸収される可能性を示唆する。
【００６５】
実施例１０．
ＴＡＢ１のＣ−末端の６８個のアミノ酸〔ＴＡＢ１（４３７−５０４）〕はＴＡＫ１に結合しそしてそれを活性化するために十分であり、ＴＡＢ１のＮ−末端ドメインがＴＡＢ１の機能における制御的役割を演ずることが示唆された。この可能性を試験するため、Ｃ−末端ＴＡＫ１結合ドメインを欠くＴＡＢ１の短縮形〔ＴＡＢ１（１−４１８）〕を作製した。ＭｖｌＬｕ細胞を、ｐ８００nedUC レポーターと、ＴＡＢ１（１−４１８）又はＴＡＢ１（全長）をコードする発現ベクターの図９に示す量とにより一過性にトランスフェクトし、そしてそれらをｐＥＦコントロールベクターにより補完した。
【００６６】
なお、ＴＡＢ１（１−４１８）をコードする発現ベクターは次のようにして作製した。プラスミドＴＡＢＩ−ｆ−４の１．３kbのＥCOＲＩ−ＨｉｎｃII断片（ＴＡＢ１のアミノ酸１−４１８のＮ−末端領域を含有する）をｐＫＴ１０ベクターにサブクローニングしてｐＫＴ１０−ＴＡＢ１（１−４１８）を作製した。ｐＥＦをＥCOＲＩ及びＳａｌＩにより開裂せしめ、そしてｐＫＳ１０−ＴＡＢ１（１−４１８）からのＥCOＲＩ−ＳａｌＩ断片を挿入することによりｐＥＦ−ＴＡＢ１（１−４１８）を作製した。
【００６７】
次に、細胞を３０ng／mlのＴＧＦ−β１と共に又はこれを伴わないで２０時間インキュベートし、そして細胞溶解物をルシフェラーゼ活性について測定した。数値は、ｐＥＦによりトランスフェクトされた対照細胞に対する誘導の倍数の％として示した。ＴＧＦ−βによるルシフェラーゼの非誘導（誘導倍数１）は０％に相当する。すべてのトランスフェクション及びルシフェラーゼの測定は少なくとも３回行い、各実験を３連とした。データーは、代表的な実験における３連の実験からのルシフェラーゼ活性の平均±ＳＥＭで示す。
【００６８】
結果を図９に示す。ＭｖｌＬｕ細胞でのＴＡＢ１（１−４１８）の過剰発現は、ＴＧＦ−β刺激により誘導されるレポーター遺伝子の活性を抑制した。従ってＴＡＢ１（１−４１８）はＴＧＦ−βにより誘導される遺伝子発現のドミナント−ネガティブインヒビターとして作用する。これらの結果は、ＴＡＢ１がＴＧＦ−βのシグナル伝達に関与することを示している。
【００６９】
ＴＡＢ１がＴＡＫ１の活性化を誘導するメカニズムとしては、ＴＡＫ１に結合するＴＡＢ１が活性化に必要なコンホーメーション変化を誘導することが考えられる。ＴＡＫ１のＮ−末端における２０アミノ酸の除去はプロテインキナーゼの構成的活性化をもたらすことから、Ｎ−末端ドメインが触媒ドメインを束縛してキナーゼ活性を阻害することが示唆される（K.Yamaguchi ら、Science, Vol.270, p.2008 (1995))。ＴＡＢ１はＴＡＫ１のこの負の制御ドメインをその触媒ドメインから解除するのかも知れない。ＴＡＫ１結合部位として機能するＴＡＢ１のＣ−末端は、ＴＡＫ１のＮ−末端に見出される領域と同様にセリン及びスレオニンリッチ領域を含有している。従って、ＴＡＢ１はＴＧＦ−βとＴＡＫ１ ＭＡＰＫＫＫとの間の重要なシグナル伝達中間体であろう。
【００７０】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＴＡＫ１蛋白質上の、ＴＡＢ１蛋白質が結合する領域を示す図である。斜線部分はＴＡＢ１の触媒領域を示す。
【図２】図２は、酵母におけるフェロモン活性化ＭＡＰＫ経路中のＳｔｅ１１欠損株におけるＴＡＫ１とＴＡＢ１との共存によるＳｔｅ１１欠損の補完を示す図であり、電気泳動の結果を示す図面代用写真である。
【図３】図３は、ＴＡＢ１がＴＡＫ１のを活性を増強することを示すイン・ビトロ実験の結果を示す図面代用写真である。
【図４】図４は、ＴＡＢ１のアミノ酸配列を示す。
【図５】図５は、種々の器官又は組織においてＴＡＢ１をコードするｍＲＮＡが発現されることを示す電気泳動図であり、図面に代る写真である。
【図６】図６は、哺乳類細胞中でＴＡＢ１とＴＡＫ１の会合が生ずることを示すイムノブロット図であり、図面代用写真である。
【図７】図７は、哺乳類細胞中で、ＴＡＢ１がＴＡＫ１のキナーゼ活性を増強することを示すグラフ（上）と、ＴＡＫ１及びＫＮ−ＭＰＫ２が同程度に生産されたことを示すブロット図であり、図面代用写真である。
【図８】図８は、ＴＧＦ−βにより刺激した哺乳類細胞において、ＴＡＫ１とＴＡＢ１の共存によりレポーターとしてのルシフェラーゼ遺伝子の発現が増強されることを示すグラフである。
【図９】図９は、Ｃ−末端が欠けたＴＡＢ１（ＴＡＢ１（１−４１８））がＴＧＦ−βにより誘導されるレポーターとしてのルシフェラーゼ遺伝子の発現を阻害することを示すグラフである。
Claims (10)
- 配列番号：１に示すアミノ酸配列からなるTAB1蛋白質。
- 配列番号：１に示すアミノ酸配列に対して、１又は数個のアミノ酸の置換、欠失及び／又は付加によって修飾されているアミノ酸配列からなり、且つTAB1蛋白質の生物学的性質を有する蛋白質。
- 配列番号：１に示すアミノ酸配列において、アミノ酸位置437〜504位のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
- 請求項１〜３のいずれか１項に記載の蛋白質又はポリペプチドの製造方法において、該蛋白質又はポリペプチドをコードするDNAを含んでなる発現ベクターにより形質転換された宿主を培養し、該培養物から該蛋白質又はポリペプチドを採取することを特徴とする方法。
- 前記宿主が哺乳類細胞又は酵母細胞である、請求項４に記載の方法。
- 請求項１〜３のいずれか１項に記載の蛋白質又はポリペプチドを哺乳類細胞において生成せしめる方法であって、該蛋白質又はポリペプチドをコードするDNAを哺乳動物細胞に導入することを特徴とする方法。
- 請求項１〜３のいずれか１項に記載の蛋白質又はポリペプチドをコードするDNA。
- 請求項７に記載のDNAを含んで成る発現ベクター。
- 請求項８に記載の発現ベクターにより形質転換された宿主。
- 前記宿主が哺乳類細胞又は酵母細胞である、請求項９に記載の宿主。
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