JPH104976A - Ｔａｂ１蛋白質及びそれをコードするｄｎａ - Google Patents
Ｔａｂ１蛋白質及びそれをコードするｄｎａInfo
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- JPH104976A JPH104976A JP8300856A JP30085696A JPH104976A JP H104976 A JPH104976 A JP H104976A JP 8300856 A JP8300856 A JP 8300856A JP 30085696 A JP30085696 A JP 30085696A JP H104976 A JPH104976 A JP H104976A
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- C07K—PEPTIDES
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- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
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- C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
Abstract
(57)【要約】
【課題】 ＴＧＦ−βシグナル伝達系における新規な因
子の提供。 【解決手段】 ＴＧＦ−βシグナル伝達系における１因
子であるＴＡＫ１を活性化する活性を有するＴＡＢ１蛋
白質であって、図１に示すアミノ酸配列を有する。
子の提供。 【解決手段】 ＴＧＦ−βシグナル伝達系における１因
子であるＴＡＫ１を活性化する活性を有するＴＡＢ１蛋
白質であって、図１に示すアミノ酸配列を有する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は形質転換増殖因子−
β（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ＧｒｏｗｔｈＦａｃｔ
ｏｒ −β；ＴＧＦβ）のシグナル伝達系の１員である
ＴＡＢ１蛋白質、及びそれをコードする遺伝子に関す
る。
β（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ＧｒｏｗｔｈＦａｃｔ
ｏｒ −β；ＴＧＦβ）のシグナル伝達系の１員である
ＴＡＢ１蛋白質、及びそれをコードする遺伝子に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】ＴＧＦ−βは、細胞機能の多くの面を制
御する多機能因子である。その一面として、ＴＧＦ−β
は様々な傷害に伴う組織の修復及び再生を司る。慢性化
した傷害におけるＴＧＦ−β異常産生により、組織の修
復、再生のバランスが崩れ病的な線維化が生ずることが
ある。ＴＧＦ−β産生のバランスが崩れた病態として、
肝線維症が知られている。肝臓において、ＴＧＦ−βは
線維化の原因となる細胞外マトリックス蛋白質の産生を
亢進させ、細胞外マトリックス蛋白質分解酵素の合成を
阻害および分解酵素の阻害物質を誘導することにより、
肝線維症の主要な原因因子として働く。
御する多機能因子である。その一面として、ＴＧＦ−β
は様々な傷害に伴う組織の修復及び再生を司る。慢性化
した傷害におけるＴＧＦ−β異常産生により、組織の修
復、再生のバランスが崩れ病的な線維化が生ずることが
ある。ＴＧＦ−β産生のバランスが崩れた病態として、
肝線維症が知られている。肝臓において、ＴＧＦ−βは
線維化の原因となる細胞外マトリックス蛋白質の産生を
亢進させ、細胞外マトリックス蛋白質分解酵素の合成を
阻害および分解酵素の阻害物質を誘導することにより、
肝線維症の主要な原因因子として働く。
【０００３】ＴＧＦ−βのスーパーファミリーのメンバ
ーのシグナル伝達系の１メンバーとして、マイトジエン
−活性化プロテイン・キナーゼ・キナーゼ・キナーゼ
（Ｍｉｔｏｇｅｎ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉ
ｎ Ｋｉｎａｓｅ Ｋｉｎａｓｅ Ｋｉｎａｓｅ；ＭＡ
ＰＫＫＫ）系が知られている。
ーのシグナル伝達系の１メンバーとして、マイトジエン
−活性化プロテイン・キナーゼ・キナーゼ・キナーゼ
（Ｍｉｔｏｇｅｎ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉ
ｎ Ｋｉｎａｓｅ Ｋｉｎａｓｅ Ｋｉｎａｓｅ；ＭＡ
ＰＫＫＫ）系が知られている。
【０００４】ＭＡＰＫ経路は受容体のシグナルを種々の
作用に転換する保存された真核性シグナル伝達系であ
り、この系は３種類のプロテインキナーゼ、すなわち前
記のＭＡＰＫＫＫ，ＭＡＰＫＫ及びＭＡＰＫを含んでお
り、ＭＡＰＫはＭＡＰＫＫによるリン酸化により活性化
され、ＭＡＫＫはＭＡＰＫＫＫにより活性化される（E.
Nishidaら、Trends Biochem. Sci. Vol.18, p.128 (199
3) ; K. J. Blu mer ら、前掲Vol.19, p.236 (1994) ;
R.J.David、前掲Vol.19, p.470 (1994) ; C.J.Marchal
l, Cell, Vol.80, p.179 (1995))。
作用に転換する保存された真核性シグナル伝達系であ
り、この系は３種類のプロテインキナーゼ、すなわち前
記のＭＡＰＫＫＫ，ＭＡＰＫＫ及びＭＡＰＫを含んでお
り、ＭＡＰＫはＭＡＰＫＫによるリン酸化により活性化
され、ＭＡＫＫはＭＡＰＫＫＫにより活性化される（E.
Nishidaら、Trends Biochem. Sci. Vol.18, p.128 (199
3) ; K. J. Blu mer ら、前掲Vol.19, p.236 (1994) ;
R.J.David、前掲Vol.19, p.470 (1994) ; C.J.Marchal
l, Cell, Vol.80, p.179 (1995))。
【０００５】ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバー
のシグナル伝達系において機能するＭＡＰＫＫＫファミ
リーの１メンバーであるＴＡＫ１はK.Yamaguchi らによ
り同定された (K.Yamaguchi ら、Science, Vol.270, p.
2008 (1995))。ＴＧＦ−βは、細胞質側にセリン−及び
スレオニン−特異的キナーゼドメインを含有する膜貫通
蛋白質である１型及び２型ＴＧＦ−β受容体のヘテロマ
ーコンプレックスを介してシグナルを伝達する（J.L.Wr
ana ら、Nature, Vol.370, p.341 (1994) ; D.M.Kingsl
eyら、Genes Dev., Vol.8, p.133 (1994))。しかしなが
らＴＧＦ−β受容体から下流のシグナル伝達機構は分子
レベルにおいてほとんど知られていない。
のシグナル伝達系において機能するＭＡＰＫＫＫファミ
リーの１メンバーであるＴＡＫ１はK.Yamaguchi らによ
り同定された (K.Yamaguchi ら、Science, Vol.270, p.
2008 (1995))。ＴＧＦ−βは、細胞質側にセリン−及び
スレオニン−特異的キナーゼドメインを含有する膜貫通
蛋白質である１型及び２型ＴＧＦ−β受容体のヘテロマ
ーコンプレックスを介してシグナルを伝達する（J.L.Wr
ana ら、Nature, Vol.370, p.341 (1994) ; D.M.Kingsl
eyら、Genes Dev., Vol.8, p.133 (1994))。しかしなが
らＴＧＦ−β受容体から下流のシグナル伝達機構は分子
レベルにおいてほとんど知られていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明は、Ｔ
ＧＦ−β受容体のシグナル伝達系の新しく見出された１
メンバーであるＴＡＢ１蛋白質及びそれをコードする遺
伝子を提供しようとするものである。さらに、本発明は
ＴＧＦ−βシグナル伝達系阻害物質のスクリーニング方
法を提供する。なお、ＴＡＢ１は、ＴＡＫ１に結合する
蛋白質（ＴＡＫ１Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ）を
意味する。
ＧＦ−β受容体のシグナル伝達系の新しく見出された１
メンバーであるＴＡＢ１蛋白質及びそれをコードする遺
伝子を提供しようとするものである。さらに、本発明は
ＴＧＦ−βシグナル伝達系阻害物質のスクリーニング方
法を提供する。なお、ＴＡＢ１は、ＴＡＫ１に結合する
蛋白質（ＴＡＫ１Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ）を
意味する。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、上記の課題を
解決するため、本発明は、配列番号：１に示すアミノ酸
配列を有するＴＡＢ１蛋白質；配列番号：１に示すアミ
ノ酸配列に対して、１又は複数のアミノ酸の置換、欠失
及び／又は付加によって修飾されているアミノ酸配列を
有し、且つＴＡＢ１蛋白質の生物学的性質を有する蛋白
質；配列番号１に示すアミノ酸配列において５２番目の
アミノ酸がアルギニンである蛋白質；配列番号：１に示
すヌクレオチド配列を有するＤＮＡに対して６０℃、
０．１×ＳＳＣ，０．１％ドデシル硫酸ナトリウムのハ
イブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすること
ができるＤＮＡによりコードされており、且つＴＡＢ１
蛋白質の生物学的活性を有する蛋白質；配列番号：１に
示すアミノ酸配列において、アミノ酸位置２１位〜５７
９位のアミノ酸から成るアミノ酸配列を有する蛋白質；
並びに配列番号：１に示すアミノ酸配列において、アミ
ノ酸位置４３７位〜５０４位の６８個のアミノ酸から成
るアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。
解決するため、本発明は、配列番号：１に示すアミノ酸
配列を有するＴＡＢ１蛋白質；配列番号：１に示すアミ
ノ酸配列に対して、１又は複数のアミノ酸の置換、欠失
及び／又は付加によって修飾されているアミノ酸配列を
有し、且つＴＡＢ１蛋白質の生物学的性質を有する蛋白
質；配列番号１に示すアミノ酸配列において５２番目の
アミノ酸がアルギニンである蛋白質；配列番号：１に示
すヌクレオチド配列を有するＤＮＡに対して６０℃、
０．１×ＳＳＣ，０．１％ドデシル硫酸ナトリウムのハ
イブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすること
ができるＤＮＡによりコードされており、且つＴＡＢ１
蛋白質の生物学的活性を有する蛋白質；配列番号：１に
示すアミノ酸配列において、アミノ酸位置２１位〜５７
９位のアミノ酸から成るアミノ酸配列を有する蛋白質；
並びに配列番号：１に示すアミノ酸配列において、アミ
ノ酸位置４３７位〜５０４位の６８個のアミノ酸から成
るアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。
【０００８】本発明はまた、上記の蛋白質又はポリペプ
チドの製造方法において、該蛋白質又はポリペプチドを
コードするＤＮＡを含んで成る発現ベクターにより形質
転換された宿主を培養し、該培養物から該蛋白質又はポ
リペプチドを採取することを特徴とする方法を提供す
る。本発明はまた、上記の蛋白質又はポリペプチドを哺
乳類細胞において生成せしめる方法において、該蛋白質
又はポリペプチドをコードするＤＮＡを哺乳動物細胞に
導入することを特徴とする方法を提供する。
チドの製造方法において、該蛋白質又はポリペプチドを
コードするＤＮＡを含んで成る発現ベクターにより形質
転換された宿主を培養し、該培養物から該蛋白質又はポ
リペプチドを採取することを特徴とする方法を提供す
る。本発明はまた、上記の蛋白質又はポリペプチドを哺
乳類細胞において生成せしめる方法において、該蛋白質
又はポリペプチドをコードするＤＮＡを哺乳動物細胞に
導入することを特徴とする方法を提供する。
【０００９】本発明はまた、前記の蛋白質又はポリペプ
チドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含んで成る発現ベ
クター、及び該発現ベクターにより形質転換された宿主
を提供する。本発明はさらに、ＴＧＦ−βシグナル伝達
系阻害物質のスクリーニング方法を提供する。
チドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含んで成る発現ベ
クター、及び該発現ベクターにより形質転換された宿主
を提供する。本発明はさらに、ＴＧＦ−βシグナル伝達
系阻害物質のスクリーニング方法を提供する。
【００１０】
【発明の実施の形態】本発明のＴＡＢ１蛋白質は、形質
転換増殖因子−β（ＴＧＦ−β）のシグナル伝達経路に
おいてＴＡＫ１に結合してＴＡＫ１を活性化する性質を
有する。この性質及びその他の諸性質については実施例
２〜４及び６〜１０に詳細に記載されている。本発明の
ＴＡＢ１蛋白質は、実施例１及び５に記載する方法によ
りクローニングされたｃＤＮＡのヌクレオチド配列から
推定されるアミノ酸配列（配列番号：１）を有する。
転換増殖因子−β（ＴＧＦ−β）のシグナル伝達経路に
おいてＴＡＫ１に結合してＴＡＫ１を活性化する性質を
有する。この性質及びその他の諸性質については実施例
２〜４及び６〜１０に詳細に記載されている。本発明の
ＴＡＢ１蛋白質は、実施例１及び５に記載する方法によ
りクローニングされたｃＤＮＡのヌクレオチド配列から
推定されるアミノ酸配列（配列番号：１）を有する。
【００１１】しかしながら、生物学的活性を有する蛋白
質において、１又は複数のアミノ酸の置換、欠失及び／
又は付加により修飾されたアミノ酸配列を有するもので
も、生来の蛋白質が有する生物学的性質を保持すること
がよく知られている。従って、本発明は、配列番号：１
に示すアミノ酸配列に対して１又は複数のアミノ酸の置
換、欠失及び／又は付加により修飾されたアミノ酸配列
を有し、且つＴＡＢ１の生物学的性質を有するものを含
む。その一態様として、配列番号１に示されるアミノ酸
配列において５２番目のアミノ酸がアルギニンである蛋
白質が挙げられる。
質において、１又は複数のアミノ酸の置換、欠失及び／
又は付加により修飾されたアミノ酸配列を有するもので
も、生来の蛋白質が有する生物学的性質を保持すること
がよく知られている。従って、本発明は、配列番号：１
に示すアミノ酸配列に対して１又は複数のアミノ酸の置
換、欠失及び／又は付加により修飾されたアミノ酸配列
を有し、且つＴＡＢ１の生物学的性質を有するものを含
む。その一態様として、配列番号１に示されるアミノ酸
配列において５２番目のアミノ酸がアルギニンである蛋
白質が挙げられる。
【００１２】さらに、一旦特定の蛋白質をコードするＤ
ＮＡがクローニングされれば、そのＤＮＡをプローブと
して、例えばその蛋白質が得られた種の器官又は組織と
は異る器官又は組織からのＤＮＡライブラリーあるいは
他の種からのＤＮＡライブラリーをスクリーニングする
ことにより、同様の生物学的性質を有するがアミノ酸配
列を異にする蛋白質をコードするＤＮＡが得られること
も知られている。従って、本発明は、配列番号：１に示
すヌクレオチド配列を有するＤＮＡに対して、例えば６
０℃、０．１×ＳＳＣ，０．１％ドデシル硫酸ナトリウ
ムのハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズす
ることができるＤＮＡによりコードされており、且つＴ
ＡＢ１蛋白質の生物学的性質を有する蛋白質をも包含す
る。
ＮＡがクローニングされれば、そのＤＮＡをプローブと
して、例えばその蛋白質が得られた種の器官又は組織と
は異る器官又は組織からのＤＮＡライブラリーあるいは
他の種からのＤＮＡライブラリーをスクリーニングする
ことにより、同様の生物学的性質を有するがアミノ酸配
列を異にする蛋白質をコードするＤＮＡが得られること
も知られている。従って、本発明は、配列番号：１に示
すヌクレオチド配列を有するＤＮＡに対して、例えば６
０℃、０．１×ＳＳＣ，０．１％ドデシル硫酸ナトリウ
ムのハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズす
ることができるＤＮＡによりコードされており、且つＴ
ＡＢ１蛋白質の生物学的性質を有する蛋白質をも包含す
る。
【００１３】本発明の修飾された蛋白質としては、例え
ば、配列番号：１のアミノ酸配列において、アミノ酸位
置２１位〜５７９位のアミノ酸から成るアミノ酸配列を
有する蛋白質が挙げられる。この蛋白質はＴＡＢ１蛋白
質の生物学的性質を有している。また、本発明の修飾さ
れたポリペプチドとして、配列番号：１に示すアミノ酸
配列において、アミノ酸位置４３７位〜５０４位の６８
個のアミノ酸から成るアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドが挙げられる。このポリペプチドはＴＡＫ１に結合す
ることによって、ＴＡＫ１のキナーゼ活性を活性化する
性質を有する。さらに、本発明の修飾された蛋白質とし
て、上記蛋白質又はポリペプチドが他の蛋白質と融合し
ており、かつＴＡＢ１の生物学的活性を有する蛋白質が
挙げられる。
ば、配列番号：１のアミノ酸配列において、アミノ酸位
置２１位〜５７９位のアミノ酸から成るアミノ酸配列を
有する蛋白質が挙げられる。この蛋白質はＴＡＢ１蛋白
質の生物学的性質を有している。また、本発明の修飾さ
れたポリペプチドとして、配列番号：１に示すアミノ酸
配列において、アミノ酸位置４３７位〜５０４位の６８
個のアミノ酸から成るアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドが挙げられる。このポリペプチドはＴＡＫ１に結合す
ることによって、ＴＡＫ１のキナーゼ活性を活性化する
性質を有する。さらに、本発明の修飾された蛋白質とし
て、上記蛋白質又はポリペプチドが他の蛋白質と融合し
ており、かつＴＡＢ１の生物学的活性を有する蛋白質が
挙げられる。
【００１４】本発明の蛋白質又はポリペプチドは、例え
ば、ＴＧＦ−βのシグナル伝達系に重要なＴＡＫ１を活
性化することによってＴＧＦ−βの生理機能をそれ自身
で模倣できるほか、ＴＡＫ１と結合することを利用して
ＴＡＫ１とＴＡＢ１の結合を阻害し、細胞増殖抑制、免
疫抑制、骨分化などの作用に対するアゴニストあるいは
アンタゴニストとして働く物質のスクリーニング方法の
ために有用である。
ば、ＴＧＦ−βのシグナル伝達系に重要なＴＡＫ１を活
性化することによってＴＧＦ−βの生理機能をそれ自身
で模倣できるほか、ＴＡＫ１と結合することを利用して
ＴＡＫ１とＴＡＢ１の結合を阻害し、細胞増殖抑制、免
疫抑制、骨分化などの作用に対するアゴニストあるいは
アンタゴニストとして働く物質のスクリーニング方法の
ために有用である。
【００１５】本発明の蛋白質をコードするＤＮＡは、例
えば、配列番号：１に示すアミノ酸配列をコードするＤ
ＮＡである。このようなＤＮＡは例えば、実施例１及び
５に記載する方法により得ることができ、配列番号：１
のヌクレオチド配列を有する。しかしながら、配列番
号：１に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、必ず
しも配列番号：１に示すヌクレオチド配列を有する必要
はなく、同一のアミノ酸をコードする別のコドンから構
成されていてもよい。例えば、配列番号：１に示すヒト
由来のヌクレオチド配列を、細菌や酵母等の微生物にお
いて効率よく翻訳されるコドンを含むものに変えること
ができ、これは、例えばプライマーを用いる部位特定変
異誘発等の周知技術を用いて行うことができる。
えば、配列番号：１に示すアミノ酸配列をコードするＤ
ＮＡである。このようなＤＮＡは例えば、実施例１及び
５に記載する方法により得ることができ、配列番号：１
のヌクレオチド配列を有する。しかしながら、配列番
号：１に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、必ず
しも配列番号：１に示すヌクレオチド配列を有する必要
はなく、同一のアミノ酸をコードする別のコドンから構
成されていてもよい。例えば、配列番号：１に示すヒト
由来のヌクレオチド配列を、細菌や酵母等の微生物にお
いて効率よく翻訳されるコドンを含むものに変えること
ができ、これは、例えばプライマーを用いる部位特定変
異誘発等の周知技術を用いて行うことができる。
【００１６】本発明の、配列番号：１に示すアミノ酸配
列に対して、１又は複数のアミノ酸配列が置換、欠失及
び／又は付加されているアミノ酸配列を有する蛋白質又
はポリペプチドをコードするＤＮＡは、例えば、配列番
号：１に示すヌクレオチド配列を有するＤＮＡを鋳型と
し、部位特定変異誘発法、ＰＣＲ法等、それ自体周知の
方法を用いて作製することができる。さらにまた、修飾
されたアミノ酸配列を有する蛋白質の内、生来の蛋白質
に比較して短縮された蛋白質又はポリペプチドをコード
するＤＮＡは、例えば、生来のＤＮＡ、例えばｃＤＮＡ
に翻訳開始コドン及び／又は翻訳終止コドンを導入する
ことによって得ることもできる。これらのコドンの導入
は、例えば部位特定変異誘発、ＰＣＲ法等により行うこ
とができる。あるいは、生来のＤＮＡ、例えばｃＤＮＡ
を適当な制限酵素により切断し、そして所望によりオリ
ゴヌクレオチドを付加することによっても得られる。
列に対して、１又は複数のアミノ酸配列が置換、欠失及
び／又は付加されているアミノ酸配列を有する蛋白質又
はポリペプチドをコードするＤＮＡは、例えば、配列番
号：１に示すヌクレオチド配列を有するＤＮＡを鋳型と
し、部位特定変異誘発法、ＰＣＲ法等、それ自体周知の
方法を用いて作製することができる。さらにまた、修飾
されたアミノ酸配列を有する蛋白質の内、生来の蛋白質
に比較して短縮された蛋白質又はポリペプチドをコード
するＤＮＡは、例えば、生来のＤＮＡ、例えばｃＤＮＡ
に翻訳開始コドン及び／又は翻訳終止コドンを導入する
ことによって得ることもできる。これらのコドンの導入
は、例えば部位特定変異誘発、ＰＣＲ法等により行うこ
とができる。あるいは、生来のＤＮＡ、例えばｃＤＮＡ
を適当な制限酵素により切断し、そして所望によりオリ
ゴヌクレオチドを付加することによっても得られる。
【００１７】本発明の配列番号：１に示すヌクレオチド
配列を有するＤＮＡとハイブリダイズすることができ、
且つＴＡＢ１の生物学的性質を有する蛋白質をコードす
るＤＮＡは、例えば、実施例６に示す種々の組織又は器
官、例えば心臓、脳、胎盤、肝臓、骨格筋、腎臓、すい
臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、結腸、末
梢血白血球等から調製したゲノミックＤＮＡライブラリ
ー又はｃＤＮＡライブラリーを、本発明の、例えば配列
番号：１に示すヌクレオチド配列又はその部分をプロー
ブとして用いて、スクリーニングすることにより行われ
る。上記のＤＮＡライブラリーは、ヒトに由来するもの
のみならず、他の動物、例えば、ラット、マウス、ウサ
ギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ブタ等に由来するものであっ
てもよい。
配列を有するＤＮＡとハイブリダイズすることができ、
且つＴＡＢ１の生物学的性質を有する蛋白質をコードす
るＤＮＡは、例えば、実施例６に示す種々の組織又は器
官、例えば心臓、脳、胎盤、肝臓、骨格筋、腎臓、すい
臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、結腸、末
梢血白血球等から調製したゲノミックＤＮＡライブラリ
ー又はｃＤＮＡライブラリーを、本発明の、例えば配列
番号：１に示すヌクレオチド配列又はその部分をプロー
ブとして用いて、スクリーニングすることにより行われ
る。上記のＤＮＡライブラリーは、ヒトに由来するもの
のみならず、他の動物、例えば、ラット、マウス、ウサ
ギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ブタ等に由来するものであっ
てもよい。
【００１８】本発明はまた、上記のＤＮＡを含んで成る
発現ベクター及びそれにより形質転換された宿主に関す
る。発現ベクターは宿主により異る。本発明の宿主とし
ては、原核生物及び真核生物のいずれも使用することが
できる。原核生物としては、細菌、例えばエシェリシア
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属の微生物、例えば大腸菌
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、バシルス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ）属微生物、例えばバシルス・ズブチリ
ス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、等が使用され、真核生物
としては、下等真核生物、例えば糸状菌又は酵母が挙げ
られる。
発現ベクター及びそれにより形質転換された宿主に関す
る。発現ベクターは宿主により異る。本発明の宿主とし
ては、原核生物及び真核生物のいずれも使用することが
できる。原核生物としては、細菌、例えばエシェリシア
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属の微生物、例えば大腸菌
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、バシルス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ）属微生物、例えばバシルス・ズブチリ
ス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、等が使用され、真核生物
としては、下等真核生物、例えば糸状菌又は酵母が挙げ
られる。
【００１９】糸状菌としては、アスペルギルス（Ａｓｐ
ｅｒｇｉｌｌｕｓ）属微生物、例えばアスペルギルス・
ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アス
ペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｉ
ｚａｅ）等、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）
属微生物、等が挙げられ、酵母としては、例えばサッカ
ロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属微生物、例
えばサッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等が挙げられる。
ｅｒｇｉｌｌｕｓ）属微生物、例えばアスペルギルス・
ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アス
ペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｉ
ｚａｅ）等、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）
属微生物、等が挙げられ、酵母としては、例えばサッカ
ロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属微生物、例
えばサッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等が挙げられる。
【００２０】また、高等真核生物としては動植物細胞、
例えば不滅化された動物培養細胞例、例えばＣＯＳ細
胞、ＣＨＯ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３等が使用できる。また、
昆虫細胞、例えばＳｆ９，Ｓｆ１２等も使用できる。本
発明の発現ベクターは、本願発明の蛋白質又はポリペプ
チドをコードするＤＮＡのほかに、上記の宿主において
機能し得る発現制御配列、例えばプロモーターを含有す
る。
例えば不滅化された動物培養細胞例、例えばＣＯＳ細
胞、ＣＨＯ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３等が使用できる。また、
昆虫細胞、例えばＳｆ９，Ｓｆ１２等も使用できる。本
発明の発現ベクターは、本願発明の蛋白質又はポリペプ
チドをコードするＤＮＡのほかに、上記の宿主において
機能し得る発現制御配列、例えばプロモーターを含有す
る。
【００２１】細菌、例えば大腸菌のプロモーターとして
は、Ｔ３，Ｔ７等が使用でき、酵母のプロモーターとし
ては、例えば解糖系酵素の遺伝子のプロモーター、例え
ばＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ４プロモーター等が挙
げられる。動物細胞用のプロモーターとしてはウイルス
性プロモーター、例えばＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０
プロモーター等が挙げられる。発現ベクターによる宿主
の形質転換、宿主の培養、培養物からの本発明の蛋白質
又はポリペプチドの採取・精製は、常法に従って行うこ
とができる。例えば、培養物から蛋白質又はポリペプチ
ドの単離・精製は、蛋白質又はポリペプチドを単離・精
製するための常用手段、例えば硫酸アンモニウム沈澱
法、ゲル濾過法、逆相ＨＰＬＣ等を単独で、又は組合わ
せて用いることができる。
は、Ｔ３，Ｔ７等が使用でき、酵母のプロモーターとし
ては、例えば解糖系酵素の遺伝子のプロモーター、例え
ばＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ４プロモーター等が挙
げられる。動物細胞用のプロモーターとしてはウイルス
性プロモーター、例えばＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０
プロモーター等が挙げられる。発現ベクターによる宿主
の形質転換、宿主の培養、培養物からの本発明の蛋白質
又はポリペプチドの採取・精製は、常法に従って行うこ
とができる。例えば、培養物から蛋白質又はポリペプチ
ドの単離・精製は、蛋白質又はポリペプチドを単離・精
製するための常用手段、例えば硫酸アンモニウム沈澱
法、ゲル濾過法、逆相ＨＰＬＣ等を単独で、又は組合わ
せて用いることができる。
【００２２】本発明はさらに、ＴＧＦ−βシグナル伝達
系阻害物質のスクリーニング方法に関する。ＴＡＢ１の
生物学的活性を有する蛋白質とＴＡＫ１（K.Yamaguchi
ら、Sceince,vol.270,p2008(1995))を発現する細胞にＴ
ＧＦ−βシグナル伝達系阻害物質を含む試料を接触させ
るか又は導入し、次いでＴＡＫ１の活性を測定する。Ｔ
ＡＢ１の生物学的活性を有する蛋白質又はポリペプチド
およびＴＡＫ１は他の蛋白質との融合蛋白質でもよく、
これらを発現する細胞は酵母あるいは哺乳類細胞であ
る。このようなスクリーニング系は、実施例１，２，
３，４，７，８および９に記載する方法により構築する
ことができる。
系阻害物質のスクリーニング方法に関する。ＴＡＢ１の
生物学的活性を有する蛋白質とＴＡＫ１（K.Yamaguchi
ら、Sceince,vol.270,p2008(1995))を発現する細胞にＴ
ＧＦ−βシグナル伝達系阻害物質を含む試料を接触させ
るか又は導入し、次いでＴＡＫ１の活性を測定する。Ｔ
ＡＢ１の生物学的活性を有する蛋白質又はポリペプチド
およびＴＡＫ１は他の蛋白質との融合蛋白質でもよく、
これらを発現する細胞は酵母あるいは哺乳類細胞であ
る。このようなスクリーニング系は、実施例１，２，
３，４，７，８および９に記載する方法により構築する
ことができる。
【００２３】構築したスクリーニング系へＴＧＦ−βシ
グナル伝達系阻害物質を含む試料を接触させるか又は導
入し、ＴＡＫ１のキナーゼ活性を測定する。ＴＡＫ１の
キナーゼ活性の測定方法は、ＴＡＫ１自身のキナーゼ活
性を測定してもよいし、シグナル伝達系のＴＡＫ１の下
流に存在しＴＡＫ１により活性化されるＭＡＰＫＫやＭ
ＡＰＫのキナーゼ活性を測定してもよい。また、ＭＡＰ
Ｋ経路の標的遺伝子や標的遺伝子プロモーターの制御下
にあるレポーター遺伝子の活性、ｍＲＮＡ量又は遺伝子
の表現型により測定することができる。本発明のＴＧＦ
−βシグナル伝達系阻害物質のスクリーニング方法によ
れば、ＴＧＦ−βの異常産生が関与する疾患の治療剤と
なり得る、ＴＡＢ１とＴＡＫ１の結合を阻害する物質を
スクリーニングすることができる。
グナル伝達系阻害物質を含む試料を接触させるか又は導
入し、ＴＡＫ１のキナーゼ活性を測定する。ＴＡＫ１の
キナーゼ活性の測定方法は、ＴＡＫ１自身のキナーゼ活
性を測定してもよいし、シグナル伝達系のＴＡＫ１の下
流に存在しＴＡＫ１により活性化されるＭＡＰＫＫやＭ
ＡＰＫのキナーゼ活性を測定してもよい。また、ＭＡＰ
Ｋ経路の標的遺伝子や標的遺伝子プロモーターの制御下
にあるレポーター遺伝子の活性、ｍＲＮＡ量又は遺伝子
の表現型により測定することができる。本発明のＴＧＦ
−βシグナル伝達系阻害物質のスクリーニング方法によ
れば、ＴＧＦ−βの異常産生が関与する疾患の治療剤と
なり得る、ＴＡＢ１とＴＡＫ１の結合を阻害する物質を
スクリーニングすることができる。
【００２４】
【実施例】次に、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。実施例１． ＴＧＦ−βシグナル伝達において機能するＴ
ＡＫ１−依存性経路を解析するため、酵母２−ハイブリ
ッド系（S.Freldsら、Trend Genet. 10,286 (1994)) を
用いて、ＴＡＫ１と直接相互作用する蛋白質を探索し
た。
説明する。実施例１． ＴＧＦ−βシグナル伝達において機能するＴ
ＡＫ１−依存性経路を解析するため、酵母２−ハイブリ
ッド系（S.Freldsら、Trend Genet. 10,286 (1994)) を
用いて、ＴＡＫ１と直接相互作用する蛋白質を探索し
た。
【００２５】まず、ＴＡＫ１遺伝子とＬｅｘＡ ＤＮＡ
−結合ドメインをコードする遺伝子とを連結せしめるこ
とにより発現ベクターを作製した。ｐＬｅｘＡ−ＴＡＫ
１ΔＮは、ｐＢＴＭ１１６（A.B.Vojtekら、Cell, Vol.
74, p.205 (1993)) にフレームを合わせて挿入したＴＡ
Ｋ１ΔＮコード配列（K.Yamaguchi ら、Science, Vol.2
70, p.2008 (1995))を含有する。ヒト脳ｃＤＮＡライブ
ラリー中にコードされており、ＴＡＫ１ΔＮと相互作用
する蛋白質を同定するために酵母２−ハイブリッド系を
使用した。
−結合ドメインをコードする遺伝子とを連結せしめるこ
とにより発現ベクターを作製した。ｐＬｅｘＡ−ＴＡＫ
１ΔＮは、ｐＢＴＭ１１６（A.B.Vojtekら、Cell, Vol.
74, p.205 (1993)) にフレームを合わせて挿入したＴＡ
Ｋ１ΔＮコード配列（K.Yamaguchi ら、Science, Vol.2
70, p.2008 (1995))を含有する。ヒト脳ｃＤＮＡライブ
ラリー中にコードされており、ＴＡＫ１ΔＮと相互作用
する蛋白質を同定するために酵母２−ハイブリッド系を
使用した。
【００２６】酵母ＨＩＳ３コード領域の上流にＬｅｘＡ
蛋白質のための結合部位が配置されている一体化された
レポーター構成物を含有するサッカロミセス・セレビシ
エー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ）Ｌ４０株（ＬＹＳ２：：ＬｅｘＡ−ＨＩＳ３）に
おいて２つのハイブリッドを発現させた。２つのハイブ
リッド蛋白質が相互作用すれば、前記レポーター構成物
のトランスアクチベーションが起こり、そして酵母はヒ
スチジンの非存在下（ＳＣ−Ｈｉｓ）で増殖することが
できる。
蛋白質のための結合部位が配置されている一体化された
レポーター構成物を含有するサッカロミセス・セレビシ
エー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ）Ｌ４０株（ＬＹＳ２：：ＬｅｘＡ−ＨＩＳ３）に
おいて２つのハイブリッドを発現させた。２つのハイブ
リッド蛋白質が相互作用すれば、前記レポーター構成物
のトランスアクチベーションが起こり、そして酵母はヒ
スチジンの非存在下（ＳＣ−Ｈｉｓ）で増殖することが
できる。
【００２７】ＬｅｘＡ−ＴＡＫ１ΔＮ融合体は単独で、
外部からのヒスチジンを必要としないで増殖を可能にす
るのに十分な量のＨＩＳ３の発現をもたらす。しかしな
がら、ＨＩＳ３遺伝子の産物であるイミダゾール・グリ
セロール・デヒドロケナーゼの化学阻害剤である４０mM
３−アミノトリオゾール（３−ＡＴ）の存在下で細胞
を増殖せしめることによりヒスチジン栄養要求性を達成
することができる（G.M.Kishore ら、Annu. Rev. Bioch
em. Vol.57, p.627 (1988)) 。
外部からのヒスチジンを必要としないで増殖を可能にす
るのに十分な量のＨＩＳ３の発現をもたらす。しかしな
がら、ＨＩＳ３遺伝子の産物であるイミダゾール・グリ
セロール・デヒドロケナーゼの化学阻害剤である４０mM
３−アミノトリオゾール（３−ＡＴ）の存在下で細胞
を増殖せしめることによりヒスチジン栄養要求性を達成
することができる（G.M.Kishore ら、Annu. Rev. Bioch
em. Vol.57, p.627 (1988)) 。
【００２８】この誘引（ｂａｉｔ）プラスミドを、ＧＡ
Ｌ４活性化ドメイン（ＧＡＤ）をコードする遺伝子と連
結させたヒト脳ｃＤＮＡ発現ライブラリークローンを含
有する捕獲プラスミドと共に酵母を形質転換した。約１
×１０6 個の形質転換体から、蛋白質をコードする陽性
クローンＴＡＢ１ｃＤＮＡを得た。以後において、この
ＤＮＡ単離物により発現されるＧＡＤ融合蛋白質をＧＡ
Ｄ−ＴＡＢ１と称する。
Ｌ４活性化ドメイン（ＧＡＤ）をコードする遺伝子と連
結させたヒト脳ｃＤＮＡ発現ライブラリークローンを含
有する捕獲プラスミドと共に酵母を形質転換した。約１
×１０6 個の形質転換体から、蛋白質をコードする陽性
クローンＴＡＢ１ｃＤＮＡを得た。以後において、この
ＤＮＡ単離物により発現されるＧＡＤ融合蛋白質をＧＡ
Ｄ−ＴＡＢ１と称する。
【００２９】実施例２．ＴＡＢ１との相互作用を司るＴ
ＡＫ１中の位置を決定するため、一連のＬｅｘＡ−ＴＡ
Ｋ１欠失キメラ体を２−ハイブリッド測定により試験し
た。ＬｅｘＡＤＮＡ−結合ドメインに融合した全長ＴＡ
Ｋ１又はその欠失構成物をコードする発現ベクターを、
ｐＧＡＤ−ＴＡＢ１と共に、酵母レポーター株Ｌ４０に
同時形質転換した。なお、ＴＡＫ１の各欠失構成物をコ
ードするＤＮＡは全長ＴＡＫ１をコードするＤＮＡから
作製した。
ＡＫ１中の位置を決定するため、一連のＬｅｘＡ−ＴＡ
Ｋ１欠失キメラ体を２−ハイブリッド測定により試験し
た。ＬｅｘＡＤＮＡ−結合ドメインに融合した全長ＴＡ
Ｋ１又はその欠失構成物をコードする発現ベクターを、
ｐＧＡＤ−ＴＡＢ１と共に、酵母レポーター株Ｌ４０に
同時形質転換した。なお、ＴＡＫ１の各欠失構成物をコ
ードするＤＮＡは全長ＴＡＫ１をコードするＤＮＡから
作製した。
【００３０】また、前記プラスミドｐＧＡＤ−ＴＡＢ１
は、ＴＡＢ１ｃＤＮＡをｐＢＳ（W.O.Bullock ら、Biot
echniques Vol.5,p.376(1987))のＥcoＲＩ部位にサブク
ローニングすることにより得たものである。このプラス
ミドにより発現される融合蛋白質間の相互作用が、４０
mM ３−ＡＴを含有するＳＣ−Ｈｉｓ培地のプレート上
で増殖する酵母株の能力により示される。この結果を図
１に示す。この図中右側に、ＴＡＫ１又はその欠失体
と、ＴＡＢ１とが相互作用した（＋）か、又はしなかっ
た（−）かを示す。この結果から、ＴＡＢ１はＴＡＫ１
のＮ−末端側ドメインと相互作用することが示された。
は、ＴＡＢ１ｃＤＮＡをｐＢＳ（W.O.Bullock ら、Biot
echniques Vol.5,p.376(1987))のＥcoＲＩ部位にサブク
ローニングすることにより得たものである。このプラス
ミドにより発現される融合蛋白質間の相互作用が、４０
mM ３−ＡＴを含有するＳＣ−Ｈｉｓ培地のプレート上
で増殖する酵母株の能力により示される。この結果を図
１に示す。この図中右側に、ＴＡＫ１又はその欠失体
と、ＴＡＢ１とが相互作用した（＋）か、又はしなかっ
た（−）かを示す。この結果から、ＴＡＢ１はＴＡＫ１
のＮ−末端側ドメインと相互作用することが示された。
【００３１】実施例３．ＴＡＫ１と相互作用する蛋白質
は上流の制御部及び下流の標的の両方を含む可能性があ
る。ＴＡＢ１がＴＡＫ１の活性化に役割を演ずるのであ
れば、それらの同時発現が酵母におけるＴＡＫ１の活性
に影響を与えると予想される。本発明者らは、酵母フェ
ロモン−誘導ＭＡＰＫ経路において哺乳類ＭＡＰＫＫＫ
活性を測定するための系を開発している（K.Yamaguchi
ら、Science, Vol.270, p.2008 (1995) ; K.Irieら、 S
cience, Vol.265 , p.1716 (1994))。ＴＡＫ１の活性化
された形態（ＴＡＫ１ΔＮ）はＳｔｅ１１ ＭＡＰＫＫ
Ｋ活性を代替することができる。
は上流の制御部及び下流の標的の両方を含む可能性があ
る。ＴＡＢ１がＴＡＫ１の活性化に役割を演ずるのであ
れば、それらの同時発現が酵母におけるＴＡＫ１の活性
に影響を与えると予想される。本発明者らは、酵母フェ
ロモン−誘導ＭＡＰＫ経路において哺乳類ＭＡＰＫＫＫ
活性を測定するための系を開発している（K.Yamaguchi
ら、Science, Vol.270, p.2008 (1995) ; K.Irieら、 S
cience, Vol.265 , p.1716 (1994))。ＴＡＫ１の活性化
された形態（ＴＡＫ１ΔＮ）はＳｔｅ１１ ＭＡＰＫＫ
Ｋ活性を代替することができる。
【００３２】すなわち、フェロモン−活性化ＭＡＰＫ径
路はＳｔｅ１１，Ｓｔｅ７、及びＦｕｓ３又はＫｓｓ１
キナーゼから成り、これらはそれぞれＭＡＰＫＫＫ，Ｍ
ＡＰＫＫ及びＭＡＰＫに対応する。これらの酵母プロテ
インキナーゼは次々に作用してシグナルを転写因子Ｓｔ
ｅ１２に伝達し、このＳｔｅ１２はＦＵＳ１のごとき接
合特異的（ｍａｔｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃ）遺伝子の
転写を活性化する（I.Herskowitz, Cell, Vol.80, p.18
7 (1995) ; D.E.Levinら、Curr. Opin. Cell Biol., Vo
l.7, p.197 (1995) ; J.Schultz ら、Jr. Curr. Opin.
Gene Dev., No.5, p.31 (1995)) 。
路はＳｔｅ１１，Ｓｔｅ７、及びＦｕｓ３又はＫｓｓ１
キナーゼから成り、これらはそれぞれＭＡＰＫＫＫ，Ｍ
ＡＰＫＫ及びＭＡＰＫに対応する。これらの酵母プロテ
インキナーゼは次々に作用してシグナルを転写因子Ｓｔ
ｅ１２に伝達し、このＳｔｅ１２はＦＵＳ１のごとき接
合特異的（ｍａｔｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃ）遺伝子の
転写を活性化する（I.Herskowitz, Cell, Vol.80, p.18
7 (1995) ; D.E.Levinら、Curr. Opin. Cell Biol., Vo
l.7, p.197 (1995) ; J.Schultz ら、Jr. Curr. Opin.
Gene Dev., No.5, p.31 (1995)) 。
【００３３】ＦＵＳ１ｐ：：ＨＩＳ３レポーター遺伝子
は、ＨＩＳ３オープンリーディングフレームに連結され
たＦＵＳ１上流活性化配列を含んで成り、そしてｈｉｓ
３ΔＦＵＳ１ｐ：：ＨＩＳ３株におけるシグナル活性
を、ＳＣ−Ｈｉｓ培地上で増殖する細胞の能力（Ｈｉｓ
表現型）によりモニターすることを可能にする。ｈｉｓ
３Δｓｔｅ１１ΔＦＵＳ１ｐ：：ＨＩＳ３ＳＴＥ７P368
（セリン−３６８におけるプロリン置換）株はＨｉｓ-
表現型を有する（K.Irieら、Science, Vol.265, p.1716
(1994))。
は、ＨＩＳ３オープンリーディングフレームに連結され
たＦＵＳ１上流活性化配列を含んで成り、そしてｈｉｓ
３ΔＦＵＳ１ｐ：：ＨＩＳ３株におけるシグナル活性
を、ＳＣ−Ｈｉｓ培地上で増殖する細胞の能力（Ｈｉｓ
表現型）によりモニターすることを可能にする。ｈｉｓ
３Δｓｔｅ１１ΔＦＵＳ１ｐ：：ＨＩＳ３ＳＴＥ７P368
（セリン−３６８におけるプロリン置換）株はＨｉｓ-
表現型を有する（K.Irieら、Science, Vol.265, p.1716
(1994))。
【００３４】この株におけるＴＡＫ１ΔＮの発現がＨｉ
ｓ+ 表現型をもたらす（K.Yamaguchi ら、Science, Vo
l.270, p.2008 (1995))。従って、ＴＡＫ１の活性化型
はＳｔｅ７P368−依存的にＳｔｅ１１活性を代替するこ
とができる。しかしながら全長ＴＡＫ１の発現はｓｔｅ
１１Δ変異を回復せず、酵母はＴＡＫ１のための仮定の
活性化因子を有しないことが示唆される（K.Yamaguchi
ら、Science, Vol.270,p.2008 (1995))。
ｓ+ 表現型をもたらす（K.Yamaguchi ら、Science, Vo
l.270, p.2008 (1995))。従って、ＴＡＫ１の活性化型
はＳｔｅ７P368−依存的にＳｔｅ１１活性を代替するこ
とができる。しかしながら全長ＴＡＫ１の発現はｓｔｅ
１１Δ変異を回復せず、酵母はＴＡＫ１のための仮定の
活性化因子を有しないことが示唆される（K.Yamaguchi
ら、Science, Vol.270,p.2008 (1995))。
【００３５】酵母ＭＡＰＫ経路を用いて、ＧＡＤ−ＴＡ
Ｂ１構成物を、ＴＡＫ１の存在下でｓｔｅ１１Δ変異を
補完するそれらの能力について試験した。すなわち、酵
母ＳＹ１９８４−Ｐ株（ｈｉｓ３Δｓｔｅ１１ΔＦＵＳ
１ｐ：：ＨＩＳ３ＳＴＥ７P368）を、ｐＮＶ１１−ＨＵ
１１（ＴＡＫ１ΔＮ）＋ｐＧＡＤ１０（ＧＡＤ）（Ｃｌ
ｏｎｔｅｃｈ）；ｐＮＶ１１−ＨＵ１１Ｆ（ＴＡＫ１）
＋ｐＧＡＤ１０；ｐＮＶ１１−ＨＵ１１Ｆ＋ｐＧＡＤ−
ＴＡＢ１；又はｐＮＶ１１＋ｐＧＡＤ−ＴＡＢ１により
形質転換し、そして形質転換体をＳＣ−Ｈｉｓプレート
上にまき、そして３０℃にてインキュベートした。
Ｂ１構成物を、ＴＡＫ１の存在下でｓｔｅ１１Δ変異を
補完するそれらの能力について試験した。すなわち、酵
母ＳＹ１９８４−Ｐ株（ｈｉｓ３Δｓｔｅ１１ΔＦＵＳ
１ｐ：：ＨＩＳ３ＳＴＥ７P368）を、ｐＮＶ１１−ＨＵ
１１（ＴＡＫ１ΔＮ）＋ｐＧＡＤ１０（ＧＡＤ）（Ｃｌ
ｏｎｔｅｃｈ）；ｐＮＶ１１−ＨＵ１１Ｆ（ＴＡＫ１）
＋ｐＧＡＤ１０；ｐＮＶ１１−ＨＵ１１Ｆ＋ｐＧＡＤ−
ＴＡＢ１；又はｐＮＶ１１＋ｐＧＡＤ−ＴＡＢ１により
形質転換し、そして形質転換体をＳＣ−Ｈｉｓプレート
上にまき、そして３０℃にてインキュベートした。
【００３６】なお、上記ＳＹ１９８４−Ｐ株は、ＳＹ１
９８４株（ｈｉｓ３Δｓｔｅ１１ΔＦＵＳ１ｐ；；ＨＩ
Ｓ３）を、ＣＹＣ１プロモーターの制御のもとにＳＴＥ
７P368を含有するプラスミドｐＮＣ３１８−ｐ３６８に
より形質転換したものである（K.Irieら、Science, Vo
l.265, p.1716 (1994))。また、上記プラスミドｐＮＶ
１１−ＨＵ１１及びｐＮＶ１１−ＨＵ１１Ｆはそれぞ
れ、ＴＤＨ３プロモーターの制御のもとに短縮されたＴ
ＡＫ１ΔＮ（アミノ酸２１−５７９）及び全長のＴＡＫ
１を発現する（K.Yamaguchi ら、Science, Vol.270, p.
2008 (1995))。
９８４株（ｈｉｓ３Δｓｔｅ１１ΔＦＵＳ１ｐ；；ＨＩ
Ｓ３）を、ＣＹＣ１プロモーターの制御のもとにＳＴＥ
７P368を含有するプラスミドｐＮＣ３１８−ｐ３６８に
より形質転換したものである（K.Irieら、Science, Vo
l.265, p.1716 (1994))。また、上記プラスミドｐＮＶ
１１−ＨＵ１１及びｐＮＶ１１−ＨＵ１１Ｆはそれぞ
れ、ＴＤＨ３プロモーターの制御のもとに短縮されたＴ
ＡＫ１ΔＮ（アミノ酸２１−５７９）及び全長のＴＡＫ
１を発現する（K.Yamaguchi ら、Science, Vol.270, p.
2008 (1995))。
【００３７】結果を図２に示す。左側のパネルは試験し
た酵母株がＴＡＫ１ΔＮ又はＴＡＫ１を発現したか否
か、及びＧＡＤ−ＴＡＢ１が同時発現されたか否かを示
す。右側のパネルはＳＣ−Ｈｉｓプレート上での細胞の
増殖を示す。各パッチは独立した形質転換体についての
結果を示す。ＧＡＤ−ＴＡＢ１とＴＡＫ１の同時形質転
換はＳｔｅ１１欠損を回復した。この結果は、ＴＡＢ１
がＴＡＫ１の機能を増強することを示している。
た酵母株がＴＡＫ１ΔＮ又はＴＡＫ１を発現したか否
か、及びＧＡＤ−ＴＡＢ１が同時発現されたか否かを示
す。右側のパネルはＳＣ−Ｈｉｓプレート上での細胞の
増殖を示す。各パッチは独立した形質転換体についての
結果を示す。ＧＡＤ−ＴＡＢ１とＴＡＫ１の同時形質転
換はＳｔｅ１１欠損を回復した。この結果は、ＴＡＢ１
がＴＡＫ１の機能を増強することを示している。
【００３８】実施例４．ＴＡＢ１を発現する酵母におい
てＴＡＫ１活性が増加するか否かを決定するため、ヘマ
グルチニン（ＨＡ）−由来Ｃ−末端エピトープを担持す
るＴＡＫ１及び触媒的に不活性なＴＡＫ１変異体〔ＡＴ
Ｐ−結合部位の６３位のリジンがトリプトファンにより
置換されたＴＡＫ１−Ｋ６３Ｗ（K.Yamaguchi ら、Scie
nce, Vol.270, p.2008 (1995) 〕の発現ＤＮＡベクター
を、ＴＡＢ１遺伝子の非存在下又は存在下に酵母細胞に
形質転換した。
てＴＡＫ１活性が増加するか否かを決定するため、ヘマ
グルチニン（ＨＡ）−由来Ｃ−末端エピトープを担持す
るＴＡＫ１及び触媒的に不活性なＴＡＫ１変異体〔ＡＴ
Ｐ−結合部位の６３位のリジンがトリプトファンにより
置換されたＴＡＫ１−Ｋ６３Ｗ（K.Yamaguchi ら、Scie
nce, Vol.270, p.2008 (1995) 〕の発現ＤＮＡベクター
を、ＴＡＢ１遺伝子の非存在下又は存在下に酵母細胞に
形質転換した。
【００３９】ＨＡに対するモノクローナル抗体１２ＣＡ
５により認識されるエピトープをコードするＤＮＡ配列
をＴＡＫ１コード配列及びＴＡＫ１−Ｋ６３ＷのＣ−末
端にフレームを合わせて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）により連結した。すべての構成物はＴＤＨプロモー
ターから発現される。ＴＡＢ１発現プラスミドｐＧＡＰ
−ＨＴＨ９ＭはＴＡＢ１のＣ−末端の６８アミノ酸を発
現する。ＹＥｐＧＡＰ１１２はＴＤＨ３プロモーターを
含有する多コピーＴＲＰ１プラスミドである〔H.Banno
ら、Mol. Cell Biol. 13, 475 (1993)〕。
５により認識されるエピトープをコードするＤＮＡ配列
をＴＡＫ１コード配列及びＴＡＫ１−Ｋ６３ＷのＣ−末
端にフレームを合わせて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）により連結した。すべての構成物はＴＤＨプロモー
ターから発現される。ＴＡＢ１発現プラスミドｐＧＡＰ
−ＨＴＨ９ＭはＴＡＢ１のＣ−末端の６８アミノ酸を発
現する。ＹＥｐＧＡＰ１１２はＴＤＨ３プロモーターを
含有する多コピーＴＲＰ１プラスミドである〔H.Banno
ら、Mol. Cell Biol. 13, 475 (1993)〕。
【００４０】ＴＡＢ１のＣ−末端の６８アミノ酸のコー
ド配列を、ＥCOＲＩ部位及びＡＴＣコドンを含有する
５′−プライマー５′−ＧＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＣＧＧ
ＣＡＡＡＧＣ−３′（配列番号：２）、並びにＳａｌＩ
部位を含有する３′−プライマー−５′−ＧＧＧＴＣＧ
ＡＣＴＡＣＧＧＴＧＣ−３′（配列番号：３）を用いる
ＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲにより生じた２４０bpの
ＥCOＲＩ−ＳａｌＩ断片をＹＥｐＧＡＰ１１２のＥCOＲ
Ｉ−ＳａｌＩギャップに挿入することによりｐＧＡＤ−
ＨＴＨ９Ｍを生じさせた。
ド配列を、ＥCOＲＩ部位及びＡＴＣコドンを含有する
５′−プライマー５′−ＧＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＣＧＧ
ＣＡＡＡＧＣ−３′（配列番号：２）、並びにＳａｌＩ
部位を含有する３′−プライマー−５′−ＧＧＧＴＣＧ
ＡＣＴＡＣＧＧＴＧＣ−３′（配列番号：３）を用いる
ＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲにより生じた２４０bpの
ＥCOＲＩ−ＳａｌＩ断片をＹＥｐＧＡＰ１１２のＥCOＲ
Ｉ−ＳａｌＩギャップに挿入することによりｐＧＡＤ−
ＨＴＨ９Ｍを生じさせた。
【００４１】結果を図３に示す。前記のように酵母ＳＹ
１９８４株を前記のＴＡＫ１−ＨＡをコードするプラス
ミド又はＴＡＫ１−Ｋ６３Ｗをコードするプラスミドに
より形質転換し、さらにこの形質転換体に空ベクターＹ
ＥｐＧＡＰ１１２（−）、又はＴＡＢ１をコードするｐ
ＧＡＰ−ＨＴＨ９Ｍ（＋）を導入した。ＴＡＫ１−ＨＡ
（−）又はＴＡＫ１−Ｋ６３Ｗ−ＨＡ（ＫＮ）を各細胞
抽出物から免疫沈降せしめ、そして免疫沈降物をインビ
トロキナーゼ測定にかけた。具体的には、６０mlの酵母
細胞培養物を６００nmでの光学密度０．８まで増殖せし
め、細胞溶解緩衝液（K.Irieら、Science, Vol.265, p.
1716 (1994))により細胞抽出液を調製し、そして１０
０，０００ｇにて３０分間遠心分離した。
１９８４株を前記のＴＡＫ１−ＨＡをコードするプラス
ミド又はＴＡＫ１−Ｋ６３Ｗをコードするプラスミドに
より形質転換し、さらにこの形質転換体に空ベクターＹ
ＥｐＧＡＰ１１２（−）、又はＴＡＢ１をコードするｐ
ＧＡＰ−ＨＴＨ９Ｍ（＋）を導入した。ＴＡＫ１−ＨＡ
（−）又はＴＡＫ１−Ｋ６３Ｗ−ＨＡ（ＫＮ）を各細胞
抽出物から免疫沈降せしめ、そして免疫沈降物をインビ
トロキナーゼ測定にかけた。具体的には、６０mlの酵母
細胞培養物を６００nmでの光学密度０．８まで増殖せし
め、細胞溶解緩衝液（K.Irieら、Science, Vol.265, p.
1716 (1994))により細胞抽出液を調製し、そして１０
０，０００ｇにて３０分間遠心分離した。
【００４２】上清を、ＨＡに対する抗体との免疫沈降に
かけた。すなわち、上清の１部分（３００μｌ）を２μ
ｌの抗体及び９０μｌのプロテインＡ−セファロースと
混合し、そして免疫複合体を細胞溶解緩衝液で３回洗浄
し、そしてキナーゼ測定（K.Yamaguchi ら、Science, V
ol.270, p.2008 (1995))に用した。ＨＡに対するモノク
ローナル抗体１２ＣＡ５による各免疫沈降物のイムノブ
ロットの結果は、各サンプルにおいて、およそ同じ量の
ＴＡＫ１−ＨＡ又はＴＡＫ１−Ｋ６３Ｗ−ＨＡが回収さ
れることを示した。これにより、ＴＡＢ１の発現がＴＡ
Ｋ１の発現量に影響しないことが示された。
かけた。すなわち、上清の１部分（３００μｌ）を２μ
ｌの抗体及び９０μｌのプロテインＡ−セファロースと
混合し、そして免疫複合体を細胞溶解緩衝液で３回洗浄
し、そしてキナーゼ測定（K.Yamaguchi ら、Science, V
ol.270, p.2008 (1995))に用した。ＨＡに対するモノク
ローナル抗体１２ＣＡ５による各免疫沈降物のイムノブ
ロットの結果は、各サンプルにおいて、およそ同じ量の
ＴＡＫ１−ＨＡ又はＴＡＫ１−Ｋ６３Ｗ−ＨＡが回収さ
れることを示した。これにより、ＴＡＢ１の発現がＴＡ
Ｋ１の発現量に影響しないことが示された。
【００４３】免疫沈降したＴＡＫ１は組換えＸＭＥＫ２
（ＳＥＫ１）を活性化する能力により測定し、該組換え
ＸＭＥＫ２（ＳＥＫ１）の活性は触媒的に不活性な（Ｋ
Ｎ）ｐ３８（ＭＰＫ２）をリン酸化するその能力により
測定した（K.Yamaguchi ら、Science, No.270, p.2008
(1995)) 。電気泳動の後、ＫＨ−ｐ３８（ＭＰＫ２）の
リン酸化をオートラジオグラフィーにより検出した。酵
素抽出物なしでは、キナーゼ測定値を示す抽出物はなか
った。このレベルはＸＭＥＫ２のベース活性に相当す
る。実験は少なくとも３回行い、同様の結果を得た。
（ＳＥＫ１）を活性化する能力により測定し、該組換え
ＸＭＥＫ２（ＳＥＫ１）の活性は触媒的に不活性な（Ｋ
Ｎ）ｐ３８（ＭＰＫ２）をリン酸化するその能力により
測定した（K.Yamaguchi ら、Science, No.270, p.2008
(1995)) 。電気泳動の後、ＫＨ−ｐ３８（ＭＰＫ２）の
リン酸化をオートラジオグラフィーにより検出した。酵
素抽出物なしでは、キナーゼ測定値を示す抽出物はなか
った。このレベルはＸＭＥＫ２のベース活性に相当す
る。実験は少なくとも３回行い、同様の結果を得た。
【００４４】結果を図３に示す。ＴＡＫ１−ＨＡ及びＴ
ＡＫ１−Ｋ３６Ｗ−ＴＡＫ１のキナーゼ測定の結果は、
ＴＡＢ１がＴＡＫ１のキナーゼ活性を増加させたことを
示した。この活性増加は、ＴＡＫ１−Ｋ６３ＷＫＮ及び
ＴＡＢ１を発現する細胞からの免疫複合体においては観
察されず、観察されたキナーゼ活性はＴＡＫ１に由来す
ることが示された。これらの結果が示すところによれ
ば、ＴＡＢ１はＴＡＫ１の触媒ドメインに直接結合する
ことによりＴＡＫ１のキナーゼ活性を活性化する。
ＡＫ１−Ｋ３６Ｗ−ＴＡＫ１のキナーゼ測定の結果は、
ＴＡＢ１がＴＡＫ１のキナーゼ活性を増加させたことを
示した。この活性増加は、ＴＡＫ１−Ｋ６３ＷＫＮ及び
ＴＡＢ１を発現する細胞からの免疫複合体においては観
察されず、観察されたキナーゼ活性はＴＡＫ１に由来す
ることが示された。これらの結果が示すところによれ
ば、ＴＡＢ１はＴＡＫ１の触媒ドメインに直接結合する
ことによりＴＡＫ１のキナーゼ活性を活性化する。
【００４５】実施例５．ＴＡＢ１の全長コード配列を得
るため、ヒト腎細胞ライブラリーを、前記の酵母２−ハ
イブリッド系から得られたＴＡＢ１のｃＤＮＡの部分配
列をプローブとして用いてスクリーニングした。２個の
独立のクローンが、Kozak のコンセスサスに一致する開
始メチオニンコドンから始まる１個のオープンリーディ
ングフレーム（ＯＲＦ）を含有する３．１kbのｃＤＮＡ
をもたらした。５′−ＲＡＣＥ−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ
（Ｃｌｏｎｆｅｃｈ）を用いる５′ＲＡＣＥ法により
５′−末端を決定した。
るため、ヒト腎細胞ライブラリーを、前記の酵母２−ハ
イブリッド系から得られたＴＡＢ１のｃＤＮＡの部分配
列をプローブとして用いてスクリーニングした。２個の
独立のクローンが、Kozak のコンセスサスに一致する開
始メチオニンコドンから始まる１個のオープンリーディ
ングフレーム（ＯＲＦ）を含有する３．１kbのｃＤＮＡ
をもたらした。５′−ＲＡＣＥ−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ
（Ｃｌｏｎｆｅｃｈ）を用いる５′ＲＡＣＥ法により
５′−末端を決定した。
【００４６】コード配列の仮定のＮ−末端におけるヌク
レオチド配列（ＣＣＡＡＡＴＧＧ）はKozak コンセンサ
ス（M.Kozak, J. Cell Biol. Vol.108, p.229 (1989))
に対応し、そしてその前にＡＴＧコドンは存在しない。
ＴＡＢ１のヌクレオチド配列をジデオキシヌクレオチド
・チェイン・ターミネーション法により決定した。全長
ＴＡＢ１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列からアミノ酸配列
を推定した。その結果、１８５番目の塩基がシトシンで
あるクローンとアデニンであるクローンの二種が得られ
た。１８５番目がシトシンのクローンにおいては５２番
目のアミノ酸がセリンを、１８５番目がアデニンのクロ
ーンにおいては５２番目のアミノ酸がアルギニンをコー
ドしていた。
レオチド配列（ＣＣＡＡＡＴＧＧ）はKozak コンセンサ
ス（M.Kozak, J. Cell Biol. Vol.108, p.229 (1989))
に対応し、そしてその前にＡＴＧコドンは存在しない。
ＴＡＢ１のヌクレオチド配列をジデオキシヌクレオチド
・チェイン・ターミネーション法により決定した。全長
ＴＡＢ１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列からアミノ酸配列
を推定した。その結果、１８５番目の塩基がシトシンで
あるクローンとアデニンであるクローンの二種が得られ
た。１８５番目がシトシンのクローンにおいては５２番
目のアミノ酸がセリンを、１８５番目がアデニンのクロ
ーンにおいては５２番目のアミノ酸がアルギニンをコー
ドしていた。
【００４７】１８５番目のヌクレオチドがシトシンであ
るクローンのヌクレオチド配列を配列番号１に示し、そ
してアミノ酸配列を図４および配列番号１に示す。ま
た、１８５番目のヌクレオチドがアデニンであるクロー
ンのヌクレオチド配列を配列番号４に示し、そしてアミ
ノ酸配列を配列番号４に示す。なお、１８５番目のヌク
レオチドがシトシンのクローンのｃＤＮＡは、ｐＢＳの
ＥｃｏＲＩおよびＳｍａＩ部位にサブクローニングされ
プラスミドＴＡＢＩ−ｆ−４として作製され、１８５番
目のヌクレオチドがアデニンのクローンのｃＤＮＡは、
ｐＢＳのＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングされプラス
ミドｐＢＳ−ＴＡＢ１として作製された。
るクローンのヌクレオチド配列を配列番号１に示し、そ
してアミノ酸配列を図４および配列番号１に示す。ま
た、１８５番目のヌクレオチドがアデニンであるクロー
ンのヌクレオチド配列を配列番号４に示し、そしてアミ
ノ酸配列を配列番号４に示す。なお、１８５番目のヌク
レオチドがシトシンのクローンのｃＤＮＡは、ｐＢＳの
ＥｃｏＲＩおよびＳｍａＩ部位にサブクローニングされ
プラスミドＴＡＢＩ−ｆ−４として作製され、１８５番
目のヌクレオチドがアデニンのクローンのｃＤＮＡは、
ｐＢＳのＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングされプラス
ミドｐＢＳ−ＴＡＢ１として作製された。
【００４８】プラスミドｐＢＳ−ＴＡＢ１を含有する大
腸菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＨＢ１０１
（ｐＢＳ−ＴＡＢ１）と命名され、工業技術院生命工学
工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−５５０８として１９
９６年４月１９日に寄託された。また、プラスミドＴＡ
ＢＩ−ｆ−４を含有する大腸菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α（ＴＡＢＩ−ｆ−４）と命名
され、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ
ＢＰ−５５９９として１９９６年７月１９日に寄託され
た。以下に示す実験については、配列番号：１に示すヌ
クレオチド配列を有するクローンを用いて行った。
腸菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＨＢ１０１
（ｐＢＳ−ＴＡＢ１）と命名され、工業技術院生命工学
工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−５５０８として１９
９６年４月１９日に寄託された。また、プラスミドＴＡ
ＢＩ−ｆ−４を含有する大腸菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α（ＴＡＢＩ−ｆ−４）と命名
され、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ
ＢＰ−５５９９として１９９６年７月１９日に寄託され
た。以下に示す実験については、配列番号：１に示すヌ
クレオチド配列を有するクローンを用いて行った。
【００４９】図４において、ＡはＡｌａを、ＣはＣｙｓ
を、ｂはＡｓｐを、ＥはＧｌｕを、ＦはＰｈｅを、Ｇは
Ｇｌｙを、ＨはＨｉｓを、ＩはＩｌｅを、ＫはＬｙｓ
を、ＬはＬｅｕを、ＭはＭｅｔを、ＮはＡｓｎを、Ｐは
Ｐｒｏを、ＱはＧｌｎを、ＲはＡｒｇを、ＳはＳｅｒ
を、ＴはＴｈｒを、ＶはＶａｌを、ＷはＴｒｐを、そし
てＹはＴｙｒをそれぞれ示す。酵母２−ハイブリッド系
を用いて単離されたＧＡＤ−ＴＡＢ１中のＣ−末端の６
８アミノ酸を箱で囲んである。
を、ｂはＡｓｐを、ＥはＧｌｕを、ＦはＰｈｅを、Ｇは
Ｇｌｙを、ＨはＨｉｓを、ＩはＩｌｅを、ＫはＬｙｓ
を、ＬはＬｅｕを、ＭはＭｅｔを、ＮはＡｓｎを、Ｐは
Ｐｒｏを、ＱはＧｌｎを、ＲはＡｒｇを、ＳはＳｅｒ
を、ＴはＴｈｒを、ＶはＶａｌを、ＷはＴｒｐを、そし
てＹはＴｙｒをそれぞれ示す。酵母２−ハイブリッド系
を用いて単離されたＧＡＤ−ＴＡＢ１中のＣ−末端の６
８アミノ酸を箱で囲んである。
【００５０】ＴＡＫ１のＮ−末端の配列は、ＴＡＫ１の
このセグメントへの類似下を示す領域を示すための配置
で示される。ＴＡＫ１のアミノ酸に対して同じアミノ酸
及び保存されているアミノ酸、それぞれ星印及び点で示
す。このＯＲＦから、いかなる既知蛋白質とも明瞭な類
似性を有さず、そして生化学的機能を示すなんらのモチ
ーフも含有しない５５kDa の分子サイズを有する５０４
アミノ酸の蛋白質が予想された。
このセグメントへの類似下を示す領域を示すための配置
で示される。ＴＡＫ１のアミノ酸に対して同じアミノ酸
及び保存されているアミノ酸、それぞれ星印及び点で示
す。このＯＲＦから、いかなる既知蛋白質とも明瞭な類
似性を有さず、そして生化学的機能を示すなんらのモチ
ーフも含有しない５５kDa の分子サイズを有する５０４
アミノ酸の蛋白質が予想された。
【００５１】実施例６．種々のヒト細胞におけるＴＡＢ
１ ｍＲＮＡの発現のパターンをノーザンブロット分析
により分析した。１６の組織から調製したｍＲＮＡによ
るヒト組織ブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を32Ｐ−標識
化ＴＡＢ１ｃＤＮＡによりプローブし、そしてオートラ
ジオグラフィーにかけた。この結果を図５に示す。各レ
ーンは２μｇのｍＲＮＡを含有した。プローブはMultip
rime labeling Kit (Amersham)を用いて〔α−32Ｐ〕−
ｄＣＴＰで標識し、そしてH.Shibuya ら、Nature, Vol.
357, p.700 (1992) に記載されているようにしてハイブ
リダイズさせた。試験したすべての組織から、約３．５
kbの主たる転写物が検出された。
１ ｍＲＮＡの発現のパターンをノーザンブロット分析
により分析した。１６の組織から調製したｍＲＮＡによ
るヒト組織ブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を32Ｐ−標識
化ＴＡＢ１ｃＤＮＡによりプローブし、そしてオートラ
ジオグラフィーにかけた。この結果を図５に示す。各レ
ーンは２μｇのｍＲＮＡを含有した。プローブはMultip
rime labeling Kit (Amersham)を用いて〔α−32Ｐ〕−
ｄＣＴＰで標識し、そしてH.Shibuya ら、Nature, Vol.
357, p.700 (1992) に記載されているようにしてハイブ
リダイズさせた。試験したすべての組織から、約３．５
kbの主たる転写物が検出された。
【００５２】実施例７．ＴＡＢ１とＴＡＫ１との会合が
哺乳類細胞中で起こることを確認するため、ＨＡエピト
ープで標識されたＴＡＫ１（ＨＡ−ＴＡＫ１）（K.Yama
guchi ら、Science, Vol.270, p.2008 (1995))を生産す
る発現ベクター及びＭｙｃエピトープで標識されたＴＡ
Ｂ１（Ｍｙｃ−ＴＡＢ１）を生産する発現プラスミドに
より、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１ネズミ骨芽細胞（S.Ohtaら、FE
BS Lett., Vol.314, p.356 (1992))を一過性（ｔｒａｎ
ｓｉｅｎｔ）にトランスフェクトした。後者のプラスミ
ドは次のようにして得た。
哺乳類細胞中で起こることを確認するため、ＨＡエピト
ープで標識されたＴＡＫ１（ＨＡ−ＴＡＫ１）（K.Yama
guchi ら、Science, Vol.270, p.2008 (1995))を生産す
る発現ベクター及びＭｙｃエピトープで標識されたＴＡ
Ｂ１（Ｍｙｃ−ＴＡＢ１）を生産する発現プラスミドに
より、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１ネズミ骨芽細胞（S.Ohtaら、FE
BS Lett., Vol.314, p.356 (1992))を一過性（ｔｒａｎ
ｓｉｅｎｔ）にトランスフェクトした。後者のプラスミ
ドは次のようにして得た。
【００５３】全長ＴＡＢ１ｃＤＮＡを、Ｍｙｃに対する
モノクローナル抗体９Ｅ１０により認識されるＭｙｃエ
ピトープ（ＬＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮ）（アミノ酸配列
の１文字表示）の６コピーを含有するｐＣＳ２ＭＴベク
ター（D.L.Tumer ら、GenesDev., Vol.8, p.1434 (199
4)) にサブクローニングした。得られるプラスミドｐＣ
Ｓ２ＭＴ・ＴＡＢ１においては、Ｍｙｃエピトープ標識
はＴＡＢ１のＮ−末端に対応するＤＮＡ配列にフレーム
を合わせて連結されている。ｐＣＳＡ２ＭＴ−ＴＡＢ１
をＢａｍＨＩ及びＸｂａＩにより消化した。断片を単離
し、そして哺乳類発現ベクターｐＥＦのＥCOＲＩ−Ｘｂ
ａＩ部位に挿入した。このプラスミドは、ヒト伸長因子
１α（ＥＦ１α）プロモーターからＴＡＢ１を発現させ
る。
モノクローナル抗体９Ｅ１０により認識されるＭｙｃエ
ピトープ（ＬＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮ）（アミノ酸配列
の１文字表示）の６コピーを含有するｐＣＳ２ＭＴベク
ター（D.L.Tumer ら、GenesDev., Vol.8, p.1434 (199
4)) にサブクローニングした。得られるプラスミドｐＣ
Ｓ２ＭＴ・ＴＡＢ１においては、Ｍｙｃエピトープ標識
はＴＡＢ１のＮ−末端に対応するＤＮＡ配列にフレーム
を合わせて連結されている。ｐＣＳＡ２ＭＴ−ＴＡＢ１
をＢａｍＨＩ及びＸｂａＩにより消化した。断片を単離
し、そして哺乳類発現ベクターｐＥＦのＥCOＲＩ−Ｘｂ
ａＩ部位に挿入した。このプラスミドは、ヒト伸長因子
１α（ＥＦ１α）プロモーターからＴＡＢ１を発現させ
る。
【００５４】細胞抽出物をＨＡに対するモノクローナル
抗体１２ＣＡ５（図６のレーン２）、Ｍｙｃに対するモ
ノクローナル抗体９Ｅ１０（図６のレーン３）、又は対
照非免疫ＩｇＧ（図６のレーン４）との免疫沈降にかけ
た。免疫複合体を洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離
し、ニトロセルロースに移行せしめ、そしてＭｙｃに対
する抗体（図６の上レーン）又はＨＡに対する抗体（図
６の下レーン）を用いてイムノブロットした。
抗体１２ＣＡ５（図６のレーン２）、Ｍｙｃに対するモ
ノクローナル抗体９Ｅ１０（図６のレーン３）、又は対
照非免疫ＩｇＧ（図６のレーン４）との免疫沈降にかけ
た。免疫複合体を洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離
し、ニトロセルロースに移行せしめ、そしてＭｙｃに対
する抗体（図６の上レーン）又はＨＡに対する抗体（図
６の下レーン）を用いてイムノブロットした。
【００５５】細胞抽出物はまた、イムノブロット分析に
直接かけた（図６のレーン１）。図６に示すごとく、各
免疫沈降においてかなりの量のＭｙｃ−ＴＡＢ１が検出
され、ＴＡＫ１がＴＡＢ１と共免疫沈降し得ることが示
された。免疫沈降した蛋白質をＨＡに対する抗体により
ブロットする相互実験により、ＴＡＢ１とＴＡＫ１との
会合が確認された。これらの実験は、ＴＡＢ１が、酵母
におけると同様に哺乳類細胞中でもＴＡＫ１と会合し得
ることを示すものである。
直接かけた（図６のレーン１）。図６に示すごとく、各
免疫沈降においてかなりの量のＭｙｃ−ＴＡＢ１が検出
され、ＴＡＫ１がＴＡＢ１と共免疫沈降し得ることが示
された。免疫沈降した蛋白質をＨＡに対する抗体により
ブロットする相互実験により、ＴＡＢ１とＴＡＫ１との
会合が確認された。これらの実験は、ＴＡＢ１が、酵母
におけると同様に哺乳類細胞中でもＴＡＫ１と会合し得
ることを示すものである。
【００５６】実施例８．ＴＡＢ１の過剰発現が哺乳類細
胞中でＴＡＫ１のキナーゼ活性を活性化し得るか否か検
討した。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞をＭｙｃ−ＴＡＢ１の存
在下（＋）又は非存在下（−）でＨＡ−ＴＡＫ１により
一過性にトランスフェクトした。細胞を２０ng／mlのＴ
ＧＦ−β１により１０分間処理し（＋）又は処理せず
（−）、次に実施例３に記載したようにしてＨＡ−ＴＡ
Ｋ１を免疫沈降せしめ、そしてキナーゼ活性について測
定した。すなわち、免疫沈降の一部分をＨＡに対する抗
体によりイムノブロットした。結果を図７に示す。
胞中でＴＡＫ１のキナーゼ活性を活性化し得るか否か検
討した。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞をＭｙｃ−ＴＡＢ１の存
在下（＋）又は非存在下（−）でＨＡ−ＴＡＫ１により
一過性にトランスフェクトした。細胞を２０ng／mlのＴ
ＧＦ−β１により１０分間処理し（＋）又は処理せず
（−）、次に実施例３に記載したようにしてＨＡ−ＴＡ
Ｋ１を免疫沈降せしめ、そしてキナーゼ活性について測
定した。すなわち、免疫沈降の一部分をＨＡに対する抗
体によりイムノブロットした。結果を図７に示す。
【００５７】活性は、刺激されていない細胞からのＨＡ
−ＴＡＫ１の量に対する増加倍数として示し、３回以上
の実験からの平均±ＳＥＭとして表わした（図７上段の
グラフ）。ＨＡ−ＴＡＫ１はＫＨ−ｐ３８（ＭＰＫ２）
を直接リン酸化しなかった（K.Yamaguchi ら、Science,
Vol.270, p.2008 (1995))。中段パネルは、ＫＮ−ｐ３
８（ＭＰＫ２）のリン酸化を表すオートラジオグラフで
ある。下段パネルは、ＨＡに対するモノクローナル抗体
１２ＣＡ５による各免疫沈降のイムノブロット分析を示
し、各サンプルにおいて、およそ同じ量のＴＡＫ１−Ｈ
Ａが回収されたことを示している。中段及び下段のパネ
ルに示すデーターは典型的な実験からのものである。
−ＴＡＫ１の量に対する増加倍数として示し、３回以上
の実験からの平均±ＳＥＭとして表わした（図７上段の
グラフ）。ＨＡ−ＴＡＫ１はＫＨ−ｐ３８（ＭＰＫ２）
を直接リン酸化しなかった（K.Yamaguchi ら、Science,
Vol.270, p.2008 (1995))。中段パネルは、ＫＮ−ｐ３
８（ＭＰＫ２）のリン酸化を表すオートラジオグラフで
ある。下段パネルは、ＨＡに対するモノクローナル抗体
１２ＣＡ５による各免疫沈降のイムノブロット分析を示
し、各サンプルにおいて、およそ同じ量のＴＡＫ１−Ｈ
Ａが回収されたことを示している。中段及び下段のパネ
ルに示すデーターは典型的な実験からのものである。
【００５８】ＴＡＫ１免疫沈降物のインビトロキナーゼ
測定が示すところによれば、ＴＧＦ−βの非存在下でさ
えＴＡＢ１によりトランスフェクトされた細胞において
ＴＡＫ１活性が刺激された。ＴＡＢ１の過剰発現による
ＴＡＫ１の活性化は、ＨＡ−ＴＡＫ１のみを発現するＴ
ＧＦ−βで刺激された細胞において観察される活性化に
匹敵した。
測定が示すところによれば、ＴＧＦ−βの非存在下でさ
えＴＡＢ１によりトランスフェクトされた細胞において
ＴＡＫ１活性が刺激された。ＴＡＢ１の過剰発現による
ＴＡＫ１の活性化は、ＨＡ−ＴＡＫ１のみを発現するＴ
ＧＦ−βで刺激された細胞において観察される活性化に
匹敵した。
【００５９】実施例９．ＴＧＦ−βは、プラスミノーゲ
ン活性化因子インヒビター−１（ＰＡＩ−１）をコード
するｍＲＮＡの量を急速に増加せしめる（M.R.Keeton
ら、J. Biol. Chem., Vol.266, p.23048 (1991))。ＴＡ
Ｋ１の活性化形（ＴＡＫ１ΔＮ）の過剰発現により、Ｔ
ＧＦ−β−誘導性ｐＡＩ−１遺伝子プロモーターの制御
下にあるルシフェラーゼ遺伝子を含有するレポーター遺
伝子は構成的に活性化される（K.Yamaguchi ら、Scienc
e, Vol.270, p.2008 (1995))。ＴＡＢ１の過剰発現がル
シフェラーゼレポーター遺伝子の活性化をもたらすか否
かを試験した。
ン活性化因子インヒビター−１（ＰＡＩ−１）をコード
するｍＲＮＡの量を急速に増加せしめる（M.R.Keeton
ら、J. Biol. Chem., Vol.266, p.23048 (1991))。ＴＡ
Ｋ１の活性化形（ＴＡＫ１ΔＮ）の過剰発現により、Ｔ
ＧＦ−β−誘導性ｐＡＩ−１遺伝子プロモーターの制御
下にあるルシフェラーゼ遺伝子を含有するレポーター遺
伝子は構成的に活性化される（K.Yamaguchi ら、Scienc
e, Vol.270, p.2008 (1995))。ＴＡＢ１の過剰発現がル
シフェラーゼレポーター遺伝子の活性化をもたらすか否
かを試験した。
【００６０】ＭｖｌＬｕ細胞を、レポータープラスミド
ｐ８００neoLUC (M.Abe ら、Analyt. Biochem., Vol.21
6, p.276 (1994))と、ＴＡＢ１発現プラスミドｐＥＦ−
ＴＡＢ１又はＴＡＫ１をコードする発現プラスミド（K.
Yamaguchi ら、Science, Vol.270, p.2008 (1995))とを
用いて、リン酸カルシウム法（H.Shibuya ら、Nature,
Vol.357, p.700 (1992))により一過性トランスフェクト
した。なお、プラスミドｐＥＦ−ＴＡＢ１は、ＥＦ１α
プロモーターの制御のもとに全長ＴＡＢ１コード配列を
含有しており、ｐＥＦをＥCOＲＩにより開裂せしめそし
てプラスミドＴＡＢＩ−ｆ−４からのＥCOＲＩ断片を挿
入することにより作製したものである。
ｐ８００neoLUC (M.Abe ら、Analyt. Biochem., Vol.21
6, p.276 (1994))と、ＴＡＢ１発現プラスミドｐＥＦ−
ＴＡＢ１又はＴＡＫ１をコードする発現プラスミド（K.
Yamaguchi ら、Science, Vol.270, p.2008 (1995))とを
用いて、リン酸カルシウム法（H.Shibuya ら、Nature,
Vol.357, p.700 (1992))により一過性トランスフェクト
した。なお、プラスミドｐＥＦ−ＴＡＢ１は、ＥＦ１α
プロモーターの制御のもとに全長ＴＡＢ１コード配列を
含有しており、ｐＥＦをＥCOＲＩにより開裂せしめそし
てプラスミドＴＡＢＩ−ｆ−４からのＥCOＲＩ断片を挿
入することにより作製したものである。
【００６１】このプラスミドＴＡＢＩ−ｆ−４はｐＢＳ
のＥCOＲＩおよびＳｍａＩ部位にＴＡＢ１ｃＤＮＡをサ
ブクローニングすることにより作製したものである。細
胞を３０ng／mlのヒトＴＧＦ−β１と共に又はこれを伴
わないで２０時間インキュベートし、抽出物を調製し、
そしてルシフェラーゼの測定を行った（H.Shibuya ら、
Mol. Cell Biol., Vol.14, p.5812 (1994)) 。ルシフェ
ラーゼ活性はβ−ガラクトシダーゼの発現に基いて補正
した。
のＥCOＲＩおよびＳｍａＩ部位にＴＡＢ１ｃＤＮＡをサ
ブクローニングすることにより作製したものである。細
胞を３０ng／mlのヒトＴＧＦ−β１と共に又はこれを伴
わないで２０時間インキュベートし、抽出物を調製し、
そしてルシフェラーゼの測定を行った（H.Shibuya ら、
Mol. Cell Biol., Vol.14, p.5812 (1994)) 。ルシフェ
ラーゼ活性はβ−ガラクトシダーゼの発現に基いて補正
した。
【００６２】すなわち、トランスフェクション効率を補
正するため、ｐＸｅＸ−β−Ｇａｌベクター（A.D.John
son ら、Gene, Vol.147, p.223 (1994))をすべてのルシ
フェラーゼレポーター実験において同時トランスフェク
トした。β−ガラクトシダーゼの測定は、ルシフェラー
ゼ測定のために調製された細胞溶解物を用いて、製造者
（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）の指示書に従って行った。ルシフ
ェラーゼ活性は、ベクターによりトランスフェクトされ
た非刺激細胞の活性に対する増加倍数として示した。す
べてのトランスフェクション及びルシフェラーゼ測定は
少なくとも５回行い、各実験は３連とした。
正するため、ｐＸｅＸ−β−Ｇａｌベクター（A.D.John
son ら、Gene, Vol.147, p.223 (1994))をすべてのルシ
フェラーゼレポーター実験において同時トランスフェク
トした。β−ガラクトシダーゼの測定は、ルシフェラー
ゼ測定のために調製された細胞溶解物を用いて、製造者
（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）の指示書に従って行った。ルシフ
ェラーゼ活性は、ベクターによりトランスフェクトされ
た非刺激細胞の活性に対する増加倍数として示した。す
べてのトランスフェクション及びルシフェラーゼ測定は
少なくとも５回行い、各実験は３連とした。
【００６３】結果を図８に示す。図中、ＫＮは触媒的に
不活性なＴＡＫ１−Ｋ６３Ｗを示す。データーは、代表
的な実験における３連の実験からのルシフェラーゼ活性
の平均±ＳＥＭを示す。ＴＡＫ１と共にＴＡＢ１の過剰
発現はＴＧＦ−βの非存在下でもレポーター遺伝子の発
現を誘導したが、ＴＡＫ１又はＴＡＢ１のみの過剰発現
はルシフェラーゼ活性の構成的量にほとんど影響を与え
なかった。これらの研究は、ＴＡＢ１が哺乳類細胞にお
いてＴＡＫ１の活性を増強することを示している。
不活性なＴＡＫ１−Ｋ６３Ｗを示す。データーは、代表
的な実験における３連の実験からのルシフェラーゼ活性
の平均±ＳＥＭを示す。ＴＡＫ１と共にＴＡＢ１の過剰
発現はＴＧＦ−βの非存在下でもレポーター遺伝子の発
現を誘導したが、ＴＡＫ１又はＴＡＢ１のみの過剰発現
はルシフェラーゼ活性の構成的量にほとんど影響を与え
なかった。これらの研究は、ＴＡＢ１が哺乳類細胞にお
いてＴＡＫ１の活性を増強することを示している。
【００６４】ＴＡＫ１−Ｋ６３Ｗの変異体の過剰発現は
ＴＧＦ−βに刺激されたルシフェラーゼ活性を阻害した
が（K.Yamaguchi ら、Science, Vol.270, p.2008 (199
5))、これはおそらく経路中の必須要素を妨害する（ｓ
ｅｑｕｅｓｔｅｒｉｎｇ）ためであろう。他方、ＴＡＢ
１の過剰発現はＴＡＫ１−Ｋ６３Ｗの阻害効果を低減さ
せ、ＴＡＢ１がＴＡＫ１−Ｋ６３Ｗの過剰発現により吸
収される可能性を示唆する。
ＴＧＦ−βに刺激されたルシフェラーゼ活性を阻害した
が（K.Yamaguchi ら、Science, Vol.270, p.2008 (199
5))、これはおそらく経路中の必須要素を妨害する（ｓ
ｅｑｕｅｓｔｅｒｉｎｇ）ためであろう。他方、ＴＡＢ
１の過剰発現はＴＡＫ１−Ｋ６３Ｗの阻害効果を低減さ
せ、ＴＡＢ１がＴＡＫ１−Ｋ６３Ｗの過剰発現により吸
収される可能性を示唆する。
【００６５】実施例１０．ＴＡＢ１のＣ−末端の６８個
のアミノ酸〔ＴＡＢ１（４３７−５０４）〕はＴＡＫ１
に結合しそしてそれを活性化するために十分であり、Ｔ
ＡＢ１のＮ−末端ドメインがＴＡＢ１の機能における制
御的役割を演ずることが示唆された。この可能性を試験
するため、Ｃ−末端ＴＡＫ１結合ドメインを欠くＴＡＢ
１の短縮形〔ＴＡＢ１（１−４１８）〕を作製した。Ｍ
ｖｌＬｕ細胞を、ｐ８００nedUC レポーターと、ＴＡＢ
１（１−４１８）又はＴＡＢ１（全長）をコードする発
現ベクターの図９に示す量とにより一過性にトランスフ
ェクトし、そしてそれらをｐＥＦコントロールベクター
により補完した。
のアミノ酸〔ＴＡＢ１（４３７−５０４）〕はＴＡＫ１
に結合しそしてそれを活性化するために十分であり、Ｔ
ＡＢ１のＮ−末端ドメインがＴＡＢ１の機能における制
御的役割を演ずることが示唆された。この可能性を試験
するため、Ｃ−末端ＴＡＫ１結合ドメインを欠くＴＡＢ
１の短縮形〔ＴＡＢ１（１−４１８）〕を作製した。Ｍ
ｖｌＬｕ細胞を、ｐ８００nedUC レポーターと、ＴＡＢ
１（１−４１８）又はＴＡＢ１（全長）をコードする発
現ベクターの図９に示す量とにより一過性にトランスフ
ェクトし、そしてそれらをｐＥＦコントロールベクター
により補完した。
【００６６】なお、ＴＡＢ１（１−４１８）をコードす
る発現ベクターは次のようにして作製した。プラスミド
ＴＡＢＩ−ｆ−４の１．３kbのＥCOＲＩ−ＨｉｎｃII断
片（ＴＡＢ１のアミノ酸１−４１８のＮ−末端領域を含
有する）をｐＫＴ１０ベクターにサブクローニングして
ｐＫＴ１０−ＴＡＢ１（１−４１８）を作製した。ｐＥ
ＦをＥCOＲＩ及びＳａｌＩにより開裂せしめ、そしてｐ
ＫＳ１０−ＴＡＢ１（１−４１８）からのＥCOＲＩ−Ｓ
ａｌＩ断片を挿入することによりｐＥＦ−ＴＡＢ１（１
−４１８）を作製した。
る発現ベクターは次のようにして作製した。プラスミド
ＴＡＢＩ−ｆ−４の１．３kbのＥCOＲＩ−ＨｉｎｃII断
片（ＴＡＢ１のアミノ酸１−４１８のＮ−末端領域を含
有する）をｐＫＴ１０ベクターにサブクローニングして
ｐＫＴ１０−ＴＡＢ１（１−４１８）を作製した。ｐＥ
ＦをＥCOＲＩ及びＳａｌＩにより開裂せしめ、そしてｐ
ＫＳ１０−ＴＡＢ１（１−４１８）からのＥCOＲＩ−Ｓ
ａｌＩ断片を挿入することによりｐＥＦ−ＴＡＢ１（１
−４１８）を作製した。
【００６７】次に、細胞を３０ng／mlのＴＧＦ−β１と
共に又はこれを伴わないで２０時間インキュベートし、
そして細胞溶解物をルシフェラーゼ活性について測定し
た。数値は、ｐＥＦによりトランスフェクトされた対照
細胞に対する誘導の倍数の％として示した。ＴＧＦ−β
によるルシフェラーゼの非誘導（誘導倍数１）は０％に
相当する。すべてのトランスフェクション及びルシフェ
ラーゼの測定は少なくとも３回行い、各実験を３連とし
た。データーは、代表的な実験における３連の実験から
のルシフェラーゼ活性の平均±ＳＥＭで示す。
共に又はこれを伴わないで２０時間インキュベートし、
そして細胞溶解物をルシフェラーゼ活性について測定し
た。数値は、ｐＥＦによりトランスフェクトされた対照
細胞に対する誘導の倍数の％として示した。ＴＧＦ−β
によるルシフェラーゼの非誘導（誘導倍数１）は０％に
相当する。すべてのトランスフェクション及びルシフェ
ラーゼの測定は少なくとも３回行い、各実験を３連とし
た。データーは、代表的な実験における３連の実験から
のルシフェラーゼ活性の平均±ＳＥＭで示す。
【００６８】結果を図９に示す。ＭｖｌＬｕ細胞でのＴ
ＡＢ１（１−４１８）の過剰発現は、ＴＧＦ−β刺激に
より誘導されるレポーター遺伝子の活性を抑制した。従
ってＴＡＢ１（１−４１８）はＴＧＦ−βにより誘導さ
れる遺伝子発現のドミナント−ネガティブインヒビター
として作用する。これらの結果は、ＴＡＢ１がＴＧＦ−
βのシグナル伝達に関与することを示している。
ＡＢ１（１−４１８）の過剰発現は、ＴＧＦ−β刺激に
より誘導されるレポーター遺伝子の活性を抑制した。従
ってＴＡＢ１（１−４１８）はＴＧＦ−βにより誘導さ
れる遺伝子発現のドミナント−ネガティブインヒビター
として作用する。これらの結果は、ＴＡＢ１がＴＧＦ−
βのシグナル伝達に関与することを示している。
【００６９】ＴＡＢ１がＴＡＫ１の活性化を誘導するメ
カニズムとしては、ＴＡＫ１に結合するＴＡＢ１が活性
化に必要なコンホーメーション変化を誘導することが考
えられる。ＴＡＫ１のＮ−末端における２０アミノ酸の
除去はプロテインキナーゼの構成的活性化をもたらすこ
とから、Ｎ−末端ドメインが触媒ドメインを束縛してキ
ナーゼ活性を阻害することが示唆される（K.Yamaguchi
ら、Science, Vol.270, p.2008 (1995))。ＴＡＢ１はＴ
ＡＫ１のこの負の制御ドメインをその触媒ドメインから
解除するのかも知れない。ＴＡＫ１結合部位として機能
するＴＡＢ１のＣ−末端は、ＴＡＫ１のＮ−末端に見出
される領域と同様にセリン及びスレオニンリッチ領域を
含有している。従って、ＴＡＢ１はＴＧＦ−βとＴＡＫ
１ ＭＡＰＫＫＫとの間の重要なシグナル伝達中間体で
あろう。
カニズムとしては、ＴＡＫ１に結合するＴＡＢ１が活性
化に必要なコンホーメーション変化を誘導することが考
えられる。ＴＡＫ１のＮ−末端における２０アミノ酸の
除去はプロテインキナーゼの構成的活性化をもたらすこ
とから、Ｎ−末端ドメインが触媒ドメインを束縛してキ
ナーゼ活性を阻害することが示唆される（K.Yamaguchi
ら、Science, Vol.270, p.2008 (1995))。ＴＡＢ１はＴ
ＡＫ１のこの負の制御ドメインをその触媒ドメインから
解除するのかも知れない。ＴＡＫ１結合部位として機能
するＴＡＢ１のＣ−末端は、ＴＡＫ１のＮ−末端に見出
される領域と同様にセリン及びスレオニンリッチ領域を
含有している。従って、ＴＡＢ１はＴＧＦ−βとＴＡＫ
１ ＭＡＰＫＫＫとの間の重要なシグナル伝達中間体で
あろう。
【００７０】
配列番号：１ 配列の長さ：１５６０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 GAATTCGTGG CCCGCAGGGT TCCTCCAAG ATG GCG GCG CAG AGG AGG AGC TTG 53 Met Ala Ala Gln Arg Arg Ser Leu 5 CTG CAG AGT GAG CAG CAG CCA AGC TGG ACA GAT GAC CTG CCT CTC TGC 101 Leu Gln Ser Glu Gln Gln Pro Ser Trp Thr Asp Asp Leu Pro Leu Cys 10 15 20 CAC CTC TCT GGG GTT GGC TCA GCC TCC AAC CGC AGC TAC TCT GCT GAT 149 His Leu Ser Gly Val Gly Ser Ala Ser Asn Arg Ser Tyr Ser Ala Asp 25 30 35 40 GGC AAG GGC ACT GAG AGC CAC CCG CCA GAG GAC AGC TGG CTC AAG TTC 197 Gly Lys Gly Thr Glu Ser His Pro Pro Glu Asp Ser Trp Leu Lys Phe 45 50 55 AGG AGT GAG AAC AAC TGC TTC CTG TAT GGG GTC TTC AAC GGC TAT GAT 245 Arg Ser Glu Asn Asn Cys Phe Leu Tyr Gly Val Phe Asn Gly Tyr Asp 60 65 70 GGC AAC CGA GTG ACC AAC TTC GTG GCC CAG CGG CTG TCC GCA GAG CTC 293 Gly Asn Arg Val Thr Asn Phe Val Ala Gln Arg Leu Ser Ala Glu Leu 75 80 85
【００７１】 CTG CTG GGC CAG CTG AAT GCC GAG CAC GCC GAG GCC GAT GTG CGG CGT 341 Leu Leu Gly Gln Leu Asn Ala Glu His Ala Glu Ala Asp Val Arg Arg 90 95 100 GTG CTG CTG CAG GCC TTC GAT GTG GTG GAG AGG AGC TTC CTG GAG TCC 389 Val Leu Leu Gln Ala Phe Asp Val Val Glu Arg Ser Phe Leu Glu Ser 105 110 115 120 ATT GAC GAC GCC TTG GCT GAG AAG GCA AGC CTC CAG TCG CAA TTG CCA 437 Ile Asp Asp Ala Leu Ala Glu Lys Ala Ser Leu Gln Ser Gln Leu Pro 125 130 135 GAG GGA GTC CCT CAG CAC CAG CTG CCT CCT CAG TAT CAG AAG ATC CTT 485 Glu Gly Val Pro Gln His Gln Leu Pro Pro Gln Tyr Gln Lys Ile Leu 140 145 150 GAG AGA CTC AAG ACG TTA GAG AGG GAA ATT TCG GGA GGG GCC ATG GCC 533 Glu Arg Leu Lys Thr Leu Glu Arg Glu Ile Ser Gly Gly Ala Met Ala 155 160 165 GTT GTG GCG GTC CTT CTC AAC AAC AAG CTC TAC GTC GCC AAT GTC GGT 581 Val Val Ala Val Leu Leu Asn Asn Lys Leu Tyr Val Ala Asn Val Gly 170 175 180 ACA AAC CGT GCA CTT TTA TGC AAA TCG ACA GTG GAT GGG TTG CAG GTG 629 Thr Asn Arg Ala Leu Leu Cys Lys Ser Thr Val Asp Gly Leu Gln Val 185 190 195 200 ACA CAG CTG AAC GTG GAC CAC ACC ACA GAG AAC GAG GAT GAG CTC TTC 677 Thr Gln Leu Asn Val Asp His Thr Thr Glu Asn Glu Asp Glu Leu Phe 205 210 215 CGT CTT TCG CAG CTG GGC TTG GAT GCT GGA AAG ATC AAG CAG GTG GGG 725 Arg Leu Ser Gln Leu Gly Leu Asp Ala Gly Lys Ile Lys Gln Val Gly 220 225 230
【００７２】 ATC ATC TGT GGG CAG GAG AGC ACC CGG CGG ATC GGG GAT TAC AAG GTT 773 Ile Ile Cys Gly Gln Glu Ser Thr Arg Arg Ile Gly Asp Tyr Lys Val 235 240 245 AAA TAT GGC TAC ACG GAC ATT GAC CTT CTC AGC GCT GCC AAG TCC AAA 821 Lys Tyr Gly Tyr Thr Asp Ile Asp Leu Leu Ser Ala Ala Lys Ser Lys 250 255 260 CCA ATC ATC GCA GAG CCA GAA ATC CAT GGG GCA CAG CCG CTG GAT GGG 869 Pro Ile Ile Ala Glu Pro Glu Ile His Gly Ala Gln Pro Leu Asp Gly 265 270 275 280 GTG ACG GGC TTC TTG GTG CTG ATG TCG GAG GGG TTG TAC AAG GCC CTA 917 Val Thr Gly Phe Leu Val Leu Met Ser Glu Gly Leu Tyr Lys Ala Leu 285 290 295 GAG GCA GCC CAT GGG CCT GGG CAG GCC AAC CAG GAG ATT GCT GCG ATG 965 Glu Ala Ala His Gly Pro Gly Gln Ala Asn Gln Glu Ile Ala Ala Met 300 305 310 ATT GAC ACT GAG TTT GCC AAG CAG ACC TCC CTG GAC GCA GTG GCC CAG 1013 Ile Asp Thr Glu Phe Ala Lys Gln Thr Ser Leu Asp Ala Val Ala Gln 315 320 325 GCC GTC GTG GAC CGG GTG AAG CGC ATC CAC AGC GAC ACC TTC GCC AGT 1061 Ala Val Val Asp Arg Val Lys Arg Ile His Ser Asp Thr Phe Ala Ser 330 335 340 GGT GGG GAG CGT GCC AGG TTC TGC CCC CGG CAC GAG GAC ATG ACC CTG 1109 Gly Gly Glu Arg Ala Arg Phe Cys Pro Arg His Glu Asp Met Thr Leu 345 350 355 360 CTA GTG AGG AAC TTT GGC TAC CCG CTG GGC GAA ATG AGC CAG CCC ACA 1157 Leu Val Arg Asn Phe Gly Tyr Pro Leu Gly Glu Met Ser Gln Pro Thr 365 370 375 CCG AGC CCA GCC CCA GCT GCA GGA GGA CGA GTG TAC CCT GTG TCT GTG 1205 Pro Ser Pro Ala Pro Ala Ala Gly Gly Arg Val Tyr Pro Val Ser Val 380 385 390 CCA TAC TCC AGC GCC CAG AGC ACC AGC AAG ACC AGC GTG ACC CTC TCC 1253 Pro Tyr Ser Ser Ala Gln Ser Thr Ser Lys Thr Ser Val Thr Leu Ser 395 400 405 CTT GTC ATG CCC TCC CAG GGC CAG ATG GTC AAC GGG GCT CAC AGT GCT 1301 Leu Val Met Pro Ser Gln Gly Gln Met Val Asn Gly Ala His Ser Ala 410 415 420 TCC ACC CTG GAC GAA GCC ACC CCC ACC CTC ACC AAC CAA AGC CCG ACC 1349 Ser Thr Leu Asp Glu Ala Thr Pro Thr Leu Thr Asn Gln Ser Pro Thr 425 430 435 440 TTA ACC CTG CAG TCC ACC AAC ACG CAC ACG CAG AGC AGC AGC TCC AGC 1397 Leu Thr Leu Gln Ser Thr Asn Thr His Thr Gln Ser Ser Ser Ser Ser 445 450 455 TCT GAC GGA GGC CTC TTC CGC TCC CGG CCC GCC CAC TCG CTC CCG CCT 1445 Ser Asp Gly Gly Leu Phe Arg Ser Arg Pro Ala His Ser Leu Pro Pro 460 465 470 GGC GAG GAC GGT CGT GTT GAG CCC TAT GTG GAC TTT GCT GAG TTT TAC 1493 Gly Glu Asp Gly Arg Val Glu Pro Tyr Val Asp Phe Ala Glu Phe Tyr 475 480 485 CGC CTC TGG AGC GTG GAC CAT GGC GAG CAG AGC GTG GTG ACA GCA CCG 1541 Arg Leu Trp Ser Val Asp His Gly Glu Gln Ser Val Val Thr Ala Pro 490 495 500 TAGGGCAGCC GGAGGAATG 1560
【００７３】配列番号：２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GAGAATTCAT GCGGCAAAGC 20
【００７４】配列番号：３ 配列の長さ：１６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GGGTCGACTA CGGTGC 16
【００７５】配列番号４ 配列の長さ：１５６０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 GAATTCGTGG CCCGCAGGGT TCCTCCAAG ATG GCG GCG CAG AGG AGG AGC TTG 53 Met Ala Ala Gln Arg Arg Ser Leu 5 CTG CAG AGT GAG CAG CAG CCA AGC TGG ACA GAT GAC CTG CCT CTC TGC 101 Leu Gln Ser Glu Gln Gln Pro Ser Trp Thr Asp Asp Leu Pro Leu Cys 10 15 20 CAC CTC TCT GGG GTT GGC TCA GCC TCC AAC CGC AGC TAC TCT GCT GAT 149 His Leu Ser Gly Val Gly Ser Ala Ser Asn Arg Ser Tyr Ser Ala Asp 25 30 35 40 GGC AAG GGC ACT GAG AGC CAC CCG CCA GAG GAC AGA TGG CTC AAG TTC 197 Gly Lys Gly Thr Glu Ser His Pro Pro Glu Asp Arg Trp Leu Lys Phe 45 50 55 AGG AGT GAG AAC AAC TGC TTC CTG TAT GGG GTC TTC AAC GGC TAT GAT 245 Arg Ser Glu Asn Asn Cys Phe Leu Tyr Gly Val Phe Asn Gly Tyr Asp 60 65 70 GGC AAC CGA GTG ACC AAC TTC GTG GCC CAG CGG CTG TCC GCA GAG CTC 293 Gly Asn Arg Val Thr Asn Phe Val Ala Gln Arg Leu Ser Ala Glu Leu 75 80 85
【００７６】 CTG CTG GGC CAG CTG AAT GCC GAG CAC GCC GAG GCC GAT GTG CGG CGT 341 Leu Leu Gly Gln Leu Asn Ala Glu His Ala Glu Ala Asp Val Arg Arg 90 95 100 GTG CTG CTG CAG GCC TTC GAT GTG GTG GAG AGG AGC TTC CTG GAG TCC 389 Val Leu Leu Gln Ala Phe Asp Val Val Glu Arg Ser Phe Leu Glu Ser 105 110 115 120 ATT GAC GAC GCC TTG GCT GAG AAG GCA AGC CTC CAG TCG CAA TTG CCA 437 Ile Asp Asp Ala Leu Ala Glu Lys Ala Ser Leu Gln Ser Gln Leu Pro 125 130 135 GAG GGA GTC CCT CAG CAC CAG CTG CCT CCT CAG TAT CAG AAG ATC CTT 485 Glu Gly Val Pro Gln His Gln Leu Pro Pro Gln Tyr Gln Lys Ile Leu 140 145 150 GAG AGA CTC AAG ACG TTA GAG AGG GAA ATT TCG GGA GGG GCC ATG GCC 533 Glu Arg Leu Lys Thr Leu Glu Arg Glu Ile Ser Gly Gly Ala Met Ala 155 160 165 GTT GTG GCG GTC CTT CTC AAC AAC AAG CTC TAC GTC GCC AAT GTC GGT 581 Val Val Ala Val Leu Leu Asn Asn Lys Leu Tyr Val Ala Asn Val Gly 170 175 180 ACA AAC CGT GCA CTT TTA TGC AAA TCG ACA GTG GAT GGG TTG CAG GTG 629 Thr Asn Arg Ala Leu Leu Cys Lys Ser Thr Val Asp Gly Leu Gln Val 185 190 195 200 ACA CAG CTG AAC GTG GAC CAC ACC ACA GAG AAC GAG GAT GAG CTC TTC 677 Thr Gln Leu Asn Val Asp His Thr Thr Glu Asn Glu Asp Glu Leu Phe 205 210 215 CGT CTT TCG CAG CTG GGC TTG GAT GCT GGA AAG ATC AAG CAG GTG GGG 725 Arg Leu Ser Gln Leu Gly Leu Asp Ala Gly Lys Ile Lys Gln Val Gly 220 225 230
【００７７】 ATC ATC TGT GGG CAG GAG AGC ACC CGG CGG ATC GGG GAT TAC AAG GTT 773 Ile Ile Cys Gly Gln Glu Ser Thr Arg Arg Ile Gly Asp Tyr Lys Val 235 240 245 AAA TAT GGC TAC ACG GAC ATT GAC CTT CTC AGC GCT GCC AAG TCC AAA 821 Lys Tyr Gly Tyr Thr Asp Ile Asp Leu Leu Ser Ala Ala Lys Ser Lys 250 255 260 CCA ATC ATC GCA GAG CCA GAA ATC CAT GGG GCA CAG CCG CTG GAT GGG 869 Pro Ile Ile Ala Glu Pro Glu Ile His Gly Ala Gln Pro Leu Asp Gly 265 270 275 280 GTG ACG GGC TTC TTG GTG CTG ATG TCG GAG GGG TTG TAC AAG GCC CTA 917 Val Thr Gly Phe Leu Val Leu Met Ser Glu Gly Leu Tyr Lys Ala Leu 285 290 295 GAG GCA GCC CAT GGG CCT GGG CAG GCC AAC CAG GAG ATT GCT GCG ATG 965 Glu Ala Ala His Gly Pro Gly Gln Ala Asn Gln Glu Ile Ala Ala Met 300 305 310 ATT GAC ACT GAG TTT GCC AAG CAG ACC TCC CTG GAC GCA GTG GCC CAG 1013 Ile Asp Thr Glu Phe Ala Lys Gln Thr Ser Leu Asp Ala Val Ala Gln 315 320 325 GCC GTC GTG GAC CGG GTG AAG CGC ATC CAC AGC GAC ACC TTC GCC AGT 1061 Ala Val Val Asp Arg Val Lys Arg Ile His Ser Asp Thr Phe Ala Ser 330 335 340 GGT GGG GAG CGT GCC AGG TTC TGC CCC CGG CAC GAG GAC ATG ACC CTG 1109 Gly Gly Glu Arg Ala Arg Phe Cys Pro Arg His Glu Asp Met Thr Leu 345 350 355 360 CTA GTG AGG AAC TTT GGC TAC CCG CTG GGC GAA ATG AGC CAG CCC ACA 1157 Leu Val Arg Asn Phe Gly Tyr Pro Leu Gly Glu Met Ser Gln Pro Thr 365 370 375 CCG AGC CCA GCC CCA GCT GCA GGA GGA CGA GTG TAC CCT GTG TCT GTG 1205 Pro Ser Pro Ala Pro Ala Ala Gly Gly Arg Val Tyr Pro Val Ser Val 380 385 390 CCA TAC TCC AGC GCC CAG AGC ACC AGC AAG ACC AGC GTG ACC CTC TCC 1253 Pro Tyr Ser Ser Ala Gln Ser Thr Ser Lys Thr Ser Val Thr Leu Ser 395 400 405 CTT GTC ATG CCC TCC CAG GGC CAG ATG GTC AAC GGG GCT CAC AGT GCT 1301 Leu Val Met Pro Ser Gln Gly Gln Met Val Asn Gly Ala His Ser Ala 410 415 420 TCC ACC CTG GAC GAA GCC ACC CCC ACC CTC ACC AAC CAA AGC CCG ACC 1349 Ser Thr Leu Asp Glu Ala Thr Pro Thr Leu Thr Asn Gln Ser Pro Thr 425 430 435 440 TTA ACC CTG CAG TCC ACC AAC ACG CAC ACG CAG AGC AGC AGC TCC AGC 1397 Leu Thr Leu Gln Ser Thr Asn Thr His Thr Gln Ser Ser Ser Ser Ser 445 450 455 TCT GAC GGA GGC CTC TTC CGC TCC CGG CCC GCC CAC TCG CTC CCG CCT 1445 Ser Asp Gly Gly Leu Phe Arg Ser Arg Pro Ala His Ser Leu Pro Pro 460 465 470 GGC GAG GAC GGT CGT GTT GAG CCC TAT GTG GAC TTT GCT GAG TTT TAC 1493 Gly Glu Asp Gly Arg Val Glu Pro Tyr Val Asp Phe Ala Glu Phe Tyr 475 480 485 CGC CTC TGG AGC GTG GAC CAT GGC GAG CAG AGC GTG GTG ACA GCA CCG 1541 Arg Leu Trp Ser Val Asp His Gly Glu Gln Ser Val Val Thr Ala Pro 490 495 500 TAGGGCAGCC GGAGGAATG 1560
【図１】ＴＡＫ１蛋白質上の、ＴＡＢ１蛋白質が結合す
る領域を示す図である。斜線部分はＴＡＢ１の触媒領域
を示す。
る領域を示す図である。斜線部分はＴＡＢ１の触媒領域
を示す。
【図２】図２は、酵母におけるフェロモン活性化ＭＡＰ
Ｋ経路中のＳｔｅ１１欠損株におけるＴＡＫ１とＴＡＢ
１との共存によるＳｔｅ１１欠損の補完を示す図であ
り、電気泳動の結果を示す図面代用写真である。
Ｋ経路中のＳｔｅ１１欠損株におけるＴＡＫ１とＴＡＢ
１との共存によるＳｔｅ１１欠損の補完を示す図であ
り、電気泳動の結果を示す図面代用写真である。
【図３】図３は、ＴＡＢ１がＴＡＫ１のを活性を増強す
ることを示すイン・ビトロ実験の結果を示す図面代用写
真である。
ることを示すイン・ビトロ実験の結果を示す図面代用写
真である。
【図４】図４は、ＴＡＢ１のアミノ酸配列を示す。
【図５】図５は、種々の器官又は組織においてＴＡＢ１
をコードするｍＲＮＡが発現されることを示す電気泳動
図であり、図面に代る写真である。
をコードするｍＲＮＡが発現されることを示す電気泳動
図であり、図面に代る写真である。
【図６】図６は、哺乳類細胞中でＴＡＢ１とＴＡＫ１の
会合が生ずることを示すイムノブロット図であり、図面
代用写真である。
会合が生ずることを示すイムノブロット図であり、図面
代用写真である。
【図７】図７は、哺乳類細胞中で、ＴＡＢ１がＴＡＫ１
のキナーゼ活性を増強することを示すグラフ（上）と、
ＴＡＫ１及びＫＮ−ＭＰＫ２が同程度に生産されたこと
を示すブロット図であり、図面代用写真である。
のキナーゼ活性を増強することを示すグラフ（上）と、
ＴＡＫ１及びＫＮ−ＭＰＫ２が同程度に生産されたこと
を示すブロット図であり、図面代用写真である。
【図８】図８は、ＴＧＦ−βにより刺激した哺乳類細胞
において、ＴＡＫ１とＴＡＢ１の共存によりレポーター
としてのルシフェラーゼ遺伝子の発現が増強されること
を示すグラフである。
において、ＴＡＫ１とＴＡＢ１の共存によりレポーター
としてのルシフェラーゼ遺伝子の発現が増強されること
を示すグラフである。
【図９】図９は、Ｃ−末端が欠けたＴＡＢ１（ＴＡＢ１
（１−４１８））がＴＧＦ−βにより誘導されるレポー
ターとしてのルシフェラーゼ遺伝子の発現を阻害するこ
とを示すグラフである。
（１−４１８））がＴＧＦ−βにより誘導されるレポー
ターとしてのルシフェラーゼ遺伝子の発現を阻害するこ
とを示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (15)
- 【請求項１】 配列番号：１に示すアミノ酸配列を有す
るＴＡＢ１蛋白質。 - 【請求項２】 配列番号：１に示すアミノ酸配列に対し
て、１又は複数のアミノ酸の置換、欠失及び／又は付加
によって修飾されているアミノ酸配列を有し、且つＴＡ
Ｂ１蛋白質の生物学的性質を有する蛋白質。 - 【請求項３】 配列番号：１に示すヌクレオチド配列を
有するＤＮＡに対して６０℃，０．１×ＳＳＣ，０．１
％ドデシル硫酸ナトリウムのハイブリダイゼーション条
件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡによりコ
ードされており、且つＴＡＢ１蛋白質の生物学的性質を
有する蛋白質。 - 【請求項４】 配列番号：１に示すアミノ酸配列におい
て、アミノ酸位置２１位〜５７９位のアミノ酸から成る
アミノ酸配列を有する蛋白質。 - 【請求項５】 配列番号：１に示すアミノ酸配列におい
て、アミノ酸位置４３７〜５０４の６８個のアミノ酸か
ら成るアミノ酸配列を有するポリペプチド。 - 【請求項６】 配列番号１に示すアミノ酸配列において
５２番目のアミノ酸がアルギニンである、請求項２に記
載の蛋白質。 - 【請求項７】 請求項１〜６のいずれか１項に記載の蛋
白質又はポリペプチドを含んで成る融合蛋白質。 - 【請求項８】 請求項１〜７のいずれか１項に記載の蛋
白質又はポリペプチドの製造方法において、該蛋白質又
はポリペプチドをコードするＤＮＡを含んで成る発現ベ
クターにより形質転換された宿主を培養し、該培養物か
ら該蛋白質又はポリペプチドを採取することを特徴とす
る方法。 - 【請求項９】 前記宿主が哺乳類細胞又は酵母細胞であ
る、請求項８に記載の方法。 - 【請求項１０】 請求項１〜７のいずれか１項に記載の
蛋白質又はポリペプチドを哺乳類細胞において生成せし
める方法であって、該蛋白質又はポリペプチドをコード
するＤＮＡを哺乳動物細胞に導入することを特徴とする
方法。 - 【請求項１１】 請求項１〜７のいずれか１項に記載の
蛋白質又はポリペプチドをコードするＤＮＡ。 - 【請求項１２】 請求項１１に記載のＤＮＡを含んで成
る発現ベクター。 - 【請求項１３】 請求項１２に記載の発現ベクターによ
り形質転換された宿主。 - 【請求項１４】 前記宿主が哺乳類細胞又は酵母細胞で
ある、請求項１３に記載の宿主。 - 【請求項１５】 （Ａ）請求項１〜６のいずれか１項に
記載のＴＡＢ１蛋白質又はポリペプチドとＴＡＫ１蛋白
質を発現する細胞にＴＧＦ−βシグナル伝達系阻害物質
を含む試料を接触させるか又は導入し、そして（Ｂ）Ｔ
ＡＫ１蛋白質のキナーゼ活性を測定する、ことを特徴と
するＴＧＦ−βシグナル伝達系阻害物質のスクリーニン
グ方法。
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|---|---|---|---|
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| US08/752,891 US5837819A (en) | 1996-04-24 | 1996-11-20 | TAB1 protein |
| DE69731682T DE69731682T2 (de) | 1996-04-24 | 1997-04-24 | TAB1 Protein und dafür kodierende DNA |
| EP97302808A EP0803571B1 (en) | 1996-04-24 | 1997-04-24 | TAB1 protein and DNA coding therefor |
| ES97302808T ES2230586T3 (es) | 1996-04-24 | 1997-04-24 | Proteina tab1 y asdn que la codifica. |
| AT97302808T ATE283356T1 (de) | 1996-04-24 | 1997-04-24 | Tab1 protein und dafür kodierende dna |
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| US09/406,854 US6140042A (en) | 1996-04-24 | 1999-09-29 | TAB1 protein and DNA coding therefore |
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| JP12628296 | 1996-04-24 | ||
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-
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- 2002-04-17 US US10/123,427 patent/US20020119525A1/en not_active Abandoned
-
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- 2005-07-14 US US11/180,911 patent/US7381543B2/en not_active Expired - Fee Related
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