SK287034B6

SK287034B6 - Peptidy schopné väzby s oblasťou SH3 proteínu GAP, nukleotidové sekvencie kódujúce tieto peptidy a spôsob ich prípravy a použitie

Info

Publication number: SK287034B6
Application number: SK629-97A
Authority: SK
Inventors: Marc Duchesne; Didier Faucher; Fabienne Parker; Fabien Schweighoffer; Bruno Tocque
Original assignee: Aventis Pharma S. A.
Priority date: 1994-11-22
Filing date: 1995-11-22
Publication date: 2009-10-07
Also published as: ES2248800T3; FI972170A; HU221410B1; AU4263696A; ATE305037T1; HUT77029A; DK0793721T3; CZ154597A3; WO1996016169A1; AU713937B2; CZ292538B6; EP0793721A1; SK62997A3; EP0793721B1; NO972313D0; JP2006122049A; BR9510067A; FI972170A0; IL116026A0; DE69534471T2

Abstract

Sú opísané peptidy schopné vstúpiť do interakcie s doménou SH3 proteínu GAP a sekvencie nukleových kyselín kódujúcich tieto peptidy. Ďalej sú opísané farmaceutické kompozície, ktoré tieto peptidy obsahujú ako účinnú látku.

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka nových peptidových a nukleotidových sekvencií a ich farmaceutického použitia. Hlavne sa vynález týka peptidov schopných viazať sa na oblasť SH3 proteínov GAP.

Doterajší stav techniky

Produkty génov ras, ktoré sú všeobecne označované ako proteíny p21, majú kľúčovú úlohu pri regulácii bunkového delenia pri všetkých eukaryotických organizmoch, pri ktorých sa študovali. Niektoré špecifické modifikácie týchto proteínov spôsobujú, že uvedené proteíny strácajú uvedenú normálnu regulačnú schopnosť a stávajú sa onkogénnymi. Vzhľadom na to je veľký počet ľudských nádorov spojených s prítomnosťou modifikovaných génov ras. Podobne môže nadmerná expresia uvedených proteínov p21 viesť k deregulácii bunkovej proliferácie. Globálne sa môže uviesť, že proteíny p21 sú implikované pri 30 % ľudských rakovín.

Pochopenie presnej úlohy uvedených proteínov p21 je teda základnou úlohou štúdií vykonávaných v oblasti onkológie.

Model, ktorý je v súčasnej dobe považovaný za platný na vysvetlenie funkcie proteínov p21, spočíva na analógiách, ktoré uvedené proteíny zdieľajú s transdukčnými proteínmi G. V bunkách existuje rovnováha medzi aktívnymi proteínmi p21, viazanými ku GTP, a inaktívnymi formami fixovanými ku GTP. Vo kviescentnej bunke, kde proteíny p21 nie sú žiaduce, je väčšina z nich vo forme GDP. Keď je bunka stimulovaná, stáva sa výmenný faktor nukleotidov GEF aktívnejším a uľahčuje evakuáciu GDP a jeho nahradenie faktorom GTP. Proteín takto príjme aktívnu konformáciu, ktorá mu umožní rozpoznať a stimulovať efektor, ktorým je proteín GAP „GTase activating proteín“, a ktorý je pravdepodobne združený s ďalšími proteínmi. Komplex p21-GTP-GAP vstupuje pravdepodobne sám osebe do interakcie s ďalším proteínom alebo ďalšími proteínmi, ktorá takto umožňuje prenos signálu, ktorý spôsobí biologickú odozvu bunky. Kombinácia p21 -GTP s GAP súčasne odštartuj e hydrolýzu GTP a návrat p21 do inaktívnej formy.

V prípade onkogénnych proteínov p21 bráni mutácia, ktorú proteíny p21 obsahujú, návratu proteínov p21 do inaktívneho stavu.

Uvedená komplexná rovnováha medzi aktívnou a neaktívnou formou p21 je súčasne regulovaná faktormi, ktoré sú zosilnené s biochemickými vlastnosťami proteínov p21 (relatívna afinita ku GDP a GTP, rýchlosť výmeny nukleotidov...), a externými faktormi modulujúcimi ich aktivitu, ako je hlavne proteín GAP.

Proteín GAP je cytosolický proteín, ktorý je prítomný pri všetkých eukaryotických organizmoch, ktoré majú takto schopnosť výrazne urýchľovať hydrolýzu GTP, viazaného na normálny proteín p21 (Trahey a Mc Cormick 1987). Uvedený proteín má dve domény zaisťujúce rozlišovacie funkcie. Jeho karboxy-terminálny koniec je nositeľom katalytickej aktivity, ktorá fixuje proteíny p21 a zvyšuje ich GTPase-aktivitu. Na jeho druhom konci sa za amino-termálnou časťou nachádza juxtapozícia domén SH2 a SH3, ktoré sú schopné participovať na interakciách s ďalšími proteínmi.

V súčasnosti sú známe dva proteíny, ktoré vstupujú do interakcie s proteínom GAP. Ide o proteíny označované ako p62 a pl90 majúce dĺžku 62 kDa resp. 190 kDa. Tieto dva proteíny, ktoré sú imunoprecipitované protilátkami riadenými proti rôznym epitopom GAP, tvoria evidentne špecifický komplex s GAP. Je známe, že to je na úrovni oblasti SH2, a že ide o interakciu proteínov p62 s proteínom GAP.

Pokiaľ ide o doménu SH3, vedie jej prítomnosť v rôznych proteínoch, akými sú fosfolipázy Cgama (PLC-gama), podjednotka p85 fosfatidyllinozitol-3-kinázy a proteín grb-2, ktoré sú všetky implikované na úrovni prenosu signálu p21-Ras, ku domienke, že táto doména je mimoriadne dôležitá na riadenie interakcie proteín-protein a tiež nevyhnutná pre funkciu zodpovedajúceho proteínu a/alebo na jeho bunkovú lokalizáciu. V špecifickom prípade proteínov GAP by uvedená doména SH3 mohla tiež participovať na prenose signálu Ras. Z uvedeného je zrejmé, že pochopenie presnej úlohy uvedenej domény SH3 by bolo v te-rapeutickej rovine veľkým prínosom.

Jednoznačne vymedzeným cieľom je takto prispieť na objasnenie prínosu uvedenej domény SH3 na prenos signálu ras.

Podstata vynálezu

Prihlasovaťeľ v rámci plnenia uvedeného cieľa preukázal existenciu proteínov schopných viazať sa k proteínu GAP prostredníctvom priamej väzby k jeho doméne SH3.

Presnejšie vymedzené, vynález je odvodený od identifikácie, izolácie a charakterizácie proteínov schopných vstúpiť do interakcie s doménou SH3 proteínu GAP. Vynález je rovnako dôsledkom štruktúrnej charakterizácie týchto proteínov identifikáciou zodpovedajúcich peptidových sekvcncií.

Polypeptid podľa vynálezu schopný interakcie s doménou SH3 proteínov GAP obsahuje celok alebo časť peptidovej sekvencie zvolenej z množiny zahrnujúcej sekcencie SEQ ID n°l, SEQ ID n°2, SEQ ID n°3, SEQ ID n°4, SEQ ID n°5 a SEQ ID n°9 a deriváty týchto sekvencií.

V rámci vynálezu výraz derivát označuje ľubovoľnú molekulu získanú modifikáciou genetického a/alebo chemického charakteru polypeptidu podľa vynálezu a zachovávajúcu si požadovanú aktivitu. Pod špecifikáciou modifikácie genetického a/alebo chemického charakteru sa rozumie ľubovoľná mutácia, substitúcia, delécia, adícia a/alebo modifikácia jedného alebo niekoľkých zvyškov. Takéto deriváty sa môžu generovať na rôzne účely, medzi ktoré hlavne patrí zvýšenie afinity peptidov k jeho interakčnému miestu, zlepšenie miery ich produkcie, zvýšenie rezistencie proti proteázam, zvýšenie jeho terapeutickej účinnosti alebo zníženie jeho sekundárnych účinkov, alebo tiež udelenie nových farmakokinetických a/alebo biologických vlastnosti.

Môže rovnako ísť o fragmenty uvedených sekvencií derivátov týchto sekvencií. Takéto fragmenty sa môžu generovať rôznymi spôsobmi. Tieto fragmenty sa môžu syntetizovať chemickou cestou na báze sekvencie uvedenej na obr. 1 s použitím peptidových syntetizátorov, ktoré sú v danom odbore známe. Tieto fragmenty sa môžu rovnako syntetizovať genetickou cestou a to expresiou v bunkovom hostiteľovi nukleotidovej sekvencie kódujúcej požadovaný peptid. V tomto prípade môže byť nukleotidová sekvencia pripravená chemicky s použitím oligonukleotidového syntetizátora a to na báze peptidovej sekvencie uvedenej v prihláške vynálezu a genetického kódu. Nukleotidová sekvencia sa môže rovnako pripraviť zo sekvencie uvedenej v prihláške vynálezu, enzymatickým štiepením, ligáciou, klonovaním a pod., a to technikami, ktoré sú odborníkovi v danom odbore známe, alebo vytriedením z bánk DNA pri použití sond získaných zo sekvencie SEQ ID n°l.

V rámci špecifickej formy uskutočnenia vynálezu obsahuje nárokovaný polypeptid sekvenciu SEQ ID n°l, sekvenciu SEQ ID n°2, sekvenciu SEQ ID n°3 a/alebo sekvenciu SEQ ID n°4.

Výhodne má polypeptid podľa vynálezu molekulovú hmotnosť asi 68 kDa.

V rámci špecifickej formy uskutočnenia vynálezu ide o polypeptid ľudského pôvodu obsahujúci celok alebo časť sekvencie SEQ ID n°5, sekvencie SEQ ID n°9 alebo niektorého z jej derivátov, tak ako boli definované.

Ide hlavne o polypeptid obsahujúci sekvenciu SEQ ID n°5.

Výhodnejšie ide o polypeptid reprezentovaný v SEQ ID n°9 alebo o niektorý z jeho derivátov.

Prekvapivo tomuto proteínu chýba homológia s ďalším proteínom, ktorý bol identifikovaný ako proteín viažuci sa k doméne SH3 Ser. Proteín nie je fosforylovaný na úrovni svojich tyrozínových jednotiek v bunkách v priebehu rastu alebo v stave mitózy.

Analýza proteínovej sekvencie SEQ ID n°9 ukazuje, že proteín združený s doménou SR+H3 proteínu GAP, označovaný ako G3BP, patrí ku skupine heterogénnych jadrových ribonukleoproteínov hnRNP. Presnejšie povedané, je G3BP proteín s 466 A.a majúce zjavnú molekulovú hmotnosť 68 kDa a obsahujú niekoľko charakteristických domén proteínov, ktoré sa viažu k RNA:

- domény RNP2 a RNP1 (A.a 342 až 347),

- 4 RGG box (A.a 435 - 449) a

- pomocná kyslá doména (A.a 144 až 221).

Vynález sa rovnako vzťahuje k peptidom schopným antagonizovať interakciu medzi G3BP a doménou SH3 proteínu GAP. Aktivita týchto peptidov sa môže preukázať kompetičným testom (pozri príklad 2-3) alebo testom stanovujúcim interferenciu signálov prenesenými proteínmi Ras.

Ďalším predmetom vynálezu sú polyklonálne alebo monoklonálne protilátky, alebo fragmenty protilátok riadené proti polypeptidu, ktorý bol definovaný. Takéto protilátky sa môžu generovať spôsobmi, ktoré sú v danom odbore známe. Tieto protilátky sa môžu pripraviť imunizáciou zvieraťa proti polypeptidu, ktorého sekvencia je zvolená z množiny zahrnujúcej sekvenciu SEQ ID n°l, sekvenciu SEQ ID n°2, sekvenciu SEQ ID n“3, sekvenciu SEQ ID n°4, sekvenciu SEQ ID n°5 a sekvenciu SEQ ID n°9, ako aj fragment alebo derivát týchto sekvencií, odobranim krvi zvieraťa a izoláciou uvedených protilátok z tejto krvi. Tieto protilátky môžu byť rovnako generované prípravou hybridomov technikami, ktoré sú v danom odbore známe.

Protilátky alebo fragmenty protilátok podľa vynálezu sa môžu takto použiť na reguláciu aktivačného stavu produkcie génov ras.

Inak sa môžu tieto protilátky použiť tiež na detekciu a/alebo stanovenie peptidov podľa vynálezu v biologických vzorkách a teda na získanie informácií o aktivačnom stave produktov génov ras.

Vynález sa rovnako vzťahuje na antagonizujúce činidlá, t. j. na ľuboboľný peptid, ktorý je schopný blokovať interakciu polypeptidov podľa vynálezu s doménou SH3 proteínov GAP. Takéto peptidy sa môžu preukázať v porovnávacom (pozri príklad 2-3) alebo inhibičnom teste aktivity ras.

SK 287034 Β6

Vynález tiež umožňuje generovať polypeptidy odvodené od identifikovaných sekvencii, ako aj protilátky riadené proti týmto polypeptidom alebo proti zodpovedajúcim proteínom, ktoré majú zaujímavé biologické vlastnosti so zreteľom na ich farmaceutické použitie.

Vynález rovnako poskytuje nepeptidové alebo výlučne nepeptidové zlúčeniny, ktoré sú použiteľné farmaceutický. V skutočnosti je možné realizovať z aktívnych proteínových motívov opísaných v prihláške vynálezu inhibičné molekuly signalizačnej cesty závislej od nevýlučne peptidových proteínov p21, ktoré sú zlučiteľné s farmaceutickým použitím. V tomto ohľade sa vynález týka použitia opísaného polypeptidu podľa vynálezu na prípravu nepeptidových alebo výlučne nepeptidových a farmaceutický aktívnych molekúl stanovením štruktúrnych prvkov uvedeného polypeptidu, ktoré sú dôležité na jeho aktivitu a reprodukciu týchto prvkov nepeptidovými alebo výlučne nepeptidovými štruktúrami. Predmetom vynálezu sú rovnako farmaceutické kompozície, ktoré obsahujú jednu alebo niekoľko takto pripravených molekúl.

Predmetom vználezu je tiež každá sekvencia nukleovej kyseliny kódujúcej polypeptid schopný viazať sa k doméne SH3 proteínov GAP. Výhodne ide o sekvenciu obsahujúcu:

a) celok alebo časť sekvencie SEQ ID n°6, sekvencie SEQ ID n°10 alebo jedného z jej komplementárnych reťazcov,

b) ľubovoľnú sekvenciu hybridizujúcu so sekvenciou a) a kódujúcu polypeptid podľa vynálezu, a

c) sekvencie odvodené od sekvencii a) a b) na základe degenerácie genetického kódu.

Výhodne uvedená sekvencia obsahuje sekvenciu SEQ ID n°6, pričom je ešte výhodnejšie reprezentovaná sekvenciou SEQ ID n°10.

Rôzne nukleotidové sekvencie podľa vynálezu môžu, ale nemusia, mať umelý pôvod. Môže ísť o génové sekvencie, cDNA, RNA, hybridné sekvencie alebo syntetické, alebo polysyntetické sekvencie. Tieto sekvencie sa môžu získať vytriedením bánk DNA (banky cDNA alebo banky genómovej DNA) pomocou sond získaných na báze uvedených sekvencii. Tieto banky sa môžu realizovať z buniek rôznych pôvodov klasickými technikami molekulárnej biológie známymi v odbore. Nukleotidové sekvencie podľa vynálezu sa môžu tiež pripraviť chemickou syntézou, hlavne metódou fosforamiditov alebo tiež zmiešanými metódami zahrnujúcimi chemickú alebo enzymatickú modifikáciu sekvencii získaných vytriedením bánk.

Uvedené nukleotidové sekvencie podľa vynálezu sú použiteľné vo farmaceutickej oblasti a to buď na výrobu polypeptidov, alebo na realizáciu antimediátorových sekvencii použiteľných v rámci génovej terapie alebo tiež na detekciu a diagnostiku, na hybridizačné a aktivitné pokusy s proteínom GAP v biologických vzorcoch alebo na izoláciu homologických sekvencii z iných bunkových zdrojov.

Na účely produkcie polypeptidov podľa vynálezu sa definované nukleové sekvencie vložia pod kontrolu signálov umožňujúcich ich expresiu v bunkovom hostiteľovi. Voľba týchto signálov (promótory, terminátory, sekrečné sekvencie „leader“ atď.) môže byť závislá od použitého bunkového hostiteľa. Výhodne tvoria nukleotidové sekvencie podľa vynálezu súčasť vektora, ktorý môže mať autonómnu alebo integratívnu replikáciu. Vektory s autonómnymi replikáciami sa môžu pripraviť pri použití sekvencii s autonómnou replikáciou pri zvolenom hostiteľovi. Ak ide o integratívne vektory, potom sa môžu takéto vektory pripraviť napríklad pri použití homológových sekvencii k niektorým oblastiam genómu hostiteľa, umožňujúcich integráciu vektora mechanizmom homológovej rekombinácie.

Bunkovými hostiteľmi použiteľnými na produkciu polypeptidov podľa vynálezu sú eukaryotickí a prokaryotickí hostitelia. Ako príklady vhodných eúkaryotických hostiteľov sa môžu uviesť zvieracie bunky, kvasinky alebo huby. V prípade kvasiniek sa môžu uviesť kvasinky rodov Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Schwanniomyces alebo Hansenula. Zo zvieracích buniek sa môžu uviesť bunky COS, CHO, C127 atď. Ako príklady húb sa môžu citovať hlavne Aspergillus ssp. alebo Trichoderma ssp. V prípade prokaryotických hostiteľov sa dáva prednosť použitiu nasledujúcich baktérií: E. coli, Bacillus alebo Streptomyces.

Nukleové sekvencie podľa vynálezu môžu tiež slúžiť na realizáciu antimediátorových nukleových kyselín použiteľných ako farmaceutické činidlá. Inhibícia expresie niektorých onkogénov antimediátorovými nukleovými kyselinami je overenou stratégiou pri pochopení úlohy uvedených onkogénov a predstavuje sľubný prístup na ceste k získaniu protirakovinového postupu. Antimediátorové oligonukleotidy sú krátke komplementárne oligonukleotidy reťazca kódujúceho daný gén, v dôsledku čoho sú schopné špecificky hybridizovať s predpísanou mRNA a inhibovať tak jej transláciu. Takéto oligonukleotidy môžu byť tvorené celými alebo časťou definovaných nukleových sekvencii. Všeobecne ide o komplementárne sekvencie alebo sekvenčné fragmenty kódujúce peptidy podľa vynálezu. Takéto oligonukleotidy sa môžu získať z uvedených sekvencii fragmentáciou atď., alebo chemickou syntézou.

Vynález sa tiež týka syntetických alebo nesyntetických nukleotidových sond schopných hybridizácie s definovanými nukleotidovými sekvenciami, ktoré kódujú polypeptid podľa vynálezu, alebo so zodpovedajúcou mRNA. Takéto sondy sa môžu použiť in vitro ako diagnostický nástroj. Tieto sondy musia byť predbežne značené a to rôznymi technikami, ktoré sú známe v danom odbore. Uvedené sondy sa môžu rovnako použiť na dôkaz a izoláciu aminokyselinových homologických sekvencii kódujúcich polypeptid podľa vynálezu z ďalších bunkových zdrojov.

Ako ilustračný príklad takýchto sond sa môžu uviesť sekvencie SEQ ID n°7 a SEQ ID n°8, ktoré sú použité v ďalej uvedenom príklade 3.

Vynález sa tiež týka farmaceutickej kompozície obsahujúcej ako účinnú látku aspoň jeden definovaný polypeptid.

Predmetom vynálezu je tiež farmaceutická kompozícia obsahujúca ako účinnú látku aspoň jednu protilátku, ktorá bola definovaná, ako aj farmaceutická kompozícia obsahujúca ako účinnú látku aspoň jeden definovaný antimediátorový oligonukleotid.

Inak je predmetom vynálezu tiež farmaceutická kompozícia, v ktorej sú definovaný polypeptid, definovaná protilátka a definovaný oligonukleotid buď vzájomne združené, alebo združené s ďaľšími účinnými látkami.

Kompozície podľa vynálezu sa môžu použiť na modelovanie aktivácie proteínov p21 a takto na modelovanie proliferácie niektorých bunkových typov. Uvedené farmaceutické kompozície sú hlavne určené na liečbu rakovín. Početné rakoviny sú v skutočnosti spojené s prítomnosťou onkogénnych proteínov ras. Z rakovín, pri ktorých sa najčastejšie uplatňujú mutované gény ras, sa môžu uviesť hlavne adenokarcinómy pankreasu, z ktorých 90 % má mutovaný onkogén Ki-ras na dvanástom kodóne (Almoguera a kol., Celí 53 (1988) 549), adenokarcinómy hrubého čreva a rakoviny štítnej žľazy (50 %) alebo rakovinu pľúc a myeloidnej leukémie (30 %, Bos, J.L.CancerRes.49 (1989) 4682).

Predmetom vználezu je tiež použitie opísaných molekúl na modulovanie a dokonca až inhibovanie aktivity proteínov p21. Vynález sa hlavne týka použitia celku alebo častí fragmentu G3BP na interferáciu zo signálmi prenesenými produktmi génov Ras. Uvedené proteínové fragmenty homológne s hnRNP sa výhodne používajú na inhibíciu väzby G3BP s jeho cieľovými RNA. Sekvencie, ktoré sú identické alebo komplementárne s týmito cieľovými RNA, môžu sa rovnako použiť na interferenciu so signálmi prenesenými proteínom G3BP.

Vynález ďalej poskytuje spôsob detekcie expresie a/alebo nadmernej expresie proteínu G3BP v biologickej vzorke. Tento spôsob napríklad zahŕňa uvedenie do styku takej vzorky s protilátkou alebo s fragmentom protilátky podľa vynálezu, vyvolanie komplexov antigén-protilátka a porovnanie získaných výsledkov s výsledkami získanými so štandardnou vzorkou. Pri takomto spôsobe sa môže protilátka použiť v suspenzii alebo sa môže predbežne imobilizovať na nosiči. Tento spôsob môže tiež zahŕňať uvedenie vzorky do styku s nukleotidovou sondou podľa vynálezu, dokázanie získaných hybridov a porovnanie s hybridmi získanými v štandardnej vzorke.

Vynález sa môže použiť z mnohých dôvodov v terapeutickej oblasti: polypeptidy, protilátky a nukleotidové sekvencie podľa vynálezu sú schopné modulovať aktivitu génov ras a skutočne umožňujú intervenovať v procese a rozvoji rakovín. Vzhľadom na ich silnú expresiu v bunkách priečne pruhovaných skeletových svalov intervenujú uvedené peptidy najpravdepodobnejšie pri patologických stavoch súvisiacich so signálnou nedostatočnosťou, z ktorých možno napríklad uviesť diabetes. Iný aspekt vynálezu spočíva v použití nukleotidových sekvencií DNA alebo RNA schopných vstúpiť do interakcie s nárokovanými polypeptidmi. Tieto sekvencie sa môžu pripraviť spôsobom opísaným v medzinárodnej prihláške WO91/19813.

Vynález sa môže tiež použiť v oblasti diagnostikovania a vytypovania rakovín.

Ďalšie výhody vynálezu budú zrejmé z nasledujúcich príkladov a obrázkov, ktoré majú len ilustračný a predmet vynálezu nijako neobmedzujú.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1 ilustruje účinok nadmernej expresie G3BP vo fibroblastoch NIH 3T3 na aktivitu CAT.

Obr. 2 ilustruje účinok nadmernej expresie G3BP vo fibroblastoch NIH 3T3 na tvorbu ložísk indukovaných onkogénmi Src a Ras.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Použité látky a metódy

Všeobecné techniky klonovania

Klasické metódy používané v molekulárnej biológii, akými sú preparatívne extrakcie plazmidovej DNA, odstreďovanie plazmidovej DNA s použitím gradientu chloridu cézneho, elektroforéza na agarózovom alebo akrylamidovm géli, purifikácia fragmentov DNA elektroelúciou, extrakcia proteínov fenolom alebo sústavou fenol-chloroform, vyzrážanie DNA v prostredí soli etanolom alebo izopropanolom, transformácia v Escherichia coli atd’., sú odborníkovi v danom odbore veľmi dobre známe a sú dostatočne opísané v literatúre (Maniatis T. a kol., „Molecular Cloning, a Laboratory Manual“, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982, Ausubel F.M. a kol (ed.) „Current Protocol in Molecular Biology“, John Wiley and Sohn, New York, 1987).

Reštrikčné enzýmy poskytla firma New England Biolabs (Biolabs), Bethesda Research Laboratories (BRL) alebo firma Amersham a sú použité podľa doporučenia dodávateľa.

Plazmid pGEX 2T bol získaný komerčnou cestou.

Enzymatická amplifikácia fragmentov DNA technikou nazvanou PCR (Polymerase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R.K. a kol., Science 230 (1985) 1350-1354, Mullis K.B. a Faloona F.A., Meth. Enzým. 155 (1987) 335-350) sa uskutočňuje pri použití činidla „DNA thermal cycler“ (Perkin Elmer Cetus) podľa doporučenia výrobcu.

Overenie nukleotidových sekvencii sa uskutočňuje metódou vyvinutou Sangerom a kol./Proc.Natl. Acad.Sci.USA, 74 (1977) 5463-5467/ a s použitím súpravy distribuovanej firmou Amersham.

Pri hybridizačných pokusoch sa používajú nasledujúce normálne striangenčné podmienky: hybridizácia 3 x SCC v prítomnosti 5 x Denharťs pri teplote 65 °C, premytie: 0,5 x SSC pri teplote 65 °C.

Príklad 1

Príprava fúznych proteínov glutation-S-transfreráza SH3

Sekvencia DNA kódujúce domény SH3 proteínov GAP (zvyšky 275 až 350) a c-Src (zvyšky 84 až 148) sa amplifikujú technikou PCR a klonujú do expresného vektora pGEX2T medzi reštrikčnými miestami Bam Hl a EcoRI. Takto transformované baktérie sa kultivujú, indukujú s IPTG (1-tio-beta-D-galaktopyranozid) a podrobia sa lýze s použitím ultrazvuku. Fúzne proteíny GST SH3 sa potom purifikujú afinitnou chromatografiou na guľôčkach agaro-glutationu (Pharmacia LKB biotech) a eluujú 10 mM redukovaným glutatiónom.

Príklad 2 (1) Príprava bunkového lyzátu

Bunky ER22 (fibroblasty škrečka superexprimujúce ľudský receptor EGF) alebo bunky NIH 3T3 (exprimujúce pp60 C-Src-F-527) sa kultivujú v prostredí DMEM (Dubelcco's Modiefied Eagle Médium) obohatenom 10 % fetálneho telacieho séra obsahujúceho antibiotikum G418 (200 pm/ml) a mM/Ι glutamínu (5GBICO-BRL) pri teplote 37 °C pod atmosférou obsahujúcou 5 % oxidu uhličitého.

Pri každom pokuse sa bunky ER22 kultivujú na miskách s priemerom 100 ml až do splynutia a potom ešte bez séra počas 18 hodín. Potom sa pridá ortovanadičnan sodný na dosiahnutie finálnej koncentrácie 100 μΜ a v inkubácii sa pokračuje počas ďalších 30 minút. EGF sa potom priamo pridá do uvedeného prostredia na dosiahnutie finálnej koncentrácie 80 nM v priebehu 10 minút a pri teplote 37 °C.

Pri niektorých pokusoch sa mitotické bunky izolujú pôsobením 0,4 pg nocodazolu (SIGMA) počas 18 hodín. Bunky sa potom rýchle premyjú soľným pufrom na báze fosfátu, ochladia na ľade a potom solubilizujú počas 30 minút pri teplote 4 °C v 1 ml pufra na lýzu, HNTG (50 mM Hepes, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 % Tritonu x 100, 10 % glycerolu, 1 mM chloridu horečnatého a 1 mM EDTA v prítomnosti inhibítorov fosfáz (1 mM NaVO₄, 10 Na₄P₂O₇, 10 mM NaF) a inhibítorov proteáz (1 pg/ml leupeptínu, 1 pg/ml inhibítorov trypsínu, 1 pg/ml pepstatínu A, 2 pg/ml aprotinínu, 10 pg/ml benzamidínu, 1 mM fenylmetánsulfonylfluoridu, 1 pg/ml antipainu a 1 pg/ml chymostatínu).

Lyzáty sa dekantujú odstredením pri 15 000 otáčkach za minútu počas 10 minút, a na to sa stanoví koncentrácia proteínov (Bio-rad micro-test).

(2) Test determinujúci priamu väzbu

Sústava tvorená bunkovým lyzátom (200 pg) a imunoprecipitovanými proteínmi sa rozdelí na polyakrylamidovom géli obsahujúcom 7,5 % dodecylsulfátu sodného (SDS-PAGE) a potom zavedú na polyvinylidendifluoridovú membránu (PVDF Millipore Corpo.). Nešpecifická väzba na úrovni filtrov je blokovaná 2 % odstredeným mliekom v PBS obsahujúcim 0,05 % produktu Tween 20 počas 2 hodín pri teplote okolia. Filtre sa potom inkubujú s proteínom GST a proteínmi GST-SH3 v blokačnom pufre počas 12 hodín pri teplote 4 °C. Po premytí PBS-0,05 % Tweenu 20 sa viazané proteíny detegujú následnou inkubáciou s monokloniálnou protilátkou anti-GST (0,25 pg/ml) (Hybridolab Pasteur Inst.), protilátkou anti-souris konjugovanou s alkalickou fosfatázou a produktom firmy PROMEGA komerčne dostupným pod označením „sel 5- bromo-4-chloro-3-indolylphosphate toludiniumnitroblue tetrazolium.“ (3) Porovnávací test

Syntetické peptidy zodpovedajúce sekvenciám (275-305), (299-326), (317-326), (320-350) GAP SH3 alebo putatívna sekvencia dynamínu (RRAPAVPPARPGS) viažuce sa k doméne SH3 sa syntetizujú v zariadení Applied Biosystems 431 A s použitím chémie FMOC.

Protein p68 v purifikovanom stave sa izoluje elektroforézou na polyakrylamid-natriumdodecylsulfátovom géli a prevedie elektroforézou na membránu PVDF. Uvedené membrány sa potom inkubujú s rastúcim množstvom peptidov. Peptid poly-L-prolín (SIGMA) sa použije v množstve 500 μΜ pri kontrolnej reakcii. Po jednohodinovej inkubácii sa ku každému reakčnému prostrediu pridá protein GST-GAP-SH3 (2 gg/ml). Filtráty sa potom sondujú pri použití monoklonálnej látky s anti-GST spôsobom, ktorý už bol opísaný.

(4) Imunoprecipitácia a imunoprenos

Rozpustené bunkové lyzáty (3 mg) sa dekantujú s 50 μ proteín-A-sepharosy CL-4B (Pharmacia Biotech) počas 2 hodín pri teplote 4 °C. Dekantované bunkové lyzáty sa potom inkubujú s monoklonálnou protilátkou antifosfotyrozínom (anticorps monoclonal 4G10-Upstate Biotechnology Incorporated) počas 4 hodín pri teplote 4 °C. Ku komplexu sa potom pridá 50 pg proteín-A-sepharosy a v inkubácii sa pokračuje cez noc pri teplote 4 °C. Imunoprecipitát sa trikrát premyje pufrom HNTG a solubilizuje vo vzorke pufra SDS (100 pg). Komplexy sa potom oddelia pomocou SDS-PAGE a prevedú elektroforézou na membrány PVDF.

Tieto membrány sa potom inkubujú s fosfotyrozínovou monokloniálnou protilátkou v TBS (10 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 3 % sérového bovinného albumínu) a okrem toho inkubujú s druhými protilátkami konjugovanými s alkalickou fosfatázou. Substráty na alkalickú fosfatázu sa potom pridajú na dosiahnutie vhodného zafarbenia.

(5) Purifikácia a analýza sekvencie

Asi 5.10⁹ buniek ER22 sa podrobí lýze vo 200 ml pufra HNTG. Získaný lyzát sa odstredí v priebehu 15 minút pri 15 000 g a potom 5-krát zriedi pufrom HNG (50 mM Hepes, pH 7,5, 150 mM NaCl, 10 % glycerolu, 1 mM EFTA, inhibitory fosfáz a inhibitory proteáz). Tento lyzát sa potom inkubuje cez noc pri použití 6 ml S-Sepharose Fast flow, ktorý je v rovnováhe s rovnakým pufrom. Získaný komplex sa prevedie do kolóny (2,5 x 1,3 cm - IBF). Kolóna sa premyje objemom pufra, ktorý sa rovná desaťnásobku jej objemu a viazané proteíny sa potom eluujú pri rýchlosti elúcie 60 ml za hodinu pri použití lineárneho gradientu 60 ml 0 až 1 M NaCl rovnakého pufra. Frakcia má aktivitu väzby stanovenú pri podmienkach uvedených v príklade 2.2 (0,15 - 0,37 M NaCl) sa zlúči, 10-krát zriedi pufrom HNG a zavedie do produktu Heparine-Sepharose CL-6B (3 ml) (Pharmacia LKB), ktorý bol predbežne uvedený do rovnováhy s rovnakým pufrom pri rýchlosti elúcie 24 ml za hodinu. Po premytí pufrom HNG sa kolóna eluuje pri použití gradientu 24 ml - 0 až 1 M NaCl. Aktívna frakcia chromatografie S Sepharose Fast Flow sa zlúči, zriedi štyrikrát v pufre MES (100 mM MES, pH 6,8, 1 mM MgSO₄, 1 mM EGTA) a zavedie na stĺpec ATP agarózy (3 ml) (Sigma N°A9264), ktorá bola predbežne uvedená do rovnováhy s pufrom MES obsahujúcim 50 mM NaCl, pričom sa elúcia uskutočňuje pri prietoku 6 ml za hodinu. Kolóna sa potom premyje 20 ml pufra MES obsahujúceho mM NaCl a eluuje pri rýchlosti elúcie 30 ml za hodinu a pri použití lineárneho gradientu 50 mM až 20 mM NaCl v pufri MES. K elúcii proteínu p68 prichádza medzi 0,3 a 0,4 M NaCl. Aktívna frakcia sa zlúči, dialyzuje pri použití 20 mM NH₄HCO_1? pH 8,3 a zahustí. Proteíny zahustené do sucha sa opätovne resuspendujú v pufri SDS a separujú elektroforézou na polyakrylamidovom géli. Gél sa zafarbí kumasovou modrou a pás s molekulovou hmotnosťou 68 kDA, ktorý zodpovedá väzbovej aktivite SH3, sa izoluje. Tento pás sa premýva počas jednej hodiny nasledujúcimi tekutými podielmi: voda, zmes vody a metanolu v objemovom pomere 90 : 10, zmes vody a CH₃CN v objemovom pomere 80 : 20 a zmes vody a CHjCN v objemovom pomere 50 : 50.

Pás gélu obsahujúci purifikovaný protein p68 sa potom rozdelí na malé fragmenty a vysuší sa prostriedkom SPEED/VAC (Savant). Pridá sa 400 μΐ roztoku obsahujúceho 25 mM Tris pH 8,5, 1 mM EDTA, 0,05 % SDS a 5 pg endoproteinázy Lys-c (Boehringer Mannheim) a celý podiel sa inkubuje cez noc pri teplote 37 °C. Získaný hydrolyzát sa potom injikuje na kolónu vysokotlakovej kvapalinovej chromatografie s inverznou fázou (Vydac C18 : 2,1 x 250 mm). Kolóna sa potom eluuje pri rýchlosti prietoku 0,2 ml/min. pri použití lineárneho gradientu 0 až 35 % B počas 150 minút. (A: H₂O+TFA 0,007 % a B: CH₃CN+TFA 0,07 %) a elučné piky pozorované pri 113,7, 117,7 a 133,7 minúty sa izolujú a priamo sekvenujú pri použití mikrosekvenzora Applied Biosystems 477A. Sekvencie peptidov, ktoré boli takto získané, sú ďalej označené ako SEQ ID n°l, SEQ ID n°2, SEQ ID n°3 a SEQ ID n°4. Tieto sekvencie nemajú žiadnu homológiu s proteínmi uvedenými ako referenčné subjekty v bázach proteínových hodnôt (PIR 33, Swiss-Prot 33 (intelligenetics)).

Na účely stanovenia skutočnosti, že protein p68 je fosforylovaný na úrovni tyrozínu v mitotických alebo nesynchrónnych bunkách, sa proteíny lyzátov prechádzajúcich z buniek ER22 kultivovaných v 10 % fetálnom teľacom sére alebo buniek ošetrených nocodazalom imunoprecipitujú pri použití anti-fosfotyrozínových protilátok, prevedú na membránu a/alebo imunodetegujú pri použití anti-fosfotyrozínových protilátok, alebo inkubujú s GST-GAP-SH3 pri podmienkach opísaných v príkladoch 2.2 a 2.4.

Ako kontrolné pokusy sa proteíny buniek NIH 3ST transformované s alelou aktivovanou c-Src (c-Src Y527F) testujú pri rovnakých podmienkach, aké boli opísané pre proteíny ER22. Získané výsledky ukazujú, že proteíny sú fosforylované na úrovni tyrozínu, hlavne v oblasti 60-70 kDA. V bunkách ER22 nebola detekovaná žiadna väzba k fosforylovanému proteínu p68 sondami GST-GAP-SH3 alebo GST-Src-SH3. V bunkách NIH3T3 (c-Src Y527F) sa sonda GST-Src-SH3 viaže k proteínu s molekulovou hmotnosťou 68 kDA fosforylovanému v tyrozíne, zatiaľ čo sonda GST-GAP-SH3 nevstupuje do interakcie so žiadnym proteínom.

Na účely potvrdenia funkčnej implikácie uvedeného proteínu v rámci signalizačnej cesty ras boli vykonané kompetitívne pokusy pri podmienkach opísaných v príklade 2.3. Získané výsledky ukazujú, že peptidy odvodené od GAP schopných blokovať pretrhnutie zárodočných mechúrikov xenopových vajíčok (GVBD) indukované signálom ras, t. j. peptidy (299-326) a (317-326) GAPSH3 sú rovnako schopné blokovať interakciu medzi proteínom G3BP a GAP.

Uvedené výsledky jednoznačne potvrdzujú, že schopnosť blokovať aktivitu proteínu podľa vynálezu alebo vstupovať do interakcie s jeho aktivitou predstavuje nový, zvlášť sľubný prístup k liečeniu rakoviny.

Príklad 3

Izolácia ľudskej sekvencie SEQ ID n°6 z banky cDNA ľudskej placenty

V rámci tohto príkladu sa použijú sondy SEQ ID n°7 a SEQ ID n°8, získané z peptidových sekvencii SEQ ID n°l a SEQ ID n°3. DNA z banky Clonetech HL1008B bola pripravená a použitá pri reakcii PCR. Pri nasledujúcich podmienkach sa vykonalo 30 amplifikačných cyklov: denaturácia počas 1 minúty pri teplote 94 °C, párovanie počas 1 minúty pri teplote 34 a 40 °C a elongácia počas 1 minúty pri teplote 72 °C. Táto rekcia umožňuje izolovať fragment DNA s dĺžkou 1,3 kb, ktorého časť sekvencie je daná v SEQ ID n°6. Analýza na Northen Blote ukazuje, že zodpovedajúca RNA (3,3kb) je ubikvistná a silne exprimovaná v dospelom skeletovom svale.

Príklad 4

Izolácia sekvencie SEQ ID n°10 kódujúca ľudský p68 z banky DNAc ľudskej placenty

V rámci tohto príkladu sa použijú oba nukleotidy (SEQ ID n°7) a (SEQ ID n°8) ako zárodky na amplifikáciu cDNA v banke ľudskej placenty. Reakcia PCR sa uskutočnila vďaka sústave Amplitag Perkin Elmer pri anelačnej teplote 35 °C a nasledujúcou 1 minútovou extenziou pri teplote 72 °C v prítomnosti 10 percent formamidu. Bol amplifikovaný fragment DNAc s dĺžkou 1 164 bp. Po priamom klonovaní do vektora pMOSblue (Amersham) obsahujúcom sekvenciu -20 a inverznú sekvenciu bol fragment sekvenovaný pri použití fluorescentných sond. Tento fragment PCR sa potom použil ako sonda na skríning 10⁶ fágov banky lambda gtll cDNA ľudskej placenty (Clontech). Sonda bola syntetizovaná systémom Rediprime od firmy Amersham a filtre boli inkubované 16 hodín v hybridizačnom pufri (6X SSC, 5X Denhardťs, 100 pg/ml lososích spermií, 0,25 % SDS) obsahujúcim uvedenú sondu pri teplote 45 °C. Filtre sa potom premývajú počas 1 hodiny pri teplote okolia a počas 20 minút pri hybridizačnej teplote pri použití činidla 2X SSC, 0,05 % SDS. Identifikovalo sa 8 pozitívnych klonov. Dva z nich sa purifikovali a cDNA boli štiepené pomocou EcoRI na účely uvoľnenia inzertov. Tieto boli subklonované v M13mpl8/EcoRI na účely sekvenovania. Toto sekvenovanie sa vykonalo na fragmentoch pochádzajúcich z progresívnej delécie exonukleázou III cDNA (Nested Deletion Kit, Pharmacia Biotech). Rozdiely veľkosti fragmentov sa analyzovali amplifikáciou PCR medzi zárodkami -20 a revers vektora mM13 a na sekvenovanie sa zvolili populácie s rozdielnou veľkosťou. Zostavenie rôznych získaných sekvencii umožnilo rekonštitúciu celej otvorenej fázy P68.

Príklad 5

Superexpresia G3BP vo fibroblastoch NIH 3T3

Fibroblasty NIH 3T3 transfektujú reportérovým génom, ktorým je gén z chloramfenikolacetyltransferázy, vloženým pod kontrolu prvkov odozvy na Ras odvodeným od enhanceru vírusu polyómu. Tieto prvky sa stimulujú 15 až 30-krát v prípade, že bunky sú transfektované expresným vektorom nesúcim DNAc onkogénov Src a Ras. Tieto stimulácie sú realizované, keď je proteín G3BP exprimovaný po kotransfekcii expresného vektora obsahujúceho cDNA, ktorá zodpovedá otvorenej fáze proteínu. G3BP inhibuje dávkovo závislým spôsobom aktivitu CAT stimulovanú Src a onkogénnou formou Ras. Toto pozorovanie je graficky zobrazené na obr. 1.

Rovnakým spôsobom expresia proteínu G3BP oponuje tvorbe ložísk indukovanej onkogénmi Src a Ras. Toto pozorovnie je ilustrované na obr. 2.

Uvedené pokusy zreteľne dokazujú schopnosť G3BP oponovať proliferačným účinkom signálov prenášaných normálnymi alebo onkogénymi proteínmi Ras.

Zoznam sekvencii

Informácia o sekvencii SEQ ID n°l

Charakteristika sekvencie:

dĺžka: 19 aminokyselín typ: aminokyselinový konfigurácia: lineárna

Typ molekuly : proteín

Pôvod: škrečok

Opis sekvencie: SEQ ID n°l:

Val Met Glu Lys Pro Ser Pro Leu Leu Val Gly Arg Glu Phe Val

10 15

Arg Gin Tyr íle

Informácia o sekvencií SEQ ID n°2

Charakteristika sekvencie:

dĺžka: 15 aminokyselín typ: aminokyselinový konfigurácia: lineárna

Typ molekuly: proteín

Pôvod: škrečok

Ďalšie informácie: prvá Xaa reprezentuje motív buď alanínu, alebo treonínu a druhá Xaa reprezentuje ľubovoľnú aminokyselinu

Opis sekvencie : SEQ ID n°2

Xaa Xaa Glu Gly Asp Asp Arg Asp Asn Arg Leu Leu Gly Pro

5 10 ¹⁵

Informácia o sekvencií SEQ ID n°3

Charakteristika sekvencie:

dĺžka: 17 aminokyselín typ: aminokyselinový konfigurácia: lineárna

Typ molekuly: proteín

Pôvod: škrečok

Opis sekvencie: SEQIDn°3:

Leu Pro Asn phe Gly Phe Val Val Phe Asp Asp Ser Glu Pro Val ¹ 5 10 15

Gin Lys

Informácia o sekvencií SEQ ID n°4

Charakteristika sekvencie:

dĺžka: 19 aminokyselín typ: aminokyselinový konfigurácia: lineárna

Typ molekuly: proteín

Pôvod: škrečok

Opis sekvencie: SEQ ID n°4:

Ser Ala Thr Pro Ala Pro Ala Asp Val Ala Pro Ala Gin Glu Asp ¹ 5 10 15

Arg Xaa Phe

Informácia o sekvencií SEQ ID n°5

Charakteristika sekvencie:

SK 287034 Β6 dĺžka: 68 aminokyselín typ: aminokyselinový konfigurácia: lineárna

Typ molekuly: proteín

Pôvod: človek

Opis sekvencie: SEQIDn°5:

Arg

Glu

Ala

Gly

Glu

Gin

Gly

Asp

íle

Glu

Pro

Arg

Met

Val

1

5

10

15

Arg

His

Pro

Asp

Ser

His

Gin

Leu

Phe

íle

Gly

Asn

Leu

Pro

His

20

25

30

Glu

Val

Asp

Lys

Ser

Glu

Leu

Lys

Asp

Phe

Gin

Ser

Tyr

Gly

35

40

45

Asn

Val

Glu

Leu

Arg

íle

asn

Ser

Gly

Pro

Lys

Leu

Pro

Asn

50

55

60

Phe

Ala

Phe

Val

Phe

Asp

65

Informácia o sekvencii SEQ ID n°6 Charakteristika sekvencie: dĺžka: 204 párov báz typ: nukleová kyselina počet reťazcov:dvojitý konfigurácia: lineárna

Typ molekuly: cDNA hypotetická: nie antimediátorová: nie

Pôvod: človek

Opis sekvencie: SEQ ID n°6:

CGTGAGGCTG	GTGAGCAAGG	TGACATTGAA	CCCCGAAGAA	TGGTGAGACA	CCCTGACAGT	60
CACCAACTCT	TCATTGGCAA	CCTGCCTCAT	GAAGTGGACA	AATCAGAGCT	TAAAGATTTC	1 20
TTTCAAAGTT	ATGGAAACGT	GGTGGAGTTG	CGCATTAACA	GTGGTGGGAA	ATTACCCAAT	130
TTCGCCTTCG	TCGTCTTCGA	TGAT				204

Informácia o sekvencii SEQ ID n°7

Charakteristika sekvencie: dĺžka: 32 párov báz typ: nukleová kyselina počet reťazcov: jednoduchý konfigurácia: lineárna

Typ molekuly: cDNA hypotetická: nie antimediátorová: nie Pôvod: človek

Opis sekvencie: SEQ ID n°7:

GTIATGGAIA AICCITCCCC ICTICTIGTIGG

Informácia o sekvencii SEQ ID n°8

Charakteristika sekvencie:

dĺžka: 26 párov báz typ: nukleová kyselina počet reťazcov: jednoduchý konfigurácia: lineárna

Typ molekuly: cDNA hypotetická: nie antimediátorová: nie

Pôvod: človek

Opis sekvencie: SEQ ID n°8:

GAATCATCGA AIACIACGAA ICCGAA

Informácia o sekvencií SEQ ID n°9

Charakteristika sekvencie:

dĺžka: 466 aminokyselín typ: aminokyselinový počet reťazcov: jednoduchý konfigurácia: lineárna

Typ molekuly: peptid

Opis sekvencie: SEQ ID n°9:

Met 1	Val	Met Glu	Lvs 5'	Pro Ser Pro	Leu Leu val Gly Arg Glu Phe Val
10	15
Arg	Gin	Tyr	Tyr	Thr	Leu Leu Asn	Gin	Ala Pro	Asp	Met	Leu His Arg
			20			25				30
Phe	Tyr	Glv	Lys	Asn	Ser Ser Tyr	Val	His Gly	Gly	Leu	Asp Ser Asn
		35			40				45
Gly	L.vs	Pro	Ala	Asp	Ala Val Tyr	Gly	Gin Lys	Glu	íle	His Arg Lys
	5Ô				55			60
Val	Met	Ser	Gin	Asn	Phe Thr Asn	Cys	His Thr	Lys	íle	Arg His Val
65					70		75			80
Asp	Ala	His	Ala	Thr	Leu Asn Asp	Gly	Val Val	Val	Gin.	Val Met Gly
				85			90			95
Leu	Leu	Ser	Asn	Asn	Asn Gin Ala	Leu	Arg Arg	Phe	Met	Gin Thr Phe
			100			105				110
Val	. Leu	, Ala	. Pro	Glu	Gly Ser Val	Ala	Asn Lys	Phe	Tyr	Val His Asn
		115		120				125
Asp	íle	Arg	Tyr	Gin	Asp Glu Val	Phe	Cly Gly	Phe	Val	Thr Glu Pro
	130				1 35			1 40
Gin	Glu	Glu	Ser	Glu	Glu Glu Val	Glu	Glu Pro	Glu	Glu	Arg Gin Gin
145					1 SO		155			150
Thr	Pro	Glu	val	Val	Pro Asp Asp	Ser	Glv Thr	Phe	Tyr	Asp Gin Ala
				1 65			170			175
Val	Val	Ser	Asn	Asp	Met Glu Glu	His	Leu Glu	Glu	Pro	Val Ala Glu
			180			185				190
Pro	Glu	Pro	Asp	Pro	Glu Pro Glu	Pro	Glu Gin	Glu	Pro	Val Ser Glu
		195			200				205
íle	Gin	Glu	Glu	Lys	Pro Glu Pro	Val	Leu Glu	Glu	Thr	Ala Pro Glu
	210				215			220
Asp	Ala	Gin	Lys	Ser	Ser Ser Pro	Ala	Pro Ala	Asp	íle	Ala Gin Thr
225					230		235			240

Val

Gin Glu

Aso Leu Arg 245

Thr

Phe

Ser

Trn 25Ó

Ala Ser

Val

Thr

Ser 255

Lys

Asn

Leu

Pro

Ser

Gly

Ala

Val

Pro

Val

Thr

Gly

Ile

Pro

H1S

260

265

270

Val

Lvs

val

Pro

Ala

Ser

Glr.

Pro

Arg

Pro

Glu

Ser

Lys

Pro

Glu

275

230

285

Ser

Gin

Ile

Pro

Gin

Arg

Pro

Gin

Arg

Asp

Glr.

Arg

Val

Λ-

Glu

290

295

300

Gin

Arg

Ile

Asn

Ile

Pro

Gin

Arg

Gly

Pro

Arg

Pro

Ile

Arg

Glu

305

310

• ·“

315

3 20

Ala

Gly

Glu

Gin

Gly

Asp

íle

Glu

Pro

Arg

Met:

Val

Arg

His

Pro

325

330

335

Asp

Ser

His

Gin

Leu

Phe

Ile

Gly

Asn

Leu

Pro

His

Glu

Val

Asp

Lys

340

345

350

Ser

Glu

Leu

Lys

Asp

Phe

Gin

Ser

Tyr

Gly

Asn

Val

Glu

Leu

355

360

365

Arg

Ile 370

Asn

Ser

Gly Gly

Lvs 375

Leu Pro

Asn

Phe Glv 380

Phe Val

val Phe

Asp

Ser

Glu

Pro Val

Gin

Lys

val

Leu

Ser Asn

Arg

Ile Met

385

350

355

400

Phe

Arg

Gly

Glu

Val Arg

Leu

Asn

Val

Glu

Glu Lys

Lys

*r»v -

Arg Ala

405

410

41 5

Ala

Arg

Glu

Glv

Asp Arg

Arg

Asp

Asn

Arg

Leu Arg

Gly

Gly Gly

420

425

430

Pro

Arg

Gly

Leu Glv

Gly

Met

Arg

Gly Pro

Pro

Arg

Gly Gly

435

440

445

Met

Val

Gin

^T-ys

Pro Gly

Phe

Gly

Val

Gly

Arg Gly

Leu

Ala

Pro Arg

450

455

460

Gin Glx

465

Informácia o sekvencii SEQ ID n°10 5 Charakteristika sekvencie: dĺžka: 2 129 párov báz typ: nukleotid počet reťazcov: jednoduchý konfigurácia: lineárna 10 Typ molekuly: cDNA hypotetická: nie

Opis sekvencie: SEQ ID n°10:

GCTTGCCTGT	CAGGTCGACT	CTAGAGCCCG	GGTACCGAGC	TCGAATTCGG	CGGGGTTTGT	60
ACTATCCTCG	GTGCTGTGGT	GCAGAGCTAG	TTCCTCTCCA	GCTCAGCCGC	GTAGGTTTGG	1 20
ACATATTTAC	TCTTTTCCCC	CCAGGTTGÄA	TTGACCAAAG	CAATGGTGAT	GGAGAAGCCT	180
AGTCCCCTGC	TGGTCGGGCG	GGAATTTGTG	AGACAGTATT	ACACACTGCT	GAACCAGGCC	240
CCAGACATGC	TGCATAGATT	TTATGGAAAG	AACTCTTCTT	ATGTCCATGG	GGGATTGGAT	300
TCAAATGGAA	AGCCAGCAGA	TGCAGTCTAC	GGACAGAAAG	AAATCCACAG	GAAAGTGATG	360

SK 287034 Β6

TCACAAAACT	TCACCAACTG	CCACACCAAG	ATTCGCCATG	TTGATGCTCA	TGCCACGCTA	420
AATGATGGTG	TGGTAGTCCA	GGTGATGGGG	CTTCTCTCTA	ACAACAACCA	ggctttgagg	430
AGATTCATGC	AAACGTTTGT	CCTTGCTCCT	GAGGGGTCTG	TTGCAAATAA	ATTCTATGTT	540
CACAATGATA	TCTTCÄGATA	CCAAGATGAG	GTCTTTGGTG	GGTTTGTCAC	TGAGCCTCAG	600
GAGGAGTCTG	AAGAAGAAGT	AGAGGAACCT	GAAGAAAGCA	GCAAACACCT	GAGGTGGTA C	650
CTGATGATTC	TGGAACTTTC	TATGATCAGG	CAGTTGTCAG	TAATGACATG	GAAGAACATT	720
TAGAGGAGCC	TGTTGCTGAA	CCAGAGCCTG	ATCCTGÄACC	AGAACCAGAA	CAAGAACCTG	730
TATCTGAAAT	CCAAGAGGAA	AAGCCTGAGC	CAGTAITAGA	AGAAACTGCC	CCTGAGGATG	840
CTCAGAAGAG	TTCTTCTCCA	GCACCTGCAG	ACATAGCTCA	GACAGTACAG	GAAGACTTGA	900
GCACATT-TC	TTGGGCATCT	GTGACCAGTA	AGAATCTTCC	ACCCAGTGGA	GCTGTTCCAG	960
TTACTCGGAT	ACCACCTCAT	GTTGTTAAAG	TACCAGCTTC	ACAGCCCCGT	CCAGACTCTA	t C 20
AGCCTGAATC	TCAGATTCGA	CCACAAAGAC	CTCAGCGGGA	TCAAAGAGTG	CGAGAACÄAC	oso
GÄATAAATAT	TCCTCCCCAA	AGGGGACCCA	GACCAATCCG	TGAGGCTGGT	GAG>_AAG>j - G	1 1 40
ACATTGAACC	CCGAAGAATG	GTGAGACACC	CTGACAGTCA	CCAACTCTTC	ATTGGCAACC	1 200
TGCCTCATGA	ΑστασΑϋΑΑΑ	TCAGAGCTTA	AAGATTTCTT	TCAAAGTTAT	GGAAACGTG<j	i 260
TGGAGTTGCG	CATTAACAGT	GGTGGGAAAT	TACCCAATTT	rGCT-TTCTT	ctctľcgatg	1 3 20
ATTCTGAGCC	TGTTCAGAAA	GTCCTTAGCA	ACAGGCCCAT	CATGTTCAGA	GG'ľGAG'jICC	1 380
GTCTGAATGT	CGAAGAGAAG	AAGACTCGAG	CTGCCAGGGA	AGGGGACCGA	CGAGAGA-AIC	i 440
GCCTTCGGGG	ACCTGGAGGC	CCTCGAGGTG	GGCTGGGTGG	TGGAATGAGA	GGCCCľCCCC	1 500
GTGGAGGCAT	GGTGCAGAAA	CCAGGATTTG	GAGTGGGAAG	GGGGCTľGCG	CCACGGCAGT	1560
AATCTTCATG	GATCTTCATG	CAGCCATACA	AACCCTGGTT	CCAACAGAAT	GGTGAA'T'ľ'ľT	1 620
CGACAGCCTT	TGGTATCTTG	GAGTATGACC	CCAGTCTGTT	ATAAACTGCT	TAAGTTTGTA	1 630
TAATTTTACT	TTTTTTGTGT	GTTAATGGTG	TGTGCTCCCT	ctccctctct		1 740
GACCTTTAGT		CAATTTTGTG	GAATGATATT	TTAGGAATAA	CGGAC «Τ -*GA	1 300
CCCGAATTCG	TAATCATGGT	CATAGCTGTT	TCCGTGTGAA	ATTGTTATCC	GCTCACAATT	1 3S0
CCACACAACÄ	TACGAGCCGG	AAGCATAAAG	TGTAAAGCCT	GGGGTGCCTA	ATGAGTGAGC	1 920
TAACTCACAT	TAATTGCGTT	GCGCTCACTG	CCCGCTTTCC	AGTCGusj AAA	CCTGTCGTGC	1 980
CÄGCGCATTA	ATGAATCGGC	CAACGCGCGG	GGAGAGGCGG	TTTGCGTATT	GGGC GC CAGG	2040
GTGGTTTTCT	TTTCACCAGT	GAGACGGGCA	ACAGCTGATT	GGGGTTCACC	/•.T’z'	2 ! 00
AGAGAGTTGC	AGCAAGCGGT	CCACGCTGG				2129

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Polypeptid schopný interakcie s doménou SH3 proteínu GAP, vyznačujúci sa tým, že obsahuje peptidovú sekvenciu vybranú zo sekvencií SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 a SEQ ID NO: 9.

10 2. Polypeptid podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že obsahuje SEQ ID NO: 1, SEQ ID

NO: 2, SEQ ID NO: 3 a/alebo SEQ ID NO: 4.

3. Polypeptid podľa niektorého z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že má molekulová hmotnosť 68 kDA.

4. Polypeptid podľa nároku 1 alebo 3, vyznačujúci sa tým, že je ľudského pôvodu.

5. Polypeptid podľa nároku 4, vyznačujúci sa tým, že obsahuje sekvencie SEQ ID NO: 5 a SEQ ID NO: 9.

6. Polypeptid podľa nároku 1, 4 alebo 5, vyznačujúci sa tým, že je reprezentovaný sekvenciou SEQ ID NO: 9.

7. Polypeptid podľa niektorého z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že sa jeho tyrozínové motívy nefosforylujú v mitotických bunkách alebo v bunkách v štádiu rastu.

8. Protilátka alebo fragment protilátky, vyznačujúci sa tým, že je nasmerovaný proti sekvencií vybranej zpeptidových sekvencií, ktoré sú znázornené v SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 a SEQ ID NO: 9.

9. Protilátka alebo fragment protilátky podľa nároku 8, vyznačujúce sa tým, že majú schopnosť inhibovať interakciu medzi proteínom GAP a polypeptidom podľa niektorého z nárokov 1 až 7.

10. Nukleová kyselina, vyznačujúca sa tým, že obsahuje

a) sekvenciu SEQ ID NO: 6 a SEQ ID NO: 10 alebo jej komplementárne reťazce, a

b) sekvencie odvodené od sekvencií a) v dôsledku degenerácie genetického kódu.

11. Nukleová kyselina podľa nároku 10, vyznačujúca sa tým, že obsahuje sekvenciu SEQ ID NO: 6.

12. Nukleová kyselina podľa nároku 10 alebo 11,vyznačujúca sa tým, že je znázornená v SEQ ID NO: 10.

13. Použitie nukleovej kyseliny podľa niektorého z nárokov 10 až 12 na diagnózu génových anomálií.

14. Farmaceutická kompozícia, vyznačujúca sa tým, že obsahuje ako účinnú látku aspoň jeden polypeptid podľa niektorého z nárokov 1 až 7 a/alebo protilátku alebo fragment protilátky podľa nároku 8 alebo 9.

15. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 14 určená na moduláciu aktivity proteínu p21.

16. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 14 určená na liečenie rakovín.

17. Použitie protilátky alebo fragmentu protilátky podľa nároku 8 na detekciu expresie a/alebo subexpresie polypeptidu podľa niektorého z nárokov 1 až 7.

18. Použitie polypeptidu podľa niektorého v nárokov 1 až 7 na prípravu liečiva určeného na interferenciu so signálmi prenesenými produktmi génov Ras.

2 výkresy