HU221410B1

HU221410B1 - Polypeptides capable of binding to the gap protein sh3 domain, nucleotide sequences coding thereof, preparation and use thereof

Info

Publication number: HU221410B1
Application number: HU9702079A
Authority: HU
Inventors: Marc Duchesne; Didier Faucher; Fabienne Parker; Fabien Schweighoffer; Bruno Tocque
Original assignee: Rhone Poulenc Rorer Sa
Priority date: 1994-11-22
Filing date: 1995-11-22
Publication date: 2002-09-28
Also published as: AU713937B2; SK62997A3; DE69534471D1; EP0793721A1; FI972170A; WO1996016169A1; IL116026A; FI972170A0; IL116026A0; EP0793721B1; CA2204438A1; NO972313L; JP2006122049A; CZ154597A3; ATE305037T1; HUT77029A; US5886150A; MX9703364A; CZ292538B6; JPH10509044A

Abstract

A találmány olyan polipeptidekre vonatkozik, melyek képesekkölcsönhatásba lépni a GAP protein SH3 doménjével, és ezáltalbefolyásolni a ras géntermékek jelátvitelét. A találmány vonatkozik azezen polipeptideket kódoló DNS szekvenciákra, a polipeptidek elleniantitestekre, a polipeptidek termelődését gátló antiszensznukleinsavakra, valamint az ezen vegyületeket tartalmazógyógyszerkészítményekre is. A fenti vegyületek hasznosak lehetnekkülönböző rákok vagy jelátvitellel kapcsolt betegségek kezelésében,tipizálásában, kimutatásában. ŕ

Description

A találmány tárgyát új polipeptidek és nukleotid-szekvenciák és ezek gyógyászati alkalmazása képezi. Részletesebben a találmány a GAP proteinek SH3 doménjéhez kötődni képes polipeptidekre vonatkozik.

A ras gének termékei, melyeket általában p21-gyel jelölnek, minden vizsgált eukarióta szervezetnél kulcsszerepet játszanak a sejtosztódás szabályozásában. Ezen fehérjék bizonyos módosítások hatására elvesztik normális szabályozottságukat és onkogénekké válnak, így számos humán tumor kötődik módosított ras gének jelenlétéhez. Ráadásul ezen p21 fehérjék szuppressziója a sejtosztódás szabályozottságának elvesztéséhez vezethet. Mindent összevéve a p21 proteinek a humán rákok 30%-ában játszanak szerepet.

A p21 fehérjék pontos szerepének megértése tehát az onkológia területén végzett kutatások egyik célja.

A modell, melyet a p21 fehérjék működésének magyarázatára javasolunk, azon az analógián alapszik, melyet a p21 fehérjék a transzdukció G proteinjeivel mutatnak. A sejtekben az aktív, GTP-hez kötött p21 fehérjék, és az inaktív, GDP-hez kötött formák között egyensúly áll fenn. Egy adott sejtben, ahol a p21 fehérjék nincsenek aktiválva, ezek nagy része GDP-hez kötött formában van jelen. Ha a sejtet stimulálják, a nukleotid kicserélődési faktor (GEF) aktívabbá válik, és megkönnyíti a GDP kiürülését és GTP-vel való helyettesítését. A fehérje ekkor egy aktív konformációt vesz fel, ami lehetővé teszi számára azt, hogy effektorát, a GAP „GTPáz aktiváló proteint” felismerje és aktiválja, amely utóbbi valószínűleg más fehérjékkel kapcsolódik. A p21GTP-GAP komplex valószínűleg egy vagy több másik fehérjével lép kölcsönhatásba, és ez így lehetővé teszi a jelátvitelt, ami a sejt biológiai válaszához vezet. A p21GTP GAP-pal való kapcsolódása egyidejűleg a GTP hidrolízisét, és a p21 inaktív formába való visszatérését indítja be.

Az onkogén p21 fehérjék esetében a hordozott mutáció meggátolja az inaktív állapotba való visszatérést. Ebben az esetben az egyensúly a p21 aktív formája felé tolódik el.

Ezt a p21 aktív és inaktív formája közötti összetett egyensúlyt mind a p21 fehérje biokémiai tulajdonságaival együtt járó faktorok (a GDP-hez és a GTP-hez való relatív affinitás, nukleotid kicserélődési sebesség,...), mind külső aktivitás szabályozó faktorok, mint például a GAP, kontrollálják.

A GAP fehérje egy minden eukarióta szervezetben jelenlevő citoszol protein, amely tehát rendelkezik azzal a képességgel, hogy a GTP normál p21 fehérével kapcsolt hidrolízisét nagymértékben meggyorsítsa [Trahey és Mc Cormick, 1987]. Két, különböző funkciókért felelős doménje van. Karboxi-terminális vége hordozza a p21 proteint kötő, és annak GTPáz aktivitását megnövelő katalitikus aktivitást. Másik végén, az amino-terminális résztől lefelé található egy kapcsolt SH2 és SH3 dómén, melyek más fehérjékkel való kölcsönhatásokért felelősek.

Jelenleg két fehérjét ismerünk, melyek kölcsönhatásba lépnek a GAP proteinnel. Ezek a 62 kD-os p62 és a 190 kD-os pl90 fehérjék. Ez a két fehérje a GAP különböző epitópjai elleni antitestekkel történt immunprecipitálás alapján nyilvánvalóan egy specifikus komplexet alkot a GAP-pal. Tudjuk, hogy az SH2 régió területe az, ahol a p62 protein és a GAP protein közötti kölcsönhatás létrejön.

Ami az SH3 domént illeti, különböző fehérjékben való jelenléte, mint például a foszfolipáz Cy, a foszfatidil-inozitol 3-kináz p85 alegysége és a grb-2 protein, melyek mind a p21-Ras jelátvitelben játszanak szerepet, azt sugallja, hogy ez a dómén különösen fontos a fehérje-fehérje kölcsönhatások szabályozásában, és így a megfelelő protein működéséhez és/vagy sejten belüli lokalizációjához szükséges. A GAP protein esetében tehát ez az SH3 dómén szintén a Ras jelátvitelben vehetne részt. Világos, hogy az SH3 dómén pontos szerepének megértése különösen nagy értékű lenne terápiás területen.

A találmány célja éppen az, hogy hozzájáruljon az SH3 dómén ras jelátvitelben való részvételének tisztázásához.

Vizsgálataink során kimutattuk, hogy vannak olyan proteinek, melyek képesek a GAP proteinnel kapcsolódni egy, az SH3 doménnel való közvetlen kötés útján.

Részletesebben a találmány a GAP protein SH3 doménjével kapcsolódni képes fehérjék azonosításának, izolálásának és jellemzésének, valamint ezen fehérjéknek a megfelelő peptidszekvenciák azonosítása útján való strukturális jellemzésének eredménye.

Részletesebben a találmány szerinti polipeptid, amely képes kölcsönhatásba lépni a GAP protein SH3 doménjével, az 1., a 2., a 3., a 4., az 5. vagy a 9. számú szekvenciák közül választott peptidszekvenciát, vagy annak egy származékát tartalmazza részben vagy egészében.

A találmány keretein belül a származék kifejezés minden olyan molekulát jelöl, amelyet a találmány szerinti polipeptid genetikai és/vagy kémiai természetű módosításával kaptak, és amely megőrzi a vizsgált aktivitást. Genetikai és/vagy kémiai természetű módosításon kell értenünk minden mutációt, szubsztitúciót, deléciót, addíciót és/vagy egy vagy több gyök megváltoztatását. Ezeket a származékokat különböző célokkal hozhatják létre, például a peptid kölcsönhatási helyéhez való affinitásának megnövelésére, termelődés! szintjének javítására, proteázokkal szembeni rezisztenciájának megnövelésére, terápiás hatékonyságának megnövelésére vagy másodlagos hatásainak csökkentésére, vagy új farmakokinetikai és/vagy biológiai tulajdonságok kialakítására.

Szó lehet az előzőekben felsorolt szekvenciák és származékaik fragmentumairól is. Ezeket a fragmentumokat különböző módon kaphatjuk meg. Például szintetizálhatjuk azokat kémiai úton, az 1. ábrán megadott szekvencia alapján, a szakember számára ismert peptidszintetizáló berendezéseket alkalmazva. Szintetizálhatjuk azokat genetikai úton is, a vizsgált peptidet kódoló nukleotid szekvenciának egy gazdasejtben való kifejezésével. Ebben az esetben a nukleotid szekvenciát kémiai úton állíthatjuk elő oligonukleotid szintetizátort alkalmazva, a leírásban megadott peptidszekvencia

HU 221 410 Bl és a genetikai kód alapján. A nukleotid-szekvenciát a leírásban megadott szekvenciából kiindulva enzimatikus hasításokkal, ligálással, klónozással, stb. is előállíthatjuk, szakember számára ismert módszerekkel, vagy DNS-bankoknak az 1. számú szekvencia alapján kidolgozott szondákkal való szűrésével.

A találmány egyik megvalósítási módja szerint a kívánt polipeptid az 1., a 2., a 3. és/vagy a 4. számú szekvenciát tartalmazza.

A találmány szerinti polipeptid előnyösen 68 kD-os molekulatömeggel rendelkezik.

A találmány egy különleges megvalósítása esetében humán eredetű polipeptidről van szó, amely az 5. vagy a 9. számú szekvenciának vagy azok egy előzőkben definiált származékának egy részét vagy egészét tartalmazza.

Különösen egy 5. számú szekvenciát tartalmazó polipeptidről van szó.

Előnyösen a 9. számú szekvencia által képviselt polipeptidről vagy annak egy származékáról van szó.

Váratlan módon ez a fehérje nem homológ más, már azonosított p68 proteinekkel, mint amilyen például az Src SH3 doménjéhez kapcsolódó fehérje (Natúré 368 (6474), 871-4, 1994). Nem foszforilált a tirozin maradékokon mitózisban vagy növekedésben lévő sejtekben, ellentétben az ismert p68 proteinnel.

A 9. számú aminosav szekvencia analízise feltárta, hogy ez a GAP protein SR+H3 doménjéhez kapcsolt protein, melyet G3BP-vel jelölünk, a hnRNP (heterogenous nuclear RiboNucleoProteins, heterogén nukleáris ribonukleoproteinek) családjához tartozik. Pontosabban a G3BP egy 466 aminosavmaradékot tartalmazó fehérje, amely 68 kD látszólagos molekulatömeget mutat, és amely több, az RNS-hez kapcsolódó fehérjékre jellemző domént tartalmaz:

- RNP2 és RNP1 domének (342-347 aminosavak)

- 4 RGG box (435-449 aminosavak)

- egy savas kiegészítő dómén (144-221 aminosavak).

A találmány oltalmi köre azokra a polipeptidekre is kiterjed, melyek képesek a G3BP és a GAP SH3 doménje közötti kölcsönhatást gátolni. Ezen peptidek aktivitása kompetíciós tesztekkel (v.ö. 2-3. példa) vagy a Ras proteinek jelátvitelével való kölcsönös függő viszony alapján azonosítható.

A találmány egy másik tárgyát képezik az előzőekben definiált polipeptid elleni poliklonális vagy monoklonális antitestek vagy ezek fragmentumai. Ilyen antitesteket a szakember számára ismert módszerekkel nyerhetünk. Részletesen ezeket az antitesteket egy állatnak egy az 1., 2., 3., 4., 5. és a 9. számú szekvenciák vagy ezek bármely fragmentuma vagy származéka közül kiválasztott szekvenciájú polipeptiddel való immunizálásával, a vér levételével és az antitestek izolálásával állíthatjuk elő. Az antitesteket hibridómák előállításával is megkaphatjuk a szakember számára ismert módszerekkel.

A találmány szerinti antitestek vagy antitest-fragmentumok tehát a ras géntermékek aktivációs állapotának szabályozására alkalmazhatók.

Másrészt ezek az antitestek felhasználhatók arra is, hogy egy találmány szerinti polipeptidet egy biológiai mintában kimutassunk, vagy mennyiségét meghatározzuk, és ennek alapján a ras gének termékének aktivációs állapotáról tájékozódjunk.

A találmány oltalmi köre kiterjed az antagonistákra, azaz minden olyan peptidre, amely képes gátolni a találmány szerinti polipeptid kölcsönhatását a GAP protein SH3 doménjével. Ilyen peptideket kompetíciós tesztekkel (v.ö. 2-3. példa) vagy a ras aktivitás gátlása alapján találhatunk.

A találmány tehát lehetővé teszi, hogy az alább azonosított szekvenciákból származó polipeptideket, valamint ezen polipeptidek vagy a megfelelő fehérjék elleni antitesteket hozzunk létre, melyek gyógyászati alkalmazás szempontjából kívánatos biológiai tulajdonságokat mutatnak.

A találmány gyógyászatilag alkalmazható nem-peptid vagy nem-kizárólag peptid természetű vegyületeket is szolgáltat. Valóban lehetséges a leírásban leírt aktív fehérje motívumokból kiindulva olyan a P21 fehérjéktől függő jelátviteli útvonalat gátló, nem-kizárólag peptid természetű molekulákat létrehozni, melyek alkalmasak a gyógyászati alkalmazásra. Ebben a tekintetben a találmány vonatkozik az előzőekben leírt találmány szerinti polipeptid nem-peptid vagy nem-kizárólag peptid természetű, gyógyászatilag aktív molekulák előállítására való alkalmazására is a polipeptidek azon szerkezeti elemeinek azonosításával, melyek lényegesek az aktivitáshoz, és ezen elemek nem-peptid vagy nemkizárólag peptid természetű szerkezetekkel való ismételt kialakításával. A találmány tárgyát képezik azon gyógyszerkészítmények is, melyek egy vagy több találmány szerint előállított molekulát tartalmaznak.

A találmány tárgya továbbá nukleotid-szekvencia, amely egy GAP protein SH3 doménjéhez kapcsolódni képes, találmány szerinti polipeptidet kódol. Részletesebben egy olyan szekvenciáról van szó, amely tartalmazza :

(a) a 6,, vagy a 10. számú szekvenciáknak vagy ezek komplementer láncának részét vagy egészét, (b) az (a) szekvenciákkal szigorú körülmények között hibridizáló szekvenciát, amely egy a találmány szerinti polipeptidet kódol, vagy (c) az (a) és (b) szekvenciáknak a genetikai kód degeneráltságából fakadó származékait.

Előnyösen a 6. számú szekvenciát tartalmazza, és még előnyösebben a 10. számú szekvenciát.

A találmány szerinti különböző szekvenciák mesterséges vagy természetes eredetűek lehetnek. Szó lehet genomiális szekvenciákról, cDNS-ről, RNS-ről, hibrid szekvenciákról vagy szintetikus vagy félig szintetikus szekvenciákról. Ezeket a szekvenciákat például DNSbankok (cDNS-bank, genomiális DNS-bank) szűrésével kaphatjuk meg az alább bemutatott szekvenciák alapján kidolgozott szondákat alkalmazva. Ilyen bankokat különböző eredetű sejtekből kiindulva állíthatunk elő a molekuláris biológia szakember számára ismert klasszikus módszereivel. A találmány szerinti nukleotid-szekvenciákat kémiai szintézissel is előállíthatjuk,

HU 221 410 Bl nevezetesen a foszforamidites módszer szerint vagy vegyes eljárásokkal, melyek a bankok szűrésével kapott szekvenciák kémiai vagy enzimatikus módosításait foglalják magukba.

Ezek a találmány szerinti nukleotid-szekvenciák gyógyászati területen alkalmazhatók, vagy a találmány szerinti polipeptidek előállítására, vagy antiszenz szekvenciák létrehozására, melyeket génterápiás területen alkalmazhatunk, vagy továbbá a GAP protein aktivitásának hibridizációs kísérletek útján végzett detektálására vagy diagnosztizálására, vagy homológ szekvenciák azonosítására egy másik kiindulási sejtből.

A találmány szerinti polipeptidek előállításához a fent definiált nukleotid-szekvenciákat általában kifejezésüket egy gazdasejtben lehetővé tevő szignálok szabályozása alá helyezzük. Ezen szignálok (promoterek, terminátorok, szekréciós „leader” szekvenciák, stb.) kiválasztása az alkalmazott gazdasejt függvényében változhat. Előnyösen ezek a találmány szerinti nukleotidszekvenciák egy vektor részét képezik, amely lehet autonóm replikálódó vagy integratív. Részletesebben az autonóm replikálódó vektorokat a választott gazdasejtnél autonóm replikálódó szekvenciákat alkalmazva állíthatjuk elő. Az integratív vektorokat például a gazda bizonyos genom régiójával homológ szekvenciákat alkalmazva állíthatjuk elő, amely lehetővé teszi homológ rekombináció útján a vektor beépülését.

A találmány szerinti polipeptidek előállítására alkalmazható gazdasejtek ugyanúgy lehetnek eukarioták, mint prokarioták. A megfelelő eukarióta gazdák között megemlíthetjük az állati sejteket, az élesztőket, vagy a gombákat. A gombák közül különösen a Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Schwanniomyces vagy Hansenula nemzetiségeket említhetjük meg. Az állati sejtek között megemlíthetjük a COPS, CHO, C127, stb. sejteket. A gombák között különösen az Aspergillus vagy Trichoderma fajokat említhetjük meg. Prokarióta gazdaként a következő baktériumok alkalmazását helyezzük előtérbe: E. coli, Bacillus vagy Streptomyces.

A találmány szerinti nukleotid-szekvenciák antiszensz nukleinsavak kialakítására is használhatók, melyeket gyógyászati hatóanyagokként alkalmazhatunk. Bizonyos onkogének expressziójának antiszenz nukleinsavakkal való gátlása hasznos stratégiának bizonyult ezen onkogének szerepének megértésében, és egy nagyon ígéretes útnak a rák elleni kezelés kialakításában. Az antiszenz oligonukleotidok kis méretű oligonukleotidok, amelyek az adott gén kódoló szálával komplementerek, és emiatt képesek specifikusan a transzkript mRNS-sel hibridizálni, így gátolva annak fehérjévé való fordítását. Ezeket az oligonukleotidokat az előzőekben definiált nukleotid-szekvenciák egésze vagy része alapján építhetjük fel. Általában a találmány szerinti fehérjéket kódoló szekvenciákkal komplementer szekvenciákról vagy szekvencia-fragmentumokról van szó. Ezeket az oligonukleotidokat az előzőekben említett szekvenciákból kiindulva fragmentációval, stb. állíthatjuk elő, vagy kémiai szintézissel.

A találmány nukleotid-szekvenciaként szintetikus vagy nem szintetikus nukleotid szondákra is vonatkozik, melyek képesek az előzőekben definiált, egy találmány szerinti polipeptidet kódoló nukleotid szekvenciákkal, vagy a megfelelő mRNS-sel hibridizálni. Ezeket a szondákat in vitro diagnosztikai eszközökként alkalmazhatjuk. Ezeket a szondákat az alkalmazás előtt jelölhetjük, ehhez különböző módszerek ismeretesek egy szakember számára. Az ezen szondák használatához alkalmas hibridizációs körülmények a normál erősségű körülmények. A szondákat a találmány szerinti polipeptidet kódoló homológ nukleinsavak más kiindulási sejtből való kimutatására és izolálására is alkalmazhatjuk. Ezen szondákra példaként említhetjük meg különösen a 7. és a 8. számú szekvencián bemutatott szondákat, amelyeket a későbbi 3. példában alkalmazunk.

A találmánynak tárgya továbbá gyógyszerkészítmény, amely fő hatóanyagként legalább egy az előzőekben definiált polipeptidet tartalmaz.

A találmány tárgyát képezik azok a gyógyszerkészítmények is, amelyek fő hatóanyagként legalább egy, a fentiekben definiált antitestet és/vagy antitest-fragmentumot tartalmaznak, valamint olyan gyógyszerkészítmények, amelyek fő hatóanyagként legalább egy, az előzőekben definiált antiszenz oligonukleotidot tartalmaznak.

Másrészt tárgyai a találmánynak az olyan gyógyszerkészítmények, melyekben az előzőekben definiált polipeptidek, antitestek és antiszenz oligonukleotidok egymással vagy más hatóanyagokkal kapcsolódnak.

A találmány szerinti gyógyszerkészítményeket a p21 proteinek aktivitásának szabályozására, és ebből kifolyólag bizonyos típusú sejtek osztódásának szabályozására alkalmazhatjuk. Részletesebben ezek a gyógyszerkészítmények a rák kezelésére szolgálnak. Számos rák kapcsolt onkogén ras proteinek jelenlétéhez. A leggyakoribb mutáns ras géneket magukba foglaló rákok közül megemlíthetjük például a hasnyálmirigy adenokarcinomákat, melyeknek 90%-a rendelkezik a 12. kodonon mutált K.i-ras onkogénnel [Almoguera és munkatársai, Cell 53, 549 (1988)], a vastagbél adenokarcinomákat és a pajzsmirigy rákokat (50%), vagy a tüdőkarcinomákat és a mieloid leukémiákat (30%) [Bős, J. L. Cancer Rés. 49, 4682 (1989)].

A találmánynak tárgya az előzőekben leírt molekulák alkalmazása a p21 fehérjék aktivitásának szabályozására, sőt gátlására. Részletesen, a találmány tárgya a G3BP egészének vagy fragmentumának alkalmazása abból a célból, hogy a Ras-géntermékek jelátvitelét befolyásoljuk. A hnRNP-kel homológ protein fragmentumokat előnyösen alkalmaznak arra, hogy gátolják a G3BP cél RNS-eihez való kapcsolódását. Ezekkel a cél RNS-ekkel azonos vagy komplementer szekvenciákat szintén használhatunk arra, hogy befolyásoljuk a G3BP fehérje jelátvitelét.

A találmány egy eljárást is nyújt a G3BP fehérje expressziójának és/vagy túltermelésének detektálására egy biológiai mintában. Egy ilyen eljárás magába foglalja például a minta érintkezésbe hozását egy találmány szerinti antitesttel vagy antitest fragmentummal, az antigén-antitest komplex kimutatását, és a kapott eredmények összehasonlítását egy standard mintával.

HU 221 410 Bl

Egy ilyen eljárásban az antitest lehet szuszpenzióban, vagy előzőleg immobilizálva egy hordozón. Az eljárás magában foglalhatja a minta érintkezésbe hozását egy találmány szerinti nukleotid szondával, a kapott hibridek kimutatását, és az összehasonlítást egy standard mintával.

A találmányt számos formában alkalmazhatjuk terápiás területen: a találmány szerinti polipeptidek, antitestek és nukleotid-szekvenciák, mivel képesek a ras gének aktivitását szabályozni, lehetővé teszik, hogy a rákok fejlődési folyamatába beavatkozzunk. Ezek a peptidek, a vázizomzat harántcsíkolt izmainak sejtjeiben meglévő erős expressziójuk miatt másrészt valószínűleg a szignalizációhoz kapcsolt kórképekben, mint például a diabétesz, is közreműködnek. A találmány egy másik aspektusa abból áll, hogy olyan DNS vagy RNS nukleotid-szekvenciákat alkalmazunk, melyek képesek az igényelt polipeptidekkel kölcsönhatásba lépni. Ezeket a szekvenciákat a WO 91/19813 számon közzétett nemzetközi szabadalmi bejelentésben leírt módon állíthatjuk elő.

A találmányt diagnosztikai területen és rákok tipizálására is alkalmazhatjuk.

A találmány más előnyei a következő példák és ábrák tanulmányozása során tűnnek elő, melyeket csak illusztrációnak kell tekinteni, nem pedig az oltalmi kört korlátozónak.

Az ábrák magyarázata :

1. ábra: A G3BP túltermelésének hatása a CAT aktivitásra NIH 3T3 fibroblasztokban.

2. ábra: A G3BP túltermelésének hatása az Src és Ras onkogének által indukált gócpontok kialakulására NIH 3T3 fibroblasztokban.

Anyagok és módszerek

Általános klónozási technikák

A molekuláris biológia klasszikus módszerei, mint a plazmid DNS preparatív extrakciója, a plazmid DNS cézium-klorid gradiens-centrifugálása, az agaróz vagy akrilamid gélelektroforézis, a DNS fragmentumok tisztítása elektroelucióval, a fehérjék extrakciója fenollal vagy fenol/kloroformmal, a DNS sós közegbe való kicsapása etanollal vagy izopropil-akohollal, az Escherichia coliban való transzformáció, stb. jól ismertek a szakember számára, és az irodalom részletesen ismerteti azokat [Maniatis T. et al., „Molecular Cloning, a Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1982), Ausubel F. M. et al. (eds), „Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley & Sons, New York (1987)].

A restrikciós enzimeket a New England Biolabs (Biolabs), a Bethesda Research Laboratories (BRL) vagy az Amersham szolgáltatta, és a forgalmazó előírásai szerint alkalmaztuk azokat.

A pGEX2T plazmid kereskedelmi eredetű.

A DNS fragmentumok úgynevezett PCR technikával (Polimerase-catalyzed Chain Reaction, polimerázkatalizált láncreakció) [Saiki R. K. et al., Science 230, 1351-1354 (1985), Mullis K. B. and Faloona F. A., Meth Enzym. 155, 335-350 (1987)] végzett enzimatikus amplifikációját egy „DNA-thermal cycler” (Perkin

Elmer Cetus) alkalmazásával végeztük, a gyártó előírásai szerint.

A nukleotid-szekvenciák igazolását a Sanger és munkatársai által kidolgozott eljárás szerint végeztük [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467, (1977)], az Amersham által forgalmazott kitet használva.

A hibridizációs kísérletekhez a normál erősségű feltételek általában a következők: hibridizáció: 3xSCC 5 χ Denhart jelenlétében 65 °C-on, mosás: 0,5 χ SCC 65 °C-on.

1. példa

A glutation-S-transzferáz SH3 fúziós protein előállítása

A GAP protein (275-351 gyökök) és a c-Src (84-148 gyökök) SH3 doménjét kódoló DNS-szekvenciákat PCR technikával amplifikáltuk, és a pGEX2T expressziós vektorba klónoztuk a BamHI és az EcoRI helyek közé. Az így transzformált baktériumokat tenyésztettük, IPTG-vel (l-tio-(P-D-galaktopiranozid) indukáltuk, és ultrahangos kezeléssel lizáltuk. A GST SH3 fúziós proteineket agaróz glutation gyöngyökön (Pharmacia LKB biotech) affinitás kromatográfiával tisztítottuk, majd 10 mM redukált glutationnal eluáltuk.

2. példa

1. A sejtlizátum előállítása

ER22 sejteket (hörcsög fibroblaszt sejtek, melyek túltermelik a humán EGF receptort) vagy NIH 3T3 sejteket (ATCC CRL-1709), melyek C-Src(F-527) pp60-at fejeznek ki, 10% borjú magzati szérummal (FCS) kiegészített DMEM közegen (Dulbecco’s Modified Eagle Médium), mely G418 antibiotikumot (200 pg/ml) és 2 mM/Ι glutamint (5GBICO-BRL) tartalmazott, 37 °C-on 5% CO₂ alatt tenyésztettük.

Minden vizsgálatban az ER22 sejteket (Science 247, 723-6, 1990) 100 mm-es üvegekben tenyésztettük összefolyásig, majd szérum nélkül 18 órán át. Nátrium-ortovanadátot adtunk hozzá 100 μΜ végkoncentrációban, és az inkubációt 30. percig folytattuk. Ezután EGF-et adtunk hozzá közvetlenül a közegbe, 80 nM végkoncentrációban, 10 percig 37 °C-on.

Egyes vizsgálatokban a mitotikus sejteket ml-enként 0,4 pg nocodazole-lal (SIGMA) 18 órán át végzett kezeléssel összegyűjtöttük. Foszfát alapú sópufferrel gyorsan mostuk, majd jégen lehűtöttük, és szolubilizáltuk 30 percig 4 °C-on 1 ml HNTG lízis pufferben (50 mM Hepes, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% TritonX 100,10% glicerin, ImM MgCl₂, 1 mM EGTA), foszfatáz inhibitorok (1 mM Na₃VO₄, 10 mM Na₄P₂O₇, 10 mM NaF) és proteáz inhibitorok (1 pg/ml leupeptin, pg/ml tripszin inhibitor, 1 pg/ml pepsztatin A, pg/ml aprotinin, 10 pg/ml benzamidin, 1 mM fenilmetán-szulfonil-fluorid, 1 pg/ml antipain, 1 pg/ml kimosztatin) jelenlétében.

A lizátumokat 15 000 fordulat/perc sebességgel 10 percig tartó centrifugálással dekantáltuk. Ezután a protein koncentrációt meghatároztuk (Bio-rad mikro teszt).

HU 221 410 Bl

2. A közvetlen kötések kimutatása

A sejtlizátumok összességét (200 pg) és az immunprecipitált proteineket 7,5%-os nátrium-dodecilszulfát poliakrilamid gélelektroforézissel (SDS-PAGE) elválasztottuk, majd egy poli(vinilidén-difluorid) membránra (PVDF Millipore Corpo.) vittük át. A nem specifikus kötődést a filterhez 0,05% Tween 20-at tartalmazó PBS-ben oldott 2%-os sovány tejjel blokkoltuk 2 órán át szobahőmérsékleten. A szűrőket GST fehérével és GST-SH3 fehérjékkel inkubáltuk blokkoló pufferban 12 órán át 4 °C-on. Miután PBS-0,05% Tween 20-ban mostuk, a kötődött fehérjéket anti-GST monoklonális antitesttel (0,25 pg/ml) (Hybridolab Pasteur Inst.), majd alkalikus foszfatázzal konjugált anti-egér antitesttel és 5-bróm-4-klór-3-indolil-foszfát toluidin nitroblue tetrazolium sóval (PROMEGA) egymás után történő inkubálással mutattuk ki.

3. Kompetíciós tesztek

A GAP SH3 (275-305), (299-326), (317-326), (320-350) szekvenciáinak vagy az SH3 doménhez kapcsolódó dinamin valósnak vélt szekvenciájának (RRAPAVPPARPGS) megfelelő szintetikus peptideket FMOC kémiát alkalmazva szintetizáltuk egy Applied Biosystems 431 A készüléken.

A tisztított 68 kD-os fehérjét nátrium-dodecil-szulfát poliakrilamid gélelektroforézissel izoláltuk, és elektroforézissel PVDF membránra vittük át. A membránokat a peptidek növekvő mennyiségével inkubáltuk. A kontroll reakcióban a poli-L-prolin peptidet (SIGMA) alkalmaztuk 500 pM koncentrációban. 1 órás inkubálás után minden reakcióközeghez GST-GAPSH3 fehérjét (2 pg/ml) adtunk hozzá. A szűrleteket anti-GST monoklonális antitesttel vizsgáltuk át, amint azt korábban leírtuk.

4. Immunprecipitáció és immuntranszfer

Az oldott sejtlizátumokat (3 mg) 50 pl protein A Sepharose CL-4B-a (Pharmacia Biotech) 2 órán át 4 °C-on dekantáltuk. A dekantált sejtlizátumokat antifoszfotirozin monoklonális antitestekkel (4G10 monoklonális antitestek - Upstate Biotechnology Incorporated) inkubáltuk 4 órán át 4 °C-on. Ezután 50 pl protein A Sepharose-t adtunk a komplexhez, és az inkubációt egy egész éjszakán át folytattuk 4 °C-on. Az immunprecipitátumot 3-szor mostuk HNTG pufferrel, és SDS puffer egy mintájában (100 pl) oldottuk. A komplexeket ezután SDS-PAGE-vel elválasztottuk, és elektroforézissel PVDF membránra vittük át.

A membránokat TBS-ben (10 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 3% borjú szérum albumin) foszfotirozin monoklonális antitestekkel, ezenkívül alkalikus foszfatázzal konjugált második antitestekkel inkubáltuk. Ezután hozzáadtuk az alkalikus foszfatáz szubsztrátját a megfelelő szín kifejlesztéséhez.

5. A szekvencia tisztítása és analízise

Körülbelül 5-10⁹ ER22 sejtet lizáltunk 200 ml

HNTG pufferben. A lizátumot 15 000 g-vel centrifugáltuk 15 percig, és 5-szörösére hígítottuk HNG pufferben (50 mM Hepes, pH 7,5, 150 mM NaCl, 10% glicerol, 1 mM EGT A, foszfatáz és proteáz inhibitorok). A lizátumot egy éjszakán át inkubáltuk 6 ml ugyanazon pufferrel kiegyensúlyozott S-Sepharose Fást flow-val. A komplexet oszlopba töltöttük (2,5 χ 1,3 cm - IBF). Az oszlopot 10-szeres térfogatú pufferral mostuk, és a kötődött fehéijéket azután 60 ml/h elúciós sebességgel eluáltuk, 60 ml 0-1 M NaCl lineáris gradiensével ugyanazon pufferban. A 2.2. példában megadott feltételek között meghatározott kötődési aktivitással rendelkező frakciókat (0,15-0,37 M NaCl) összegyűjtöttük, 10szeresére hígítottuk HNG pufferben, és 24 ml/h elúciós sebességgel Heparin-Sepharose CL-6B oszlopra töltöttük (3 ml) (Pharmacia LKB), melyet előzőleg ugyanazon pufferral egyensúlyoztunk ki. HNG pufferral végzett mosás után az oszlopot 24 ml 0-1 M NaCl gradiensével eluáltuk. Az S Fást Flow kromatográfia aktív frakcióit összegyűjtöttük, 4-szeresére hígítottuk MES pufferban (100 mM MES, pH 6,8, 1 mM MgSO₄, 1 mM EGTA), és 6 ml/h elúciós sebességgel egy agaróz-ATP oszlopra (3 ml) (Sigma N° A9264) vittük át, melyet előzőleg 50 mM NaCl-t tartalmazó MES pufferral egyensúlyoztunk ki. Az oszlopot azután 20 ml MES pufferral mostuk, mely 50 mM NaCl-t is tartalmazott, és 30 ml/h sebességgel eluáltuk 50 mM-2 M NaCl lineáris gradiensével MES pufferban. A 68 kD-os protein 0,3 M és 0,4 M NaCl között eluálódott. Az aktív frakciókat összegyűjtöttük, 20 mM NH₄HCO₃-tal (pH 8,3) dializáltuk, és koncentráltuk. A szárazzá tett fehéijéket SDS pufferban újra szuszpendáltuk, és poliakril-amid gélelektroforézissel elválasztottuk. A gélt Coomassiekékkel festettük, és a 68 kD molekulatömegű sávot, amely az SH3 kötő aktivitásnak felel meg, kinyertük. A csíkot 1 órán át mostuk a következő oldatokban: víz, víz/metanol (90/10), víz/CH₃CN (80/20), víz/CH₃CN (50/50).

A tisztított 68 kD-os proteint tartalmazó gélcsíkot azután kis részekre osztottuk, és SPEED/VAC (SAVANT) alatt szárítottuk. 400 μΐ-t adtunk hozzá egy oldatból, amely 25 mM Trist (pH 8,5), 1 mM EDTA-t, 0,05% SDS-t és 5 pg endoproteináz Lys-C-t (Boehringer Mannheim) tartalmaz, és mindezt egy éjszakán át inkubáltuk 37 °C-on. A hidrolizátumot fordított fázisú HPLC oszlopra (Vydac Cl8:2,1 x250 mm) injektáltuk. Az oszlopot 0,2 ml/perc sebességgel eluáltuk 0-35% B lineáris gradienssel 150 perc alatt. (A: H₂0 + 0,07% TFA és B: CH₃CN + 0,07% TFA) A 113,7,117,7 és 133,7 percnél megfigyelt elúciós csúcsokat összegyűjtöttük, és Applied Biosystem 477A mikroszekvenátort alkalmazva közvetlenül szekvenáltuk. A megfelelő peptidek így kapott szekvenciáit az 1., 2., 3. és 4. számú szekvenciák mutatják be. Ezek a szekvenciák semmilyen homológiát nem mutatnak protein adatbázisokban referált más proteinekkel [PÍR 33. Swiss-Prot 33 (intelligenetics)].

Annak meghatározására, hogy a 68 kD-os protein a mitotikus vagy nem-szinkronizált sejtekben foszforilált-e a tirozinon, a 10% borjú magzati szérumon (FCS) tenyésztett ER22 sejtekből vagy a nocodazollal kezelt sejtekből származó lizátumok fehérjéit antifoszfotirozin antitestekkel immunprecipitáltuk, membránra vittük át, és vagy anti-foszfotirozin antitestekkel immundetektáltuk, vagy inkubáltuk GST-GAP-SH36

HU 221 410 BI mai vagy GST-Src-SH3-mal, a 2.2. és a 2.4. példákban leírt körülmények között.

Kontrollként a NIH 3T3 sejtek proteinjeit, mely sejtek a cSrc egy aktivált alléljával (c-Src Y527F) vannak transzformálva, az ER22 proteinek esetében leírtakkal azonos körülmények között teszteltük. A kapott eredmények azt mutatják, hogy a fehérjék foszforiláltak a tirozinon, különösen a 60-70 kD tartományban. Az ER22 sejtekben nem detektáltunk semmilyen kötődést foszforilált 68 kD-os proteinhez a GST-GAP-SH3 vagy a GST-Src-SH3 szondákkal. A NIH 3T3 sejtekben (cSrc Y527F) a GST-Src-SH3 szonda kötődött egy 68 kD molekulatömegű, tirozinon foszforilált fehérjéhez, míg a GST-GAP-SH3 szonda semmilyen fehérjével nem lépett kölcsönhatásba.

Ennek a fehérjének a ras szignalizáció útjában betöltött funkcionális szerepének bebizonyítására, a 2.3. példában leírt körülmények között kompetíciós kísérleteket végeztünk. A kapott eredmények azt mutatják, hogy a GAP-ból származó peptidek képesek gátolni a Xenopus tojások germinális vezikulumainak (GVBD) felszakadását, amelyet a ras indukál, és a (299-326) és a (317-326) peptidek képesek a G3BP fehérje és a GAP közötti kölcsönhatás gátlására is.

Ezek az eredmények világosan bebizonyítják, hogy a találmány szerinti fehérje aktivitásának gátlása vagy az aktivitás befolyásolása egy új, különösen ígéretes megközelítés a rákok kezeléséhez.

3. példa

A humán 6. számú szekvencia izolálása humán placenta cDNS bankból kiindulva

Szondaként a 7. és a 8. számú szekvenciákat alkalmazzuk, melyeket az 1. és a 3. számú szekvenciák szerinti peptidszekvenciák alapján állapítottunk meg. Preparáltuk a Clonetech HL1008B bank DNS-ét, és egy PCR reakcióban alkalmaztuk. 30 amplifikációs ciklust végeztünk a következő körülmények között: denaturáció 1 perc 94 °C-on, párosítás 1 perc 35 °C és 40 °C között, és elongáció 1 perc 72 °C-on. Ez a reakció lehetővé teszi, hogy egy 1,3 kb-os DNS-fragmenst izoláljunk, mely fragmens szekvenciájának egy részét a 6. számú szekvencia adja meg. Northem-blot analízissel kimutattuk, hogy a megfelelő RNS (3,3 kb) mindenütt jelen van, és igen erősen fejeződik ki a felnőtt vázizomzatban.

4. példa

A humán 68 kD-os-at kódoló 10. számú szekvencia izolálása humán placenta cDNS bankból

Egy humán placenta bank cDNS-ének amplifikációjában kezdő szekvenciaként a 7. és a 8. számú szekvenciáknak megfelelő két oligonukleotidot alkalmaztuk. A PCR-t Amplitaq Perkin Elmer segítségével valósítottuk meg, 35 °C-os anneálási hőmérséklettel, amit 1 perc 10% formamid jelenlétében 72 °C-on végzett extenzió követett. Egy 1164 bp cDNS fragmentumot amplifikáltunk. A pMOSblue vektorba (Amersham) végzett direkt klónozás után, mely a -20 szekvenciát és annak inverz szekvenciáját hordozza, a fragmentumot szekvenáltuk fluoreszcens szondák segítségével. Ezt a PCR-fragmentumot használtuk azután szondaként egy humán placenta cDNS ygtll bank (Clontech) 10^{4 * 6} fágjának szűrésére. A szondát az Amersham Rediprime rendszerével szintetizáltuk, és a szűrőket 16 órán keresztül inkubáltuk a szondát is tartalmazó hibridizációs pufferban (6XSCC, 5XDenhardt, 100 pg/ml lazac sperma, 0,25% SDS) 45 °C-on. A szűrőket ezután 1 órán át mostuk szobahőmérsékleten, és 20 percig hibridizációs hőmérsékleten 2XSSC, 0,05% SDS-ben. Nyolc pozitív kiónt azonosítottunk. Ezek közül kettőt tisztítottunk, és a cDNS-t EcoRI-gyel emésztettük az inszertumok visszanyerése céljából. Ezeket azután M13mpl8/EcoRI-ban szubklónoztuk a szekvenáláshoz. A szekvenálást a cDNS exonukleáz III-mal végzett progresszív deléciójából (Nested Deletion Kit, Pharmacia Biotech) származó fragmentumokon végeztük el. A fragmentumok méretkülönbözőségét az M13 vektor -20 kezdő szekvencia és inverze közötti PCR amplifikációval analizáltuk, és különböző méretpopulációkat választottunk a szekvenáláshoz. A kapott különböző szekvenciák összeállítása lehetővé tette, hogy a 68 kD-os polipeptid teljes nyílt leolvasási keretét (10. számú szekvencia) rekonstruáljuk.

5. példa

A G3BP túltermelése NIH 3T3 flbroblasztokban

NIH 3T3 fibroblasztokat transzformáltunk egy riportergénnel, a kloramfenikol-acetil-transzferáz génjével, melyet a Ras válasz polioma vírus enhanceréből származó szabályozó elemeinek kontrollja alá helyeztünk. Ezek az elemek 15-30-szorosan stimulálódnak, ha a sejteket egy a Ras és Src onkogének cDNS-ét hordozó expressziós vektorral transzformáljuk. Erre a stimulációra hatással van, ha a megfelelő nyílt leolvasási keretet kódoló cDNS-t tartalmazó expressziós vektorral való kotranszformáció után a G3BP fehérje (9. számú szekvencia) kifejeződik. A G3BP fehérje dózis-függő módon gátolja az Src és a Ras onkogén formája által stimulált CAT aktivitást. Ezt a megfigyelést az 1. ábrán mutatjuk be.

Ugyanilyen módon a G3BP fehérje kifejeződése az Src és a Ras által indukált gócok kialakulása ellen hat, A 2. ábra ezt a megfigyelést mutatja be.

Ezek a kísérletek világosan bizonyítják a G3BP képességét arra, hogy gátolja a normál vagy onkogén Ras proteinek által átvitt sejtosztódási jelek hatását.

Szekvenciák jegyzéke (1) Az 1. számú szekvencia adatai:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 19 aminosav (B) típus: aminosav (D) konfiguráció: lineáris

HU 221 410 Bl (ii) Molekulatípus: protein (vi) Származás: hörcsög (xi) Az 1. számú szekvencia leírása:

Val Met Glu Lys Pro Ser Pro Leu Leu Val Gly Arg Glu Phe Val Arg Gin 15 10 15

Tyr Ile (2) A 2. számú szekvencia adatai:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 15 aminosav (B) típus: aminosav (D) konfiguráció: lineáris (ii) Molekulatípus: protein (vi) Származás: hörcsög (ix) Jellegzetesség:

(D) Egyéb információ: az első Xaa egy Alá vagy Thr maradék lehet, a második Xaa pedig bármilyen ami nosav.

(xi) A 2. számú szekvencia leírása:

Xaa Xaa Glu Gly Asp Asp Arg Asp Asn Arg Leu Leu Gly Pro 1 5 10 15 (3) A 3. számú szekvencia adatai:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 17 aminosav (B) típus: aminosav (D) konfiguráció: lineáris (ii) Molekulatípus: protein (vi) Származás: hörcsög (xi) A 3. számú szekvencia leírása:

Leu Pro Asn Phe Gly Phe Val Val Phe Asp Asp Ser Glu Pro Val 15 10 15

Gin Lys (4) A 4. számú szekvencia adatai:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 19 aminosav (B) típus: aminosav (D) konfiguráció: lineáris (ii) Molekulatípus: protein (vi) Származás: hörcsög (xi) A 4. számú szekvencia leírása:

Ser Alá Thr Pro Alá Pro Alá Asp Val Alá Pro Alá Gin Glu Asp Leu 15 10 15

Arg Xaa Phe (5) Az 5. számú szekvencia adatai:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 68 aminosav (B) típus: aminosav (D) konfiguráció: lineáris (ii) Molekulatípus: protein (vi) Származás: humán (xi) Az 5. számú szekvencia leírása:

Arg 1

Glu

Al a

Gly

Glu 5

Gin Gly

As p

Ile

Glu 10

Pro

Arg

Me t

Val 15

Arg

Hi s

Pro

As p

Ser

Hi s

G1 n

Leu

Phe

Ile

Gly

As n

Leu

Pro

Hi s

Glu

Val

20

25

30

As p

Ly s

Ser

Glu

Leu

Lys

Asp

Phe

Gin

Ser

Tyr

Gly

As n

Val

Va 1

35

40

45

Glu

Leu

Arg

I 1 e

Asn

Ser

Gly

Pro

Ly s

Leu

Pro

As n

Phe

Al a

Phe

Val

50

55

60

Val

Phe

Asp

As p

65

HU 221 410 Β1 (6) A 6. számú szekvencia adatai:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 204 bázispár (B) típus: nukleinsav (C) szálak száma: kettő (D) konfiguráció: lineáris (ii) Molekulatípus: cDNS (iii) Hipotetikus: nem (iii) Antiszensz: nem (vi) Származás:

(A) Organizmus: humán (xi) A 6. számú szekvencia leírása :

CGTGAGGCTG GTGAGCAAGG TGACATTGAA CCCCGAAGAA TGGTGAGACA CCCTGACAGT CACCAACTCT TCATTGGCAA CCTGCCTCAT GAAGTGGACA AATCAGAGCT TAAAGATTTC TTTCAAAGTT ATGGAAACGT GGTGGAGTTG CGCATTAACA GTGGTGGGAA ATTACCCAAT TTCGCCTTCG TCGTCTTCGA TGAT (7) A 7. számú szekvencia adatai:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 32 bázispár (B) típus: nukleinsav (C) szálak száma: egyetlen (D) konfiguráció: lineáris (ii) Molekulatípus: cDNS (iii) Hipotetikus: nem (iii) Antiszensz: nem (vi) Származás:

(A) Organizmus: humán (xi) A 7. számú szekvencia leírása:

GTIATGGAIA AICCITCCCC ICTICTIGTI GG (8) A 8. számú szekvencia adatai:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 26 bázispár (B) típus: nukleinsav (C) szálak száma: egyetlen (D) konfiguráció: lineáris (ii) Molekulatípus: cDNS (iii) Hipotetikus: nem (iii) Antiszensz: nem (vi) Származás:

(A) Organizmus: humán (xi) A 8. számú szekvencia leírása:

GAATCATCGA AIACIACGAA ICCGAA (9) A 9. számú szekvencia adatai:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 466 aminosav (B) típus: aminosav (C) szálak száma: egyetlen

120

180

204 (D) konfiguráció: lineáris (ii) Molekulatípus: peptid (xi) Az 9. számú szekvencia leírása:

Me t 1

Val

Me t

Glu

Lys 5

Pro

Ser

Pro

Leu

Leu 10

Va 1

Gly

Arg

G1 u

Phe 15

Va 1

Arg

Gin

Tyr

Thr

Leu

As n

G1 n

Al a

Pro

As p

Me t

Leu

H i s

Arg

20

25

30

Phe

Tyr

Gly

Ly s

As n

Ser

Tyr

Va 1

Hi s

Gly

Leu

As p

Ser

As n

35

40

45

Gly

Ly s

Pro

Al a

As p

Al a

Va 1

Tyr

Gly

G1 n

Ly s

Glu

11 e

Hi s

Arg

Lys

50

55

60

Va 1

Me t

Ser

Gin

As n

Phe

Thr

As n

Cy s

Hi s

Thr

Ly s

I 1 e

Arg

Hi s

Va 1

65

70

75

80

HU 221 410 Β1

As p

Al a

Hi s

Al a

Thr 85

Leu

Asn

As p

Gly

Val 90

Va 1

Gin

Va 1

Me t 95

Gly

Leu

Ser

Asn 100

Asn

Gin

Al a

Leu 105

Arg

Phe

Me t

Gin 110

Thr

Phe

Val

Leu

Al a 115

Pro

Glu

Gly

Ser

Va 1 120

Al a

Asn

Ly s

Phe

Tyr 125

Val

Hi s

Asn

As p

Ile 130

Arg

Tyr

Gin

Asp

Glu 135

Val

Phe

Gly

Phe 140

Va 1

Thr

Glu

Pro

Gin 145

Glu

Ser

Glu

Glu 150

Glu

Val

Glu

Pro 155

Glu

Arg

Gin

Gin 160

Thr

Pro

Glu

Val

Val 165

Pro

As p

Ser

Gly 170

Thr

Phe

Tyr

As p

Gin 175

Alá

Val

Va 1

Ser

Asn 180

As p

Me t

Glu

Hi s 185

Leu

Glu

Pro

Val 190

Al a

Glu

Pro

Glu

Pro 195

As p

Pro

Glu

Pro

Glu 200

Pro

Glu

Gin

Glu

Pro 205

Va 1

Ser

Glu

Ile

Gin 210

Glu

Ly s

Pro

Glu 215

Pro

Va 1

Leu

Gl u

Glu 220

Thr

Al a

Pro

Glu

As p 225

Al a

Gin

Ly s

Ser

Ser 230

Ser

Pro

Al a

Pro

Al a 235

As p

Ile

Al a

Gin

Thr 240

Val

Gl n

Glu

As p

Leu 245

Arg

Thr

Phe

Ser

Trp 250

Al a

Ser

Va 1

Thr

Ser 255

Ly s

Asn

Leu

Pro

Pro 260

Ser

Gl y

Al a

Va 1

Pro 265

Va 1

Thr

Gly

Ile

Pro 270

Pro

Hi s

Val

Va 1

Ly s 275

Va 1

Pro

Al a

Ser

Gin 280

Pro

Arg

Pro

G1 u

Ser 285

Ly s

Pro

Glu

Ser

Gin 290

Ile

Pro

Gin

Arg 295

Pro

Gin

Arg

As p

Gin 300

Arg

Va 1

Arg

Glu

Gin 305

Arg

Ile

As n

Ile

Pro 310

Pro

Gin

Arg

Gly

Pro 315

Arg

Pro

Ile

Arg

Glu 320

Al a

Gly

Glu

Gin

Gly 325

As p

Ile

Glu

Pro

Arg 330

Arg

Me t

Val

Arg

Hi s 335

Pro

Asp

Ser

Hi s

Gin 340

Le u

Phe

Ile

Gly

As n 345

Leu

Pro

Hi s

Glu

Va 1 350

As p

Ly s

Ser

Gl u

Leu 355

Ly s

As p

Phe

Gin 360

Ser

Tyr

Gly

Asn

Va 1 365

Va 1

Glu

Leu

Arg

Ile 370

Asn

Ser

Gly

Ly s 375

Leu

Pro

Asn

Phe

Gl y 380

Phe

Va 1

Phe

Asp 385

As p

Ser

Gl u

Pro

Va 1 390

Gin

Ly s

Val

Leu

Ser 395

Asn

Arg

Pro

Ile

Me t 400

Phe

Arg

Gly

Glu

Val 405

Arg

Le u

As n

Val

Glu 410

Glu

Ly s

Thr

Arg 415

Al a

Arg

Glu

Gl y 420

As p

Arg

As p

Asn 425

Arg

Leu

Arg

Gly

Pro 430

Gly

Pro

Arg

Gly 435

Gly

Leu

Gly

Gly 440

Me t

Arg

Gly

Pro

Pro 445

Arg

Gly

Me t Gin 465

Val 450 Glx

Gl n

Ly s

Pro

Gly

Phe 455

Gly

Va 1

Gly

Arg

Gly 460

Leu

Al a

Pro

Arg

(10) A 10. számú szekvencia adatai:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossz: 2129 bázispár (B) típus: nukleinsav (C) szálak száma: egyetlen (D) konfiguráció: lineáris (ii) Molekulatípus: cDNS (iii) Hipotetikus: nem

HU 221 410 BI (xi) A 10. számú szekvencia leírása:

GCTTGCCTGT CAGGTCGACT CTAGAGCCCG GGTACCGAGC TCGAATTCGG CGGGGTTTGT 60 ACTATCCTCG GTGCTGTGGT GCAGAGCTAG TTCCTCTCCA GCTCAGCCGC GTAGGTTTGG 120 ACATATTTAC TCTTTTCCCC CCAGGTTGAA TTGACCAAAG CAATGGTGAT GGAGAAGCCT 180 AGTCCCCTGC TGGTCGGGCG GGAATTTGTG AGACAGTATT ACACACTGCT GAACCAGGCC 240 CCAGACATGC TGCATAGATT TTATGGAAAG AACTCTTCTT ATGTCCATGG GGGATTGGAT 300 TCAAATGGAA AGCCAGCAGA TGCAGTCTAC GGACAGAAAG AAATCCACAG GAAAGTGATG 360 TCACAAAACT TCACCAACTG CCACACCAAG ATTCGCCATG TTGATGCTCA TGCCACGCTA 420 AATGATGGTG TGGTAGTCCA GGTGATGGGG CTTCTCTCTA ACAACAACCA GGCTTTGAGG 480 AGATTCATGC AAACGTTTGT CCTTGCTCCT GAGGGGTCTG TTGCAAATAA ATTCTATGTT 540 CACAATGATA TCTTCAGATA CCAAGATGAG GTCTTTGGTG GGTTTGTCAC TGAGCCTCAG 600 GAGGAGTCTG AAGAAGAAGT AGAGGAACCT GAAGAAAGCA GCAAACACCT GAGGTGGTAC 660 CTGATGATTC TGGAACTTTC TATGATCAGG CAGTTGTCAG TAATGACATG GAAGAACATT 720 TAGAGGAGCC TGTTGCTGAA CCAGAGCCTG ATCCTGAACC AGAACCAGAA CAAGAACCTG 780 TATCTGAAAT CCAAGAGGAA AAGCCTGAGC CAGTATTAGA AGAAACTGCC CCTGAGGATG 840 CTCAGAAGAG TTCTTCTCCA GCACCTGCAG ACATAGCTCA GACAGTACAG GAAGACTTGA 900 GGACATTTTC TTGGGCATCT GTGACCAGTA AGAATCTTCC ACCCAGTGGA GCTGTTCCAG 960 TTACTGGGAT ACCACCTCAT GTTGTTAAAG TACCAGCTTC ACAGCCCCGT CCAGAGTCTA 1020 AGCCTGAATC TCAGATTCCA CCACAAAGAC CTCAGCGGGA TCAAAGAGTG CGAGAACAAC 1080 GAATAAATAT TCCTCCCCAA AGGGGACCCA GACCAATCCG TGAGGCTGGT GAGCAAGGTG 1140 ACATTGAACC CCGAAGAATG GTGAGACACC CTGACAGTCA CCAACTCTTC ATTGGCAACC 1200 TGCCTCATGA AGTGGACAAA TCAGAGCTTA AAGATTTCTT TCAAAGTTAT GGAAACGTGG 1260 TGGAGTTGCG CATTAACAGT GGTGGGAAAT TACCCAATTT TGGTTTTGTT GTGTTTGATG 1320 ATTCTGAGCC TGTTCAGAAA GTCCTTAGCA ACAGGCCCAT CATGTTCAGA GGTGAGGTCC 1380 GTCTGAATGT CGAAGAGAAG AAGACTCGAG CTGCCAGGGA AGGCGACCGA CGAGATAATC 1440 GCCTTCGGGG ACCTGGAGGC CCTCGAGGTG GGCTGGGTGG TGGAATGAGA GGCCCTCCCC 1500 GTGGAGGCAT GGTGCAGAAA CCAGGATTTG GAGTGGGAAG GGGGCTTGCG CCACGGCAGT 1560 AATCTTCATG GATCTTCATG CAGCCATACA AACCCTGGTT CCAACAGAAT GGTGAATTTT 1620 CGACAGCCTT TGGTATCTTG GAGTATGACC CCAGTCTGTT ATAAACTGCT TAAGTTTGTA 1680 TAATTTTACT TTTTTTGTGT GTTAATGGTG TGTGCTCCCT CTCCCTCTCT TCCCTTTCCT 1740 GACCTTTAGT CTTTCACTTC CAATTTTGTG GAATGATATT TTAGGAATAA CGGACTTTTA 1800 CCCGAATTCG TAATCATGGT CATAGCTGTT TCCGTGTGAA ATTGTTATCC GCTCACAATT 1860 CCACACAACA TACGAGCCGG AAGCATAAAG TGTAAAGCCT GGGGTGCCTA ATGAGTGAGC 1920 TAACTCACAT TAATTGCGTT GCGCTCACTG CCCGCTTTCC AGTCGGGAAA CCTGTCGTGC 1980 CAGCGCATTA ATGAATCGGC CAACGCGCGG GGAGAGGCGG TTTGCGTATT GGGCGCCAGG 2040 GTGGTTTTCT TTTCACCAGT GAGACGGGCA ACAGCTGATT GCCCTTCACC GCTGGCCCTG 2100 AGAGAGTTGC AGCAAGCGGT CCACGCTGG 2129

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Polipeptid, amely képes a GAP fehérje SH3 doménjével kölcsönhatásba lépni, azzal jellemezve, 45 hogy L, 2., 3., 4., 5. vagy 9. számú szekvenciának vagy származékának egészét vagy egy részét tartalmazza.
2. Az 1. igénypont szerinti polipeptid, azzal jellemezve, hogy az 1., 2., 3. és/vagy 4. számú szekvenciát tartalmazza. 50
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti polipeptid, azzal jellemezve, hogy molekulatömege 68 kD.
4. Az 1. vagy 3. igénypont szerinti polipeptid, azzal jellemezve, hogy humán eredetű.
5. A 4. igénypont szerinti polipeptid, azzal jellemez- 55 ve, hogy az 5. vagy 9. szekvenciának vagy származékának egészét vagy egy részét tartalmazza.
6. Az 1., 4. vagy 5. igénypont szerinti polipeptid, azzal jellemezve, hogy a 9. számú szekvencia vagy annak egy származéka. 60
7. Az 1 -6. igénypontok bármelyike szerinti polipeptid, azzal jellemezve, hogy mitózisban vagy növekedésben levő sejtekben a tirozin-maradékokon nem foszforilált.
8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti polipeptid elleni antitest vagy antitest-fragmentum.
9. A 8. igénypont szerinti antitest vagy antitestfragmentum, azzal jellemezve, hogy 1., 2., 3., 4., 5. vagy 9. számú szekvencia ellen irányul.
10. A 8. vagy 9. igénypont szerinti antitest vagy antitest-fragmentum, amely a GAP protein és az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti polipeptid közötti kölcsönhatást gátló antitest.
11. Nukleotid-szekvencia, amely egy 1-7. igénypontok bármelyike szerinti polipeptidet kódol.
12. A 1. igénypont szerinti nukleotid-szekvencia, azzal jellemezve, hogy (a) 6. számú vagy 10. számú szekvencia vagy ezek komplementer láncai egészét vagy egy részét,

HU 221 410 Β1 (b) az (a) szekvenciával szigorú körülmények között hibridizáló szekvenciát, vagy (c) az (a) vagy (b) szekvenciáknak a genetikai kód degeneráltságából eredő származékát tartalmazza.
13. A 11. vagy 12. igénypont szerinti nukleotidszekvencia, azzal jellemezve, hogy a 6. számú szekvenciát tartalmazza.
14. A 11-13. igénypont szerinti nukleotid-szekvencia, azzal jellemezve, hogy a 10. számú szekvencia.
15. Antiszenz nukleinsav, amely képes legalább részben gátolni egy 1-7. igénypont szerinti polipeptid termelődését.
16. Egy 11-14. igénypontok bármelyike szerinti nukleotid-szekvencia alkalmazása egy 1-7. igénypontok egyike szerinti polipeptid expressziójának vagy genetikai rendellenességek (hibás párosodás, polimorfizmus vagy pontmutáció) kimutatására.
17. Egy 1-7. igénypontok bármelyike szerinti polipeptid alkalmazása egy, a GAP proteinnel kölcsönhatásba lépő nem-peptid vagy nem-kizárólag peptid vegyület megalkotására az aktivitáshoz lényeges szerkezeti elemek meghatározásával és ezen elemek nem-peptid vagy nem-kizárólag peptid-szerkezetekkel való ismételt kialakításával.
18. Gyógyszerkészítmény, amely hatóanyagként legalább egy 1-7. igénypontok bármelyike szerinti polipeptidet és/vagy egy 8-10. igénypontok bármelyike szerinti antitestet vagy antitest-fragmentumot és/vagy egy 15. igénypont szerinti antiszenz nukleinsavat és/vagy egy 17. igénypont szerint kialakított vegyületet tartalmaz.
19. A 18. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény p21 proteinek aktiválásának szabályozására.
20. A 18. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény rákok kezelésére.
21. Egy 10. igénypont szerinti antitest vagy antitestfragmentum és/vagy egy 11. igénypont szerinti nukleotid-szekvencia alkalmazása egy 1-7. igénypontok szerinti, amplifikált, mutált vagy újrarendezett polipeptid expressziójának és/vagy túltermelésének biológiai mintában való kimutatására.
22. Egy 8-10. igénypontok bármelyike szerinti antitest vagy antitest-fragmentum és/vagy egy 11-13. igénypontok bármelyike szerinti nukleotid-szekvencia alkalmazása rákok vagy jelátviteli rendellenességgel kapcsolt betegségek tipizálására.
23. Egy 1-7. igénypontok bármelyike szerinti polipeptiddel kölcsönhatásba lépni képes RNS- vagy DNSszekvencia alkalmazása.
24. Egy 1-7. igénypontok bármelyike szerinti polipeptid alkalmazása Ras géntermékek jelátvitelének befolyásolására.