JPH10155491A

JPH10155491A - 新規な蛋白質及びそれをコードするｄｎａ

Info

Publication number: JPH10155491A
Application number: JP8334882A
Authority: JP
Inventors: Kazuhiko Maekawa; 前川　　和彦; Noriko Imagawa; 紀子今川; Osamu Yoshie; 修義江
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1996-11-29
Filing date: 1996-11-29
Publication date: 1998-06-16

Abstract

(57)【要約】【課題】細胞内シグナル伝達に関与する新規な蛋白質
を得る。【解決手段】ＰＤＺドメインを有する蛋白質と結合
し、カルボキシ末端に配列番号１に記載のアミノ酸番号
３９７−４０４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白
質。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ヒト細胞内シグナ
ル伝達に関与する蛋白質の遺伝子工学的な製造に関し、
さらに詳しくは、チロシンリン酸化蛋白質（チロシン残
基がリン酸化された蛋白質）との結合活性を示す蛋白質
をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有するベクター、該
ベクターで形質転換された宿主細胞、得られた形質転換
体を培養することによる、組換え蛋白質の製造、及びこ
のようにして製造された組換え蛋白質に関する。

【０００２】

【従来の技術】細胞内のシグナル伝達過程として非常に
重要なものに、ある種の蛋白質の可逆的チロシンリン酸
化がある。このタイプのシグナル伝達機構は、通常、触
媒型受容体タンパクを介しており、まず、該タンパクが
細胞外でリガンドと結合すると、細胞質側に露出した触
媒部位で細胞中の特定の蛋白質（自己を含む）のチロシ
ン残基をリン酸化し、細胞内にシグナルを伝達する。シ
グナル伝達は、このチロシンのリン酸化と、リン酸化さ
れた蛋白質の脱リン酸化を通して行われる。即ち、蛋白
質のチロシン残基のリン酸化または脱リン酸化は、調節
される蛋白質のコンフォメーションの変化を引き起こし
たり、あるいは新たな蛋白質−蛋白質結合を誘導するこ
とにより、細胞内でシグナルを伝えていると考えられ
る。蛋白質のチロシンリン酸化はプロテインチロシンキ
ナーゼ（以下チロシンキナーゼと呼称）、脱リン酸はプ
ロテインチロシンフォスファターゼ（以下チロシンフォ
スファターゼと呼称）によって、それぞれ行われる。す
でに記したように、チロシンリン酸化によって伝えられ
るシグナルは可逆的であるので、チロシンフォスファタ
ーゼによって脱リン酸化される基質は、即ちチロシンキ
ナーゼによってリン酸化される基質であり、この「基
質」となる蛋白質がシグナル伝達系において非常に重要
な役割を担っていると考えられる。

【０００３】多くの癌遺伝子産物や成長因子受容体が、
チロシンキナーゼ活性を有している事が発見されて以
来、チロシン残基における蛋白質のリン酸化の重要性が
認識され、これまでに非常に多数のチロシンキナーゼ
や、チロシンフォスファターゼがクローニングされてい
る。しかしながら、チロシンキナーゼの基質となる蛋白
質そのもの、さらにはチロシンフォスファターゼが、脱
リン酸化されるべきチロシンリン酸化蛋白質（基質）を
どのように選択するかについては、殆ど理解が進んでい
ない状態である。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】チロシンリン酸化−脱
リン酸化に関与する蛋白質を同定し、細胞内シグナル伝
達機構を調べることが、様々なシグナルによって刺激さ
れる生理作用、細胞の正常又は異常な増殖や細胞接着機
構等の研究の推進に役立つと考えられる。既知のチロシ
ンフォスファターゼの１つにＰＴＰ−ＢＡＳ（プロテイ
ンチロシンフォスフォターゼ−ＢＡＳ）がある。ＰＴ
Ｐ−ＢＡＳはヒト好塩基球より単離された細胞質型チロ
シンフォスファターゼで、ＦＡＰ−１、ＰＴＰ−Ｌ１、
ＰＴＰ−１Ｅ、ＰＴＰＮ１３とも呼ばれ［Maekawa,K.,
Imagawa,N., Nagamatsu,M 及びHarada,S. FEBS lett. 3
37,200-206(1994)；Sato, T., Irie,S., Kitada,S. 及
びRead,C., Science 268, 411-415 (1995)］、分子内に
１つのBand4.1 相同領域とチロシンフォスファターゼ(P
TPase）活性領域、そして５つのＰＤＺドメインと呼ば
れる領域を持つ。Band4.1 相同領域は細胞骨格に結合し
ている蛋白質 Band4.1に相同性を示す領域で、これを持
つ分子を細胞骨格近傍にアンカーする働きがあると考え
られている。またチロシンフォスファターゼ活性領域は
プロテインチロシンフォスファターゼに、必ず１つ以上
存在する相同性の高い領域であり、チロシン脱リン酸化
能はこの領域によって発揮されると考えられている。一
方ＰＤＺドメインは別名ＧＬＧＦリピートあるいはＤＨ
Ｒとも呼ばれ、ＰＳＤ−９５やＤＬＧ−Ｒファミリー及
びＺＯ−１等の蛋白質に共通して見い出された領域であ
る。近年、ＰＤＺ領域を介して蛋白質−蛋白質結合が形
成されることが見出され、この領域が様々な細胞内シグ
ナル伝達に関与する事が分かってきた［Kim,E.，Nietha
mmer,M.，Rothschild,A.,Jan,Y.N. 及びSheng,M. : Nat
ure 378, 85-88 (1995)］。ＰＴＰ−ＢＡＳはこのＰＤ
Ｚドメインを少なくとも５つ有しているが（図３）、り
ん酸化蛋白質と結合する仕組みは未だ見いだされていな
いことから、基質となるりん酸化蛋白質を認識し、脱り
ん酸化する機構の解明が急がれていた。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、細胞内シ
グナル伝達に関与する蛋白質を得ることを目的として鋭
意、研究を重ねた結果、ＰＴＰ−ＢＡＳのＰＤＺドメイ
ンをバイト（bait）として用い、この領域に結合する蛋
白質の遺伝子をYeast Two-hybrid System(Vojtek,A.,
B., Hollenberg,S.,M.,及び Cooper, J.,A.: Cell 74,2
05-214(1993)）を利用して単離し、その塩基配列を決定
し、それによってコードされている新規な蛋白質のアミ
ノ酸配列を決定した。これらの塩基配列及びアミノ酸配
列は、それぞれ配列番号１及び２に示されている。この
新規な蛋白質は、分子内に２つのＰＨ(pleckstrin homo
logy)ドメインと、Ｃ末端領域にＰＤＺドメインとの結
合領域とを有し、リン酸化蛋白質に対して結合活性を示
すことが分かった。これらの事実は、該蛋白質がシグナ
ル伝達機構に関与することを示唆するものである。

【０００６】従って、本発明は、ＰＤＺドメインを有す
る蛋白質と結合し、カルボキシ末端に配列番号１に記載
のアミノ酸番号３９７−４０４で示されるアミノ酸配列
を有する蛋白質を提供するものである。本発明はまた、
カルボキシ末端に配列番号１に記載のアミノ酸番号３９
３−４０４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質を提
供するものである。上記の本発明の蚕白質には、ＰＤＺ
ドメイン結合領域と２個のＰＨドメインを有する蛋白質
が含まれる。本発明により、細胞内シグナル伝達に関与
する新規な蛋白質をコードするＤＮＡがクローニングさ
れ、該蛋白質のアミノ酸配列及びそれをコードしうるＤ
ＮＡが開示されたので、当業者ならば、当該技術分野で
既知の方法によって該アミノ酸配列において１又はそれ
以上のアミノ酸の挿入、欠失又は置換により、本発明の
新規な蛋白質を得ることができる。従って、本発明はま
た、配列番号１に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配
列に対する１以上のアミノ酸の挿入、欠失又は置換によ
り導かれるアミノ酸配列を有し、ＰＤＺドメインを有す
る蚕白質と結合しうる蛋白質を提供する。

【０００７】本発明はまた、上記の新規な蛋白質をコー
ドしているＤＮＡ、該ＤＮＡを含有するベクター、該ベ
クターで形質転換された宿主細胞、及び該形質転換体を
培養することによる、新規な組換え蛋白質の製造方法を
も提供する。本発明の蛋白質は、後述するように、蛋白
質分子全体のみならずそのフラグメントも有用であり、
そのようなフラグメントとして、配列番号１のアミノ酸
番号２９０−４０４、特にアミノ酸番号３９３−４０
４、中でもアミノ酸番号３９７−４０４で示される配列
を有するペプチドフラグメントを挙げることができる。

【０００８】

【発明の実施の形態】以下に、本発明の蛋白質及びそれ
をコードするＤＮＡ、及びその製造方法について、詳し
く説明する。なお、本明細書中、本発明の新規な蛋白質
を「ＢＡＳ−ＧＲＩＰ」と呼称する。またＢＡＳ−ＧＲ
ＩＰをコードするＤＮＡをＢＡＳ−ＧＲＩＰＤＮＡと
呼称するが、単にＢＡＳ−ＧＲＩＰと記載することもあ
る。本発明の目的から、ＢＡＳ−ＧＲＩＰをコードする
ＤＮＡは、合成ＤＮＡ（例、ｃＤＮＡ）又は天然のＤＮ
Ａ（ゲノムＤＮＡ）のいずれであってもよく、これら全
てを包含するものである。また、本発明の蛋白質ＢＡＳ
−ＧＲＩＰが結合するチロシン残基がリン酸化された蛋
白質を「チロシンリン酸化蛋白質」と称する。

【０００９】ＰＨドメインはpleckstrin、dynamin や m
SOS といった種々のシグナル伝達タンパクに見いだされ
るドメインであり、その機能としてＧ蛋白質との結合や
フォスファチジルイノシトール−４、５−二リン酸（Ｐ
ＩＰ２）などのリン脂質との結合が報告されている［Ha
rlan,J.E., Hajduk,P.J. Yoon H.S. 及び Fesik,S.W.:N
ature,371,168-170(1994)］。また、pleckstrin の結晶
構造解析の結果から、ＰＨドメインが、一次構造上は全
く相同性のない、Shc やIRS-1 のリン酸化チロシン結合
（ＰＴＢ：phospho-tyrosine binding）ドメインとよく
似た立体構造をしている事が報告されており、機能面で
も同様の働きをすることが期待される［Lemmon,M.A.,Fe
rguson,K.M.及びSchlessinger,J.：Cell,85,621-624(19
96)］。しかしながら、実際にＰＨドメインが、チロシ
ンリン酸化蛋白質と結合する事を示した報告はない。

【００１０】後述するように、本発明のＢＡＳ−ＧＲＩ
Ｐは、ＰＨドメインを介してチロシンリン酸化蛋白質と
結合することが示唆され、チロシンりん酸化を介する細
胞内シグナル伝達機構に関与していることが明らかにな
った。具体的には、ＢＡＳ−ＧＲＩＰは、ＰＤＺドメイ
ンをもつチロシンフォスファターゼ、例えばＰＴＰ−Ｂ
ＡＳに基質（チロシンりん酸化蛋白質）を提供する活性
を有する可能性が示唆された。また、本発明のＢＡＳ−
ＧＲＩＰとＰＤＺとの結合には、Ｃ末端側のアミノ酸配
列、配列番号１におけるアミノ酸番号２９０〜４０４、
中でもアミノ酸番号３９３−４０４の１２アミノ酸が重
要な役割を果していることが示された。従って、これら
のペプチドフラグメント又はそれに対する抗体は、ＰＤ
Ｚドメインと、それに結合する蚕白質（例えばＦＡＳ）
の結合を阻害し、シグナル伝達を変化させることがで
き、有用である。なお、ペプチド及びＤＮＡは、新規Ｐ
ＤＺ含有蚕白の検索に利用できる。以下に、ＢＡＳ−Ｇ
ＲＩＰの製造方法、その解析結果を説明する。

【００１１】（１）ＢＡＳ−ＧＲＩＰをコードするＤＮ
Ａ分子の単離ＰＴＰ−ＢＡＳ（type２）のＰＤＺドメインを含むアミ
ノ酸残基番号１２０６−１４９６の領域（Maekawa,K.
ら、FEBS lett. 337,200-206(1994)）をバイト（Bait）
として、ヒト腎臓由来ｃＤＮＡより製作されたtwo-hybr
id screening用ライブラリー（Clontech社、CA、USA）
をyeast two-hybrid system（前掲）によってスクリー
ニングした。これにより、このＰＤＺ領域と結合する活
性のある遺伝子の一部または全部がLexA 結合ドメイン
と融合した形で単離される。単離した遺伝子断片をプロ
ーブとして用いて、再びヒト腎臓由来ｃＤＮＡより作製
されたλgt10ライブラリー（Clontech社、CA、USA）を
ハイブリダイゼーションによりスクリーニングして陽性
クローン(S4-1)を得、配列決定し、目的のＰＴＰ−ＢＡ
ＳのＰＤＺ領域と結合する遺伝子であることを確認し
た。

【００１２】（２）ＢＡＳ−ＧＲＩＰの一次構造単離したＢＡＳ−ＧＲＩＰをコードするＤＮＡ（クロー
ンS4-1)の塩基配列を決定し（配列番号２）、アミノ酸
配列を推定した（配列番号１）。配列番号１のアミノ酸
配列における１位のメチオニン残基（配列表２の６４位
から６６位のＡＴＧコドンに相当）は、翻訳開始部位に
典型的な保存配列に囲まれている。またその上流にはイ
ンフレームで終始コドン（配列表２の４６位から４８位
のＴＡＡコドンに相当）があり、これ以上、上流に蛋白
質コード領域がないことを示している。このアミノ酸配
列のコンピューター解析により、ＢＡＳ−ＧＲＩＰには
pleckstrinと弱い相同性を示す領域が２カ所見出され、
さらに解析を進めた結果、これらはＰＨドメインである
ことが分かった。図１及び２に、ＢＡＳ−ＧＲＩＰの２
つのＰＨドメイン（図中、ＰＨ１及びＰＨ２）とヒトpl
eckstrinＰＨドメイン（図中、PlekN）、ヒトDynaminＰ
Ｈドメイン（図中、DynA）とを対比させて示す。また、
図３に、スクリーニングに用いたＰＴＰ−ＢＡＳのＰＤ
Ｚドメイン及びＢＡＳ−ＧＲＩＰの構造模式図を示す。

【００１３】（３）ＢＡＳ−ＧＲＩＰのＰＤＺドメイン
との結合ＢＡＳ−ＧＲＩＰがどの部分でＰＤＺドメインと結合す
るかを調べるため、種々の変異体をコードするＤＮＡを
作製し、Yeast Two-hybrid Systemによって各変異体の
結合活性を調べた。その結果、図４に示すように、結合
はＢＡＳ−ＧＲＩＰのＣ末端から１２アミノ酸以内の領
域で行われ、Ｃ末端のバリンにアラニンを人工的に付加
すると結合活性が失われる事が分かった。即ちＣ末端の
バリンがフリーのカルボキシル末端をもつことが、ＢＡ
Ｓ−ＧＲＩＰとＰＤＺドメインとの結合に重要である。
従って、この１２アミノ酸ペプチド断片又はそれに対す
る抗体を用いて、ＰＤＺドメインと、それに結合する蚕
白質（例えばＦＡＳ）の結合を阻害し、シグナル伝達を
変化させることができる。また、ペプチド及びＤＮＡは
新規ＰＤＺ含有蚕白の検索に利用できる。

【００１４】（４）ＢＡＳ−ＧＲＩＰの染色体上の位置
決定ＢＡＳ−ＧＲＩＰがヒト染色体のどの部位に存在するか
を決定するため、ＢＡＳ−ＧＲＩＰの一部を特異的にゲ
ノムＤＮＡから増幅するプライマーを用い、ヒト−ハム
スターの雑種細胞から単離したＤＮＡパネルをテンプレ
ートに用いてＰＣＲを行った。その結果、ヒト１０番染
色体上にＢＡＳ−ＧＲＩＰはコードされていることがわ
かった。その位置をさらに詳しく決定するため、同じく
ヒト−ハムスターRadiation Hybrid panelをテンプレー
トにしてＰＣＲを行った。その結果、ＢＡＳ−ＧＲＩＰ
をコードする遺伝子は１０番染色体の長腕に存在するマ
ーカーＷＩ−５２５５の近傍に位置することが分かっ
た。

【００１５】（５）ＢＡＳ−ＧＲＩＰの機能及び考察上記の様に、ＢＡＳ−ＧＲＩＰは２つのＰＨドメインお
よびＣ末端領域にＰＤＺドメインと結合できる部位を有
する。ＢＡＳ−ＧＲＩＰがチロシンフォスファターゼＰ
ＴＰ−ＢＡＳのＰＤＺドメインと結合する蛋白質として
単離されたこと、およびpleckstrinのＰＨドメインの立
体構造が、一次構造的には相同性のないＰＴＢドメイン
と似ている（Lemmon,M.A.,Ferguson,K.M.,Schlessinge
r,J.:Cell,85,621-624(1996))ことから、このＰＨドメ
インにはチロシンリン酸化された蛋白質と結合する活性
があると推察され、それを以下のようにして確認した。

【００１６】１）ＢＡＳ−ＧＲＩＰのＮ末端にＨＡエピ
トープタグを導入した変異体ＨＡ−ＢＡＳ−ＧＲＩＰを
作製し、これを発現ベクターに組み込み、³⁵Ｓ−メチオ
ニン、システイン存在下でサル腎臓由来ＣＯＳ７細胞に
発現させた。この細胞をＰＡＯ（酸化フェニル砒素（Ph
enyl arsine oxide））で処理したのち、細胞を可溶化
し、ＨＡエピトープタグに対する抗体またはＢＡＳ−Ｇ
ＲＩＰに対する抗体で免疫沈降を行った。ＰＡＯはチロ
シンフォスファターゼに対する阻害剤で、この薬剤で細
胞を処理することにより、細胞内のチロシン脱リン酸化
酵素は機能を失い、結果的に細胞内でチロシンリン酸化
が昂進した状態になる。即ち、通常は、特定のシグナル
に反応して、特定の蛋白質がリン酸化され、やがて脱リ
ン酸化され、平常状態に戻るが、ＰＡＯ処理によって、
蛋白質が継続的にリン酸化される異常な状態になる。特
定のシグナルがない時でも、チロシンキナーゼは弱く活
性化されているが、細胞内にチロシンフォスファターゼ
が同時に存在しているため、シグナルは伝わらない。と
ころがＰＡＯ処理によってフォスファターゼ活性が阻害
されるためにこの平衡状態が崩れ、シグナルが入らなく
ても蛋白質がチロシンリン酸化された状態になる。

【００１７】従って、何らかの刺激でチロシンリン酸化
された状態の蛋白質がＢＡＳ−ＧＲＩＰに結合するなら
ば、ＢＡＳ−ＧＲＩＰを免疫沈降した場合、その蛋白質
がＢＡＳ−ＧＲＩＰと一緒に免疫沈降されると考えられ
る。上記の条件でＰＡＯ処理した細胞およびＰＡＯ処理
しなかった細胞からＨＡ−ＢＡＳ−ＧＲＩＰを免疫沈降
した結果、約１００Ｋダルトンおよび約２５Ｋダルトン
の蛋白質がＰＡＯ処理特異的に共沈してくることが分か
った（図５）。２）共沈した蛋白質がリン酸化されていることを確認す
るため、同様の実験を、³⁵Ｓ−メチオニン、システイン
でなく、³²Ｐ存在下で行った。その結果、同様にＰＡＯ
処理特異的にリン酸化された約１００Ｋダルトンおよび
約２５Ｋダルトンの蛋白質が共沈することが示された。
この２つの蛋白質がチロシンにリン酸化を受けているこ
とを確かめるために、この蛋白に相当するバンドを切り
抜き、ホスホアミノ酸分析を行ったところ、これらの約
１００Ｋダルトン及び約２５Ｋダルトンの蛋白質は、い
ずれもチロシンリン酸化されていることが示された(図
６)。

【００１８】３）上記のように、ＢＡＳ−ＧＲＩＰはＰ
ＴＰ−ＢＡＳのＰＤＺドメイン結合能及びチロシンリン
酸化蛋白質結合能を有しており、ＰＴＰ−ＢＡＳにはチ
ロシンリン酸化蛋白質と結合する仕組みは見いだされて
いないことから、チロシンリン酸化蛋白質を、ＰＴＰ−
ＢＡＳ近傍にリクルートしてくる機能を担っていると考
えられる。従って、ＢＡＳ−ＧＲＩＰがその機能を失
う、又は阻害されることにより、特定の蛋白質が脱リン
酸化されなくなり、該蛋白質はそれが関与するシグナル
の受けた状態で維持されることになる。その結果、既述
の「可逆的チロシンリン酸化」システムが崩れ、細胞内
シグナル伝達機構が正常に作動しなくなり、生理的な異
常が引き起こされる可能性がある。

【００１９】４）また、ＢＡＳ−ＧＲＩＰのＰＤＺ結合
部位はセリン−Ｘ（任意のアミノ酸）−バリンといった
ＰＳＤ−９５などのＰＤＺドメイン結合コンセンサス配
列をもっていることから、ＰＴＰ−ＢＡＳ以外のＰＤＺ
を有する蛋白質と結合することが予想される。このよう
に、ＢＡＳ−ＧＲＩＰは、チロシンキナーゼの基質であ
ると同時にフォスファターゼの基質でもあり、細胞内シ
グナル伝達に関与する蛋白質のスクリーニング、シグナ
ル伝達の機構等の解明に有用である。

【００２０】本発明のＢＡＳ-ＧＲＩＰをコードするＤ
ＮＡの発現には、当業者既知の発現ベクター−宿主系か
ら、適当なものを選択して用いることができる。次い
で、選択した発現ベクターのプロモーターの下流に本発
明のＢＡＳ-ＧＲＩＰＤＮＡを挿入し、適当な宿主に導
入し、培養することにより、製造することができる。本
発明のＢＡＳ−ＧＲＩＰＤＮＡを担持する発現ベクタ
ーで形質転換するための宿主としては、大腸菌等の原核
性微生物、Ｓ.セレビシエ等の真核性微生物、さらには
より高等な動物細胞、哺乳類細胞等が用いられる。

【００２１】宿主として、原核性細胞、特に大腸菌を使
用するのに適した発現ベクターは既知であり、例えば、
lacプロモーターやtacプロモーターを用いるものがあ
る。ＢＡＳ−ＧＲＩＰＤＮＡを大腸菌宿主中で発現さ
せるためには、あらかじめ、このＤＮＡを大腸菌の遺伝
子発現系に連結しておく必要がある。大腸菌の発現系に
ついてはすでに多くの成書［例、マニアティスら（Ｍan
iatis），(１９８２),Ｍoleular Ｃloning:ＡＬabor
atory Ｍanual,Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaborator
y］があり、それらに従って行うことができる。

【００２２】酵母での発現のためのプロモーターとして
は、ＡＤＨプロモーター等、哺乳動物細胞での発現のた
めのプロモーターとしては、ＳＲαプロモーター、ＣＭ
Ｖプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＥＦ−１ａプロ
モーター等を挙げることができる。発現ベクターによる
宿主細胞の形質転換は既知であり、Molecular Clonin
g：ALABOLATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laborato
ry Pressに記載の方法で行うことができる。例えば、原
核性宿主の場合は、コンピテントセル作製法、真核性宿
主の場合は、コンピテントセル作製法、哺乳動物細胞の
場合はトランスフェクション法、エレクトロポレーショ
ン法により行うことができる。次いで、得られた形質転
換体を適当な培地に培養する。生産されたＢＡＳ−ＧＲ
ＩＰが培養溶液、培養濾液(上澄み)中に存在していると
きは、培養物を濾過又は遠心分離する。培養濾液から、
天然又は合成の蛋白質の精製、単離に一般的に用いられ
る常法（例えば透析、ゲル濾過、抗ＢＡＳ−ＧＲＩＰモ
ノクロナール抗体を用いてのアフィニティカラムクロマ
トグラフィー、適当な吸着剤を用いてのカラムクロマト
グラフィー、高速液体クロマトグラフィー等）によって
ＢＡＳ−ＧＲＩＰを精製することができる。生産された
ＢＡＳ−ＧＲＩＰが培養形質転換体のペリプラズム及び
細胞質中に存在するときは、濾過や遠心分離によって細
胞を集め、それらの細胞壁及び／又は細胞膜を、たとえ
ば超音波及び／又はリゾチーム処理によって、破壊し
て、デブリス（細胞破砕物）を得る。デブリスを適当な
水溶液（例えばトリス−塩酸緩衝液）に溶解させる。こ
の溶液から、常法によって、ＢＡＳ−ＧＲＩＰを精製す
ることができる。

【００２３】

【実施例】以下に実施例を挙げ、本発明を詳しく説明す
るが、本発明はこれらに限定されない。実施例１ＰＴＰ−ＢＡＳのＰＤＺドメインと結合する
遺伝子断片のクローニングクローニングはYeast two-hybrid systemにより行っ
た。ＰＴＰ−ＢＡＳ（type2）のアミノ酸残基番号１２
０６から１４９６に相当する部分をLexAのＤＮＡ結合ド
メインとの融合蛋白として発現するプラスミドpBTM116-
G2を構築し、これをbaitとして使用した。スクリーニン
グの対象となるライブラリーは１×１０⁶個の独立した
クローンを持つ、ヒト腎臓由来のｃＤＮＡをインサート
とした、human kidney MATCHMAKER cDNAライブラリー
［Clontech社、CA、USA］を用いた。これらのプラスミ
ドを文献［Vojtek,A.,B., Hollenberg,S.,M., & Coope
r, J.,A. : Cell 74,205-214(1993)］に記載されてい
るようにイーストＬ４０株にトランスフォームし、ヒス
チジン要求性の消失及びβガラクトシダーゼ活性の発現
を指標として陽性クローンの単離を行った。スクリーニ
ングは５mM ３−アミノ−１Ｈ−１,２,４−トリアゾー
ルを含むＳＤ−ＬＷＨ培地で作製したプレートを使用し
た。このスクリーニングで４個の陽性クローンを得た。
この陽性クローンの配列を、それぞれ、Autoread Seque
ncing Kit［Pharmacia Biotech社、Uppsala、Sweden］
とA.L.F.DNAシーケンサー［Pharmacia Biotech社、Upp
sala、Sweden］を使用して決定した。その結果、これら
は全く同じ配列を持っていることが判明した。このヌク
レオチド配列の解析により、two-hybrid systemスクリ
ーニング陽性クローンＧ２Ｙ１３は、１７８５個ヌクレ
オチドからなるインサートを持ち、３５アミノ酸がLexA
のＤＮＡ結合ドメインの下流にEcoRI制限酵素サイトで
融合した、融合蛋白を発現することがわかった。

【００２４】実施例２ＢＡＳ−ＧＲＩＰ遺伝子全長ｃ
ＤＮＡの単離 two-hybridスクリーニングで得られた陽性クローンＧ２
Ｙ１３から制限酵素EcoRIでインサートを切り出し、こ
れをReady-To-Go DNA Labeling Kit［PharmaciaBiotech
社、Uppsala、Sweden］および「α−³²Ｐ］dＣＴＰを使
用して標識したものをプローブとして、ヒト腎臓由来ｃ
ＤＮＡを含むλgt10ライブラリー［Clontech社、CA、US
A］をスクリーニングした。このスクリーニングでは、
５×ＳＳＰＥ（ｐＨ７.７）、５×Denhardt's溶液、０.
５％ＳＤＳ及び２０μg／mlサケ精子ＤＮＡを含有する
緩衝液中、６０℃にて１８時間ハイブリダイゼーション
を行った。その結果、１個の陽性クローンＳ４−１を得
た。このＳ４−１の配列解析を行ったところ、two-hybr
id systemでクローニングしたクローン(Ｇ２Ｙ１３)と
３'側が７１９bp重複したシーケンスをもっていること
がわかった。これらクローンの構造及び相互関係の模式
図を図３に示す。ヌクレオチド解析により、Ｓ４−１は
６３ヌクレオチドの５'非翻訳領域と６１２ヌクレオチ
ドの３'非翻訳領域を伴う４０４アミノ酸をコードする
１２１２ヌクレオチドのオープン解読枠を含有している
ことが判明した。Ｓ４−１のヌクレオチド配列を配列番
号２に示す。また、４０４アミノ酸からなるアミノ酸配
列を配列番号１に示す。

【００２５】実施例３ＰＴＰ−ＢＡＳのＰＤＺドメイ
ンに対する、ＢＡＳ−ＧＲＩＰ結合部位の決定 two-hybridスクリーニングで得られた陽性クローンＧ２
Ｙ１３から、ＰＣＲ法により、図４に示すように、アミ
ノ酸残基をＣ末端側から、あるいはＮ末端側から欠損し
たミュータントプラスミドをpBTM116上に構築し、yeast
two-hybrid systemでＰＴＰ−ＢＡＳのＰＤＺドインと
の結合を調べた。結果を図４に示す。図中、結合活性を
示さなかったものは点線で、結合活性を示したものは実
線で表されている。図４から明らかに、Ｃ末端を１残基
でも欠損したもの（クローンN11,N22,N26,N30,N31,N3
3）はＰＤＺドメインとの結合活性を失い、またＣ末端
に人工的にアラニンを付加したもの（クローンN34A）も
結合活性を持たない。Ｎ末端側から欠損させた場合、Ｃ
末端部１２アミノ酸を含んだクローン（クローンC22,C1
2）は結合活性を示したが、さらに４アミノ酸をも削っ
た、Ｃ末端部８アミノ酸のクローン（クローンC8）では
結合活性がないことが分かる。以上の結果から、ＢＡＳ
−ＧＲＩＰのＰＴＰ−ＢＡＳのＰＤＺドメインへの結合
には、Ｃ末端の１２アミノ酸が重要であり、かつ、Ｃ末
端のバリンのカルボキシル末端がフリーであることが必
須であることが分かる。またＣ末端のSer-Asp-ValのSer
をAlaにかえた変異体（クローンC12SA）でも結合力が弱
まったことから、このSerも結合に何らかの寄与をして
いると考えられる。

【００２６】実施例４ＢＡＳ−ＧＲＩＰと、ＰＴＰ−
ＢＡＳのＰＤＺドメインとのin vitroでの結合ＰＴＰ−ＢＡＳ（type２）のアミノ酸残基番号１２０６
から１４９６に相当する部分をＧＳＴとの融合蛋白とし
て発現するベクターpGEX4T1-G2Nと、同じ構築物である
が、アミノ酸残基番号１３６５−１４００（Gly-Asp-Ar
g-Val-Leu）を欠損させたpGEX4T1-G2Dと、アミノ酸残基
番号１３６４Thrと１３６５Glyの間にVal-Leu-Phe-Asp-
Lysを挿入されたpGEX4T1-G2Iを構築した。pGEX4T1-G2D
は、種々のＰＤＺをもつ蛋白質でよく保存されている部
分のうち５アミノ酸を削ったミュータントであり、pGEX
4T1-G2I は、alternative splice産物として見つかった
挿入配列を入れたものである。いずれもスクリーニング
に用いたＰＤＺドメインの保存性の高い部位にアミノ酸
の欠損または挿入がなされており、ＰＤＺドメインの立
体構造に影響を及ぼすと考えられる。即ち、ＢＡＳ−Ｇ
ＲＩＰとＰＴＰ−ＢＡＳのＰＤＺとの結合が非特異的な
ものであれば、ほぼ同じ強度でミュータントと結合し、
微妙な立体構造を要求する特異的なものであれば、結合
に差が出ると期待される。

【００２７】Ｓ４−１をpGEM1ベクターに、Ｔ７プロモ
ーターでｍＲＮＡが合成されるように組み込んだpGEM1-
S4-1を構築し、これをテンプレートにして³⁵Ｓ−Metと
ＴＮＴＴ７coupled Reticulocyte Lysate System［Pr
omega社、WI、USA］を利用して³⁵Ｓ−Metラベルされた
蛋白質をin vitroで合成した。この蛋白質とpGEX4T1-G2
N、pGEX4T1-G2D、pGEX4T1-G2Iを使って調製したＧＳＴ
融合蛋白質各１０μｇをGlutathione-Sepharoseに結合
させ、結合バッファー［50mM Tris-HCl(pH8.0)、150mM
NaCl、5mM DTT、1mM EDTA、0.1% Triton X-100、protea
se inhibitor］中で４℃、１６時間混合した。その後、
結合バッファーで６回洗浄し、ゲルごとＳＤＳ化し、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。ゲルを乾燥後、そのオートラ
ジオグラムをとった。その結果、図７に示すように、正
常なＰＤＺドインのみで結合が観察され、ミュータント
とは全く結合しなかった。なお、図中、n.Sと表示した
バンドはpGEM1ベクター由来の転写産物である。また、
ＢＡＳ−ＧＲＩＰcＤＮＡからは、本来のfull length以
外に途中のMetから転写を開始したと思われるサイズの
小さなバンドが２本検出されている。図７から、ＰＤＺ
ドメインとＢＡＳ−ＧＲＩＰの結合は特異的であること
が分る。

【００２８】実施例５ＢＡＳ−ＧＲＩＰに対するポリ
クローナル抗体の作製ＢＡＳ−ＧＲＩＰの内、アミノ酸残基番号２９０からＣ
末端４０４までをＧＳＴとの融合蛋白質として発現する
プラスミドpGEX-monoを構築し、これを大腸菌ＤＨ５α
で発現し、Glutatinone Sepharose 4Bカラム［Pharmaci
a Biotech社、Uppsala、Sweden］を用いてPharmacia
Biotech社のマニュアルに従ってＧＳＴ融合蛋白質ＧＳ
Ｔ−monoＢＡＳ−ＧＲＩＰを精製し、これを免疫原とし
てウサギに対して免疫を行った。２週間に１回免疫を行
い、４回免疫した。終了後、全採血を行い、抗ＢＡＳ−
ＧＲＩＰウサギ血清を得た。その一部をＧＳＴ−Sephar
oseカラムにかけてＧＳＴに対する抗体を除き、素通り
画分を（ＧＳＴ−monoＢＡＳ−ＧＲＩＰ）−Sepharose
カラムにかけて結合画分を０.１Ｍグリシン−ＨＣｌ
（ｐＨ２.０）で溶出し、１Ｍ Tris−ＨＣl（ｐＨ８.
０）で中和後、ＰＢＳに透析することによってアフィニ
ティー精製を行った。以下の実験には、血清ではなく全
てこの精製抗体を使用した。

【００２９】実施例６ＣＯＳ７細胞でのＢＡＳ−ＧＲ
ＩＰｃＤＮＡの発現ＢＡＳ−ＧＲＩＰ全長を動物細胞で発現させるためヒト
腎臓由来λgt10ライブラリーをスクリーニングして得ら
れた陽性クローンＳ４−１を動物細胞発現ベクターpEFB
OSに組み込み、pEFBOS-S4-1を構築した。このプラスミ
ドをヒト腎臓由来細胞株ＣＯＳ７細胞にトランスフェク
ションし、４８時間培養後、ＲＩＰＡバッファー［10mM
Tris-HCl(pH7.4)、1% NP-40、0.1%sodium deoxycholat
e、0.1%SDS、0.15M NaCl、1mM EDTA、protease inhibit
or］にて可溶化し、上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた
後、イモビロン−Ｐにトランスファーを行い、前項で精
製した抗ＢＡＳ−ＧＲＩＰ精製抗体にてウエスタンブロ
ッティングを行った。その結果、pEFBOS-S4-1を導入し
たＣＯＳ７上清からのみ、抗ＢＡＳ−ＧＲＩＰ抗体で約
５０Ｋダルトンの位置にバンドが現れた（図８）。

【００３０】実施例７ＰＡＯ処理によるＢＡＳ−ＧＲ
ＩＰへの蛋白質の結合の検出Ｎ末端にＨＡエピトープタグ［配列番号３：Tyr-Pro-Ty
r-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala］を付加して、ＢＡＳ−Ｇ
ＲＩＰを発現するプラスミドpEFBOS-NT-S4-1を構築し、
それを用いてサル腎臓由来ＣＯＳ７細胞にトランスフェ
クションした。２４時間培養後、³⁵Ｓ−メチオニン、シ
ステイン存在下で１６時間培養し、その後、終濃度１０
μＭの酸化フェニル砒素（ＰＡＯ）を加え、可溶化バッ
ファー（１％ジギトニン／１０mＭトリエタノールアミ
ン／１５０mＭ塩化ナトリウム／１０mＭヨードアセトア
ミド／１mＭＥＤＴＡ／プロテアーゼ阻害剤）で可溶
化した後、遠心し、上清を採取した。コントロールとし
てＰＡＯ処理していないものを使用した。このプラスミ
ド由来の産物はＮ末端にＨＡエピトープタグが導入され
ているので、抗ＨＡ抗体でも検出する事が出来る。これ
らの上清を、まず４℃でproteinG-sepharose［Pharmaci
a Biotech社、Uppsala、Sweden］と２時間転倒混和
し、proteinGに対する非特異結合の吸収をおこなったの
ち、１μgの抗ＨＡモノクローナル抗体12CA5［Boehring
erMannheim社、Mannheim、Germany］または実施例６で
調製した精製抗ＢＡＳ−ＧＲＩＰ抗体を加え、４℃で１
時間転倒混和した。次いで、２０μｌベッドボリューム
のprteinGを加え、更に４℃１時間転倒混和後、可溶化
バッファーで６回洗浄し、ＳＤＳ化した後、ポリアクリ
ルアミドゲルにて泳動した。泳動後、ゲルを乾かし、オ
ートラジオグラムをとった。その結果ＢＡＳ−ＧＲＩＰ
由来の約５０Ｋダルトンのバンドとそのalternativespl
ice産物である約３０Ｋダルトンのバンドが、ＰＡＯ処
理の有無にかかわらず現れ、その他、約１００Ｋダルト
ンと約２５Ｋダルトンのバンド（それぞれｐ１００、ｐ
２５と命名）がＰＡＯ処理依存的にＢＡＳ−ＧＲＩＰと
共沈してきた（図５）。この結果はＢＡＳ−ＧＲＩＰが
何らかの蛋白質と結合することを示している。

【００３１】実施例８ＰＡＯ処理特異的にＢＡＳ−Ｇ
ＲＩＰに結合する蛋白質のチロシンリン酸化の証明ＰＡＯ処理によってＢＡＳ−ＧＲＩＰに結合する蛋白質
がリン酸化されているか否かを調べるため、³⁵Ｓ−メチ
オニン、システインの代わりに³²Ｐを用いてラベルを行
い、上記と同様の実験を行った。その結果、やはりＰＡ
Ｏ処理特異的にｐ２５およびｐ１００のバンドが現れ、
これらがリン酸化された蛋白質であることが分かった
（図６参照）。このｐ２５およびｐ１００のバンドをＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥのゲルから切り出し、抽出液（0.05M
ＮＨ４ＨＣＯ３、0.1％ＳＤＳ、０．０５％ｖ／ｖメ
ルカプトエタノール）で抽出後、ＢＳＡをキャリヤーと
して加え、ＴＣＡで沈殿させ、この沈殿を洗浄後、６Ｎ
塩酸で、１０５℃にて２時間加水分解を行った。この加
水分解物を１mＭリン酸化チロシン、リン酸化スレオニ
ン、リン酸化セリンを含む溶液で溶かし、ＴＬＣプレー
ト上にスポットした。これを展開溶媒（酢酸：ピリジ
ン：水＝１０：１：１８９）で５００Ｖ、１時間泳動
後、ニンヒドリンにて発色させ、リン酸化チロシン、リ
ン酸化スレオニン、リン酸化セリンの移動位置を検出し
た。このプレートをＸ線フィルムに感光させ、どの位置
に³²Ｐの陰が現れるかを観察した。その結果、リン酸化
チロシンの位置にのみ、バンドが現れ、他のアミノ酸位
には何も検出されなかった（図９参照）。これは、ＰＡ
Ｏ処理によってＢＡＳ−ＧＲＩＰに結合するｐ２５とｐ
１００蛋白質が、チロシンリン酸化されていることを示
している。

【００３２】実施例９ＢＡＳ−ＧＲＩＰのＰＣＲによ
る染色体上の位置決定まず、Somatic Cell Hybrid（BIOS laboratories）に対
して以下のプライマーＰ１とＰ２を用いＰＣＲを行っ
た。 P1; GCCAAAGATG ATAAAGGGGG （配列番号４） P2; TACATTGTTA CCACCCGAAT GAG （配列番号５）このプライマーは同一エクソンに存在するＢＡＳ−ＧＲ
ＩＰ塩基番号１２７８−１４８７、２１０ｂｐを増幅す
る。ＰＣＲはAmpliTaqＤＮＡポリメラーゼ［PERKIN ELM
ER、CT、ＵＳＡ］を用い、９４℃１分間−５８℃１分間
−７２℃１分間のサイクルを３０回行った。その結果細
胞株０１０由来のＤＮＡでのみ増幅されたバンドを認め
た。このことからＢＡＳ−ＧＲＩＰはヒト１０番染色体
上に存在することが分かった。次いで、Low Resolution
GENEBRIDGE 4 Radiation Hybrid Panel［Research Gen
etics, Inc.Alabama, USA］に対してプライマーＰ１と
Ｐ２を用い、上記と同じ条件でＰＣＲを行った。得られ
た結果をインターネットを利用してWICGR Mapping Serv
ice［http:/www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/contig/rh
mapper.pl］で解析したところ、ヒト１０番染色体上の
マーカー、ＷＩ−５２５５の近傍3.15cRのところに位置
することがわかった。

【００３３】

【発明の効果】２個のＰＨドメインと、ＰＤＺ結合領域
とを持った本発明の蛋白質ＢＡＳ−ＧＲＩＰは、ＰＤＺ
ドメインを持ったシグナル伝達物質と、リン酸化を介し
て伝わるシグナルの橋渡しをする機能を有しており、そ
のリン酸化蛋白質との結合にＰＨドメインが関与してい
ることが初めて明らかになった、新規な蛋白質である。
このＢＡＳ−ＧＲＩＰのＰＨドメインは、これらの物質
とＰＤＺドメインを持つ蛋白質（例、チロシンフォスフ
ァターゼ）とをつなぐ役割も果たしていると考えられ
る。従って、これらの連携を、促進あるいは阻害するこ
とにより、細胞内のシグナル伝達を操作することが可能
である。さらに、ＢＡＳ−ＧＲＩＰは、他のＰＤＺドメ
インの結合コンセンサス配列として知られている配列：
Ｓｅｒ−任意のアミノ酸−ＶａｌをそのＣ末端に有し、
本明細書中で例示したＰＴＰ−ＢＡＳ以外のＰＤＺ含有
蛋白質とも相互作用しうることから、ＰＤＺ含有タンパ
ク質検索及びその分布や機能の解析にも有用である。こ
のような目的には、ＢＡＳ−ＧＲＩＰそのもの、及び、
任意のペプチド断片も有用である。例えば、Ｃ末端部の
アミノ酸ペプチドで、これをＢＡＳ−ＧＲＩＰの偽物と
して使用することにより、ＢＡＳ−ＧＲＩＰとＰＤＺと
の結合を阻害し、シグナル伝達系を操作することが可能
である。さらには、ＢＡＳ−ＧＲＩＰのＣ末端部アミノ
酸ペプチドを使って（Yeast-two hybrid systemや細胞
のライセートをこのペプチドのカラムにつけるなどの方
法で)ＰＤＺ含有新規蚕白質のクローニングを行うこと
も可能である。

【００３４】また、ＢＡＳ−ＧＲＩＰの染色体上の位置
から、ＢＡＳ−ＧＲＩＰ遺伝子がある種の癌において、
抑制遺伝子として機能していることが予測される。従っ
て、この遺伝子の発現あるいは変異を調べることによ
り、癌の遺伝子診断への途が拓かれる可能性もある。ま
た、Yeast-two hybrid systemや West-Western法等によ
り、ＢＡＳ−ＧＲＩＰを使って、チロシンリン酸化に関
与する蛋白質の検索ができる。上記のＢＡＳ−ＧＲＩＰ
の様々な用途には、ＢＡＳ−ＧＲＩＰそのもののみなら
ず、例えば、Ｃ末端の１２アミノ酸ペプチドなど、適当
なペプチド断片も有用である。当業者ならば、個々の目
的に応じて、最も適切なペプチド断片を選択することが
でき、さらに、既知の方法で、配列番号１に示されるア
ミノ酸配列から、１又はそれ以上のアミノ酸の挿入、欠
失、置換等により導かれるアミノ酸配列を有し、かつ同
等の機能を有するＢＡＳ−ＧＲＩＰの誘導体を得ること
もできる。従って、これらの様々な誘導体も本発明の範
囲に包含される。

【００３５】

【配列表】

【００３６】配列番号：１配列の長さ：４０４配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列： Met Pro Tyr Val Asp Arg Gln Asn Arg Ile Cys Gly Phe Leu Asp Ile 1 5 10 15 16 Glu Glu Asn Glu Asn Ser Gly Lys Phe Leu Arg Arg Tyr Phe Ile Leu 20 25 30 32 Asp Thr Arg Glu Asp Ser Phe Val Trp Tyr Met Asp Asn Pro Gln Asn 35 40 45 48 Leu Pro Ser Gly Ser Ser Arg Val Gly Ala Ile Lys Leu Thr Tyr Ile 50 55 60 64 Ser Lys Val Ser Asp Ala Thr Lys Leu Arg Pro Lys Ala Glu Phe Cys 65 70 75 80 80 Phe Val Met Asn Ala Gly Met Arg Lys Tyr Phe Leu Gln Ala Asn Asp 85 90 95 96 Gln Gln Asp Leu Val Glu Trp Val Asn Val Leu Asn Lys Ala Ile Lys 100 105 110 112 Ile Thr Val Pro Lys Gln Ser Asp Ser Gln Pro Asn Ser Asp Asn Leu 115 120 125 128 Ser Arg His Gly Glu Cys Gly Lys Lys Gln Val Ser Tyr Arg Thr Asp 130 135 140 144 Ile Val Gly Gly Val Pro Ile Ile Thr Pro Thr Gln Lys Glu Glu Val 145 150 155 160 160 Asn Glu Cys Gly Glu Ser Ile Asp Arg Asn Asn Leu Lys Arg Ser Gln 165 170 175 176 Ser His Leu Pro Tyr Phe Thr Pro Lys Pro Pro Gln Asp Ser Ala Val 180 185 190 192 Ile Lys Ala Gly Tyr Cys Val Lys Gln Gly Ala Val Met Lys Asn Trp 195 200 205 208 Lys Arg Arg Tyr Phe Gln Leu Asp Glu Asn Thr Ile Gly Tyr Phe Lys 210 215 220 224 Ser Glu Leu Glu Lys Glu Pro Leu Arg Val Ile Pro Leu Lys Glu Val 225 230 235 240 240 His Lys Val Gln Glu Cys Lys Gln Ser Asp Ile Met Met Arg Asp Asn 245 250 255 256 Leu Phe Glu Ile Val Thr Thr Ser Arg Thr Phe Tyr Val Gln Ala Asp 260 265 270 272 Ser Pro Glu Glu Met His Ser Trp Ile Lys Ala Val Ser Gly Ala Ile 275 280 285 288 Val Ala Gln Arg Gly Pro Gly Arg Ser Ala Ser Ser Glu His Pro Pro 290 295 300 304 Gly Pro Ser Glu Ser Lys His Ala Phe Arg Pro Thr Asn Ala Ala Ala 305 310 315 320 320 Ala Thr Ser His Ser Thr Ala Ser Arg Ser Asn Ser Leu Val Ser Thr 325 330 335 336 Phe Thr Met Glu Lys Arg Gly Phe Tyr Glu Ser Leu Ala Lys Val Lys 340 345 350 352 Pro Gly Asn Phe Lys Val Gln Thr Val Ser Pro Arg Glu Pro Ala Ser 355 360 365 368 Lys Val Thr Glu Gln Ala Leu Leu Arg Pro Gln Ser Lys Asn Gly Pro 370 375 380 384 Gln Glu Lys Asp Cys Asp Leu Val Asp Leu Asp Asp Ala Ser Leu Pro 385 390 395 400 400 Val Ser Asp Val 404 404

【００３７】配列番号：２配列の長さ：２９４４配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ配列 GGTGCAGTTT AGCATGTTCC TCTGTGTTCT GCATCTCCTG TAGTGTAATG TTCAAGCTCA 60 GAA 63 ATG CCT TAT GTG GAT CGT CAG AAT CGC ATT TGT GGT TTT CTA GAC ATT 111 GAA GAA AAT GAA AAC AGT GGG AAA TTT CTT CGA AGG TAC TTC ATA CTG 159 GAT ACC AGA GAA GAT AGT TTC GTG TGG TAC ATG GAT AAT CCA CAG AAC 207 CTA CCT TCT GGA TCA TCA CGT GTT GGA GCC ATT AAG CTT ACC TAC ATT 255 TCA AAG GTT AGC GAT GCT ACT AAG CTA AGG CCA AAG GCG GAG TTC TGT 303 TTT GTT ATG AAT GCA GGA ATG AGG AAG TAC TTC CTA CAA GCC AAT GAT 351 CAG CAG GAC CTA GTG GAA TGG GTA AAT GTG TTA AAC AAA GCT ATA AAA 399 ATT ACA GTA CCA AAG CAG TCA GAC TCA CAG CCT AAT TCT GAT AAC CTA 447 AGT CGC CAT GGT GAA TGT GGG AAA AAG CAA GTG TCT TAC AGA ACT GAT 495 ATT GTT GGT GGC GTA CCC ATC ATT ACT CCC ACT CAG AAA GAA GAA GTA 543 AAT GAA TGT GGT GAA AGT ATT GAC AGA AAT AAT CTG AAA CGG TCA CAA 591 AGC CAT CTT CCT TAC TTT ACT CCT AAA CCA CCT CAA GAT AGT GCG GTT 639 ATC AAA GCT GGA TAT TGT GTA AAA CAA GGA GCA GTG ATG AAA AAC TGG 687 AAG AGA AGA TAT TTT CAA TTG GAT GAA AAC ACA ATA GGC TAC TTC AAA 735 TCT GAA CTG GAA AAG GAA CCT CTT CGC GTA ATA CCA CTT AAA GAG GTT 783 CAT AAA GTC CAG GAA TGT AAG CAA AGC GAC ATA ATG ATG AGG GAC AAC 831 CTC TTT GAA ATT GTA ACA ACG TCT CGA ACT TTC TAT GTG CAG GCT GAT 879 AGC CCT GAA GAG ATG CAC AGT TGG ATT AAA GCA GTC TCT GGC GCC ATT 927 GTA GCA CAG CGG GGT CCC GGC AGA TCT GCG TCT TCT GAG CAT CCC CCC 975 GGT CCT TCA GAA TCC AAA CAC GCT TTC CGT CCT ACC AAC GCA GCC GCC 1023 GCC ACC TCA CAT TCC ACA GCC TCT CGC AGC AAC TCT TTG GTC TCA ACC 1071 TTT ACC ATG GAG AAG CGA GGA TTT TAC GAG TCT CTT GCC AAG GTC AAG 1119 CCA GGG AAC TTC AAG GTC CAG ACT GTC TCT CCA AGA GAA CCA GCT TCC 1167 AAA GTG ACT GAA CAA GCT CTG TTA AGA CCT CAA AGT AAA AAT GGC CCT 1215 CAG GAA AAA GAT TGT GAC CTA GTA GAC TTG GAC GAT GCG AGC CTT CCG 1263 GTC AGT GAC GTG 1275 TGAGGCAGAA GCGCACGGAG CCTGCCTGCC TCTGCCGTCC TCAGTTTCCT TTCATGAGGC 1335 TTCTAGCCAA AGATGATAAA GGGGGAAATG GTTTTTAGTG CGTATATTAT ACTGCCTCTT 1395 AGGTGTACTC TTTATAAGCT GGTAAACCAA GAATCTAGGG AGTGGCCAAA CTAAATATAA 1455 TTTCTTTAAA AAAGAAAGAA AAAGGAAAAA TCCAAAATAT CTCAGTATCA TCTGTCTGAA 1515 GCATTGTGTG TTCTCATTCG GGTGGTAACA ATGTATGTGT AATATTTTTT TCTTAGTGAT 1575 TTTGACAGTT TAAATGTTTA ACAACTTAAA GCATTAAAAA TGCTTATTAA TAACTTTGGT 1635 CATTTAAAAA ATGCTACAAT GACTTCCTAT TAAAGGTTCA ATATTTACAC ATTCTTATTG 1695 GTTGATATTA CCACATGAAA TATTGCCAGA CCAAGATACC TAAACTCATG ATGTCTGTGG 1755 TGCTGTAAAA TTTATACTAA AATGTGGACT ATTTTGAAAT TATAACCATT TTTGATGCCC 1815 TGAATCTTGA GGTGACTTAT TTTGCATAGA GGATATGGAT AGACCAACAG TAAGGGTTGT 1875 GGGTTATACC GGCATAGAGA AAAGAAGAAA ACTAGAATTG AAACAACTGT GTCTTAGACA 1935 TTTGTTTGAA AAAGCTTCAT CAGGCCTTGG AGCAGTCACT GCTTTATTCC GCAAAAATTA 1995 TTTGGTAGGA AATTTTTGGG AGATCTGATT TTCTTATCCA AGTTTTGTAA ATAGTTGTTA 2055 TTTCTATATT TGGATTGGTG AAAGACCTCA AGTTTATATG TAAAGACATA ACTGCCCTTA 2115 GTCATGAAAT TGTTGTGACC TCTACTTTTT GTCACTAATA GCCTACATTC AAGTGCCTGT 2175 GTTTTTTCAT CTTGTTTAGG AATGTTTTGA GATTAATGTG CTTAAAAGTC CTACGTGACT 2235 GATTTTAAAC ATTGTGATAA AATTAATTTT CAGTAGAATA GTTGAATGTG TTAAGATAGG 2295 ATTTTATGTT AGAGATACCA GAATGCTGGT ATTCTACTAC TTGTGCAATA TATATGTTTT 2355 AAAAAAACAA ATTTGAGAAT ACATTTAATC ATAGGGATAT AGATATAAGC ACCTCTCTAA 2415 AGAATCTTTA GTTTCCGACG TTGAATTATA GACCAGTTTG AGTAAGTACT GCTTTTTTTT 2475 TTTTGGAGAC GGGCTCTCGC TCTGTTGCTC AGGCTGGAGT GCAGTGGCGT GATCTCAGCT 2535 CACTACAGCC TCCACCTCGT GGGTTCAAAC AGTTGTGCTG CCTCAGCTTC CCGAGTAGCT 2595 AGGATTACAG GTGCATGCCA CCACACCTGG CTAATTTTTG TATTTTAGTA GAGATGGGGT 2655 TTCACCATGT TGGCCAGGCT CGTCTCGAAC TCCTGACTTC AGGTGATCCA CCCATCTCAG 2715 CCTCCCAAAG TGCTGGGATT ACAGGCGTGA GCCACCATGC CCGGCCCATA AGTACCGTTT 2775 TTGAGGTTCA GTCTTAAACA TTTGCTTTAA GAAAACAGTC TTGAATTTCA CATGCTGCTA 2835 TTTTTATATT TTGCCATTTT ACAGTACTGT TTTGTTTTGA ATTCATGCAT ATCATTGAAA 2895 ATTTCTCGTT TTCATTTTCT TAGATGACTT CTTGTCTGAG ACAGAAAAA 2944

【００３８】配列番号：３配列の長さ：９配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ペプチド配列： Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala 5 9 9

【００３９】配列番号：４配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列： GCCAAAGATG ATAAAGGGGG 20

【００４０】配列番号：５配列の長さ：２３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列： TACATTGTTA CCACCCGAAT GAG 23

【図面の簡単な説明】

【図１】ＢＡＳ−ＧＲＩＰの２つのＰＨドメインと、
ヒトpleckstrin及びヒトdynaminのＰＨドメインとの相
同性の比較のための模式図。

【図２】ＢＡＳ−ＧＲＩＰの２つのＰＨドメインと、
ヒトpleckstrin及びヒトdynaminのＰＨドメインとの相
同性の比較のための模式図。

【図３】ＰＴＰ−ＢＡＳ及びＢＡＳ−ＧＲＩＰの構造
模式図。

【図４】ＰＴＰ−ＢＡＳのＰＤＺドメインとの結合領
域を決めるためのミュータントの構造を示す模式図。図
中、結合活性を示さなかったものを点線で、結合活性を
示したものを実線で表している。

【図５】 N末端にＨＡエピトープタグが付加されたＢ
ＡＳ−ＧＲＩＰを発現するプラスミドpEFBOS-NT-S4-1を
発現させたＣＯＳ７細胞を³⁵Ｓ−メチオニン、システイ
ン存在下で培養し、ＰＡＯ処理後、抗ＨＡモノクローナ
ル抗体又は精製抗ＢＡＳ−ＧＲＩＰ抗体と共沈する蛋白
質を示す、ポリアクリルアミドゲル電気泳動の模写図。
約１００Ｋダルトンと約２５Ｋダルトンの位置に、ＰＡ
Ｏ処理依存的に精製抗ＢＡＳ−ＧＲＩＰ抗体により共沈
する、２つの蛋白質ｐ１００及びｐ２５が示されてい
る。

【図６】図５と同様の実験を、³⁵Ｓ−メチオニン、シ
ステインの代わりに³²Ｐを用いて行った結果を示す模写
図。

【図７】ＰＴＰ−ＢＡＳ（type２）のアミノ酸残基番
号1206から1496に相当する部分をＧＳＴとの融合蛋白と
して発現するベクターpGEX4T1-G2Nと、アミノ酸残基番
号1365-1400を欠損させたpGEX4T1-G2D及びアミノ酸残基
番号1364Thrと1365Glyの間に挿入を含むpGEX4T1-G2Iと
を用いて調製したＧＳＴ融合蛋白質，GST-G2N，GST-G2D
及びGST-G2Iと、pGEM1ベクターを用いてＢＡＳ−ＧＲＩ
ＰをコードするＳ４−１を組み込んだpGEM1-S4-1をテン
プレートにして、in vitroで合成した³⁵Ｓ−Metラベル
蛋白質との結合活性を示す、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの模写
図。図中、n.Sと表示したバンドはpGEM1ベクター由来の
転写産物であり、ＢＡＳ−ＧＲＩＰcＤＮＡからは、本
来のfull length以外に途中のMetから転写を開始したと
思われるサイズの小さなバンドが２本検出されている。

【図８】ＢＡＳ−ＧＲＩＰをコードするクローンＳ４
−１を組み込んだ発現ベクターpEFBOS-S4-1によりトラ
ンスフェクションしたＣＯＳ細胞により発現された蛋白
質の、抗ＢＡＳ−ＧＲＩＰ精製抗体によるウエスタンブ
ロッティングの結果を示す模写図。

【図９】図６のリン酸化されたバンドｐ２５とｐ１０
０の、ホスホアミノ酸分析の結果を示す模写図。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ＰＤＺドメインを有する蛋白質と結合
し、カルボキシ末端に配列番号１に記載のアミノ酸番号
３９７−４０４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白
質。
【請求項２】カルボキシ末端に配列番号１に記載のア
ミノ酸番号３９３−４０４で示されるアミノ酸配列を有
する蛋白質。
【請求項３】ＰＤＺドメイン結合領域と２個のＰＨド
メインを有する請求項１又は２記載の蛋白質。
【請求項４】配列番号１に記載のアミノ酸配列又は該
アミノ酸配列に対する１以上のアミノ酸の挿入、欠失又
は置換により導かれるアミノ酸配列を有する請求項１又
は２記載の蛋白質。
【請求項５】請求項１〜４のいずれかに記載の蛋白質
をコードするＤＮＡ。
【請求項６】配列番号２に記載する塩基配列からなる
ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
し、かつＰＤＺドメインを有する蛋白質と結合する蛋白
質をコードするＤＮＡ。
【請求項７】請求項５又は６記載のＤＮＡを含有する
ベクター。
【請求項８】請求項７記載のベクターで形質転換され
た形質転換体。
【請求項９】請求項８記載の形質転換を培地で培養す
ることからなる請求項１〜４のいずれかに記載の蛋白質
の製造方法。
【請求項１０】請求項１〜４のいずれかに記載の蛋白
質に対する抗体。
【請求項１１】請求項５又は６記載のＤＮＡにハイブ
リダイズし、該ＤＮＡの一部又は全部の増幅に使用しう
るオリゴヌクレオチド。