JP3993649B2 - 精製された膜タンパク質の凍結による再活性化方法 - Google Patents

Description

【０００１】
本発明は、精製された膜タンパク質を、それらが活性タンパク質になるように再活性化する方法に関する。
【０００２】
膜タンパク質、たとえば受容体は１または２以上の膜貫通ドメインならびに細胞内および細胞外ドメインから構成される。この種のタンパク質の活性は、多くの場合、その精製されたタンパク質を人工膜中に統合したのちに測定される。
【０００３】
組織因子（組織トロンボプラスチン）を一例として取り上げることができる。この第VII因子の受容体はアポタンパク質および脂質から構成されている。アポタンパク質はグリコシル化された２６３個のアミノ酸のポリペプチドである。このタンパク質はカルボキシル末端付近に２３個のアミノ酸の疎水性配列を有し、この部分によって膜に繋留されている。細胞内部分は２１個のアミノ酸から構成されている。インビボにおいては、組織因子は、血液とは直接接触しない細胞中に、膜内在性タンパク質として存在する。細胞表面受容体としては、その生理学的機能に、血液もしくは血漿との接触時における血漿凝固第VII因子の結合およびその活性化がある。この複合体はセリンプロテアーゼ活性を有し、またその役割として、第IX因子および第Ｘ因子を活性化し凝固を誘発することができる。
【０００４】
組織因子の単離方法は２つに分類することができる。第一の方法では、活性組織因子は適当な組織の破砕ついで相当する膜断片の単離により部分的に精製される。この物質は、まず第一に、血漿凝固試験のために診断的に使用される試薬の調製に用いられる。膜タンパク質はその全体が単離される（すなわち、結合脂質分子を包含する）ので、アポタンパク質の再活性化の必要はない。
【０００５】
第二の方法は単離されたアポタンパク質を取得するものである。この場合アポタンパク質の活性はほとんど残っていないので、再活性化されなければならない。このためには、アポタンパク質は脂質膜中に再統合されなければならない。この操作は組換え体によって得られるタンパク質の場合には必須である。その産生に使用される微生物は通常、十分に活性な膜タンパク質を供給することができないからである。原理的に、これらの考慮はインビトロにおいて部分的もしくは全体的合成によって製造されるタンパク質の場合にも必要である。
【０００６】
精製された膜タンパク質を脂質膜内に再導入するためには多くの方法が知られている。このためには通常、リン脂質を、界面活性剤たとえばTriton Ｘ100を用いて水溶液とする。この溶液をついで膜タンパク質と混合する。その後、界面活性剤はたとえば透析によって除去される。アポタンパク質をリン脂質と混合する間および界面活性剤の除去の間に、形成する膜小胞中にタンパク質が取り込まれる。デオキシコ−ル酸は透析により除去できるので、好ましい界面活性剤である。しかしながら、他の界面活性剤も原則として、それらを混合液から再び除去できるのであれば、使用することが可能である。
【０００７】
本発明の基盤となった目的は、膜タンパク質を可能な限り迅速に脂質小胞中に統合させ、それにより最小限の工程数を用いて膜タンパク質を再活性化することができる簡易化された方法を利用可能にすることであった。
【０００８】
驚くべきことに、この再脂質化は、リン脂質、界面活性剤および膜タンパク質の混合物を凍結することによって簡単に達成できることが見出されたのである。続く反応混合物からの界面活性剤の除去は必ずしも必要ではない。
原理的に、この新規な方法は、精製されたタンパク質の混合物にも同様に適用することができる。
【０００９】
再脂質化は、好ましくは濃縮された、液体の好ましくは水性の、リン脂質、界面活性剤および膜タンパク質の混合物を凍結することによって達成できることが見出された。凍結は０℃〜−２００℃の温度、好ましくは約−７０℃で行うことができる。凍結の速度にはとくに限界はない。混合物が凍結状態に維持される期間は１時間〜１年間の間で変動させることができる。混合物は好ましくは約１６時間凍結させる。混合物全体が均一に凍結されていることが有利である。解凍は、０℃〜１００℃、好ましくは約３７℃で行われる。
【００１０】
本技術分野における通常の技術を有する者にはそれ自体よく知られている植物または動物起源の材料が、リン脂質として、既知成分の天然の混合物のまま使用できる。本技術分野における通常の技術を有する者によく知られている純粋なリン脂質またはその混合物も使用できる。この新規な方法においては、植物リン脂質の混合物の使用が好ましい。凍結させる混合物中における脂質濃度は好ましくは０mg／mlを超える濃度から５００mg／mlまでの濃度である。
【００１１】
膜タンパク質は、ヒト、植物、動物、微生物または組換え体起源の膜タンパク質とすることができる。また、天然に存在するタンパク質の不活性変異体を活性化することも可能である。
【００１２】
ヒトタンパク質、および適当な組換えタンパク質であるこの種のタンパク質がとくに好ましい。
０mg／mlを超える濃度から５０mg／mlまでの濃度に溶解した膜タンパク質の使用がとくに好ましい。
【００１３】
非イオン、陰イオンまたは陽イオン界面活性剤は純粋な形態または一緒に混合して、界面活性剤として使用できる。その濃度は０％を超える濃度から５０％までの濃度である。この新規な方法では非イオン界面活性剤Triton Ｘ100を２％の濃度で用いて行うのが好ましい。
【００１４】
好ましくは、リン脂質は最初に水中または水性液体中に０％を超える濃度から５０％までの濃度に、乳化する。界面活性剤を水中または水性液体中に０％を超える濃度から５０％までの濃度に溶解する。ついで、リン脂質、界面活性剤および膜タンパク質を、各場合に適当な分量比で混合する。混合物を０℃〜−２００℃で凍結する。混合物全体が完全に凍結されたならば、この温度に１時間から１年間の期間、好ましくは１６時間維持する。その後、０℃〜１００℃の温度、好ましくは３７℃で解凍する。過剰の界面活性剤は緩衝液に対して透析することによって除去することもできるし、また、以後の反応にもう干渉しないように大量の緩衝液を添加して希釈してもよい。
【００１５】
凍結は水の存在下で行うのが好ましい。しかしながら、この成分の液体混合物を水の不存在下に凍結することも可能と思われる。脂質および界面活性剤とともに凍結する場合、膜タンパク質は固体マトリックスに結合させておくこともできる。
【００１６】
再脂質化後、膜タンパク質は脂質膜中に取り込まれて活性型である。その後の使用のためには、必要に応じて、添加物を加え製剤化して提供することができる。
【００１７】
この新規方法により、たとえば組織因子アポタンパク質が再脂質化されれば、それは治療剤としてまたは診断薬として使用することができる。第二の例では、再脂質化組織因子は、とくに、血漿凝固のモニタリングの目的でのプロトロンビン時間測定用の試薬に処理することができる。
【００１８】
この新規な方法が既知の報告されている膜タンパク再脂質化法に比べて有利な点は、実施が簡単な点である、とくに、労力を要し経費のかかる、界面活性剤を含まない緩衝液に対する透析工程を省略することが可能である。
【００１９】
本発明を以下に、組織因子アポタンパク質を例に用いて、さらに詳細に説明することにする。
【００２０】
例１：組換え体によって得られ精製されたヒト組織トロンボプラスチンアポタンパク質の再脂質化のための凍結の使用
以下の成分を一緒に混合した。
蒸留水中10％リン脂質懸濁液(Phospholipon 25P，Nattermann) ３０ml
１mg／ml精製ヒト組織トロンボプラスチンアポタンパク質 ５ml
20％Triton Ｘ100 ４ml
蒸留水 １ml
１時間撹拌したのち、混合物を−７０°で１６時間凍結する。この期間の終了時点で、混合液を３７℃で解凍し、２０Ｌの
Ｎ−(２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ′−(２−エタン
スルホン酸)，pH７.５ ５０mM
塩化カルシウム １３mM
で希釈する。
プロトロンビン時間の測定にはシュニッツガー・グロス(Schnitger and Gross）凝固計（正常ヒト血漿プール０.１ml＋再脂質化組織因子０.２ml）を用い、凝固時間１０.８ｓが得られた。
【００２１】
例２：再脂質化の温度依存性
試薬はほぼ例１の記載のようにして調製された。膜タンパク質、界面活性剤および脂質の混合物は−２０℃および−６０℃で凍結し、ついで緩衝液で希釈した。
陰性対照として用いるために、脂質とタンパク質の混合物、および脂質と界面活性剤の混合物を同様に凍結し、解凍した。ついで、欠けている成分および緩衝液を添加して混合した。
以下の凝固時間が、シュニッツガー・グロス凝固計を使用して、正常ヒト血漿プ−ルについて得られた。
【表１】

【００２２】
例３：試薬の品質：第VII因子感受性
正常ヒト血漿プールは第VII因子−欠損血漿（Behringwerke AG，Marburg，Germany）によって希釈した。第VII因子の濃度は１００％から１％（正常ヒト血漿プールに基づく）の間で使用した。
サンプルのプロトロンビン時間はついで、シュニッツガー・グロス凝固計によって測定した。測定された時間は正常ヒト血漿プールのプロトロンビン時間との比とした。サンプル中の第VII因子濃度に対しプロットされた相対プロトロンビン時間を図１に示す。
【数１】

以下の２種の組織因子試薬が用いられた。
ａ：ヒト胎盤から単離したネイティブな組織因子（Thromborel S, Behringwerke AG）。
ｂ：組換え体組織因子アポプロテインに基づく、新規方法（例１による）に従って調製された試薬。
ヒト集団における第VII因子濃度の正常範囲（９５百分位数）はプロトロンビン比１.００±０.２０の範囲内である。比がこの範囲外にある血漿は病的異常と考えられる。この感度限界に相当する第VII因子濃度は、ここで試験された２種の試薬で極めて類似している。
第VII因子１０％未満の範囲においては、組換え体組織因子アポタンパク質に基づく試薬の方が感度が高いことが明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図１】サンプル中の第VII因子濃度に対しプロットされた相対プロトロンビン時間を示す図。

Claims (11)

1. 組織因子アポタンパク質を脂質および界面活性剤の存在下に凍結し、凍結された物質をついで解凍することからなる組織因子アポタンパク質の再活性化方法。
2. 組織因子アポタンパク質は、ヒト、動物または組換え体起源である請求項１に記載の方法。
3. 組織因子アポタンパク質は、変異体である請求項１に記載の方法。
4. 純粋な脂質、純粋な脂質の混合物または天然脂質混合物を用いる請求項１に記載の方法。
5. 界面活性剤は０％を超える濃度から５０％までの濃度で用いる請求項１に記載の方法。
6. 非イオン界面活性剤が使用される請求項１に記載の方法。
7. 凍結は０℃〜−２００℃の温度で行う請求項１に記載の方法。
8. 溶解させた組織因子アポタンパク質を用いる請求項１に記載の方法。
9. アフィニティーカラムに結合させた組織因子アポタンパク質を使用する請求項１に記載の方法。
10. 組織因子アポタンパク質は、０mg／mlを超える濃度から５０mg／mlまでの濃度とする請求項１に記載の方法。
11. 脂質は０mg／mlを超える濃度から５００mg／mlまでの濃度とする請求項１に記載の方法。

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