JP3549559B2 - 精製した膜タンパク質の再活性化法 - Google Patents
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Description
【発明の背景】
本発明は、精製した膜タンパク質の再活性化法に関する。
【0002】
膜タンパク質(例えば、レセプター)は、一以上の膜貫通領域並びに細胞内および細胞外領域から構成される。このようなタンパク質の活性は、精製したタンパク質を人工膜へ組込んだ後にしばしば測定されている。
【0003】
組織因子(組織トロンボプラスチン)を、一例として挙げることができる。この血液凝固系のVII 因子のレセプターは、アポタンパク質および脂質からなっている(Pitlick, F.A. およびNemerson, Y.、1970年)。このアポタンパク質は、263個のアミノ酸からなるグリコシル化されたポリペプチドである。これはカルボキシ末端付近に23個のアミノ酸の疎水性配列を有し、これによりアポタンパク質は膜に固定されている。細胞内部分は21個のアミノ酸からなっている(Fisher等、1987年;Morrissey 等、1987年)。インビボでは、組織因子は血液と直接に接触しない細胞の膜内在性タンパク質として存在している。その細胞表面レセプターとしての生理的機能は、血液または血漿と接触した時点での血漿凝固VII 因子との結合と活性化である。この複合体はセリンプロテアーゼ活性を有し、因子IXおよびXを活性化することにより凝固を開始させることができる。
【0004】
組織因子を単離するには2種類の異なる方法がある。その1つによると、活性な組織因子は、好適な組織を崩壊させ、膜画分を単離することによって部分精製される。この材料は、主として血漿中の血液凝固を調べる診断試薬の調製に使用される。この膜タンパク質は結合脂質分子を含んで単離されるため、アポタンパク質の再活性化が不要である。
【0005】
二番目の方法では、単離したアポタンパク質が得られる。これはほとんど失活しているため(Broze, G.J. 等、1985年)、再活性化の必要がある。そのためには、これを脂質膜内に再度組込まなければならない(Pitlick, F.A. およびNemerson, Y.1970年、Bach等、1981年)。前記の組織因子を製造する微生物では活性の十分な膜タンパク質を提供することができないため、この方法は組換体を通じて得られるタンパク質に必須である。これらの原則的な知見は、インビトロでの部分または全合成によって調製できるタンパク質にもあてはまる。
【0006】
精製した膜タンパク質を脂質膜に再度組み込む方法としては、多くのものが知られている。このためには、通常は界面活性剤、例えばデオキシコール酸塩など、を用いてリン脂質の水性懸濁液を調製する。この懸濁液を、精製した膜タンパク質と混合する。続いて、界面活性剤を透析などを用いて除去する。アポタンパク質をリン脂質懸濁液と混合するかまたは界面活性剤を除去することによって、このタンパク質は生成する膜小胞に取り込まれる(Pitlick, F.A. およびNemerson, Y.、1970年)。デオキシコール酸塩は透析によって除去することができるので、好ましい界面活性剤である。しかしながら、原則的には、混合物から除去することができるならば、他の界面活性剤を用いることもできる。
【0007】
例えば、Wijngaards等は、タウロコール酸ナトリウムを界面活性剤として用いて組織因子を再脂質化する方法について記載した。彼らはpH4.0で最適pHとなることを見出したが、再脂質化後に混合物から界面活性剤を除去しなければならなかった。
【0008】
界面活性剤を使用する根本的な欠点は、混合物からこれらの補助剤を除去する必要があるということである。これらはタンパク質の膜への取り込みを媒介するものの、脂質小胞にも組込まれるため、膜−タンパク質複合体の活性を著しく妨害する。界面活性剤を除去するには、混合物は概して大量の緩衝液に対して透析される。この段階は時間と手間がかかり、収率や活性の損失を引き起こす。その上、この方法では、界面活性剤を完全に除去することはできない。
【0009】
【発明の概要】
本発明は、界面活性剤を使用せずに精製した膜タンパク質を再活性化し、生理的環境におけるタンパク質と機能的に一致するようにする簡便な方法を提供することをその目的とする。この再活性化は、適切な膜タンパク質の好適な脂質ミセルへの取り込み(再脂質化)から成る。これは凝固過程における精製した組織因子アポタンパク質の天然の生理活性を回復することのできる唯一の手段である。
【0010】
【発明の具体的説明】
驚くべきことに、再脂質化は界面活性剤によらずタンパク質/脂質混合物を酸性にしおよび/または加熱することによって行うことができることが分かった。原則として、本発明による方法は、精製したタンパク質の混合物にも適用できる。
【0011】
再脂質化は、十分に低いpH値でタンパク質とリン脂質とを混合することによって行うことができる、ということが分かっている。この方法では、リン脂質を界面活性剤によって溶解する必要はなく、代わりに水溶液中でそれらを乳化するだけで十分である。試料を混合して均質にした直後に、pHを所望の値へ再度調整することができる。適当なpHはpH1〜5の間、好ましくはpH2〜4、特に好ましいpHは約3である。当業者に既知の植物または動物由来の天然リン脂質混合物を使用することができる。当業者に既知の所定の純粋な物質またはその混合物も、同様に使用することができる。本発明による方法は、植物リン脂質の混合物を用いて行うのが好ましい。
【0012】
再脂質化は、溶解した膜タンパク質またはアフィニティーカラム(例えばポリクローナルまたはモノクローナル抗体を含む免疫吸着カラム)に結合した膜タンパク質を用いて行うことができる。原則としては、人間、植物、動物、微生物または組換体由来の膜タンパク質が使用でき、天然に存在するタンパク質の突然変異体も同様に使用することができる。最高50mg/mlまでの濃度に溶解した膜タンパク質の使用が好ましい。この場合、最初にリン脂質の水性エマルジョンを200mg/mlまで、好ましくは50mg/mlまでを酸性pHで緩衝液と混合する。次に、精製した膜タンパク質をこの酸性エマルジョンに加えて混合する。1〜10分、好ましくは2〜6分間のインキュベーション後に、緩衝液を加えて混合物を中和する。
【0013】
本発明の目的は、リン脂質の存在下でタンパク質を加熱することによって、膜タンパク質を脂質膜に組込む第二の態様に基づいており、またこれを達成することができる。酸性化に関した方法と同様、界面活性剤によって脂質を溶解することは必要ない。リン脂質として既に前記したような材料を使用することができる。
【0014】
使用する膜タンパク質およびリン脂質の型および好ましい濃度の範囲は、本発明の第一の態様と同じである。
【0015】
50℃〜130℃、より好ましくは80〜95℃で1〜10分間の加熱が好ましく、より好ましくは4〜6分間程度である。続いて混合物を1〜10分、好ましくは4〜6分程度以内に室温に冷却し、続いて緩衝液を加える。
【0016】
再脂質化の後、膜タンパク質は脂質膜に組み込まれた活性な形態で存在する。これは好適な添加物を加えて提供したり、次の工程に付すことができる。組織因子アポタンパク質を本発明による方法の1つを用いて再脂質化する場合、これを治療薬または診断薬として使用することができる。後者の場合、再脂質化組織因子は、詳細には血漿中の血液凝固を調べる目的で、プロトロンビン時間(以下「PT」ということがある)の測定試薬に調製することができる。
【0017】
【実施例】
組織因子アポタンパク質の例を用いて、本発明を下記において更に詳細に説明することにする。
【0018】
実施例1 組換体由来および精製したヒトのトロンボプラスチンアポタンパク質の酸性化による再脂質化
ヒトの組織因子アポタンパク質を、E.coliで発現させた。このタンパク質を、前記E.coli抽出物から免疫吸着カラムを用いて精製し、10μg/mlに希釈した。
リン脂質懸濁液50μl(Phospholipon 25P、蒸留水中0.5%w/v、Nattermann社製、ドイツ)および0.1Mグリシン50μl(HClによってpH2.5に調整したもの)を混合して再脂質化混合物とした。
混合後、この試料を室温で5分間インキュベーションし、次いで組織因子アポタンパク質100μlを加えた。再び混合した後、試料を室温で1分間インキュベーションし、次いで、50mMN−2−ヒドロキシエチルピペラジン−N′−2−エタンスルホン酸、5g/リットルグリシン、13mMCaCl2および0.1%0.NaN3(pH7.5)の溶液を800μl加えた。
プロトロンビン時間は、Schnitger とGross の凝固計によって測定(正常ヒト血漿プール0.1ml+再脂質化した組織因子0.2ml)し、凝固時間11.0秒を得た。
【0019】
実施例2 再脂質化のpH依存性
組織因子の再脂質化は、実施例1に説明される通り行った。しかしpH値の異なるグリシン緩衝液(pH1.5から13.5)を用いた。このpHは、Phospholipon懸濁液を組織因子と混合した後に測定した。図1は、再脂質化混合物のpH測定値および得られたプロトロンビン時間の関係を示す。最適pHは、pH3からpH5の間である。この範囲内では、プロトロンビン時間の測定値は、同量の組織から単離した生組織因子について測定したプロトロンビン時間に匹敵する。選択した緩衝液を用いた前記の再脂質化混合物において更に低いpH値を得ることは不可能だが、そのような低いpH値も好適であると考えられる。
【0020】
実施例3 酸性化による再脂質化の時間依存性
再脂質化は実施例1に説明される通りに行った。混合物は、脂質およびタンパク質を混合した後、10秒から10分間の種々の時間差で中和した。続いて正常ヒト血漿プールのプロトロンビン時間を凝固計で測定した。図2に酸性pHでのインキュベーションの長さ、および測定したプロトロンビン時間の関連を示す。プロトロンビン時間は、酸性pHでのインキュベーションの長さには僅かに依存するのみであり、最短のプロトロンビン時間は5から10分間の長さのインキュベーションから得られる。
【0021】
実施例4 加熱による再脂質化
組織因子アポタンパク質(10μg/ml)100μlおよび蒸留水中0.5%(w/v)のPhospholipon25P 100μlを再脂質化混合物を形成させるために混合した。
この混合物を、25℃から95℃の温度に5分間曝した。続いてこれを5分以内に室温まで冷却し、50mMのN−2−ヒドロキシエチルピペラジン−N’−2−エタンスルホン酸、5g/リットルグリシン、13mMCaCl2、0.1%NaN3(pH7.5)の溶液800μlを加えた。正常ヒト血漿プールのプロトロンビン時間は、Schnitger とGross の凝固計で測定した。図3に加熱段階の温度およびプロトロンビン時間の測定値の関連を示す。最短時間は、95℃での加熱段階から得られる。80℃以上の温度では、これと一致する量の生組織因子について測定したものより短いプロトロンビン時間となる。図4に95℃での加熱段階の長さおよび正常ヒト血漿プールのプロトロンビン時間の測定値との関連を示す。再脂質化は、長さわずか1分間の加熱段階から得られる。
【0022】
実施例5 試薬としての質( VII 因子に対する感受性)
正常ヒト血漿プールは、VII 因子欠陥血漿で希釈する(Behringwerke AG 、マールブルク、ドイツ)。VII 因子の濃度は100%から10%の間で用いた(正常ヒト血漿プールに基づく)。
続いてこの試料のプロトロンビン時間を、Schnitger とGross の凝固計で測定した。測定時間は、正常ヒト血漿プールのプロトロンビン時間と関連していた。図5に、この試料におけるVII 因子濃度に依存した相対的なプロトロンビン時間[比=(PT)/(PT100%VII 因子)]を示す。以下の2種類の組織因子試薬を使用した。
a)ヒト胎盤から単離した生組織因子(Thromborel S、Behringwerke AG )
b)組換え組織因子アポタンパク質から出発し、本発明による方法によって調製した試薬(実施例1と同様)
ヒト個体群(95百分位数(percentile))におけるVII 因子濃度の正常範囲は、1.00±0.20のプロトロンビン比で示される。この範囲外のプロトロンビン比を有する血漿は病的であると考えられる。この感受性限界と一致するVII 因子濃度は、ここに使用した両試薬と非常に類似している。
【図面の簡単な説明】
【図1】再脂質化のpH依存性
試薬は、実施例1および実施例2に記載される通りに調製した。Phospholipon25Pを、pH値の異なるグリシン緩衝液と予め混合した。組織因子アポタンパク質を加えた後、そのpHを測定し、続いて混合物を中和した。正常ヒト血漿プールのプロトロンビン時間(PT)は、Schnitger とGross の凝固計で測定した(複製決定の平均値)。
【図2】酸性条件下での再脂質化の時間依存性
試薬は、実施例1および実施例3に記載される通りに調製した。図は、酸性pHでのインキュベーションの長さを変えた、正常ヒト血漿プールのプロトロンビン時間(PT)(複製決定の平均値)を示したものである。
【図3】再脂質化の加熱段階の温度依存性
試薬は、実施例4に記載される通りに調製した。この図は、5分間の加熱段階の温度への、正常ヒト血漿プールのプロトロンビン時間(複製決定の平均値)を示したものである。
【図4】加熱による再脂質化の時間依存性
図は、95℃での加熱温度の長さへの、正常ヒト血漿プールのプロトロンビン時間PT(複製決定の平均値)を示したものである。
【図5】VII 因子に対する感受性
試薬は、実施例1にしたがって調製し、正常ヒト血漿プールは実施例5にしたがってVII 因子欠陥血漿で希釈した。
図は、VII 因子濃度に依存した相対的なプロトロンビン時間[比=(PT)/(PT100%VII 因子)]を示したものである。この試薬は、本発明による方法によって組換え組織因子から調製し、部分精製したヒト胎盤からの生組織因子と比較した(Thromborel S、Behringwerke AG )。
Claims (13)
- 膜タンパク質とリン脂質との反応を界面活性剤を加えずに、pHが1から5の間で、かつ/または、50℃〜130℃の温度で行うことを特徴とする、精製した膜タンパク質の再活性化法。
- pHが3から5の間である、請求項1に記載の方法。
- 80℃〜130℃の温度で行う、請求項1または2に記載の方法。
- 植物または動物由来の純粋な脂質、純粋な脂質の所定の混合物、または、天然の脂質混合物を用いて行う、請求項1から3のいずれか1項に記載の方法。
- 溶解した膜タンパク質を用いて行う、請求項1から4のいずれか1項に記載の方法。
- 再活性化をアフィニティーカラムに結合した膜タンパク質を用いて行う、請求項1から5のいずれか1項に記載の方法。
- 免疫吸着カラムを用いる、請求項1から6のいずれか1項に記載の方法。
- 膜タンパク質に対し1種類以上のモノクローナル抗体を用いる、請求項7に記載の方法。
- ポリクローナル抗体を用いる、請求項7に記載の方法。
- 組織因子アポタンパク質を用いて行う、請求項1から9のいずれか1項に記載の方法。
- 組織因子アポタンパク質がヒト、動物または組換え体由来である、請求項10に記載の方法。
- 組織因子アポタンパク質の突然変異体を用いて行う、請求項10または11に記載の方法。
- 請求項1から12に記載のいずれか1項に記載の方法によって得ることができる、界面活性剤非存在下で再活性化した組換え組織因子アポタンパク質を含む、プロトロンビン時間の測定用試薬。
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