JPH07316198A - 精製した膜タンパク質の再活性化法 - Google Patents

精製した膜タンパク質の再活性化法

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JPH07316198A JP5348098A JP34809893A JPH07316198A JP H07316198 A JPH07316198 A JP H07316198A JP 5348098 A JP5348098 A JP 5348098A JP 34809893 A JP34809893 A JP 34809893A JP H07316198 A JPH07316198 A JP H07316198A
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 膜タンパク質とリン脂質との反応を界面活性
剤を加えずに行うことを特徴とする、精製した膜タンパ
ク質の再活性化法。再活性化は酸性条件下および／また
は高温下で行うことができる。 【効果】 界面活性剤を用いることなく精製膜タンパク
質を膜に組みこむことができる。従って膜タンパク質の
再活性化を簡便に行うことができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】本発明は、精製した膜タンパク質の再活
性化法に関する。
【０００２】膜タンパク質（例えば、レセプター）は、
一以上の膜貫通領域並びに細胞内および細胞外領域から
構成される。このようなタンパク質の活性は、精製した
タンパク質を人工膜へ組込んだ後にしばしば測定されて
いる。
【０００３】組織因子（組織トロンボプラスチン）を、
一例として挙げることができる。この血液凝固系のVII
因子のレセプターは、アポタンパク質および脂質からな
っている（Pitlick, F.A. およびNemerson, Y.、１９７
０年）。このアポタンパク質は、２６３個のアミノ酸か
らなるグリコシル化されたポリペプチドである。これは
カルボキシ末端付近に２３個のアミノ酸の疎水性配列を
有し、これによりアポタンパク質は膜に固定されてい
る。細胞内部分は２１個のアミノ酸からなっている（Fi
sher等、１９８７年；Morrissey 等、１９８７年）。イ
ンビボでは、組織因子は血液と直接に接触しない細胞の
膜内在性タンパク質として存在している。その細胞表面
レセプターとしての生理的機能は、血液または血漿と接
触した時点での血漿凝固VII 因子との結合と活性化であ
る。この複合体はセリンプロテアーゼ活性を有し、因子
IXおよびＸを活性化することにより凝固を開始させるこ
とができる。
【０００４】組織因子を単離するには２種類の異なる方
法がある。その１つによると、活性な組織因子は、好適
な組織を崩壊させ、膜画分を単離することによって部分
精製される。この材料は、主として血漿中の血液凝固を
調べる診断試薬の調製に使用される。この膜タンパク質
は結合脂質分子を含んで単離されるため、アポタンパク
質の再活性化が不要である。
【０００５】二番目の方法では、単離したアポタンパク
質が得られる。これはほとんど失活しているため（Broz
e, G.J. 等、１９８５年）、再活性化の必要がある。そ
のためには、これを脂質膜内に再度組込まなければなら
ない（Pitlick, F.A. およびNemerson, Y.１９７０年、
Bach等、１９８１年）。前記の組織因子を製造する微生
物では活性の十分な膜タンパク質を提供することができ
ないため、この方法は組換体を通じて得られるタンパク
質に必須である。これらの原則的な知見は、インビトロ
での部分または全合成によって調製できるタンパク質に
もあてはまる。
【０００６】精製した膜タンパク質を脂質膜に再度組み
込む方法としては、多くのものが知られている。このた
めには、通常は界面活性剤、例えばデオキシコール酸塩
など、を用いてリン脂質の水性懸濁液を調製する。この
懸濁液を、精製した膜タンパク質と混合する。続いて、
界面活性剤を透析などを用いて除去する。アポタンパク
質をリン脂質懸濁液と混合するかまたは界面活性剤を除
去することによって、このタンパク質は生成する膜小胞
に取り込まれる（Pitlick, F.A. およびNemerson, Y.、
１９７０年）。デオキシコール酸塩は透析によって除去
することができるので、好ましい界面活性剤である。し
かしながら、原則的には、混合物から除去することがで
きるならば、他の界面活性剤を用いることもできる。
【０００７】例えば、Wijngaards等は、タウロコール酸
ナトリウムを界面活性剤として用いて組織因子を再脂質
化する方法について記載した。彼らはｐＨ４．０で最適
ｐＨとなることを見出したが、再脂質化後に混合物から
界面活性剤を除去しなければならなかった。
【０００８】界面活性剤を使用する根本的な欠点は、混
合物からこれらの補助剤を除去する必要があるというこ
とである。これらはタンパク質の膜への取り込みを媒介
するものの、脂質小胞にも組込まれるため、膜−タンパ
ク質複合体の活性を著しく妨害する。界面活性剤を除去
するには、混合物は概して大量の緩衝液に対して透析さ
れる。この段階は時間と手間がかかり、収率や活性の損
失を引き起こす。その上、この方法では、界面活性剤を
完全に除去することはできない。
【０００９】
【発明の概要】本発明は、界面活性剤を使用せずに精製
した膜タンパク質を再活性化し、生理的環境におけるタ
ンパク質と機能的に一致するようにする簡便な方法を提
供することをその目的とする。この再活性化は、適切な
膜タンパク質の好適な脂質ミセルへの取り込み（再脂質
化）から成る。これは凝固過程における精製した組織因
子アポタンパク質の天然の生理活性を回復することので
きる唯一の手段である。
【００１０】
【発明の具体的説明】驚くべきことに、再脂質化は界面
活性剤によらずタンパク質／脂質混合物を酸性にしおよ
び／または加熱することによって行うことができること
が分かった。原則として、本発明による方法は、精製し
たタンパク質の混合物にも適用できる。
【００１１】再脂質化は、十分に低いｐＨ値でタンパク
質とリン脂質とを混合することによって行うことができ
る、ということが分かっている。この方法では、リン脂
質を界面活性剤によって溶解する必要はなく、代わりに
水溶液中でそれらを乳化するだけで十分である。試料を
混合して均質にした直後に、ｐＨを所望の値へ再度調整
することができる。適当なｐＨはｐＨ１〜５の間、好ま
しくはｐＨ２〜４、特に好ましいｐＨは約３である。当
業者に既知の植物または動物由来の天然リン脂質混合物
を使用することができる。当業者に既知の所定の純粋な
物質またはその混合物も、同様に使用することができ
る。本発明による方法は、植物リン脂質の混合物を用い
て行うのが好ましい。
【００１２】再脂質化は、溶解した膜タンパク質または
アフィニティーカラム（例えばポリクローナルまたはモ
ノクローナル抗体を含む免疫吸着カラム）に結合した膜
タンパク質を用いて行うことができる。原則としては、
人間、植物、動物、微生物または組換体由来の膜タンパ
ク質が使用でき、天然に存在するタンパク質の突然変異
体も同様に使用することができる。最高５０ｍｇ／ｍｌ
までの濃度に溶解した膜タンパク質の使用が好ましい。
この場合、最初にリン脂質の水性エマルジョンを２００
ｍｇ／ｍｌまで、好ましくは５０ｍｇ／ｍｌまでを酸性
ｐＨで緩衝液と混合する。次に、精製した膜タンパク質
をこの酸性エマルジョンに加えて混合する。１〜１０
分、好ましくは２〜６分間のインキュベーション後に、
緩衝液を加えて混合物を中和する。
【００１３】本発明の目的は、リン脂質の存在下でタン
パク質を加熱することによって、膜タンパク質を脂質膜
に組込む第二の態様に基づいており、またこれを達成す
ることができる。酸性化に関した方法と同様、界面活性
剤によって脂質を溶解することは必要ない。リン脂質と
して既に前記したような材料を使用することができる。
【００１４】使用する膜タンパク質およびリン脂質の型
および好ましい濃度の範囲は、本発明の第一の態様と同
じである。
【００１５】８０〜９５℃で１〜１０分間の加熱が好ま
しく、より好ましくは４〜６分間程度である。続いて混
合物を１〜１０分、好ましくは４〜６分程度以内に室温
に冷却し、続いて緩衝液を加える。
【００１６】再脂質化の後、膜タンパク質は脂質膜に組
み込まれた活性な形態で存在する。これは好適な添加物
を加えて提供したり、次の工程に付すことができる。組
織因子アポタンパク質を本発明による方法の１つを用い
て再脂質化する場合、これを治療薬または診断薬として
使用することができる。後者の場合、再脂質化組織因子
は、詳細には血漿中の血液凝固を調べる目的で、プロト
ロンビン時間（以下「ＰＴ」ということがある）の測定
試薬に調製することができる。
【００１７】
【実施例】組織因子アポタンパク質の例を用いて、本発
明を下記において更に詳細に説明することにする。
【００１８】実施例１ 組換体由来および精製したヒト
のトロンボプラスチンアポタンパク質の酸性化による再
脂質化 ヒトの組織因子アポタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉで発現
させた。このタンパク質を、前記Ｅ．ｃｏｌｉ抽出物か
ら免疫吸着カラムを用いて精製し、１０μｇ／ｍｌに希
釈した。リン脂質懸濁液５０μｌ（Phospholipon ２５
Ｐ、蒸留水中０．５％ｗ／ｖ、Nattermann社製、ドイ
ツ）および０．１Ｍグリシン５０μｌ（ＨＣｌによって
ｐＨ２．５に調整したもの）を混合して再脂質化混合物
とした。混合後、この試料を室温で５分間インキュベー
ションし、次いで組織因子アポタンパク質１００μｌを
加えた。再び混合した後、試料を室温で１分間インキュ
ベーションし、次いで、５０ｍＭＮ−２−ヒドロキシエ
チルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸、５ｇ／
リットルグリシン、１３ｍＭＣａＣｌ２および０．１％
０．ＮａＮ３（ｐＨ７．５）の溶液を８００μｌ加え
た。プロトロンビン時間は、Schnitger とGross の凝固
計によって測定（正常ヒト血漿プール０．１ｍｌ＋再脂
質化した組織因子０．２ｍｌ）し、凝固時間１１．０秒
を得た。
【００１９】実施例２ 再脂質化のｐＨ依存性 組織因子の再脂質化は、実施例１に説明される通り行っ
た。しかしｐＨ値の異なるグリシン緩衝液（ｐＨ１．５
から１３．５）を用いた。このｐＨは、Phospholipon懸
濁液を組織因子と混合した後に測定した。図１は、再脂
質化混合物のｐＨ測定値および得られたプロトロンビン
時間の関係を示す。最適ｐＨは、ｐＨ３からｐＨ５の間
である。この範囲内では、プロトロンビン時間の測定値
は、同量の組織から単離した生組織因子について測定し
たプロトロンビン時間に匹敵する。選択した緩衝液を用
いた前記の再脂質化混合物において更に低いｐＨ値を得
ることは不可能だが、そのような低いｐＨ値も好適であ
ると考えられる。
【００２０】実施例３ 酸性化による再脂質化の時間依
存性 再脂質化は実施例１に説明される通りに行った。混合物
は、脂質およびタンパク質を混合した後、１０秒から１
０分間の種々の時間差で中和した。続いて正常ヒト血漿
プールのプロトロンビン時間を凝固計で測定した。図２
に酸性ｐＨでのインキュベーションの長さ、および測定
したプロトロンビン時間の関連を示す。プロトロンビン
時間は、酸性ｐＨでのインキュベーションの長さには僅
かに依存するのみであり、最短のプロトロンビン時間は
５から１０分間の長さのインキュベーションから得られ
る。
【００２１】実施例４ 加熱による再脂質化 組織因子アポタンパク質（１０μｇ／ｍｌ）１００μｌ
および蒸留水中０．５％（ｗ／ｖ）のPhospholipon２５
Ｐ １００μｌを再脂質化混合物を形成させるために混
合した。この混合物を、２５℃から９５℃の温度に５分
間曝した。続いてこれを５分以内に室温まで冷却し、５
０ｍＭのＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−
２−エタンスルホン酸、５ｇ／リットルグリシン、１３
ｍＭＣａＣｌ２、０．１％ＮａＮ３（ｐＨ７．５）の溶
液８００μｌを加えた。正常ヒト血漿プールのプロトロ
ンビン時間は、Schnitger とGross の凝固計で測定し
た。図３に加熱段階の温度およびプロトロンビン時間の
測定値の関連を示す。最短時間は、９５℃での加熱段階
から得られる。８０℃以上の温度では、これと一致する
量の生組織因子について測定したものより短いプロトロ
ンビン時間となる。図４に９５℃での加熱段階の長さお
よび正常ヒト血漿プールのプロトロンビン時間の測定値
との関連を示す。再脂質化は、長さわずか１分間の加熱
段階から得られる。
【００２２】実施例５ 試薬としての質（VII 因子に対
する感受性） 正常ヒト血漿プールは、VII 因子欠陥血漿で希釈する
（Behringwerke AG 、マールブルク、ドイツ）。VII 因
子の濃度は１００％から１０％の間で用いた（正常ヒト
血漿プールに基づく）。続いてこの試料のプロトロンビ
ン時間を、Schnitger とGross の凝固計で測定した。測
定時間は、正常ヒト血漿プールのプロトロンビン時間と
関連していた。図５に、この試料におけるVII 因子濃度
に依存した相対的なプロトロンビン時間［比＝（ＰＴ）
／（ＰＴ１００％VII 因子）］を示す。以下の２種類の
組織因子試薬を使用した。 ａ）ヒト胎盤から単離した生組織因子（Thromborel S、
Behringwerke AG ） ｂ）組換え組織因子アポタンパク質から出発し、本発明
による方法によって調製した試薬（実施例１と同様） ヒト個体群（９５百分位数(percentile)）におけるVII
因子濃度の正常範囲は、１．００±０．２０のプロトロ
ンビン比で示される。この範囲外のプロトロンビン比を
有する血漿は病的であると考えられる。この感受性限界
と一致するVII因子濃度は、ここに使用した両試薬と非
常に類似している。
【図面の簡単な説明】
【図１】再脂質化のｐＨ依存性 試薬は、実施例１および実施例２に記載される通りに調
製した。Phospholipon25Pを、ｐＨ値の異なるグリシン
緩衝液と予め混合した。組織因子アポタンパク質を加え
た後、そのｐＨを測定し、続いて混合物を中和した。正
常ヒト血漿プールのプロトロンビン時間（ＰＴ）は、Sc
hnitger とGross の凝固計で測定した（複製決定の平均
値）。
【図２】酸性条件下での再脂質化の時間依存性 試薬は、実施例１および実施例３に記載される通りに調
製した。図は、酸性ｐＨでのインキュベーションの長さ
を変えた、正常ヒト血漿プールのプロトロンビン時間
（ＰＴ）（複製決定の平均値）を示したものである。
【図３】再脂質化の加熱段階の温度依存性 試薬は、実施例４に記載される通りに調製した。この図
は、５分間の加熱段階の温度への、正常ヒト血漿プール
のプロトロンビン時間（複製決定の平均値）を示したも
のである。
【図４】加熱による再脂質化の時間依存性 図は、９５℃での加熱温度の長さへの、正常ヒト血漿プ
ールのプロトロンビン時間ＰＴ（複製決定の平均値）を
示したものである。
【図５】VII 因子に対する感受性 試薬は、実施例１にしたがって調製し、正常ヒト血漿プ
ールは実施例５にしたがってVII 因子欠陥血漿で希釈し
た。図は、VII 因子濃度に依存した相対的なプロトロン
ビン時間［比＝（ＰＴ）／（ＰＴ１００％VII 因子）］
を示したものである。この試薬は、本発明による方法に
よって組換え組織因子から調製し、部分精製したヒト胎
盤からの生組織因子と比較した（Thromborel S、Behrin
gwerke AG ）。

Claims (18)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】膜タンパク質とリン脂質との反応を界面活
    性剤を加えずに行うことを特徴とする、精製した膜タン
    パク質の再活性化法。
  2. 【請求項２】再活性化を酸性条件下で行う、請求項１に
    記載の方法。
  3. 【請求項３】再活性化を高温下で行う、請求項１に記載
    の方法。
  4. 【請求項４】再活性化を酸性条件下の高温下で行う、請
    求項１に記載の方法。
  5. 【請求項５】ｐＨが１から５の間である、請求項２また
    は４に記載の方法。
  6. 【請求項６】５０℃〜１３０℃の温度で行う、請求項３
    または４に記載の方法。
  7. 【請求項７】植物または動物由来の純粋な脂質、純粋な
    脂質の所定の混合物、または、天然の脂質混合物を用い
    て行う、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 【請求項８】溶解した膜タンパク質を用いて行う、請求
    項１から７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 【請求項９】再活性化をアフィニティーカラムに結合し
    た膜タンパク質を用いて行う、請求項１から７のいずれ
    か１項に記載の方法。
  10. 【請求項１０】免疫吸着カラムを用いる、請求項１から
    ９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 【請求項１１】膜タンパク質に対し１種類以上のモノク
    ローナル抗体を用いる、請求項１０に記載の方法。
  12. 【請求項１２】ポリクローナル抗体を用いる、請求項１
    ０に記載の方法。
  13. 【請求項１３】組織因子アポタンパク質を用いて行う、
    請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 【請求項１４】組織因子アポタンパク質がヒト、動物ま
    たは組換え体由来である、請求項１３に記載の方法。
  15. 【請求項１５】組織因子アポタンパク質の突然変異体を
    用いて行う、請求項１３または１４に記載の方法。
  16. 【請求項１６】請求項１から１５に記載のいずれか１項
    に記載の方法によって得ることができる、界面活性剤非
    存在下で再活性化した組織因子アポタンパク質。
  17. 【請求項１７】請求項１６に記載の組織因子を含む、プ
    ロトロンビン時間の測定用試薬。
  18. 【請求項１８】請求項１６に記載の組織因子を含む、医
    薬組成物。
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AU (1) AU662084B2 (ja)
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DE (2) DE4243729A1 (ja)
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