JP3441456B2 - 組織因子に基づくプロトロンビン時間試薬 - Google Patents

組織因子に基づくプロトロンビン時間試薬

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Description

【発明の詳細な説明】 関連出願の引照 本出願は、1990年11月13日に出願され、「組織因子に
基づくプロトロンビン時間試薬」に対する、普通に譲渡
された米国特許願第07/612,118号の一部継続出願であ
る。その出願の開示を参考文献としてここに引用する。
発明の背景 発明の分野 本発明は精製、再構築された、自然のまたはリコンビ
ナントヒト組織因子（rTF）を使用しているプロトロン
ビン時間（PT）試薬に関する。さらに詳しくは本発明は
組織因子（TF）のリン脂質小胞またはミセル中への再構
築に関し、組織因子に基づくPT試薬を製造するものであ
る。このような試薬は、経口の抗凝固治療および凝固の
外因系経路における欠失の特別のモニターニングを可能
とする。
関連技術の記述および本発明への導入 一般に、リポソームは水性スペースを包囲する１種ま
たはそれ以上の脂質２重層からなる小胞の一般的カテゴ
リーである。このカテゴリーの範疇には、単一メンブラ
ンあるいは脂質２重層からなる単層構造の小胞、および
多くの同心のメンブラン（または脂質２重層）からなる
多層構造の小胞がある。リポソームは通常リン脂質から
調製される。スゾカ、エフ．（Szoka,F.）およびパパハ
ジョポウロス、ディ．（Papahadjopoulos,D.）、Ann.Re
v.Biophys.Bioeng.,９:467−508（1980）。
ミセルはリポソームと異なる。洗剤等の親水性および
疎水性の両特性を有する分子が水性媒体中におかれると
ミセルが形成する。分子の疎水性部分が集合して水性媒
体を排除する。その最も簡単な状態においては、ミセル
は球状であろう；しかしながらそれらは種々の形および
大きさの集合体（２重層）を形成し得る。水性内部とい
うよりは疎水性内部を有するという点でミセルはリポソ
ームと異なる。例えば、洗剤分子の親水性頭部は水中の
外側の方にミセルの顔を構成し、一方疎水性尾部はとも
に集まって疎水性構造のようになる。ディヴィス、ビ
ー．ディー（Davis,B.D.）およびドゥルベッコ、アー
ル．（Dulbecco,R.）、「殺菌および消毒（Sterization
and Disinfection）、Microbiology,第３版、第1270
頁、ハーパー＆ロー（Harper ＆ Row）出版（Davis,B.
D.ら1980年）；マーラー、エッチ．アール．（Mahler,
H.R.）およびコーデス、イー．エッチ．（Cordes,E.
H.）、Biological Chemistry、第２班、Harper ＆ Row
出版、第712−714頁（1971年）。
リポソームはドラッグデリバリーシステムとして使用
されている。この研究法はリポソームは、内部水性スペ
ースを包む比較的不浸透の脂質２重層を有しているとい
う事実を利用しており、それによりこのスペース内に種
々のドラッグを完全にカプセル化する方法を提供する。
Szoka、同上、第468頁。このタイプのデリバリーシステ
ムの重要な見地は、活性な成分ドラッグは、それがター
ゲットに到達するまでリポソームの外側の水性媒体に対
して利用できないということであろう。ジャノフ（Jano
ff）ら、米国特許第4,880,635号（1989）。
脊椎動物の組織は、クエン酸塩化された血漿に添加さ
れカルシウム再添加される（recalcified）と、血餅形
成時間が非常に加速されるということが観察された。凝
固プロテアーゼカスケードを活性化することが観察され
たこの組織成分は通常トロンボプラスチンあるいは組織
因子（TF）と呼ばれている。
1935年に、トロンボプラスチン（プロ凝固（procoagu
lant）組織因子）の使用が、一つの段階のPT試験に最初
に記載された（クイック（Quick）,J.Biol.Chem.109:73
−74、1935）。この試験は哺乳動物組織から誘導された
トロンボプラスチンおよびプールされたヒト血漿の希釈
液で調製された標準曲線を採用した。この試験は現代で
は簡単になすことができ、自動化も可能である。
プロトロンビン時間（PT）試験は、凝固実験室におけ
る最も一般的に行われるアッセイである。この試験の変
形は多くの用途がある（ホワイト（White）ら、「止血
と血栓症、基本的原理と臨床（Hemostasis and Thrombo
sis,Basic Principles and Clinical Practice）、コー
ルマン（Coleman）ら、編集J.B.Lippencott社、フィラ
デルフィア、1048−1060頁、1987）。一つの用途は、凝
固の外因系経路における欠失を評価することである（第
VII,X,V因子およびプロトロンビン）。第２番目の用途
は、再発性静脈血栓症や癌等の疾患のために長期間経口
抗凝固治療を受けている患者をモニターすることである
（ヒルシュ，ジェ（Hirsh,J）、血栓症と止血セミナー
（Seminars in Thrombosis and Hemostasis）、12:1−1
1、1986）。第３の用途は肝臓の機能障害を評価するこ
とである。
抗凝固治療の治療上の範囲は流血と血栓の併発を防止
することに基づいている。経口抗凝固治療をモニターす
るとき、PT試験による色々な他の条件に対しても同様な
ように、２の因子によるプロトロンビン時間の伸びは、
長期治療に最も望ましい（オーレイリー（O'Reilly）、
止血と血栓症、基本的原理と臨床、コールマンら、編集
J.B.Lippencott社、フィラデルフィア、1367−1372頁、
1987）。この伸び因子はプロトロンビン比（PR）として
定義され、患者の血漿のPTを正常個体の血漿のプールの
PTで割ることにより計算される。より高いPRはより敏感
なPT試薬を意味する。抗凝固治療をモニターするための
より敏感な試薬の利点は抗凝固ドラッグのより低い服用
量の使用である。このより低い服用量はまた、流血の合
併症を最小にしながら、血栓塞栓症に対する適当な保護
となる。
PTを決定するいくつかの試薬が市販されている。かか
る試薬にはトロンボレル（Thromborel）Ｓ（カーティス
マセソン サイエンティフィック（Curtis Matheson
Scientific）社、ヨーバ リンダ（Yorba Linda）,CA）
およびシンプラスチン（Simplastin）（オーガノン テ
クニカ（Organon Teknika）社、シャーロッテ（Charlot
te）、NC）が含まれる。試薬によって、同じ患者の血漿
に対するPTがかなり異なる。Thromborel SはSimplastin
より長い時間を示す。それ故、Simplastinに代えてThro
mborel Sを使用してPTをモニターする際には、より低い
服用量の抗凝固薬にて、PT時間の延長（高いPR値）が認
められる。抗凝固治療のモニターや、その他の血液凝固
系の状態をモニターするために、より敏感な組織因子に
基づくPT試薬が望まれている。本発明はまさにこのよう
な非常に望ましいPR値を有する敏感な試薬を提供するこ
とを目的とするものである。
本発明の要約 本発明は、脂質２重層と会合した組織因子を有するリ
ポソーム組成物からなる組織因子試薬に関し、該脂質２
重層はリン脂質の混合物からなり、また本発明はこのよ
うな組成物を調製する方法に関する。提供されたリポソ
ーム中におけるリン脂質の脂質２重層の比は、得られる
組織因子試薬の最高の凝固活性を考慮に入れるものであ
り、外因系凝固性因子に対する試薬の有利な感度を評価
する。
他の因子の中で、脂質２重層と会合している組織因子
を有するリポソームからなる本発明の組織因子試薬は活
性なプロ凝固性（procoagulant）複合体であり、プロ酵
素、第VII因子の、活性な凝固プロテアーゼ、第VII a因
子への効率的変換ができる複合体であるということが見
いだされたとうい驚くべき発見に本発明は基づいてい
る。組織因子単独溶液も、リポソームの脂質２重層を単
独で作り出すリン脂質混合物のどちらも、プロトロンビ
ン時間試薬として活性でないので、この発見は驚くべき
ものである。わたしはまた、さらにグリシンからなる本
発明の組成物は、正常ヒト血漿に対するプロトロンビン
時間を、疑ヒト血漿に対してデザインされた商業的コン
トロールのそれに等しくすることにより、PT評価におけ
る実質的に改良された性能を示すといことを発見した。
従って、一つの好ましい見地に従うと、本発明は、プ
ロトロンビン時間を決定するのに有用なリポソーム組成
物からなる組織因子試薬に向けられ、該リポソーム組成
物はリポソーム（またはリン脂質小胞）の脂質２重層と
会合した組織因子からなり、好ましくは低温保存剤（cr
yopreservative）とグリシンの両方を含有する緩衝液で
ある。もう一つの見地においては、本発明はこれらの組
成物の調製に向けられる。
本発明の好ましい見地においては、リポソームを調製
する方法は、比較的高い臨界ミセル濃度を有する洗剤を
利用し、高度に精製されたリン脂質を溶解する。特に好
ましい洗剤は、両性イオン洗剤、３−［（３−コラミド
プロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルフ
ォネート（３−［３−cholamidopropyl）dimethylammon
io］−１−propanesulfonate）（CHAPS）である。組織
因子も洗剤に溶解され、キャリア蛋白が添加され、そし
て洗剤が除去される。洗剤は従来の方法、例えば透析、
樹脂処理または無洗剤溶液への希釈等の方法で便利に除
去され得る。周囲溶液の洗剤濃度が低くなるに従って、
脂質２重層と会合しその中に挿入された組織因子を有す
るリポソームが自発的に形成してなる。
定義 「BHT」はブチレート化（butyrated）ヒドロキシトル
エンという。
「CHAPSは」は３−［（３−コラミドプロピル）−ジ
メチルアンモニオ］−１−プロパンスルフォネートをい
う。
「MOPS」は３−（Ｎ−モルフォリノ）−プロパンスル
フォン酸をいう。
「OTG」はオクチルベータ−Ｄ−チオグルコピラノシ
ドをいう。
「リン脂質」は、グリセロール（最も普通）またはス
フィンゴシンのいずれかから誘導された誘導分子をい
う。グリセロールから誘導されたリン脂質（またはホス
ホグリセリド）は、グリセロールバックボーン、グリセ
ロールの第１と第２の炭素にエステル化した２つの脂肪
酸の鎖および第３の炭素にエステル化したリン酸からな
る。
所望により、リン酸に対してアルコール部がエステル
化される。
「PC」はホスファチジルコリンをいい、コリンから誘
導されたアルコール部分を有する無電荷ホスホグリセリ
ドがリン酸に対してエステル化されている。
「PE」はホスファチジルエタノールアミンをいい、エ
タノールアミンから誘導されたアルコール部分を有する
正に荷電したホスホグリセリドがリン酸に対してエステ
ルカ化されている。
「PG」はホスファチジルグリセロールをいい、グリセ
ロールから誘導されたアルコール部分を有する負に荷電
したホスホグリセリドがリン酸に対してエステル化され
ている。
「PS」はホスファチジルセリンをいい、セリンから誘
導されたアルコール部分を有する負に荷電したホスホグ
リセリドがリン酸に対してエステル化されている。
「プロトロンビン時間」はPTと略され、トロンボプラ
スチンあるいはプロトロンビン時間試薬の添加と、血小
板欠乏の、クエン酸塩化された血漿中に血餅が出現する
間の時間間隔をいう。
「プロトロンビン比」はPRと略され、個体の血漿（正
常でも、異常でもよい）のプロトロンビン時間を正常の
個体の血漿のプールのプロトロンビン時間で割ったもの
をいう。
「rTF」はリコンビナント組織因子をいう。
「TBS」は150mM塩化ナトリウムを含有する20mMトリス
（pH7.5）をいう。
図面の簡単な説明 図１は、因子活性パーセントの関数として、PT試薬、
rTF PT試薬およびトロンボレル Ｓのプロトロンビン比
を示す。
図２は、経口抗凝固治療を受けている患者からの血漿
に対するPT試薬の相対的感度を示す。
本発明の詳細な説明 1.好ましい組織因子試薬組成物 本発明は、組織因子が脂質２重層を通して挿入された
ような、リポソームの脂質２重層と会合した組織因子を
有するリポソームからなる組織因子試薬を提供する。
リポソームの脂質２重層はリン脂質、好ましくはホス
ホグリセリドからなる。
また、もう一つの本発明の見地によると、組織因子が
ミセル中に挿入されているような、リン脂質ミセルと会
合した組織因子を有するリン脂質ミセル組成物からなる
組織因子試薬が提供される。
本発明の組織因子試薬は、リン脂質混合物1mg当た
り、天然またはリコンビナント組織因子約0.1μｇない
し３μｇからなる。リン脂質混合物に対する組織因子の
比は、得られる組織因子試薬の感度を決定し得る。それ
故、リン脂質混合物1mg当たり、組織因子１ないし２μ
ｇの比での使用が、約1.0の国際感度指数（Internation
al Sensitivity Index）（“ISI"）を有する組織因子試
薬に適当である。リン脂質混合物1mg当たり、組織因子
約0.25ないし約0.5μｇの比での使用が、約1.6ないし約
2.0のISIを有する組織因子試薬の調製に適当である。さ
らにグリシン約0.5ないし約1.5％（w/v）からなる組織
因子試薬が好ましい。組織因子試薬を凍結乾燥して貯蔵
し後に再構成できることを望む場合、該試薬は好ましく
は低温保存剤、好ましくは炭水化物保存剤、最も好まし
くはトレハローズを含有する。
A.好ましいリン脂質混合物 本発明のリポソーム組成物における使用に適当なリン
脂質は、12ないし20の炭素原子を有する脂肪酸を含有す
るものを含む；該脂肪酸は飽和、不飽和いずれであって
もよい。本発明の使用に好ましいリン脂質は、ホスファ
チジルコリン（PC）、ホスファチジルエタノールアミン
（PE）、ホスファチジルグリセロール（PG）およびホス
ファチジルセリン（PS）を含む。これらのリン脂質はい
かなる天然源から生じたものでもよく、そのようなリン
脂質は異なる脂肪酸を有する分子からなっていてもよ
い。異なる出所からのリン脂質からなるリン脂質混合物
を使用してもよい。例えば、PC、PGおよびPEは卵黄から
得てもよい;PSは動物の脳または脊髄から得てもよい。
これらのリン脂質は同様に合成したものでもよい。
それぞれのPLの種々の比を有するリン脂質（PL）混合
物を使用してもよい。適当なPL混合物は（ａ）約20ない
し約95モルパーセントPC;（ｂ）約2.5ないし約50モルパ
ーセントPE;（ｃ）約2.5ないし約50モルパーセントPS;
および（ｄ）約０ないし約40モルパーセントPGからな
る。好ましいものは約５ないし15モルパーセントPE、約
３ないし約20モルパーセントPS、約10ないし約25モルパ
ーセントPG;および残りがPCで、好ましくは約50ないし
約90モルパーセントPCからなるPL混合物である。特に好
ましいものは、約８ないし約12モルパーセントPE、約３
ないし約10モルパーセントPS、約14ないし約20モルパー
セントPGおよび約58ないし約75モルパーセントPCからな
るPL混合物である。
リン脂質は種々の比で使用してもよいが、我々はそれ
ぞれのリン脂質のある量を有するリン脂質の混合物が、
有利な活性と活性安定性を有する組織因子試薬の結果に
なるということを見いだした。それぞれのリン脂質を広
範囲の比で使用してもよいが、我々は有利な活性と得ら
れる組織因子試薬の安定性にとって、全リン脂質組成物
中にある量のPSが存在しなければならないといことを見
いだした。ある量まで好ましく存在するPSの量はPL混合
物の残りの成分および全PL混合物の一部としてのそれら
の相対的量により決定される。例えば、もう一つの負に
帯電したリン脂質、PGを多く使用すると（約10％以上の
オーダーで）、PSの使用はより低い濃度、約３％のオー
ダーでよい。しかしながら、PS濃度が低いPL混合物を使
用する場合、少なくとも約５％PE、好ましくは少なくと
も約10％を含むことが有益である。
リン脂質は適当な比で組み合わせて、本発明の組織因
子試薬の調製に使用されるPL混合物を得る。一つの好ま
しい具体例は、PL混合物は67:16:10:7のモル比でPC、P
G、PEおよびPSからなるものである。他の好ましい具体
例は、PL混合物は7.5:0:1:1のモル比でPC、PG、PEおよ
びPSからなるものである。
B.組織因子 天然の組織因子であれリコンビナント組織因子であれ
本発明の組織因子試薬に使用してもよい。色々な種から
の天然あるいはリコンビナント組織因子を使用してもよ
い。
天然の組織因子は従来の方法により単離しうる。例え
ば、ブロウズ、ジェーアール．ジー．ジェー．（Broze,
Jr.,G.J.）ら、J.Biol.Chem,260（20）:10917−10920
（1985）；およびモリッセイ、ジェー．エッチ．（Morr
issey,J.H.）らThrombosis Research 50:481−493（198
8）を参照せよ。
リコンビナント組織因子は当該分野に公知の方法およ
び発現システムを使用するリコンビナント技術で調製し
てもよい。例えば、Morrissey,J.H.ら、Cell 50129−13
5（1987）；サマーズ、エム．ディー．（Summers,M.
D.）、「バクロビールスベクターおよび昆虫細胞培養手
順の方法マニュアル（A Manual of Methods for Baculo
virus Vectors and Insect Cell Culture Procedur
e」、テキサス農業試験場（Texas Agricultural Experi
ment Staition）、Bulletin 1555（1987）を参照せよ。
組織因子は、他の蛋白のコンタミから特定の蛋白を分
離するように設計されているイムノアフィニティークロ
マトグラフィーまたは他のクロマトグラフの方法で精製
してもよい。
C.好ましい低温保存剤 低温保存剤は、デリケートな物質を含有する液体を凍
結したり脱水したりするとき、これらの本来の姿を保存
することに関係する。凍結およびその後の凍結乾燥時に
リポソームの完全な形の低温保存剤としての炭水化物の
使用が報告されている。ラッカー、イー．（Racker,
E.）,Membrane Biol.,10:221−235（1972）；スレタ
ー、エフ．（Sreter,F.）ら、Biochim.Biophys.Acta.,2
03:254−257（1970）；クロウエ（Crowe）ら、Biochem.
J.,242:1−10（1987）;Croweら,Biochim.Biophys.Act
a.,987:367−384（1988）。
後の使用のため保存の前に、組織因子試薬を凍結乾燥
するとき、低温保存剤としての炭水化物または炭水化物
類を含ましめ、凍結乾燥およびその後の水分補給の間、
得られるリポソーム組成物中のリポソームの本来の姿を
保護することが好ましい。適当な炭水化物低温保存剤
は、トレハローズ、マルトース、ラクトース、グルコー
スおよびマニトールを含む。本発明の好ましい見地によ
ると、トレハローズは本発明の組織因子試薬の調製（凍
結乾燥前）に使用される緩衝水溶液に、好ましくは約50
mMないし約250mMの範囲の濃度で含まれる。
D.グリシン 本発明の特に好ましい見地によると、これらの組織因
子試薬の添加成分としてグリシンを含有させる。これら
組織因子試薬にグリシンを含有させると、擬ヒト血漿に
対してデザインされた商業的コントロールのそれらと実
質的に等しい試薬になり、正常ヒト血漿用のプロトロン
ビン時間を与えるPTアッセイにおいて、実質的に改良さ
れた性能を示す。それ故、これらの好ましい組織因子試
薬はさらに約0.5パーセントないし約1.5パーセント（w:
v）グリシン、より好ましくは約0.6ないし約1.2パーセ
ントグリシンからなる。
2.組織因子試薬の調製 リン脂質、それは有機溶媒製造業者から入手してもよ
く、適当な割合で一緒に混合され、特定の組成物として
得る。次に酸化防止剤を添加して、リン脂質の脂肪酸部
分のアルキル鎖の過酸化を減少させ、そして有機溶媒
を、存在すれば、蒸発により除去する。一つの適当な酸
化防止剤はブチレート化ヒドロキシトルエンである。好
ましくは酸化防止剤約0.1％（重量）を使用する。
次に、乾燥された（蒸発された）リン脂質混合物は洗
剤水溶液で再溶解させる。適当な洗剤は比較的高い臨界
ミセル濃度（CMC）を有するものを含むものである。ウ
ォマック（Womack）ら、Biochim.Biophys.Acta,733:210
（1983）。このような洗剤は約2mMより大きいCMCを有す
る洗剤を含むものである。好ましいものは約２ないし25
mMの間のCMCを有する洗剤である。このような好ましい
洗剤は、３−［（３−コラミドプロピル）−ジメチルア
ンモニオ］−１−プロパンスルフォネート（CHAPS）お
よびアルキルグルコピラノシド、例えばオクチルベータ
−Ｄ−グルコピラノシド、オクチルベータ−Ｄ−チオグ
ルコピラノシド等を含むものである。所望により、洗剤
溶液は他の成分を含んでいてもよい。このような成分は
HEPES、トリス、リン酸塩等の緩衝塩;NaCl、KCl等種々
の他の塩；トレハローズ、マルトース、グルコース等の
炭水化物低温保存剤；およびグリシンを含む。本発明の
好ましい具体例によると、洗剤溶液は20mMトリス、pH7.
5、150mM NaCl、（TBS）含有100mMのCHAPS、150mMトレ
ハローズおよび0.8％グリシンからなる。好ましい具体
例によるとリン脂質はこの溶液に再溶解されて、最終濃
度約20mg/mlとなる。
組織因子およびキャリア蛋白は再溶解したリン脂質と
化合し、得られる混合物の容積は、上記したような、好
ましくは低温保存剤（最も好ましくはトレハローズ）お
よびグリシンを含有する洗剤は全く含有しない緩衝液で
調整される。上記したように本発明の組織因子試薬の調
製に使用される組織因子は天然あるいはリコンビナント
によるものいずれのものでもよい。本発明の一つの好ま
しい具体例によると、リコンビナント組織因子（rTF）
を使用する。組織因子、続いて、ウシのガンマグロブリ
ン等のキャリア蛋白を添加し、そして十分な緩衝液を添
加し、最終濃度として組織因子を10μg/ml、ウシガンマ
グロブリンを1mg/ml、リン脂質を4mg/mlおよび洗剤を20
mMに調整する。適当な緩衝液は150mMトレハローズおよ
び0.8％グリシンを含有するTBSを含む。結果として得ら
れる透明な、無色の溶液はボルテックス処理（vortexin
g）または音波処理（sonicationg）を必要とせず共可溶
化を確実にする。
リン脂質−組織因子混合物中の洗剤は多くの方法で除
去でき、脂質２重層を通って挿入し会合した組織因子を
有する安定なリポソーム組成物となる。洗剤除去の適当
な方法は透析、タンジェンシャル・フローディアフィル
トレーション（tangential flow diafitration）、十字
流中空繊維フィルトレーション（cross flow hollow fi
ber filtration）、疎水性クロマトグラフィー樹脂での
処理、および単純な希釈を含む。
リン脂質−組織因子混合物からの洗剤除去の一つの好
ましい方法は、150mMトレハローズ、0.8％グリシンおよ
び0.05％NaN3を含有するTBS等の緩衝溶液に対し透析メ
ンブラン管中で室温で少なくとも30時間の透析を利用
し、洗剤を除去する。もう一つの好ましい洗剤除去の方
法は、樹脂処理を利用する。適当な樹脂は、アンバーラ
イト（Amberlite）XAD−２（ローム アンド ハース
（Rohm and Haas）社、フィラデルフィア、ペンシルバ
ニア）またはバイオ−ビーズ（Bio−Beads）SM−２（バ
イオラッド（BioRad）、リッチモンド、カリフォルニ
ア）等の疎水性クロマトグラフィー樹脂を含む。リン脂
質−組織因子溶液との直接接触により、あるいは透析メ
ンブランにより分離することにより、樹脂を使用し、洗
剤を除去してもよい。リン脂質−組織因子溶液から洗剤
を除去する速度は、溶液中の洗剤およびクロマトグラフ
ィー樹脂ビーズの重量比に比例する。
次に、洗剤除去段階で生じるリポソーム溶液を5mM Cd
Cl2にする。一つの好ましい見地によると、完全に活性
な組織活性を含有するリポソーム溶液を、使用前に50mM
トリス、pH7.5、75mMトレハローズ、0.8％グリシンおよ
び10ないし15mM CaCl2の濃度に希釈する。また、希釈し
た試薬は、プロトロンビン時間試薬のような性能特性の
長期保護のために凍結乾燥し、その後使用前に水中での
懸濁により再構成してもよい。
もう一つの好ましい洗剤除去の方法は、透析あるいは
樹脂処理の使用をさけるものであるが、活性TF試薬の調
製を提供するものである。この方法によれば、TFを含有
する洗剤溶解リン脂質を洗剤を含まない緩衝液中に希釈
し、CdCl2で完全に活性化されうる状態のTFを含有する
混合ミセルを製造する。本発明のこの見地によると、リ
ン脂質は、洗剤、好ましくはアルキルグルコピラノシド
を含有する緩衝液中に20mg/mlに溶解される。適当な緩
衝−洗剤溶液は、50mMオクチルベータ−Ｄ−チオグルコ
ピラノシド（OTG）および150mM NaClを含有する20mM HE
PES（pH6）からなる。次にキャリア蛋白、TF、およびCd
Cl2を添加し、混合物をさらに150mM NaClを含有する20m
M HEPES（pH6）等の洗剤を含まない緩衝液で希釈し、TF
10μg/ml、キャリア蛋白（ウシガンマグロブリン）1mg
/ml、CdCl2 5mM、リン脂質4mg/ml、およびOTG 10mMの最
終濃縮物を得る。試薬は上記したように貯蔵のために凍
結乾燥してもよく、また使用前に上記したように希釈し
てもよい。
本発明のもう一つの見地によると、この試薬は、リヒ
テンベルグ、ディー．（Lichtenberg,D）およびバレン
ホルツ、ワイ．（Barenholtz,Y.）、Methods of Bioche
mical Analysis,33:337−462（1988）に記載されている
ように有機溶媒の除去、洗剤除去、およびサイズ変形に
よる等の機械的な手段に基づく方法によりリン脂質から
小胞および洗剤−リン脂質混合ミセルの調製のための方
法で調製してもよく、その開示を参照文献としてここに
引用する。
本発明の理解を助けるために、以下の実施例が含ま
れ、一連の実験結果を記述する。本発明に関連する以下
の実施例は例示的なものであり、当然に本発明を特に制
限するものとして解釈されるべきものではない。また、
本発明のこのうなバリエーションは、今や公知でありま
たは後で進展されたものであっても、いわゆる当業者の
範囲内になるであろうものは、後記で請求される本発明
の範囲内に入るものと考えられるべきものである。
実施例 実施例１ 抗リコンビナント組織因子アフィニティーゲルの調製 モーリッセイ（Morrissey,J.H.）ら、トロンボシス・
リサーチ（Thrombosis research）第52巻第247〜261頁
の方法により作成したTFに対するモノクローナル抗体TF
8−5G9をエジントン博士（Dr.T.S.Edginton）より得
た。TF8−5G9の腹水を、ハーロウら（Harlow,E and Lan
e,D.）の「抗体：実験室マニュアル」第304〜305頁、コ
ールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（1988
年）に記載の手法を用いて、DEAEクロマトグラフ法にて
IgGに精製した。
アフィゲル10（Affigel 10）（バイオラッド・ラボラ
トリーズ、リッチモンド、カリフォルニア）へ、製造元
より推奨された方法にてこの精製した抗体を共有付着さ
せることによってイムノアフィニティー樹脂を作成し
た、すなわち、200mgのDEAE精製ずみモノクローナル抗
体を0.1MのMOPS（pH7.5）中へ透析し、10mg/mlの溶液と
した。20mlのこの抗体溶液をその後20mlのアフィゲル10
に添加した。この混合物を一晩の間２ないし８℃で反転
させながらインキュベートした。16から24時間後、20ml
の0.1Mエタノールアミン（pH8）を添加し、全ての未反
応基を結合させてこのカップリング反応を終了させた。
樹脂を排出させ、0.1MのMOPS（pH7.5）で洗浄して得た
イムノアフィニティー樹脂を２〜８℃で保存した。95％
以上のカップリング効率が認められた。
実施例２ リコンビナント組織因子（rTF）の調製 リコンビナント組織因子（rTF）は以下の方法を用い
て細胞溶解物を精製して得た。rTFを産生する細胞をTBS
で洗浄し、0.25％のトリトンX100（Triton X100）、10
μg/mlのダイズトリプシンインヒビターおよび1mMのEDT
Aを含有するTBSに２×107/mlとなるよう再懸濁した。４
℃で30分間混合した後、細胞のデブリスを４℃、約5000
×ｇで20分間遠心分離して除いた。
上清の溶解物をTBSで2.5倍に希釈し、 トリトンの濃度を0.1％に減らし、その後TFに対するモ
ノクローナル抗体が共有的にカップリングしているイム
ノアフィニティー樹脂（実施例１で作製したもの）を通
した。この樹脂ベッドをベッド体積の２から３倍量TBS
＋0.1％のトリトンX100、２から３倍量の20mMトリス（p
H7.5）,0.5M NaCl,0.1％トリトンX100、および最後に２
から３倍量の0.5M NaCl,0.1％トリトンX100で洗浄し
た。結合したタンパクを樹脂より、0.1Mのグリシン,pH
2.5,0.1％トリトンX100で溶離させた。緩衝液をグリシ
ンに変えた後に集めたフラクションを適当な量の1Mのト
リス（pH8）で中和した。rTFはカラム流出物のpHが変化
した点のすぐ近辺のフラクションに認められた。
rTFを含有するフラクションをプールし、20mMトリス
（pH8）,0.1％トリトンX100中で透析し、その後このrTF
をベッド体積の小さいDEAEトリスアクリルカラム（IBF
バイオッテクニックス、コロンビア、メリーランド）へ
結合させた。この樹脂ベッドを、少なくともその10倍量
のCHAPS10mMを含有する20mMトリス（pH8）で洗浄し、ト
リトンX100をCHAPSと交換した。rTFは20mMトリスpH8,10
mM CHAPS中の0.5M NaClにより一段階で溶離させられ
る。
実施例３ リン脂質の調製 ホスファチジルコリン（PC）、ホスファチジルエタノ
ールアミン（PE）、ホスファチジルセリン（PS）および
ホスファチジルグリセロール（PG）はクロロホルム溶液
としてアバンティ・ポーラー・リピッズ（Avanti Polar
Lipids）（アラバスター、アラバマ）またはカルボイ
オケム・コーポレイション（Carbiochem Corporation）
（ラ・ジョラ、カリフォルニア）より、密封ガラスアン
プル入りの製品を購入し、窒素雰囲気下−20℃で保存し
た。CHAPS、他の洗剤およびウシガンマグロブリンはカ
ルボイオケム社より購入した。トリス塩基およびグリシ
ンはバイオラッド・ラボラトリース（リッチモンド、カ
リフォルニア）より購入した。他の化学試薬および生化
学試薬はシグマ社（セントルイス、ミズーリ）から購入
した。
リン脂質は再溶解するため以下の方法で処理した。P
C、PE、PSおよびPGを室温まで暖め、特定のモル比にて
適当な管またはフラスコ内で化合させた。抗酸化剤であ
るブチレート化ヒドロキシトルエン（BHT）をクロロホ
ルムへ溶解させ、このリン脂質の混合物中へ重量比0.1
（BHT:全リン脂質）で添加した。有機溶剤は乾燥窒素気
流下もしくはロータリーエバポレーター内で減圧下で蒸
発させて除いた。残存する有機溶剤は、さらに１時間、
室温にて真空ポンプを用い10μｍまたはそれ以下の圧力
における吸引によって除いた。リン脂質混合物は100mM
のCHAPSを含有する20mMトリスpH7.5,150mM NaCl（TBS）
に20mg/mlとなるように再溶解した。
実施例４ rTFプロトロンビン時間（rTF PT）試薬の透析による調
製 実施例３に記載したごとく、リン脂質は特定のPC、P
E、PSおよびPGのモル比で化合させ、その後再溶解させ
た。再溶解させたリン脂質はイムノアフィニティー精製
ずみrTFおよびウシガンマグロブリンと化合させた。さ
らに150mMのトレハローズを含有するTBSを添加し、最終
濃度をそれぞれ全リン脂質が4mg/ml、rTFが1g/ml、ウシ
ガンマグロブリンが1mg/mlおよびCHAPS20mMとした。こ
の無色透明の溶液を透析メンブランチューブ（スペクト
ラポアーＲ（SpectraporeR）（スペクトラム・メディカ
ル・インダストリース製、分子量のカットオフ12000な
いし14000）内に投入し、少なくとも室温で30時間、150
mMのトレハローズと0.05％のNaN3を含有するTBSで透析
した。透析終了後、透析物の体積を測定し、必要であれ
ば透析用緩衝液にてもとの体積にあわせた。CdCl2を最
終濃度が5mMとなるように添加し、この溶液を37度で２
時間インキュベートした。
溶液はドライアイス上で凍結させ、その後−40℃では
じまり室温で終わる48時間にわたるサイクルを用いて好
脂性とした。リポソームはその後0.1Mトリス,pH7.5,150
mMトレハローズにて作業の濃度に再構築しておよそrTF1
ないし２μg/ml、リン脂質およそ400ないし800μg/mlお
よびウシガンマグロブリン50ないし100μg/mlを含有す
る溶液を得た。
上記のように調製したrTF PT試薬はトロンボスクリー
ン・コントロール血漿（カーチン・マセソン・サイエン
ティフィック（Curtin Matheson Scientific）ヨーバ・
リンダ・カリフォルニア）および正常ヒト血漿プールの
プロトロンビン時間の測定に用いた。すなわち100μｌ
の血漿および100μｌの希釈したリポソームを凝固計の
サンプル用ウエル内に投入する。装置が20mMのCaCl2を1
00μｌ添加し、自動的にプロトロンビン時間を測定す
る。結果を表Ｉに示した。
このデータは（１）rTF PT試薬においては、rTFによる
凝結機構を開始させるためには広範囲のモル比のリン脂
質が許容できること、（２）この試薬はrTF誘導性の凝
固活性のために、リン脂質組成物としてPSまたはPGのよ
うな全体で負電荷を有するものを必要とすることおよ
び、（３）PSの濃度が実質的に少ない場合には、この試
薬はPEおよびPGを共に必要とする、ということを示す。
表Ｉにおいて使用されたコントロール血漿は経口抗凝
固治療中の患者から得られるものに似せたものである。
これらを用いて得られたプロトロンビン時間は、いずれ
かの凝固因子が欠損していることは示しさないが、いく
つかの因子の活性が低下していることを示している。
rTF PT試薬が外因系凝固経路（第Ｖ、VII、Ｘ因子）
に含まれるいくつかの因子のレベルの減少に対していか
に反応するかをFigure1に示した。プロトロンビン（P
T）時間は以下のようにして測定した。正常ヒト血漿プ
ールを1:2、1:4、1:10、1:20および1:40に0.15M NaClで
希釈し、それぞれ50、25、10、５および2.5％の因子活
性の試料を得た。凝固因子欠損血漿サンプル（トロンボ
スクリーン、カルチン・メートソン・サイエンティフィ
ック・インコーポレイテッド）は製造元の示唆のごとく
再度水和して、希釈せずに用いた。ここで用いたrTF PT
試薬はリン脂質比率が10:1:1（それぞれPC:PE:PS）で10
mMのCaCl2を含有するものである。トロンボレルＳ（Thr
omborel S）バーヒング・ダイアグノステイックス（Ber
hing Diagnostics）、サマービル、ニュー・ジャージ
ー）を再水和し製造元の推奨するように取り扱った。10
0μｌの希釈した正常ヒト血漿（NHP）および100μｌの
凝固因子欠損血漿を凝固計をサンプルウエルへ投入し
た。PT試薬（200μｌ）がこの装置によって添加され、P
Tは自動的に測定される。プルトロンビン比率（PR）を
凝固因子が欠乏した血漿のPTを希釈していないNHPで得
られたPTで除して得、NHPによって供給される因子のパ
ーセントに対してプロットした。
Figure1のデータはrTF PT試薬を用いると試験した全
ての血漿希釈標品において高いPR値となった。同じ希釈
値の正常血漿プールを用いて他のPT試薬より高いPRを示
すPT試薬はより感度が高いものである。それゆえ、この
rTF PT試薬はトロンボレルＳに比べて試験した特定の凝
固因子の欠乏に対する感度が高いということになる。
実施例５ 透析をしないrTFのプロトロンビン時間（rTF PT）試薬
の調製 リン脂質を以下の方法で再溶解した。PC、PEおよびPS
は室温まで加熱し、適当な管またはフラスコ中でPC、PE
およびPSモル比がそれぞれ7.5:1:1となるように化合さ
せた。抗酸化剤のブチレート化ヒドロキシトルエン（BH
T）をクロロホルムに溶解させ、上記リン脂質混合物に
重量比が0.1％（BHT:全リン脂質）となるように添加し
た。有機溶剤は乾燥窒素気流下もしくはロータリーエバ
ポレーターにて減圧下で蒸発させて除いた。残存する有
機溶剤は、さらに１時間室温にて真空ポンプを用い10μ
ｍまたはそれ以下の圧力における吸引によって除いた。
リン脂質混合物は50mMのオクチルベータ−Ｄ−チオグ
ルコピラノシド（OTG）を含有する20mM HEPES（pH6）,1
50mM NaCl中に最終濃度が4mg/mlとなるように再溶解さ
せた。実施例２で得たrTFとウシガンマグロブリンとを
再溶解リン脂質と混合した。十分量の20mM HEPES（pH
6）,150mM NaClを添加し、最終濃度がそれぞれrTF 10μ
g/ml、ウシガンマグロブリン1mg/ml、リン脂質4mg/mlお
よびOTGが10mMとなるようにした。CdCl2を最終濃度が5m
Mとなるように添加してrTFを活性化させた。rTF、OTGお
よびリン脂質からなる得られた混合ミセルを20mM HEPES
（pH6）,150mM NaClで希釈し、rTFをおよそ0.5ないし１
μg/ml、リン脂質をおよそ500ないし700μg/mlおよびウ
シガンマグロブリンをおよそ25ないし50μg/ml含有する
溶液を得、rTF PT試薬とした。
本実施例の試薬をトロンボスクリーンコントロール血
漿および正常ヒト血漿プールのプロトロンビン時間を測
定するのに用いた。この血漿のコントロールは異なるレ
ベルの血液凝固第II、Ｖ、VIIおよびＸ因子の活性を有
する擬血漿として製造されたものである。コントールＩ
は正常活性レベル付近を含有する、コントールIIには中
間レベルであり、コントールIIIは最低レベルを含有す
る。プロトロンビン時間はコントールＩで一番短く、コ
ントールIIIで最も長いことが予測される。表IIに結果
を示す このrTF PT試薬の感度をさらに、経口抗凝固治療中の
患者の血漿を用いて他の市販のプロトロンビン時間（P
T）試薬と比較した。市販の試薬はトロンボレルＳ（バ
ーヒング・ダイアグノステイックス、サマービル、ニュ
ージャージー）、シンプラスチン（Simplastin）（オー
ガノン・テクニカ社、シャーロッテ、ノース・カロライ
ナ）である。血漿サンプルは正常個体より得たものおよ
び経口抗凝固治療中の患者から得たものであり、地方病
院で凍結されたものを得た。
各血漿サンプルに対するプロトロンビン時間を各３つ
のPT試薬を用いて調べた。すなわち、100μｌの血漿と1
00μｌのrTF PT試薬とを凝固計のサンプルウエルに投入
した。この装置は20mMのCaCl2を100μｌ添加し、プロト
ロンビン時間を自動的に測定する。トロンボレルＳおよ
びシンプラスチンでは、100μｌの血漿をサンプルウエ
ルに投入し、この装置が200μｌのPT試薬を添加する。r
TF PT試薬およびシンプラスチンを用いて得た各患者の
プロトロンビン時間の対数変数値を、トロンボレルＳを
用いて測定した同じものに対してプロットした。Figure
2に示したデータより、rTF PTとトロンボレルＳは0.81
の傾きを示した。傾きが1.0であれば２つのPT試薬が同
じ能力を有することを意味する。すなわち、rTF PT試薬
の感度はトロンボレルＳに比べておよそ20％高い。しか
しながら、シンプラスチンとトロンボレルＳとを比較し
たグラフの傾きは1.62であり、シンプラスチンはトロン
ボレルＳよりかなり感度が低いことを示す。上記のデー
タは表IIから結論付けられる、rTF PT試薬は凝固因子活
性の減少に対して感受性であり、この感度は実際の患者
の血漿および患者の血漿に似せたものどちらででも示さ
れるということを確認する。
実施例６ rTFプロトロンビン時間試薬のディアフィルトレーショ
ン（diafiltration）による調製 リン脂質は7.5:1:1（PC:PE:PS）のモル比で化合さ
せ、乾燥させて有機溶剤を除き、その後実施例３に記載
したごとく再溶解させた。100mMのCHAPSを含有するTBS
に15mg/mlで再溶解したリン脂質をイムノアフィニティ
ーで精製したrTF（実施例２で得たもの）およびウシガ
ンマグロブリンと化合させた。150mMのトレハローズを
含有するTBSをさらに添加して最終濃度がリン脂質4mg/m
l、rTFが10μg/ml、ウシガンマグロブリンが1mg/mlおよ
びCHAPSが20mMとなるようにした。
洗剤（CHAPS）を、ピロスタート（Pyrostart）または
ウルトラスタート（Ultrastart）フィルターユニット
（サートリアス社（Sartorius Corp.）ボヘミア、ニュ
ーヨーク）を用い、透析用緩衝液として150mMのトレハ
ローズを含有するTBSを用いてタンジェンシャル・フロ
ー・ディアフィルトレーション（tangential flow diaf
iltration）によって除いた。およそ95から100％のCHAP
Sが、10倍量の透析用緩衝液をこの装置に通すことによ
って除かれた。ディアフィルトレーションの後、透析物
の体積を測定し、（必要であれば）150mMのトレハロー
ズを含有するTBSで最初の体積に調節し、0.05％のNaN3
・CdCl2を最終濃度が5mMとなるように添加しこの溶液を
37℃で２時間インキュベートした。
溶液をドライアイス上で凍結し、その後−40℃ではじ
まり室温で終了する48時間にわたるサイクルによって凍
結乾燥してもよい。得られた試薬は0.1Mトリス,pH7.5,1
50mMトレハローズを添加して作動濃度にし、rTFをおよ
そ１ないし２μg/ml、リン脂質をおよそ400ないし800μ
g/mlおよび、ウシガンマグロブリンを50ないし100μg/m
l含有する溶液を得た。この試薬は表IIで観察されたも
のと同様の性能を示した。
実施例７ rTFプロトロンビン時間試薬のXAD−２樹脂の添加による
調製 リン脂質はモル比67:16:10:7（PC:PG:PE:PS）で化合
させ、乾燥させて有機溶剤を除き、その後実施例３に記
載されたごとく再溶解した。100mMのCHAPSと0.8％のグ
リシンを含有するTBSに15mg/mlに再溶解させたリン脂質
を、イムノアフィニティーで精製したrTF（実施例２よ
り）およびウシガンマグロブリンと化合させた。さらに
150mMのトレハローズと0.8％のグリシンを含有するTBS
をさらに添加し、リン脂質3mg/ml、rTF4.5μg/ml、ウシ
ガンマグロブリン1mg/mlおよびCHAPS 20mMの最終濃度を
得た。
アンバーライトXAD−２（Amberlite XAD−２）（ロー
ムアンド・ハース社フィラデルフィア、ペンシルバニ
ア）またはバイオ−ビーズSM−２（Bio−Beads SM−
２）（バイオラッド、リッチモンド、カリフォルニア）
のような疎水性クロマトグラフィー用樹脂を洗剤（CHAP
S）を除くのに、リン脂質溶液に直接接触させて、また
は透析メンブランによりリン脂質より分離させたものに
接触させて用いた。除去速度は溶液中の溶液中の洗剤と
クラマトグラフ樹脂ビーズとの洗剤との重量比に比例す
る。実際、除去速度は添加した樹脂の量および添加速度
の両方に比例する。全洗剤を除去するのに必要とされる
量は樹脂の容量（製造元より与えられた）および除去す
る全洗剤の体積から計算される。さらに、洗剤を99.9％
除去するのは、この量の樹脂が添加される速度に依存し
て30℃において、１時間以内または24時間以内のどちで
あってもよい。CdCl2を最終濃度が5mMとなるように添加
し、この溶液を37℃で２時間インキュベートした。リポ
ソームは50mMトリス,pH7.5,75mMトレハローズ,15mM CaC
l2,0.8％グリシン,1％マルトース,0.05％NaN3で作動濃
度に希釈し、rTFをおよそ0.04ないし0.20μg/ml、リン
脂質をおよそ40から150μg/mlおよびウシガンマグロブ
リンを50ないし100μg/ml含有する溶液を得た。
溶液はドライアイス上で凍結させ、その後−40℃では
じまり室温で終了する48時間にわたるサイクルを用いて
凍結乾燥した。凍結乾燥した試薬を使用前に蒸留水で再
構成した。
rTF PT試薬の性能を測定し、その結果を以下の表III
に示した。すなわち、100μｌの正常ヒト血漿プールま
たはオルソ・コントロール血漿（Ortho control plasm
a）を凝固計のサンプル用ウエル内へ投入した。この装
置は100μｌのrTF PTを添加してプロトロンビン時間を
測定する。
このデータはrTF PT試薬が本発明の目的とする能力を有
することを示す。第一に異なったコントロールのプロト
ロンビン時間が様々な程度の抗凝固治療中患者からの血
漿に似せるようにデザインされたこれらのコントロール
に対してその予測される変化を反映している。第２に正
常ヒト血漿プロトロンビン時間がレベルＩのコントロー
ルと合致する。後者の効果はグリシンを試薬中に含むこ
とに起因する。表Ｉと表IIIのデータを比較せよ。
フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭57−178161（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−91899（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−107742（ＪＰ，Ａ) 特表 昭62−501631（ＪＰ，Ａ) Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉ ｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ，（1985），260, Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（1977）165, Ｐ89−96 Ｓｏｏｔｔ Ｍ，Ｂｒｏｗｎ，ｅｔ. ａｌ，ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ ＯＦ Ａ ＨＵＭＡＮ ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＮ Ｔ ＴＩＳＳＵＥ ＦＡＣＯＲ（ｒＴ Ｆ）−ＢＡＳＥＤ ＰＲＯＴＨＲＯＭＢ ＩＮ ＴＩＮＥ（ＰＴ）ＲＥＡＧＥＮ Ｔ，ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴ ＲＹ，1991年，37（６）951 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/86 A61K 9/127 A61K 38/43 ACB

Claims (29)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】（ａ）以下のリン脂質を含有する脂質混合
    物： （ｉ）20から95モルパーセントのホスファチジルコリ
    ン； （ii）2.5から50モルパーセントのホスファチジルエタ
    ノールアミン； （iii）2.5から50モルパーセントのホスファチジルセリ
    ン；および （iv）０から40モルパーセントのホスファチジルグリセ
    ロール、および （ｂ）リン脂質混合物1mgにつき0.1μｇから３μｇの組
    織因子 を含有するリポソーム組成物を含有する、組織因子に基
    づくプロトロンビン時間試薬。
  2. 【請求項２】0.5パーセントから1.5パーセント（w/v）
    のグリシンをさらに含有する第１項記載のプロトロンビ
    ン時間試薬。
  3. 【請求項３】トレハローズ、マルトース、ラクトース、
    グルコースおよびマニトールからなる群から選択される
    炭水化物低温保存剤をさらに含有する第１項記載のプロ
    トロンビン時間試薬。
  4. 【請求項４】炭水化物低温保存剤が50mMから250mMのト
    レハローズを含む第３項記載のプロトロンビン時間試
    薬。
  5. 【請求項５】リン脂質混合物が、５から15モルパーセン
    トのホスファチジルエタノールアミン、５から20モルパ
    ーセントのホスファチジルセリン、10から25モルパーセ
    ントのホスファチジルグリセロールおよびその残りのホ
    スファチジルコリンを含有する第４項記載のプロトロン
    ビン時間試薬。
  6. 【請求項６】リン脂質混合物が、８から12モルパーセン
    トのホスファチジルエタノールアミン、３から10モルパ
    ーセントのホスファチジルセリン、14から20モルパーセ
    ントのホスファチジルグリセロールおよび58から75モル
    パーセントのホスファチジルコリンを含有する第４項記
    載のプロトロンビン時間試薬。
  7. 【請求項７】リン脂質混合物が、８から12モルパーセン
    トのホスファチジルエタノールアミン、３から10モルパ
    ーセントのホスファチジルセリン、14から20モルパーセ
    ントのホスファチジルグリセロールおよび58から75モル
    パーセントのホスファチジルコリンを含有する第１項ま
    たは第２項記載のプロトロンビン時間試薬。
  8. 【請求項８】組織因子がリコンビナント組織因子である
    第７項記載のプロトロンビン時間試薬。
  9. 【請求項９】0.6から1.2パーセント（w/v）のグリシン
    を含有する第４項記載のプロトロンビン時間試薬。
  10. 【請求項１０】以下のステップ： （ａ）リン脂質混合物、組織因子およびキャリアータン
    パクを洗剤で共溶解する； （ｂ）洗剤を除く；そして （ｃ）カルシウム塩を添加する、 を含み、リン脂質混合物が、 （ｉ）20から95モルパーセントのホスファチジルコリ
    ン； （ii）2.5から50モルパーセントのホスファチジルエタ
    ノールアミン； （iii）2.5から50モルパーセントのホスファチジルセリ
    ン；および （iv）０から40モルパーセントのホスファチジルグリセ
    ロールを含有し、 リン脂質混合物1mgにつき0.1μｇから３μｇの組織因子
    を用いる、リン脂質小胞の脂質二重層と会合した活性組
    織因子を含有するプロトロンビン時間試薬の調製方法。
  11. 【請求項１１】ステップ（ａ）において0.5から1.5パー
    セント（w/v）のグリシンをさらに共溶解性とする、第1
    0項記載の方法。
  12. 【請求項１２】組織因子がリコンビナント組織因子であ
    る第11項記載の方法。
  13. 【請求項１３】洗剤がチャプス（CHAPS）、オクチルベ
    ータ−Ｄ−グルコピラノシドおよびオクチルベータ−Ｄ
    −チオグルコピラノシドからなる群から選択される第10
    項記載の方法。
  14. 【請求項１４】洗剤が透析、タンジェンシャル・フロー
    ・ディアフィルトレーション（tangential flow diafil
    tration）およびクロマトグラフ法からなる群から選択
    される手法により除かれる第10項記載の方法。
  15. 【請求項１５】（ａ）以下のリン脂質を含有するリン脂
    質混合物： （ｉ）20から95モルパーセントのホスファチジルコリ
    ン； （ii）2.5から50モルパーセントのホスファチジルエタ
    ノールアミン； （iii）2.5から50モルパーセントのホスファチジルセリ
    ン；および （iv）０から40モルパーセントのホスファチジルグリセ
    ロール； （ｂ）リン脂質混合物1mgにつき0.1μｇから３μｇの組
    織因子；および （ｃ）洗剤 を含有するリン脂質ミセルを含有する組織因子に基づく
    プロトロンビン時間試薬。
  16. 【請求項１６】0.5から1.5パーセント（w/v）のグリシ
    ンをさらに含有する第15項記載のプロトロンビン時間試
    薬。
  17. 【請求項１７】トレハローズ、マルトース、ラクトー
    ス、グルコースおよびマニトールからなる群から選択さ
    れる炭水化物低温保存剤をさらに含有する第15項または
    16項記載のプロトロンビン時間試薬。
  18. 【請求項１８】炭水化物低温保存剤が50mMから250mMの
    トレハローズである第17項記載のプロトロンビン時間試
    薬。
  19. 【請求項１９】リン脂質混合物が、５から15モルパーセ
    ントのホスファチジルエタノールアミン、５から20モル
    パーセントのホスファチジルセリン、10から25モルパー
    セントのホスファチジルグリセロールおよびその残りの
    ホスファチジルコリンを含有する第18項記載のプロトロ
    ンビン時間試薬。
  20. 【請求項２０】リン脂質混合物が、８から12モルパーセ
    ントのホスァチジルエタノールアミン、３から10モルパ
    ーセントのホスファチジルセリン、14から20モルパーセ
    ントのホスファチジルグリセロールおよび58から75モル
    パーセントのホスファチジルコリンを含有する第18項記
    載のプロトロンビン時間試薬。
  21. 【請求項２１】リン脂質混合物が、８から12モルパーセ
    ントのホスファチジルエタノールアミン、３から10モル
    パーセントのホスファチジルセリン、14から20モルパー
    セントのホスファチジルグリセロールおよび58から75モ
    ルパーセントのホスファチジルコリンを含有する第15項
    または16項記載のプロトロンビン時間試薬。
  22. 【請求項２２】組織因子がリコンビナントの組織因子で
    ある第21項記載のプロトロンビン時間試薬。
  23. 【請求項２３】0.6から1.2パーセント（w/v）のグリシ
    ンを含有する第18項記載のプロトロンビン時間試薬。
  24. 【請求項２４】洗剤がアルキルグルコピラノシドである
    第15項または16項記載のプロトロンビン時間試薬。
  25. 【請求項２５】以下のステップ： （ａ）リン脂質混合物、組織因子およびキャリアータン
    パクを洗剤で共溶解する；そして （ｂ）カルシウム塩を添加する を含み、リン脂質混合物が、 （ｉ）20から95モルパーセントのホスファチジルコリ
    ン； （ii）2.5から50モルパーセントのホスファチジルエタ
    ノールアミン； （iii）2.5から50モルパーセントのホスファチジルセリ
    ン； （iv）０から40モルパーセントのホスファチジルグリセ
    ロール を含有し、リン脂質混合物1mgにつき0.1μｇから３μｇ
    の組織因子を用いる、リン脂質ミセルと会合した活性組
    織因子を含有するプロトロンビン時間試薬の調製方法。
  26. 【請求項２６】洗剤が、オクチルベータ−Ｄ−グルコピ
    ラノシドおよびオクチルベータ−Ｄ−チオグルコピラノ
    シドからなる群から選択される第25項記載の方法。
  27. 【請求項２７】ステップ（ａ）において0.5から1.5パー
    セント（w/v）のグリシンをさらに共溶解性とする、第2
    6項記載の方法。
  28. 【請求項２８】洗剤がアルキルグルコピラノシドを含有
    する第26項または第27項記載の方法。
  29. 【請求項２９】洗剤がオクチルベータ−Ｄ−グルコピラ
    ノシドおよびオクチルベータ−Ｄ−チオグルコピラノシ
    ドからなる群から選択される第28項記載の方法。
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