JP3416778B2 - 組換えヒト組織因子及び精製された天然及び合成のリン脂質からのプロトロンビン時間試薬の製造 - Google Patents
組換えヒト組織因子及び精製された天然及び合成のリン脂質からのプロトロンビン時間試薬の製造Info
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- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
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- G01N2405/04—Phospholipids, i.e. phosphoglycerides
Description
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、一般的に、凝固系における機能障害を判定
するためのプロトロンビン時間試薬の分野に関し、より
具体的には、プロトロンビン時間試験のための、組換え
ヒト組織因子及び天然又は合成起源のリン脂質より作ら
れる試薬に関する。本発明はまた、組織因子とリン脂質
とを組み合わせる方法をも含む。
するためのプロトロンビン時間試薬の分野に関し、より
具体的には、プロトロンビン時間試験のための、組換え
ヒト組織因子及び天然又は合成起源のリン脂質より作ら
れる試薬に関する。本発明はまた、組織因子とリン脂質
とを組み合わせる方法をも含む。
先行技術の記述
組織因子（トロンボプラスチンとも呼ばれる）は、血
液凝固第VII及びVII a因子と複合体を形成することによ
って機能する膜関連糖蛋白質である。これらの因子の複
合体化は、第VII及びVII a因子の蛋白質分解活性を非常
に高める。組織因子の機能的活性は、リン脂質の存在へ
の絶対的依存性を有している。Bach,Ronald R.,Initiat
ion of Coagulation by Tissue Factor,CRC Critical R
eview in Biochemistry 1988;23（４）:pp.339−368.第
VII/VII a因子／組織因子複合体は、凝固カスケードの
外因性の及び共通の経路を構成する一連の特異的酵素を
活性化し、最終的にはトロンビン、フィブリンの形成、
血小板活性化を、そして最後に血餅形成をもたらす。Ne
merson,Yale,Tissue Factor and Hemostasis,Blood 198
8;71:pp.1−8. プロトロンビン時間（PT）のような診断試験は、患者
の血液凝固系における機能障害を診断するために、管理
された条件下においてin vitroでこの一連の酵素的事象
を利用する。PT試験においては、血餅形成の起こるに要
する時間がプロトロンビン時間すなわちPT値である。
液凝固第VII及びVII a因子と複合体を形成することによ
って機能する膜関連糖蛋白質である。これらの因子の複
合体化は、第VII及びVII a因子の蛋白質分解活性を非常
に高める。組織因子の機能的活性は、リン脂質の存在へ
の絶対的依存性を有している。Bach,Ronald R.,Initiat
ion of Coagulation by Tissue Factor,CRC Critical R
eview in Biochemistry 1988;23（４）:pp.339−368.第
VII/VII a因子／組織因子複合体は、凝固カスケードの
外因性の及び共通の経路を構成する一連の特異的酵素を
活性化し、最終的にはトロンビン、フィブリンの形成、
血小板活性化を、そして最後に血餅形成をもたらす。Ne
merson,Yale,Tissue Factor and Hemostasis,Blood 198
8;71:pp.1−8. プロトロンビン時間（PT）のような診断試験は、患者
の血液凝固系における機能障害を診断するために、管理
された条件下においてin vitroでこの一連の酵素的事象
を利用する。PT試験においては、血餅形成の起こるに要
する時間がプロトロンビン時間すなわちPT値である。
現在入手可能なPT試験はいずれも、天然の源より抽出
された粗製の組織因子を含んだPT試薬を利用している。
PT試薬は次の特性を有することが重要である。すなわ
ち、異常なサンプルに対して鋭敏であり、正常血漿に対
して十分に限定された正常PT値を与え、正確且つ再現性
のある結果を与え、各ロット間の均一性を有し、凍結乾
燥状態において貯蔵のために安定でなければならず、そ
して再構成した後安定でなければならない。
された粗製の組織因子を含んだPT試薬を利用している。
PT試薬は次の特性を有することが重要である。すなわ
ち、異常なサンプルに対して鋭敏であり、正常血漿に対
して十分に限定された正常PT値を与え、正確且つ再現性
のある結果を与え、各ロット間の均一性を有し、凍結乾
燥状態において貯蔵のために安定でなければならず、そ
して再構成した後安定でなければならない。
現在、PT試薬において使用されている組織因子は、家
兎の脳、家兎の脳／肺混合物、ヒトの胎盤又は牛の脳か
ら抽出された粗製の組織因子調製物である。これらの源
の各々は、それらを問題あるものとしている限界を有す
る。例えば、家兎の脳トロンボプラスチンは、いくらか
の季節的変動性、ロット間変動性を示し、そして比較的
供給が不足している。ヒト組織因子はHIV又は他のヒト
ウイルス性疾患の源であり得、牛の脳は他の通常の源か
らの組織因子を使用して観察されるよりもずっと長い正
常PT値を与える。より長いPT値は、試験室における一層
少ない成果につながる。加えて、これらの一層長い時間
は、牛の組織因子の、ヒト第VII因子に結合する能力に
おける差異を反映するものであろう。更に、天然の源か
らの粗製の組織因子調製物は、他の凝固因子を不純物と
して含む。凝固因子による汚染は、凝固因子欠乏血漿に
対する感受性の乏しい凝固因子アッセイ曲線をもたら
す。従って、一層再現性のあるPT試薬を生み出すため
に、これらの欠点を持たず且つロット間変動性の改善さ
れた組織因子の源が必要とされている。最近、現在入手
できるPT試験において使用するための、組換え組織因子
の使用が示唆されている。Pabrosky,L.et al.,Purifica
tion of Recombinant Human Tissue Factor,Biochemist
ry 1989;28（20）:pp.8072−8077. 本発明においては、E.coliを含む数種のタイプの生物
中においてごく最近クローン化され発現されたヒト組織
因子が、これらの問題を解決するためにPT試薬において
使用される。Konigsberg W.H.,Nemerson,Y.et al.,Isol
ation of cDNA clones coding for human tissue facto
r:Primary structure of the protein and cDNA,Proc.N
atl.Acad.Sci.1987;84:pp.5148−5152.加えて、本発明
は、クローン化された組織因子の一部分をPT試薬におい
て使用することができる。例えば、クローン化された組
織因子の細胞内（細胞質）ドメインの大部分は、機能的
活性を失うことなしに切断されることができる。更に、
Cys 245のセリンへの変換のような点突然変異は、機能
的活性の喪失なしに達成できる。Pabrosky L.,et al.,P
urification of Recombinant Human Tissue Factor,Bio
chemistry 1989:28（20）:pp.8072−8077. 先に述べたように、組織因子は機能的活性のためにリ
ン脂質を絶対的に要求している。現在PT試薬中に見出さ
れるリン脂質は、しかしながら、組織因子が動物源より
抽出されるときにこれに接着する脂質である。例えば、
家兎脳の抽出過程は、組織因子と、in vivoで該組織因
子に結合して抽出工程をくぐり抜けた天然に存在するリ
ン脂質との同時単離をもたらす。更なる脂質の添加はな
い。従って、PT試薬において使用されている脂質の性
質、量及び質は、出発組織及び抽出工程に依存して変動
する。この変動は、PT試薬のロット間変動を増大するで
あろう。Dade トロンボプラスチン試薬、トロンボプラ
スチンＣ、Ｃ＋、及びISは、いずれも緩衝剤及び安定化
剤のアセトン脱水混合物の抽出物に基づいている。該部
分的に精製された組織因子抽出物は完全には脱脂されて
おらず、従って、脂質が抽出物へ加え戻されず、脂質の
性質及び組成は満足に限定されずロット間で変動し得
る。
兎の脳、家兎の脳／肺混合物、ヒトの胎盤又は牛の脳か
ら抽出された粗製の組織因子調製物である。これらの源
の各々は、それらを問題あるものとしている限界を有す
る。例えば、家兎の脳トロンボプラスチンは、いくらか
の季節的変動性、ロット間変動性を示し、そして比較的
供給が不足している。ヒト組織因子はHIV又は他のヒト
ウイルス性疾患の源であり得、牛の脳は他の通常の源か
らの組織因子を使用して観察されるよりもずっと長い正
常PT値を与える。より長いPT値は、試験室における一層
少ない成果につながる。加えて、これらの一層長い時間
は、牛の組織因子の、ヒト第VII因子に結合する能力に
おける差異を反映するものであろう。更に、天然の源か
らの粗製の組織因子調製物は、他の凝固因子を不純物と
して含む。凝固因子による汚染は、凝固因子欠乏血漿に
対する感受性の乏しい凝固因子アッセイ曲線をもたら
す。従って、一層再現性のあるPT試薬を生み出すため
に、これらの欠点を持たず且つロット間変動性の改善さ
れた組織因子の源が必要とされている。最近、現在入手
できるPT試験において使用するための、組換え組織因子
の使用が示唆されている。Pabrosky,L.et al.,Purifica
tion of Recombinant Human Tissue Factor,Biochemist
ry 1989;28（20）:pp.8072−8077. 本発明においては、E.coliを含む数種のタイプの生物
中においてごく最近クローン化され発現されたヒト組織
因子が、これらの問題を解決するためにPT試薬において
使用される。Konigsberg W.H.,Nemerson,Y.et al.,Isol
ation of cDNA clones coding for human tissue facto
r:Primary structure of the protein and cDNA,Proc.N
atl.Acad.Sci.1987;84:pp.5148−5152.加えて、本発明
は、クローン化された組織因子の一部分をPT試薬におい
て使用することができる。例えば、クローン化された組
織因子の細胞内（細胞質）ドメインの大部分は、機能的
活性を失うことなしに切断されることができる。更に、
Cys 245のセリンへの変換のような点突然変異は、機能
的活性の喪失なしに達成できる。Pabrosky L.,et al.,P
urification of Recombinant Human Tissue Factor,Bio
chemistry 1989:28（20）:pp.8072−8077. 先に述べたように、組織因子は機能的活性のためにリ
ン脂質を絶対的に要求している。現在PT試薬中に見出さ
れるリン脂質は、しかしながら、組織因子が動物源より
抽出されるときにこれに接着する脂質である。例えば、
家兎脳の抽出過程は、組織因子と、in vivoで該組織因
子に結合して抽出工程をくぐり抜けた天然に存在するリ
ン脂質との同時単離をもたらす。更なる脂質の添加はな
い。従って、PT試薬において使用されている脂質の性
質、量及び質は、出発組織及び抽出工程に依存して変動
する。この変動は、PT試薬のロット間変動を増大するで
あろう。Dade トロンボプラスチン試薬、トロンボプラ
スチンＣ、Ｃ＋、及びISは、いずれも緩衝剤及び安定化
剤のアセトン脱水混合物の抽出物に基づいている。該部
分的に精製された組織因子抽出物は完全には脱脂されて
おらず、従って、脂質が抽出物へ加え戻されず、脂質の
性質及び組成は満足に限定されずロット間で変動し得
る。
In vitroの組織因子研究は、20:80乃至40:60の範囲の
フォスファチジルセリン：フォスファチジルコリンが、
アポ組織因子の活性を保存することを示している。Neme
rson,Yale,Tissue Factor and Hemostasis,Blood 1988;
71:pp.108.リン脂質の極性の先端基の性質は、組織因子
の活性を劇的に変える。Bach,Ronald,Initiation of Co
agulation by Tissue Factor,CRC Critical Review in
Biochemistry 1988;23（４）:pp.339−368.しかしなが
ら、一般的には、PT試薬において使用されている脂質は
十分に特徴付けられていなかった。十分に限定された再
現性のよいリン脂質組成物が、改良されたPT試薬を提供
するために必要とされている。
フォスファチジルセリン：フォスファチジルコリンが、
アポ組織因子の活性を保存することを示している。Neme
rson,Yale,Tissue Factor and Hemostasis,Blood 1988;
71:pp.108.リン脂質の極性の先端基の性質は、組織因子
の活性を劇的に変える。Bach,Ronald,Initiation of Co
agulation by Tissue Factor,CRC Critical Review in
Biochemistry 1988;23（４）:pp.339−368.しかしなが
ら、一般的には、PT試薬において使用されている脂質は
十分に特徴付けられていなかった。十分に限定された再
現性のよいリン脂質組成物が、改良されたPT試薬を提供
するために必要とされている。
発明の概要
本発明は、精製された組換えヒト組織因子（rTF）を
使用して製造されるPT試薬に関する。本発明はまた、該
組換え又は天然の組織因子と組合せての、高度に精製さ
れ十分に限定された、合成の又は天然の脂質の使用をも
記述している。組織因子源及び純度を管理し、そして高
度に精製された脂質を十分に限定された特定の緩衝剤及
び安定剤と組み合わせて使用することにより、PT試薬に
おける組織因子の性能の管理が改善される。
使用して製造されるPT試薬に関する。本発明はまた、該
組換え又は天然の組織因子と組合せての、高度に精製さ
れ十分に限定された、合成の又は天然の脂質の使用をも
記述している。組織因子源及び純度を管理し、そして高
度に精製された脂質を十分に限定された特定の緩衝剤及
び安定剤と組み合わせて使用することにより、PT試薬に
おける組織因子の性能の管理が改善される。
本発明は、次のものよりなるPT試薬である。すなわ
ち、組換え組織因子、リン脂質（合成又は天然のいずれ
か）、カルシウムイオン、及び緩衝剤組成物、並びに、
グリシン又はデキストランのような安定化剤及びNaClの
ような塩類を有してもよい。
ち、組換え組織因子、リン脂質（合成又は天然のいずれ
か）、カルシウムイオン、及び緩衝剤組成物、並びに、
グリシン又はデキストランのような安定化剤及びNaClの
ような塩類を有してもよい。
本発明の好ましい具体例は、Nemerson,Y.et al.,Isol
ation of cDNA clones coding for human tissue facto
r:Primary structure of the protein and cDNA,Proc.N
atl.Acad.Sci.1987;84:pp.5148−5152.、Pabrosky L.,e
t al.,Purification of Recombinant Human Tissue Fac
tor,Biochemistry 1989:28（20）pp.8072−8077.によっ
て得られる組換え組織因子又はそれらの部分を使用す
る。本発明の好ましい具体例は、匹敵する活性を有する
ものである、切断されているか又は点突然変異を含んで
いてよい約20乃至400ng/mLの濃度のrTFと、好ましくは
精製された天然の又は合成のフォスファチジルセリン：
フォスファチジルコリン及びそれらの合成誘導体を約3
0:70の比に含むリン脂質組成物とからなり、そして組織
因子：リン脂質のモル比約1:2000乃至1:20000を有し、
並びに緩衝剤及び安定化剤を有する。該好ましい具体例
における緩衝剤は、約20乃至80mMの濃度においてHEPE
S、TAPSO、MOPS、TES、DIPSO、POPSO、及びTRISよりな
る群より選ばれるが、他の緩衝剤を使用してもよい。該
好ましい具体例の増量剤は、約０乃至10％のグリシン及
び約０乃至５％のデキストランを含むが、他の薬剤を使
用してもよい。該好ましい具体例はまた、約９乃至15mM
のカルシウムイオンをも含み、また約０乃至300mMのNaC
lを含んでもよい。
ation of cDNA clones coding for human tissue facto
r:Primary structure of the protein and cDNA,Proc.N
atl.Acad.Sci.1987;84:pp.5148−5152.、Pabrosky L.,e
t al.,Purification of Recombinant Human Tissue Fac
tor,Biochemistry 1989:28（20）pp.8072−8077.によっ
て得られる組換え組織因子又はそれらの部分を使用す
る。本発明の好ましい具体例は、匹敵する活性を有する
ものである、切断されているか又は点突然変異を含んで
いてよい約20乃至400ng/mLの濃度のrTFと、好ましくは
精製された天然の又は合成のフォスファチジルセリン：
フォスファチジルコリン及びそれらの合成誘導体を約3
0:70の比に含むリン脂質組成物とからなり、そして組織
因子：リン脂質のモル比約1:2000乃至1:20000を有し、
並びに緩衝剤及び安定化剤を有する。該好ましい具体例
における緩衝剤は、約20乃至80mMの濃度においてHEPE
S、TAPSO、MOPS、TES、DIPSO、POPSO、及びTRISよりな
る群より選ばれるが、他の緩衝剤を使用してもよい。該
好ましい具体例の増量剤は、約０乃至10％のグリシン及
び約０乃至５％のデキストランを含むが、他の薬剤を使
用してもよい。該好ましい具体例はまた、約９乃至15mM
のカルシウムイオンをも含み、また約０乃至300mMのNaC
lを含んでもよい。
本発明はまた、組織因子をリン脂質と組み合わせる方
法をも含んでなる。リン脂質は、その透析又はダイアフ
ィルトレーションを許容するに十分高い臨界ミセル濃度
を有する界面活性剤中に可溶化される。組織因子もまた
界面活性剤中に可溶化されリン脂質と組み合わされる。
混合物は次いで、接線流システム中においてダイアフィ
ルトレーションを受け、膜の外面と接触する。ダイアフ
ィルトレーションは、本質的に全ての界面活性剤が除去
されるまで続けられる。
法をも含んでなる。リン脂質は、その透析又はダイアフ
ィルトレーションを許容するに十分高い臨界ミセル濃度
を有する界面活性剤中に可溶化される。組織因子もまた
界面活性剤中に可溶化されリン脂質と組み合わされる。
混合物は次いで、接線流システム中においてダイアフィ
ルトレーションを受け、膜の外面と接触する。ダイアフ
ィルトレーションは、本質的に全ての界面活性剤が除去
されるまで続けられる。
この発明によれば、PT値を決定するための高度の感受
性及び再現性を有するPT試薬が提供される。本発明の更
なる目的は、凝固系の全体的機能に対して感受性のある
PT試薬を提供することである。この発明の別の目的は、
正常血漿サンプルに対する十分限定された凝固時間を有
し且つ異常血漿サンプルの凝固時間を延長するPT試薬を
提供することである。本発明の更なる目的は、最小のロ
ット間変動性と高められた安定性及び光学的透明性とを
有するPT試薬を提供することである。この発明の更なる
目的は、現行の方法より能率的且つ再現性のある、rTF
をリン脂質と組み合わせる方法を提供することである。
性及び再現性を有するPT試薬が提供される。本発明の更
なる目的は、凝固系の全体的機能に対して感受性のある
PT試薬を提供することである。この発明の別の目的は、
正常血漿サンプルに対する十分限定された凝固時間を有
し且つ異常血漿サンプルの凝固時間を延長するPT試薬を
提供することである。本発明の更なる目的は、最小のロ
ット間変動性と高められた安定性及び光学的透明性とを
有するPT試薬を提供することである。この発明の更なる
目的は、現行の方法より能率的且つ再現性のある、rTF
をリン脂質と組み合わせる方法を提供することである。
本発明の利点及び組成は、以下の詳細な説明及び実施
例を参照することにより一層よく理解されるであろう。
例を参照することにより一層よく理解されるであろう。
図面の簡単な説明
図１は、商業的に入手できる試薬に対する、再構成さ
れた凍結乾燥された本発明のPT試薬の安定性の改善を示
すグラフである。
れた凍結乾燥された本発明のPT試薬の安定性の改善を示
すグラフである。
図２は、商業的に入手できる試薬に対する、凍結乾燥
された本発明のPT試薬の安定性の改善を示すグラフであ
る。
された本発明のPT試薬の安定性の改善を示すグラフであ
る。
好ましい具体例の詳細な説明
本発明の好ましい具体例が先行技術に対して有する利
点は、それが、精製された十分に限定されたリン脂質と
の組合せにおいて、十分に限定された精製されたrTF蛋
白質を使用することである。Nemerson及びPabroskyの各
方法に従って、完全長の並びに切断した組換え分子を使
用することができる。本発明はまた、PT試薬の機能的活
性を減ずることのないアミノ酸の付加、削除及び置換を
伴ったrTFをも範囲に含む。rTFの好ましい修正は、アミ
ノ酸残基243又はその付近において切断されたものであ
る。PT試薬におけるrTFの好ましい濃度は約20乃至400ng
/mLであり、最も好ましくは約40乃至250ng/mLである。
これらの原材料より作られたPT試薬は、天然起源の材料
の粗製抽出物に基づくPT試薬中に見出される微細な析出
物を有さず、光学的に透明である。原材料が高度に精製
されていることから、化学分析は、それらの期待される
性能の意味ある尺度を与える。化学分析は、機能的アッ
セイと組み合わせて、重要な臨床的考慮事項であるロッ
ト間均一性を提供する助けとなる。表Ｉは、rTFを使用
して作ったPT試薬の３つの異なるロットの比較を示す。
結果は、正常血漿、正常対照、異常対照及びワルファリ
ン処理サンプルからのPT値を比較することによって、こ
れらのロットの均一性を実証している。
点は、それが、精製された十分に限定されたリン脂質と
の組合せにおいて、十分に限定された精製されたrTF蛋
白質を使用することである。Nemerson及びPabroskyの各
方法に従って、完全長の並びに切断した組換え分子を使
用することができる。本発明はまた、PT試薬の機能的活
性を減ずることのないアミノ酸の付加、削除及び置換を
伴ったrTFをも範囲に含む。rTFの好ましい修正は、アミ
ノ酸残基243又はその付近において切断されたものであ
る。PT試薬におけるrTFの好ましい濃度は約20乃至400ng
/mLであり、最も好ましくは約40乃至250ng/mLである。
これらの原材料より作られたPT試薬は、天然起源の材料
の粗製抽出物に基づくPT試薬中に見出される微細な析出
物を有さず、光学的に透明である。原材料が高度に精製
されていることから、化学分析は、それらの期待される
性能の意味ある尺度を与える。化学分析は、機能的アッ
セイと組み合わせて、重要な臨床的考慮事項であるロッ
ト間均一性を提供する助けとなる。表Ｉは、rTFを使用
して作ったPT試薬の３つの異なるロットの比較を示す。
結果は、正常血漿、正常対照、異常対照及びワルファリ
ン処理サンプルからのPT値を比較することによって、こ
れらのロットの均一性を実証している。
組換えTFを含むPT試薬に使用される天然に存するリン
脂質は、全リン脂質の約25乃至35％の範囲、最も好まし
くは30％の天然のフォスファチジルセリン（PS）と、全
リン脂質の約65乃至75％の範囲、最も好ましくは70％の
天然のフォスファチジルコリン（PC）とを含む。使用さ
れるフォスファチジルコリンは中性電荷であり、一方フ
ォスファチジルセリンは負に荷電している。好ましい具
体例においては、脂質は全体で負の電荷を有する。本発
明の他の具体例においては、他の脂質の組合せを使用す
ることができる。組織因子：リン脂質のモル比約1:2000
乃至1:20000が必要であり、最も好ましい比は約1:10000
である。これは、約１乃至300μＭの全リン脂質濃度を
有するPT試薬をもたらす。天然PSの好ましい起源は、牛
の脳からのものであり、天然PCの好ましい起源は卵黄か
らのものである。
脂質は、全リン脂質の約25乃至35％の範囲、最も好まし
くは30％の天然のフォスファチジルセリン（PS）と、全
リン脂質の約65乃至75％の範囲、最も好ましくは70％の
天然のフォスファチジルコリン（PC）とを含む。使用さ
れるフォスファチジルコリンは中性電荷であり、一方フ
ォスファチジルセリンは負に荷電している。好ましい具
体例においては、脂質は全体で負の電荷を有する。本発
明の他の具体例においては、他の脂質の組合せを使用す
ることができる。組織因子：リン脂質のモル比約1:2000
乃至1:20000が必要であり、最も好ましい比は約1:10000
である。これは、約１乃至300μＭの全リン脂質濃度を
有するPT試薬をもたらす。天然PSの好ましい起源は、牛
の脳からのものであり、天然PCの好ましい起源は卵黄か
らのものである。
合成のリン脂質もまた本発明に使用できる。これらの
合成化合物は種々あってよく、脂肪酸側鎖において天然
に存在するリン脂質には見られない変種を有することが
できる。PT試薬の改善をもたらす側鎖の変種は、PS若し
くはPC又はこれらの双方についてのC14、C16又はC18鎖
長を有する不飽和脂肪酸側鎖である。好ましい具体例に
は、ジオレオイル（18:1）−PS、パルミトイル（16:0）
−オレオイル（18:1）−PS、ジミリストイル（14:0）−
PS、ジパルミトレオイル（16:1）−PC、ジパルミトイル
（16:0）−PC、ジオレオイル（18:1）−PC、パルミトイ
ル（16:0）−オレオイル（18:1）−PC、及びミリストイ
ル（14:0）−オレオイル（18:1）−PCが構成要素として
含まれるが、これらに限定はされない。
合成化合物は種々あってよく、脂肪酸側鎖において天然
に存在するリン脂質には見られない変種を有することが
できる。PT試薬の改善をもたらす側鎖の変種は、PS若し
くはPC又はこれらの双方についてのC14、C16又はC18鎖
長を有する不飽和脂肪酸側鎖である。好ましい具体例に
は、ジオレオイル（18:1）−PS、パルミトイル（16:0）
−オレオイル（18:1）−PS、ジミリストイル（14:0）−
PS、ジパルミトレオイル（16:1）−PC、ジパルミトイル
（16:0）−PC、ジオレオイル（18:1）−PC、パルミトイ
ル（16:0）−オレオイル（18:1）−PC、及びミリストイ
ル（14:0）−オレオイル（18:1）−PCが構成要素として
含まれるが、これらに限定はされない。
PT試薬の至適活性は、組織因子：合成リン脂質比が約
1:2000乃至1:20000、好ましい比としては、約1:10000の
ときに達成される。これは、全リン脂質の約１乃至300
μＭの最終濃度をもたらす。このように、これらPS:PC
及び全リン脂質に対するrTFの比の双方が、至適な機能
的活性を達成し維持するのに必須である。
1:2000乃至1:20000、好ましい比としては、約1:10000の
ときに達成される。これは、全リン脂質の約１乃至300
μＭの最終濃度をもたらす。このように、これらPS:PC
及び全リン脂質に対するrTFの比の双方が、至適な機能
的活性を達成し維持するのに必須である。
天然のリン脂質及び側鎖に変更を伴う又は伴わない合
成のリン脂質と組み合わせて、組換えの又は天然の精製
された組織因子より作られたPT試薬は、PT試薬の質及び
感受性における改良を提供する。
成のリン脂質と組み合わせて、組換えの又は天然の精製
された組織因子より作られたPT試薬は、PT試薬の質及び
感受性における改良を提供する。
合成リン脂質は、一層再現性のある最終製品という利
益を与え、側鎖が変更されるとき、PT試薬の一層良好に
管理された機能的活性という改良を提供する。
益を与え、側鎖が変更されるとき、PT試薬の一層良好に
管理された機能的活性という改良を提供する。
緩衝剤及び安定化剤の選択には広範囲の変化があり、
やはりPT試薬の安定性を補助することができる。最も好
ましい具体例は、約９乃至15mMの濃度範囲のカルシウム
イオン、約０乃至10％の濃度範囲最も好ましくは約２乃
至５％の範囲の濃度の塩化ナトリウム、約０乃至５％の
範囲のデキストラン、及び適当な緩衝剤を含むものであ
ろう。Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−N'−２−
アミノエタンスルホン酸（HEPES）、３−〔Ｎ−トリス
−（ヒドロキシメチル）メチルアミノ〕−２−ヒドロキ
シプロパンスルホン酸（TAPSO）、３−（Ｎ−モルフォ
リノ）プロパンスルホン酸（MOPS）、Ｎ−トリス−（ヒ
ドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸
（TES）、３−〔Ｎ−ビス（ヒドロキシエチル）−アミ
ノ〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（DIPSO）、
ピペラジン−N,N'−ビス（２−ヒドロキシプロパンスル
ホン酸）（POPSO）、Ｎ−ヒドロキシエチルピペラジン
−N'−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（HEPPSO）及
びトリス−（ヒドロキシメチル）アミノメタン（TRIS）
のような緩衝剤が、PT試薬において好ましい。最も好ま
しい緩衝剤は、約20乃至80mMの濃度範囲のHEPES又はTAP
SOである。
やはりPT試薬の安定性を補助することができる。最も好
ましい具体例は、約９乃至15mMの濃度範囲のカルシウム
イオン、約０乃至10％の濃度範囲最も好ましくは約２乃
至５％の範囲の濃度の塩化ナトリウム、約０乃至５％の
範囲のデキストラン、及び適当な緩衝剤を含むものであ
ろう。Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−N'−２−
アミノエタンスルホン酸（HEPES）、３−〔Ｎ−トリス
−（ヒドロキシメチル）メチルアミノ〕−２−ヒドロキ
シプロパンスルホン酸（TAPSO）、３−（Ｎ−モルフォ
リノ）プロパンスルホン酸（MOPS）、Ｎ−トリス−（ヒ
ドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸
（TES）、３−〔Ｎ−ビス（ヒドロキシエチル）−アミ
ノ〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（DIPSO）、
ピペラジン−N,N'−ビス（２−ヒドロキシプロパンスル
ホン酸）（POPSO）、Ｎ−ヒドロキシエチルピペラジン
−N'−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（HEPPSO）及
びトリス−（ヒドロキシメチル）アミノメタン（TRIS）
のような緩衝剤が、PT試薬において好ましい。最も好ま
しい緩衝剤は、約20乃至80mMの濃度範囲のHEPES又はTAP
SOである。
本発明の好ましい具体例においては、原材料である組
換えヒト組織因子は、E.coli中においてin vitroで増殖
され、界面活性剤溶液によって抽出され、次いで、ヒト
組織因子に対して指向性の固定化モノクローナル抗体上
でのアフィニティークロマトグラフィー法を使用して精
製される。Bach,Ronald R.,Initiation of Coagulation
by Tissu Factor,CRC Critical Review in Biochemist
ry 1988;23（４）:pp.339−368. 本発明の方法においては、精製された組織因子は、先
に記述したように、精製された天然の又は特定の合成の
リン脂質の混合物と組み合わされる。この工程は、オク
チルグルコシド又は類似の界面活性剤のような界面活性
剤中の組換え蛋白質を、やはり界面活性剤中にて可溶化
されたリン脂質と混合することによって達成される。該
界面活性剤は、ダイアフィルトレーションを許容するに
十分高い臨界ミセル濃度を有しなければならない。該界
面活性剤は、次いで組織因子を含んだ脂質ミセルを形成
するためのダイアフィルトレーション又は透析工程によ
って除去される。
換えヒト組織因子は、E.coli中においてin vitroで増殖
され、界面活性剤溶液によって抽出され、次いで、ヒト
組織因子に対して指向性の固定化モノクローナル抗体上
でのアフィニティークロマトグラフィー法を使用して精
製される。Bach,Ronald R.,Initiation of Coagulation
by Tissu Factor,CRC Critical Review in Biochemist
ry 1988;23（４）:pp.339−368. 本発明の方法においては、精製された組織因子は、先
に記述したように、精製された天然の又は特定の合成の
リン脂質の混合物と組み合わされる。この工程は、オク
チルグルコシド又は類似の界面活性剤のような界面活性
剤中の組換え蛋白質を、やはり界面活性剤中にて可溶化
されたリン脂質と混合することによって達成される。該
界面活性剤は、ダイアフィルトレーションを許容するに
十分高い臨界ミセル濃度を有しなければならない。該界
面活性剤は、次いで組織因子を含んだ脂質ミセルを形成
するためのダイアフィルトレーション又は透析工程によ
って除去される。
ダイアフィルトレーションは、次のようにして達成さ
れる。すなわち、本発明のリン脂質、例えば約70:30の
比率の天然又は合成のフォスファチジルコリン：フォス
ファチジルセリンが、ダイアフィルトレーションを許容
するに十分高い臨界ミセル濃度を有する界面活性剤中に
おいて攪拌、混合、加熱及び／又は水浴超音波照射され
る。混合物のリン脂質は、約８乃至20mMであり好ましく
は10mMである。界面活性剤の臨界ミセル濃度は、好まし
くは約１×10-4m/Lより大きく、約2.5×10-2m/Lに最も
好ましい濃度を有する。例えば、オクチルグルコシド又
は他の類似の界面活性剤にあっては、好ましい脂質は、
界面活性剤の濃度範囲約11mg/mL乃至220mg/mL、最も好
ましくは約110mg/mLにおいて可溶化される。脂質混合物
は、約0.1乃至10％の範囲の界面活性剤、好ましくは約
１％のオクチルグルコシド又は他の界面活性剤中に溶解
されたrTFと室温にて組み合わされる。本発明の他の界
面活性剤としては、非イオン性グルコピラノシド、ポリ
オキシエチレン及び非変成性の両性イオン界面活性剤が
含まれる。好ましい界面活性剤はオクチルグルコシドで
ある。脂質/rTF混合物は、緩衝剤によって直ちに約1:1
に希釈され、そしてMembrex Benchmark GX Biofiltr
ation System、又は他の接線流システムの容器へポンプ
で汲み入れられ、膜の外部と接触させられる。膜の孔を
通って界面活性剤が流れ出るとき、緩衝剤がポンプで汲
み入れられる。この工程の間サンプルは再循環され、そ
して生物濾過膜は、表面における脂質の堆積を防止して
緩衝剤にフィルターを通過させるため、回転する。代わ
りに、脂質の堆積は、いかなる接線流濾過装置において
も起こるように、フィルターに対して接線方向に材料を
掃引することによって防止されよう。代わりに、膜は、
Membrex Pacesetter VFF Systemにおけるように、静止
している。膜を掃引する渦は、膜の中心を走り下りるロ
ーターの運動によって発生される。代わりに、もしもrT
F及びリン脂質を溶解するために使用される各面活性剤
が、同じ濃度の同じ界面活性剤であるならば、rTF及び
リン脂質は、一緒に加えてよい。
れる。すなわち、本発明のリン脂質、例えば約70:30の
比率の天然又は合成のフォスファチジルコリン：フォス
ファチジルセリンが、ダイアフィルトレーションを許容
するに十分高い臨界ミセル濃度を有する界面活性剤中に
おいて攪拌、混合、加熱及び／又は水浴超音波照射され
る。混合物のリン脂質は、約８乃至20mMであり好ましく
は10mMである。界面活性剤の臨界ミセル濃度は、好まし
くは約１×10-4m/Lより大きく、約2.5×10-2m/Lに最も
好ましい濃度を有する。例えば、オクチルグルコシド又
は他の類似の界面活性剤にあっては、好ましい脂質は、
界面活性剤の濃度範囲約11mg/mL乃至220mg/mL、最も好
ましくは約110mg/mLにおいて可溶化される。脂質混合物
は、約0.1乃至10％の範囲の界面活性剤、好ましくは約
１％のオクチルグルコシド又は他の界面活性剤中に溶解
されたrTFと室温にて組み合わされる。本発明の他の界
面活性剤としては、非イオン性グルコピラノシド、ポリ
オキシエチレン及び非変成性の両性イオン界面活性剤が
含まれる。好ましい界面活性剤はオクチルグルコシドで
ある。脂質/rTF混合物は、緩衝剤によって直ちに約1:1
に希釈され、そしてMembrex Benchmark GX Biofiltr
ation System、又は他の接線流システムの容器へポンプ
で汲み入れられ、膜の外部と接触させられる。膜の孔を
通って界面活性剤が流れ出るとき、緩衝剤がポンプで汲
み入れられる。この工程の間サンプルは再循環され、そ
して生物濾過膜は、表面における脂質の堆積を防止して
緩衝剤にフィルターを通過させるため、回転する。代わ
りに、脂質の堆積は、いかなる接線流濾過装置において
も起こるように、フィルターに対して接線方向に材料を
掃引することによって防止されよう。代わりに、膜は、
Membrex Pacesetter VFF Systemにおけるように、静止
している。膜を掃引する渦は、膜の中心を走り下りるロ
ーターの運動によって発生される。代わりに、もしもrT
F及びリン脂質を溶解するために使用される各面活性剤
が、同じ濃度の同じ界面活性剤であるならば、rTF及び
リン脂質は、一緒に加えてよい。
約20乃至50体積の緩衝剤の後、界面活性剤除去は完全
であり、rTFを含有する脂質ミセルが形成される。界面
活性剤の除去が完全であることを保証するために、正常
の及び異常の対照血漿を使用してPTアッセイが実施され
る。PT時間の延長及び正常に対する異常のPT値の高い比
率は、残存界面活性剤が依然存在することを示す。サン
プルは濃縮され、そして機能的活性につきアッセイされ
る。ダイアフィルトレーション工程は、透析を用いる現
行の工程に比し一層効率的且つ再現性がある。ダイアフ
ィルトレーション工程は、使用されている現行の透析工
程に比して、必要とする体積がずっと少なく、時間の無
駄が少ない。界面活性剤不含蛋白質：リン脂質混合物
は、次いで、緩衝剤及び安定化剤の溶液に添加される。
混合物は均一化を保証するために攪拌され、バイアルに
小分けされ、次いで凍結されて凍結乾燥される。乾燥し
た試薬は、水の添加によりその活性な形態へと再構成さ
れる。
であり、rTFを含有する脂質ミセルが形成される。界面
活性剤の除去が完全であることを保証するために、正常
の及び異常の対照血漿を使用してPTアッセイが実施され
る。PT時間の延長及び正常に対する異常のPT値の高い比
率は、残存界面活性剤が依然存在することを示す。サン
プルは濃縮され、そして機能的活性につきアッセイされ
る。ダイアフィルトレーション工程は、透析を用いる現
行の工程に比し一層効率的且つ再現性がある。ダイアフ
ィルトレーション工程は、使用されている現行の透析工
程に比して、必要とする体積がずっと少なく、時間の無
駄が少ない。界面活性剤不含蛋白質：リン脂質混合物
は、次いで、緩衝剤及び安定化剤の溶液に添加される。
混合物は均一化を保証するために攪拌され、バイアルに
小分けされ、次いで凍結されて凍結乾燥される。乾燥し
た試薬は、水の添加によりその活性な形態へと再構成さ
れる。
PT値は、機械的及び光−光学的機器を含む、通常使用
されているいかなる終点検出方法によっても決定される
ことができる。この組成に基づくPT試薬の高められた透
明性は、光−光学的機器にとって特に有利である。
されているいかなる終点検出方法によっても決定される
ことができる。この組成に基づくPT試薬の高められた透
明性は、光−光学的機器にとって特に有利である。
本発明のPT試薬は、商業的に入手できるPT試薬に対し
て、再構成の前及び後における改善された安定性を示
す。表IIは、商業的に入手できる試薬と比較して、再構
成された切断rTF試薬によって試験された正常対照を用
いてPT値の安定性の改善を示す。
て、再構成の前及び後における改善された安定性を示
す。表IIは、商業的に入手できる試薬と比較して、再構
成された切断rTF試薬によって試験された正常対照を用
いてPT値の安定性の改善を示す。
図１は、この安定性をグラフにより示す。切断された
rTFによって調製された本発明の凍結乾燥されたPT試薬
及び商業的に入手できるPT試薬は、再構成され37℃にて
貯蔵された。種々の時間において、正常の対照を両方の
タイプのPT試薬によって試験した。得られたPT値が、同
じ正常対照について、新たに再構成された両方のタイプ
のPT試薬を用いて得られるPT値と比較された。本発明の
PT試薬は、商業的に入手できるPT試薬に対して、改善さ
れた再構成安定性を示す。
rTFによって調製された本発明の凍結乾燥されたPT試薬
及び商業的に入手できるPT試薬は、再構成され37℃にて
貯蔵された。種々の時間において、正常の対照を両方の
タイプのPT試薬によって試験した。得られたPT値が、同
じ正常対照について、新たに再構成された両方のタイプ
のPT試薬を用いて得られるPT値と比較された。本発明の
PT試薬は、商業的に入手できるPT試薬に対して、改善さ
れた再構成安定性を示す。
図２は、37℃において、切断rTF凍結乾燥PT試薬の再
構成前（乾燥の）安定性の、商業的に入手できる試薬と
比較した場合における改善を実証している。データは、
各タイプのPT試薬の数個の再構成前のバイアルを37℃に
て貯蔵し、示された日に両方のタイプのPT試薬の新たな
バイアルを再構成することによって得られた。両方のタ
イプのPT試薬につき、２乃至８℃にて貯蔵されたバイア
ルが、これら両方のタイプのPT試薬のための対照として
使用された。正常対照はこれらの日に試験され、そし
て、両方のタイプのPT試薬につき、37℃にて貯蔵したバ
イアルを使用して得られたPT値が、各日において２乃至
８℃にて貯蔵されたバイアルについて得られたPT値と比
較された。これら２種の温度にて貯蔵されたバイアル間
のPT値における差が計算され、変化は、試験した日に対
してプロットされた。本発明のPT試薬は、商業的に入手
できるPT試薬に対して改善された再構成前安定性を示
す。
構成前（乾燥の）安定性の、商業的に入手できる試薬と
比較した場合における改善を実証している。データは、
各タイプのPT試薬の数個の再構成前のバイアルを37℃に
て貯蔵し、示された日に両方のタイプのPT試薬の新たな
バイアルを再構成することによって得られた。両方のタ
イプのPT試薬につき、２乃至８℃にて貯蔵されたバイア
ルが、これら両方のタイプのPT試薬のための対照として
使用された。正常対照はこれらの日に試験され、そし
て、両方のタイプのPT試薬につき、37℃にて貯蔵したバ
イアルを使用して得られたPT値が、各日において２乃至
８℃にて貯蔵されたバイアルについて得られたPT値と比
較された。これら２種の温度にて貯蔵されたバイアル間
のPT値における差が計算され、変化は、試験した日に対
してプロットされた。本発明のPT試薬は、商業的に入手
できるPT試薬に対して改善された再構成前安定性を示
す。
実施例 １
完全長組換えヒト組織因子及び天然リン脂質を使用して
作られたPT試薬−rTFの濃度を変化させることの効果 種々の濃度の組換えヒト組織因子が、PS:PC比30:70の
精製牛フォスファチジルセリン（PS）及び精製卵フォス
ファチジルコリン（PC）によって、且つ、モル比1:1000
0のrTF:リン脂質で脂質化された。処方はまた、50mMのT
APSO、11mMのCaCl2、2.6％のグリシン、2.6％のデキス
トラン、pH7.4、を含んだ。結果は凝固時間として与え
られ、MLA Electra 800光−光学的凝固タイマーを用い
て測定された。家兎脳の組織因子に基づく２種の市販の
PT試薬であるトロンボプラスチンＣ＋及びトロンボプラ
スチンISが、比較のため含められている。試験血漿は、
正常凍結乾燥対照、Ci−Trol 1（COL 1）、異常凍結乾
燥対照、Ci−Trol II（COL 2）、新鮮正常血漿のプール
（FNP）、及びワルファリンを投与されている患者から
の血漿の凍結乾燥プール（WARFARIN）である。WAR/FNP
の下の欄は、ワルファリン処理血漿プールのPT値を正常
血漿プールのPT値で除した比である。この比は、試薬の
感受性の尺度である。データ表Ｉを参照のこと。
作られたPT試薬−rTFの濃度を変化させることの効果 種々の濃度の組換えヒト組織因子が、PS:PC比30:70の
精製牛フォスファチジルセリン（PS）及び精製卵フォス
ファチジルコリン（PC）によって、且つ、モル比1:1000
0のrTF:リン脂質で脂質化された。処方はまた、50mMのT
APSO、11mMのCaCl2、2.6％のグリシン、2.6％のデキス
トラン、pH7.4、を含んだ。結果は凝固時間として与え
られ、MLA Electra 800光−光学的凝固タイマーを用い
て測定された。家兎脳の組織因子に基づく２種の市販の
PT試薬であるトロンボプラスチンＣ＋及びトロンボプラ
スチンISが、比較のため含められている。試験血漿は、
正常凍結乾燥対照、Ci−Trol 1（COL 1）、異常凍結乾
燥対照、Ci−Trol II（COL 2）、新鮮正常血漿のプール
（FNP）、及びワルファリンを投与されている患者から
の血漿の凍結乾燥プール（WARFARIN）である。WAR/FNP
の下の欄は、ワルファリン処理血漿プールのPT値を正常
血漿プールのPT値で除した比である。この比は、試薬の
感受性の尺度である。データ表Ｉを参照のこと。
実施例 ２
完全長組換えヒト組織因子及び天然リン脂質を使用して
作られたPT試薬−rTF:リン脂質（凍結乾燥試薬）比を変
化させることの効果 145ng/mL又は200ng/mLの組換えヒト組織因子が、PS:P
C比30:70の精製牛フォスファチジルセリン（PS）及び精
製卵フォスファチジルコリン（PC）の混合物と組み合わ
された。示した実施例においては、rTF:リン脂質1:1000
0及び1:20000という,rTF:リン脂質の２種のモル比が用
いられた。145ng/mLのrTFを有する第１の処方（10S、20
s）はまた、68mMのTAPSO、11mMのCaCl2、140mMのNaCl、
5.2％のグリシン、pH7.4、をも含んだ。該処方は、バイ
アルに小分けされて凍結乾燥された。結果は凝固時間と
して与えられ、MLA Electra 700光−光学的凝固タイマ
ーを用いて測定された。比較として、市販のPT試薬であ
るトロンボプラスチンISを含めた。試験血漿は、正常凍
結乾燥対照、Ci−Trol 1（COL 1）、異常凍結乾燥対
照、Ci−Trol II（COL 2）、新鮮正常血漿のプール（FN
P）、及びワルファリン投与を受けている患者の血漿の
凍結乾燥プール（WARFARIN）である。WAR/FNPの下の欄
は、ワルファリン処理血漿プールのPT値を正常血漿プー
ルのPT値で除した比である。この比は、試薬の感受性の
尺度である。データ表２を参照のこと。
作られたPT試薬−rTF:リン脂質（凍結乾燥試薬）比を変
化させることの効果 145ng/mL又は200ng/mLの組換えヒト組織因子が、PS:P
C比30:70の精製牛フォスファチジルセリン（PS）及び精
製卵フォスファチジルコリン（PC）の混合物と組み合わ
された。示した実施例においては、rTF:リン脂質1:1000
0及び1:20000という,rTF:リン脂質の２種のモル比が用
いられた。145ng/mLのrTFを有する第１の処方（10S、20
s）はまた、68mMのTAPSO、11mMのCaCl2、140mMのNaCl、
5.2％のグリシン、pH7.4、をも含んだ。該処方は、バイ
アルに小分けされて凍結乾燥された。結果は凝固時間と
して与えられ、MLA Electra 700光−光学的凝固タイマ
ーを用いて測定された。比較として、市販のPT試薬であ
るトロンボプラスチンISを含めた。試験血漿は、正常凍
結乾燥対照、Ci−Trol 1（COL 1）、異常凍結乾燥対
照、Ci−Trol II（COL 2）、新鮮正常血漿のプール（FN
P）、及びワルファリン投与を受けている患者の血漿の
凍結乾燥プール（WARFARIN）である。WAR/FNPの下の欄
は、ワルファリン処理血漿プールのPT値を正常血漿プー
ルのPT値で除した比である。この比は、試薬の感受性の
尺度である。データ表２を参照のこと。
実施例３
完全長組換えヒト組織因子及び合成リン脂質を使用して
作られたPT試薬−リン脂質の脂肪酸側鎖部分の性質を変
えることの効果 100又は300ng/mLの精製組換えヒト組織因子が、PS:PC
比30:70の合成フォスファチジルセリン（PS）及び合成
フォスファチジルコリン（PC）の混合物と、且つ、TF:
リン脂質の比1:10000にて組み合わされた。処方はま
た、50mMのTAPSO、11mMのCaCl2、100mMのNaCl、pH7.4、
も含んだ。結果は凝固時間として与えられ、MLA Electr
a 800光−光学的凝固タイマーを用いて測定された。天
然リン脂質（牛PS及び卵PC）によって脂質化された組換
え組織因子が対照として使用された。試験血漿は、正常
凍結乾燥対照、CiTrol 1（COL 1）、異常凍結乾燥対
照、CiTro II（COL 2）、及びワルファリンの投与を受
けている患者からの血漿の凍結乾燥プール（WARFARIN）
である。RATの下の欄は、ワルファリン処理血漿プール
のPT値をCOL 1のPT値で除した比である。この比は、試
薬の感受性の尺度である。データ表３を参照のこと。
作られたPT試薬−リン脂質の脂肪酸側鎖部分の性質を変
えることの効果 100又は300ng/mLの精製組換えヒト組織因子が、PS:PC
比30:70の合成フォスファチジルセリン（PS）及び合成
フォスファチジルコリン（PC）の混合物と、且つ、TF:
リン脂質の比1:10000にて組み合わされた。処方はま
た、50mMのTAPSO、11mMのCaCl2、100mMのNaCl、pH7.4、
も含んだ。結果は凝固時間として与えられ、MLA Electr
a 800光−光学的凝固タイマーを用いて測定された。天
然リン脂質（牛PS及び卵PC）によって脂質化された組換
え組織因子が対照として使用された。試験血漿は、正常
凍結乾燥対照、CiTrol 1（COL 1）、異常凍結乾燥対
照、CiTro II（COL 2）、及びワルファリンの投与を受
けている患者からの血漿の凍結乾燥プール（WARFARIN）
である。RATの下の欄は、ワルファリン処理血漿プール
のPT値をCOL 1のPT値で除した比である。この比は、試
薬の感受性の尺度である。データ表３を参照のこと。
実施例 ４
完全長組換えヒト組織因子及び合成リン脂質を用いて作
られたPT試薬−脂質凍結乾燥試薬の脂肪酸側鎖部分の性
質を変えることの効果 300ng/mLの精製組換えヒト組織因子が、PS:PC比30:70
の合成フォスファチジルセリン（PS）及び合成フォスフ
ァチジルコリン（PC）の混合物と、且つ、rTF:リン脂質
比1:10000で組み合わされた。処方はまた、30mMのTAPS
O、11mMのCaCl2、215mMのNaCl、３％のグリシン、pH7.
4、をも含んだ。混合物は、バイアルに小分けされて凍
結乾燥された。結果は凝固時間として与えられ、MLA El
ectra 800光−光学的凝固タイマーを使用して測定され
た。試験血漿は、正常凍結乾燥対照、Ci−Trol 1（COL
1）、異常凍結乾燥対照、Ci−Trol II（COL 2）、新鮮
正常血漿のプール（FNP）、及びワルファリンを投与さ
れている患者からの血漿の凍結乾燥プール（WARFARIN）
である。RATの下の欄は、ワルファリン処理血漿プール
のPT値を正常血漿プールのPT値で除した比である。この
比は、試薬の感受性の尺度である。２種の対照が試験に
含められた。天然リン脂質である牛PS及び卵PCによって
脂質化したものである10F対照は、実施例２において与
えられた10F処方であった。他の対照であるトロンボプ
ラスチンISは、商業的に入手できる高感度の家兎脳に基
づくトロンボプラスチン試薬、トロンボプラスチンISで
ある。データ表４を参照のこと。
られたPT試薬−脂質凍結乾燥試薬の脂肪酸側鎖部分の性
質を変えることの効果 300ng/mLの精製組換えヒト組織因子が、PS:PC比30:70
の合成フォスファチジルセリン（PS）及び合成フォスフ
ァチジルコリン（PC）の混合物と、且つ、rTF:リン脂質
比1:10000で組み合わされた。処方はまた、30mMのTAPS
O、11mMのCaCl2、215mMのNaCl、３％のグリシン、pH7.
4、をも含んだ。混合物は、バイアルに小分けされて凍
結乾燥された。結果は凝固時間として与えられ、MLA El
ectra 800光−光学的凝固タイマーを使用して測定され
た。試験血漿は、正常凍結乾燥対照、Ci−Trol 1（COL
1）、異常凍結乾燥対照、Ci−Trol II（COL 2）、新鮮
正常血漿のプール（FNP）、及びワルファリンを投与さ
れている患者からの血漿の凍結乾燥プール（WARFARIN）
である。RATの下の欄は、ワルファリン処理血漿プール
のPT値を正常血漿プールのPT値で除した比である。この
比は、試薬の感受性の尺度である。２種の対照が試験に
含められた。天然リン脂質である牛PS及び卵PCによって
脂質化したものである10F対照は、実施例２において与
えられた10F処方であった。他の対照であるトロンボプ
ラスチンISは、商業的に入手できる高感度の家兎脳に基
づくトロンボプラスチン試薬、トロンボプラスチンISで
ある。データ表４を参照のこと。
実施例５
切断組換えヒト組織因子及び合成リン脂質を用いて作ら
れたPT試薬−リン脂質凍結乾燥試薬の脂肪酸側鎖部分の
性質を変化させることの効果 243個の残基を含み且つ分子の細胞質部分の殆どを失
った精製組換えヒト組織因子が、PS:PC比30:70の合成フ
ォスファチジルセリン（PS）及び合成フォスファチジル
コリン（PC）の混合物と、且つrTF:リン脂質比1:10000
にて組み合わされた。処方は、300ng/mLのrTF、30mMのT
APSO、11mMのCaCl2、215MのNaCl、３％のグリシン、pH
7.4、を含んだ。混合物は、バイアルに小分けされて凍
結乾燥された。結果は凝固時間として与えられ、MLA El
ectra 800光−光学的凝固タイマーを使用して測定され
た。試験血漿は、正常凍結乾燥対照、Ci−Trol 1（COL
1）、異常凍結乾燥対照、Ci−Trol II（COL 2）、新鮮
正常血漿のプール（FNP）及びワルファリン投与を受け
ている患者からの血漿の凍結乾燥プール（WARFARIN）で
ある。RATの下の欄は、ワルファリン処理血漿プールのP
T値を正常血漿プールのPT値で除した比である。この比
は、試薬の感受性の尺度である。３つの対照を、試験に
含めた。１つは先の実施例における完全長rTF、第２は
天然リン脂質（牛PS及び卵PC）によって脂質化した切断
rTF、そして第３は、商業的に入手できる高感度の家兎
脳に基づくトロンボプラスチン試薬であるトロンボプラ
スチンISである。データ表５を参照のこと。
れたPT試薬−リン脂質凍結乾燥試薬の脂肪酸側鎖部分の
性質を変化させることの効果 243個の残基を含み且つ分子の細胞質部分の殆どを失
った精製組換えヒト組織因子が、PS:PC比30:70の合成フ
ォスファチジルセリン（PS）及び合成フォスファチジル
コリン（PC）の混合物と、且つrTF:リン脂質比1:10000
にて組み合わされた。処方は、300ng/mLのrTF、30mMのT
APSO、11mMのCaCl2、215MのNaCl、３％のグリシン、pH
7.4、を含んだ。混合物は、バイアルに小分けされて凍
結乾燥された。結果は凝固時間として与えられ、MLA El
ectra 800光−光学的凝固タイマーを使用して測定され
た。試験血漿は、正常凍結乾燥対照、Ci−Trol 1（COL
1）、異常凍結乾燥対照、Ci−Trol II（COL 2）、新鮮
正常血漿のプール（FNP）及びワルファリン投与を受け
ている患者からの血漿の凍結乾燥プール（WARFARIN）で
ある。RATの下の欄は、ワルファリン処理血漿プールのP
T値を正常血漿プールのPT値で除した比である。この比
は、試薬の感受性の尺度である。３つの対照を、試験に
含めた。１つは先の実施例における完全長rTF、第２は
天然リン脂質（牛PS及び卵PC）によって脂質化した切断
rTF、そして第３は、商業的に入手できる高感度の家兎
脳に基づくトロンボプラスチン試薬であるトロンボプラ
スチンISである。データ表５を参照のこと。
実施例６
切断組換えヒト組織因子及び合成リン脂質を使用して作
られたPT試薬−rTFの濃度及び試薬の組成を変化させる
ことの効果 243個の残基を含み且つ分子の細胞質部分の大部分を
失った精製組換えヒト組織因子が、合成リン脂質の30:7
0混合物と、rTF:リン脂質比1:10000にて組み合わされ
た。処方Ａは、合成１−パルミトイル−２−オレオイル
フォスファチジルセリン（POPS）及びジオレオイルフォ
スファチジルコリン（DOPC）、60mMのHEPES、11mMのCaC
l2、200mMのNaCl、4.6％のグリシン、5mg/mLのポリブレ
ン（polybrene）、pH7.4、を含む。処方Ｂは、同じPOPS
及びDOPC濃度、60mMのHEPES、11mMのCaCl2、215mMのNaC
l、4.6％のグリシン、5mg/Lのポリブレン、pH7.4、を含
む。処方Ｃは、ジオレオイルフォスファチジルセリン
（DOPS）及びDOPC、40mMのTAPSO、11mMのCaCl2、220mM
のNaCl、2.1％のグリシン、pH7.4、を含む。混合物は、
バイアルに小分けされて凍結乾燥された。結果は凝固時
間として与えられ、MLA Electra 800光−光学的凝固タ
イマーを使用して測定された。試験血漿は、正常凍結乾
燥対照、Ci−Trol 1（COL1）、異常凍結乾燥対照、Ci−
Trol II（COL 2）、新鮮正常血漿のプール（FNP）及び
ワルファリン投与を受けている患者からの血漿の凍結乾
燥プール（WARFARIN）である。RATIOの下の欄は、ワル
ファリン処理血漿プールのPT値を正常血漿プールのPT値
で除した比である。この比は、試薬の感受性の尺度であ
る。商業的に入手できる高感度の家兎脳に基づくトロン
ボプラスチン試薬であるトロンボプラスチンISが対照と
して含まれている。データ表６を参照のこと。
られたPT試薬−rTFの濃度及び試薬の組成を変化させる
ことの効果 243個の残基を含み且つ分子の細胞質部分の大部分を
失った精製組換えヒト組織因子が、合成リン脂質の30:7
0混合物と、rTF:リン脂質比1:10000にて組み合わされ
た。処方Ａは、合成１−パルミトイル−２−オレオイル
フォスファチジルセリン（POPS）及びジオレオイルフォ
スファチジルコリン（DOPC）、60mMのHEPES、11mMのCaC
l2、200mMのNaCl、4.6％のグリシン、5mg/mLのポリブレ
ン（polybrene）、pH7.4、を含む。処方Ｂは、同じPOPS
及びDOPC濃度、60mMのHEPES、11mMのCaCl2、215mMのNaC
l、4.6％のグリシン、5mg/Lのポリブレン、pH7.4、を含
む。処方Ｃは、ジオレオイルフォスファチジルセリン
（DOPS）及びDOPC、40mMのTAPSO、11mMのCaCl2、220mM
のNaCl、2.1％のグリシン、pH7.4、を含む。混合物は、
バイアルに小分けされて凍結乾燥された。結果は凝固時
間として与えられ、MLA Electra 800光−光学的凝固タ
イマーを使用して測定された。試験血漿は、正常凍結乾
燥対照、Ci−Trol 1（COL1）、異常凍結乾燥対照、Ci−
Trol II（COL 2）、新鮮正常血漿のプール（FNP）及び
ワルファリン投与を受けている患者からの血漿の凍結乾
燥プール（WARFARIN）である。RATIOの下の欄は、ワル
ファリン処理血漿プールのPT値を正常血漿プールのPT値
で除した比である。この比は、試薬の感受性の尺度であ
る。商業的に入手できる高感度の家兎脳に基づくトロン
ボプラスチン試薬であるトロンボプラスチンISが対照と
して含まれている。データ表６を参照のこと。
実施例７
切断組換えヒト組織因子及び合成リン脂質を使用して作
られたPT試薬−POPS:DOPC比及び試薬組成を変化させる
ことの効果 243個の残基を含み且つ分子の細胞質部分の大部分が
失われた精製組換えヒト組織因子が、合成の１−パルミ
トイル−２−オレオイルフォスファチジルセリン（POP
S）及びジオレオキシフォスファチジルコリン（DOPC）
の種々の混合物と、rTF:リン脂質比1:10000にて組み合
わされた。処方Ａは、種々の比率のPOPS:DOPCと220ng/m
LのrTF、60mMのHEPES、11mMのCaCl2、215mMのNaCl、4.6
％のグリシン、5mg/Lのポリブレン、pH7.4、を含んだ。
処方Ｂは、30:70のPOPS:DOPCと240ng/mLのrTF、60mMのH
EPES、11mMのCaCl2、215mMのNaCl、4.6％のグリシン、p
H7.4、を含んだ。処方Ｃは、30:70のPOPS:DOPCと165ng/
mLのrTF、40mMのTAPSO、11mMのCaCl2、220mMのNaCl、2.
1％のグリシン、pH7.4、を含んだ。混合物は、バイアル
に小分けされて凍結乾燥された。結果は凝固時間として
与えられ、MLA Electra 800光−光学的凝固タイマーを
使用して測定した。試験血漿は、正常凍結乾燥対照、Ci
−Trol 1（COL1）、異常凍結乾燥対照、Ci−Trol II（C
OL 2）、新鮮正常血漿のプール（FNP）及びワルファリ
ン投与を受けている患者からの血漿の凍結乾燥プール
（WARFARIN）である。RATIOの下の欄は、ワルファリン
処理血漿プールのPT値を正常血漿プールのPT値で除した
比である。この比は、試薬の感受性の尺度である。商業
的に入手できる高感度の家兎脳に基づくトロンボプラス
チン試薬であるトロンボプラスチンISが対照として含ま
れている。データ表７を参照のこと。
られたPT試薬−POPS:DOPC比及び試薬組成を変化させる
ことの効果 243個の残基を含み且つ分子の細胞質部分の大部分が
失われた精製組換えヒト組織因子が、合成の１−パルミ
トイル−２−オレオイルフォスファチジルセリン（POP
S）及びジオレオキシフォスファチジルコリン（DOPC）
の種々の混合物と、rTF:リン脂質比1:10000にて組み合
わされた。処方Ａは、種々の比率のPOPS:DOPCと220ng/m
LのrTF、60mMのHEPES、11mMのCaCl2、215mMのNaCl、4.6
％のグリシン、5mg/Lのポリブレン、pH7.4、を含んだ。
処方Ｂは、30:70のPOPS:DOPCと240ng/mLのrTF、60mMのH
EPES、11mMのCaCl2、215mMのNaCl、4.6％のグリシン、p
H7.4、を含んだ。処方Ｃは、30:70のPOPS:DOPCと165ng/
mLのrTF、40mMのTAPSO、11mMのCaCl2、220mMのNaCl、2.
1％のグリシン、pH7.4、を含んだ。混合物は、バイアル
に小分けされて凍結乾燥された。結果は凝固時間として
与えられ、MLA Electra 800光−光学的凝固タイマーを
使用して測定した。試験血漿は、正常凍結乾燥対照、Ci
−Trol 1（COL1）、異常凍結乾燥対照、Ci−Trol II（C
OL 2）、新鮮正常血漿のプール（FNP）及びワルファリ
ン投与を受けている患者からの血漿の凍結乾燥プール
（WARFARIN）である。RATIOの下の欄は、ワルファリン
処理血漿プールのPT値を正常血漿プールのPT値で除した
比である。この比は、試薬の感受性の尺度である。商業
的に入手できる高感度の家兎脳に基づくトロンボプラス
チン試薬であるトロンボプラスチンISが対照として含ま
れている。データ表７を参照のこと。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 テジドール，リリアーナ
アメリカ合衆国33185フロリダ、マイア
ミ、サウスウエスト・ワンハンドレッド
アンドフォーティエイトス・アベニュー
コート 4349
(72)発明者 メイナード，ジェイムス
アメリカ合衆国28269ノースカロライナ、
シャーロット、ハイグレンドライブ
3104 エル
(72)発明者 ジョンソン，ケビン，ビー
アメリカ合衆国33173フロリダ、マイア
ミ、サウスウエスト116コート 6601、
ナンバー108
(56)参考文献 Ｒｏｎａｌｄ Ｂａｃｈ ｅｔ．ａ
ｌ”Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩ Ｂｉｎｄｉ
ｎｇ ｔｏ Ｔｉｓｓｕｅ Ｆ
Ｌｉｓａ Ｒ．Ｐａｂｏｒｓｋｙ ｅ
ｔ．ａｌ”Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
Ｄｏｎｏｇｈ Ｐ．Ｏ’Ｂｒｉｅｎ
ｅｔ．ａｌ”Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ−
Ｂｙｐａｓｓｉｎｇ Ａｃｔｉ
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
G01N 33/86
C12Q 1/56
ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (5)
- 【請求項１】（ａ）ヒト組織因子のアミノ酸配列を実質
的に有する組換え蛋白質と、 （ｂ）前記蛋白質を活性化するのに十分な量の合成リン
脂質の混合物であって、リン脂質の少なくとも一つは不
飽和脂肪酸鎖を有し、そして不飽和脂肪酸鎖はC14、C16
又はC18炭素鎖長を有する合成リン脂質の混合物と、 （ｃ）緩衝剤組成物と、 （ｄ）前記組換え蛋白質を活性化するのに十分な量のカ
ルシウムイオンを含んでいるプロトロンビン時間試薬。 - 【請求項２】（ａ）ヒト組織因子のアミノ酸配列を実質
的に有する組換え蛋白質と、 （ｂ）前記蛋白質を活性化するのに十分な量の合成リン
脂質の混合物であって、合成フォスファチジルセリンと
合成フォスファチジルコリンを25:75ないし35:65の比で
含んでいる合成リン脂質混合物と、 （ｃ）緩衝剤組成物と、 （ｄ）前記組換え蛋白質を活性化するのに十分な量のカ
ルシウムイオンを含んでいるプロトロンビン時間試薬。 - 【請求項３】前記混合物は、合成フォスファチジルセリ
ンとフォスファチジルコリンを70:30の比で含んでいる
請求項２のプロトロンビン時間試薬。 - 【請求項４】前記組換え蛋白質は、組織因子のアミノ酸
243又はその付近で切断された蛋白質である請求項１な
いし３のいずれかのプロトロンビン時間試薬。 - 【請求項５】請求項１ないし４のいずれかのプロトロン
ビン時間試薬を調製する方法であって、 （ａ）前記リン脂質混合物を界面活性剤中に可溶化し、 （ｂ）可溶化したリン脂質混合物へ前記組換え蛋白質を
合併し、 （ｃ）合併したリン脂質混合物および組換え蛋白質から
界面活性剤を除去するため合併したリン脂質混合物およ
び組換え蛋白質をダイアフィルトレーションにかけ、 （ｄ）界面活性剤を含まない、合併したリン脂質混合物
および組換え蛋白質を、緩衝剤およびカルシウムを含ん
でいる溶液へ加えることを含むプロトロンビン時間試薬
の調製方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US77129491A | 1991-10-04 | 1991-10-04 | |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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