DE69131204T3

DE69131204T3 - Prothrombinzeitreagenz basierend auf gewebefaktor

Info

Publication number: DE69131204T3
Application number: DE69131204T
Authority: DE
Inventors: Scott Martin San Diego BROWN
Original assignee: Corvas International Inc
Current assignee: Dendreon Pharmaceuticals LLC
Priority date: 1990-11-13
Filing date: 1991-11-04
Publication date: 2007-05-24
Anticipated expiration: 2011-11-05
Also published as: DE69131204T2; GR3030906T3; MX9102042A; FI109764B; NO314617B1; DK0564495T3; DK0564495T4; US5314695A; ES2133310T5; ES2133310T3; EP0564495A4; JP3441456B2; AU4448996A; EP0564495A1; IE913955A1; WO1992008479A1; PT99499A; NZ240577A; PT99499B; DE69131204D1

Description

Hintergrund der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Prothrombinzeit-(PT)-Reagenz, welches einen gereinigten, rekonstituierten natürlichen oder rekombinanten humanen Gewebefaktor (rTF) verwendet. Genauer gesagt, betrifft die Erfindung die Rekonstitution von einem Gewebefaktor zu Phospholipidvesikeln oder -micellen, um ein Gewebefaktorbasiertes PT-Reagenz herzustellen. Ein solches Reagenz erlaubt die spezifische Überwachung einer oraler antikoagulanten Therapie und der Defizienten beim extrinsischen Koagulationsweg.
Beschreibung von verwandtem Fachgebiet und Einführung in die Erfindung
Im Allgemeinen sind Liposomen eine generelle Vesikelkategorie, welche eine oder mehrere Lipiddoppelschichten, die einen wässrigen Raum umschließen, umfassen. Innerhalb dieser Kategorie sind unilamellare Vesikel aus einer einzelnen Membran oder einer Lipiddoppelschicht zusammengesetzt und multilamellare Vesikel aus vielen konzentrischen Membranen (oder Lipiddoppelschichten) zusammengesetzt. Liposomen werden üblicherweise aus Phospholipiden hergestellt. Szoka, F. und Papahadjopoulos, D., Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9: 467 – 508 (1980). Micellen sind von Liposomen verschieden. Micellen bilden sich, wenn Moleküle, die sowohl hydrophobe als auch hydrophile Eigenschaften besitzen, wie Detergenzien, in wässrige Medien gebracht werden. Die hydrophoben Teile der Moleküle aggregieren, um die wässrigen Medien zu meiden. In ihrer einfachsten Beschaffenheit können Micellen kugelförmig sein; sie können jedoch Aggregate (Doppelschichten) verschiedener Formen und Größen bilden. Micellen unterscheiden sich von Liposomen darin, dass sie eher ein hydrophobes Inneres als ein wässriges Inneres aufweisen. Zum Beispiel weisen die hydrophilen Köpfe der Detergenzmoleküle, umfassend die Mizellen, nach außen zum Wasser, während die hydrophoben Schwänze sich mit anderen ähnlichen hydrophoben Strukturen zu einer Gruppe vereinigen. Davis, B. D. und Dulbecco, R. „Sterilization and Disinfection." Microbiology, 3. Ausgabe, S. 1270, Harper & Row (Davis, B. D., et al., 1980); Mahler, H.
R. und Cordes, E. H., Biological Chemistry, zweite Ausgabe, Harper & Row Publishers, Seiten 712 – 714 (1971).
Liposomen sind als Arzneimittelzuführsystem eingesetzt worden. Dieser Ansatz macht sich die Tatsache zu Nutze, dass Liposomen eine relativ undurchlässige Lipid-Doppelschicht besitzen, welche einen wässrigen Innenraum umschließen kann, und dadurch ein Verfahren zur vollständigen Einkapselung verschiedener Arzneimittel innerhalb dieses inneren Raums zur Verfügung stellt. Szoka, oben, auf S. 468. Ein wichtiger Aspekt eines Zuführsystems dieses Typs würde sein, dass der wirksame Arzneimittel-Inhaltsstoff für das wässrige Medium außerhalb des Liposoms nicht verfügbar wäre, bis es sein Ziel erreicht hätte. Janoff et al., US-Patent, Serien-Nr. 4 880 635 (1989).
Das US-Patent Nr. 4 857 319 beschreibt Verfahren zum Konservieren von Liposomen unter Verwendung eines Disaccharid-Konservierungsreagenzes, so dass die eingekapselten Inhalte nach der Rehydratation erhalten bleiben.
Es ist beobachtet worden, dass die Gewebe von Vertebraten, wenn man sie zu mit Citrat versetztem (citrated) Plasma hinzu gibt und rekalzifiziert, die Gerinnungszeit tief greifend beschleunigen werden. Diese Gewebekomponente, von der beobachtet wurde, dass sie die Koagulationsprotease-Kaskaden aktiviert, wird im allgemeinen als Thromboplastin oder Gewebefaktor (TF) bezeichnet.
1935 wurde erstmals die Verwendung von Thromboplastin (ein prokoagulanter Gewebefaktor) in einem einstufigen PT-Test beschrieben (Quick, J. Biol. Chem., 109: 73 – 74, 1935). Dieser Test verwendete Thromboplastin, das von Säugergewebe stammte, und eine Standardkurve, die mit Verdünnungen von vereinigtem normalem humanem Plasma erstellt wurde. Die moderne Version dieses Tests ist einfach durchzuführen und kann automatisiert werden.
Der Prothrombinzeit-(PT)-Test ist das im Koagulationslabor am häufigsten durchgeführte Assay. Varianten dieses Tests weisen eine Anzahl von Anwendungen auf (White, et al., Hemostasis and Thrombosis, Basic Principles and Clinical Practice, Coleman et al., Hrsg., J. B. Lippencott Co., Philadelphia, Seiten 1048 – 1060, 1987). Eine Anwendung ist die Bestimmung von Defizienzen beim extrinsischen Koagulationsweg (Faktoren VII, X, V und Prothrombin). Eine zweite Anwendung ist die Überwachung von Patienten, die sich einer oralen antikoagulanten Langzeittherapie gegen Beschwerden, wie periodisch auftretende venöse Thrombose und Krebs, unterziehen (Hirsh, J., Seminars in Thrombosis and Hemostasis, 12: 1 – 11, 1986). Eine dritte Anwendung ist die Beurteilung einer Leber-Dysfunktion.
Der therapeutische Bereich der antikoagulanten Therapie basiert auf der Vermeidung von Blutung und thrombolischen Komplikationen. Wenn man die orale antikoagulante Therapie ebenso wie bei einer Vielzahl anderer Bedingungen durch den PT-Test überwacht, ist eine Verlängerung der Prothrombinzeit um einen Faktor von 2 für eine Langzeit-Therapie am wünschenswertesten (O'Reilly, Hemostasis and Thrombosis, Basic Principles and Clinical Practice, Coleman et al., Hrsg., J. B. Lippencott Co., Philadelphia, Seiten 1367 – 1372, 1987). Dieser Verlängerungsfaktor ist als das Prothrombinverhältnis (PR) definiert und wird berechnet, indem man die PT eines Patientenplasmas durch die PT einer Vereinigung von Plasmen normaler Individuen teilt. Ein höheres PR zeigt ein empfindlicheres PT-Reagenz an. Der Nutzen eines empfindlicheren Reagenzes für die Überwachung einer Antikoagulations-Therapie liegt in der Anwendung niedrigerer Dosen von antikoagulantem Arzneimittel. Diese niedrigeren Dosen bieten immer noch einen adäquaten Schutz gegen eine thromboembolische Erkrankung, während sie Blutungs-Komplikationen minimieren.
Das US-Patent Nr. 3 179 567 beschreibt ein Reagenz, das nützlich ist, um gleichzeitig, in einem einzigen Test, die Blutkoagulation sowohl durch die intrinsischen als auch die extrinsischen Raten zu messen. Das Reagenz schließt als ein schwaches Thromboplastin-Gewebeextrakte, die nicht wesentlich gereinigt sind, zusammen mit Cephalin ein.
Wingaards et al., Biochem. Biophys Acta 488, 161 – 171 (1977) beschreiben bestimmte Studien, betreffend die Thromboplastin-Aktivität, gemessen nach der Rekombination einer inaktiven Proteinfraktion von Thromboplastin mit entweder einem reinen Phospholipid oder binären Kombinationen reiner Phospholipide.
Mehrere Reagenzien zur Bestimmung von PTs sind kommerziell erhältlich. Diese schließen Thromborel S (Curtis Matheson Scientific, Inc., Yorba Linda CA) und Simplastin (Organon Teknika Corp., Charlotte, NC) ein. Diese Reagenzien ergeben sehr unterschiedliche PTs für das gleiche Patientenplasma, wobei Thromborel S eine längere Zeit als Simplastin aufweist. Niedrigere Dosen des antikoagulanten Arzneimittels sind daher notwendig, um verlängerte PT-Zeiten (hohes PR) beizubehalten, wenn die PTs unter Verwendung von Thromborel S anstelle von Simplastin überwacht werden. Es existiert die Notwendigkeit für ein noch sensitiveres auf einem Gewebefaktor basierendes PT-Reagenz, um die antikoagulante Therapie und andere Bedingungen zu überwa chen. Die vorliegende Erfindung stellt gerade solch ein sensitives Reagenz mit seinem höchst wünschenswerten PR zu Verfügung.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Gewebefaktor-Reagenzien, welche Liposomzusammensetzungen umfassen, die einen mit der Lipiddoppelschicht assoziierten Gewebefaktor aufweisen, wobei die Lipiddoppelschicht eine Mischung von Phospholipiden umfasst, und Verfahren für die Herstellung solcher Zusammensetzungen, wie in den Ansprüchen definiert. Das bereitgestellte Verhältnis der Lipiddoppelschicht der Phospholipide in den Liposomen gewährleistet eine maximale Koagulanzaktivität des resultierenden Gewebefaktorreagenzes und daher eine vorteilhafte Sensitivität des Reagenzes gegenüber den extrinsischen Koagulationsfaktoren, die bewertet werden.
Neben anderen Faktoren basiert die vorliegende Erfindung auf den überraschenden Ergebnissen, dass herausgefunden wurde, dass das Gewebefaktorreagenz dieser Erfindung, das Liposome mit einem Gewebefaktor, der mit ihrer Lipiddoppelschicht assoziiert ist, umfasst, ein aktiver prokoakulanter Komplex ist, ein Komplex, der zu einer effizienten Umwandlung des Proenzyms, Faktor VII, zur aktiven Koagulations-Protease, Faktor VIIa, in der Lage ist. Dieses Ergebnis war überraschend, da weder der Gewebefaktor allein in Lösung noch die Phospholipidmischung, welche die Doppelschicht der Liposome bildet, alleine ein aktives Prothrombinzeitreagenz ist. Ich habe ebenfalls herausgefunden, dass Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, die ferner Glycin umfassen, eine wesentlich verbesserte Leistungsfähigkeit in PT-Assays aufweisen, indem sie die Prothrombinzeiten für normales menschliches Plasma zu jenen von kommerziellen Kontrollen äquivalent macht, die dafür gedacht sind, menschliches Plasma nachzuahmen.
Daher, gemäß einem bevorzugten Aspekt, ist die vorliegende Erfindung auf Gewebefaktorreagenzien gerichtet, welche für die Bestimmung von Prothrombinzeiten nützliche Liposomzusammensetzungen umfassen, wobei die Liposomzusammensetzungen einen mit der Lipiddoppelschicht der Liposome (oder Phospholipidvesikel) assoziierten Gewebefaktor umfassen, vorzugsweise in einem Puffer, der sowohl ein Kryokonservierungsmittel als auch Glycin enthält. In einem weiteren Aspekt ist sie auf ein Verfahren zur Herstellung dieser Zusammensetzungen gerichtet.
In einem bevorzugten Aspekt der Erfindung verwendet das Verfahren zur Herstellung der Liposome ein Detergenz mit einer relativ hohen kritischen Micellkonzentration, um die hoch gereinigten Phospholipide zu solubilisieren. Ein besonders bevorzug tes Detergenz ist das zwitterionische Detergenz, 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethyl-ammonio]-1-propansulfonat (CHAPS). Der Gewebefaktor, der ebenfalls in Detergenz solubilisiert ist, wird mit einem Trägerprotein hinzugesetzt, und das Detergenz wird dann entfernt. Das Detergenz kann konventionell durch herkömmliche Techniken entfernt werden, wie durch Dialyse, durch eine Harzbehandlung oder durch Verdünnung zu einer detergenzfreien Lösung. Liposome, die einen damit assoziierten und in ihre Lipiddoppelschicht eingefügten Gewebefaktor aufweisen, bilden sich spontan, wenn die Detergenzkonzentration der umgebenden Lösung verringert wird.
Definitionen
„BHT" bezeichnet butyriertes Hydroxytoluol.
„CHAPS" bezeichnet 3-[(3-Cholamidopropyl)-dimethyl-ammonio]-1-propansulfonat.
„MOPS" bezeichnet 3-(N-Morpholino)-propansulfonsäure.
„OTG" bezeichnet Octyl-beta-D-thioglucopyranosid.
Ein „Phospholipid" bezeichnet ein organisches Molekül, das entweder von Glycerin (am häufigsten) oder Sphingosin abgeleitet ist. Phospholipide, die von Glycerin (oder Phosphoglyceriden) abgeleitet sind, umfassen ein Glycerin-Grundgerüst, zwei Fettsäureketten, die mit dem ersten und zweiten der Kohlenstoffe des Glycerins verestert sind, und eine Phosphorsäure, die mit dem dritten Kohlenstoff verestert ist.
Wahlweise ist ein Alkoholrest mit der Phosphorsäure verestert.
„PC" bezeichnet Phosphatidylcholin, ein ungeladenes Phosphoglycerid mit einem von Cholin abgeleiteten Alkoholrest, der mit der Phosphorsäure verestert ist.
„PE" bezeichnet Phosphatidylethanolamin, ein positiv geladenes Phosphoglycerid mit einem von Ethanolamin abgeleiteten Alkoholrest, der mit der Phosphorsäure verestert ist.
„PG" bezeichnet Phosphatidylglycerin, ein negativ geladenes Phosphoglycerid mit einem von Glycerin abgeleiteten Alkoholrest, der mit der Phosphorsäure verestert ist.
„PS" bezeichnet Phosphatidylserin, ein negativ geladenes Phosphoglycerid mit einem von Serin abgeleiteten Alkoholrest, der mit der Phosphorsäure verestert ist.
Die „Prothrombinzeit" wird als PT abgekürzt und bezeichnet das Zeitintervall zwischen dem Hinzufügen eines Thromboplastins oder Prothrombinzeitreagenzes und dem Auftreten eines Gerinnsels in an Blutplättchen armen Citrat-Plasma.
Das „Prothrombinverhältnis" wird als PR abgekürzt und bezeichnet die Prothrombinzeit des Plasmas einer einzelnen Person (entweder normal oder abnormal) dividiert durch die Prothrombinzeit einer Vereinigung von Plasmen normaler Individuen.
„rTF" bezeichnet einen rekombinanten Gewebefaktor.
„TBS" bezeichnet 20 mM Tris (pH 7,5), das 150 mM Natriumchlorid enthält.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt die Prothrombinverhältnisse von PT-Reagenzien, einem rTF-PT-Reagenz und Thromborel S, als eine Funktion der prozentualen Faktoraktivität.
2 zeigt die relativen Sensitivitäten der PT-Reagenzien gegenüber Plasmen von Patienten, die sich einer oralen antikoagulanten Therapie unterziehen.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
1. Bevorzugte Gewebefaktorreagenz-Zusammensetzungen
Die vorliegende Erfindung stellt Gewebefaktorreagenzien zur Verfügung, welche Liposome mit einem Gewebefaktor umfassen, der mit der Lipiddoppelschicht der Liposome assoziiert ist, so dass der Gewebefaktor durch die Lipiddoppelschicht eingefügt ist.
Die Lipiddoppelschicht der Liposome umfasst Phospholipide, vorzugsweise Phosphoglyceride.
Alternativ, gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung, werden Gewebefaktorreagenzien bereit gestellt, welche Phospholipidmicellzusammensetzun gen umfassen, die einen Gewebefaktor aufweisen, der mit Phospholipidmicellen assoziiert ist, so dass der Gewebefaktor in die Micelle eingefügt ist.
Die Gewebefaktorreagenzien der vorliegenden Erfindung umfassen etwa 0,1 μg bis etwa 3 μg natürlichen oder rekombinanten Gewebefaktor pro mg der Phospholipidmischung. Das Verhältnis von Gewebefaktor zur Phospholipidmischung kann die Sensitivität des resultierenden Gewebefaktorreagenzes bestimmen. Daher kann die Verwendung eines Verhältnisses von etwa 1 bis 2 μg Gewebefaktor pro mg Phospholipidmischung für ein Gewebefaktorreagenz mit einem International Sensitivity Index („ISI") von etwa 1,0 zweckmäßig sein. Die Verwendung eines Verhältnisses von etwa 0,25 bis etwa 0,5 μg Gewebefaktor pro mg Phospholipidmischung kann für die Herstellung eines Gewebefaktorreagenzes mit einem ISI von etwa 1,6 bis etwa 2,0 geeignet sein. Bevorzugt sind Gewebefaktorreagenzien, die zusätzlich von etwa 0,5 bis etwa 1,5 % (w/v) Glycin umfassen. Wo es gewünscht wird, das Gewebefaktorreagenz lyophilisieren zu können, um eine Lagerung und spätere Rekonstitution zu ermöglichen, schließt das Reagenz vorzugsweise ein Kryokonservierungsmittel, bevorzugt ein Kohlenhydrat-Kryokonservierungsmittel, am meisten bevorzugt Trehalose ein.
A. Bevorzugte Phospholipidmischungen
Geeignete Phospholipide für die Verwendung in den Liposomzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung schließen jene ein, welche Fettsäuren mit zwölf bis zwanzig Kohlenstoffatomen enthalten; die Fettsäuren können entweder gesättigt oder ungesättigt sein. Phospholipide für die Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung sind Phosphatidylcholin (PC), Phospatidylethanolamin (PE), Phosphatidylglycerin (PG) und Phosphatidylserin (PS). Diese Phospholipide können aus einer beliebigen natürlichen Quelle stammen, und die Phospholipide als solche können von Molekülen mit sich unterscheidenden Fettsäuren beinhaltet sein. Phospholipidmischungen, die Phospholipide aus unterschiedlichen Quellen umfassen, können verwendet werden. Zum Beispiel können PC, PG und PE aus Eidotter erhalten werden; PS kann aus tierischem Hirn oder Rückenmark erhalten werden. Diese Phospholipide können genauso gut aus synthetischen Quellen stammen.
Es können Phospholipid-(PL)-Mischungen, die ein unterschiedliches Verhältnis der einzelnen PLs aufweisen, verwendet werden. Die PL-Mischungen umfassen von etwa 5 bis 15 Mol-% PE, von etwa 3 bis etwa 20 Mol-% PS, von etwa 10 bis etwa 25 Mol-% PG; und der Restanteil PC, vorzugsweise von etwa 50 bis etwa 90 Mol-% PC. Besonders bevorzugt sind PL-Mischungen, die von etwa 8 bis etwa 12 Mol-% PE, von etwa 3 bis etwa 10 Mol-% PS, von etwa 14 bis etwa 20 Mol-% PG und von etwa 58 bis etwa 75 Mol-% PC umfassen.
Obwohl die Phospholipide in unterschiedlichen Verhältnissen eingesetzt werden können, haben wir herausgefunden, dass Phospholipidmischungen mit bestimmten Mengen der einzelnen Phospholipide Gewebefaktorreagenzien zur Folge haben, die eine vorteilhafte Aktivität und Aktivitätsstabilität aufweisen. Obwohl ein weiter Bereich an Verhältnissen der einzelnen Phospholipide verwendet werden kann, haben wir herausgefunden, dass für eine vorteilhafte Aktivität und Stabilität des resultierenden Gewebefaktorreagenzes ein bestimmter Level an PS in der gesamten PL-Mischung vorhanden sein muss. Die Menge an PS, die vorzugsweise zum Teil vorliegt, wird durch die verbleibenden Komponenten der PL-Mischung und ihren relativen Mengen als Teil der gesamten PL-Mischung bestimmt. Zum Beispiel erlaubt die Verwendung von großen Mengen an PG, einem weiteren negativ geladenen Phospholipid, (in der Größenordnung von etwa 10% oder mehr) die Verwendung niedrigerer Level an PS, in der Größenordnung von etwa 3%. Jedoch, wenn eine an PS arme PL-Mischung verwendet wird, ist es vorteilhaft, mindestens etwa 5% PE einzuschließen, vorzugsweise mindestens etwa 10%.
Die Phospholipide werden bequem in den geeigneten Verhältnissen vereint, um die PL-Mischung für die Verwendung bei der Herstellung der Gewebefaktorreagenzien der vorliegenden Erfindung zur Verfügung zu stellen. In einer bevorzugten Ausführungsform kann die PL-Mischung PC, PG, PE und PS im Molverhältnis von jeweils 67 : 16 10 : 7 umfassen.
B. Gewebefaktor
Entweder natürlicher Gewebefaktor oder rekombinanter Gewebefaktor kann in den Gewebefaktorreagenzien der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Natürlicher oder rekombinanter Gewebefaktor kann von unterschiedlichen Spezies verwendet werden.
Natürlicher Gewebefaktor kann durch konventionelle Techniken isoliert werden. Siehe, z. B., Broze, Jr., G. J. et al., J. Biol. Chem. 260 (20): 10917 – 10920 (1985); und Morrissey, J. H., et al., Thrombosis Research 50: 481 – 493 (1988).
Rekombinanter Gewebefaktor kann durch eine rekombinante Technologie unter Verwendung von Verfahren und Expressionssystemen nach Stand der Technik hergestellt werden. Siehe, z. B., Morrissey, J. H. et al., Cell 50: 129 – 135 (1987); Summers, M. D., „A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures," Texas Agricultural Experiment Station, Bulletin 1555 (1987).
Der Gewebefaktor kann durch Immunoaffinitätschromatographie oder andere chromatographische Verfahren, die vorgesehen sind, um ein spezifisches Protein von anderen Proteinverunreinigungen zu trennen, aufgereinigt werden.
C. Bevorzugte Kryokonservierungsmittel
Die Kryokonservierung betrifft die Bewahrung der Intaktheit von empfindlichen Substanzen, wenn sie enthaltende Flüssigkeiten gefroren und entwässert werden. Die Verwendung eines Kohlenhydrats als ein Kryokonservierungsmittel der Liposomintaktkeit beim Gefrieren und anschließender Lyophilisation wurde berichtet. Racker, E., Membrane Biol., 10: 221 – 235 (1972); Sreter, F. et al., Biochim. Biophys. Acta., 203: 254 – 257 (1970); Crowe et al., Biochem. J., 242: 1 – 10 (1987); Crowe et al., Biochim. Biophys. Acta., 987: 367 – 384 (1988).
Wenn der Gewebefaktor, der Lagerung vorausgehend für eine spätere Verwendung, lyophilisiert werden wird, ist es bevorzugt, ein Kohlenhydrat oder Kohlenhydrate als Kryokonservierungsmittel beizufügen, um die Intaktheit der Liposomen in der resultierenden Liposomzusammensetzung während der Lyophilisation und der nachfolgenden Rehydratation zu schützen. Geeignete Kohlenhydrat-Konservierungsmittel schließen Trehalose, Maltose, Lactose, Glucose und Mannitol ein. Gemäß einem bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird Trehalose in einer wässrigen Pufferlösung beigefügt, die bei der Herstellung der Gewebefaktorreagenzien der vorliegenden Erfindung (der Lyophilisation vorausgehend) verwendet wird, vorzugsweise in einer Konzentration im Bereich von etwa 50 mM bis etwa 250 mM.
D. Glycin
Gemäß eines besonders bevorzugten Aspekts der vorliegenden Erfindung ist Glycin als eine zusätzliche Komponente dieser Gewebefaktorreagenzien eingeschlossen. Die Einfügung von Glycin in diese Gewebefaktorreagenzien führt zu Reagenzien, die eine wesentlich verbesserte Leistungsfähigkeit in PT-Assays aufweisen, wobei sich Prothrombinzeiten für normales humanes Plasma ergeben, die im Wesentlichen zu jenen von kommerziellen Kontrollen äquivalent sind, die dafür gedacht sind, menschliches Plasma nachzuahmen. Daher umfassen diese bevorzugten Gewebefaktorreagenzien ferner von etwa 0,5 % bis etwa 1,5 % (w : v) Glycin, stärker bevorzugt von etwa 0,6 bis etwa 1,2 % Glycin.
2. Herstellung von Gewebefaktorreagenzien
Die Phospholipide, die vom Hersteller in einem organischen Lösungsmittel erhalten werden können, werden zusammen in den geeigneten Verhältnissen gemischt, um die spezifizierte Zusammensetzung zu erhalten. Ein Antioxidationsmittel wird dann hinzugefügt, um die Alkylkettenperoxidation der Fettsäureanteile der Phospholipide zu verringern, und das organische Lösungsmittel, wenn vorhanden, wird durch Verdampfung entfernt. Ein geeignetes Antioxidationsmittel ist butyriertes Hydroxytoluol. Vorzugsweise wird etwa 0,1% (bezogen auf das Gewicht) an Antioxidationsmittel eingesetzt.
Die getrocknete (eingedampfte) Phospholipidmischung wird anschließend in einer wässrigen Detergenz-Lösung wieder gelöst. Geeignete Detergenzien schließen jene, die eine relativ hohe kritische Micellkonzentration (CMC) besitzen, ein. Womack et al., Biochim. Biophys. Acta, 733: 210 (1983). Solche Detergenzien schließen Detergenzien mit einer CMC größer als etwa 2 mM ein. Bevorzugt sind jene Detergenzien mit einer CMC zwischen etwa 2 bis 25 mM. Solche bevorzugten Detergenzien schließen 3-[(3-Cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propansulfonat (CHAPS) und Alkylglucopyranoside, wie Octyl-beta-D-glucopyranosid, Octyl-beta-D-thioglucopyranosid und dergleichen ein. Wahlweise kann die Detergenzlösung weitere Komponenten einschließen. Diese Komponenten können Puffersalze, wie HEPES, Tris, Phosphat und dergleichen; verschiedene andere Salze, wie NaCl, KCl und dergleichen; ein Kohlenhydrat-Kryokonservierungsmittel, wie Trehalose, Maltose, Glucose und dergleichen; und Glycin einschließen. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die Detergenzlösung 20 mM Tris, pH 7,5, 150 mM NaCl, (TBS), enthaltend 100 mM CHAPS, 150 mM Trehalose und 0,8% Glycin. Gemäß dieser bevorzugten Ausführungsform werden die Phospholipide in dieser Lösung wieder gelöst, um eine Endkonzentration von etwa 20 mg/ml zu ergeben.
Der Gewebefaktor und das Trägerprotein werden mit den wieder gelösten Phospholipiden vereinigt, und das Volumen der resultierenden Mischung wird mit einem Puffer, wie oben beschrieben, eingestellt, der vorzugsweise ein Kryokonservierungsmittel (am stärksten bevorzugt Trehalose) und Glycin, aber kein Detergenz enthält. Wie oben erwähnt kann der Gewebefaktor, der bei der Herstellung der Gewebefaktorreagenzien der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird, entweder natürlichen oder rekombinanten Ursprungs sein. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein rekombinanter Gewebefaktor (rTF) verwendet. Der Gewebefaktor wird zugegeben, gefolgt von Trägerprotein, wie Rindergammaglobulin und genügend Puffer wird hinzugesetzt, um die endgültigen Konzentrationen von Gewebefaktor auf 10 μg/ml, von Rindergammaglobulin auf 1 mg/ml, von Phospholipid auf 4 mg/ml und von Detergenz auf 20 mM einzustellen. Geeignete Puffer schließen TBS, das 150 mM Trehalose und 0,8% Glycin enthält, ein. Die resultierende klare, farblose Lösung benötigt kein Vortexen oder Ultrabeschallen, um das Co-Solubilisieren sicher zu stellen.
Das Detergenz in der Phospholipid-Gewebefaktormischung kann durch eine Anzahl von Techniken entfernt werden, was eine stabile Liposomzusammensetzung mit einem Gewebefaktor, der damit assoziiert und durch die Lipiddoppelschicht insertiert ist, zur Folge hat. Geeignete Techniken der Entfernung des Detergenzes, schließen die Dialyse, die Tangentialfluß-Diafiltration, die Querfluß-Hohlfaserfiltration, die Behandlung mit hydrophobem Chromatographieharz und die einfache Verdünnung ein.
Eine bevorzugte Technik der Detergenzentfernung aus der Phospholipid-Gewebefaktormischung verwendet eine Dialyse während mindestens 30 Stunden bei Raumtemperatur in einem Dialysemembranschlauch gegen einen Puffer wie TBS, der 150 mM Trehalose, 0,8% Glycin und 0,05% NaN₃ enthält, um das Detergenz zu entfernen. Eine weitere bevorzugte Technik der Detergenzentfernung setzt eine Harzbehandlung ein. Geeignete Harze schließen hydrophobe Chromatographieharze, wie Amberlite XAD-2 (Rohm and Haas Co. in Philadelphia, Pennsylvania) oder Bio-Beads SM-2 (Bio-Rad in Richmond, Kalifornien) ein. Die Harze können verwendet werden, um das Detergenz zu entfernen, entweder durch direkten Kontakt mit der Phospholipid-Gewebefaktorlösung oder getrennt von ihr durch eine Dialysemembran. Die Rate der Detergenzentfernung aus der Phospholipid-Gewebefaktorlösung ist proportional zum Gewichtsverhältnis des Detergenzes in der Lösung und den chromatographischen Harzkügelchen.
Die Liposomlösung, die aus dem Schritt der Detergenzentfernung resultiert, wird dann auf 5 mM CdCl₂ eingestellt. Gemäß eines bevorzugten Aspektes wird die Liposomlösung, welche den vollständig aktiven Gewebefaktor enthält, auf eine Konzentration von 50 mM Tris, pH 7,5, 75 mM Trehalose, 0,8% Glycin und 10 bis 15 mM CaCl₂ vor der Verwendung verdünnt. Alternativ kann das verdünnte Reagenz für eine Langzeitkonservierung seiner Leistungscharakteristika als Prothrombinzeitreagenz lyophilisiert und dann später durch Suspension in Wasser vor der Verwendung rekonstituiert werden.
Ein weiteres bevorzugtes Verfahren der Detergenzentfernung vermeidet die Verwendung entweder einer Dialyse oder einer Harzbehandlung und sorgt doch für die Herstellung eines aktiven TF-Reagenzes. Gemäß dieses Verfahrens werden die mit dem Detergenz solubilisierten, den TF enthaltenden Phospholipide in einem Puffer oh ne Detergenz verdünnt, um gemischte, den TF enthaltende Micellen zu erzeugen, welche durch CdCl₂ vollständig aktiviert werden können. Gemäß diesem Aspekt der Erfindung werden die Phospholipide zu 20 mg/ml in einem Puffer gelöst, der ein Detergenz, vorzugsweise ein Alkylglucopyranosid enthält. Eine geeignete Puffer-Detergenzlösung umfasst 20 mM HEPES (pH 6), die 50 mM Octyl-beta-D-thioglucopyranosid (OTG) und 150 mM NaCl enthält. Trägerprotein, TF und CdCl₂ werden dann hinzugefügt und die Mischung ferner mit Puffer ohne Detergenz verdünnt, wie 20 mM HEPES (pH 6), der 150 mM NaCl enthält, um Endkonzentrationen des TF von 10 μg/ml, des Trägerproteins (Rindergammaglobulin) von 1 mg/ml, des CdCl₂ von 5 mM, der Phospholipide von 4 mg/ml und des OTG von 10 mM zu ergeben. Das Reagenz kann für eine Lagerung, wie oben beschrieben, lyophilisiert oder wie oben beschrieben vor der Verwendung verdünnt werden.
Gemäß eines weiteren Aspekts der vorliegenden Erfindung kann dieses Reagenz durch folgende Verfahren zur Herstellung von Vesikeln und gemischten Detergenz-Phospholipidmicellen aus Phospholipiden durch auf mechanische Vorrichtungen basierende Techniken, durch die Entfernung von organischen Lösungsmitteln, durch Detergenzentfernung und durch Größentransformation hergestellt werden, wie durch Lichtenberg, D. und Barenholz, Y., Methods of Biochemical Analysis, 33: 337 – 462 (1988) beschrieben, und dessen Offenlegungen hierin durch Bezugnahme mit einbezogen werden.
Um das Verständnis der vorliegenden Erfindung zu unterstützen, sind die folgenden Beispiele eingeschlossen, welche die Ergebnisse eine Serie von Experimenten beschreiben.
Beispiele
Beispiel 1
Herstellung von Anti-rTF-Affinitätsgel
Der monoklonale Antikörper, der gegen den TF, TF8-5G9, gerichtet ist, wurde von Dr. T. S. Edgington erhalten und wurde durch die Verfahrensweise von Morrissey, J. H. et al., Thrombosis Research, 52: 247 – 261 (1988) hergestellt. Der TF8-5G9-Aszites wurde zu IgG durch DEAE-Chromatographie gereinigt, unter Verwendung der Verfahrensweise, wie in Harlow, E. und Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual, Seiten 304 – 305, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) beschrieben.
Das Immunoaffinitätsharz wurde durch eine kovalente Anbindung des gereinigten Antikörpers an Affigel 10 (Biorad Laboratories in Richmond, Kalifornien) durch die durch den Hersteller empfohlene Prozedur hergestellt. Somit wurden 200 mg DEAE-gereinigten monoklonalen Antikörpers in 0,1 M MOPS (pH 7,5) dialysiert, um eine 10 mg/ml Lösung zu erhalten. 20 ml dieser Antikörperlösung wurde dann zu 20 ml Affigel 10 hinzu gegeben. Die Mischung wurde anschließend über Nacht bei 2 bis 8°C inkubieren gelassen und in einer vertikalen überkopfartigen Weise gemischt. Nach 16 bis 24 Stunden wurden zwanzig ml 0,1 M Ethanolamin (pH 8) hinzugefügt, um sich mit jeder nicht reagierten Gruppe zu verbinden und die Kopplungsreaktion zu beenden. Das Harz wurde abtropen gelassen und mit 0,1 M MOPS (pH 7,5) gewaschen und das Immunoaffinitätsharz wurde bei 2 – 8 °C gelagert. Es wurde eine Kopplungseffizienz größer als 95% beobachtet.
Beispiel 2
Herstellung von rekombinantem Gewebefaktor (rTF)
Der rekombinante Gewebefaktor (rTF) wurde von den Zell-Lysaten unter Verwendung des folgenden Verfahrens gereinigt. Die den rTF produzierenden Zellen wurden mit TBS gewaschen und zu 2 × 10⁷/ml in TBS resuspendiert, das 0,25% Triton X100, 10 μg/ml Sojabohnen-Trypsininhibitor und 1 mM EDTA enthielt. Nach dem Mischen während 30 Minuten bei 4 °C, wurden die zellulären Trümmer durch Zentrifugieren 20 min lang bei etwa 5000 × g bei 4 °C entfernt.
Das geklärte Lysat wurde 2,5-fach mit TBS verdünnt, um die Triton-Konzentration auf 0,1% zu reduzieren, und wurde dann durch das Immunoaffinitätsharz (hergestellt in Beispiel 1) durchlaufen gelassen, das einen kovalent gebundenen monoklonalen, gegen den TF gerichteten Antikörper enthielt. Das Harzbett wurde mit 2 bis 3 Bettvolumina an TBS + 0,1% Triton X100, 2 bis 3 Volumina 20 mM Tris, pH 7,5, 0,5 M NaCl, 0,1 % Triton X100 und schließlich mit 2 bis 3 Bettvolumina 0,5 M NaCl, 0,1 % Triton X100 gewaschen. Das gebundene Protein wurde vom Harz mit 0,1 M Glycin, pH 2,5, 0,1% Triton X100 eluiert. Fraktionen, die gesammelt wurden, nachdem der Puffer auf Glycin umgestellt wurde, wurden sofort mit einem geeigneten Volumen von 1 M Tris, pH 8 neutralisiert. Der rTF wurde in jenen Fraktionen gefunden, die den Punkt, wo der pH des Säulenausflusses sich geändert hatte, unmittelbar umgeben.
Die den rTF enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt, gegen 20 mM Tris, pH 8, 0,1% Triton X100 dialysiert und anschließend aufkonzentriert, indem der rTF an eine DEAE-Trisacrylsäule mit kleinem Bettvolumen (IBF Biotechniques in Columbia, Manland) gebunden wurde. Das Triton X100 wurde durch CHAPS ersetzt, indem das Harzbett mit mindestens 10 Bettvolumina von 20 mM Tris, pH 8, das 10 mM CHAPS enthielt, gewaschen wurde. Der rTF wurde mit einem einzelnen Schritt von 0,5 M NaCl in 20 mM Tris, pH 8, 10 mM CHAPS eluiert.
Beispiel 3
Herstellung von Phospholipiden
Phosphatidylcholin (PC), Phosphatidylethanolamin (PE), Phosphatidylserin (PS) und Phosphatidylglycerin wurde in einer Chloroform-Lösung von Avanti Polar Lipids in Alabaster, Alabama, oder Calbiochem Corporation in La Jolla, Kalifornien in verschlossenen Glasampullen erhalten und unter N₂ bei –20 °C gelagert. CHAPS, andere Detergenzien und Rindergammaglobulin wurden von Calbiochem erhalten. Tris-Base und Glycin wurde von BioRad Laboratories in Richmond, Kalifornien bezogen. Alle weiteren Chemikalien und Biochemikalien wurden von Sigma in St. Louis, Missouri erworben.
Die Phospholipide wurden für die Resolubilisierung in der folgenden Art und Weise aufbereitet. PC, PE, PS und PG wurden auf Raumtemperatur erwärmt und in einem geeigneten Röhrchen oder Kolben in den spezifizierten Molverhältnissen zusammengefügt. Das Antioxidationsmittel, butyriertes Hydroxytoluol (BHT) wurde in Chloroform gelöst und zu der Mischung der Phospholipide in einem Gewichtsverhältnis von 0,1 % (BHT : Gesamtphospholipide) zugesetzt. Das organische Lösungsmittel wurde durch Verdampfung unter einem Strom von trockenem Stickstoff oder unter reduziertem Druck in einem Rotationsverdampfer entfernt. Verbleibendes organisches Lösungsmittel wurde durch 1 Stunde zusätzliches Pumpen bei Raumtemperatur mit einer Vakuumpumpe bei einem Druck von 10 μm oder weniger eliminiert. Die Mischung von Phospholipiden wurde zu 20 mg/ml in 20 mM Tris, pH 7,5, 150 mM NaCl (TBS), das 100 mM CHAPS enthielt, erneut gelöst.
Beispiel 4
Herstellung des rTF-Prothrombinzeit (rTF PT)-Reagenzes durch Dialyse
Die Phospholipide wurden in den spezifizierten Molverhältnissen von PC, PE, PS und PG zusammengefügt, anschließend, wie in Beispiel 3 beschrieben, resolubilisiert. Die resolubilisierten Phospholipide wurden mit immunoaffinitätsgereinigtem rTF (aus Beispiel 2) und Rindergammaglobulin vereinigt. Zusätzlich wurde 150 mM Trehalose enthaltendes TBS zugegeben, um Endkonzentrationen von 4 mg/ml Gesamtphospholipid, 10 ug/ml rTF, 1 mg/ml Rindergammaglobulin und 20 mM CHAPS zu erhalten. Diese klare und farblose Lösung wurde in einen Dialysemembranschlauch (Spectrapore^R, Spectrum Medical Industries, Molekulargewichtsgrenze von 12 000 bis 14 000) platziert und mindestens 30 Stunden lang bei Raumtemperatur gegen TBS, das 150 mM Trehalose und 0,05 % NaN₃ enthielt, dialysiert. Nach der Dialyse wurde das Volumen des Dialysats bestimmt und zurück auf das ursprüngliche Volumen, falls notwendig, mit Dialysepuffer eingestellt. CdCl₂ wurde zu einer Endkonzentration von 5 mM hinzugesetzt, und die Lösung wurde bei 37 °C 2 Stunden lang inkubiert.
Die Lösung wurde auf Trockeneis gefroren, anschließend lyophilisiert unter Verwendung eines Zyklus, beginnend bei –40°C und endend bei Raumtemperatur, über eine 48 Stunden Periode. Die Liposomen wurde anschließend auf eine Arbeits-Konzentration mit 0,1 M Tris, pH 7,5, 150 mM Trehalose rekonstituiert, um eine Lösung zu ergeben, die den rTF zu etwa 1 bis 2 μg/ml, die Phospholipide zu etwa 400 bis 800 μg/ml und Rindergammaglobulin zu 50 bis 100 μg/ml enthielt.
Die rTF-PT-Reagenzien, wie oben hergestellt, wurden verwendet, um die Prothrombinzeiten von Thromboscreen Kontrollplasmen (Curtin Matheson Scientific in Yorba Linda, Kalifornien) und einem Pool von normalem humanem Plasma zu bestimmen. Dementsprechend wurden 100 μl Plasma und 100 μl von verdünnten Liposomen in der Probenmulde eines Koagulometers platziert. Das Instrument fügte 100 μl 20 mM CaCl₂ hinzu und bestimmte automatisch die Prothrombinzeit. Die Ergebnisse werden in Tabelle I unten dargestellt. Tabelle I

^a Das Verhältnis der Phospholipide wird jeweils als Molverhältnis von Phosphatidylcholin zu Phosphatidylethanolamin zu Phosphatidylserin zu Phosphatidylglycerin ausgedrückt.
^b Normaler humaner Pool (NHP) ist aus Plasma zusammengesetzt, das von 10 normalen Individuen vereinigt, in kleine Aliquote aufgeteilt und schockgefroren wurde.
^c Die Level I, II und III sind Thromboscreen-Kontrollplasmen (Curtin Matheson Scientific, Yorba Linda, Kalifornien) und sind dazu gedacht, Patienten zu simulieren, die sich 3 unterschiedlichen Leveln oder Intensitäten der oralen Antikoagulanz-Therapie unterziehen.
^d Diese Zeit war länger als 300 Sek.
* Nicht Teil der Erfindung

Die Daten zeigten, dass (1) ein weiter Bereich an Phospholipidmolverhältnissen im rTF-PT-Reagenz für eine rTF-vermittelte Initiierung des Gerinnungsmechanismus akzeptabel ist, (2) das Reagenz eine Phospholipidzusammensetzung, die netto eine negative Ladung trägt, wie PS oder PG, für die rTF-induzierte Gerinnungsaktivität benötigt, und (3) das Reagenz PE und PG zusammen benötigt, wenn PS in der Konzentration wesentlich reduziert ist.
Die in Tabelle I verwendeten Kontrollplasmen sind dafür gedacht, die Plasmen von Patienten zu simulieren, die sich einer oralen antikoagulanten Therapie unterziehen. Die unter deren Verwendung erhaltenen Prothrombinzeiten zeigen nicht eine Defizienz in einem beliebigen Koagulationsfaktor, sondern spiegeln stattdessen eine Depression der Aktivitäten mehrerer Faktoren wider.
Ein Beispiel, wie ein rTF-PT-Reagenz (nicht Teil der Erfindung) auf reduzierte Level mehrerer Faktoren, die in dem extrinsischen Koagulationsweg (Faktoren V, VII, X) involviert sind, reagiert, ist in 1 dargestellt. Die Prothrombin (PT)-Zeiten wurden auf die folgende Weise bestimmt. Ein Pool an normalem Humanplasma wurde 1 : 2, 1 : 4, 1 : 10, 1 : 20 und 1 : 40 mit 0,15 M NaCl verdünnt, um entsprechend 50, 25, 10, 5 bzw. 2,5% Faktoraktivität zu ergeben. An Koagulationsfaktor arme Plasmaproben (Thromboscreen, Curtis Matheson Scientific, Inc.) wurden rehydratisiert, wie von den Herstellern vorgeschlagen, und wurden unverdünnt eingesetzt. Das hier verwendete rTF-PT-Reagenz wurde mit einem Phospholipidverhältnis von 10 : 1 : 1 (PC : PE : PS, entsprechend) hergestellt und enthielt 10 mM CaCl₂. Thromborel S (Berhing Diagnostics in Somerville, New Jersey) wurde rehydratisiert und gemäß der Empfehlung des Herstellers gehandhabt. Einhundert μl verdünntes normales Humanplasma (NHP) und 100 μl koagulationsfaktorarmes Plasma wurden in eine Koagulometer-Probenmulde gegeben. Das PT-Reagenz (200 μl) wurde durch das Instrument hinzugesetzt und die PT wurde automatisch bestimmt. Das Prothrombinverhältnis (PR) wurde berechnet, indem die koagulationsfaktorarme PT durch die PT geteilt wurde, die mit dem unverdünnten NHP erhalten wurde, und wurde gegen des Prozentwert an Faktor aufgetragen, der durch das NHP geliefert wurde.
Die Daten in 1 zeigen, dass die Verwendung des rTF-PT-Reagenzes höhere PRs bei allen getesteten Plasmaverdünnungen zur Folge hat. Ein PT-Reagenz, das ein höheres PR als ein anderes PT-Reagenz bei der gleichen Verdünnung des normalen Plasmapools soll ein sensitiveres Reagenz sein. Daher ist das rTF-PT-Reagenz sensitiver als das Thromborel S gegenüber der Depletion an spezifischen Koagulationsfaktoren, die getestet wurden.
Beispiel 5 (Nicht Teil der Erfindung)
Herstellung von rTF-Prothrombinzeit (rTF-PT)-Reagenz ohne Dialyse
Phospholipide wurden in der folgenden Weise für die Resolubilisierung präpariert. PC, PE und PS wurden auf Raumtemperatur erwärmt und in einem geeigneten Röhrchen oder Kolben in einem Molverhältnis von 7,5 : 1 : 1 an jeweils PC, PE bzw. PS zusammengefügt. Das Antioxidationsmittel, butyriertes Hydroxytoluol (BHT) wurde in Chloroform gelöst und zur Phospholipidmischung in einem Gewichtsverhältnis von 0,1% (BHT : Gesamtphospholipide) zugesetzt. Das organische Lösungsmittel wurde durch Verdampfung unter einem Strom von trockenem Stickstoff oder unter reduziertem Druck in einem Rotationsverdampfer entfernt. Verbleibendes organisches Lösungsmittel wurde durch 1 Stunde zusätzliches Pumpen bei Raumtemperatur mit einer Vakuumpumpe bei einem Druck von 10 μm oder weniger entfernt.
Die Mischung von Phospholipiden wurde in 50 mM Octyl-beta-D-thioglucopyranosid (OTG) in 20 mM HEPES (pH 6), 150 mM NaCl zu einer Endkonzentration von 4 mg/ml erneut gelöst. rTF aus Beispiel 2 und Rindergammaglobulin wurden mit den resolubilisierten Phospholipiden gemischt. Genügend 20 mM HEPES (pH 6), 150 mM NaCl wurde zugegeben, um die Endkonzentrationen auf 10 μg/ml rTF, 1 mg/ml Rindergammaglobulin, 4 mg/ml Phospholipide und 10 mM OTG einzustellen. CdCl₂ wurde bis zu einer Endkonzentration von 5 mM hinzugesetzt, um den rTF zu aktivieren. Die resultierenden gemischten Micellen, die rTF, OTG und Phospholipide umfassten, wurden mit 20 mM HEPES, pH 6, 150 mM NaCl verdünnt, um eine Lösung zu ergeben, die den rTF in etwa 0,5 bis 1 μg/ml, die Phospholipide in etwa 500 bis 700 μg/ml und das Rindergammaglobulin in 25 bis 50 μg/ml enthielt, was das rTF-PT-Reagenz ergab.
Dieses Reagenz wurde in diesem Beispiel verwendet, um die PT von Thromboscreen Kontrollplasmen und einem normalen Humanplasmapool zu bestimmen. Die Plasmakontrollen werden hergestellt, um Plasma nachzuahmen, das unterschiedliche Aktivitätslevel der Koagulationsfaktoren II, V, VII und X enthält. Kontrolle I enthält Aktivitätslevel nahe normal, Kontrolle II enthält mittlere Level, während Kontrolle III die geringsten Level enthält. Es wird erwartet, dass die PTs bei Kontrolle I die kürzesten und die längsten bei Kontrolle III sein sollten. Die Ergebnisse in Tabelle II unten zeigen, dass dies der Fall ist. Tabelle II

^a Das normale Humanplasma und die Thromboscreen Kontrollplasmen werden in der Fußnote von Tabelle 1 beschrieben.

Die Sensitivität dieses rTF-PT-Reagenzes wurde auch mit anderen kommerziellen Prothrombinzeit-(PT)-Reagenzien verglichen unter Verwendung von Plasmen von Patienten, die sich einer oralen antikoagulanten Therapie unterziehen. Die kommerziellen Reagenzien waren Thromborel S (Berhing Diagnostics in Somerville, New Jersey) und Simplastin (Organon Teknika Corporation in Charlotte, North Carolina). Die Plasmaproben, welche von normalen Individuen und Patienten, die sich einer oralen antikoagulanten Therapie unterzogen, gezogen wurden, wurden gefroren von einem lokalen Krankenhaus erhalten.
Die Prothrombinzeit für jede Plasmaprobe wurde bestimmt, wobei jedes der drei PT-Reagenzien eingesetzt wurde. Somit wurden 100 μl Plasma und 100 μl rTF-PT-Reagenz in die Probenmulde eines Koagulometers platziert. Das Instrument fügte 100 μl 20 mM CaCl₂ hinzu und bestimmte automatisch die Prothrombinzeit. Bei Thromborel S und Simplastin wurden 100 μl Plasma in die Probenmulde platziert und das Instrument fügte 200 μl des PT-Reagenzes hinzu. Der Logarithmus der Prothrombinzeit, die für jede Patientenprobe unter Verwendung des rTF-PT-Reagenzes und Simplastin erhalten wurde, wurde aufgetragen gegen die gleiche, unter Verwendung von Thromborel S. Die in 2 gezeigten Daten zeigen, dass die Steigung für das rTF-PT-Reagenz und Thromborel S 0,81 beträgt. Eine Steigung von 1,0 würde auf eine identische Leistungsfähigkeit der beiden PT-Reagenzien hinweisen. Folglich ist das rTF-PT-Reagenz etwa 20% sensitiver als Thromborel S. Jedoch die Steigung der Linie, die in dem Diagramm, das Simplastin und Thromborel S vergleicht, beobachtet wird, beträgt 1,62, was darauf hinweist, dass Simplastin viel weniger sensitiv ist, als es Thromborel S ist. Die Daten oben bestätigen den aus Tabelle II gezogenen Schluss, dass das rTF-PT- Reagenz sensitiv gegen Verminderungen in den Koagulationsfaktoraktivitäten ist, und dass diese Sensitivität sowohl bei realen als auch bei simulierten Patientenplasmen gesehen wird.
Beispiel 6 (nicht Teil der Erfindung)
Herstellung von rTF-Prothrombinzeitreagenz durch Diafiltration
Die Phospholipide wurden in einem Molverhältnis von 7,5 : 1 : 1 (PC : PE : PS) vereinigt, getrocknet, um das organische Lösungsmittel zu entfernen, dann resolubilisiert, wie in Beispiel 3 beschrieben. Die zu 15 mg/ml resolubilisierten Phospholipide in 100 mM CHAPS enthaltendem TBS wurden mit immunoaffinitätsgereinigtem rTF (aus Beispiel 2) und Rindergammaglobulin vereinigt. Zusätzlich wurde 150 mM Trehalose enthaltendes TBS zugegeben, um Endkonzentrationen von 4 mg/ml Phospholipid, 10 ug/ml rTF, 1 mg/ml Rindergammaglobulin und 20 mM CHAPS zu ergeben.
Das Detergenz (CHAPS) wurde durch Tangentialfluß-Diafiltration entfernt, unter Verwendung einer Pyrostart- oder Ultrastart-Filtereinheit (Sartorius Corp., Bohemia, NY, Molekulargewichts-Grenze von 20 000) und 150 mM Trehalose enthaltendem TBS als den Dialysepuffer. Etwa 95 bis 100 % des CHAPS kann entfernt werden, indem man 10 Volumina an Dialysepuffer durch das Gerät durchführt. Nach der Diafiltration wurde das Volumen des Dialysats bestimmt und auf das ursprüngliche Volumen zurück (falls notwendig) mit TBS eingestellt, das 150 mM Trehalose und 0,05% NaN₃ enthielt. CdCl₂ wurde bis zu einer Endkonzentration von 5 mM hinzugesetzt, und die Lösung wurde bei 37°C 2 Stunden lang inkubiert.
Die Lösung kann auf Trockeneis gefroren, anschließend lyophilisiert werden unter Verwendung eines Zyklus, beginnend bei –40°C und endend bei Raumtemperatur, über eine 48 Stunden Periode. Das resultierende Reagenz kann auf eine Arbeits-Konzentration durch die Zugabe von 0,1 M Tris, pH 7,5, 150 mM Trehalose rekonstituiert werden, um eine Lösung zu erhalten, die rTF in etwa 1 bis 2 μg/ml, Phospholipide in etwa 400 bis 800 μg/ml und Rindergammaglobulin in 50 bis 100 μg/ml enthielt. Die Reagenzleistung war ähnlich der in Tabelle II beobachteten.
Beispiel 7
Herstellung von rTF-Prothrombinzeitreagenz durch Zugabe von XAD-2 Harz
Die Phospholipide wurden in einem Molverhältnis von 67 : 16 : 10 : 7 (PC : PG PE : PS) vereiningt, getrocknet, um das organische Lösungsmittel zu entfernen, dann resolubilisiert, wie in Beispiel 3 beschrieben. Die zu 15 mg/ml resolubilisierten Phospholipide in TBS, das 100 mM CHAPS und 0,8% Glycin enthielt, wurden mit immunoaffintätsgereinigtem rTF (aus Beispiel 2) und Rindergammaglobulin vereinigt. Zusätzlich wurde 150 mM Trehalose und 0,8% Glycin enthaltendes TBS zugegeben, um Endkonzentrationen von 3 mg/ml Phospholipid, 4,5 μg/ml rTF, 1 mg/ml Rindergammaglobulin und 20 mM CHAPS zu ergeben.
Hydrophobe chromatographische Harze, wie Amberlite XAD-2 (Rohm and Haas Co., Philadelphia, Pa) oder BioBeads SM-2 (BioRad, Richmond, Ca) können ebenfalls eingesetzt werden, um das Detergenz (CHAPS) zu entfernen, entweder im direkten Kontakt mit der Phospholipidlösung oder von ihr durch eine Dialysemembran getrennt. Die Entfernungsrate war proportional zum Gewichtsverhältnis des Detergenzes in Lösung und den chromatographischen Harzkügelchen. In der Tat ist die Entfernungsrate sowohl zur zugegebenen Menge an Harz als auch zur Rate der Zugabe proportional. Die Menge, die benötigt wird, um alles Detergenz zu entfernen wird aus der Kapazität des Harzes (vom Hersteller zur Verfügung gestellt) und der Gesamtmasse des zu entfernenden Detergenzes berechnet. Zudem kann 99,9% Entfernen des Detergenzes entweder in 1 Stunde oder in 24 Stunden bei 30 C erreicht werden, in Abhängigkeit von der Rate mit der diese Harzmenge zugegeben wird. CdCl₂ wurde bis zu einer Endkonzentration von 5 mM zugesetzt, und die Lösung wurde bei 37°C 2 Stunden lang inkubiert. Die Liposome wurden dann auf eine Arbeitskonzentration mit 50 mM Tris, pH 7,5, 75 mM Trehalose, 15 mM CaCl₂, 0,8% Glycin, 1 % Maltose und 0,05% NaN₃ verdünnt, um eine Lösung zu erhalten, die den rTF zu etwa 0,04 bis 0,20 μg/ml, Phospholipide zu etwa 40 bis 150 μg/ml und Rindergammaglobulin zu 50 bis 100 μg/ml enthielt.
Die Lösung wurde auf Trockeneis gefroren, anschließend lyophilisiert, unter Verwendung eines Zyklus, beginnend bei –40°C und endend bei Raumtemperatur, über eine 48-Stunden-Periode. Das lyophilisierte Reagenz wurde mit destilliertem Wasser vor der Verwendung rekonstituiert.
Die Leistung des rTF-FT-Reagenzes wurde bestimmt und die Ergebnisse sind in Tabelle III unten gezeigt. Demnach wurden 100 μl von normalen Humanplasmapool oder Ortho-Kontrollplasmen in eine Koagulometerprobenmulde platziert. Das Instrument fügte 200 μl des rTF-PT-Reagenzes zu und bestimmte die PT. Tabelle III

^a Der normale Humanplasma-Pool (NHP) ist aus Plasma zusammengesetzt, das von 10 normalen Individuen vereinigt, in kleine Aliquote aufgeteilt und schockgefroren wurde. Level I, II und III sind Ortho Diagnostic Systems-Kontrollplasmen (Raritan, New Jersey) und sind dazu gedacht, Patienten zu simulieren, die sich drei verschiedener Level oder Intensitäten einer oralen antikoagulanten Therapie unterziehen.

Die Daten zeigen, dass das rTF-PT-Reagenz die von der vorliegenden Erfindung gewünschte Leistung liefert. Erstens spiegeln die PTs die für die unterschiedlichen Kontrollen erwarteten Änderungen wieder, da diese Kontrollen dafür gedacht sind, Plasmen von Patienten zu simulieren, die sich verschiedener Graden von antikoagulanter Therapie unterziehen. Zweitens stimmen die PTs für das normale Humanplasma mit jenen der Level I Kontrollen überein. Der letztere Effekt wird auf das Einfügen von Glycin in das Reagenz zurückgeführt. Vergleiche Daten in den Tabellen I und III.

Claims

Prothrombinzeitreagenz, geeignet zur Verwendung bei der Messung der Koagulations- bzw. Gerinnungsaktivität beim extrinsischen Koagulationsweg, wobei das Reagenz gereinigten natürlichen oder rekombinanten Gewebefaktor enthält, welcher eine Liposomzusammensetzung umfaßt, umfassend: (a) eine Phospholipidmischung, umfassend: (i) 5 bis 15 Mol-% Phosphatidylethanolamin; (ii) 3 bis 20 Mol-% Phosphatidylserin; und (iii) 10 bis 25 Mol-% Phosphatidylglycerin; (iv) der Restanteil ist Phosphatidylcholin; (b) 0,1 μg bis 3 μg gereinigten natürlichen oder rekombinanten Gewebefaktor pro mg Phospholipidmischung.
Prothrombinzeitreagenz, geeignet zur Verwendung bei der Messung der Koagulationsaktivität beim extrinsischen Koagulationsweg, wobei das Reagenz gereinigten natürlichen oder rekombinanten Gewebefaktor enthält, welcher eine Phospholipidmicellzusammensetzung umfaßt, umfassend: (a) eine Phospholipidmischung, umfassend: (i) 5 bis 15 Mol-% Phosphatidylethanolamin; (ii) 3 bis 20 Mol-% Phosphatidylserin; (iii) 10 bis 25 Mol-%. Phosphatidylglycerin; (iv) der Restanteil ist Phosphatidylcholin; (b) 0,1 bis 3 μg gereinigten natürlichen oder rekombinanten Gewebefaktor pro mg Phospholipidmischung; und (c) ein Detergenz.
Prothrombinzeitreagenz gemäß Anspruch 1 oder 2, ferner umfassend 0,5 % bis 1,5 % Glycin.
Prothrombinzeitreagenz gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, ferner umfassend ein Kohlenhydrat-Kryokonservierungsmittel, das aus der Trehalose, Maltose, Lactose, Glucose und Mannitol umfassenden Gruppe gewählt ist.
Prothrombinzeitreagenz gemäß Anspruch 4, wobei das Kohlenhydrat-Kryokonservierungsmittel 50 mM bis 250 mM Trehalose umfaßt.
Prothrombinzeitreagenz gemäß Anspruch 5, wobei die Phospholipidmischung 5 bis 15 Mol-% Phosphatidylethanolamin, 5 bis 20 Mol-% Phosphatidylserin, 10 bis 25 Mol-% Phosphatidylglycerin und als Rest Phosphatidylcholin umfaßt.
Prothrombinzeitreagenz gemäß Anspruch 5, wobei die Phospholipidmischung 8 bis 12 Mol-% Phosphatidylethanolamin, 3 bis 10 Mol-% Phosphatidylserin, 14 bis 20 Mol-% Phosphatidylglycerin und 58 bis 75 Mol-% Phosphatidylcholin umfaßt.
Prothrombinzeitreagenz gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Phospholipidmischung 8 bis 12 Mol-% Phosphatidylethanolamin, 3 bis 10 Mol-% Phosphatidylserin, 14 bis 20 Mol-% Phosphatidylglycerin und 58 bis 75 Mol-% Phosphatidylcholin umfaßt.
Prothrombinzeitreagenz gemäß Anspruch 8, wobei der Gewebefaktor rekombinanter Gewebefaktor ist.
Prothrombinzeitreagenz gemäß Anspruch 5, umfassend 0,6 bis 1,2 % (w/v) Glycin.
Prothrombinzeitreagenz gemäß Anspruch 2 oder 3, worin das Detergenz ein Alkylglucopyranosid ist.
Verfahren zur Herstellung eines Prothrombinzeitreagenzes gemäß Anspruch 1 oder einem seiner Unteransprüche, welches aktiven Gewebefaktor enthält, der mit Lipiddoppelschichten von Phospholipidvesikeln assoziiert ist, die folgenden Schritte umfassend: (a) Miteinander Solubilisieren von einer Phospholipidmischung, Gewebefaktor und Trägerprotein mit Detergenz; (b) Entfernen von Detergenz; und (c) Hinzusetzen von Cadmiumsalz.
Verfahren zur Herstellung eines Prothrombinzeitreagenzes gemäß Anspruch 2 oder einem seiner Unteransprüche, welches aktiven Gewebefaktor enthält, der mit Phospholipidmicellen assoziiert ist, die folgenden Schritte umfassend: (a) Miteinander Solubilisieren von einer Phospholipidmischung, Gewebefaktor und Trägerproteinen mit Detergenz; und (b) Hinzusetzen von Cadmiumsalz.
Verfahren gemäß Anspruch 13, wobei das Detergenz aus der Octyl-beta-D-glucopyranosid und Octyl-beta-D-thioglucopyranosid umfassenden Gruppe gewählt wird.
Verfahren, gemäß Anspruch 12 oder Anspruch 14, ferner umfassend in Schritt (a) das Co-Solubilisieren von 0,5 bis 1,5 Mol-% Glycin.
Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei der Gewebefaktor rekombinanter Gewebefaktor ist.
Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei das Detergenz aus der 3-[(3-Cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propansulfonat (CHAPS), Octyl-beta-D-glucopyranosid und Octyl-beta-D-thioglucopyranosid umfassenden Gruppe gewählt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei das Detergenz mittels einer Technik entfernt wird, die aus der die Dialyse, Tangentialfluß-Diafiltration und chromatographische Methoden umfassenden Gruppe gewählt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei das Detergenz ein Alkylglucopyranosid umfaßt.