JP6626761B2 - プロトロンビン時間測定用試薬およびその製造方法 - Google Patents

プロトロンビン時間測定用試薬およびその製造方法 Download PDF

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Description

本発明は、プロトロンビン時間測定用試薬およびその製造方法に関する。
プロトロンビン時間の測定には、例えば、ホスファチジルコリンとホスファチジルセリンとからなるリポソームに組換組織因子を会合させた組織因子含有リポソームを含むプロトロンビン時間測定用試薬などが用いられている（例えば、特許文献１参照）。
一方、近年、凝固検査の標準化の観点から、プロトロンビン時間の評価に用いられるプロトロンビン時間測定用試薬に対し、適正な範囲の凝固時間および適正な国際感受性指標を定めることが提唱されている。
国際公開第９８／４８２８３号
しかし、従来のプロトロンビン時間測定用試薬を用いて正常血漿の凝固時間を測定した場合、適正な範囲の凝固時間および適正な国際感受性指標の双方を満たすことが望まれている。
本発明は、正常血漿の凝固の測定の際に適正な範囲の凝固時間と適正な国際感受性指標とを確保することができる新たなプロトロンビン時間測定用試薬およびその製造方法を提供する。
本発明の１つの側面は、リン脂質層を有する第１のリポソームと、第１のリポソームとは異なる組成のリン脂質層を有する第２のリポソームと、組織因子とを含むリポソーム組成物を含有し、第１のリポソームおよび第２のリポソームの少なくとも一方のリン脂質層に組織因子が会合しており、第１のリポソームが、ホスファチジルコリン化合物と、ホスファチジルエタノールアミン化合物と、ホスファチジルセリン化合物とを含むリポソームであり、第２のリポソームが、ホスファチジルコリン化合物およびホスファチジルエタノールアミン化合物からなる群より選ばれた少なくとも１種類のリン脂質を含むリポソームであることを特徴とするプロトロンビン時間測定用試薬を含む。
本発明の別の側面は、（Ａ）ホスファチジルコリン化合物と、ホスファチジルエタノールアミン化合物と、ホスファチジルセリン化合物とを用いてリン脂質層を有する第１のリポソームを形成させる工程、
（Ｂ）ホスファチジルコリン化合物およびホスファチジルエタノールアミン化合物からなる群より選ばれた少なくとも１種類のリン脂質を用いて第１のリポソームとは異なる組成のリン脂質層を有する第２のリポソームを形成させる工程、および
（Ｃ）工程（Ａ）で得られた第１のリポソームおよび工程（Ｂ）で得られた第２のリポソームの少なくとも一方のリン脂質層と組織因子とを会合させる工程
を含むプロトロンビン時間測定用試薬の製造方法を含む。
本発明によれば、正常血漿の凝固の測定の際に適正な範囲の凝固時間と適正な国際感受性指標とを確保することができる新たなプロトロンビン時間測定用試薬およびその製造方法を提供することができる。
試薬キットの構成を説明する図である。 実施例２および比較例２のプロトロンビン時間測定用試薬を用いたときの凝固時間の変化率とトリグリセリドの濃度との関係を示すグラフである。 実施例２および比較例２のプロトロンビン時間測定用試薬を用いたときの凝固時間の変化率とビリルビンＦの濃度との関係を示すグラフである。
１．プロトロンビン時間測定用試薬
本実施形態に係るプロトロンビン時間測定用試薬（以下、「試薬」という）は、リン脂質層を有する第１のリポソームと、第１のリポソームとは異なる組成のリン脂質層を有する第２のリポソームと、組織因子とを含むリポソーム組成物を含有する。第１のリポソームおよび第２のリポソームの少なくとも一方のリン脂質層に組織因子が会合している。第１のリポソームは、ホスファチジルコリン化合物と、ホスファチジルエタノールアミン化合物と、ホスファチジルセリン化合物とを含むリポソームである。また、第２のリポソームは、ホスファチジルコリン化合物およびホスファチジルエタノールアミン化合物からなる群より選ばれた少なくとも１種類のリン脂質を含むリポソームである。
なお、本明細書において、ホスファチジルコリン化合物とは、置換基を有していてもよいホスファチジルコリンをいう。ホスファチジルエタノールアミン化合物とは、置換基を有していてもよいホスファチジルエタノールアミンをいう。ホスファチジルセリン化合物とは、置換基を有していてもよいホスファチジルセリンをいう。
置換基を有していてもよいホスファチジルコリンの置換基としては、例えば、炭素数８〜２０、好ましくは１４〜１８のアシル基などが挙げられるが、特に限定されない。置換基を有していてもよいホスファチジルエタノールアミンの置換基としては、例えば、炭素数８〜２０、好ましくは１４〜１８のアシル基などが挙げられるが、特に限定されない。置換基を有していてもよいホスファチジルセリンの置換基としては、例えば、炭素数８〜２０、好ましくは１４〜１８のアシル基などが挙げられるが、特に限定されない。炭素数８〜２０のアシル基としては、例えば、ラウロイル基、ミリストイル基、パルミトイル基、ステアロイル基、オレオイル基などが挙げられるが、特に限定されない。
ホスファチジルコリン化合物としては、例えば、ホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリンなどのアシル基の炭素数が８〜２０、好ましくは１４〜１８であるジアシルホスファチジルコリンなどが挙げられるが、特に限定されない。これらのホスファチジルコリン化合物のなかでは、アシル基の炭素数が８〜２０であるジアシルホスファチジルコリンが好ましく、ジオレオイルホスファチジルコリンがより好ましい。
ホスファチジルエタノールアミン化合物としては、例えば、ホスファチジルエタノールアミン、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンなどのアシル基の炭素数が８〜２０、好ましくは１４〜１８であるジアシルホスファチジルエタノールアミンなどが挙げられるが、特に限定されない。これらのホスファチジルエタノールアミン化合物のなかでは、アシル基の炭素数が８〜２０であるジアシルホスファチジルエタノールアミンが好ましく、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンがより好ましい。
ホスファチジルセリン化合物としては、例えば、ホスファチジルセリン、ジラウロイルホスファチジルセリン、ジミリストイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、ジステアロイルホスファチジルセリン、ジオレオイルホスファチジルセリンなどのアシル基の炭素数が８〜２０、好ましくは１４〜１８であるジアシルホスファチジルセリンなどが挙げられるが、特に限定されない。これらのホスファチジルセリン化合物のなかでは、アシル基の炭素数が８〜２０であるジアシルホスファチジルセリンが好ましく、ジオレオイルホスファチジルセリンがより好ましい。
第１のリポソームにおいて、ホスファチジルエタノールアミン化合物の質量に対するホスファチジルコリン化合物の質量の割合である［ホスファチジルコリン化合物／ホスファチジルエタノールアミン化合物］は、適正な凝固時間および感度を確保する観点から、好ましくは２．０以上であり、適正な凝固時間および感度を確保する観点から、好ましくは３．０未満、より好ましくは２．９以下である。
第１のリポソームの粒子径は、適正な凝固時間および感度を確保する観点から、通常、好ましくは４００〜６００ｎｍである。なお、本明細書において、「粒子径」の値は、粒子径測定装置〔スペクトリス（株）製、商品名：ゼータサイザーナノＺＳＰ〕を粒子径測定モードで用い、動的光散乱法により、２５℃で測定することによって求められる値である。
本実施形態に係る試薬において、第２のリポソームは、ホスファチジルコリン化合物およびホスファチジルエタノールアミン化合物からなる群より選ばれた少なくとも１種類のリン脂質をリン脂質として含むリン脂質層を有する。第２のリポソームは、リン脂質として、ホスファチジルコリン化合物単独またはホスファチジルエタノールアミン化合物単独を実質的に含むリポソームであってもよく、リン脂質として、ホスファチジルコリン化合物とホスファチジルエタノールアミン化合物とを実質的に含むリポソームであってもよい。
第２のリポソームに用いられるホスファチジルコリン化合物およびホスファチジルエタノールアミン化合物は、第１のリポソームに用いられるホスファチジルコリン化合物およびホスファチジルエタノールアミン化合物と同様である。
第２のリポソームが、リン脂質として、ホスファチジルコリン化合物単独を実質的に含むリポソームである場合、第２のリポソームにおけるホスファチジルコリン化合物の量は、適正な凝固時間および感度を確保する観点から、好ましくは２０ｍｇ／ｍＬ以上、より好ましくは４０ｍｇ／ｍＬ以上であり、適正な凝固時間および感度を確保する観点から、好ましくは１００ｍｇ／ｍＬ以下である。
第２のリポソームが、リン脂質として、ホスファチジルエタノールアミン化合物単独を実質的に含むリポソームである場合、第２のリポソームにおけるホスファチジルエタノールアミン化合物の量は、適正な凝固時間および感度を確保する観点から、好ましくは２０ｍｇ／ｍＬ以上、より好ましくは４０ｍｇ／ｍＬ以上であり、適正な凝固時間および感度を確保する観点から、好ましくは１００ｍｇ／ｍＬ以下である。
第２のリポソームが、リン脂質として、ホスファチジルコリン化合物とホスファチジルエタノールアミン化合物とを実質的に含むリポソームである場合、第２のリポソームにおけるリン脂質の合計量は、適正な凝固時間および感度を確保する観点から、好ましくは２０ｍｇ／ｍＬ以上、より好ましくは４０ｍｇ／ｍＬ以上であり、適正な凝固時間および感度を確保する観点から、好ましくは１００ｍｇ／ｍＬ以下である。
本実施形態に係る試薬において、組織因子は、第１のリポソームおよび第２のリポソームの少なくとも一方のリン脂質層に会合している。第１のリポソームのリン脂質層および第２のリポソームのリン脂質層は、通常、脂質２重層であると考えられる。組織因子は、通常、リン脂質層を貫通した状態でリン脂質層と会合していると考えられる。本実施形態に係る試薬には、以下の態様が包含される：
・ 第１のリポソームのリン脂質層に組織因子が会合しており、第２のリポソームのリン脂質層に組織因子が会合していないリポソーム組成物を含む試薬、
・ 第１のリポソームのリン脂質層に組織因子が会合しておらず、第２のリポソームのリン脂質層に組織因子が会合しているリポソーム組成物を含む試薬、
・ 第１のリポソームのリン脂質層および第２のリポソームのリン脂質層の双方に組織因子が会合しているリポソーム組成物を含む試薬。
組織因子は、トロンボプラスチン（「凝固因子の第ＩＩＩ因子」ともいう）である。組織因子としては、天然由来の組織因子および組換え組織因子が挙げられる。本実施形態に係る試薬においては、組換え組織因子が好ましい。原料の調達が容易であり、安定的に供給されることおよびロット間の性能の差が小さく、測定結果の再現性に優れるからである。
天然由来の組織因子として、例えば、慣用の手法により、種々の動物種の脳、胎盤などから単離された組織因子などを用いることができる。動物種としては、例えば、ヒト、ウサギ、ウシ、サルなどが挙げられるが、特に限定されない、これらの動物種のなかでは、ヒトの血液凝固時間をより的確に測定する観点から、ヒトが好ましい。
組換え組織因子は、例えば、所望の動物種の組織因子をコードするｃＤＮＡを保持する遺伝子組換え生物内で発現させることなどによって得ることができる。また、組換え組織因子は、市販の組換え組織因子であってもよい。組換え組織因子のなかでは、ヒトの血液凝固時間をより的確に測定する観点から、組み換えヒト組織因子が好ましい。組織因子をコードするｃＤＮＡとしてはヒト組織因子をコードするｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００１９９３）、ウシ組織因子をコードするｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿１７３８７８）などが挙げられるが、特に限定されない。遺伝子組換え生物は、例えば、組織因子をコードするｃＤＮＡを保持するベクターを宿主に導入することなどによって得られる。ベクターとしては、例えば、バキュロウイルスベクターＡＢｖおよびＢＥＶＳなどが挙げられるが、特に限定されない。ベクターは、宿主に応じて適宜選択することができる。宿主としては、例えば、カイコ虫体；例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１などの昆虫細胞などが挙げられるが、特に限定されない。宿主へのベクターの導入は、ベクターの種類に応じた方法によって行なうことができる。ベクターがウイルスベクターである場合、宿主へのウイルスベクターの導入は、ウイルスベクターから得られた組換えウイルスを宿主に感染させることによって行なうことができる。発現した組換え組織因子は、例えば、以下の操作などを行なうことによって遺伝子組換え生物から取得することができる。まず、遺伝子組換え生物を破砕して破砕液を得る。得られた破砕液を遠心分離に供して組換え組織因子を含む画分を得る。つぎに、得られた画分を可溶化させて組換え組織因子を含む溶液を得ることができる。
本実施形態に係る試薬に含まれるリン脂質１ｍｇあたりの組織因子の量は、通常、適正な凝固時間および感度を確保する観点から、好ましくは１．６μｇ以上、より好ましくは５．０μｇ以上であり、適正な凝固時間および感度を確保する観点から、好ましくは１６．７μｇ以下、より好ましくは１２．０μｇ以下である。
本実施形態に係る試薬におけるカルシウムイオンの量は、第ＶＩＩ因子を活性化させ、凝固反応を進行させるのに適した量であればよい。本実施形態に係る試薬におけるカルシウムイオンの量は、通常、適正な凝固時間および感度を確保する観点から、好ましくは８ｍＭ以上、より好ましくは１５ｍＭ以上であり、適正な凝固時間および感度を確保する観点から、好ましくは４５ｍＭ以下、より好ましくは３０ｍＭ以下である。
本実施形態に係る試薬は、当該試薬に含まれる組織因子、カルシウムイオンを安定的に保持する観点から、緩衝液をさらに含むことができる。緩衝液としては、例えば、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸〔ＨＥＰＥＳ〕緩衝液、トリス緩衝液などが挙げられるが、特に限定されない。緩衝液のｐＨは、本実施形態に係る試薬に含まれる組織因子、カルシウムイオンを安定的に保持するのに適したｐＨであればよい。緩衝液のｐＨは、適正な凝固時間を確保するとともに安定性を向上させる観点から、好ましくは７以上、より好ましくは７．５であり、適正な凝固時間を確保するとともに安定性を向上させる観点から、好ましくは８．５以下である。
本実施形態に係る試薬は、助剤をさらに含んでいてもよい。助剤としては、例えば、防腐剤、抗酸化剤、賦形剤などが挙げられるが、特に限定されない。防腐剤としては、例えば、アジ化ナトリウムなどが挙げられるが、特に限定されない。抗酸化剤としては、例えば、ブチルヒドロキシアニソールなどが挙げられるが、特に限定されない。腑形剤としては、例えば、アラニン、スクロース、マンニトールなどが挙げられるが、特に限定されない。
本実施形態に係る試薬は、凍結乾燥物であってもよく、凍結乾燥物が溶媒に溶解された溶液であってもよい。
本実施形態に係る試薬における全リポソームの含有量に対する第２のリポソームの含有量は、適正な凝固時間および感度を確保する観点から、好ましくは２０〜７０質量％、より好ましくは３０〜５０質量％である。
本実施形態に係る試薬は、第１のリポソームと、第１のリポソームに含まれるホスファチジルコリン化合物およびホスファチジルエタノールアミン化合物からなる群より選ばれた少なくとも１種類のリン脂質からなる第２のリポソームとをリポソームとして含む。したがって、本実施形態に係る試薬によれば、正常血漿の凝固の測定の際に適正な範囲の凝固時間、具体的には１０．０〜１３．０秒間および適正な国際感受性指標、具体的には１．０±０．２の両方を確保することができる。また、本実施形態に係る試薬は、凝固時間の測定の際に、共存物質による影響を受けにくいという利点を有する。
２．プロトロンビン時間測定用試薬の製造方法
本実施形態に係るプロトロンビン時間測定用試薬の製造方法（以下、「試薬の製造方法」ともいう）は、（Ａ）ホスファチジルコリン化合物と、ホスファチジルエタノールアミン化合物と、ホスファチジルセリン化合物とを用いてリン脂質層を有する第１のリポソームを形成させる工程、
（Ｂ）ホスファチジルコリン化合物およびホスファチジルエタノールアミン化合物からなる群より選ばれた少なくとも１種類のリン脂質を用いて第１のリポソームとは異なる組成のリン脂質層を有する第２のリポソームを形成させる工程、および
（Ｃ）工程（Ａ）で得られた第１のリポソームおよび工程（Ｂ）で得られた第２のリポソームの少なくとも一方のリン脂質層と組織因子とを会合させる工程
を含むプロトロンビン時間測定用試薬の製造方法を含む。
工程（Ａ）では、ホスファチジルコリン化合物と、ホスファチジルエタノールアミン化合物と、ホスファチジルセリン化合物とを用いてリン脂質層を有する第１のリポソームを形成させる。
工程（Ａ）では、まず、ホスファチジルコリン化合物と、ホスファチジルエタノールアミン化合物と、ホスファチジルセリン化合物とをクロロホルムに添加して溶解させ、リン脂質のクロロホルム溶液を得る。リン脂質のクロロホルム溶液における［ホスファチジルコリン化合物／ホスファチジルエタノールアミン化合物］（質量比）は、適正な凝固時間および感度を確保する観点から、好ましくは２．０以上であり、適正な凝固時間および感度を確保する観点から、好ましくは３．０未満、より好ましくは２．９以下である。
つぎに、得られたリン脂質のクロロホルム溶液からクロロホルムを蒸発させことにより、リン脂質の薄膜を形成させる。得られたリン脂質の薄膜をＨＥＰＥＳ緩衝液Ａ〔組成：１５０ｍＭ塩化ナトリウムおよび２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３５）〕で膨潤させ、リン脂質２重層を有する第１のリポソームを形成させる。クロロホルムの蒸発は、例えば、エバポレーターなどを用いることによって行なうことができる。
つぎに、得られた第１のリポソームを含む混合物を、例えば、スターラーなどによって攪拌させる。撹拌速度は、混合物の成分を十分に混合する観点から、通常、４００ｒｐｍ以上、より好ましくは４５０ｒｐｍ以上であり、リポソームの破砕を抑制する観点から、好ましくは６５０ｒｐｍ以下、より好ましくは６００ｒｐｍ以下である。撹拌時間は、リポソームの膨潤を達成するのに十分な時間であればよい。撹拌時間は、通常、好ましくは４５分間以上、より好ましくは６０分間以上であり、好ましくは１２０分間以下、より好ましくは９０分間以下である。
その後、混合物に対し超音波を照射し、分散液を得る。これにより、ホスファチジルコリン化合物と、ホスファチジルエタノールアミン化合物と、ホスファチジルセリン化合物とを含むリン脂質２重層を有する第１のリポソームの分散液が得られる。なお、必要に応じ、分散液に対し、所望の粒子径の第１のリポソームを得るのに適切な孔径を有するメンブランを用い、エクストルーダー処理を施して第１のリポソームの粒子径を均一化させてもよい。超音波の周波数は、混合物の液体成分に対し、第１のリポソームを十分に分散させることができる周波数であればよい。超音波の周波数は、通常、３７〜４０ｋＨｚである。超音波の照射時間は、混合物の液体成分に対し、第１のリポソームを十分に分散させることができる時間であればよい。超音波の照射時間は、通常、５〜２０分間である。
工程（Ｂ）では、リン脂質として、ホスファチジルコリン化合物およびホスファチジルエタノールアミン化合物からなる群より選ばれた少なくとも１種類のリン脂質を用いて前記第１のリポソームとは異なる組成のリン脂質層を有する第２のリポソームを形成させる。
工程（Ｂ）では、まず、ホスファチジルコリン化合物およびホスファチジルエタノールアミン化合物からなる群より選ばれた少なくとも１種類のリン脂質をクロロホルムに添加して溶解させ、リン脂質のクロロホルム溶液を得る。
工程（Ｂ）において、リン脂質の薄膜の形成から第２のリポソームの形成の操作は、工程（Ａ）におけるリン脂質の薄膜の形成から第１のリポソームの形成の操作と同様である。これにより、ホスファチジルコリン化合物およびホスファチジルエタノールアミン化合物からなる群より選ばれた少なくとも１種類のリン脂質を含むリン脂質２重層を有する第２のリポソームの分散液が得られる。
工程（Ｃ）では、工程（Ａ）で得られた第１のリポソームおよび工程（Ｂ）で得られた第２のリポソームの少なくとも一方のリン脂質層と組織因子とを会合させる。
工程（Ｃ）では、まず、第１のリポソームの分散液および／または第２のリポソームの分散液を、組織因子含有溶液に混合し、リポソームと組織因子との混合液を得る。なお、工程（Ｃ）においては、工程（Ａ）で得られた第１のリポソームの分散液と工程（Ｂ）で得られた第２のリポソームの分散液との混合物に組織因子溶液を接触させてもよい。あるいは、工程（Ｃ）では、工程（Ａ）で得られた第１のリポソームの分散液または工程（Ｂ）で得られた第２のリポソームの分散液に組織因子溶液を接触させた後、得られた産物と組織因子溶液と接触させていないリポソームの分散液とを接触させてもよい。
組織因子含有溶液に用いられる溶媒としては、例えば、トリス塩酸緩衝液Ａ〔組成：１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１０質量％グリセロールおよび２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）〕などが挙げられるが、特に限定されない。組織因子含有溶液における組織因子の量は、所望の試薬の種類に応じて適宜決定することができる。組織因子含有溶液における組織因子の量は、通常、適正な凝固時間および感度を確保する観点から、好ましくは０．１μｇ／ｍＬ以上、より好ましくは０．３μｇ／ｍＬ以上であり、適正な凝固時間および感度を確保する観点から、好ましくは１．０μｇ／ｍＬ以下、より好ましくは０．７μｇ／ｍＬ以下である。
組織因子を第１のリポソームのリン脂質層に会合させる場合、第１のリポソームの分散液１ｍＬあたりの組織因子溶液の容量は、第１のリポソーム１ｍｇあたりの組織因子の量が１．６〜１６．７μｇとなる容量であればよい。組織因子を第１のリポソームのリン脂質層および第２のリポソームのリン脂質層の両方に会合させる場合、第１のリポソームの分散液１ｍＬあたりの組織因子溶液の容量は、第１のリポソーム１ｍｇあたりの組織因子の量が１．６〜１６．７μｇとなる容量であればよい。
その後、工程（Ｃ）では、リポソームと組織因子との混合液を、例えば、スターラーなどにより、攪拌させる。これにより、第１のリポソームのリン脂質層および第２のリポソームのリン脂質層の少なくとも一方に組織因子が会合したリポソーム組成物が得られる。撹拌速度は、適正な凝固時間および感度を確保する観点から、好ましくは８５０ｒｐｍ以上、より好ましくは９００ｒｐｍ以上であり、適正な凝固時間および感度を確保する観点から、好ましくは１０５０ｒｐｍ以下、より好ましくは１０００ｒｐｍ以下である。撹拌時間は、リポソームと組織因子とが十分に会合する時間であればよい。撹拌時間は、通常、好ましくは１００時間以上、より好ましくは１４０時間以上であり、好ましくは３００時間以下、より好ましくは２００時間以下である。
工程（Ｃ）で得られたリポソーム組成物には、さらにカルシウム溶液を添加し、得られた混合物を撹拌する。これにより、前述のプロトロンビン時間測定用試薬を得る。また、工程（Ｃ）で得られたリポソーム組成物には、必要により、安定化剤などをさらに添加してもよい。得られたプロトロンビン時間測定用試薬は、適宜凍結乾燥させることができる。カルシウム溶液としては、例えば、塩化カルシウム水溶液などが挙げられるが、特に限定されない。カルシウム溶液におけるカルシウムイオンの濃度は、通常、適正な凝固時間および感度を確保する観点から、好ましくは３７．５ｍＭ以上、より好ましくは５０ｍＭ以上であり、適正な凝固時間および感度を確保する観点から、好ましくは７５ｍＭ以下、より好ましくは６２．５ｍＭ以下である。リポソーム組成物に対するカルシウム溶液の添加量は、試薬におけるカルシウムイオンの量が好ましくは８ｍＭ以上、より好ましくは１５ｍＭ以上となり、好ましくは４５ｍＭ以下、より好ましくは３０ｍＭ以下となる量であればよい。
本実施形態に係る試薬には、当該試薬に含まれる組織因子、カルシウムイオンを安定的に保持する観点から、緩衝液をさらに混合することができる。
３．試薬キット
前述の試薬は、容器に封入された試薬キットとして提供することができる。本実施形態に係る試薬キットの一例を図１に示す。図１に示される試薬キット１０は、試薬２１が入った容器２２と、添付文書３１と、箱４１とを含む。試薬２１は、第１のリポソーム１０１と、第２のリポソーム１０２とを含む。第１のリポソーム１０１のリン脂質層２００には、組織因子２１０が貫通した状態で会合している。本実施形態では、第１のリポソーム１０１のリン脂質層２００は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン２０１とジオレオイルホスファチジルコリン２０２とジオレオイルホスファチジルセリン２０３とから構成されている。本実施形態では、第２のリポソーム１０２は、ジオレオイルホスファチジルコリン２０２からなるリン脂質層からなる。なお、図１に示される実施形態では、第２のリポソーム１０２のリン脂質層には組織因子２１０が会合していないが、第２のリポソーム１０２のリン脂質層に組織因子２１０が結合していてもよい。試薬キット１０には、例えば、希釈用の水系溶媒、対照血漿などが含まれていてもよい。水系溶媒は、血液凝固能の臨床検査に通常用いられる水系溶媒から適宜選択できる。水系溶媒としては、例えば、水、生理食塩水などが挙げられるが、特に限定されない。対照血漿としては、例えば、正常血漿などが挙げられるが、特に限定されない。添付文書３１は、試薬キット１０を用いてプロトロンビン時間の測定を行なう操作手順などの記載を含む。箱４１は、試薬２１が入った容器２２と、添付文書３１とを収容する。
以下において、「リポソームＡ」は前述の第１のリポソームを示す。また、「リポソームＢ」は前述の第２のリポソームを示す。さらに、以下の実施例などにおいて、各略語の意味は、以下のとおりである。
＜略語＞
ＤＯＰＥ： ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン
ＤＯＰＣ： ジオレオイルホスファチジルコリン
ＤＯＰＳ： ジオレオイルホスファチジルセリン
ＰＥ： ホスファチジルエタノールアミン化合物
ＰＣ： ホスファチジルコリン化合物
ＰＳ： ホスファチジルセリン化合物
ＨＥＰＥＳ： ４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸〔４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ〕
ＩＳＩ： 国際感受性指標（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ）
（実施例１および比較例１）
（１）リポソームＡ１の調製
２５ｍｇ／ｍＬリン脂質−クロロホルム溶液Ａ〔ＤＯＰＥ ５１０ｍｇ、ＤＯＰＣ １０２０ｍｇおよびＤＯＰＳ ５１０ｍｇ含有〕をナスフラスコに添加した。つぎに、リン脂質−クロロホルム溶液Ａが入ったナスフラスコをロータリエバポレーターで回転させながら、クロロホルムを蒸発させた。これにより、ナスフラスコの内壁面にリン脂質の薄膜を形成させた。ＨＥＰＥＳ緩衝液Ａ〔組成：１５０ｍＭ塩化ナトリウムおよび２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３５）〕８５０ｍＬを用いてリン脂質の薄膜を膨潤させ、リポソームを含む混合物を得た。つぎに、スターラーを用いて混合物を５００ｒｐｍで６０分間攪拌させた。その後、水浴型超音波装置〔シャープ（株）製、商品名：ＵＴ−３０６Ｈ〕を用い、混合物に対し１５分間３７ｋＨｚの超音波を照射してリポソームＡ１含有液を得た。得られたリポソームＡ１におけるＤＯＰＥ、ＤＯＰＣおよびＤＯＰＳそれぞれの濃度は、０．６ｍｇ／ｍＬ（ＤＯＰＥ濃度）、１．２ｍｇ／ｍＬ（ＤＯＰＣ濃度）および０．６ｍｇ／ｍＬ（ＤＯＰＳ濃度）であった。
（２）リポソームＢ１の調製
ＤＯＰＥ ５１０ｍｇ、ＤＯＰＣ １０２０ｍｇ、ＤＯＰＳ ５１０ｍｇを用いる代わりに、ＤＯＰＣ １２８０ｍｇを用いたことおよびＨＥＰＥＳ緩衝液Ａ ８００ｍＬを用いてリン脂質の薄膜を膨潤させたことを除き、（１）と同様の操作を行ない、リポソームＢ含有液を得た。リポソームＢにおけるＤＯＰＣ濃度は、１．６ｍｇ／ｍＬであった。
（３）プロトロンビン時間測定用試薬の調製
（１）のリポソームＡ１含有液７７５ｍＬと、（２）のリポソームＢ１含有液７７５ｍＬと、５０μｇ／ｍＬ組織因子溶液３１０ｍＬと、ＨＥＰＥＳ緩衝液Ｂ〔組成：２２ｍＭ塩化カルシウム、１ｍＭ塩化マグネシウム、１質量％スクロース、０．１質量％アジ化ナトリウムおよび２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）〕１２４０ｍＬとを混合した。得られた混合物を３７℃に加温しながら、９５０ｒｐｍで８日間撹拌させることにより、リポソームと組織因子とを再構成させ、リポソーム組成物を得た。得られたリポソーム組成物３ＬとＨＥＰＥＳ緩衝液Ｃ〔組成：０．７５ｍＭアラニン、０．０７５ｍＭスクロース、２．５ｍＭ塩化マグネシウム、６０ｍＭ塩化カルシウムおよび２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）〕１２Ｌとを混合した。得られた混合物をバイアルに２ｍＬずつ分注した。バイアル中の混合物を凍結乾燥させ、実施例１のプロトロンビン時間測定用試薬を得た。実施例１の試薬における全リポソームの含有量に対するリポソームＢ１の含有量は、４０質量％であった。
また、（１）のリポソームＡ１含有液７７５ｍＬと、ＨＥＰＥＳ緩衝液Ａ ７７５ｍＬと、５０μｇ／ｍＬ組織因子溶液３１０ｍＬと、ＨＥＰＥＳ緩衝液Ｂ １２４０ｍＬとを混合した。得られた混合物を３７℃に加温しながら、９５０ｒｐｍで８日間撹拌させることにより、リポソームと組織因子とを再構成させ、リポソーム組成物を得た。得られたリポソーム組成物３ＬとＨＥＰＥＳ緩衝液Ｃ １２Ｌとを混合した。得られた混合物をバイアルに２ｍＬずつ分注した。バイアル中の混合物を凍結乾燥させ、比較例１のプロトロンビン時間測定用試薬を得た。
（４）凝固時間の測定およびＩＳＩの算出
（３）のプロトロンビン時間測定用試薬の３ロットそれぞれを精製水４ｍＬに再溶解させ、試薬溶液を得た。
凝固測定装置〔シスメックス（株）製、商品名：ＣＳ−２０００ｉ〕内において、検体50μＬを３７℃で１〜２分間インキュベーションした。つぎに、試薬溶液１００μＬを凝固測定装置内の検体に添加した後、得られた測定試料について、凝固測定装置を用いて波長６６０ｎｍでの透過光量の変化を測定した。なお、検体として、コントロール血漿〔プレシジョン・バイオロジック・インク（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＢｉｏＬｏｇｉｃ Ｉｎｃ．）製、商品名：ＣＲＹＯｃｈｅｃｋ Ｐｏｏｌｅｄ Ｎｏｒｍａｌ Ｐｌａｓｍａ〕およびキャリブレーター〔テクノクローン（Ｔｅｃｈｎｏｃｌｏｎｅ）製、商品名：ＡＫ Ｃａｌｉｂｒａｎｔ〕を用いた。
キャリブレーターの凝固時間の測定値を用い、式（Ｉ）：
ＩＳＩ＝［標準試薬を用いたときのＩＳＩ］×［（評価対象の試薬を用いたときのキャリブレーターの凝固時間の対数）と（標準試薬を用いたときのキャリブレーターの凝固時間の対数）とをプロットして得られた直線の傾き］
（Ｉ）
にしたがってＩＳＩを求めた。
実施例１および比較例１のプロトロンビン時間測定用試薬を用いたときの凝固時間およびＩＳＩを調べた結果を表１に示す。
表１に示された結果から、実施例１のプロトロンビン時間測定用試薬を用いたときのコントロール血漿の凝固時間は、適正な凝固時間の範囲（１０．０〜１３．０）であることがわかった。これに対し、表１に示された結果から、比較例１のプロトロンビン時間測定用試薬を用いたときのコントロール血漿の凝固時間は、適正な凝固時間の範囲（１０．０〜１３．０）から逸脱した範囲の時間であることがわかった。
実施例１のプロトロンビン時間測定用試薬のリポソームＡのリン脂質の組成は、比較例１のプロトロンビン時間測定用試薬にリポソームのリン脂質の組成と同じである。しかし、実施例１のプロトロンビン時間測定用試薬では、リン脂質の組成が異なる２種類のリポソームが含まれている。これに対し、比較例１のプロトロンビン時間測定用試薬では、１種類のリポソームが含まれている。したがって、これらの結果から、実施例１のプロトロンビン時間測定用試薬のリポソームＡと同じリン脂質の組成を有するリポソームを単独で用いても、適正な凝固時間を確保することができないことがわかった。
また、表１に示された結果から、実施例１のプロトロンビン時間測定用試薬を用いたときのＩＳＩは、適正なＩＳＩの範囲（１．０±０．２）であることがわかった。これに対し、表１に示された結果から、比較例２のプロトロンビン時間測定用試薬を用いたときのＩＳＩは、１．３４であり、適正なＩＳＩの範囲から大きく逸脱していることがわかった。したがって、比較例２のプロトロンビン時間測定用試薬は、実用に適した性質を有していないことがわかった。
これらの結果から、実施例１のプロトロンビン時間測定用試薬は、適正な範囲の凝固時間および適正なＩＳＩを確保することができることがわかった。
（実施例２および比較例２）
（１）リポソームＡ２の調製
ＤＯＰＥ １５ｍｇと、ＤＯＰＣ ３０ｍｇと、ＤＯＰＳ １５ｍｇとを含むリン脂質−クロロホルム溶液Ａをガラス製容器に入れた。つぎに、リン脂質−クロロホルム溶液Ａが入ったガラス製容器をローテーター〔アズワン（株）製、商品名：ＭＩＸ ＲＯＴＯＲ ＶＭＲ−５Ｒ〕で回転させながら、クロロホルムを蒸発させた。これにより、ガラス製容器の内壁面にリン脂質の薄膜を形成させた。ＨＥＰＥＳ緩衝液Ａ ２５ｍＬを用いてリン脂質の薄膜を膨潤させ、リポソームＡ２を含む混合物を得た。つぎに、スターラーを用いて混合物を５００ｒｐｍで６０分間攪拌させた。その後、水浴型超音波装置〔シャープ（株）製、商品名：ＵＴ−３０６Ｈ〕を用い、混合物に対し１５分間超音波を照射してリポソームＡ２含有液を得た。得られたリポソームＡ２におけるＤＯＰＥ、ＤＯＰＣおよびＤＯＰＳそれぞれの濃度は、０．６ｍｇ／ｍＬ（ＤＯＰＥ濃度）、１．２ｍｇ／ｍＬ（ＤＯＰＣ濃度）および０．６ｍｇ／ｍＬ（ＤＯＰＳ濃度）であった。
（２）リポソームＢ２の調製
ＤＯＰＥ １５ｍｇ、ＤＯＰＣ ３０ｍｇおよびＤＯＰＳ １５ｍｇを用いる代わりに、ＤＯＰＣ ４０ｍｇを用いたことを除き、（１）と同様の操作を行ない、リポソームＢ２含有液を得た。リポソームＢ２におけるＤＯＰＣ濃度は、１．６ｍｇ／ｍＬであった。
（３）プロトロンビン時間測定用試薬の調製
（１）のリポソームＡ２含有液２０ｍＬと、（２）のリポソームＢ２含有液２０ｍＬと、５０μｇ／ｍＬ組織因子溶液８ｍＬと、ＨＥＰＥＳ緩衝液Ｂ ３２ｍＬとを混合した。得られた混合物を３７℃に加温しながら、６５０ｒｐｍで撹拌させることにより、リポソームと組織因子とを再構成させ、リポソーム組成物を得た。得られたリポソーム組成物を得た。得られたリポソーム組成物８０ｍＬとＨＥＰＥＳ緩衝液Ｃ ３２０ｍＬとを混合した。得られた混合物をバイアルに２ｍＬずつ分注した。バイアル中の混合物を凍結乾燥させ、実施例２のプロトロンビン時間測定用試薬を得た。実施例２の試薬における全リポソームの含有量に対するリポソームＢ２の含有量は、４０質量％であった。
また、（１）のリポソームＡ２含有液２０ｍＬと、５０μｇ／ｍＬ組織因子溶液８ｍＬとをＨＥＰＥＳ緩衝液Ｂ ３２ｍＬに添加した。得られた混合物を３７℃に加温しながら、６５０ｒｐｍで撹拌させることにより、リポソームと組織因子とを再構成させ、リポソーム組成物を得た。得られたリポソーム組成物を得た。得られたリポソーム組成物６０ｍＬと、ＨＥＰＥＳ緩衝液Ａ ２０ｍＬと、ＨＥＰＥＳ緩衝液Ｃ ３２０ｍＬとを混合した。得られた混合物をバイアルに２ｍＬずつ分注した。バイアル中の混合物を凍結乾燥させ、比較例２のプロトロンビン時間測定用試薬を得た。
（４）凝固時間に対するトリグリセリドの影響
実施例２のプロトロンビン時間測定用試薬および比較例２のプロトロンビン時間測定用試薬を用い、トリグリセリドを含む検体またはトリグリセリドを含まない検体を用いたことを除き、実施例１および比較例１の（４）と同様の操作を行ない、凝固時間を測定した。つぎに、トリグリセリドを含まない検体の凝固時間に対するトリグリセリドを含む検体の凝固時間の変化率を求めた。なお、トリグリセリドを含む検体は、以下のように調製した。まず、正常血漿〔シスメックス（株）製、商品名：コアグトロールＩＸ〕とトリグリセリド含有液〔日本製薬（株）製、商品名：イントラファット注２０％〕とを、正常血漿／トリグリセリド（体積比）が９．５／０．５となるように混合し、サンプルＡを得た。また、正常血漿と生理食塩水とを、正常血漿／生理食塩水（体積比）が９．５／０．５となるように混合し、サンプルＢを得た。つぎに、サンプルＡとサンプルＢとをサンプルＡ／サンプルＢ（体積比）が１／９となるように混合し、トリグリセリド濃度１００ｍｇ／ｄＬの検体を得た。また、サンプルＡとサンプルＢとをサンプルＡ／サンプルＢ（体積比）が１／４となるように混合し、トリグリセリド濃度２００ｍｇ／ｄＬの検体を得た。なお、サンプルＢを、トリグリセリドを含まない検体（トリグリセリド濃度０ｍｇ／ｄＬの検体）とした。
実施例２および比較例２のプロトロンビン時間測定用試薬を用いたときの凝固時間の変化率とトリグリセリド濃度との関係を調べた結果を図２に示す。図中、白丸は実施例２のプロトロンビン時間測定用試薬を用いたときの凝固時間の変化率とトリグリセリド濃度との関係、黒丸は比較例２のプロトロンビン時間測定用試薬を用いたときの凝固時間の変化率とトリグリセリド濃度との関係を示す。
図２に示された結果から、実施例２のプロトロンビン時間測定用試薬を用いたときの凝固時間の変化率は、比較例２のプロトロンビン時間測定用試薬を用いたときの凝固時間の変化率よりも小さいことがわかった。したがって、これらの結果から、リポソームＡと、リポソームＡに含まれるＰＣからなるリポソームＢとをリポソームとして含むプロトロンビン時間測定用試薬は、血漿に含まれる共存物質のトリグリセリドによる影響を受けにくいことがわかった。
（５）凝固時間に対するビリルビンＦ濃度の影響
実施例２のプロトロンビン時間測定用試薬および比較例２のプロトロンビン時間測定用試薬を用い、ビリルビンＦを含む検体を用いたことを除き、実施例１および比較例１の（４）と同様の操作を行ない、凝固時間を測定した。つぎに、ビリルビンＦを含まない検体の凝固時間に対するビリルビンＦを含む検体の凝固時間の変化率を求めた。なお、ビリルビンＦを含む検体は、以下のように調製した。まず、正常血漿〔シスメックス（株）製、商品名：コアグトロールＩＸ〕とビリルビンＦ含有液〔シスメックス（株）製、商品名：干渉チェックＡプラス〕とを、正常血漿／ビリルビンＦ（体積比）が８／２となるように混合し、サンプルＡを得た。また、正常血漿と生理食塩水とを、正常血漿／生理食塩水（体積比）が８／２となるように混合し、サンプルＢを得た。つぎに、サンプルＡとサンプルＢとをサンプルＡ／サンプルＢ（体積比）が表２に示される体積比となるように混合し、ビリルビンＦを含む検体を得た。サンプルＢを、ビリルビンＦを含まない検体（ビリルビンＦ濃度０ｍｇ／ｍＬの検体）とした。
実施例２および比較例２のプロトロンビン時間測定用試薬を用いたときの凝固時間の変化率とビリルビンＦ濃度との関係を調べた結果を図３に示す。図中、白丸は実施例２のプロトロンビン時間測定用試薬を用いたときの凝固時間の変化率とビリルビンＦ濃度との関係、黒丸は比較例２のプロトロンビン時間測定用試薬を用いたときの凝固時間の変化率とビリルビンＦ濃度との関係を示す。
図３に示された結果から、実施例２のプロトロンビン時間測定用試薬を用いたときの凝固時間の変化率は、比較例２のプロトロンビン時間測定用試薬を用いたときの凝固時間の変化率よりも小さいことがわかった。したがって、これらの結果から、リポソームＡと、リポソームＡに含まれるＰＣからなるリポソームＢとをリポソームとして含むプロトロンビン時間測定用試薬は、血漿に含まれる共存物質のビリルビンＦによる影響を受けにくいことがわかった。
（実施例３〜７および比較例３）
（１）リポソームＡ３およびＡ４の調製
ＤＯＰＥ １５ｍｇと、ＤＯＰＣ ３０ｍｇと、ＤＯＰＳ １５ｍｇとを含むリン脂質−クロロホルム溶液Ａをガラス製容器に入れた。つぎに、リン脂質−クロロホルム溶液Ａが入ったガラス製容器をローテーター〔アズワン（株）製、商品名：ＭＩＸ ＲＯＴＯＲ ＶＭＲ−５Ｒ〕で回転させながら、クロロホルムを蒸発させた。これにより、ガラス製容器の内壁面にリン脂質の薄膜を形成させた。ＨＥＰＥＳ緩衝液Ａ ２５ｍＬを用いてリン脂質の薄膜を膨潤させ、リポソームＡ３を含む混合物を得た。つぎに、スターラーを用いて混合物を５００ｒｐｍで６０分間攪拌させた。その後、水浴型超音波装置〔シャープ（株）製、商品名：ＵＴ−３０６Ｈ〕を用い、混合物に対し１５分間超音波を照射してリポソームＡ３含有液を得た。得られたリポソームＡ３におけるＤＯＰＥ、ＤＯＰＣおよびＤＯＰＳそれぞれの濃度は、０．６ｍｇ／ｍＬ（ＤＯＰＥ濃度）、１．２ｍｇ／ｍＬ（ＤＯＰＣ濃度）および０．６ｍｇ／ｍＬ（ＤＯＰＳ濃度）であった。
また、ＤＯＰＥ １５ｍｇ、ＤＯＰＣ ３０ｍｇおよびＤＯＰＳ １５ｍｇを用いる代わりに、ＤＯＰＥ １５ｍｇ、ＤＯＰＣ ７０ｍｇおよびＤＯＰＳ １５ｍｇを用いたことを除き、リポソームＡ３の調製と同様の操作を行ない、リポソームＡ４含有液を得た。リポソームＡ４におけるにおけるＤＯＰＥ、ＤＯＰＣおよびＤＯＰＳそれぞれの濃度は、０．６ｍｇ／ｍＬ（ＤＯＰＥ濃度）、２．８ｍｇ／ｍＬ（ＤＯＰＣ濃度）および０．６ｍｇ／ｍＬ（ＤＯＰＳ濃度）であった。
（２）リポソームＢ３〜Ｂ７の調製
ＤＯＰＥ １５ｍｇ、ＤＯＰＣ ３０ｍｇおよびＤＯＰＳ １５ｍｇを用いる代わりに、ＤＯＰＣ ２０ｍｇを用いたことを除き、（１）のリポソームＡ３の調製と同様の操作を行ない、リポソームＢ３含有液を得た。リポソームＢ３におけるＤＯＰＣ濃度は、０．８ｍｇ／ｍＬであった。
ＤＯＰＥ １５ｍｇ、ＤＯＰＣ ３０ｍｇおよびＤＯＰＳ １５ｍｇを用いる代わりに、ＤＯＰＣ ４０ｍｇを用いたことを除き、（１）のリポソームＡ３の調製と同様の操作を行ない、リポソームＢ４含有液を得た。リポソームＢ４におけるＤＯＰＣ濃度は、１．６ｍｇ／ｍＬであった。
ＤＯＰＥ １５ｍｇ、ＤＯＰＣ ３０ｍｇおよびＤＯＰＳ １５ｍｇを用いる代わりに、ＤＯＰＣ ６０ｍｇを用いたことを除き、（１）のリポソームＡ３の調製と同様の操作を行ない、リポソームＢ５含有液を得た。リポソームＢ５におけるＤＯＰＣ濃度は、２．４ｍｇ／ｍＬであった。
ＤＯＰＥ １５ｍｇ、ＤＯＰＣ ３０ｍｇおよびＤＯＰＳ １５ｍｇを用いる代わりに、ＤＯＰＣ ８０ｍｇを用いたことを除き、（１）のリポソームＡ３の調製と同様の操作を行ない、リポソームＢ６含有液を得た。リポソームＢ６におけるＤＯＰＣ濃度は、３．２ｍｇ／ｍＬであった。
ＤＯＰＥ １５ｍｇ、ＤＯＰＣ ３０ｍｇおよびＤＯＰＳ １５ｍｇを用いる代わりに、ＤＯＰＣ １００ｍｇを用いたことを除き、（１）のリポソームＡ３の調製と同様の操作を行ない、リポソームＢ７含有液を得た。リポソームＢ７におけるＤＯＰＣ濃度は、４．０ｍｇ／ｍＬであった。
（３）プロトロンビン時間測定用試薬の調製
リポソームＡ１含有液２０ｍＬと、５０μｇ／ｍＬ組織因子溶液８ｍＬと、ＨＥＰＥＳ緩衝液Ｂ ３２ｍＬとを混合した。得られた混合物を３７℃に加温しながら、６５０ｒｐｍで撹拌させることにより、リポソームと組織因子とを再構成させ、リポソーム組成物を得た。得られたリポソーム組成物６０ｍＬと、リポソームＢ３含有液２０ｍＬと、ＨＥＰＥＳ緩衝液Ｃ ３２０ｍＬとを混合した。得られた混合物をバイアルに２ｍＬずつ分注した。バイアル中の混合物を凍結乾燥させ、実施例３のプロトロンビン時間測定用試薬を得た。実施例３の試薬における全リポソームの含有量に対するリポソームＢ３の含有量は、２５質量％であった。
リポソームＢ３含有液を用いる代わりに、リポソームＢ４含有液（実施例４）、リポソームＢ５含有液（実施例５）、リポソームＢ６含有液（実施例６）またはリポソームＢ７含有液（実施例７）を用いたことを除き、実施例３と同様の操作を行ない、実施例４〜７のプロトロンビン時間測定用試薬を得た。実施例４の試薬における全リポソームの含有量に対するリポソームＢ４の含有量は、４０質量％であった。実施例５の試薬における全リポソームの含有量に対するリポソームＢ５の含有量は、５０質量％であった。実施例６の試薬における全リポソームの含有量に対するリポソームＢ６の含有量は、５７質量％であった。実施例７の試薬における全リポソームの含有量に対するリポソームＢ７の含有量は、６３質量％であった。
リポソームＡ２含有液２０ｍＬと、５０μｇ／ｍＬ組織因子溶液８ｍＬと、ＨＥＰＥＳ緩衝液Ａ ２０ｍＬと、ＨＥＰＥＳ緩衝液Ｂ ３２ｍＬとを混合した。得られた混合物を３７℃に加温しながら、６５０ｒｐｍで撹拌させることにより、リポソームと組織因子とを再構成させ、リポソーム組成物を得た。得られたリポソーム組成物を得た。得られたリポソーム組成物８０ｍＬと、ＨＥＰＥＳ緩衝液Ｃ ３２０ｍＬとを混合した。得られた混合物をバイアルに２ｍＬずつ分注した。バイアル中の混合物を凍結乾燥させ、比較例３のプロトロンビン時間測定用試薬を得た。
（４）凝固時間の測定およびＩＳＩの算出
実施例３〜７および比較例３のプロトロンビン時間測定用試薬を用いたことを除き、実施例１および比較例１の（４）と同様の操作を行ない、凝固時間の測定およびＩＳＩの算出を行なった。
実施例３〜７および比較例３のプロトロンビン時間測定用試薬を用いたときの凝固時間およびＩＳＩを調べた結果を表３に示す。
表３に示された結果から、リン脂質としてＤＯＰＣを含むリポソームＢを含む実施例３〜７のプロトロンビン時間測定用試薬を用いたときの凝固時間およびＩＳＩは、リポソームＢにおけるＤＯＰＣの含有量の如何を問わず、いずれも、適正な凝固時間およびＩＳＩであることがわかった。しかし、リン脂質としてＤＯＰＣを含むリポソームＢを含まず、リポソームＡにおけるＤＯＰＣの含有量が多い比較例３のプロトロンビン時間測定用試薬のＩＳＩは、適正なＩＳＩの範囲から逸脱していることがわかった。したがって、これらの結果から、リポソームＡと、リポソームＡに含まれるＰＣからなるリポソームＢとをリポソームとして含むプロトロンビン時間測定用試薬によれば、適正な凝固時間およびＩＳＩを確保することができることがわかった。
（実施例８〜１０および比較例４）
（１）リポソームＡ５の調製
ＤＯＰＥ １５ｍｇと、ＤＯＰＣ ３０ｍｇと、ＤＯＰＳ １５ｍｇとを含むリン脂質−クロロホルム溶液Ａをガラス製容器に入れた。つぎに、リン脂質−クロロホルム溶液Ａが入ったガラス製容器をローテーター〔アズワン（株）製、商品名：ＭＩＸ ＲＯＴＯＲ ＶＭＲ−５Ｒ〕で回転させながら、クロロホルムを蒸発させた。これにより、ガラス製容器の内壁面にリン脂質の薄膜を形成させた。ＨＥＰＥＳ緩衝液Ａ ２５ｍＬを用いてリン脂質の薄膜を膨潤させ、リポソームＡ５を含む混合物を得た。つぎに、スターラーを用いて混合物を５００ｒｐｍで６０分間攪拌させた。その後、水浴型超音波装置〔シャープ（株）製、商品名：ＵＴ−３０６Ｈ〕を用い、混合物に対し１５分間超音波を照射してリポソームＡ５含有液を得た。得られたリポソームＡ５におけるＤＯＰＥ、ＤＯＰＣおよびＤＯＰＳそれぞれの濃度は、０．６ｍｇ／ｍＬ（ＤＯＰＥ濃度）、１．２ｍｇ／ｍＬ（ＤＯＰＣ濃度）および０．６ｍｇ／ｍＬ（ＤＯＰＳ濃度）であった。
（２）リポソームＢ８〜Ｂ１１の調製
ＤＯＰＥ １５ｍｇ、ＤＯＰＣ ３０ｍｇおよびＤＯＰＳ １５ｍｇを用いる代わりに、ＤＯＰＥ ４０ｍｇを用いたことを除き、（１）のリポソームＡ５の調製と同様の操作を行ない、リポソームＢ８含有液を得た。リポソームＢ８におけるＤＯＰＥ濃度は、１．６ｍｇ／ｍＬであった。
ＤＯＰＥ １５ｍｇ、ＤＯＰＣ ３０ｍｇおよびＤＯＰＳ １５ｍｇを用いる代わりに、ＤＯＰＥ ２０ｍｇおよびＤＯＰＣ ２０ｍｇを用いたことを除き、（１）のリポソームＡ５の調製と同様の操作を行ない、リポソームＢ９含有液を得た。リポソームＢ９におけるＤＯＰＥおよびＤＯＰＣそれぞれの濃度は、０．８ｍｇ／ｍＬおよび０．８ｍｇ／ｍＬであった。
ＤＯＰＥ １５ｍｇ、ＤＯＰＣ ３０ｍｇおよびＤＯＰＳ １５ｍｇを用いる代わりに、ＤＯＰＣ ４０ｍｇを用いたことを除き、（１）のリポソームＡ５の調製と同様の操作を行ない、リポソームＢ１０含有液を得た。リポソームＢ１０におけるＤＯＰＣ濃度は、１．６ｍｇ／ｍＬであった。
ＤＯＰＥ １５ｍｇ、ＤＯＰＣ ３０ｍｇおよびＤＯＰＳ １５ｍｇを用いる代わりに、ＤＯＰＳ ４０ｍｇを用いたことを除き、（１）のリポソームＡ５の調製と同様の操作を行ない、リポソームＢ１１含有液を得た。リポソームＢ１１におけるＤＯＰＳ濃度は、１．６ｍｇ／ｍＬであった。
（３）プロトロンビン時間測定用試薬の調製
（１）のリポソームＡ５含有液２０ｍＬと、（２）のリポソームＢ８含有液２０ｍＬと、５０μｇ／ｍＬ組織因子溶液８ｍＬと、ＨＥＰＥＳ緩衝液Ｂ ３２ｍＬとを混合した。得られた混合物を３７℃に加温しながら、９５０ｒｐｍで８日間撹拌させることにより、リポソームと組織因子とを再構成させ、リポソーム組成物を得た。得られたリポソーム組成物８０ｍＬとＨＥＰＥＳ緩衝液Ｃ３２０ｍＬとを混合した。得られた混合物をバイアルに２ｍＬずつ分注した。バイアル中の混合物を凍結乾燥させ、実施例８のプロトロンビン時間測定用試薬を得た。実施例８の試薬における全リポソームの含有量に対するリポソームＢ８の含有量は、４０質量％であった。
リポソームＢ８含有液を用いる代わりに、リポソームＢ９含有液（実施例９）、リポソームＢ１０含有液（実施例１０）またはリポソームＢ１１含有液（比較例４）を用いたことを除き、実施例８と同様の操作を行ない、実施例９〜１０および比較例４のプロトロンビン時間測定用試薬を得た。実施例９の試薬における全リポソームの含有量に対するリポソームＢ９の含有量は、４０質量％であった。実施例１０の試薬における全リポソームの含有量に対するリポソームＢ１０の含有量は、４０質量％であった。比較例４の試薬における全リポソームの含有量に対するリポソームＢ１１の含有量は、４０質量％であった。
（４）凝固時間の測定およびＩＳＩの算出
実施例８〜１０および比較例４のプロトロンビン時間測定用試薬を用いたことを除き、実施例１および比較例１の（４）と同様の操作を行ない、凝固時間の測定およびＩＳＩの算出を行なった。
実施例８〜１０および比較例４のプロトロンビン時間測定用試薬を用いたときの凝固時間およびＩＳＩを調べた結果を表４に示す。
表４に示された結果から、リポソームＢを構成するリン脂質がＤＯＰＥ単独（実施例８）、ＤＯＰＣとＤＯＰＥとの混合物(実施例９)またはＤＯＰＣ単独（実施例１０）であるプロトロンビン時間測定用試薬の凝固時間およびＩＳＩは、いずれも、適正な凝固時間およびＩＳＩであることがわかった。したがって、これらの結果から、リポソームＡと、リポソームＡに含まれるＰＥおよびＰＣからなる群より選ばれた少なくとも１種類のリン脂質からなるリポソームＢとをリポソームとして含むプロトロンビン時間測定用試薬によれば、適正な凝固時間およびＩＳＩを確保することができることがわかった。
以上説明したように、本実施形態に係るプロトロンビン時間測定用試薬によれば、第１のリポソームと、第１のリポソームに含まれるホスファチジルコリン化合物およびホスファチジルエタノールアミン化合物からなる群より選ばれた少なくとも１種類のリン脂質からなる第２のリポソームとをリポソームとして含むので、正常血漿の凝固時間の測定の際に適正な凝固時間およびＩＳＩを確保することができ、しかも共存物質による影響を受けにくいことが示唆された。
１０ 試薬キット
２１ 試薬
２２ 容器
３１ 添付文書
４１ 箱
１０１ 第１のリポソーム
１０２ 第２のリポソーム
２００ リン脂質
２０１ ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン
２０２ ジオレオイルホスファチジルコリン
２０３ ジオレオイルホスファチジルセリン
２１０ 組織因子

Claims (11)

  1. リン脂質層を有する第１のリポソームと、前記第１のリポソームとは異なる組成のリン脂質層を有する第２のリポソームと、組織因子とを含むリポソーム組成物を含有し、
    前記第１のリポソームおよび第２のリポソームの少なくとも一方のリン脂質層に前記組織因子が会合しており、
    前記第１のリポソームが、ホスファチジルコリン化合物と、ホスファチジルエタノールアミン化合物と、ホスファチジルセリン化合物とを含むリポソームであり、
    前記第２のリポソームが、ホスファチジルコリン化合物およびホスファチジルエタノールアミン化合物からなる群より選ばれた少なくとも１種類のリン脂質を含むリポソームである
    ことを特徴とするプロトロンビン時間測定用試薬。
  2. 前記第１のリポソームにおける前記ホスファチジルエタノールアミン化合物の質量に対する前記ホスファチジルコリン化合物の質量の割合が３．０未満である請求項１に記載の試薬。
  3. 前記試薬における全リポソームの含有量に対する第２のリポソームの含有量が２０〜７０質量％である請求項１または２に記載の試薬。
  4. 前記ホスファチジルコリン化合物が、アシル基の炭素数が８〜２０であるジアシルホスファチジルコリンであり、前記ホスファチジルエタノールアミン化合物が、アシル基の炭素数が８〜２０であるジアシルホスファチジルエタノールアミンであり、前記ホスファチジルセリン化合物が、アシル基の炭素数が８〜２０であるジアシルホスファチジルセリンである請求項１〜３のいずれか１項に記載の試薬。
  5. 前記ホスファチジルコリン化合物が、ジオレオイルホスファチジルコリンであり、前記ホスファチジルエタノールアミン化合物が、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンであり、前記ホスファチジルセリン化合物が、ジオレオイルホスファチジルセリンである請求項１〜４のいずれか１項に記載の試薬。
  6. 前記組織因子が組換え組織因子である請求項１〜５のいずれか１項に記載の試薬。
  7. 前記組換え組織因子が組換えヒト組織因子である請求項６に記載の試薬。
  8. カルシウムイオンをさらに含む請求項１〜７のいずれか１項に記載の試薬。
  9. （Ａ）ホスファチジルコリン化合物と、ホスファチジルエタノールアミン化合物と、ホスファチジルセリン化合物とを用いてリン脂質層を有する第１のリポソームを形成させる工程、
    （Ｂ）ホスファチジルコリン化合物およびホスファチジルエタノールアミン化合物からなる群より選ばれた少なくとも１種類のリン脂質を用いて前記第１のリポソームとは異なる組成のリン脂質層を有する第２のリポソームを形成させる工程、および
    （Ｃ）前記工程（Ａ）で得られた第１のリポソームおよび前記工程（Ｂ）で得られた第２のリポソームの少なくとも一方のリン脂質層と組織因子とを会合させる工程
    を含むプロトロンビン時間測定用試薬の製造方法。
  10. 工程（Ｃ）において、前記工程（Ａ）で得られた第１のリポソームと前記工程（Ｂ）で得られた第２のリポソームとの混合物に組織因子を接触させる請求項９に記載の方法。
  11. 工程（Ｃ）において、前記工程（Ａ）で得られた第１のリポソームまたは前記工程（Ｂ）で得られた第２のリポソームに組織因子を接触させる請求項９に記載の方法。
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