CN101410049A

CN101410049A - 用于检验凝血的方法和设备

Info

Publication number: CN101410049A
Application number: CNA2007800112607A
Authority: CN
Inventors: 劳斯特姆·F·伊斯马吉洛夫; 克里斯蒂安·J·卡斯特鲁普; 马修·K·鲁尼恩; 海伦·宋; 沈峰
Original assignee: University of Chicago
Current assignee: University of Chicago
Priority date: 2006-01-31
Filing date: 2007-01-31
Publication date: 2009-04-15
Also published as: EP1983889A4; JP2009528509A; US20090104637A1; WO2007089777A2; WO2007089777A3; EP1983889A2

Abstract

本发明提供了一种用于检验血液凝结活性的设备。所述设备包括输入血液流体的入口和导管中的材料的两个以上的补块。所述材料能够在血液流体中引发凝结途径。本发明还提供了一种用于测量凝块增长的设备，所述设备包括带有能够引发凝结途径的材料的区域和对凝块增长进行监测的区域。本发明还提供了一种检验血液凝结活性的方法，所述方法包括检验凝血途径的完整性，检验物质对凝血途径完整性的影响，监测凝块增长和避免凝块从一个导管到另一个导管的增长。

Description

用于检验凝血的方法和设备

相关申请的交叉引用

本发明要求2006年1月31日提交的序列号为60/763,574的美国临时专利申请的优先权。

政府利益

本发明创造时得到美国政府的支持(NSF资助的授权号CHE0349034；ONR PECASE资助的授权号N00014-03-1-0482；和YIP(青年研究员项目，Young Investigators Program)资助的授权号N000140610630)。美国政府可在本发明中具有一定的权益。

技术领域

本发明涉及用于检验凝血的方法和装置的领域。

背景技术

止血是指使出血停止的过程。止血是控制凝血的复杂的生物化学网络的结果。该网络的主要功能之一是促使血管受伤的部位引发凝血并使血凝局部化。当该网络无法正确地发挥其功能时可能引起导致大出血的过度出血，或者相反，可能造成过度的凝块增长，这将导致血栓形成并因此引起心脏病发作和中风。因此，在正确的位置中引发血凝块的形成并维持局部性凝结响应对该网络的功能是必要的。然而，调控该响应的机制仍远未得到表征，在美国，与凝血异常有关的疾病仍是死亡的第一主因。

进行诊断凝血异常的实验应该包括体内存在的相关时空参数。这些参数包括：i)包含见于血管表面上和血管损害区域中的分子的异质表面，ii)模拟血管几何形状的通道，和iii)类似于体内所观察到的血流。引入这些参数的临床实验会更精确地诊断与凝血有关的疾病，而且可以减少与这些疾病有关的死亡数量。然而，用以诊断与凝血有关的疾病的现行临床实验并不包括这些时空参数。这些方法包括：i)活化部分促凝血酶原激酶时间(APTT)测试，ii)凝血酶原时间(PT)测试，和iii)血小板凝集率。缺乏时空参数，这些临床测试可能造成误诊或甚至不能诊断。因此，需要用于诊断与凝血有关的疾病的新的临床方法。

发明内容

本发明提供了一种用于检验凝结活性的设备。在一个实施方式中，所述设备包括输入血液流体的入口、与所述入口以流体连通的导管(vessel)、和所述导管中的至少两个补块(patch)。每个所述补块包括与来自受试对象的血液流体接触时能够引发凝结途径的激活材料。一个所述补块中的所述激活材料不同于另一个所述补块中的所述激活材料；或一个所述补块在所述激活材料的浓度上不同于另一个所述补块；或一个所述补块具有不同于另一个所述补块的表面积；或一个所述补块具有不同于另一个所述补块的形状；或一个所述补块具有不同于另一个所述补块的尺寸。

所述设备可以包含多个补块。在该实例中，一组补块之间的距离不同于另一组补块之间的距离。

所述设备可以包括与所述导管中的表面联合的多个补块，其中第一组补块在第一位置而第二组补块在第二位置，并且其中第一组补块的数量不同于第二组补块的数量。激活材料可以包括选自由以下凝结刺激物组成的组中的至少一种凝结刺激物：组织因子、因子II、因子XII、因子X、玻璃、玻璃样物质、高岭土、硫酸葡聚糖、细菌和细菌组分。

所述设备可以包括珠子，其中所述补块与所述珠子联合。所述设备可以包括作为珠子的补块。所述补块还可以包括惰性材料。

所述设备的导管可以包括两个相交的微通道，所述微通道彼此流体连通。

本发明提供了一种检验凝血的方法。所述方法包括使来自受试对象的血液流体与至少两个补块接触，其中每个所述补块包括与来自受试对象的血液流体接触时能够引发凝结途径的激活材料。一个所述补块中的激活材料不同于另一个所述补块中的激活材料；或一个所述补块在所述激活材料的浓度上不同于另一个所述补块；或一个所述补块具有不同于另一个所述补块的表面积；或一个所述补块具有不同于另一个所述补块的形状；或一个所述补块具有不同于另一个所述补块的尺寸。所述方法包括确定哪些补块引发来自所述受试对象的血液流体的凝结。

当实施所述方法的时候，所述激活材料可以能够在来自健康受试对象的血液流体中引发凝结途径。所述接触保持一段足以至少让最大的补块在来自健康受试对象的血液流体中引发凝结途径的时间。所述方法可以用尺寸可以不同的第一补块和第二补块实施，或用激活材料可以不同的第一补块和第二补块实施。同样，第一补块和第二补块中的激活材料的浓度可以不同。

所述方法也可以包括使来自受试对象的血液流体与第三补块和第四补块接触，其中所述补块与表面联合，并且所述第一补块和第二补块之间的距离不同于所述第二补块和第三补块之间的距离。

所述方法可以以每补块单独地与珠子联合来实施。每个珠子的或者尺寸或者形状可以不同。同时，所述方法可以以凝结途径为血小板凝集途径的方式来实施。

使来自受试对象的血液流体与补块接触可以包括首先使第一量的血液流体与第一浓度的珠子进行第一接触，和使第二量的血液流体与第二浓度的珠子进行第二接触，其中各珠子独立地与含有激活材料和惰性材料的补块联合。可以用尺寸逐渐增大的珠子滴定血液流体的等分试样。所述血液流体可以作为连续流与补块接触。作为选择，血液流体可以以通过非混溶性质所区分开的液滴的形式与补块相接触。所述导管还可以是微流体通道。

测定哪些补块引发凝结可以包括光学观测。所述光学观测可以包括测量光的散射。

所述方法可以以所述血液流体为选自由全血和血浆组成的组的血液流体的方式实施。

所述方法可以包括首先将过量的凝结因子加入到血液流体中然后使血液流体与补块接触。所述方法可以包括将测试物质加入到血液流体中然后使血液流体与补块接触。所述方法可以包括监测血凝块的增长速度。所述方法也可以包括将来自不同受试对象的血液流体加入到所述血液流体然后使所述血液流体与补块接触。

本发明提供了用于测量凝块增长的设备。所述设备包括包含激活材料的第一区域和与所述第一区域连通的适用于监测凝块增长的第二区域。当血液流体被放在第一区域时，凝块形成并增长至所述第二区域。

所述设备可以包括包含激活材料的补块。所述设备可以包括包含第一区域和第二区域的微通道。作为选择，所述设备可以包括多个平行的微通道，每个微通道包含第一区域和第二区域。

所述设备可以包括至少一组交叉的微通道，其中第二区域处在第一组微通道的交叉点处。所述设备可以包括多个微通道和所述微通道的至少两个交叉点，其中第二区域位于其中的一个交叉点处，并且其中两个交叉点的尺寸不同。

本发明提供了监测凝块增长的方法，所述方法包括以下步骤：使血液流体与所述设备的第一区域接触(所述第一区域包含激活材料)，和监测所述设备的第二区域内的凝块增长(其中所述第二区域与所述第一区域连通)。

附图说明

图1是扩散和反应之间的竞争的示意图，所述竞争决定凝结的引发是否会在给定的补块上发生。

图2所示的图片和曲线图描述在没有流动的情况下通过微流体通道的血凝块的增长的测量结果。

图3所示的图片和曲线图描述导管-至-导管结合部如何能够用来评价血凝块增长的阈值。

图4所示的基于简单的化学机理的曲线图描述用于凝结引发的数值模拟。

图5描述化学模型和血浆中的引发的比例换算关系，其中显示所述引发如何响应凝结刺激物即组织因子(TF)的量。

图6所示的图片和曲线图描述人类血浆的凝结引发如何响应相同面积的表面补块的形状。

图7所示的图片描述简化的反应-扩散体系的数值模拟如何证明对形状的响应。

图8所示的图片和曲线图描述构造到模仿止血的简化化学体系如何响应提供相同面积的刺激物的表面补块的形状。

图9是以化学模型试验装置的示意图。

图10图示了描述速率方程的速率图如何被引入模块化机制的数值模拟中的曲线图。

图11是显示示出模型中引发“凝结”的概率的数值模拟如何显示对补块尺寸的阈值响应。

图12示意性描述用于血浆和全血实验中的微流腔室。

图13描述所产生的酸的量如何取决于补块的总表面积。

图14描述化学模型中的pH敏感颜料在光致酸表面上的荧光强度谱的定量。

图15描述血浆凝结的引发的定量。

图16描述阵列上血浆凝结的引发的定量。

图17所示的图片和曲线图描述人类血浆和简单的化学模型如何都能引发凝结并且对提供凝结刺激物的补块的尺寸具有阈值响应。

图18所示的图片和曲线图描述化学模型如何正确地预测人类血浆中凝结的体外引发依赖于空间分布而不是依赖于提供组织因子(TF，一种凝结的激活剂)的脂质表面的总表面积。

图19所示的图片描述化学模型如何正确地预测人类血浆凝结的引发能在通过扩散连通的子阈值补块的紧密簇(tight cluster)上发生。

图20所示的图片描述化学模型如何正确地预测借助第二(因子XII)途径进行的凝结的引发。

图21是所提议的在高(a)和低(b)剪切速率下通过两个导管的结合部调控凝块增长的机制的示意图。

图22是对

的阈值如何通过所述结合部调控凝块增长的示图。

图23是通过结合部的凝块增长如何在结合部而不是在“膜瓣”处受到

的调控。

图24描述通过结合部的凝块增长如何能够通过加入抑制剂而发生改变。

图25是监测在流动的情况下通过结合部的凝块增长的实验程序的示图。

图26是显示用于在流动的情况下通过结合部的凝块增长的装置的实际几何形状和尺寸的示意图。

图27是用于测定APTT和用于滴定阿加曲班的基于栓塞的微流装置的示图。

图28描述在使用疏水性侧通道的微流装置中的溶合。

图29是亲水性玻璃毛细管如何插入侧通道内的示图和显示如何通过流速控制注入到栓塞内的体积的图表。

图30是使用亮视野显微术检查的示图和全血的栓塞内所观察的凝块的图表。

图31描述使用明视野和荧光显微术检查的图片和富含血小板的血浆(PRP)的栓塞内形成纤维蛋白凝块的图表。

图32所示的曲线图描述在将阿加曲班滴定到血样中的同时在23℃时凝血酶生成和APTT的测量结果。

图33所示的曲线图描述在将阿加曲班滴定到(a)所汇集的正常血浆、(b)供体血浆中的同时在37℃时的APTT测量结果，以及APTT(c)的对应值及(d)APTT比率的对应值。

图34描述在没有流动的情况下可用来并行监测多个血样的凝块增长的装置的一个实例。

图35描述能用来监测凝结的三个方面的装置的实例：i)引发，ii)没有流动的情况下的增长，和iii)流动血样中的增长。

图36是用于检验以下假设的实验的示意图，即，重要的是单独补块的尺寸p而不是总表面区。

图37是用于检验以下假设的实验的示意图，即，亚阈值补块群在一起靠近到足以通过扩散来连通时会引发凝结。

图38描述能够快速表征个人的凝结势(clotting potential)的系统的示意图。

具体实施方式

为了有助于对本发明原理的理解，现在将参考本发明的某些优选的实施方式，而且将使用特定的术语来描述所述实施方式。然而应当理解的是并没有任何要藉此限定本发明范围的意思。在此描述的本发明的原理的任何改变、进一步的改进和应用均认为是本发明所属技术领域的技术人员通常会想到的。

血液的凝固是一个复杂的过程，在这一过程中，血液形成固体凝块。血液凝固是止血(使从受损血管失血停止)的一个重要部分，由此使纤维蛋白凝块覆盖受损血管壁从而使流血停止并有助于受损血管的恢复(在Davie，2003，J.Biol.Chem.278：50819-50832；Nemerson，1988，Blood71：1-8中的综述)。简而言之，血管受伤时，血小板附着在内皮下组织中的大分子上，然后聚集形成原初止血栓塞。所述血小板刺激血浆凝结因子的局部激活，导致形成能加固所述血小板聚集体的纤维蛋白凝块。在所述凝结级联中，所述“接触激活”途径(也称之为“内在”途径)和组织因子途径(也称之为“外在”途径)导致纤维蛋白形成。当伤口愈合时，所述血小板聚集体和纤维蛋白凝块被破坏掉。将血小板聚集体和纤维蛋白凝块限制性形成于受伤位置处对于保持血液流动是必须的。

本发明提供了一种能用于测量表面上血液流体凝结时间的设备(也称为装置)。能采用诸如湿式和干式蚀刻和/或其他传统平版印刷术或微机械加工技术(如软平版印刷术)制作或制造所述设备。如此处所使用，术语“设备”包括那些被称为，已知为或者分类为微制作装置的设备。

在一个实例中，本发明的设备可具有每边约0.3cm～约15cm和厚度约1μm～约1cm的尺度，但所述设备的尺度也可在这些范围之外。所述设备可由各种材料制成，并且通常由诸如聚合物、金属、玻璃、复合物或其他较为惰性的材料等合适的材料制成。所述设备的表面可以是光滑的或者具有图案的。所述设备的不同侧可具有不同的表面。

在一个实施方式中，本发明的设备包括输入血液流体的入口、与所述入口以流体连通的导管、和所述导管中的至少一个补块。所述补块包括能在与诸如来自受试者的血液流体等样品相接触时引发凝结途径的凝结刺激物(也称为“激活材料”)。所述补块也可包括惰性材料。所述惰性材料可与所述激活材料相混合。

所述设备的表面可含有凝血刺激物，包括所述外在凝结途径的激活剂和所述内在凝结途径的激活剂。

例如，表面可包括能引发所述外在凝结途径的凝结刺激物，诸如组织因子(TF)。表面可包括能引发所述内在凝结途径的凝结刺激物，诸如玻璃、玻璃样物质、高岭土、细菌组分、硫酸葡聚糖、淀粉样蛋白β、鞣花酸、和其他人工表面。

所述凝结刺激物是能引发凝结的任何表面。广泛已知的引发凝结的表面包括带负电荷的表面(Gailani和Broze，1991，Science 253：909)和结合有凝结因子的表面(Mann，1999，Thrombosis and Haemostasis 82：165)。已知能引发凝结的带负电荷的表面包括玻璃、硫酸葡聚糖和细菌组分(Persson等，2003，J.Biological Chemistry 278：31884)。已知在与表面结合时能引发凝结的凝结因子包括组织因子、因子XII、因子X和因子II(Kop等，1984，J.Biological Chemistry 259：3993；Mann，1999，Thrombosis andHaemostasis 82：165)。此外，许多细胞提供能作为刺激物的表面(Mann等，1990，Blood 76：1)。

所述设备可包含一种类型的血液凝结刺激物。作为另外一种选择，所述设备可包含两种以上的刺激物。在所述表面上每种刺激物的浓度可变。例如，凝结刺激物可以在生理浓度、药物相关浓度、超生理浓度(supraphysiological concentration)或亚生理浓度(subphysiological concentration)使用。两种以上的刺激物可相互混合。所述刺激物可以在溶液中。所述刺激物也可以在栓塞中。使用栓塞的技术在以下美国专利和专利申请中描述，在此以参考的方式引入：US 7,129,091B2；US 2006/0003439A1；US 2006/0094119A1和US 2005/0087122A1。

一种以上的刺激物可与其他物质、惰性物质、载体、药物等相混合。例如，在一个优选实施方式中，重新脂化的TF能以1pmol/L～1000pmol/L(在5～5000nmol/L磷脂囊泡(PCPS)中)的浓度使用。PCPS可由例如25％来自牛脑的磷脂酰丝氨酸(PS)和75％来自蛋黄的磷脂酰胆碱(PC)构成。当TF在囊泡溶液中时，TF在所述囊泡溶液中的优选浓度是约0.10nM～约1000nM。作为另外一种选择，可以使用DLPC/PS/Texas

DHPE(79.5/20/0.5摩尔百分比)混合囊泡和在1×HEPES-缓冲生理盐水/Ca²⁺缓冲液中浓度为0.1mg/mL～100mg/mL的重构TF。当在补块中使用TF时，优选TF浓度为约0.0001fmol/cm²～约1.0fmol/cm²。同样，对于在补块中使用TF，优选0.01nM～1000nM的TF终浓度。

包含一种以上刺激物的补块可并入到所述装置的表面，并且通常所述表面是惰性的，或者是很大程度上是惰性的。补块中的凝结刺激物浓度是可变的。因此，所述设备的表面可具有多个不同形状、尺寸、刺激物类型和刺激物浓度的补块。在一个实例中，用具有相同或不同补块面积的不同形状的刺激物的补块在表面上形成图案。

所述补块的形状和尺寸可变。所述补块的形状和尺寸的三维考虑包括所述补块的几何形状和尺度考虑。在一个实例中，所述补块可具有对称的或规则的形状(例如圆形、方形、矩形、三角形、星形等)。作为另外一种选择，所述补块在尺寸和形状上可以是不规则的。表面上的补块的数量和密度是可变的。优选为，所述表面的约1％被补块覆盖。所述补块可位于微流体通道的壁上。

在某些实施方式中，所述设备能以通道的形式制造。优选的是，当所述设备以通道的形式制造时，所述设备是微通道。在其他实施方式中，所述设备可具有其中已集成有补块的经制造通道(导管)。在一个实施方式中，设备可包括两个以上提供流体连通的相互连接的通道。所述通道可具有不同的诸如长度、宽度、厚度、深度等尺度和几何形状，并且也可具有不同形式的横截面，包括方形、矩形、三角形、圆形横截面等。

在一个实施方式中，本发明提供了包括一个以上通道的设备。例如，这样的设备可以制造为具有微工程化通道的微流装置的形式。当所述装置具有至少一个以上的通道时，所述通道的横截面可以相同或不同。所述通道可以提供相同或不同的流速。所述通道可以是平行的，相互成角度的或者所述通道可以相交。所述通道可具有结合部，其可被用以评估凝块增长。优选的是，所述结合部是三方向结合部(具有三条臂的结合部)，诸如Y型结合部或T型结合部。所述臂能提供相同的流速。作为另外一种选择，所述臂能提供不同的流速，在此情况下，其中一条臂通常具有不同的直径。刺激物可加入到所述通道中，优选为在所述结合部加入到所述通道中。

在另一实施方式中，本发明提供了包括沿通道的一个以上补块的设备。所述设备也可包括至少两条通道。在该实例中，补块可沿一条或多条通道放置。

在一个实施方式中，本发明提供了具有流过具有至少两个通道的设备的连续样品流的设备。在该实施方式中，流体可流过一条通道，而样品借助另一条通道引入。例如，所述流体可包括添加剂、凝结刺激物、药物，或者所述流体可以是载体流体。

在一个实施方式中，所述补块可以在小珠上。作为另外一种选择，所述小珠本身可以是补块。在另一个实施方式中，本发明提供了具有在小珠上的补块的设备，所述小珠流过具有至少一个结合部的通道。

在一个实施方式中，在所述样品被引入后没有流动。这可以例如使用疏水玻璃毛细管实现。可以引入样品而无需将所述流体泵入所述设备。作为另外一种选择，所述样品可以通过注射加入。

可以将测试物质引入到所述设备中。能监测所述测试物质对血液凝结和/或血液增长的作用。所述测试物质可以是候选药物、小分子、有机或无机分子、聚合物、核酸、肽、蛋白质、化合物库的一员、拟肽等。所述测试物质可以在血液与补块接触前和/或接触后加入。

在另一个实施方式中，本发明提供了具有一条以上通道的设备，所述通道具有装着各种刺激物的栓塞和用于将样品引入栓塞的入口部。所述设备可包括至少一个用于促进凝结的结合部。

具有补块的设备可采用本领域内已知的方法进行制造，例如在Zheng等，2004，Advanced Materials 16：1365-1368；Delamarche等，2005，Advanced Materials 17：2911-2933；Sia和Whitesides，2003，Electrophoresis24：3563-3576；Unger等，2000，Science 288：113-116中所描述。这些文献在此为所有目的以参考的方式整体引入。在一个实施方式中，所述设备可至少部分地由弹性材料制造，并且通过单层或多层软平版印刷(MSL)技术和/或牺牲层封装法进行制造。基本的MSL法包括在微加工模具上铸造一系列弹性层，从所述模具上移除所述层，然后将所述层融合在一起。在牺牲层封装法中，在需要通道的所有地方沉积光致抗蚀剂图案。

可通过多种方法制成所需形状的补块，包括但不局限于：1)可通过在受支撑的脂质膜上微图案形成法制造补块(Groves和Boxer，2002，Accounts Chem.Res.35：149-157)；2)可采用光刻术制造所述补块。使用光刻术，可以由在惰性脂质背景中的重构TF制成补块(Yee等，2004，J.Am.Chem.Soc.126：13962-13972；Yu等，2005，Advanced Materials17：1477-1480)。使用光刻术，可以由在惰性疏水性玻璃背景中的亲水性玻璃制成补块(Howland等，2005，J.Am.Chem.Soc.127：6752-6765)；3)可采用扫描探针平版印刷术制备补块(Jackson和Groves，2004，J.Am.Chem.Soc.126：13878-13879)；4)采用将小滴喷到表面上的诸如喷墨印刷技术或类似技术可将补块印刷在表面上(Steinbock等，1995，Science269：1857-1860)；5)可采用微接触印刷术制备所述补块(Xia和Whitesides，1998，Annual Review of Materials Science，28：153-184)；6)补块可以与小珠联合，其中采用上述或其他方法形成图案，或者可以具有均匀的表面组成并且没有图案。

为了在含有一种以上凝结刺激物的表面上发生凝结，所述表面的尺寸必须大于一定尺寸阈值。根据本发明，关于血液凝结的“补块尺寸阈值”指引发血液凝结的补块尺寸的下限。不同形状的补块(例如方形或星形)具有不同的阈值，即凝结势。并且，改变所述补块的尺度(例如矩形补块的长宽比)将导致不同的凝结势。因此，所述补块形状将决定是否能发生凝结。所述补块的厚度或深度通常在约1nm～约1μm的范围内。所述补块也可以是具有约1nm～约1mm的宽度的小珠。

为了更好的描述本发明，可以根据所述补块上相互距离最远的两点间的最大距离表示所述补块尺寸。例如，圆形形式的补块的补块尺寸等于该圆形的直径。方形形式的补块的补块尺寸等于该方形的对角线。通常，可用于实践本发明的补块的尺寸具有约0.01μm～约500μm的尺寸阈值。优选的是，所述补块尺寸阈值小于约100μm。也可用的是将补块尺寸表示为所述补块的面积。这对于比较不同形状的补块是特别有用的。优选的是，所述补块的面积为约1μm²～约1mm²。

可用于实践本发明的补块包括小于所述补块尺寸阈值的补块；这些补块也称为“亚阈值”补块。所述补块尺寸阈值取决于刺激物的浓度、药物浓度和血液供体。优选的是，采用具有约1μm～大于1cm的尺寸的补块进行凝结测量。采用纳米图案化技术，可以在纳米尺度上测量凝结的引发。

相互靠近的一群亚阈值补块将引发凝结。在会发生凝结的亚阈值补块间的距离接近于所述补块尺寸阈值。

例如，对于特定的血液样品和刺激物浓度，所述补块尺寸阈值可以是75μm。倘若如此，大于75μm的补块将快速引发凝结，反之小于75μm的补块则不会。当相互距离250μm时，50μm的补块将不会引发凝结，但相距25μm时则将引发凝结。

所述补块可包含各种添加剂，诸如一种以上标签、报道分子、荧光分子、染料(例如pH敏感、凝血酶敏感)、微生物(例如细菌、病毒)、药物、蛋白质、代谢物、金属离子、凝血因子、促凝结因子或药物、抗凝结因子或药物、纤溶因子或药物，或其他化合物。这些化合物可以包埋、冻干、偶联或者以任何其他方式与所述补块联合。为了使测试可视化，这些化合物可在本发明的某些优选的实施方式，例如在某些检验中使用以测试外部加入的物质对血液凝结等的影响。在给定补块中任一这些化合物的浓度可变。可以将多于一种的如此化合物加入到补块中。任一这些化合物可以加入到一个以上的补块中。当在溶液中监测凝结时也可以加入添加剂。

改变所述补块中指定凝结刺激物的浓度将以可预测的方式改变所述补块尺寸阈值。同样，改变凝结抑制药物的浓度也将以特定方式影响所述补块尺寸阈值。使用来自不同供体(包括带有不健康血液的供体)的血流将以可预测的方式给出不同的补块尺寸阈值。同样，所述补块尺寸阈值随刺激物浓度和所加入的药物而变化。

如果一组小补块靠近在一起，小补块能引发凝结。补块间的距离可在约0.01μm～约500μm的范围内变化。优选的是，补块间的距离小于约100μm。至少有两个补块的第一组中最靠近的成员之间的距离可以与至少有两个补块的第二组中最靠近的成员之间的距离不同。

在一些实施方式中，所述补块能单独使用，而在其他实施方式中，一些补块可与其他相似或不相似的补块共同配合使用。因此，在该设备的一个实施方式中，具有相似或不相似的刺激物的补块可加入到惰性背景中。

具有补块的表面可悬浮在溶液中。以及，表面可形成为微粒或小珠。因此，可用于实践本发明的补块可与微粒或小珠联合。作为另外一种选择，所述补块可以是三维立体的并且采用微粒或小珠的形式。所述微粒或小珠的尺寸和形状可变。

本发明的设备可用于各种检验，包括：(i)检验血液凝结；(ii)检验凝块增长；(iii)检验血液凝结途径的完整性；(iv)检验物质对血液凝结途径的完整性的影响；(v)检验以防凝块由一根导管增长至另一根导管。

通常而言，本发明的方法包括将样品与根据本发明描述的补块相接触。受检验的样品优选为全血或血流(含血的流体，例如血浆)，但可以还包括血液组分、血浆蛋白溶液和来自于血液的细胞溶液。所述样品可获得自多个受试对象，包括人和非人类动物诸如大鼠、小鼠和斑马鱼。优选的是，所述样品获得自人类。

所述样品可获得自单一试样。作为另外一种选择，所述样品可获得自多个试样。来自多个试样或多个受试对象的样品可在与补块接触前相混合；作为另外一种选择，来自多个试样或多个受试对象的样品可顺序与所述补块相接触。所述样品可获得自健康人类或者非人类受试对象。所述样品可替代性地获得自不健康的人类或非人类受试对象。也可能的是将获得自健康受试对象和不健康受试对象的样品相混合并在所述检验中使用所述混合物。以及，可能的是以任何顺序依次地加入来自健康或者不健康受试对象的补块样品。

所述样品可包含各种添加剂，诸如一种以上标签、报道分子、荧光分子、染料(例如pH敏感、凝血酶敏感)、微生物(例如细菌、病毒)、药物、蛋白质、代谢物、金属离子、凝血因子、促凝血因子或药物、抗凝血因子或药物、纤溶因子或药物，或其他化合物。为了使反应或血液凝块增长可视化，这些化合物可在本发明的某些优选的实施方式，例如在某些检验中使用以测试外部加入的物质对血液凝结等的影响。在所述样品中任一这些化合物的浓度可变。任一这些化合物可以加入到与一个以上的补块相接触的一种以上的样品中。也可能的是包括向补块和样品加入相同或不同的添加剂。

使所述样品与所述补块相接触。所述样品可放置在所述补块上。例如，所述样品可被移液到所述补块上或者使用毛细管输送至所述补块。所述样品能连续地流过所述表面，由此接触一个以上的补块。作为另外一种选择，所述样品可放置在其将与所述补块相接触的表面上。以及，所述补块可放到样品中，从而使所述样品与所述补块相接触。

与补块相接触的样品量可变。通常，每1×10⁶μm²的补块面积使用约20μl～约100μl的样品。优选的是，每1×10⁶μm²的补块面积使用约50μl的样品。

本发明的设备的一个实施方式可用在测量个人血液凝结的潜力的方法中。可根据凝结的时间或可能性确定所述潜力，其中一个以上的以下参数可以发生变化：刺激物浓度；补块的尺寸；补块的浓度；补块间的距离；补块的形状；微粒的尺寸；微粒的形状；补块的浓度；刺激物的类型；血液流的流速；诸如药物、金属离子、凝结因子等添加物的浓度；以及正常血液流体的加入。这些的实例在下文中示出。

在一个实例中，本发明提供了用于测量凝结时间的方法。测量已与所述补块相接触的样品的凝结时间。由所述样品的、所述补块的或者二者的光学性质的变化，可光学观察血液或血液流体的凝结。在一个方面，所述光学性质可以是颜色、吸光度、荧光、反射系数或化学发光的变化。也可以在检验中的单个时刻或多个时刻测量所述光学性质。也可通过测量光从所述样品、所述补块或者二者中的散射而检测所述凝结时间。可以比较样品间的凝结时间，或者与完全没有补块的表面上的凝结时间进行比较。

一旦引发凝结之后，凝块增长的能力可通过在不同的补块和表面上，和在不同的通道(导管)中的凝块增长速度而测定。例如，所述凝块的前沿增长的速度可被测定并表示为随时间变化的距离。

可以在流动条件下测量凝块增长。作为另外一种选择，可以在没有流动的条件下测量凝块增长。

图21～26描述了对通过结合部的凝块增长的调控。凝块增长根据在所述结合部有流动血液的导管(流动导管)中的剪切速率，

而停止或继续；同样，通过结合部的凝块增长受到在所述结合部处的剪切速率，

的调控。

可为了多种原因而采用检验血液凝结，包括：(i)确定受试对象的血液凝结潜力；(ii)筛选凝结刺激物的效果；(iii)筛选将影响凝结引发、形成和增长的候选药物；和(iv)筛选可影响凝结引发、成形和增长的药物浓度。

可采用本发明的方法对血液凝结的引发进行检验。血液凝结的引发显示了对补块尺寸的阈值响应。在一个实例中，本发明提供了基于达姆科勒数(number)的标度律以描述表面刺激物的补块上的凝结引发(Kastrup等，2006，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103：15747-15752)。因此，凝结的引发取决于在所述补块上形成激活剂的反应时间尺度(t_r)和激活剂从所述补块上扩散运输出的扩散时间尺度(t_D)(图1)。所述达姆科勒数Da＝t_D/t_r的量级决定于所述补块的直径p。小的p对应于小的t_D和小的Da，这是因为快速发生激活剂扩散离开所述补块的情况，相反，大的p对应于大的t_r和大的Da，这是因为激活剂需要长时间从所述补块的中心扩散至边缘。当t_r快而t_d慢时，在Da大时发生凝结引发。很好地确定了标度公式，t＝x²/D，其中将时间t、距离x和对于特定分子的扩散系数D关联在一起，并且所述公式可用于预测引发血液凝结所需的补块尺寸阈值p_tr。在具有常数t_r的特定表面上，激活剂分子在反应进行前扩散的距离应当几乎与所述p_tr的直径相同。即，反应发生需要一定量的时间(t_r)，而在一些临界补块直径(p_tr)，分子可在反应发生前扩散离开所述补块。因此p_tr应当根据

p_tr＝(D×t_r)^1/2

而用t_r ^1/2标度。

其中，p是所述补块的直径，而t_r是反应时间尺度。

图1描述了激活剂的扩散(D箭头)和反应(R箭头)之间的竞争如何确定是否在指定补块(p)上发生凝结的引发。在该实例中的补块表示为在方形表面上以透视图显示的圆形。扩散的时间尺度取决于补块尺寸，而反应的时间尺度与补块尺寸无关。当所述补块的直径P较大时，反应在竞争中超过扩散，而将发生引发。当所述补块的直径p较小时，扩散快速地将激活剂从所述补块上移除，在竞争中超过反应，而不会发生引发。

在涉及本发明的设备和方法的各种应用中，包括有观察和测量阈值响应(其中包括增长波和前缘)以开发诊断工具和发现药物。可采用补块、具有图案的表面或者栓塞，或者通过组合一个以上的补块、具有图案的表面和栓塞完成阈值响应的观察和测量。

当测量在补块上引发血液凝结的阈值时，可以通过在含有全血或血浆的具有不同表面化学和不同补块尺寸的小珠或微粒中进行滴定，并监测凝结引发对小珠/微粒组成的依赖性从而完成该测量。例如，所述补块可以位于悬浮在所述血液流体中的小珠上。血液流体的等分试样可用数目不断增加的小珠进行滴定。血液流体的等分试样可用尺寸不断增大的小珠进行滴定。所述血液流体可以作为连续流输送到所述补块。所述血液流体可以作为由不混溶性流体隔开的栓塞输送到所述补块。

本发明提供了用于检验凝块根据所述剪切速率由一个导管增长至另一导管的方法。所述剪切速率描述了随着与表面距离的增加，局部流速V[m s^-1]的变化。所述剪切速率决定了在接近表面的所有方向上的运输。在压力驱动的流动中，在表面的局部流速，V[m s^-1]为零。

本发明还提供了测量凝块增长速率，以及确定与凝块形成和增长相关的疾病如何改变该血液凝块增长速度的方法。这些血液凝结失调或疾病包括血友病、遗传性出血性失调、活化蛋白C抵抗、von Willbrand氏病和血凝过快。已知减慢凝块增长的凝血因子缺陷的实例是因子VIII(fVIII)、因子X(fX)和因子XI(fXI)(Ovanesov等，2005，J.Thromb.Haemost 3：321-331)。这些因子缺陷与以下出血性疾病相关：fVIII缺陷导致血友病A，fX缺陷导致Stuart-Prower病，而fXI缺陷导致血友病C。本发明的方法也可用于检验来自于正在接受可影响血液凝结的药物治疗的受试者的样品。

本发明可用于筛选能影响凝块增长的药物。例如，可向所述样品、所述补块或者同时向所述样品和所述补块中加入凝血酶抑制剂、血栓调节蛋白、其他凝血抑制剂或其混合物。以及，所述方法可包括在将所述血液流体暴露于所述补块之前将血栓调节蛋白或其他抑制剂加入到所述样品中。凝血抑制剂预计能降低所述凝块增长，并且可进行本发明的检验以更好地表征这些化合物的作用。作为另外一种选择，向所述补块或所述样品加入的添加剂可包括一种以上的血液凝结因子。以及，所述方法可包括在将所述血液流体暴露于所述补块之前将过量的凝血因子加入到受试对象血液流体中。凝血因子预计能提高所述凝块增长，并且可进行本发明的检验以更好地表征这些化合物的作用。

本发明提供了检验血液凝结途径的完整性的方法。所述血液凝结途径可以是血小板聚集途径。本发明还提供了检验物质对血液凝结途径的完整性的影响的方法。

本发明还提供了确定来自不同血液样品的凝块如何增长的方法。此外，本发明提供了确定血液流动的存在如何影响血液凝块增长的方法。在一个实例中，本发明提供了确定不同的通道几何形状如何改变血液凝块增长的方法。测量受试对象血液的血液凝结的增长对不同尺寸的结合部的易受影响性，这也可用于评估特定的药物浓度的有效性，或者用于检测在所述凝结过程中所涉及的特定酶和蛋白质的异常。特定血液样品增长通过不同尺寸的结合部的能力取决于血液中的所述药物浓度和特定酶的活性。

本发明还提供了能用于检测不同药物和其他分子，和/或不同浓度的天然生成的蛋白对血液凝块增长速率的影响的方法。测量存在或者不存在特定药物的情况下血液凝块生长的速率可用于确定凝块将生长得如何。例如，采用本发明的方法，可证明凝血酶抑制剂能防止凝块增长通过处于低于剪切速率阈值的通道结合部。作为另外一种选择，含有各种刺激物和浓度的补块可用以对此进行测试。

本发明提供了检验以防凝块由一个导管增长至另一导管的方法。本发明的设备可用通道形式的补块制备，或者用结合在相互流体连通的流体通道的表面里的补块制备。所述通道的几何形状可经过制造使得可以测量一定范围内的凝结活性。诸如血液流体等样品随之与所述补块相接触。然后监测凝块增长通过处于低于剪切速率阈值的通道结合部的速率。如果需要，也可以加入各种物质以进一步观察所加入的物质对凝块增长通过所述通道结合部的作用。

本发明具有比已知用于检验血液凝结的方法优越的一项或多项以下优点：能使用更小体积的样品；由于自动化试剂混合使得样品制备最少；引发血小板聚集以及因此凝结时间的实时观察的可能；混合速度是可控的。

预期的是本发明的方法和装置除了能够检测血液凝结之外还能用于检测其他生物途径的活性。例如，可以测试某人的体液在补块上引发免疫应答的潜力。在该实例中，体液样品与含有一种以上抗原(例如微生物、细菌、病毒等)的补块相接触。监测对于引发的补块尺寸阈值可用于检测诸如在细菌表面簇的存在下所述免疫应答的引发等事件。

预期的是本发明的方法和装置能用于检测包括除血液或血浆之外的流体的样品中生物途径的活性。例如，用含有细菌的溶液能测试引发群体感应(quorum sensing)所需的高丝氨酸内酯的量。监测用除血液之外的溶液引发的补块尺寸阈值可用于检测诸如引发阿尔茨海默氏症途径所必需的淀粉样蛋白β的量，引发癫痫发作所必需的神经元损伤的量，并且可用于小量细菌的检测等事件。

应当理解本发明并非局限于所描述的具体方法学、方案、受试对象或试剂，并且同样都可以变化。还应当理解的是此处所使用的术语仅是为了描述特定实施方式的目的，并非旨在限制本发明的范围，而本发明的范围仅由所述权利要求进行限定。提供以下实施例以进行描述，但并非限制所要求的发明。

实施例

采用数值模拟进行自催化体系的标度预测利用人类血浆进行了试验性测试和验证。采用三维数值模拟验证了所述标度预测对于简单的自催化体系是可行的，所述体系在刺激物的补块上被激活，并具有与已知的血液凝结组分相同标度的速率和扩散常数。该简单的自催化体系是基于由本发明人提出的止血模块机制(Runyon等，2004，Angew.Chem.Int.Edit.43：1531)。简单的自催化体系在这里是指基于高阶的激活剂自催化形成和低阶的激活剂消耗之间的竞争从而表现出阈值响应的体系。该形成与消耗之间的竞争建立了至少两个稳态，一个稳定而另一个不稳定。所述不稳定的稳态出现在所述浓度阈值，在所述浓度阈值以上时，激活剂的形成快于消耗。

所述机制由三个相互作用的模块构成：激活剂的自催化形成，激活剂的线性消耗和激活剂在高浓度下的沉淀(或凝结)。形成和消耗的相互作用在所述体系中建立了两个稳态，在低浓度激活剂下的稳定稳态，和在高浓度激活剂下的不稳定稳态。通常，激活剂的浓度保持在所述稳定的稳态附近，然而，所述激活剂浓度的较大扰动将推动所述体系至所述不稳定的稳态，此时激活剂将增强并引发沉淀。此处，所述模拟假设该溶液相自催化体系位于含有刺激物补块的表面上，以及激活剂的反应和由所述补块扩散进入溶液。使用商业软件进行模拟(FEMLAB，COMSOL，瑞典)。

图2描述了贯穿无流动的微流体通道的连续不变的凝块生长(增长)。图2A是模拟受损血管的微流体通道的荧光显微图像。在该图像中，由于PC：俄勒冈绿(惰性脂类)的脂单层而观察到绿色荧光。由于所述表面(凝结激活表面)上的单层的DMPC:PS:含TF:VIIa复合物的德克萨斯红而观察到红色荧光。图2B描述了在60×60μm²无流动的微流体通道中连续凝块生长的时移荧光显微图。用对α-凝血酶具有特异性的荧光底物监测凝结。图2C是描述在三个不同通道尺寸下的相似凝块生长速度(V_f)的图。在所有情况下，V_f在30～40μm min^-1之间。

图3显示了描述导管-至-导管结合部如何能用于评估血液凝块增长阈值的显微图。图3A显示了凝块向小(20μm×20μm)导管结合部生长的时间序列图。在此微流设计中，在所述结合部的小通道的宽度小于所述结合部尺寸阈值，从而停止凝块生长。图3B显示了凝块向大(100μm×100μm)导管结合部生长的时间序列图。在此微流设计中，在所述结合部的小通道的宽度大于所述结合部尺寸阈值，从而凝块继续生长进入所述较大导管。图3C描述了对受试对象血浆的结合部尺寸阈值的量化。对于该血浆，所述结合部尺寸阈值为约40μm～75μm。

图4显示了基于简单化学机制的凝结引发的数值模拟。图4a描绘了引发时间相对于(vs.)补块尺寸的曲线。每条曲线对应于在图例中指示的特定t_r。图4b描述了p_tr相对于t_r的图如何显示了1/2次幂的标度关系并且验证了所述标度预测。

测定了来自刺激物均匀表面的多个形成速率的t_r值。当p对每个t_r发生变化时，发现存在补块尺寸阈值，如图4a所示。对于每个t_r，观察到特定值的p_tr。当p＞p_tr时，引发血液凝结，当p＜p_tr时，没有引发血液凝结。

在不同组的试验中，对简单非线性化学体系验证了该预测的准确性。所述模型是由三个反应构成的简单易兴奋(全有-或-全无)体系。所述激活剂是H⁺。在该体系中的引发对应于通过所述表面上大量形成酸而由碱性环境转变为酸性环境。通过照射所述表面上的光致酸分子而形成酸。通过光掩模选择性地照射部分所述表面而形成酸补块。通过调节所述照射的强度并由此调节在表面上形成酸，从而获得不同的t_r值。

图5描述了引发血液凝结的标度关系。在图5a中显示的是所述化学模型的p_tr相对于t_r的图。显示在5b中的是血液样品的p_tr相对于t_r的图。对于每个t_r值，观察到特定的p_tr值。p_tr相对于t_r的图显示了1/2次幂标度关系(图5a)并且实验性地验证了所述标度关系。

血液凝结可视为易兴奋体系。在这样的体系中的引发导致形成高浓度的诸如凝血酶等激活剂，以及随后形成坚固的凝块。体内形成激活剂的刺激物是组织因子(TF)。为确定所述标度预测是否适用于血液凝结，本发明人测量了暴露于含有TF的磷脂双层表面的人类血浆的凝结时间。为改变这些试验中的t_r，改变了表面上的TF的浓度，和溶液中的阿加曲班(一种凝血酶抑制剂)的浓度。通过光刻工序得到特定尺寸的TF补块。对于每个t_r值，观察到特定的p_tr值。p_tr相对于t_r的图显示了1/2次幂标度关系(图5b)并证明了所述标度预测可应用于复杂的生物体系。

本发明的体外实验预测了引发凝结所必需的血管损伤尺寸与反应的时间尺度相关，如由达姆科勒数描述的那样。理解此关系将有助于更好地设计诊断工具和治疗凝结疾病。理解药物浓度如何影响p_tr将有助于这些药物的施用。

采用本发明实现的正确物理描述可协助预测受试对象有多容易在体内发生血液凝结。通过测量体外实验中的凝结时间可常规地测定受试对象的血液凝结的潜力，在所述实验中以某一浓度加入具有非常高浓度的激活剂。这些诊断方法不能接近地模拟体内凝结引发的时空特性，更好的物理描述使之能开发更好的方法。

本发明有助于理解全有-或-全无体系的激活(在复杂网络中的反应)如何在表面上发生。本发明有助于预测复杂网络的行为。

对形状的响应

本发明人证明了对形状的响应可出现在生物化学网络水平。本发明人依靠他们所开发的机制(Runyon等，2004，Angew.Chem.Int.Edit.43：1531)和实验体系(Kastrup等，2006，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103：15747)从而试验人类血浆的体外凝结的引发。发现该生物化学网络对形状有响应-所述刺激物补块的形状控制凝结的引发与否。

为了表征所述血液凝结级联引发(引发)对提供凝结刺激物的补块的形状的响应，使用明视野和荧光显微术分别监测了在刺激物补块表面上通过凝血酶形成的纤维蛋白和蓝色荧光染料(Lo和Diamond，2004，Thromb.Haemost.92：874)。纤维蛋白和凝血酶的形成均指示发生了凝结。组织因子(TF一种刺激引发的膜整合蛋白)的表面补块用光刻术形成图案。在含有0.5mol％的用红色荧光染料标记的脂质的磷脂双层中重构TF。在微流腔室中向人类血浆提供各种形状的TF表面。当比较不同形状的补块时，所有补块的面积(以及因此TF量)保持恒定(3.14×10⁴μm²)。

图6显示了人类血浆凝结的引发如何响应于具有相同面积和凝结刺激物TF量的表面补块形状。图6a是显示在含有TF的磷脂双层的补块上的凝结的侧视示意图。图6b是量化了人类血浆在不同纵横比的矩形补块上的引发时间的图表，测量三次。图6c显示了时移荧光显微图，其显示了圆形和方形补块上的凝结，而在窄矩形和星形补块上不凝结，所述补块具有相同面积。

当人类血浆暴露于含有TF的补块时，仅仅在特定形状上出现引发。在超过临界尺寸的圆形补块上发生引发。在其他形状上的引发显示出不同的趋势。诸如方形(纵横比＝1∶1)的宽矩形在不到四分钟内引发，而窄矩形(纵横比≥16∶1)在48分钟内未能引发(图6b、6c)。这些实验似乎显示，存在导致引发所需的矩形临界宽度(对以上实验为约90μm)。令人感兴趣的是，星形补块位于引发的边界上，仅在一半的试验中引发(十四次试验中的七次)。

为研究该对形状的响应背后的机制，本发明人开发了设想简化的反应-扩散体系的3D数值模拟从而在数值模拟中再现对形状的响应。在此模拟中，自催化反应混合物与用相同面积(7854μm²)的各种形状的刺激补块图案化的表面相接触。该模拟重现了在人类血浆中见到的实验结果(图7)。

图7描述了证明对形状的响应的简化反应-扩散体系的数值模拟。图7a显示了仅考虑激活剂从补块上扩散和一级形成的来自3D模拟的2D浓度图，显示了[C]在狭窄补块上较低。激活剂的扩散移除在狭窄补块(高纵横比，左图)上更加有效，保持[C]在阈值以下，而在较宽补块(低纵横比，右图)上的最大[C]在阈值[C]以上。图7b描述了在也考虑对应于二级自催化形成和一级抑制的溶液相反应时，对于狭窄补块(左图)消耗如何占主导，保持[C]在阈值以下。对于所述较宽补块(右图)形成占主导，而且[C]增大至所述阈值以上并广泛增大，导致形成引发。

为了表征在不同形状的补块上扩散对激活剂浓度([C])的作用，仅仅考虑来自补块的激活剂的一级形成；在溶液中的反应未被考虑(图7a)。对于较宽的矩形(较低的纵横比)，由所述补块的中心至离开所述补块的扩散的时间尺度较长，在较宽补块上形成比狭窄补块(高纵横比)更高的最大[C]。为研究在较宽的和较窄的补块间的该[C]差异如何影响自催化介质的引发，将溶液相反应加入到所述模拟中(图7b)。该自催化介质的引发具有对[C]的阈值响应，这是溶液中以下两步竞争反应的结果：1)激活剂的二级自催化形成，和2)所述激活剂的一级消耗或抑制。考虑这些溶液相反应放大了补块间[C]的微小差异，而引发表现为全有-或-全无响应；[C]或者增大数个量级，导致引发，或者保持在阈值[C]以下，未导致引发。在这些模拟中，引发必需的阈值[C]为2×10^-8M。对于给定的一组参数，纵横比≤4∶1的矩形在不到12秒内引发，而纵横比≥16∶1的矩形在1000秒之内未引发，此时所述模拟被停止。

如果该对形状的响应的机制是正确的，基于与所述模拟相同的化学原理的非生物体系将重现在人类血浆中观察到的结果。本发明人开发了试验性的止血化学模型(Runyon等，2004，Angew.Chem.Int.Edit.43：1531)，重现了在人类血浆中观察到的对补块面积的阈值响应(Kastrup等，2006，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103：15747)。

由构成基于激活剂(H⁺)的抑制和自催化形成的自催化体系的已得到很好表征的非生物反应组成本发明的模型(Nagipal和Epstein，1986，J.Phys.Chem.90：6285)。在此模型中，UV光是引发“凝结”的刺激物。

图8显示了经构建以模拟止血的简化化学体系如何响应提供了相同面积的刺激物的表面补块的形状。图8a是在用UV光刺激物照射的光致酸表面的补块上“凝结”的侧视示意图。图8b是量化在矩形补块上的引发时间的图表，测量三次。图8c显示了时移荧光显微图，其显示了在具有小纵横比的诸如方形的矩形补块上发生的在在具有相同面积但较大纵横比的补块上没有发生的“凝结”。

UV光将所述光致酸(2-硝基苯甲醛)转变为2-硝基苯甲酸，当[H⁺]达到引发海藻酸从褐藻盐中沉淀(由溴苯酚蓝变至黄色所指示)所必需的阈值水平时出现“凝结”(图8a)。正如在人类血浆中所观察到和由模拟所预测，具有相同面积(1.26×10⁴μm²)的补块的形状决定了是否能出现该化学体系的引发。再次，引发取决于所述矩形的纵横比(图8b，8c)，其中较宽的矩形引发而较窄的矩形不引发。令人感兴趣的是，与人类血浆中的试验相反，星形在这些试验中不引发。该观察结果通过所述数值模拟得以解释。星形形成与所述阈值相近的激活剂浓度。改变诸如所述激活剂由补块生成的速率和扩散系数等参数，将改变星形由引发变为不引发，而其他形状保持相同的响应。

这些结果强调了尽管简化模型和模拟捕捉到所述体系的整体动力学，仍需要实验测量以建立所述复杂网络的动力学的更精细的细节。这些结果进一步证明了对形状的响应不仅在生物体水平上出现，也在更基本的生物化学网络水平上出现。

试剂

在缓冲液中使用的所有溶剂和盐均购买自商业来源并原样使用，除非另外指明。聚(二甲基硅氧烷)(PDMS，Sylgard牌184 Silicone Elastomer试剂盒)购得自Dow Corning。1，2-二月桂基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)，来自猪脑的L-α-磷脂酰丝氨酸(PS)和1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)购得自Avanti Polar Lipids。Texas

1，2-二(十六烷酰)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(Texas

DHPE)，Oregon

1，2-二(十六烷酰)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(Oregon

DHPE)，N-(7-硝基苯-2-氧杂-1，3-二唑-4-基)-1，2-二(十六烷酰)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，三乙基铵盐(NBD-DHPE)，5-(和-6)-羧基SNAFL-1(SNAFL)，罗丹明110，二-(对甲苯磺酰基-L-甘氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酸酰胺)和FluoSpheres(硫酸盐微球体，1.0μm，黄色-绿色荧光(505/515)，2％固体)购得自MolecularProbes/lnvitrogen。正常汇集血浆(人类)(NPP)购得自George KingBio-Medical，Inc.。叔丁基氧羰基-β-苄基-L-天冬氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酸-4-甲基香豆酰-7-酰胺(Boc-Asp(OBzl)-Pro-Arg-MCA)购得自PeptidesInternational。白蛋白(BS)(BSA)和中粘度海藻酸购得自Sigma。人类重组组织因子(TF)和玉米胰蛋白酶抑制剂(CTI)购得自Calbiochem。阿加曲班购得自Abbot Laboratories。溴苯酚蓝和亚氯酸钠(NaClO₂，80％纯度)购得自Acros Organics。Krytox氟化脂是Dupont的产品。硅化玻璃盖片购得自Hampton Research。无水十六烷、2-硝基苯甲醛和正十八烷基三氯硅烷(OTS)购得自Aldrich。硫代硫酸钠(Na₂S₂O₃，99.9％纯度)和无水二甲基亚砜(DMSO，99.7％纯度)购得自Fisher Scientific。

所述化学模型的试剂由溶液相试剂(所述模型反应混合物)和固相图案化基底构成。所述模型反应混合物是含有NaClO₂、Na₂S₂O₃、海藻酸和溴苯酚蓝的溶液(Runyon等，2004，Angew.Chem.Int.Ed.43：1531-1536)。含有NaClO₂和Na₂S₂O₃的溶液是亚稳定的。通过加入阈值浓度的酸(水合氢离子)，它能被触发快速地和自催化地反应，从而形成更多的酸(Nagypal和Epstein，1986，J.Phys.Chem.90：6285-6292)。海藻酸在碱性条件下以海藻酸钠存在并且是水溶性的。然而，在酸性条件下，海藻酸形成不溶性凝胶。溴苯酚蓝是pH指示剂，用于监测反应混合物反应和引发“凝结”的时间。所述反应混合物通过溴苯酚蓝的荧光(λ_ex＝535～585nm，λ_em＝600～680)进行监测。当引发“凝结”时，所述碱性反应混合物变为酸性，结果导致红色荧光的猝灭和黄色可见光的出现。所述固相图案化基底由覆盖有2-硝基苯甲醛在二甲基硅氧烷-环氧乙烷嵌段聚合物中的分散液的薄层(20～30μm)的盖片构成。通过光掩模的UV照射使2-硝基苯甲醛(非酸性)光致异构化为2-硝基苯甲酸(酸性，pKa＜4)。

制备两种稳定溶液作为亚稳定模型反应混合物的前体。制备了两种稳定溶液。当这两种溶液合并时，所得溶液构成亚稳定的所述模型反应混合物。溶液1是Na₂S₂O₃、海藻酸和溴苯酚蓝的水溶液，溶液2是NaClO₂的水溶液。

溶液1的制备：通过将海藻酸(0.290g，中度粘度)加入到NaOH溶液(50ml，pH＝10.8)中制得海藻酸储备溶液，并通过约90℃加热45分钟而溶解。通过在5mL所述海藻酸储备溶液中合并Na₂S₂O₃·5H₂O(0.122g，0.492mmol)和溴苯酚蓝(钠盐)(12.5μl 0.17M在NaOH中的水溶液，pH＝11.6)制得Na₂S₂O₃/海藻酸/溴苯酚蓝储备溶液。该过程形成最终pH为约7的Na₂S₂O₃/海藻酸/溴苯酚蓝溶液。

溶液2的制备：通过将NaClO₂(0.270g，2.99mmol)溶解在10mLMillipore过滤的H₂O中从而制得NaClO₂储备溶液(最终pH约10.7)。该溶液在12小时内使用。

将所述试剂合并形成在所述化学模型中使用的亚稳定反应混合物。通过以1∶1的体积合并所述Na₂S₂O₃/海藻酸/溴苯酚储备溶液和NaClO₂储备溶液制得所述模型反应混合物。该过程形成初始为可见的紫色并发出红色荧光的溶液。加入一滴1N HCl引发“凝结”反应并使所述溶液变为可见的黄色，并猝灭了所述红色荧光。不加入酸，自发引发(通常在20分钟内)也将由于亚氯酸盐/硫代硫酸盐反应的随机性导致同样的紫色至黄色的转变(Nagypal，I. & Epstein，I.R.，1986，J.Phys.Chem.90：6285-6292)。

光致酸涂覆的基底的制备。所述光致酸(2-硝基苯甲醛)一直保持在黑暗中。伴随搅拌，通过加热至60℃将所述光致酸溶解到二甲基硅氧烷-环氧乙烷嵌段共聚物(1∶1的重量)中。该混合物保持在60℃直至旋涂。室温下，通过将50μL的温热混合物放置在硅化盖片(22mm直径)中心来旋涂所述均匀的光致酸/硅氧烷混合物。所述基底立即以500rpm旋转10秒，然后以1500rpm旋转15秒。在5分钟内，2-硝基苯甲醛从所述硅氧烷流体中固化而出，形成覆盖在所述盖片上的薄凝胶状层(厚度为20～30μm)。所述光致酸覆盖的基底保持在黑暗中并在12小时内使用。

测量在微流腔室中的化学模型的“凝结”引发

腔室的设计和组装。通过将PDMS垫片密封到硅化盖片上从而制成在所述化学模型试验中使用的微流腔室。所述一次性腔室具有10mm的内径，20mm的外径和1mm的深度。将30μL的所述模型反应混合物液滴放入所述腔室。将涂覆有光致酸基底的玻璃盖片放在顶部。

图9是所述化学模型试验装置的示意图。将PDMS垫片(PDMS)密封至硅化玻璃盖片。将所述化学模型反应混合物(30μL，模型反应混合物)放在所述腔室中。将2-硝基苯甲醛(50重量％)在二甲基硅氧烷-环氧乙烷嵌段共聚物中的分散液的光致酸层(20～30μm)放置在所述PDMS顶部并与所述化学模型反应混合物相接触。将光掩模(Photomask，黑色)放在顶部，仅允许UV光(300～400nm，UV箭头)通过特定位置(灰色)。

通过UV照射形成酸性补块。使用100W Hg灯从上方照射样品。光通过热吸收滤镜(50mm直径Tech Spec^TM热吸收玻璃)，随后通过短波-通过滤镜(Chroma#D350)，主要使得300～400nm波长达到所述样品。光随之通过聚光镜，散焦在所述样品上形成直径约6mm的均匀照射区域。UV光照射通过直接放置在涂覆有所述光致酸分散液的玻璃盖片顶部的“聚酯薄膜上的银”光掩模(CAD/Art Services Inc.)。

使用epi-荧光显微术对所述模型反应混合物成像。使用150W氙灯光源从所述样品底部来监测模型反应混合物。光透过立方体滤镜(λ_ex＝535～585nm，λ_em＝600～680)和5×0.15NA的物镜。每180ms进行10ms的曝光时间，相机设置在bin＝2×2和增益＝255。红色荧光的猝灭指示了所述模型反应混合物已反应并引发“凝结”。对所述pH敏感的染料未见到明显的光致漂白。当所述“凝结”的引发出现时(在对大补块照射约22秒以后)，荧光强度的猝灭快速发生，以约10in＜1秒的系数降低。这与简单的光致漂白并不一致。

透过绿光通过滤镜(HOYA)过滤所述“UV照射源”得到在所述化学模型体系中的酸性补块的图像(此处本发明人并非指“凝结”的监测)。绿光通过所述光掩模和试验装置至下方的物镜。从所述样品下方获得所述补块的图像(参见图9)。从下方获取的图像显示外观“模糊”的补块，这是由于光通过所述光致酸的固体悬浮物的薄层时的失真。

分析在所述化学模型体系中“凝结”引发的图像。对于所述模型反应混合物，原始灰度时移荧光图显示当引发“凝结”时荧光的猝灭(由高荧光转变为低荧光)(图片参见图14)。在

中，这些图像均匀地假染为黄色并对黑色物体设置阈值。该过程导致所有图像中的亮黄色和暗区域的反转。最终结果是在引发“凝结“时图像由暗色变为亮黄色。该过程使之能使用更灵敏的荧光成像，同时在“凝结”时获得可视觉观察到的黄色。

所述酸性补块的原始图像假染为绿色并在

中调节水平。所述处理过的

图像在新的Adobe Photoshop文档中打开并设置为RGB模式。创建由两层构成的覆盖图像(overlaid image)：顶层为所述补块的绿色图像，底层为所述“凝结”溶液的黄色图像。仅当绿色时将顶层的混合选项设置为混合。

使用5-(和-6)-羧基-半萘荧光素-1(SNAFL)对由所述化学模型中的补块产生的酸进行量化

制造试验装置以量化酸形成。使用与以上所述用于所述化学模型的试验装置相似的试验装置(相同的照射设置和成像设置)。采用以下不同：1)使用不同的腔室，2)使用40×0.85NA物镜和3)所述模型反应混合物由SNAFL溶液替代。对于这些实验，所述腔室由绕成直径约3mm的圆形的直径100μm的银线构成并放置在硅化盖片(22mm)顶部。将硅脂涂抹在银线周围。将2μL在10mM三(羟甲基)氨基甲烷(Tris，pH＝9.7)中的10μM SNAFL(红色荧光＝碱性，绿色荧光＝酸性)液滴放在所述银线环中，但不与所述银线接触。所述光致酸基底放置在所述银线顶部并由所述硅脂密封。所述光掩模放置在所述光致酸基底的顶部。

用SNAFL生成酸校准曲线。生成SNAFL荧光强度相对于所加入的酸浓度的校准曲线。制备具有不同HCl含量的各SNAFL/Tris溶液。所述溶液的最终pH为6.5～9.7。测量在所述腔室中的SNAFL/Tris+HCl溶液的绿色和红色荧光强度。用S形曲线对所述酸滴定校准曲线(绿/红强度比相对于[H₃O⁺])进行拟合。

量化不同补块尺寸的酸形成。补块阵列和单一补块的酸形成用所描述的用于SNAFL溶液的试验装置进行测量。样品用UV脉冲照射20秒，使之平衡2分钟，随后测量绿色和红色荧光强度。使用所述荧光强度数据、所测定的校准曲线和所述样品的已知体积来测定所形成的酸的量(结果参见图13)。

在存在凝结刺激物的表面上引发凝结的模块机制的数值模拟

数值模拟用以说明对于所提出的模块机制可存在补块尺寸阈值，其中采用了单一速率等式表示每个模块的动力学。在此试验中，本发明人：i)测试了两个模块(一个产生激活剂(自催化地)和一个消耗所述激活剂(线性地))间的竞争是否能形成对所述激活剂的浓度的阈值响应；ii)测试了加入了这两个模块(即产生激活剂的表面补块，和扩散)的模拟是否能产生对所述补块的尺寸的阈值响应；iii)测试血液凝结的生物化学反应的合理参数是否能形成与试验测量值相同量级的补块尺寸阈值。目的并非在于预测所述阈值补块的精确尺寸。反应的时间尺度(t_R，单一试验确定的参数)是所述阈值补块的尺寸的更简单和更可靠的预测值。

选择在数值模拟中使用的参数。在所述模块机制中，在存在“凝结”刺激物的补块上发生的扩散和反应用商业上的有限元件套装(finiteelement package)FEMLAB 3.1版(Comsol，Stockholm，瑞典)进行数值模拟。所述表面由存在“凝结”刺激物和围绕所述补块的1mm“惰性”邻近区域构成。测定了不同的补块尺寸对浓度曲线和“凝结时间”的影响。

为数值模拟激活剂(“C”)浓度的变化，考虑在溶液中的扩散，以及在溶液中和表面补块上发生的反应。C可以与在血液中存在的凝血促进分子组相比较。用标准对流扩散方程对C的质量运输建模。采用5×10^-11m²s^-1的扩散系数(在血液凝结中溶液相蛋白酶如凝血酶的近似值)。在该模拟中未使用对流。选择1μm的边界层厚度。对于该边界层厚度，假设为穿过所述层的侧向扩散较快，而所述溶液在侧向上是均匀的。所述边界层的尺寸是相当随机的，可以使用一定范围的厚度，只要穿过所述边界层的厚度的扩散远比反应速率和跨过最小补块的扩散速率快。使用所述边界层将3D模拟简化为计算上更有效的假-2D模拟。绝缘/对称的边界条件可用在所述“惰性”邻近区域的外缘。

在所述模拟中加入三个速率等式：i)在所述补块表面处的C的形成，速率＝k_补块；ii)溶液中C的自催化形成，速率＝k_形成[C]²+b；和iii)溶液中C的线性消耗，速率＝-k_消耗[C]。所使用的数值是[C]_初始＝1×10^-9M，k_补块＝1×10^-9M s^-1，k_形成＝2×10⁷M^-1S^-1，b＝2×10^-10M s^-1和k_消耗＝0.2s^-1。这些值是基于在血液凝结中的典型反应的近似值而选择的(Kuharsky和Fogelson，2001，Biophys.J.80：1050-1074)。使用这些值，出现了两个稳态，一个在[C]＝1.1×10^-9M，一个在8.9×10^-9M。通过考虑所述反应速率等式的速率图，可以理解这些稳态的存在(图10)。对于描述速率图的综述，参见Tyson等，2003，Curr.Opin.Cell Biol.15：221-231。

图10描述了所述速率等式的速率图如何加入到所述模块机制的数值模拟中(细节参见上文)。图10A显示了两个等式，表示i)C的自催化形成的模块(曲线)，和ii)C的线性消耗的模块(直线)。这两条线的交叉点表示稳态。在[C]＝1.1×10^-9M的稳态是稳定的。然而，在[C]＝8.9×10^-9M的稳态是不稳定的，并表示C_阈值，即阈值[C]。当[C]＞C_阈值时，形成速率大于消耗速率并且出现[C]的快速增长。图10B描述了另外两个等式，表示i)所述补块的表面上的C的形成中所涉及的反应，(水平线)，和ii)在高[C]发生的沉淀的模块(虚线)。所述沉淀模块没有加入到所述模拟中(虽然它加入到所述试验性化学模型中)，在此为了表述清楚将其示意性地包括在内。

在[C]＝8.9×10^-9M的稳态是不稳定的，并且表示所述C的浓度阈值，C_阈值。当[C]＞C_阈值时，发生快速增长，这将导致产生足够的[C]以引发沉淀(固体“凝块”的形成)。在没有补块的模拟中(其中补块尺寸(p)为零)，[C]保持在稳定的稳态值[C]＝1.1×10^-9M。当大的补块加入到所述模拟中时，在溶液中和在所述补块上形成的合计C将导致[C]在10秒内超过[C]_tr。

模拟结果。通过数值模拟得到的浓度曲线表明，在模拟中的“凝结”显示出了对补块尺寸(p)的阈值响应(图11)。采用上述参数，对于p＝50μm的补块，[C]从未增长至C_阈值。然而，当p＝100，[C]在10秒内增长至C_阈值。所述补块尺寸阈值p_tr，(能引发凝结的最小的p)在50μm～60μm之间。p_tr值随k_补块的降低而增加，指明了在所述补块表面上的形成速率将影响p_tr。由于在补块表面上形成速率的变化导致的p_tr的该变化与之前的试验结果相一致，其显示了当TF浓度降低时，t_R增加，并且p_tr增加。在所述数值模拟中，p_tr的值随D的增加而增加。

图11描述了所述数值模拟如何指示出在所述模型中引发“凝结”的可能性表现出对补块尺寸的阈值响应。在模拟中，p≤50μm的补块从未引发“凝结”，但p＞60μm的补块总是引发“凝结”。

所述模拟和试验在量化上的一致可能是巧合的。反应的时间尺度(t_R，单一试验确定的参数)是对于不同血浆样品的阈值补块的尺寸的更简单和更可靠的预测值。

在亚阈值补块的紧密簇上的“凝结”的数值计算。测定了改变亚阈值补块间的距离对C的浓度曲线和对“凝结时间”的影响。一簇p＝40μm的亚阈值补块，仅在处于相互足够近时，形成[C]＞C_阈值：当40μm补块相隔80μm时，从未达到C_阈值，然而如果补块仅相隔20μm，则快速达到C_阈值并引发“凝结”。

制备血浆试验用的PDMS微流腔室

腔室的设计和制造。在所述血浆和全血试验中使用的微流腔室(图12)主要由聚(二甲基硅氧烷)(PDMS)构成，由多层、机磨黄铜母模制成。一次性PDMS腔室具有13mm的内径、20mm的外径和1mm的深度。

图12描述了血浆试验用试验装置和图案化磷脂双层基底。图12A是用于盛放涂覆有图案化磷脂双层的玻璃盖片的PDMS微流室(灰色)的示意图。带有重构组织因子(TF)(深灰色圆圈)的促进凝结的负电荷磷脂在惰性中性脂质背景中形成图案。所述腔室盛有血浆，并在顶部用硅化玻璃致密密封。图12B是所述腔室的截面图。

消除在所述腔室中的对流和背景凝结。为了减少溶液中的对流，将PDMS腔室浸入NaCl溶液(150mM)4～8小时。为了进一步减少对流和减少在所述PDMS表面的背景凝结，随之将腔室浸在1％BSA(在磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液中，pH＝7.3)中1～2小时。在所述血浆或全血试验前，用NaCl溶液(150mM)彻底清洗所述腔室。为了在所述PDMS和所述硅化玻璃盖片之间形成良好密封，通过使用无尘擦拭纸进行擦拭从所述腔室的顶层外表面移除部分BSA。

组装凝结实验用腔室。所述浸过的腔室放置在35×10mm培养皿(BD Biosciences)中。所述基底(图案化盖片)放置在所述腔室中。一薄层的Krytox氟化脂涂抹在所述腔室顶部。然后将适当的血浆或全血样品(参见下文)放置在所述腔室里。轻微地向下按压硅化玻璃盖片，而挤出过量的血浆，与所述脂接触并密封所述腔室。然后将NaCl溶液(150mM)装入所述培养皿，保持所述腔室浸没以防止透过PDMS的蒸发。所述腔室保持在23℃～24℃或者37℃。

测量所述腔室里的对流。在对照试验中，通过获取在正常汇集血浆中的荧光微球体(FluoSpheres)的时移荧光显微图，测量在所述PDMS腔室里的流动。测量了单个FluoSphere行进的距离并除以所经过的时间。FluoSpheres(硫酸盐微球体，1.0μm直径，黄色-绿色荧光(505/515)，2％固体)的储备溶液用NaCl溶液(150mM)稀释(25μL至5mL)。稀释的FluoSphere溶液漩涡处理30秒并超声处理1分钟以使FluoSphere的聚集体破碎。该FluoSphere溶液(70μL)加入到柠檬酸盐处理的正常汇集血浆(210μL)中。所述FluoSphere/血浆混合物加入到腔室中并密封所述腔室。每1分钟在透过所述腔室的最多10个位置进行拍照。

制备图案化支持磷脂双层以在空间上控制经由所述组织因子(TF)途径的凝结引发

清洁盖片以减少污染并形成亲水表面。为获得在使用磷脂双层的凝结试验中的可重复性结果，有必要清除诸如大的玻璃颗粒和灰尘等污染物。所述盖片的清洁过程由以下步骤构成：1)施用3M Scotch胶带(#810)以移除大的玻璃颗粒，2)用溶液循环(i.EtOH，ii.H₂O，iii.10％ES 7×去污剂，iv.EtOH，v.Millipore过滤水)进行超声处理，步骤间用H₂O和EtOH冲洗以进一步清除松散的玻璃颗粒，3)浸泡在新制备的“piranha”溶液(H₂SO₄∶H₂O₂，3∶1，体积比；该混合物与有机材料剧烈反应，必须小心操作)中约20分钟，和4)用Millipore过滤水彻底冲洗并在N₂流中干燥。清洁的盖片在干燥后立即使用。

制备脂质-囊泡的溶液。在别处已描述了单层囊泡的制备(Yee等，2004，J.Am.Chem.Soc.126：13962-13972)。简而言之，在经piranha清洁的玻璃小瓶中，适宜的脂质氯仿溶液经混合至所需的浓度和摩尔比例。用N₂(气)流将氯仿蒸发，然后在真空下(50毫托)干燥所述脂质饼至少三小时。通过漩涡搅动将所干燥的脂质悬浮在Millipore过滤水中(10mg/mL)，然后在4℃水合过夜。所述水合囊泡经过五个冷冻-解冻循环。将它们冷冻在干冰/丙酮浴中并在温度设置为高于所述脂质转变温度的烘箱中解冻。在高于所述脂质转变温度的温度下通过Whatman NucleporeTrack-Etch膜(100nm孔径)将这些囊泡挤出十次(Lipex^TM挤出机，NorthernLipids)。所挤出的囊泡用Millipore过滤水稀释至储备浓度(5mg/mL)并在4℃保存。所有囊泡溶液在两周内使用。

将组织因子(TF)重构以得到凝结促进囊泡。将TF重构到在1×HEPES-缓冲盐水/Ca²⁺缓冲液中浓度为1.25mg/mL的DLPC/PS/Texas

DHPE(79.5/20/0.5摩尔百分比)的混合囊泡中。对于图17、18和19中的试验，在所述囊泡溶液中的TF浓度为0.40nM(TF∶脂质比为2.5×10^-7)。假设所有TF并入所述囊泡，则计算的表面浓度为0.08fmol/cm²。对于表1中的试验，使用0.16nM TF(TF∶脂质比为1×10^-7)的终浓度。在将TF加入所述囊泡溶液后，所述溶液在37℃温育30分钟，随后在12℃保存。所述囊泡在18小时内使用。

形成惰性双层。所述惰性支持磷脂双层由DPPC(97％)和绿色荧光染料(3％的Oregon

DHPE或NBD-DHPE)(Jung等，2005，ChemPhysChem 6：423-426)构成。在50℃，将215μL所述DPPC囊泡溶液(在PBS中的0.34mg/mL囊泡)加入到在亲水性PDMS腔室中的刚清洁的盖片从而制备双层。在加上所述盖片之前通过用血浆清洁剂(SPIPlasma Prep)氧化而使所述PDMS具有亲水性。所述盛有囊泡溶液的微流腔室在50℃温育10分钟并随之冷却至室温。通过反复使用NaCl溶液(150mM)清洗除去多余的囊泡。所述双层保存在室温、黑暗中并在24小时内使用。

回填到所述惰性双层中以消除任何暴露的玻璃区域。为确保没有任何由于所述DPPC双层中的不完整性而导致的暴露玻璃基底，用30μLDLPC囊泡溶液(在PBS缓冲液中的2.5mg/mL囊泡)回填所有双层并使之在室温下黑暗中温育40分钟。通过使用NaCl溶液(150mM)充分清洗而除去多余的囊泡。将这些双层在数小时内进行光致图案化。

光致图案化以选择性地除去惰性双层的补块区域。所述已经用DLPC回填的DPPC双层利用先前已公开的方法进行光致图案化(Yee等，2004，J.Am.Chem.Soc.126：13962-13972；Yu等，2005，Adv.Mater.17：1477-1480)。简言之，将所述双层涂覆的盖片放置在光掩模(chrome onquartz，Photo Sciences，Inc.)下的铝制调整盘上。将该装置放置在冷却板(Echo therm^TM，Torrey Pines Scientific)上，所述冷却板设置为0℃以在照射时使所述样品的温度保持为20℃～30℃。双层用深色UV光(在双壁冷却石英浸泡井中的Hanovia中等压力450W Hg浸泡灯)照射7分钟并随后用NaCl溶液(150mM)彻底冲洗。将图案化的双层在2小时内进行回填。

通过回填凝结促进脂质到所述双层的光致移除区域从而形成补块。为形成所述凝结促进补块，用30μL所述TF重构的囊泡溶液(在PBS缓冲液中的1.25mg/mL囊泡)回填所述图案化双层并在室温下温育4分钟。含有活性TF的磷脂双层之前已有制备(Contino等，1994，Biophys.J.67：1113-1116(1994))。用NaCl溶液(150mM)有力地冲洗除去多余的囊泡。立即在凝结试验中使用图案化双层。

在硅烷化玻璃盖片上制备图案化亲水性补块从而在空间上控制经由因子XII途径的凝结引发

在玻璃盖片上形成惰性硅烷化表面。之前已描述了使玻璃盖片硅烷化的详细过程(Howland等，2005，J.Am.Chem.Soc.127：6752-6765)。简言之，将刚使用piranha清洁的玻璃盖片放置在干净的玻璃盘中。在N₂(气体)氛围中将无水十六烷(10mL)和正十八烷基三氯硅烷(OTS)(40μL)加入到所述盖片。该溶液温育30分钟。然后，向所述溶液加入第二份40μLOTS等分试样并再温育45分钟。通过用无水十六烷冲洗六次，随后用EtOH冲洗数次以除去过量的OTS。所述硅烷化的盖片保存在真空并在48小时内使用。

光致图案化以选择性地在所述惰性硅烷化层中形成亲水玻璃补块。使用上文和文献(Howland等，2005，J.Am.Chem.Soc.127：6752-6765)中所描述的光致图案化装置形成亲水性补块。在光掩模下照射所述硅烷化盖片2小时。在照射后，用EtOH和Millipore过滤水冲洗所述盖片。所述图案化盖片在30分钟内使用。

用润湿测试检测亲水性补块。使用甘油润湿测试(Wu和Whitesides，2002，J.Micromech.Microeng.12：747-758)检测亲水性区域。所述图案化盖片用甘油覆盖并用温和的真空除去过量的甘油。该过程将甘油滴仅留在盖片的曾暴露于UV光的区域(亲水性区域)。在成像后，并在加入正常汇集血浆前，用NaCl溶液(150mM)有力地冲洗以除去所述甘油。

制备试验用人类血液样品

由供体血液制备全血和富含血小板的血浆。依据由芝加哥大学的Institutional Review Board所规定的指南(第12502A号方案)由独立健康供体获得血液样品。在含有3.2％柠檬酸钠(9∶1的体积)的

管中收集全血。通过在300×g离心10分钟得到富含血小板的血浆(PRP)。

制备正常汇集血浆。柠檬酸盐处理的正常汇集血浆(NPP)(人类)(Butenas等，Blood 105：2764-2770)购得自George King Bio-Medical，Inc.，并在-80℃保存以1mL等分试样直至需要使用的时候。需要时，通过在18℃温育解冻所述血浆。

再次钙化所述血浆样品并加入凝血酶敏感染料。通过加入含有凝血酶敏感的荧光染料Boc-Asp(OBzl)-Pro-Arg-MCA的CaCl₂溶液(CaCl₂，40mM；NaCl，90mM；和Boc-Asp(OBzl)-Pro-Arg-MCA，0.4mM)将所有血浆样品再次钙化。在每次试验开始时，所述血浆和含有CaCl₂的溶液以体积比1∶3进行混合。所述再次钙化的血浆溶液(400μL)在轻微搅拌下加入到图9中所示的试验装置中。使用明视野显微术，由纤维蛋白的出现，以及当4-甲基-香豆酰-7-胺(MCA)被凝血酶从Boc-Asp(OBzl)-Pro-Arg-MCA上切割下时产生的荧光信号的出现检测到凝结。

全血样品的再次钙化和加入凝血酶敏感染料。由以下步骤再次钙化全血样品(Rivard等，2005，J.Thrombosis and Heamostasis 3，2039-2043)，1)首先，将全血(376μL)与凝血酶敏感荧光染料，即罗丹明110-二-(对甲苯磺酰基-L-甘氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酸酰胺)(2μL，在DMSO中10mM)相混合，2)然后，所述全血与CaCl₂溶液(23.5μL，200mM)相混合。该再次钙化的全血溶液加入到图12中所示的试验装置中。通过罗丹明110被凝血酶从罗丹明110-二-(p-甲苯磺酰基-L-甘氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酸酰胺)上切割下时产生的荧光信号的出现检测凝结。在全血试验中使用罗丹明110染料替代所述MCA染料用于凝血酶检测，这是因为与MCA相比，在罗丹明110的最大激发和发射波长下，红细胞具有更低的吸光系数。

用玉米胰蛋白酶抑制剂来抑制因子XII途径。对于测量所述TF途径的凝结时间的试验(所有试验使用磷脂双层和重构TF)，所述因子XII(接触)途径用玉米胰蛋白酶抑制剂(CTI)进行抑制。在所述血浆解冻后立即(对于NPP)或者在离心后(对于PRP)，向血浆加入CTI的储备溶液(6.27mg/mL)至终浓度100μg/mL，并在每次试验前在18℃温育约10小时。对于全血，在收集后加入CTI至终浓度100μg/mL。对于测量所述因子XII(接触)途径的凝结时间的试验(所有试验用亲水性玻璃补块或明胶)，未加入CTI。替代的是，在每次试验前将NPP解冻并在18℃保存4小时。

血浆凝结引发的成像

用荧光显微术检测凝结和荧光脂质。使用与具有0.65×耦合器(coupler)的冷却CCD相机ORCA ERG 1394(12-位，1344×1024分辨率)(Hamamatsu Photonics，K.K.)相连的具有10×0.4NA物镜的Leica DMI6000B epi-荧光显微镜获取图像。由75W Xe光源提供照明。使用三个立方体滤镜：1)DAPI/Hoechst/AMCA(λ_ex＝320～400nm，λ_em＝435～495)(色度#31000v2)以检测MCA，2)德克萨斯红(λ_ex＝530～590nm，λ_em＝600～680)(色度#41004)以检测所述德克萨斯红DHPE脂质染料，和3)FITC/Bodipy/Fluo3/DiO(λ_ex＝455～505nm，λ_em＝510～565)(色度#41001)以检测所述俄勒冈绿DHPE脂质染料，NBD-DHPE脂质染料和罗丹明110。也使用明视野显微术(由卤素灯照明)检测凝结过程中纤维蛋白的形成(实例参见图15)。使用

成像系统(Universal ImagingCorp)收集图像。用

成像系统和Adobe Photoshop处理图像。所有图像调整均统一地应用于整幅图像，以及应用于所有组的所得图像。

凝结引发图像的分析。凝结和所述脂质双层的原始灰度荧光图是在

中被假染色的。由所述立方体滤镜的发射波长设置颜色。对于所有凝结的荧光图像，色阶调整至相同值。这些图直接从拷贝粘贴到设置为RGB模式的新Adobe Photoshop文档中。在AdobePhotoshop中，通过掩蔽所述红色图像将来自MCA的蓝色荧光图和所述脂质双层的代表性红色荧光图相重叠。对所有图像应用统一的转换，并且以相同的方式对所有图像进行处理。

用以确立在所述化学模型中的“凝结”的引发仅仅是由于在所述补块上形成光诱导所致的酸的其他对照试验

排除加热和光化学是模型反应混合物的引发的原因。为将所述光掩模的加热降至最小，使用短波-通过和IR滤镜除去λ＜300.nm和λ＞400nm的光线。照射没有敞开的补块的光掩模并不引发所述反应，提示所述反应并非由所述掩模的加热而触发。在没有2-硝基苯甲醛时的照射不引发所述反应，提示所述化学模型本身的光化学在所使用的条件下并不诱导引发。在没有照射时，所述模型反应混合物也能稳定500秒～1200秒。

确定酸形成取决于补块面积。为测量由所述酸性补块产生的酸量(H⁺产生)，所述模型体系被酸敏感荧光染料，5-(和-6)-羧基-半萘荧光素-1(SNAFL)溶液所替代(该溶液的制备参见上文)。通过测量SNAFL的荧光强度测量酸性补块的各种阵列的H⁺形成(图13)。测量所述H⁺的形成以确定具有酸性补块的相同总表面积a但单个补块的不同尺寸p的不同阵列产生约相同量的酸。每个阵列具有相同的补块总表面积(a＝5.03×10⁵μm²)，每个阵列产生大致相同量的酸(在2倍系数之内)。单个800μm补块(a＝5.03×10⁵μm²)以2.9×10^-2nmol/s的速率形成H⁺，4×400μm补块阵列(a＝5.03×10⁵μm²)形成3.4×10^-2nmol/s，16×200μm补块阵列(a＝5.03×10⁵μm²)形成2.6×10^-2nmol/s，以及64×100μm补块阵列(a＝5.03×10⁵μm²)形成1.7×10^-2nmol/s。单个400μm补块(a＝1.26×10⁵μm²)形成7×10^-3nmol/s。

图13描述了产生的酸的量是如何取决于所述补块的总表面积。在没有所述模型反应混合物时，用酸敏感染料(5-(和-6)-羧基-半萘荧光素-1，SNAFL，具有双发射、双激发性质的染料)检测H⁺的产生。首先，通过用HCl滴定，测定SNAFL的荧光强度相对于H⁺浓度的校准曲线(数据未示出)。然后，在20秒的透过所述光掩模和光致酸层的UV光脉冲之后，每2分钟测量一次SNAFL的绿色和红色荧光强度的变化。使用所述荧光强度数据、所测量的校准曲线和已知体积的样品，确定所产生的H⁺量。对于具有相同的补块总表面积a但不同补块尺寸p的补块的不同阵列测量了H⁺的产生。对具有相同总表面积的阵列所述H⁺的产生大致相同(在2倍系数以内)。对于单个400μm的补块也测量了所述H⁺的产生，其具有比所述阵列小4倍的表面积，产生少2.4～4.8倍的H⁺。

通过测量所述H⁺产生线的斜率来测定速率(图13)。所述单个400μm补块具有比所述p≤200的阵列小四倍的面积，并产生约少4倍的酸，但能引发所述化学模型的“凝结”。所述p≤200的补块并不引发“凝结”。这些结果支持了所述观点，即阈值并非简单地由产生的酸的总量所决定，而是由所述产生酸的补块的尺寸决定。

量化在所述光致酸表面的所述化学模型中的pH-敏感染料的荧光强度谱

在所述化学模型中的“凝结”的引发导致由碱性条件变为酸性条件，以及来自所述染料溴苯酚蓝的红色荧光的猝灭。对于所述模型反应混合物，所述原始灰度时移荧光图显示了“凝结”引发时荧光的猝灭(由高荧光变为低荧光)。在图17～19中，所述化学模型图均统一地假染为黄色并对暗色物体设置阈值。该过程导致在所有图像中亮黄色和暗区域的反转。

图14描述了在光致酸表面上的化学模型中pH-敏感染料的荧光强度谱的量化。所述原始(未修改)图像的荧光强度经量化以确定所述化学模型的所有试验中的“凝结”时间。图14A是在400μm补块上的化学模型中的“凝结”引发的时移荧光显微图和线扫描(虚线)。线扫描显示在22秒引发“凝结“，并猝灭所述荧光。图14B显示了在200μm补块的阵列上的化学模型的时移荧光显微图和线扫描。线扫描显示在这些补块上并未引发“凝结”，原因在于荧光强度并未明显降低。修改和假染图像并未使所述信息失真，并且假染色图像的分析给出类似的强度谱。

当引发“凝结”时，荧光强度发生的明显降低。单个400μm补块在22秒内引发“凝结”(图14A)。所述“凝块”作为反应性前沿从所述补块增长开来，随其增长而猝灭荧光。200μm补块的阵列在220秒之内未能引发“凝结”(图14B)。在所述补块中增大的强度是由于少量红色和绿色光从上方的光源透过所述透明的光掩模补块(参见图9中的模型体系示意图)。由于在用于测量荧光的低放大倍数下的正常非均匀照射，在所述图像的边缘出现较低的荧光强度。相反，由所述样品顶部的UV照射散焦形成直径约6mm的均匀照射区域。作为对照试验，对荧光染料的均匀溶液进行成像，其显示相同程度的非均匀性并且在边缘处的强度降低。

在图案化支持脂质双层上的血浆中的凝血酶敏感染料的荧光强度谱的量化

血浆凝结的引发导致凝血酶的爆发式形成，其中伴随着纤维蛋白形成的开始。为检测血浆中凝结的引发，使用荧光显微术检测肽-修饰的香豆素染料的凝血酶诱导切割，其将释放出4-甲基-香豆酰-7-酰胺(MCA，蓝色荧光)(图15H)，并使用明视野显微术检测纤维蛋白的形成(图15I)。对于61μm补块(图15A～E)，在45分钟内在所述补块上没有引发富含血小板的血浆(PRP)的凝结。

图15描述了血浆凝结的引发的量化。在图15A和B中显示的是在含有绿色脂质染料的惰性双层背景上图案化的含有红色脂质染料的TF重构双层的61μm补块。图15C和D显示在所述61μm补块上在20分钟内没有观察到由MCA导致的荧光强度的明显增强。在所述61μm补块上没有交联纤维蛋白丝形成或血小板聚集。图15E显示了量化图15C中的荧光强度的线扫描(在(C)中的虚线)。在图15F和G中显示的是在含有绿色脂质染料的惰性双层背景上图案化的含有红色脂质染料的TF重构双层的137μm补块。在图15H和I中显示的是在所述137μm补块上在2分钟之内观察到由于凝血酶而释放出的MCA所导致的荧光强度的明显增强。在所述137μm补块上观察到交联纤维蛋白丝的形成和血小板的聚集(实心白色箭头)。所述空心白色箭头指出在所述盖片以下的PDMS腔室中的不完整。图15J显示了量化(H)中的荧光强度的线扫描(在(H)中的虚线)。

没有观察到由于凝血酶而释放出的MCA所导致的荧光的明显增强(图15C和E)，没有观察到交联纤维蛋白丝的形成和血小板的聚集(图15D)。对于未引发凝结的所有补块均观察到该通常响应。对于137μm补块(图15F～J)，在所述补块上2分钟之内引发PRP的凝结。观察到由于凝血酶而释放出的MCA所导致的荧光的明显增强(图15H和J)。也观察到交联纤维蛋白丝的形成和血小板的聚集(图15I)。对于所有引发凝结的补块均观察到该通常响应。

在图18C和D中所示的补块阵列中，观察到相同的通常响应(图16)。在图16中显示的是在图18D中所示的阵列上血浆凝结的引发的量化。图16A和B显示了对于50μm的补块的阵列，如何在43分钟内在补块上未引发凝结。没有观察到由于凝血酶而释放出的MCA所导致的荧光的明显增强(图16A和B)，没有观察到交联纤维蛋白丝的形成。图16C和D显示了对于400μm补块的阵列，如何在3分钟之内在所述补块上引发凝结。观察到由于凝血酶而释放出的MCA所导致的荧光的明显增强(图16C和D)。也观察到交联纤维蛋白丝的形成。

测量和消除在盛有血浆的腔室中的对流

通过摄取在正常汇集血浆中的荧光微球体(FluoSphere)的时移荧光显微图而测量了在所述血浆腔室里的流动(图12)。测量个体FluoSphere所移动的距离并除以所耗费的时间(该溶液的制备见上文)。在所述腔室经优化消除流动之后，在所述基底以上10μm处的流速通常小于3μm/min，在所述基底以上100μm处的流速通常小于10μm/min。3μm/min的速率比被引发的凝结的扩散速率(25～35μm/min)小10倍。

消除流动所采取的步骤。消除流动所采取的步骤包括：i)使用密封的PDMS腔室以消除在空气/血浆界面产生的对流(Marangoni流动)和蒸发，ii)PDMS腔室浸入在NaCl溶液(150mM)中4～8小时以消除透过所述PDMS的蒸发，并保持恒定的渗透压，iii)然后所述腔室浸泡在PBS(pH＝7.3)中的1％BSA中1小时以消除由于表面张力的可能梯度而在PDMS/血浆界面形成的Marangoni流动，iv)在将血浆密封在内之后，将所述腔室浸没在NaCl溶液(150mM)中，v)使在使用显微术过程的照射量降至最低，和vi)使载物台移动(stage movement)减至最小。

在24℃和37℃比较供体富含血小板的血浆和正常汇集血浆的阈值

在24℃和37℃测量供体富含血小板的血浆和正常汇集血浆的补块尺寸阈值。在含有不同尺寸补块的阵列中的存在凝结刺激物(TF重构双层)的补块上测量凝结时间(表1)。在单一试验中，测量了在七个不同补块尺寸上的凝结时间。用于制备表1中所述双层的在囊泡中的TF的浓度是0.16nM(TF∶脂质比率为1×10^-7)。该值比在正文中所描述的试验中使用的浓度(0.40nM)小约2.5倍。对于正常汇集血浆(NPP)，相比使用[TF]＝0.40nM(t_R＝30s)，使用[TF]＝0.16nM形成更长的反应时间尺度，t_R＝206s，以及相应更大的补块尺寸阈值P_tr[m](对于[TF]＝0.16nM的160±32μm相比对于[TF]＝0.40nM的75±25μm)。测量了来自供体的富含血小板的血浆(PRP)的凝结时间相对于补块尺寸。对于给定的[TF]，PRP具有比NPP(206s)更短的t_R(对于供体X为40s，对于供体Y为48s)，以及相应更小的p_tr(对于PRP的85±26μm和90±7μm相对于对于NPP的160±32)。

表1在24℃和37℃，PRP和NPP的补块尺寸阈值p_tr和反应时间尺度t_R

血液样品	温度(℃)	t_R(S)	t_R ^1/2(s^1/2)	P_tr±σ(μm)^*	血液来源
血液样品	温度(℃)	t_R(S)	t_R ^1/2(s^1/2)	P_tr±σ(μm)^*	血液来源	PRP	24	40	6.3	85±26	供体X
PRP	24	48	6.9	90±7	供体Y	PRP	24	40	6.3	85±26	供体X
PRP	24	48	6.9	90±7	供体Y	NPP	24	206	14.4	160±32	G.King，Inc
PRP	37	26	5.1	90±15	供体Y	NPP	24	206	14.4	160±32	G.King，Inc
PRP	37	26	5.1	90±15	供体Y	NPP	37	121	11.0	125±15	G.King，Inc

^*通过将获得自每个阵列(每个血液样品共3～6个阵列)的p_tr平均而确定p_tr的值。在每个阵列中，测量七个不同的补块尺寸，σ是p_tr值的标准偏差。

模块化学机制预测在止血中的引发

本发明人证明了采用模块方法构建的简单化学模型体系能用于预测在止血的复杂网络中的血液凝结的引发的时空动力学。微流体学用于构建体外环境，其暴露了所述复杂网络和具有用存在凝结刺激物的补块图案化的表面的模型体系。两个体系均显示了阈值响应，凝结引发仅发生在大于尺寸阈值的独立补块上。两个体系的补块尺寸阈值的量级可用达姆科勒数进行描述，测定了反应和扩散之间的竞争。反应在所述补块上产生激活剂，而扩散从所述补块上移除激活剂。所述化学模型作出更多由使用人类血浆所证实的预测，指示出用微流体学补充的这样的化学模型体系可用于预测复杂生物化学网络的时空动力学。

为对所述引发的时空动力学进行建模，大约80个止血反应用以表示三种交互作用模块，其总体动力学对应于i)较高阶的自催化激活剂形成，ii)激活剂的线性消耗，和iii)在高浓度激活剂下凝块的形成。激活剂的浓度C作为对照参数。在这些模块间的相互作用导致浓度阈值，C_阈值，在其上(而非其下)将引发凝结。在该表示中，止血通常是在低C下的稳定稳态中。C的较小增加保持了C＜C_阈值，这样扰动衰减，体系返回所述稳定稳态。大的扰动提高所述浓度至超过不稳定稳态(C＞C_阈值)，导致激活剂的增加并引发凝结。因此，通过用所具有的动力学与所述模块的动力学相匹配的至少一个化学反应替代每个模块可以建立被明显简化的功能性止血化学模型。

图17描述了人类血浆和简单化学模型如何都能引发凝结，而所述凝结对存在有凝结刺激物的补块的尺寸具有阈值响应。图17A是用于测试在所述化学模型中的“凝结”的引发的阈值响应的微流装置的简化示意图。所述反应混合物保持在含有2-硝基苯甲醛的光致酸表面上。透过光掩模的UV照射使2-硝基苯甲醛(非酸性)光致异构化为2-硝基苯甲酸(酸性，pKa＜4)，形成“凝结刺激物”的酸性补块(绿色)。当引发“凝结”时，碱性反应混合物变为酸性，并变黄。

图17B显示了在补块p＝200μm(顶图，没有引发)和p＝800μm(底图，快速引发)的化学模型中的“凝结”(假染的黄色)的引发的时移荧光显微图。图17C显示了数值模拟，其量化地描述了在所述补块上的凝结激活剂的产生和激活剂从所述补块上的扩散在调控凝结引发上竞争。对于亚阈值补块(顶图，50μm)，扩散占主导，激活剂的浓度从未达到引发凝结所必需的浓度阈值C_阈值(虚线)。对于超阈值补块(底图，100μm)，激活剂的产生占主导，超过C_阈值，导致激活剂的快速增加并凝结。

图17D是用于盛放血浆并使之暴露于存在凝结刺激物的补块的体外微流体系的示意图。带有负电荷的含重构组织因子的磷脂双层(脂质/TF)(红色荧光)的补块在惰性脂质的背景中图案化。蓝色表示凝结。图17E所示的时移荧光显微图显示了在红色补块p＝50μm(顶图，未引发)和p＝100μm(底图，快速引发)上的血浆凝结(蓝色荧光)的引发，其中p[m]是所述补块的直径。

在所述化学模型中“凝结”的引发显示了对补块尺寸的阈值响应

为观察该化学模型体系的量化动力学，本发明人测试了在酸性补块上的“凝结”的引发是否强有力(在大的补块而不是小的补块上引发)(图18A)。UV光用作引发“凝结”的刺激物。用光掩模将酸的光致化学形成在空间上限制在所述补块。酸从所述表面补块扩散进入溶液，而所述“凝结”反应仅在所述酸的局部浓度超过所述阈值C_阈值时引发。

图18描述了所述化学模型如何正确地预测人类血浆的体外凝结引发依赖于所述空间分布，而不是存在有组织因子(TF)(凝结激活剂)的脂质表面的总表面积。图18A的时移荧光显微图是在p＝50、200、400和800μm的补块的阵列(由上至下，绿色)上的化学模型中“凝结”的引发(黄色)。所有阵列具有相同的补块总表面积(5×10⁵μm²)。“凝结”在p＝50～200μm的补块的阵列上并不引发，但在p＝400～800μm的补块上快速引发。图18B是量化了在所述化学模型中对于“凝结”的引发的阈值响应的图，使用A中所显示的数据。图18C的时移荧光显微图显示在p＝100μm和p＝400μm补块的阵列(红色)上血浆的凝结的引发(蓝色)，而在p＝25μm和p＝50μm补块的阵列上没有引发(红色)。在所有阵列中的补块的总表面积均相同(3.5×10⁶μm²)。图18D是量化了对于血浆的凝结的引发的阈值响应的图，其中使用C中所显示的数据。通过监测纤维蛋白的出现来测定凝结时间。

在所述化学模型中的“凝结”的引发显示了对补块尺寸p[m](圆形补块的直径)的阈值响应(图18B，17次试验)。p≥400≥p_trμm的单个补块可靠地在约22秒之内引发“凝结”，而p≤200≤p_trμm的单个补块不能在500秒内导致引发。对照试验证实了引发是由于在表面上酸的形成，而不是由于样品的加热或者溶液的光化学。

在所述化学模型中的“凝结”的引发可以用达姆科勒数进行描述

为获得该体系中动力学的半定量描述，本发明人通过考虑反应和扩散的竞争，估算了所述补块尺寸阈值p_tr[m](引发凝结的最小补块的尺寸p)。反应在时间尺度t_R[s]在所述补块上形成激活剂，而扩散运输在时间尺度t_D[s]将所述激活剂从补块上移除。对于p＜p_tr的补块，扩散占主导，(t_D＜t_R)，而激活剂的浓度从未达到阈值C_阈值。对于p＞p_tr的补块，反应占主导(t_D＞t_R)，激活剂局部浓度超过所述阈值C_阈值，并引发“凝结”。该竞争可由达姆科勒数描述(Bird等，2002，Transport Phenomena，John Wiley& Sons，New York，第二版)，p_tr对应于在t_R≈t_D时的p(图18C)。由于t_D≈p²/D，p_tr应当标度为p_tr≈(D×t_R)^1/2，其中D[m²s^-1]是所述激活剂的扩散系数。该尺度预测是合理的，并且与最初为膜补块尺寸所提出的相一致，所述膜补块尺寸调控凝结时在膜上的蛋白水解回馈环(Beltrami和Jesty，2001，Math.Biosci.172：1-13)。对于化学模型体系，试验值200＜p_tr＜400μm与预测p_tr为约470μm相一致，这是用D(H⁺)为约10^-8m²s^-1和t_R为约22秒计算的。

所述化学模型正确地预测了凝结引发的时空动力学

所述化学模型对血液凝结的引发做了四个预测。首先，它预测了补块尺寸阈值p_tr的存在和数值，为了验证该测试，并探明所述止血网络的引发的动力学，本发明人开发了体外微流体系以在空间上和时间上对凝结的引发进行控制(图18D)。图案化支持磷脂双层用于提供所述凝结刺激物的补块，其为含有被并入在双层中的带有重构人类组织因子(TF)的磷脂酰丝氨酸的脂质表面。TF是在血管损伤和动脉粥样斑破裂处暴露的膜整合蛋白。这些凝结诱导补块由惰性脂质双层(磷脂酰胆碱)的背景区域所包围。微流腔室用于盛放覆盖在所述图案化脂质表面上的刚再次钙化的血浆和消除对流。

在所述止血网络中的引发可通过两个途径进行，即TF途径和因子XII途径。在测试由TF引发的试验中，使用玉米胰蛋白酶抑制剂对因子XII途径进行抑制。在该网络中的“引发”指在凝血酶峰和纤维蛋白的形成开始时达到顶峰的凝结过程。明视野显微术用于检测纤维蛋白的形成，而荧光显微术用于检测凝血酶诱导的肽-修饰的香豆素染料的切割。在此报道的凝结时间指纤维蛋白出现的时间，并且在所有试验中，纤维蛋白的出现与荧光增高相关联。凝结的荧光图像可统一地被设定阈值以减小所述染料的背景荧光。

在该微流系统中的血浆凝结的引发显示出对补块尺寸的阈值响应。p≥100μm的补块在少于3分钟里引发凝结(44次试验中有40次引发凝结)，而p≤50μm的补块不引发凝结(28次试验中有28次不引发凝结，每个试验中至少30个补块)(图18E)。在p≤50μm的补块的试验中在32～75分钟内观察到背景凝结(通常不在所述补块上引发)，与在完全没有补块的表面上引发的45～70分钟相吻合，并且与其他人所报道的背景凝结时间相吻合。引发的凝结作为反应性前沿以25～35μm/min的速度扩散。为了预测p_tr的值，采用了约5×10^-11m²s^-1的D(凝血酶作为在所述凝结级联的放大中所涉及的代表性激活蛋白时的近似值)，并采用约30±5秒的t_R(通过测量在非图案化凝块诱导双层上的凝结引发时间而获得)。预测的P_tr约40μm，与所述测量50＜p_tr＜100μm相一致。由于考虑激活剂在膜上的扩散，之前提出了明显更小的补块尺寸阈值(数个μm)。所述结果指出p_tr决定于蛋白质在溶液中的扩散。

第二，所述模型预测了是单个补块的尺寸(单独的，没有相互作用的)，而不是它们的总表面积决定了凝结的引发。为证实该作用，所述化学模型暴露于补块阵列(图19A和B)。

图19描述了所述化学模型如何正确地预测了人类血浆凝结的引发能在通过扩散相互连通的亚阈值补块的紧密簇上发生。图19A显示了在所述化学模型体系中，p＝200μm的亚阈值补块的簇的固定时间(54秒)荧光显微图。这些补块引发了在相隔200μm(右图)时的凝结，在相隔800μm(左图)时未凝结。图19B显示了暴露于血浆的p＝50μm的亚阈值补块(红色)的簇的固定时间(9分钟)荧光显微图。这些补块引发了在相隔50μm(右图)时的凝结，在相隔200μm(左图)时未凝结。

每个阵列具有相同的补块总表面积(5×10⁵μm²)，并产生相同量的酸，但只有具有p≥400μm的补块的阵列引发“凝结”。总面积是无关的：单个超阈值补块快速地引发“凝结”，即使它的面积比亚阈值补块阵列的面积小4倍，并产生少4倍的酸。血浆的凝结(图19C和D)也显示了该动力学-在总面积相同的补块阵列中，仅有p≥100μm的补块的阵列引发凝结(每个补块尺寸六次测量)。凝结的引发灵敏地对样品中的TF的空间分布敏感。知道在所述样品中的TF量并不足以预测是否能发生凝结-在具有恒定体积的血浆的试验中，超阈值补块诱发凝结，而具有20倍大的总表面积，带有20倍多的TF的亚阈值补块的阵列则不能。

第三，所述模型预测了足够紧密的亚阈值补块簇能引发凝结(图20)。在图20中的图像描述了所述化学模型如何正确地预测了经由第二(因子XII)途径的凝结引发，指示了所述模型描述了体外止血的整个复杂网络的引发的动力学。显示了在玻璃上人血浆中经由因子XII途径的凝结引发的测试。两张时移荧光显微图(图20A，13分钟)和(图20B，21分钟)显示了在p＝400、200、100、50和25μm(从左至右，白色)的凝块诱导亲水性玻璃补块的阵列上的凝结引发，所述补块在惰性硅烷化玻璃的背景上图案化。对于此处所示的血浆样品，所述补块尺寸阈值在100μm～200μm之间。

在所述簇的周界处的补块上的激活剂的形成降低了所述激活剂从所述中央补块上离开的扩散流。对于给定的t_R，对相隔小于所述扩散长度尺度(等于p_tr)的亚阈值补块应当发生凝结的引发。为证明该作用，本发明人将化学模型(200＜p_tr＜400)暴露于两个亚阈值补块簇(图20A)。间隔200μm的200μm补块簇快速引发“凝结”，而间隔800μm的簇则不能。数值模拟与这些试验相一致。这些预测经血浆(50＜p_tr＜100)的验证，其中相隔50μm的50μm补块快速引发凝结，而相隔200μm的补块簇则不能(九次试验，图20B)。已知的是在膜的表面，尤其是血小板的表面上能更快速地发生激活剂的增加，而这些结果进一步确证在设置p_tr时溶液中运输的重要性。

第四，如果所述化学模型代表在所述网络中引发的整体动力学，而不是在所述TF途径中的反应亚组，则其提出经由所述因子XII路径的血液凝结的引发也将显示出阈值响应。为了引发该途径，本发明人将血浆暴露于带有负电荷的玻璃；在t_R为约9分钟时发生引发。本发明人采用凝血酶的扩散系数预测所述补块尺寸阈值p_tr(为约(D×t_R)^1/2)约为160μm。为了验证该预测，在惰性、疏水性硅烷化玻璃的背景上形成亲水性玻璃的补块。通过将血浆放置在不同尺寸的补块的单个阵列上很快地确定了p_tr约为100μm(图9)。在所有14个试验中，p≥200μm的补块诱发凝结，但p≤50μm的补块则不能。p＝100μm的补块接近尺寸阈值，在十四次试验中仅有四次引发凝结(12～19分钟)，与补块与补块间的表面化学的轻微变化或者经由所述因子XII途径的凝结的引发的随机性质相吻合。由TF或因子XII途径引发受试对象的血液凝结的能力可因此快速地通过测量在不同尺寸的补块的矩阵的单个滑片上的阈值响应而确定。

描述止血网络中凝块增长的机制

如同任何复杂的生物化学网络一样，理解止血的调控机制的一种方法是建立起所述网络的模型。图21描述了模拟止血动力学的简单化学模型，其基于简单调控机制-由激活剂的形成和移除之间的竞争所导致的阈值响应。该阈值响应由仅在激活剂浓度C_激活剂超过临界浓度C_临界时出现凝结而得以证实。该机制作出了两个预测：1)如果C_激活剂保持大于C_临界，凝块以具有恒定速度F_v[m s^-1]的反应性前沿而增长，和2)对于给定几何形状的导管，凝块从阻塞的导管增长进入有流动血液的未受阻塞的导管取决于在所述具有流动血液的导管中的剪切速率

图21是所提议的用于调控凝块增长通过两个具有高(a)和低(b)剪切率的导管的结合部的机制的示意图。当所述激活剂的浓度(·)，C_激活剂超过临界浓度C_临界时引发凝结(蓝色)。当C_激活剂保持大于C_临界时，该凝块作为具有速率F_v[m s^-1]的反应性前沿增长通过受阻塞的导管。当所述增长的凝块到达两个导管之间的结合部(结合部)时，取决于在有流动血液的导管(流动导管)中的结合部的剪切速率

而停止增长或者继续增长。图21a描述了当在流动导管中的

大于剪切率阈值

时凝块如何在结合部停止增长，这是因为在所述流动导管中激活剂从生长的凝块上的移除快于其形成，从而保持在所述流动导管中的C_激活剂低于C_临界。图21b描述了当在流动导管中的小于

时凝块如何继续增长通过结合部，这是因为在所述流动导管中激活剂从生长的凝块上的移除慢于其形成，使得在所述流动导管中的C_激活剂大于C_临界。

本发明提供了微流系统，该微流系统提供了体内和简单体外试验的折衷。它使之能精确地控制流动、几何形状和表面。该系统可与人类血浆一起使用以验证所提出的机制的预测并且证实该简单机制提供了对凝块增长的时空动力学的调控的深入观察。

在没有流动时凝块以恒定速度的反应性前沿增长

为对凝块以恒定速度的反应性前沿增长的预测进行测试，本发明人使用了微流系统以调控和观察人类血浆中的凝结。该系统用聚(二甲基硅氧烷)(PDMS)制造。

图22描述了在没有流动时，血液凝块增长通过微流体通道的测量。在所述通道壁上存在和不存在凝结的膜结合抑制剂血栓调节蛋白(TM)时凝块以相似的速度(F_v)增长。图22a是在微流装置中引发和监测凝块增长的过程的示意图。凝结仅在脂质-TF涂覆的通道壁上引发(而在惰性脂质上不引发)并增长进入所述装置的以惰性脂质涂覆的所述通道壁的部分。图22b是微流装置的荧光显微图，显示了具有重构TF的脂质(脂质-TF)能定位在惰性脂质背景的通道的特定区域。图22c是时移荧光显微图，显示了在血浆引入所述通道后，在0、40和80分钟时所述凝块的位置。图22d显示了在不存在TM(F_v≈20μm min^-1)和存在TM(脂质∶TM＝7.6×10⁴，F_v≈25μm min^-1和脂质∶TM＝7.6×10³，F_v≈24μm min^-1)时量化凝块增长速度的试验。

通过用不同的磷脂图案化相同通道的壁将凝块的引发和增长在空间上分开(图22a)。通过从所述通道的相对末端，将含有磷脂囊泡的两股层流灌入所述装置实现该图案化。一股流体含有引发凝结的脂质混合物-含有重构组织因子的磷酸胆碱、磷脂酰丝氨酸和Texas

磷酸乙醇胺(脂质-TF，图22a)-而另一股流体含有不能引发凝结的脂质-磷脂酰胆碱(惰性脂质，图22a)。接着，用NaCl的水溶液冲洗所述通道以移除过量的脂质囊泡，在所述通道壁上留下脂质-TF或惰性脂质的涂层(图22a、b)。然后，使血浆流入所述装置，使之与所述脂质-TF相接触，然后停止流动。用明视野显微术检测纤维蛋白形成并荧光显微术检测肽-修饰的香豆素染料的凝血酶诱导切割从而对凝结进行监测。

仅在涂覆有脂质-TF的通道壁上引发凝结。该凝块增长进入所述装置的涂覆有惰性脂质的部分(图22a)。该凝块以恒定速度，F_v≈20μm min^-1的反应性前沿增长通过整个所述通道(图22c、d)。

在通道壁上的血栓调节蛋白不影响凝块增长

已提出凝块增长受血栓调节蛋白(TM，一种位于血管的血管损伤位点附近的血管壁中的凝结抑制剂)的调控。已显示当TM均匀混合在血浆中时，凝块增长减小。为了模拟TM在血管壁上的位置，将TM嵌入所述通道壁并测试TM是否能足以停止凝块增长。本发明人通过形成含有重构TM的惰性脂质囊泡(脂质∶TM)并使用以上所述涂覆所述通道壁的程序将TM嵌入所述惰性磷脂表面。

对照试验证实在所述通道壁上的TM活性与之前对单层内皮细胞测量的处于同一量级。所测定的TM活性显示在表2中，其描述了由带有重构血栓调节蛋白(TM)的鸡蛋PC脂质涂覆表面形成的活化蛋白C(aPC)的量化。显示了凝块生长的相应速度。

表2由带有重构血栓调节蛋白(TM)的鸡蛋PC脂质涂覆表面形成的活化蛋白C(aPC)的量化

表面	温度(℃)	TM∶蛋PC比率	计算的表面密度(pmol m^-2)	aPC形成(pmolmin^-1m^-2)	前沿速度(μm min^-1)
表面	温度(℃)	TM∶蛋PC比率	计算的表面密度(pmol m^-2)	aPC形成(pmolmin^-1m^-2)	前沿速度(μm min^-1)	PDMS	25	N/A	N/A	N/A	20
PDMS	25	1∶75600	4	10	24	PDMS	25	N/A	N/A	N/A	20
PDMS	25	1∶75600	4	10	24	PDMS	25	1∶7560	40	5^*	25
玻璃	37	N/A	N/A	N/A	41	PDMS	25	1∶7560	40	5^*	25
玻璃	37	N/A	N/A	N/A	41	玻璃	37	1∶75600	4	0.3	ND
玻璃	37	1∶7560	40	10	50	玻璃	37	1∶75600	4	0.3	ND

^*可能已达到TM浓度的饱和(Tseng等，2006，Biomaterials 27：2768-2775)。

N/A＝不适用，因为没有TM存在。显示数据仅仅为了与前沿速度进行比较。

ND＝未测定

当所述脂质∶TM的摩尔比为7.6×10⁴时，凝块以与没有TM时(F_v≈25μm min^-1，绿色三角，图22c)大约相同的速度增长。为进一步显示位于所述通道壁的TM不能停止凝块增长，TM密度增加10倍，没有观察到可察觉的F_v变化(图22c)。其他对照试验(参见表2)显示了对于此处使用的两种浓度的相似TM活性，这是与之前观察到的高TM浓度的饱和效果相一致。在该装置(表面-体积比为约0.02μm²μm^-3)中存在TM时的凝块增长提示可能有其他机制对这些条件下的凝块增长进行调控。

剪切率调控凝块由一根通道增长进入另一通道

为验证流动血液的

调控凝块增长的预测，本发明人设计微流装置使凝块的前边缘暴露于流动的再次钙化的血浆。

图22描述了

的阈值如何调节凝块增长通过所述结合部。图22a是用于测试凝块增长通过所述结合部对

的依赖性的微流装置示意图。通过监测在所述流动通道(黑色)中的三个区域(虚线框)从而测定凝块增长通过所述结合部。黑色箭头指示了流动的方向。图22b、c是在凝块到达所述结合部后27分钟，所述流动通道的所述3个区域的荧光显微图。图22b显示在

时，所述凝块如何不增长进入所述“膜瓣”。图22c显示在

时，所述凝块如何增长进入所述膜瓣并随之在所述“膜瓣”下游的流动通道中驻留。图22d是凝块增长对

的依赖性的量化。虚线表示短凝结时间和长凝结时间之间的分界。实心圆表示在所述“膜瓣”中观察到凝结的试验。空心圆表示在所述“膜瓣”中凝结之前停止的试验。

该装置使之能在一条通道中没有流动时引发凝结(引发通道，图22a)而在有流动血浆的未阻塞相连通道中不导致引发。此外，该装置在所述流动通道中加入与静脉瓣相似的几何形状以重现在膜瓣中观察到的再循环流。图22a描述了该“膜瓣“增加了所述血浆在在所述流动通道中的驻留时间，并且使之能监测凝块从所述引发通道和所述流动通道之间的结合部(下文中称之为所述结合部)的增长。对照试验证实了在所述“膜瓣”中的再循环流。该系统也使之能控制平均流速V_平均[m s^-1]和

。本发明人依据

(当在存在流动时研究凝块形成所通常使用的参数)分析了凝块增长通过结合部。在压力驱动的流动中，在表面的局部流速V[m s^-1]为零。剪切率描述了V随着距表面的距离的增加而变化，并且确定了在接近表面处各个方向上的运输。本发明人计算了在具有矩形横截面的通道的垂直壁的中点处的

。当所述凝块从所述结合部增长至所述“膜瓣”的时间超过30分钟则认为凝结时间“较长”。图22d显示了在所述流动通道中在60～80分钟内如何自发形成凝结。

由所述引发通道至所述流动通道的“膜瓣”的增长显示了对

的阈值响应，在此条件下的剪切速率阈值

为约90s^-1(图22d)。在所述引发通道中没有流动时引发凝结并增长至所述结合部。在引发通道中没有流动时总是发生至所述结合部的增长。当在流动通道中的

大于时，凝块增长停止在所述结合部，导致长凝结时间(图22b)。然而，当在所述流动通道中的

低于

时，在所述引发通道中的凝块增长通过所述结合部，首先到达所述流动通道的“膜瓣”，然后达到所述流动通道的位于所述“膜瓣”下游的其他部分，导致短凝结时间(图22c)。在

非常接近于时，本发明人在具有相同

的两个试验中均观察到短和长的凝结时间(图23d)，这证实了通过结合部的增长对

的敏感性。

在结合部的剪切率而不是在“膜瓣”处的剪切率调控凝块增长

为进一步证实在所述结合部的

调控凝块增长，本发明人设计了将所述结合部处的

与所述“膜瓣”处的

相分开的装置。在图22中所示的装置中，在所述结合部的

的变化导致在所述“膜瓣”处的

的变化，从而改变在所述“膜瓣”处的再循环速率。

图23描述了通过结合部的凝块增长是如何受所述结合部的

而不是所述“膜瓣”处的

的调控。显示了剪切率、凝结时间和所述装置各部分的示意图。凝结时间为两个试验的平均值。装置尺寸参见图26，在图23a～d中的试验的流速参见表3。

在所述结合部和“膜瓣”处的高

(190s^-1)导致长的凝结时间(23a)，而在所述结合部和所述“膜瓣”处的低

(30s^-1)导致短的凝结时间(图23b)。当所述流动通道在所述结合部变窄从而在所述结合部形成高

而在所述“膜瓣”处形成低

时，观察到长凝结时间(图23c)，这表明在所述“膜瓣”处的低

不足以促使凝块增长通过所述结合部。当所述流动通道在所述结合部变宽从而在所述结合部形成低

，而在所述“膜瓣”处形成高

，观察到短凝结时间(图23d)，这提示在所述结合部的，而不是在所述“膜瓣”处的

调控凝块增长。

表3在图23中显示的试验的流速和剪切速率

试验	体积流速^*(μL min^-1)	流速结合部(mm s^-1)	剪切速率结合部^**(s^-1)	流速“膜瓣”(mm s^-1)	剪切速率“膜瓣”(s^-1)
试验	体积流速^*(μL min^-1)	流速结合部(mm s^-1)	剪切速率结合部^**(s^-1)	流速“膜瓣”(mm s^-1)	剪切速率“膜瓣”(s^-1)	190/190	2.9	2.4	190	2.4	190
30/30	0.5	0.4	30	0.4	30	190/190	2.9	2.4	190	2.4	190
30/30	0.5	0.4	30	0.4	30	190/30	2.9	1.1	190	0.4	30
30/190	0.5	0.8	30	2.4	190	190/30	2.9	1.1	190	0.4	30

^*这是在具有“膜瓣”的通道中的体积流速。在区域1的体积流速(参见图26)为四倍大。

^**对于在矩形通道中流动，计算在垂直壁的中点处的剪切速率(Nataraja和Lakshman，1973，Indian Journal of Technology 10：435-438)。

^***在所述“膜瓣”的剪切速率对应于紧接所述“膜瓣”的上方或下方的所述矩形通道中的剪切速率(图26)。在这些区域中的不同剪切速率对应于在所述“膜瓣”中的再循环的不同速率。

暂时地抑制凝血酶使在剪切速率阈值以下的凝快增长停止。

所提议的调控机制(图21)提出当激活剂的移除速率超过激活剂的产生速率并在所述流动通道中保持C_激括剂＜C_临界时，凝块增长在所述结合部停止。因此，激活剂的产生速率的降低将降低保持C_激活剂＜C_临界所要求的

。为验证该假设，本发明人暂时地将在所述结合部处的凝块暴露于不可逆的直接凝血酶抑制剂，D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酰-氯甲基酮(PPACK，图24a)。

图24描述了当在所述流动通道中的

时，通过结合部的凝块增长能通过暂时地将在所述结合部的凝块暴露于不可逆直接凝血酶抑制剂(PPACK)而减小。图24a是试验的示意图，在所述试验中，在所述结合部的凝块的边缘暴露于PPACK。图24b描述了当在所述流动通道中的

时，暴露于PPACK 7分钟对通过结合部的凝块增长的作用的量化。在暴露于PPACK 7分钟后，凝块增长明显减小。PPACK的凝块时间为在PPACK流停止后的时间。误差线为最小值和最大值之间的范围；显示了平均值。

选择凝血酶作为抑制的目标，这是因为它是凝结的强激活剂，在凝块增长中以高浓度形成并参与到正反馈中。在

时，使再次钙化的血浆流入所述装置，并如图21中所示引发凝结。当所述凝块到达所述结合部时，将PPACK(终浓度＝0.75μM)加入到所述血浆中并在

下流动7分钟。然后，停止所述PPACK的流动，在

下将再次钙化的血浆流入，并如图22所示监测凝结。该7分钟的PPACK暴露显著减缓了凝块增长，由没有PPACK暴露时的11分钟增加至有PPACK暴露时的46分钟(图24b)。在不存在PPACK时的对照试验证实了在暴露于

10分钟后，在所述结合部的凝块保持活性。

这些体外结果补充了之前的体内研究，所述体内研究证实了为实现相同的抗血栓形成效果，在血管破损处的局部PPACK施用的浓度要求比在全身施用时低数个数量级。结合来看，这些结果表明不可逆直接凝血酶抑制剂或具有高结合亲合性的可逆直接凝血酶抑制剂诸如水蛭素(K_d＝20fM)能通过在所述凝块处对凝血酶的较长时间抑制而有效地防止血栓形成。

在试验中所使用的装置的几何形状和尺寸，其中监测存在流动时在结合部的凝块增长

图25是监测存在流动时凝块增长通过结合部的实验过程。在图25a中所示的是两种类型的磷脂囊泡(脂质-TF和惰性脂质)如何流入浸泡在NaCl溶液(150mM)中的PDMS装置。每股脂质-TF流以0.5μL min^-1流动，而每股惰性脂质流以2.0μL min^-1流动15分钟。为确保所述脂质-TF不流过所述结合部，所述脂质囊泡被顺序停止。首先，脂质-TF停止而惰性脂质继续流动大约1分钟。为停止所述惰性脂质，被塞住的入口(十字)拔去塞子，在该入口以1.0μL min^-1开始流动NaCl溶液(150mM)。然后，停止惰性脂质(i)流，在该入口以1.0μL min^-1开始流动NaCl溶液(150mM)。最后，停止惰性脂质(ii)流。图25b描述了每次如何通过使NaCl溶液以1.0μL min^-1流动20分钟从而移除过量的脂质囊泡。该过程在所述通道壁上留下脂质涂层。在所述NaCl溶液停止后，从所述NaCl溶液中取出所述装置并密封出口(i)和出口(iii)(顶部的十字和底部的十字)。为密封所述出口，将少量的(25～50μL)Norland光学粘合剂81涂抹到所述PDMS并暴露于UV光(λ＝320～400nm)15～20秒。接着，通过以3∶1的体积流速比率(血浆：CaCl₂溶液)流入血浆和CaCl₂溶液(CaCl₂，40mM；NaCl，90mM；和Boc-Asp(OBzl)-Pro-Arg-MCA，0.4mM)将血浆在芯片上再次钙化。使这些溶液流动约1分钟然后如上将出口(ii)密封(中部十字)。最后，将所述装置浸没在EDTA溶液(50mM)中。图25c描述了在所述通道壁涂覆有脂质-TF的地方如何引发凝结。该凝块增长至所述结合部，在所述“膜瓣”处监测凝结。

图26是显示用于在存在流动时凝块增长通过结合部的装置的实际几何形状和尺寸的示意图。图26a显示了在图23、24和25中使用的装置的基本设计。对于在该部分使用的装置，区域1、2、3和4的高度(h)、宽度(w)和长度(l)都是相同的。图26b、c、d显示了对区域2作出的通道几何形状的变化，从而在同一试验中获得在所述结合部和所述“膜瓣”处的不同剪切速率。对所有四个通道中的区域2作出相同的变化。对于PPACK试验(图24)在a和b中所显示的装置几何形状相同，不同之处在于该装置具有一个额外的入口使之能转换溶液。

用基于栓塞的微流系统在芯片上滴定抗凝剂阿加曲班以及确定在全血或血浆中的凝结时间

开发基于栓塞的微流系统以将抗凝剂(阿加曲班)滴定入血液样品并采用活化的部分促凝血酶原激酶时间(APTT)测试对凝结时间进行测量。为进行这些试验，对基于栓塞的系统开发了以下技术：i)在所述微通道壁上使用特氟隆AF涂层从而能够形成含有血液的栓塞并在所述栓塞里运输固体纤维蛋白凝块，ii)使用亲水性玻璃毛细管从而能将试剂由水性流中可靠地并入栓塞，iii)使用明视野显微术来检测栓塞里纤维蛋白凝块的形成，和使用荧光底物，用荧光显微术来检测凝血酶的形成，和iv)将阿加曲班(0～1.5μg/mL)滴定到栓塞中，在室温(23℃)和生理温度(37℃)下测量所得APTT。用正常汇集血浆(含较少血小板的血浆，PPP)和用供体血液样品(全血和富含血小板的血浆，PRP)进行APTT测量。通过基于栓塞的微流装置测量的APTT值和APTT比率与来自37℃的临床实验室结果进行比较。获得自芯片上测定的APTT数据大约是来自临床实验室的那些数据的两倍，但来自这两种方法的APTT比率相互吻合。

试剂和溶液。所有水溶液在18-MΩ去离子水(Millipore，Billerica，MA)中制备。除非另外指明，所有试剂购得自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)。人类α-凝血酶的荧光底物，叔丁基氧羰基-β-苄基-L-天冬氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酸-4-甲基香豆酰-7-酰胺(λ_ex＝365nm，λ_em＝440nm)，购得自Peptide Institute，Inc.(大阪，日本)。对于此底物，在37℃的动力学参数为k_cat＝160s^-1，K_M＝11μM(50mM Tris-HCl，pH8.0和0.15M NaCl、1mMCaCl₂和1mg/mL BSA的缓冲溶液中)。所述APTT试剂(Sigma诊断补体)获得自Trinity Biotech(Wicklow，爱尔兰)。阿加曲班(100mg/mL的储备浓度)获得自GlaxoSmithKline(Philadelphia，PA)。在所述试验前，该储备液用150mM NaCl，20mM Tris，pH7.8稀释。1H，1H，2H，2H-四氟-1-辛醇(PFO，98％)获得自Alfa Aesar。

活化部分促凝血酶原激酶时间(APTT)测定的方案。血液样品获得自健康供体，获得芝加哥大学医院放射科的Institutional Review Board的批准(第12502A号方案)。以1份3.2％柠檬酸钠9份血液的比例将全血收集在采血器(vacutainer)试管中从而获得脱钙的全血。轻微地晃动试管以混合内容物。对于使用供体全血(其含有细胞和血浆)的试验，使用来自采血器试管的样品而无需进一步处理。对于使用来自供体的富含血小板的血浆(PRP)的试验，在将来自采血器试管的样品在1600rpm离心10分钟2次，从而获得血浆。正常汇集血浆(含较少血小板的血浆，PPP)获得自George King Biomedical(Overland Park，KS)并保存在-80℃。这些汇集血浆样品由来自至少30名健康供体的血浆构成。对于使用正常汇集血浆(PPP)的试验，样品解冻后在1500rcf离心150分钟从而移除由于长时间保存而沉淀的碎片。

在血液凝结网络中的反应通常分类为两个途径：内在途径和外在途径。所述APTT测定测量了当由所述内在途径引发时凝结所需的时间。APTT试剂含有两种成分：i)与因子XII相结合以引发所述内在途径的带负电荷的微粒，ii)磷脂以提供因子复合物所需的结合位点。对于补体(Alexin，在所述网络中使用的APTT试剂)，所述激活剂是鞣花酸而所述磷脂是兔脑脑磷脂。首先，一份脱钙血液样品与一份Alexin相混合，并温育3分钟以充分活化所述凝结的内在途径。血浆和Alexin的该混合物随后用一份20～25mM的CaCl₂再次钙化。CaCl₂的终浓度为约7～8mM。过量的CaCl₂用于克服柠檬酸盐的作用。最后，加入CaCl₂和在样品中检测到纤维蛋白凝块之间所经过的时间记录为APTT。该过程用作指导调节所述基于栓塞的微流装置以适用于测量所述APTT。APTT的临床结果由芝加哥大学医院的凝结实验室(Coagulation lab)用STA凝结分析仪(Diagnostica Stago，Inc.，Parsippany，NJ)进行测量。

微流装置。使用PDMS(聚(二甲基硅氧烷))中的快速原型(prototyping)制造微流装置。使用之前描述的硅烷化方案使微通道疏水化和亲氟化，不同之处是向所述装置通入1.5小时而不是1小时的十三氟-1，1，2，2，-四氢辛基)-1-三氯硅烷蒸气。除了所述硅烷化方案以外，所述微通道用无定形特氟隆(Teflon AF 1600，聚[4，5-二氟-2，2-二(三氟甲基)-1，3-间二氧杂环戊烯-共-四氟乙烯])涂覆。首先，微通道用在FC-70和FC-3283的1∶4(v/v)混合物中的1％(w/v)Teflon AF 1600溶液填充。对于在37℃进行的试验，微通道用在FC-70和FC-3283的1∶1(v/v)混合物中的2.5％(w/v)Teflon AF1600溶液填充。然后，装置在70℃烘焙过夜直至溶液蒸发。复合玻璃/PDMS毛细管装置如前所述进行制造(Zheng等，2004，Angew.Chem.Int.Edit.43：2508-2511)，不同之处在于在与所述PDMS装置相连之前，用Plasma Prep II血浆清洁剂使所述玻璃毛细管亲水化。

微流体试验。如前所述进行微流体试验，并具有以下改进。使用氟化载体流形成栓塞，所述氟化载体流是10∶1(v/v)的FC-70：PFO，其中在23℃，γ＝10mN m^-1和μ＝24mPa。所述氟化载体流的流速保持在3μL/min。用于形成栓塞的水溶液是Alexin和血液样品(或者是全血、富含血小板的血浆或含较少血小板的血浆，在下一段中有更详细的信息)。对于Alexin，对在23℃进行的试验，流速为0.3μL/min，对37℃进行的试验，流速为1.2μL/min。对于所述两股血流，在23℃总流速为0.3μL/min，在37℃总流速为1.2μL/min。在溶合结合部将一滴100mM CaCl₂溶液(300mOs)注射到每个栓塞中。对23℃，所述CaCl₂溶液的流速为0.2μL/min，对37℃，为0.4μL/min。由所述Alexin、两股血流和所述CaCl₂溶液的流速估计，所述CaCl₂的浓度对于在23℃进行的试验和在37℃进行的试验分别为25mM和14mM。过量的CaCl₂用于克服柠檬酸盐的影响。对于37℃进行的试验，显微加热台(Brook Industries，Lake Villa，IL)用于将所述装置保持在37℃。

在该部分的所有图中(除了在图28中)，所述微流装置的主要PDMS通道为300μm×270μm(宽×高)，小通道为100μm×100μm。在图28a中，所述主要PDMS通道和侧通道均为200μm×250μm。在图28b中，所述主要PDMS通道为200μm×250μm，小侧通道为50μm×50μm。在图28c中，所述主要PDMS通道为200μm×260μm，所述侧臂和转角体积(corner volume)的高度为80μm。

用全血样品测量APTT。对于全血的微流体试验，在水性注射器中的储备溶液是i)Alexin，ii)全血和iii)含有3.0μg/mL阿加曲班的全血。用Leica DM IRB或DMI6000显微镜进行试验。使用Spot Insight彩色数码相机(Diagnostics Instruments，Inc)光学检测到用全血形成的栓塞里的纤维蛋白凝块。

用血浆样品测量APTT。对于血浆(富含血小板的或者含较少血小板的)的微流试验，在三个水性注射器中的出版储备溶液是i)Alexin，ii)含有150μM荧光底物的血浆，其通过将3.5μL的底物溶液加入到246.5μL血浆中而制备，和iii)含有150μM荧光底物和3.0μg/mL阿加曲班的血浆，其通过将3.5μL底物溶液和0.75μL的阿加曲班(1mg/mL)加入到245.5μL血浆中而制备。用Leica DMI6000显微镜进行试验。使用DAPI滤镜(λ_ex＝350±25nm，λ_em＝460±25nm)和冷却CCD ORCA ERG 1394(12-位，1344×1024分辨率)(Hamamatsu Photonics，K.K.，滨松市，日本)，在所述显微镜上通过荧光监测所述荧光底物被α-凝血酶的切割。用明视野显微术在显微镜上对血浆样品里的纤维蛋白凝块进行监测。

进行APTT试验所用的微流体芯片的整体设计

所述微流装置由五个不同的区域构成：栓塞形成区、混合区、温育区、溶合结合部和检测区(图27)。在图27中显示的是用于测量所述APTT和用于滴定阿加曲班的基于栓塞的微流装置的示意图。含有Alexin(所述APTT试剂)和血液(血浆或全血)的栓塞形成在所述栓塞形成区，然后运输至温育区(显微图，左上方)。流动3分钟后，在溶合结合部将CaCl₂溶液注射到每个栓塞中(显微图，右上方)。所述CaCl₂液滴在所述显微图中用虚线描绘。在所述检测区，在栓塞里形成的凝块经观察为时间的函数(显微图，右下方)。

形成三种水性试剂的栓塞：i)Alexin，ii)去钙化的血液和iii)混合有阿加曲班的去钙化血液。所述血液样品可以是供体全血、供体血浆(PRP)或正常汇集血浆(PPP)。所述Alexin的流速和所述血流的合并流速保持为1∶1比例，正如APTT测定所要求的。通过改变所述两股血流的相对流速，使栓塞里的阿加曲班的浓度发生变化。卷绕的通道加入到所述微流体网络的设计中以促进所述栓塞里的试剂的混合。微通道在所述温育区的长度经特别设计从而使得在所述水性和氟化载体流体流的总流速下，所述栓塞的温育时间为3分钟，正如APTT测定所指定的(图27，微通道网络的上部区域)。

所述溶合结合部需要用于在温育后将CaCl₂注射到栓塞中(图27，微通道网络的右侧)。关于该结合部的更多信息以下给出。为加速CaCl₂在所述栓塞里的混合，在所述微通道网络中设计有另一卷绕通道。当所述血液的栓塞和所述CaCl₂溶液在所述溶合结合部混合时，确定所述APTT的开始时间(t＝0)。这与在临床实验室中使用的APTT测定的开始时间等于将CaCl₂加入到所述血液样品中的时间是相一致的。然而，在预备微流体试验中，所述凝结时间似乎取决于所述混合速率。已知混合速率影响各种大量的自催化体系。

为了在所述栓塞里更可靠地运输所述纤维蛋白凝块而不粘附于所述PDMS微通道壁，所述微通道表面首先用氟化硅烷进行处理，然后涂覆无定形特氟隆。为确定在所述栓塞里形成纤维蛋白凝块的时间点，在所述检测区(图27，所述微通道网络的下部区域)用明视野和荧光显微术获取图像并分析。

将液流溶合到流动栓塞的两种新方法

为对基于栓塞的微流系统进行多步测定，将试剂注射到栓塞中是必须的。对于栓塞类微流体学之前已开发出有三种溶合方法：i)在其移动通过含有试剂的通道时将试剂直接注射入栓塞；ii)当液滴和栓塞35的形成之间的频率相吻合时，将小液滴溶合到所述主要通道中的邻近较大的栓塞中；iii)将10滴更小的液滴溶合到单个较大的栓塞中。然而，这三种方法难以在该测定中实现。在这些低流速下(对所述CaCl₂流，0.1～0.2mm/s)，当CaCl₂直接注射到经过的栓塞中时在所述侧通道中发生CaCl₂流的污染(图28a)。如果使用更小宽度和高度的侧结合部，形成CaCl₂的小液滴而在所述结合部不与经过的栓塞相溶合(图28b)。

图28描述了用疏水性侧通道在微流装置里溶合。在图28a中显示的是当所述侧通道是疏水性时(硅烷化的PDMS)，在所述侧通道较大(200μm宽和250μm高)时污染如何发生(在5次试验中有5次发生)。图28b描述了当所述侧通道太小时(20μm的宽和高)，不发生溶合(4次试验中有4次不发生)。另一种溶合的方法是以与所述经过的栓塞相同的频率形成CaCl₂液滴。图28c显示了在所述结合部，在所述经过的栓塞间的所述载体流如何流入所述侧臂从而从所述CaCl₂流中撞出液滴。在图28d中显示的是在不同水分数wf(Δ)中对于U_CaCl2/U_水性＝0.125，获得持续溶合。在恒定的wf＝0.4，仅对于U_CaCl2/U_水性＝0.125(■)，测得了高百分比的溶合(95％)。每个符号表示来自100个栓塞的测量结果。所有的比例尺均为100μm。

本发明人实现了两种新的溶合方法。对于第一种方法，所述溶合结合部经过设计使得所述栓塞间的氟化载体流流入所述侧臂中而在转角体积中撞出CaCl₂的液滴(图28c)。为了实现该设计，所述水性栓塞和栓塞间的载体流间隔的尺寸表征为不同的水分数，wf。使用该设计，在经过该结合部的栓塞和在所述转角部分中形成的液滴间的频率相匹配。成功的溶合取决于U_CaCl2/U_水性的比率而不是所述水分数wf。水分数wf＝U_水性/U_总量，其中U_水性[μL/min]是所述血液和Alexin的水性流的总体积流速。U_总量[μL/min]是所述血液、Alexin和载体流的总体积流速，而U_CaCl2[μL/min]是CaCl₂流的流速。存在栓塞长度和栓塞间载体流体流作为wf和U_总量[μL/min]的函数的依赖性。对于wf＝0.4，当U_CaCl2/U_水性＝0.125时，观察到最高百分比的成功溶合事件(95％)，其中U_CaCl2保持在0.1μL/min(图2d，实心符号)。如果U_CaCl2/U_水性保持在0.125，对于从0.36～0.45的不同wf观察到成功的溶合(92％～99％)(图2d，空心符号)。该方法的优点是不需要更多的制造尝试。然而，在较大范围的U_CaCl2/U_水性中不能持续一致地出现溶合。

图29a描述了使用插入在侧通道中的亲水性玻璃毛细管的持续一致的溶合。图29b显示了进入所述栓塞的CaCl₂的注射体积V_{注射的CaCl2}[nL]是如何受到流速[μL/min]的控制的，其中，U_CaCl2是CaCl₂流的流速，U_水性是Alexin和血液流的总水性流速。在所述图中，每个符号表示10个栓塞的测量结果。至少两个符号是为U_CaCl2/U_水性的每一个值显示的，其中一些符号重合。

在图29a中显示的方法依赖于对所述侧通道的表面化学的控制。使用小侧通道以避免后-污染(back-contamination)(如图28b中所示)但其形成为亲水性的。通过将亲水性毛细管插入到该侧通道中从而制造溶合结合部。由于浸润性所述CaCl₂溶液保持吸附于所述毛细管，而没有形成在图28b中看到的不希望的液滴。在此实例中，重要的是(i)为了使该方法工作，用所述主通道的边缘插入所述毛细管流，和(ii)具有比CaCl₂液滴尺寸更大的血液栓塞尺寸(U_CaCl2/U_水性＜1，在此处的试验中通常为0.17～0.33)。当这两个要求满足时，在本发明人用于APTT测定的水性流的流速(0.6～2.4μL/min)和CaCl₂流的流速(0.2～0.4μL/min)下，观察到持续一致的溶合(100％，在不同装置中进行超过40次的试验)。注射到所述栓塞中的CaCl₂体积，V_{注射的CaCl2}[nL]随着U_CaCl2/U_水性线性地增加(图29b)。通过控制所述流速，可容易地对注射试剂的量进行精确控制。该溶合方法可用于在测量APTT时直接注射CaCl₂溶液。

检测栓塞里的凝块和分析图像以测量所述APTT和凝血酶形成

所述APTT是由加入CaCl₂至在所述血液样品中检测到纤维蛋白凝块所经过的时间。在测试中心所使用的大多数床旁分析装置(point-of-caredevice)和商售机器中，通过检测光学透光度的变化或磁微粒的移动来检测所述纤维蛋白凝块的形成。此处，在栓塞里的纤维蛋白凝块是用明视野显微术检测，而在栓塞里的凝血酶形成是用荧光显微术检测的。通过分析获取的栓塞移动通过所述微通道的图像，本发明人建立了测定栓塞中APTT的标准化方法。

检测供体全血栓塞中的纤维蛋白凝块。对于用全血形成的栓塞，明视野显微术用于检测在所述纤维蛋白凝块中俘获的红细胞(RBC)。图30描述了使用明视野显微术观察全血的栓塞中的凝块。图30a描述了在单个全血栓塞移动通过所述微通道时如何对其进行跟踪。时间t[秒]是所述栓塞在与CaCl₂溶合后移动的时间。当红细胞不再在所述栓塞里移动并在所述栓塞的后半部观察到致密凝块时，认为所述栓塞里的全血完全凝结(a，底部图像)。图30b描述了如何通过分析栓塞的图像(如在a中的)，测定所述检测区里每个时间点的含有纤维蛋白凝块的栓塞的百分比。在每个时间点总共至少采用20个栓塞进行测定。试验在23℃进行。

所述APTT经测定为RBC在所述栓塞里不再移动(相对于所述所述流过所述微通道的运动)的时间。以2帧/秒获取单个栓塞的系列图片。为跟踪单个栓塞，所述显微镜台以相对于所述栓塞移动通过所述微通道的速度相同的速度移动。在凝结前，所述RBC均匀分布并在所述栓塞里由于内部循环而移动。在一些时间以后，在所述栓塞里出现小块的RBC，但其他RBC依然通过内部循环而移动(图30a，顶图t＝121sec)。在移动栓塞里的剪切力(约2s^-1)远比通过激活血小板而诱导凝结所需的剪切力(约750s^-1)要小。在随后的时间，在纤维蛋白凝块中俘获的更大更致密的RBC块移动到所述栓塞的后半部，而其他RBC由于被俘获在所述纤维蛋白网络中而不移动(图30a，底图，t＝136sec)。对于在图30a中显示的栓塞，在23℃，栓塞的APTT是t＝136sec。t_转换[s]定义为由凝结的第一迹象(图30a，顶图)至RBC不再相对于栓塞移动时(图30a，底图)所经历的时间。对于在图30a中显示的栓塞，t_转换为15秒。

也可从许多栓塞统计地确定所述APTT。在每个时间点，对至少20个栓塞获取图像。由每个时间点的一组图片，对含有纤维蛋白凝块的栓塞数目计数。该数目除以栓塞的总数目得到在每个时间点的“凝结的栓塞的百分比”(图30b)。所述APTT为50％的全血栓塞凝结的时间。所述ATPP在23℃时为122秒(图30b)，与之前测量的ATPP在23℃的175±58秒和在25℃的104±20秒相一致。由9个全血栓塞所测得的平均t_转换为15.4±2.8秒。

检测由供体血浆(富含血小板)形成的栓塞里的凝块。临床实验室经常用血浆而不是全血测量APTT。本发明人用两种方法测定血浆中的APTT：用明视野显微术观察致密纤维蛋白凝块的形成和用荧光显微术检测荧光底物由凝血酶所导致的切割。

图31描述了使用明视野和荧光显微术观察在富含血小板的血浆(PRP)的栓塞中的纤维蛋白凝块的形成。图31a显示了在单个血浆栓塞移动通过所述微通道时如何对其进行跟踪(a，左图)。用数字索贝尔滤镜处理明视野图像以更加容易地看到凝块(a，右图)。当所述纤维蛋白凝块致密化进入所述栓塞的后半部并且所述栓塞的后续图像看起来一样(对比t＝112.5秒的图和t＝115.5秒的图)时，认为血浆已经完全凝结。图31b描述了在血浆中含有凝血酶的荧光底物的栓塞如何形成。所述底物的荧光强度增加。在此图中，每条黑色虚线表示来自个体栓塞的荧光强度，其中当单个栓塞移动通过所述微通道时，对其进行跟踪(总共显示了4个栓塞)。用荧光显微术收集的图像中得到的整合强度与用明视野显微术得到的图像中观察到的凝结栓塞的百分比(红色方形)进行比较。当所述荧光强度为最大荧光信号的约30％时，约50％的栓塞凝结。每个符号表示在所述检测区的每个时间点至少10个栓塞的测量结果。试验在23℃进行。

为了使用明视野显微术观察血浆中的纤维蛋白凝块，对移动通过所述微通道的单个栓塞获取了时间序列图像(图31a，左图)。借助于数字回旋滤镜索贝尔(来自Metamorph software)的使用来对所述凝块进行视觉检测(图31a，右图)。对于在图31a中显示的栓塞，所述APTT为约113秒，t转换为14秒。t转换[s]定义为由凝结的第一迹象(图31a，第一幅图)至纤维蛋白凝块不再相对于栓塞移动时(图31a，第五幅图)所经历的时间。

使用荧光显微术，可以对于血浆栓塞获得所述凝血酶形成的更量化的测定。本发明人使用凝血酶的荧光底物。当被凝血酶切割时，所述底物的荧光强度增大约10倍。凝血酶是在所述凝结网络中形成的最终酶，并且它通过切割纤维蛋白原驱动形成纤维蛋白。纤维蛋白凝块在低浓度的凝血酶(2～10nM)下形成，而大部分的凝血酶(约1μM)是在所述凝块完全形成后产生的。相比所述底物，凝血酶更倾向于切割纤维蛋白原。

当单个血浆栓塞移动通过所述微通道时对其进行跟踪，荧光强度经测量为时间的函数(所示为4个栓塞，每个栓塞由一条黑色虚线表示，31b)。虽然每个单独栓塞的实际APTT并不相同，但相对荧光强度由0增加至1所需的时间是相同的。为测定多个栓塞的平均APTT，本发明人将通过明视野显微术的纤维蛋白凝块的检测与通过荧光显微术的凝血酶形成的检测相关联。在每个时间点由明视野和荧光显微术从相同试验获取图像。明视野图像经过分析以测定作为时间的函数的凝结栓塞百分比。所述APTT(约100秒)测定为50％的栓塞含有纤维蛋白凝块的时间。该APTT与荧光强度为最大荧光信号的约30％相关联(图31b)。

阿加曲班的滴定和APTT和凝血酶形成的测量

为测定所述抗凝剂对APTT的影响，在将阿加曲班滴定到正常汇集血浆、供体血浆或供体全血的样品中时测量APTT。正常汇集血浆的APTT的测量是在中心临床实验室中的凝结仪器的标准校准过程。因此，本发明人也由正常汇集血浆得到APTT。对于芯片上滴定，两股入流血液中的一股含有3μg/mL的阿加曲班。通过改变这两股血流的相对流速，改变所述栓塞里的阿加曲班的浓度。试验在23℃和37℃进行。

图32描述了在23℃，当阿加曲班滴定入血液样品时，凝血酶形成和APTT的测量。图32a、b描述了在血浆中凝血酶形成的检测。图32c显示了在全血中APTT的测量结果。图32d显示了由(c)所得的APTT比率。在所述栓塞里的阿加曲班的浓度为0μg/mL、0.5μg/mL、0.75μg/mL和1.0μg/mL。每个符号表示至少20个栓塞的测量结果。如图32c所示，对于全血样品，所述APTT是凝结的栓塞的百分比为50％时的时间。图32d描述了如何测定全血样品在每个浓度的阿加曲班下的APTT比率。所述APTT比率是具有阿加曲班的APTT与没有阿加曲班的基线APTT的比率。

对在23℃进行的试验，阿加曲班对供体血浆样品的凝血酶形成的影响令人满意地与所述正常汇集血浆的结果相一致(图32a、b)。所述APTT比率是血浆中具有阿加曲班的APTT与没有阿加曲班的基线APTT的比率。对于供体全血样品，在23℃的APTT比率显示了对阿加曲班浓度的依赖性(图32d)。通常，0.2～2.0μg/mL的阿加曲班剂量是得到1.5～3.0的APTT比率所需要的。在23℃，使用该芯片上APTT测定，对于0.5μg/mL的阿加曲班剂量，得到2.3的APTT比率，对于1.0μg/mL的阿加曲班剂量，得到2.8的APTT比率(图32d)。对于该供体，观察到APTT比率对阿加曲班浓度的非线性依赖性。所述依赖性从血浆试验至全血试验是可以再现的。

在37℃生理温度下进行试验需要求所述方案进行两个修改。首先，使用更浓的特氟隆AF溶液(2.5％w/v代替23℃测量所用的1％w/v)涂覆所述微通道以防止纤维蛋白凝块粘附到所述微通道壁上。纤维蛋白凝块在较高温度下更容易粘附到所述通道壁上。第二，采用Alexin和血液样品的更高注射流速以形成更大的栓塞(栓塞的宽度-长度比为约1∶3)。

图33描述了在37℃将阿加曲班滴定入(a)正常汇集血浆和(b)供体血浆中时的APTT测量结果，以及所述(c)APTT和(d)APTT比率的对应值。对于两个血浆样品，所述APTT为50％的栓塞含有纤维蛋白凝块的时间。在所述栓塞里的阿加曲班的浓度为0μg/mL、0.25μg/mL、0.5μg/mL和1.5μg/mL。每个符号表示至少20个栓塞的测量结果。图33c描述了正常汇集血浆的临床APTT的值如何比用所述基于栓塞的微流体试验测量的正常汇集血浆和供体血浆的APTT低约两倍。图33d显示了在正常汇集血浆的临床APTT和所述基于栓塞的微流体试验的正常汇集血浆和供体血浆的APTT之间，所述APTT比率如何很好地相吻合。

以与23℃试验相同的方式滴定阿加曲班，在37℃测量了正常汇集血浆(图33a)和供体血浆(图33b)的APTT。在37℃获得的APTT比率在23℃获得的APTT短约2.5倍。在这两个温度下的APTT比率相似。在0.5μg/mL的阿加曲班在23℃得到2.3的APTT比率(图6d)，在37℃得到约2.1的APTT比率(图33b)。1.0μg/mL的阿加曲班在23℃得到2.8的APTT比率(图32d)，在37℃得到2.7的APTT比率(图33d)。在37℃通过芯片上检验测定的APTT值和APTT比率与来自37℃的临床实验室结果相比较。汇集血浆样品与阿加曲班(0～1.5μg/mL)混合并提交给芝加哥大学医院的凝结实验室(Coagulation lab)进行APTT测量。由所述凝结实验室获得APTT与本发明人从芯片上检验获得的APTT有约一半是吻合的(图33c)。然而，来自这两种方法的相应APTT比率彼此非常一致(图33d)。

两项技术的开发使得呈现在该实例中的工作得以进行。首先，特氟隆AF涂层的使用有助于使纤维蛋白凝块尽可能少地粘附到所述微通道的壁上。其次，通过将所述试剂流通过狭窄的亲水性玻璃毛细管注入实现了所述试剂由水性流可靠地加入到栓塞中。该溶合方法对于进行多步检验测定和在栓塞中的反应将是重要的，尤其是在当必须将交叉感染降至最低和试剂的比率必须变化时。本发明的方法将可用于使用血液的其他测定，例如凝血酶原时间(PT)测定和在所述血液样品中的其他待分析物的检测。使用预装载的试剂盒对单个血液样品快速进行多个测试和滴定(Zheng等，2005，Angew.Chem.Int.Edit.44：2520-2523)是可以用该基于栓塞的微流系统实现的令人激动的机遇。

图36是检验以下假设的试验的示意图，所述假设为：重要的是个体补块的尺寸p，而不是总表面积。图36a描述了以下假设，活化表面的小补块(p_s)的阵列并不引发凝结。图36b描述了单个的大补块(p_l)是如何引发凝结的。在(a)中的九个补块的总活化表面积等于(b)中的大补块的总活化表面积。所述活化表面是用于化学模型试验的酸性表面，是用于血浆试验的含有组织因子的带有负电荷的脂质。

图37是检验以下假设的试验的示意图，所述假设为当相距足够近从而通过扩散而连通时，一簇亚阈值补块将引发凝结。图37a描述了以下假设，当具有活化表面的一簇亚阈值补块在相隔距离d大于所述扩散长度尺度p_tr时不能引发凝结。图37b显示了当亚阈值补块的分隔距离小于p_tr时，其是如何引发凝结的。所述活化表面是用于化学模型试验的酸性表面，是用于血浆试验的含有组织因子的带有负电荷的脂质。

图38描述了能快速表征个人凝血势的系统的示意图。图38a描述了不同尺寸的补块的单个阵列，可用于快速地测量特定血液样品的补块尺寸阈值。使用两种类型的活化表面，具有重构TF的带有负电荷的脂质(对于外在途径)，和亲水性玻璃(对于内在途径)。图38b描述了如何能在微流体通道里制造补块阵列。每个通道可含有一系列的组织因子补块和一系列的亲水性玻璃补块。在通道间，诸如补块尺寸范围、TF浓度和药物剂量等参数可以变换。对于大数量的和多类型的样品，包括商购可得的具有凝血因子异常的血浆样品和添加了诸如阿加曲班和肝素等药物的血样，可以实现高通量测量。

应当理解的是，本发明并不局限于所描述的特定的装置、方法学、方案、受试对象或试剂，并且这些都是可变化的。也应当理解的是，此处所使用的术语仅是为了描述特定实施方式的目的，而并非旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅仅由权利要求所限定。对于本领域技术人员而言显而易见的对通常能遇到的各种条件和参数的其他合适的修改和适应调整是在本发明的范围之内。所有引用的出版物、专利和专利申请在此为所有目的以参考的方式全文引入。为所有目的以参考的方式全文引入的还有在线提供的与一些上述引用的出版物相关的补充材料(包括信息、文本、图片、图像、表格和电影)。

Claims

1.一种用于检验凝结活性的设备，所述设备包括：

输入血液流体的入口；

与所述入口以流体连通的导管；和

在所述导管中的至少第一补块和第二补块，其中

(a)所述补块各自包含当与来自受试对象的血液流体接触时能够引发凝结途径的激活材料；和

(b)(i)所述第一补块中的所述激活材料不同于所述第二补块；或

(b)(ii)所述第一补块中的激活材料的浓度不同于所述第二补块；或

(b)(iii)所述第一补块具有不同于所述第二补块的表面积；或

(b)(iv)所述第一补块具有不同于所述第二补块的形状；或

(b)(v)所述第一补块具有不同于所述第二补块的尺寸。

2.如权利要求1所述的设备，所述设备包括多个补块。

3.如权利要求2所述的设备，其中第一组两个补块的补块间距离不同于第二组两个补块的补块间距离。

4.如权利要求2所述的设备，其中第一组补块处在第一位置并且第二组补块处在第二位置；并且其中所述第一组中的补块数量不同于所述第二组中的补块数量。

5.如权利要求1所述的设备，其中所述激活材料包含至少一种选自由以下凝结刺激物组成的组中的至少一种凝结刺激物：组织因子、因子II、因子XII、因子X、玻璃、玻璃样物质、高岭土、硫酸葡聚糖、淀粉样蛋白β、鞣花酸、细菌和细菌组分。

6.如权利要求1所述的设备，其中所述补块是珠子。

7.如权利要求1所述的设备，所述设备还包括珠子，其中所述补块与所述珠子联合。

8.如权利要求1所述的设备，所述补块还包含惰性材料。

9.如权利要求1所述的设备，其中所述导管包含二个相交的微通道，并且其中所述通道彼此流体连通。

10.一种检验凝血的方法，所述方法包括：

将来自受试对象的血液流体与至少第一补块和第二补块接触，其中

(b)(iii)所述第一补块具有不同于所述第二补块的表面积；或

(b)(iv)所述第一补块具有不同于所述第二补块的形状；或

(b)(v)所述第一补块具有不同于所述第二补块的尺寸；以及

测定哪些补块引发来自所述受试对象的所述血液流体的凝结。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述激活材料能够在来自健康的受试对象的血液流体中引发凝结途径。

12.如权利要求10所述的方法，其中所述接触的时间足以使至少最大的补块能够在来自健康的受试对象的血液流体中引发凝结途径。

13.如权利要求10所述的方法，所述方法还包括其中联合有补块的表面。

14.如权利要求13所述的方法，所述方法还包括将来自所述受试对象的血液流体与所述表面联合的第三补块接触，并且其中所述第一补块和所述第二补块之间的距离不同于所述第二补块和所述第三补块之间的距离。

15.如权利要求13所述的方法，其中所述表面是微流体通道。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述血液流体以通过非混溶性质所区分开的液滴的形式与补块相接触。

17.如权利要求15所述的方法，其中所述血液流体作为连续流与所述补块接触。

18.如权利要求10所述的方法，其中所述补块各自独立地为珠子。

19.如权利要求10所述的方法，其中所述补块各自独立地与珠子联合。

20.如权利要求18所述的方法，其中各个所述珠子的所述尺寸或形状不相同。

21.如权利要求10所述的方法，其中所述凝结途径是血小板凝集途径。

22.如权利要求10所述的方法，其中所述接触包括首先使第一量的血液流体与第一浓度的珠子进行第一接触，和使第二量的血液流体与第二浓度的珠子进行第二接触；其中各珠子独立地与含有激活材料和惰性材料的补块联合。

23.如权利要求21所述的方法，其中用尺寸逐渐增大的珠子滴定血液流体的等分试样。

24.如权利要求10所述的方法，其中所述测定包括光学观测。

25.如权利要求10所述的方法，其中所述测定包括测量光的散射。

26.如权利要求10所述的方法，其中所述血液流体为选自由全血、血液组分、血浆、血浆蛋白溶液和血液细胞溶液组成的组。

27.如权利要求10所述的方法，所述方法还包括首先将过量的凝血因子加入到所述血液流体中然后使所述血液流体与所述补块接触。

28.如权利要求10所述的方法，所述方法还包括将测试物质加入到血液流体中然后使所述血液流体与所述补块接触。

29.如权利要求10所述的方法，所述方法还包括监测血液凝块的增长速度。

30.如权利要求10所述的方法，所述方法还包括将来自不同受试对象的血液流体加入到所述血液流体中然后使所述血液流体与所述补块接触。

31.一种用于测量凝块增长的设备，所述设备包括：

包含激活材料的第一区域；和与所述第一区域连通的适用于监测凝块增长的第二区域；其中当所述血液流体被放在所述第一区域时，凝块形成并增长至所述第二个区域。

32.如权利要求31所述的设备，所述设备还包括含有所述激活材料的补块。

33.如权利要求31所述的设备，其中所述设备包括含有所述第一区域和所述第二区域的微通道。

34.如权利要求31所述的设备，其中所述设备包括多个微通道，各微通道含有隔开的第一区域和第二区域。

35.如权利要求31所述的设备，所述设备包括至少一组交叉的微通道，其中所述第二个区域处在第一组所述微通道的交叉点处。

36.如权利要求35所述的设备，所述设备包括多个微通道和所述微通道的至少两个交叉点，其中所述第二个区域位于其中的一个所述交叉点处，并且其中所述两个交叉点的尺寸不同。

37.一种监测凝块增长的方法，所述方法包括以下步骤：

使血液流体与设备的第一区域接触，所述第一区域包含激活材料；和

监测所述设备的第二区域内的凝块增长，所述第二区域与所述第一区域是连通的。