CN101351542A - 液体加工装置和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了液体加工装置和方法，它们可加工一种或多种不同的液体样品，对它们每一种的检测可多重化以便检测一组靶序列如20种不同靶序列中的每一种是否存在。该装置可包括基底和至少部分地由所述基底限定的一个或多个液体加工通路。每个液体加工通路可包括预扩增区域和两个或多个被置于预扩增区域下游并与其液体相通的扩增区域。可沿每一个液体加工通路设置可爆裂阀，并且该下游区域可含有预装的氨气以便向下游抽吸经扩增样品。

Description

液体加工装置和方法

相关申请的交叉引用

[0001]本申请要求之前于2005年7月15日提交的美国临时专利申请60/699,782的权益，在此通过引用将其整体并入本文。

引言

[0002]本发明涉及加工液体的装置、系统和方法。更具体地，本发明涉及操作、加工或改变液体样品的装置。

概要

[0003]根据不同实施方案，提供了下述液体加工装置，其中样品中含有的多种不同核酸序列可被预扩增，以产生多种不同的经预扩增序列，然后可以采用单一装置，对所述多种不同的经预扩增序列中的一种或多种靶核酸序列进行扩增。该液体加工装置可包括微流装置。

[0004]根据多种不同的实施方案，提供了下述液体加工装置，其可包括：可包括第一表面、相反的第二表面和厚度(thickness)的基底；和一个或多个至少部分地由该基底所限定的液体加工通路；所述一个或多个液体加工通路的每一个可包括第一区域和两个或多个第二区域，其中第一区域可包括被置于其中的预扩增反应组分，其可适合于预扩增存在于样品中的多种不同核酸序列，以产生多种经预扩增序列，第二区域的每一个都与第一区域液体相通，并且可包括被置于的扩增反应组分，其可适合于对多种经预扩增序列中的一种或多种靶序列进行扩增，以产生一种或多种经扩增靶序列。

[0005]根据多种不同的实施方案，提供了下述液体加工装置，其可包括：具有第一表面和相反的第二表面的基底；和一个或多个可至少部分地由基底所限定的液体加工通路，所述一个或多个液体加工通路的每一个可包括至少一个热介导的、压力启动的阀，当横跨该阀施加至少两个大气压的压力以及该阀被加热至约100℃至约150℃(如约110℃至约130℃)的温度时，所述阀可适于爆裂。

[0006]根据一些实施方案，提供了下述液体加工装置，其可包括：具有第一表面和相反的第二表面的基底；和一个或多个至少部分地由基底所限定的液体加工通路，所述一个或多个液体加工通路的每一个可包括第一区域和一个或多个置于第一区域下游并与其液体相通的密封区域，所述一个或多个密封区域的每一个包括可包含氨气。在一些实施方案中，所述一个或多个液体加工通路还可包括置于第一区域和所述一个或多个密封区域之间并与它们液体相通的阀。

[0007]根据一些实施方案，提供了下述液体加工系统，其可包括液体加工装置和与所述液体加工装置的每一个液体加工通路的两个或多个第二区域光学和/或电化学相通的检测器，该检测器可适合于检测所述两个或多个第二区域中的一种或多种经扩增靶序列，其中该靶序列的每一种被各自的可检测标记所标记。该液体加工系统可包括热循环装置。如果包括的话，该热循环装置可包括例如半导体制冷装置(peltier device)或其它已知的加热装置。可使用的示例性半导体制冷装置包括于2004年8月26日提交的美国专利申请10/926,915中所描述的那些，在此通过引用将其整体并入本文。该热循环装置可提供两个或多个不同的温度区，例如，以便将液体加工装置的两个部分加热至两种不同温度，和/或提供热区和冷区。

[0008]根据一些实施方案，提供了下述液体加工方法，其包括：提供液体加工装置，其可包括一个或多个液体加工通路，每一个液体加工通路包括与两个或多个第二区域液体相通的第一区域；向该液体加工装置的第一区域引入可包含多种不同核酸序列的液体样品；在第一区域中预扩增多种不同核酸序列，以产生包含多种经预扩增核酸序列的经预扩增液体样品；将经预扩增液体样品从第一区域移至所述两个或多个第二区域；以及，在所述两个或多个第二区域的每一个中对所述多种经预扩增核酸序列的至少一种各自的靶核酸序列进行扩增，以在所述两个或多个第二区域的每一个中产生至少一种各自的经扩增靶核酸序列。

[0009]根据一些实施方案，提供了下述液体加工方法，其可包括：提供液体加工装置，其可包括一个或多个液体加工通路，该液体加工通路的每一个包括第一区域和至少一个被置于所述第一区域下游并与其液体相通的密封区域，其中所述至少一个密封区域可包含氨气；在第一区域中保留液体样品；以及使液体样品与氨气接触，使得随着氨气溶解进液体样品从第一区域吸出液体样品。这种通过溶解作用进行的液体吸出可发生多次，例如，以将液体和/或其反应产物顺序吸入两个或多个不同区域。

[0010]根据多种不同的实施方案，对一种或多种靶核酸序列进行的预扩增和扩增可在单个液体加工装置(如单个微流加工装置)中完成。在一些实施方案中，预扩增和扩增连同样品制备、测序反应和检测反应中的一种或多种都可在单个液体加工装置中完成。

[0011]根据一些实施方案，提供了下述液体加工装置和方法，它们可加工多至50种不同液体样品，每一种都是针对一组病原体(如20种病原体)多重化的(multiplexed)。根据一些实施方案，提供了下述液体加工装置和方法，它们可鉴定病原体、抗生素抗性、物种起源、突变、癌症或其它基因组病症。该液体加工装置和方法可对单种分子敏感，并且可以是菌株特异性的。

[0012]根据不同实施方案，提供了这样的方法，其可包括多重扩增过程，例如多重PCR过程。该过程可包括：在液体加工装置的液体加工通路的第一或预扩增区域中，采用靶区域外侧引物，预扩增包含核酸分子的一个以上片段的大区域，接着可以是：在与该装置的第一或预扩增区域液体相通的第二或扩增区域中，采用特异于每一位点的引物扩增每一靶区域。这种方法使得能同时检测特定基因或几个基因中一个以上的多态区。

[0013]以下说明书中示出了本发明的其它特征和优点中的部分，还有部分会由于这种说明而显而易见，或可由本发明的实施而了解到。通过在下文说明中特别指出的元件和组合，可意识到并实现本发明的目的和其它优点。

[0014]应当理解，前面的一般性说明和以下的详细说明仅是示例性的和解释性的，它们旨在为本发明提供进一步的解释。

附图

[0015]在附图中举例说明了本发明的多种不同实施方案。本发明不限于绘制在附图中的实施方案，其包括在以下说明中示出的以及本领域普通技术人员结合本发明能够知道的类似结构和方法。附图中：

[0016]图1显示了根据多种不同实施方案的液体加工装置的平面图；

[0017]图2显示了根据一些实施方案的液体加工装置的平面图；

[0018]图3显示了图2中显示的液体加工装置的横截面图；

[0019]图4显示了根据多种不同实施方案的液体加工装置的平面图；

[0020]图5-10显示了根据本发明的多种不同实施方案的系统，其包括预扩增阵列、混合阵列和微流卡；以及

[0021]图11显示根据本发明其它多种不同实施方案的系统。

[0022]应当理解，以下的说明仅为示例性和解释性的。附图被并入本申请并构成其一部分，它们与说明书一起说明了若干示例性实施方案。现在将参考多种不同的实施方案，它们的实例在附图中有图解。只要可能，在附图和说明书中都用同样的附图标记来表示相同或相似的部件。

说明书

I.概述：

[0023]整份本申请中，对各个实施方案的说明采用“包括”性用语；但是本领域技术人员应理解，在一些特定情况下，备选地，实施方案可采用“基本上由...组成”或“由...组成”的用语来描述。

[0024]为更好地理解本发明而非限制本发明范围的目的，本领域技术人员应清楚，除非另有明确说明，单数的使用包括复数。因此，术语“一个/一种”(“a”、“an”)和“至少一个”在本申请中可互换使用。

[0025]除非另有指明，用在说明书和权利要求书中的所有表述数量、百分比或比例的所有数字以及其它数值应被理解为在所有情况下都被词语“约”所修饰。因此，除非有相反说明，在以下说明书和所附权利要求书中列出的数字参数为近似值，其可以根据所想获得的期望性质而变化。在一些情况下，“约”可被理解为给定值±5％。因此，例如约100nl，可指95-105nl。至少，每个数字参数应至少根据所报道的有效数字值并通过应用通常的舍入技术来理解。

[0026]用于本文中时，用语“数个”可被理解为“两个或多个”。这时，用语“两个或多个”与用语“数个”同义使用。

[0027]申请人明确地将在本公开中引用的所有文献的全部内容并入。此外，当数量、浓度或其它值或参数以范围、优选范围或一系列较高优选值和一系列较低优选值给出时，这应当被理解为明确公开了由任何上限范围值或优选值和任何下限范围值或优选值的任何配对所形成的所有范围，无论这些范围是否被独立公开。当在本文中提到数值范围时，除非另有说明，该范围旨在包括其端点和该范围内的所有整数和分数。这并不意味着本发明的范围被限制到在定义范围时提到的特定值。

[0028]本文中，术语核酸序列指核苷酸碱基的任何序列，例如，通过糖-磷酸酯骨架结合在一起的序列。用在本文时，术语“核苷酸碱基”指被取代的或未被取代的芳族环或芳族多环。在某些实施方案中，芳族环或芳族多环含有至少一个氮原子。在某些实施方案中，核苷酸碱基能够与适当互补的核苷酸碱基形成Watson-Crick和/或Hoogsteen氢键。示例性核苷酸碱基及其类似物包括但不限于，天然产生的核苷酸碱基腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、6甲基-胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶，以及天然产生的核苷酸碱基类似物，例如，7-脱氮腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮-8-氮杂鸟嘌呤、7-脱氮-8-氮杂腺嘌呤、N6-Δ2-异戊烯基腺嘌呤(6iA)、N6-Δ2-异戊烯基-2-甲硫基腺嘌呤(2ms6iA)、N2-二甲基鸟嘌呤(dmG)、7-甲基鸟嘌呤(7mG)、次黄嘌呤核苷、水粉蕈素、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、次黄嘌呤、假尿嘧啶核苷、假胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、2-硫代嘧啶、6-硫代鸟嘌呤、4-硫代胸腺嘧啶、4-硫脲嘧啶、O6-甲基鸟嘌呤、N6-甲基腺嘌呤、O4-甲基胸腺嘧啶、5，6-二氢胸腺嘧啶、5，6-二氢尿嘧啶、吡唑并[3，4-D]嘧啶(参见，例如美国专利6,143,877和6,127,121以及PCT公布的申请WO 01/38584)、亚乙烯基腺嘌呤、吲哚类如硝基吲哚和4-甲基吲哚、以及吡咯类如硝基吡咯。某些示例性核苷酸碱基可例如在Fasman，1989，Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology，pp.385-394，CRC Press，Boca Raton，Fla.以及其中引用的文献中找到。

[0029]用于本文中时，术语“核苷酸”指这样的化合物，其包含连接至糖(诸如核糖、阿拉伯糖、木糖、吡喃糖)及其糖类似物的C-1′碳上的核苷酸碱基。术语核苷酸也包括核苷酸类似物。糖可以是被取代的或未被取代的。被取代的核糖包括但不限于其中一个或多个碳原子如2′-碳原子被一个或多个相同或不同Cl、F、-R、-OR、-NR2或卤素基团取代的那些核糖，其中每个R独立地为H、C1-C6烷基或C5-C14芳基。示例性核糖包括但不限于2′-(C1-C6)烷氧基核糖、2′，3′-二脱氢核糖、2′-脱氧-3′-卤代核糖、2′-脱氧-3′-氟核糖、2′-脱氧-3′-氯核糖、2′-脱氧-3′-氨基核糖、2′-脱氧-3′-(C1-C6)烷基核糖、2′-脱氧-3′-(C1-C6)烷氧基核糖和2′-脱氧-3′-(C5-C14)芳氧基核糖、核糖、2′-脱氧核糖、2′，3′-二脱氧核糖、2′-卤代核糖、2′-氟代核糖、2′-氯代核糖、以及2′-烷基核糖，例如2′-O-甲基，4′-异头核苷酸、1′-异头核苷酸、′-4′-和3′-4′-连接的以及其它“锁定的”或“LNA”，双环糖修饰物(参见，例如PCT公开的申请WO 98/22489，WO 98/39352；和WO 99/14226)。示例性的多核苷酸中LNA糖类似物包括但不限于以下结构：

其中B为任何核苷酸碱基。

[0030]在核糖2′-或3′-位进行的修饰包括但不限于氢、羟基、甲氧基、乙氧基、烯丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、甲氧基乙基、烷氧基、苯氧基、叠氮基、氨基、烷基氨基、氟、氯和溴。核苷酸包括但不限于天然D光学异构体以及L光学异构形式(参见，例如Garbesi(1993)Nucl.Acids Res.21：4159-65；Fujimori(1990)J.Amer.Chem.Soc.112：7435；Urata，(1993)Nucleic Acids Symposium Ser.No.29：69-70)。当核苷酸碱基为嘌呤即A或G时，核糖连接到核苷酸碱基的N9位。当核苷酸碱基为嘧啶即C、T或U时，除了假尿嘧啶核苷以外，戊糖连接到核苷酸碱基的N1位，在假尿嘧啶核苷中，戊糖连接到尿嘧啶核苷酸碱基的C5位(参见，例如Romberg and Baker，(1992)DNA Replication，2ndEd.，Freeman，San Francisco，CA)。

[0031]核苷酸的一个或多个戊糖碳可以被具有下式的磷酸酯取代：

其中α是0至4的整数。

[0032]在一些实施方案中，α是2并且该磷酸酯连接到戊糖的3′或5′碳。在一些实施方案中，核苷酸是其中核苷酸碱基是嘌呤、7-脱氮嘌呤、嘧啶或其类似物的那些核苷酸。“核苷酸5′-三磷酸”指在5′位具有三磷酸酯基团的核苷酸，其有时被表示为“NTP”或“dNTP”和“ddNTP”，以特别指出该核糖的结构特点。三磷酸酯基团可以包括对多种不同的氧进行的硫取代，例如-硫代-核苷酸5′-三磷酸。关于核苷酸化学的综述，参见：Shabarova，Z.and Bogdanov，A.Advanced Organic Chemistry ofNucleic Acids，VCH，New York，1994。

[0033]用于本文中时，术语“核苷酸类似物”指下述实施方案，其中核苷酸的戊糖和/或核苷酸碱基和/或一个或多个磷酸酯可以被其各自的类似物所替换。在某些实施方案中，示例性的戊糖类似物为上文描述的那些。在某些实施方案中，核苷酸类似物具有上文描述的核苷酸碱基类似物。在某些实施方案中，示例性磷酸酯类似物包括但不限于：烷基磷酸酯、甲基磷酸酯、磷酰胺酯(phosphoramidates)、磷酸三酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、phosphoroanilothioates、phosphoroanilidates、磷酰胺酯(phosphoroamidates)、硼磷酸酯(boronophosphates)等，并且可以包括结合的平衡离子。

[0034]包括在核苷酸“类似物”定义内的还有核苷酸类似物单体，其可被聚合成多核苷酸类似物，在该多核苷酸类似物中DNA/RNA磷酸酯/或糖磷酸酯骨架被不同类型的核苷酸间键合所替换。示例性的多核苷酸类似物包括但不限于肽核酸，其中多核苷酸的糖磷酸酯骨架被肽骨架替换。还包括嵌入(intercalating)核酸(INAs，Christensen and Pedersen，2002中所描述的)和AEGIS碱(Eragen，美国专利5,432,272)。

[0035]用于本文中时，术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”可互换使用，它们指核苷酸单体的单链和双链聚合物，包括通过核苷酸间磷酸二酯腱或核苷酸间类似物连接的2′-脱氧核糖核苷酸(DNA)和核糖核苷酸以及结合的平衡离子，例如H+、NH4+、三烷基铵、Mg2+、Na+，等等。核酸可以完全由脱氧核糖核苷酸组成、完全由核糖核苷酸组成或由其嵌合混合物组成。核苷酸单体单元可以包括本文描述的任何核苷酸，其包括但不限于天然产生的核苷酸和核苷酸类似物。核酸的典型大小范围从数个单体单位(例如，当它们在现有技术中常常被称为寡核苷酸时，5-40个)到数千个单体核苷酸单元。除非另有说明，每当表述核苷酸时，应理解核苷酸从左到右为5′至3′顺序，以及除非另有说明，“A”指脱氧腺苷或其类似物、“C”指脱氧胞苷或其类似物、“G”指脱氧鸟苷或其类似物、以及“T”指胸腺嘧啶脱氧核苷或其类似物。

[0036]核酸包括但不限于基因组DNA、cDNA、hnRNA、mRNA、rRNA、tRNA、片断化核酸、从诸如线粒体或叶绿体的亚细胞器获得的核酸以及从可能存在于生物样品上或样品中的微生物或DNA或RNA病毒获得的核酸。

[0037]核酸可以由单一类型的糖部分构成(例如，在RNA和DNA的情况下)，或者由不同糖部分的混合物构成(例如，在RNA/DNA嵌合体的情况下)。在某些实施方案中，核酸为以下结构式的核糖多核苷酸和2′-脱氧核糖核苷酸：

其中每个B独立地为核苷酸或类似物核苷酸的碱基部分，例如嘌呤、7-脱氮嘌呤、嘧啶；每个m定义各核酸的长度，范围从0至数千、数万或更大；每个R独立地选自氢、卤素、--R″、--OR″、和--NR″R″，其中每个R″独立地为(C1-C6)烷基或(C5-C14)芳基，或者两个邻近的R合起来形成键以使得核糖为2′，3′-二脱氧核糖；以及每个R′独立地为羟基或

其中α为0、1或2。

[0038]在以上图解说明的核糖多核苷酸和2′-脱氧核糖多核苷酸的某些实施方案中，核苷酸碱基B共价连接到糖部分的C1′碳，如之前所描述的。

[0039]术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”还可包括核酸类似物、多核苷酸类似物和寡核苷酸类似物。术语“核酸类似物”、“多核苷酸类似物”和“寡核苷酸类似物”在本文中可互换使用，它们指含有至少一个核苷酸类似物和/或至少一个磷酸酯类似物和/或至少一个戊糖类似物的核酸。包括在核酸类似物定义中的还有磷酸酯和/或糖磷酸酯键被其它类型键替换的核酸，所述其它类型键例如为N-(2-氨基乙基)-甘氨酸酰胺和其它酰胺(参见，例如Nielsen et al.，1991，Science 254：1497-1500；WO 92/20702；U.S.Pat.No.5,719,262；U.S.Pat.No.5,698,685)；吗啉代(参见，例如U.S.Pat.No.5,698,685；U.S.Pat.No.5,378,841；U.S.Pat.No.5,185,144)；氨基甲酸脂类(参见，例如Stirchak&Summerton，1987，J.Org.Chem.52：4202)；亚甲基(甲基亚氨基)(参见，例如Vasseur et al.，1992，J.Am.Chem.Soc.114：4006)；3′-硫甲缩醛(thioformacetals)(参见，例如Jones et al.，1993，J.Org.Chem.58：2983)；氨基磺酸脂类(参见，例如U.S.Pat.No.5,470,967)；2-氨基乙基甘氨酸，常常称为PNA(参见，例如Buchardt，WO 92/20702；Nielsen(1991)Science 254：1497-1500)；以及其它键(参见，例如U.S.Pat.No.5,817,781；Frier&Altaian，1997，Nucl.Acids Res.25：4429以及其中引用的参考文献)。磷酸酯类似物包括但不限于(i)C1C4烷基磷酸酯，例如甲基磷酸酯；(ii)磷酰胺酯；(iii)C1C6烷基-磷酸三酯；(iv)硫代磷酸酯；以及(v)二硫代磷酸酯。

[0040]根据多种不同的实施方案，靶核酸序列可包括任何目的核酸序列，例如核酸、SNP、含有全长或部分目的基因多态区的核酸，等等。

[0041]根据多种不同的实施方案，提供了与样品制备和分析中涉及的过程或行为有关的方法。应当理解，在多种不同的实施方案中，方法可以以所指出过程的顺序来进行，但是在相关实施方案中，为了实现希望的目的，本领域技术人员可认为适当而改变该顺序。

[0042]根据多种不同的实施方案，液体样品可包括含水或非水样品。含水或非水样品可包括任何含有核酸的材料，例如生物材料。含有核酸的材料可包括例如以下材料中的一种或多种：血液；细胞样品；亚细胞的细胞器，例如线粒体或叶绿体；细胞裂解液；组织样品，例如皮肤；细胞培养基；体液，例如唾液、尿或渗出液；活检培养液等。这类含有核酸的材料可包括任何来源，例如，人类来源、动物来源、植物来源、细菌来源、病毒来源，等等。含有核酸的样品可在预扩增之前或在预扩增的同时被处理以获得核酸。可在预扩增之前采用本领域技术人员已知的方法获得核苷酸和核酸。

[0043]根据多种不同的实施方案，加工或反应组分可包括在一个或多个过程中使用所需或所希望的一种或多种组分，例如以任何方式影响所期望反应的进展的组分。加工组分可包括反应性组分。但是，该组分不是必须要参与反应。加工组分可包括非反应性组分。加工组分可包括可回收组分，其可包括例如溶剂和/或催化剂。加工组分可包括启动剂、促进剂或延缓剂，它们不是反应所必需的，但是会影响到反应，例如影响反应速率。术语“反应组分”与术语“加工组分”同义使用，如本文所述。合适的过程可包括一个或多个样品制备过程、样品纯化过程、样品扩增过程、预扩增过程、预扩增产物纯化过程、扩增过程、扩增产物纯化过程、分离过程、测序过程、测序产物纯化过程、标记过程、检测过程，等等。加工组分可包括样品制备组分、纯化组分、预扩增反应组分、扩增反应组分、测序反应组分，等等。无需过度实验，技术人员可容易地选择和采用适于所期望的反应或过程的组分。

[0044]根据一些实施方案，可采用现有技术中任何已知的方法将加工组分或反应组分配置在一个或多种区域或通道中。例如，组件可被喷雾和干燥，采用稀释剂递送，采用毛细管、移液器和/或自动移液器注入，或以其它方式被配置在所述区域或通道中。

[0045]根据一些实施方案，所提供的液体加工装置可包括一个或多个液体加工通路，它们每一个可包括一个或多个元件，例如一个或多个区域、通道、分支通道、阀、分流器、排气口、孔、入口区、通路、小珠、含有反应物的小珠、覆盖层、反应组件、混流器(flow combiner)、集流器(flow merger)、交叉流通路、它们的任意组合等等。任何元件可与另一元件液体相通，其中“液体相通”可被理解为直接的液体相通，例如两区域通过连接该两区域的无阻碍通道相互液体相通，或者被理解为可适合于液体相通，例如当两个区域通过包括有置于其中的密闭阀的通道或其它通路连接时(其中当打开通道中的阀时可在该两区域之间建立液体相通)，其中这两个区域为可适合于液体相通。用在本文时，术语“液体相通”指直接液体相通和/或可适合于直接液体相通，除非另有明确说明。本文也使用术语“有阀的液体相通”，指有阀置于其间的元件，使得在打开或开动阀时，可在该元件间建立液体相通。

[0046]根据多种不同的实施方案，可按照本文所述来使用的阀可例如包括可分解阀、可溶胀阀和/或复合阀，例如2005年10月18日提交的美国专利申请11/252,821、2005年10月18日提交的美国专利申请11/252,912、2005年10月18日提交的美国专利申请11/252,915以及2005年10月18日提交的美国专利申请11/252,914中所描述的，在此通过引用将它们整体并入本文。根据不同实施方案，阀可包括油封通道，例如美国专利申请11/380,327中所描述的，在此通过引用将其整体并入本文。

[0047]涉及核酸的反应可包括酶促反应，其中核酸被扩增以增加靶核酸的量用于分析。其它的反应可例如包括引物延伸反应、测序反应、断裂反应(例如采用特异的内切核酸酶)、核酸错配异型双链的切割反应、寡核苷酸连接反应和单链构象反应。根据多种不同的实施方案，相对于靶序列扩增反应，第二或下游扩增反应可以是产物扩增反应。就此而言，靶序列并不被扩增，而是其一种或多种反应产物以成倍方式产生，最终形成成倍的可检测产物。这种类型的示例性检测法为可从Third WaveTechnologies of Madison，Wisconsin获得的Invader检测法。示例性检测法在Brow等人的美国专利6,706,471和2004年1月22日公布的美国专利申请US 2004/0014067中有描述，在此通过引用将它们整体并入本文。

[0048]核酸扩增反应可包括聚合酶链式反应(PCR)，其可根据现有技术中已知的任何方法进行。例如，在一种PCR方案中，使细胞基因组DNA与两种引物接触，并进行多轮扩增以足以产生所需量的经扩增的DNA。两引物位置可例如间隔约50至350、约50至500、多至约1000或更多碱基对、多至约10,000碱基对，或多至100,000或更多碱基对。

[0049]如果要进行多重PCR扩增，开始将包括核酸分子一个以上片段的大区域用该区域外侧引物扩增，然后采用各位点特异引物扩增每一亚区域或片段，例如嵌套PCR。多重PCR的一些缺点包括PCR引物间的部分结合或PCR引物和其它引物或基因组DNA不同于靶位点的其它区域之间的部分结合，由此导致产生副产物，并且期望PCR产物的产量降低。本领域技术人员熟悉多重PCR的设计和限制。

[0050]可与本发明联合使用的示例性多重方法和装置包括例如在2004年9月9日公布的美国专利申请US2004/0175733中描述的那些，在此通过引用将其整体并入本文。

[0051]扩增核酸的其它方法可包括但不限于微PCR(mini-PCR)、连接酶链反应(LCR)[Wiedmann et al.(1994)PCR Methods Appl.Vol.3，Pp.57-64；Barnay(1991)Proc.Natl.Acad.Sci USA 88：189-93]、链置换扩增(SDA)[Walker et al.(1994)Nucleic Acids Res.22：2670-77]、RT-PCR[Higuchi et al.(1993)Bio/Technology 11：1026-1030]、滚环扩增、重组酶聚合酶扩增(Armes et al.，WO03072805；Piepenburg et al.，US2005112631)、EXPAR(van Ness et al.，WO2004067726)、产生空间定位产物(spatially localized product)的等温核酸扩增(Saba，http://wbabin.net/saba/saba17.htm)、诸如采用QJ复制酶的自身催化方法、TAS、3SR和本领域技术人员已知的任何其它适合的方法。

[0052]其它扩增方法可包括自主序列复制(Guatelli et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87：1874-1878)、转录扩增系统(Kwoh et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：1173-1177)、Qβ复制酶(Lizardi et al.(1988)Bio/Technology 6：1197)或任何其它核酸扩增方法，之后采用本领域技术人员熟知的和本文公开的技术检测经扩增的分子。如果核酸分子以极小的数量存在时，这些检测方案尤其可用于对这些分子加以检测核酸分子。或者，可以采用等位基因特异性扩增技术，其依赖于选择性PCR扩增。用作特异性扩增引物的寡核苷酸可以在分子中部带有目的等位变体(使得扩增依赖于差异杂交)，或者在一个引物的3′末端带有目的等位变体，其中在合适的条件下，错配可防止或减少聚合酶延伸(Prossner(1993)Tibtech 11：238；Newton et al.(1989)Nucl.Acids Res.17：2503)。此外，有可能希望在突变区域中引入限制性位点，以产生基于切割的检测(Gasparini et al.(1992)Mol.Cell Probes 6：1)。

[0053]引物延伸反应：引物延伸反应包括聚合酶介导的核酸链延伸的特异终止，这通过向延伸反应引入链终止剂(如二脱氧核苷酸)来实现。现有技术中已知若干种基于引物延伸的方法，它们已被用于测定核酸序列中特定核苷酸的身份。通常，制备的引物在特定核酸分子中邻近目的位点如多态位点处特异杂交。然后，在一种或多种二脱氧核苷酸存在下延伸，其中通常有至少一种二脱氧核苷酸是该多态位点核苷酸的互补物。

[0054]片断化反应：在包括PCR产物或其它扩增产物在内的特异核酸内是否存在一种或多种突变如多态性，可从这些核酸的片断来确定。可通过不同的化学和/或酶学反应产生这些片断。对于这些片断化反应的任一种，可通过例如电泳、毛细管电泳、质谱等确定反应后获得的核酸片段的分子量。

[0055]可通过其表征全序列的整体片断化模式来表征靶核酸，或通过片断化模式的所选部分来表征。核酸的某些片断可被选择性分离和纯化，例如通过在基底上的杂交或者通过其它特异性相互作用(如一条或多条片断的生物素/链霉亲和素亲和力)来捕获。用于分离和纯化所产生的全部或大部分片断的方法例如包括：通过在一种以及多种基底上的杂交来特异和非特异(例如，通过使用聚肌苷)捕获，所述基底通过离子键、氢键或疏水相互作用、螯合配体、亲和相互作用或通过本领域技术人员已知的其它手段与片断结合。

[0056]产生核酸片断(优选从扩增产物产生片断)的一种方法是使用一种或多种限制酶。对该反应的产物的数量、大小和/或组成的分析将提供关于该核酸和其在一个或多个位点变体的信息。例如，测序反应内的特异核苷酸多态性：多种核酸测序反应在现有技术中是已知的，并可用于鉴定特定核酸。示例性测序反应包括基于Maxam和Gilbert[(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74：560]或Sanger[Sanger et al.(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.74：5463]开发的技术的那些反应。对于一些实施方案，在测序反应中仅需确定一个、两个或三个核苷酸碱基的存在，这对本领域技术人员来说显而易见。例如，可进行A追踪(A-track)测序或类似测序，其中仅检测一种核苷酸。其它的测序方法是已知的(参见，例如标题为“Method of DNA sequencing employing a mixed DNA-polymerchain probe”的美国专利5,580,732和标题为“Method formismatch-directed in vitro DNA sequencing”的美国专利5,571,676)。

多重反应可在第一和第二区域中的一个或多个中进行。在示例性实施方案中，100重(100-plex)反应可在第一区域中进行，例如由此使得100种不同的靶核酸序列被扩增。然后，所述100重产物可被输送至数个第二区域，例如输送至25个反应区域。所述输送可包括形成从第一区域到每个第二区域的流体连通，例如使用数个通道和第一分流器和/或打开阀。在该25个第二区域中，可进行其它的多重反应。例如在该25个第二区域每一个中进行不同的4重反应。在其它实施方案中，可在第一区域中进行20重反应，然后在五个独立的第二区域中进行五个不同的4重反应。

[0058]在另一实施方案中，最初的cDNA样品被分进24个不同的第一区域。在该24区域的每一个中，可进行不同的独立1280重反应。然后，每个第一区域中的扩增产物可被转移进256个独立的第二反应区域中，其中可发生不同的独立5重扩增和/或检测。

[0059]根据一些实施方案，可进行多重反应，用于检测单核苷酸多态性(SNP′s)。在一些实施方案中，反应产物可被连接到分子比例(molecular rate)修饰剂，然后在毛细管电泳分析仪上解析或检测。根据一些实施方案，单核苷酸多态性可在第二区域中被检测。在一些实施方案中，SNP-plex反应可在第一和/或第二区域中进行。

[0060]寡核苷酸连接反应：在被称为核苷酸连接的另一核酸反应方案中，将两种设计来能够与靶核酸的单链的邻近序列杂交的寡核苷酸与样品核酸混合。如果在样品核酸中存在精确的互补序列，则该寡核苷酸将杂交，使得它们的末端邻接并产生连接底物。于是，样品中的核酸可采用寡核苷酸连接测定法(OLA)检测，如Landegren et al.，Science241：1077-1080(1988)中所描述的。Nickerson等人描述了一种核酸检测法，其合并了PCR和OLA的特点[Nickerson et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87：8923-89271。在该方法中，PCR被用于实现靶DNA的指数扩增，然后采用OLA对其进行检测。在另一实施方案中，可先使用OLA，然后是PCR，例如高度多重PCR。通过引用将上述参考文献都并入本文。

[0061]基于该OLA方法的若干种技术已被开发出来，其可用于检测基因多态区的特异等位基因变体。例如，美国专利5,593,826公开了一种OLA，其采用具有3′-氨基基团的寡核苷酸和5′-磷酸寡核苷酸形成具有磷酰胺酯键的偶联物。可使用的其它技术包括OLA-PCR技术和PCR-OLA技术。

[0062]在其它方案中，基于连接酶链反应(LCR)，使靶核酸与一套连接引物(ligation educts)和热稳定DNA连接酶杂交，使得连接酶引物成为彼此共价连接，形成连接产物。可用于核酸反应中的试剂：由涉及核酸的反应的类型显而易见的是，多重试剂可用在这类反应中。反应物包括酶(例如，聚合酶、内切酶、外切酶、核酸酶S1、连接酶)、引物、寡核苷酸、脱氧核苷三磷酸(dNTPs)和二脱氧核苷三磷酸(ddNTPs)。

[0063]在其它实施方案中，核酸序列可被连接至蛋白、抗体和抗原。这些方法在文献中被称为免疫PCR(Sano et al，Science 258，120-122(1992)，Sims et al.，Anal.Biochem 281，230-232(2000))和邻近连接测定法(Fredriksson et al.，Nature Biotechnology 20，473-477(2002))。它们比常规用于蛋白测定的ELISA方法更灵敏。与本文描述的装置和方法联合使用这些方法扩展了蛋白检测的有效性并有助于多重蛋白检测。

[0064]引物：引物指能够在邻近目的区域(如多态区)位置处与核酸序列(经常称为模板)特异杂交的核酸。引物可通过酶(如聚合酶)的作用在一过程中被延伸，其中互补于邻近引物的模板的核苷酸或其类似物被添加至生长的核苷酸链。例如，如果使用RNA模板，则可通过逆转录酶的作用延伸寡聚脱氧核苷酸引物，以生成互补于RNA模板的cDNA。如果使用DNA模板，则可通过DNA聚合酶的作用延伸。

[0065]引物可单独使用，例如在设计为提供关于靶核酸的鉴定和/或存在方面信息的引物延伸反应中，或者引物可与至少一种其它引物或探针一起使用，例如在扩增反应中。为了扩增至少一部分核酸，优选使用正向引物(即，5′引物)和反向引物(即，3′引物)。正向和反向引物杂交至双链核酸的互补链，使得在从每一引物延伸时，扩增双链核酸。

[0066]在不改变其作用本质情况下，可以通过末端添加核苷酸来修饰本文描述的引物(RNA、DNA(单链或双链)、PNA及其类似物)，所述核苷酸被设计用来例如并入限制性位点或其它有用序列。

[0067]可根据现有技术中熟知的以及例如在Sambrook，J.andRussell，D.(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Third Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y中描述的方法来制备引物。例如，可使用限制酶制备和克隆DNA的不连续片断。或者，可采用具有合适序列的引物通过聚合酶链式反应制备引物，或者引物可被合成。

[0068]引物，尤其是在检测等位基因变体方法中进行的反应所使用的引物，具有足够的长度，以与等位基因多态位点部分特异杂交。通常，这种长度取决于源生物体基因组的复杂性。对于人类而言，这种长度至少为14-16核苷酸，通常可以为20，30，50，100个或更多核苷酸。

[0069]核苷/核苷酸：很多涉及核酸的反应包括作为建筑块(buildingblocks)的脱氧核苷三磷酸(dNTPS)和二脱氧三磷酸(ddNTPs)，它们可例如被用在延伸、扩增和测序反应中来延伸引物。在某些实施方案中，可能希望使用经修饰的dNTPS来促进反应产物的鉴定和/或检测，或者区分不同反应的产物。例如，不同反应的核酸产物之间分子量差异可通过其自身核酸序列(组成或长度)或通过向产物引入质量修饰官能团而实现。例如，可在核酸扩增过程其间引入质量修饰。

[0070]寡核苷酸类型：寡核苷酸的序列、长度和组成将随待捕获的核酸的性质而变化。寡核苷酸可特异于每一测定产物或者可互补于两个或多个多态位点等位基因变体的共同区域。例如，在引物延伸反应测定中，表面固定的互补寡核苷酸可与源自两多态位点等位基因的延伸产物杂交。这是因为不与多态区形成杂交。寡核苷酸与多态区的5′延伸产物杂交。但是每个寡核苷酸只与单个多态区的等位基因杂交。

[0071]根据多种不同的实施方案，可将通用寡核苷酸(“zip code”寡核苷酸)固定在基底上。zip code寡核苷酸可为任何长度，典型地为6至25核苷酸长度。所捕获的测定产物具有zip code互补序列，使得其能与表面结合的寡核苷酸杂交。

[0072]根据不同实施方案，zip code可用在非固定化技术中。例如zip code可用作用于第二扩增反应的引物。根据不同实施方案，可进行的采用通用PCR和/或zip code的各种方法可包括例如Andersen等人的美国专利申请11/090,830和Lao等人的美国专利申请11/090,468(都于2005年3月24日提交)、Marmaro等人的美国专利6,605,451以及Andersen等人的公开号为WO 2004/051218的国际专利申请中所描述的方法和各组分的使用，这些文献通过引用整体并入本文。实时PCR和再测序是可采用这类方法和设备来实施的两种示例性方法。

[0073]zip code可以是用于捕获和检测一个区域中不同多态性的测定产物共有的。不同的zip code和互补zip code序列对可用于将不用区域中不同多态性位点的测定产物分离为单一测定产物以及分离为不同测定产物的小组。通用zip code序列的使用简化了基底(substrate)的生产和质量控制。所描述的策略有助于加工和分析多重样品。

[0074]对zip code方法的一种修改为向再延伸的引物中引入可切割位点。例如，可将zip code序列从测定产物切割下来，以产生更适合于分析方法如质谱的测定产物。可切割位点可为酶切位点或碱切位点。例如，脱氧核糖核苷酸序列中的单核糖核苷酸可通过核糖核酸酶或通过碱来切割。无碱基位点可在合成寡核苷酸期间引入，或者通过酶和化学试剂诱导出来，在碱性条件下对其进行切割或用酶切割。当用MALDI-TOF质谱法来分析反应产物时，用于切割的酶或试剂可与基底一起被添加至捕获的核酸。其它的备选方式包括酸切位点(例如，可被用于质谱法的基底或基底添加剂切割的位点)，如对于磷酰胺酯键的情况[参见，例如Shchepinov et al.(2001)Nucleic Acids Res.29：3864-3872]，或者光切位点，例如可以在基于激光的质谱法中通过激光切割。也可以使用二硫键，在诸如二硫苏糖醇的还原剂存在下被切割。

[0075]在另一实施方案中，表面结合的寡核苷酸是与活化基底或芯片结合的扩增产物。该基底可被活化，直至寡核苷酸加入，如此处或实施例2所描述的。PCR产物结合至所述表面的过程可在PCR期间和/或其后发生。PCR产物的化学结合通过对PCR引物的5′修饰而实现。此外，PCR产物对所述表面的被动结合可例如通过静电相互作用、Van derWaals力和氢键发生。测定产物(如引物延伸产物)通过与表面固定的扩增产物杂交而被捕获。

[0076]或者，如之前所述，通用寡核苷酸(″zip code″寡核苷酸)可被固定至基底。扩增产物具有结合的zip code互补序列，使得能与结合的寡核苷酸杂交。扩增产物同时捕获测定产物。zip code寡核苷酸可被修饰，使得所形成的杂交产物的稳定性大大增加，例如通过在序列内完全或部分使用RNAs，LNAs，(PNAs)或其它修饰的核酸衍生物。zip code和扩增产物的对应区域也可通过反应性基团在形成的杂交产物中永久相互交联。在其它实施方案中，通用zip code寡核苷酸被固定至基底。扩增产物的一条链被设计为在一端具有单链悬挂序列(overhang sequence)。在PCR或其它用于扩增的方法之后，通过杂交进行的捕获通过第三寡核苷酸进行，该第三寡核苷酸序列的一部分互补于所述表面上的zip code，而另一部分互补于扩增产物靶链上的额外悬挂序列。由此介导扩增产物和表面上的zip code序列之间的接触，所形成的杂交产物可进一步用于：例如，通过连接酶反应将靶链永久连接至所述表面。该共价结合使得能够通过在适合的缓冲条件下洗去第二链和介导性寡核苷酸，从而分离出单链扩增产物。在基底上的单链分离之后可例如跟随通过引物延伸反应鉴定固定的靶DNA内SNP位点的反应。通过与固定的靶DNA的杂交使测定产物最终被捕获并适合于分析。

[0077]多重技术(multiplexing)：多重方法使得能同时检测特定基因或几个基因中一个以上的多态区域。不同部位的多重技术可通过利用不同的捕获寡核苷酸来实现，这些不同的寡核苷酸用于每套特异测定反应的产物。根据一些实施方案，不同的捕获寡核苷酸可包括固定的捕获寡核苷酸。根据一些实施方案，不同的捕获寡核苷酸可包括非固定的捕获寡核苷酸和不同的探针组；以及至少一个激发源和检测器。或者，不同于使用固定的捕获寡核苷酸，可使用局部引物，任选地和探针一起使用。可用于多重技术的示例性系统包括这样的检测系统，其基于激发波长、基于发射波长、基于激发波长和发射波长、或基于其它分析技术来区分荧光信号。示例性系统被描述于2003年5月19日提交的美国专利申请10/440,852中，通过引用将其整体并入本文。

II.装置和系统：

[0078]根据一些实施方案，本发明提供了下述液体加工装置。该装置可包括基底以及一个或多个液体加工通路，所述基底可例如包括顶部表面或第一表面，所述通路可提供为例如与所述基底的顶部表面或第一表面的至少一部分连通和/或由其所限定。两个或多个所述一个或多个液体加工通路可作为基本上相互平行的状态被提供。所述一个或多个液体加工通路可被提供于基底的顶部表面或第一表面内、基底的顶部表面或第一表面上、基底内、基底的底部表面或第二表面内、基底的底部表面或第二表面上、基底的边缘内、基底的边缘上，及其任意组合。所述一个或多个液体加工通路可例如包括一个或多个如下组件：区域、多个区域、通道、阀、分流器、分支通道、入口区、出入口、交叉通道、混流器、偏流器、交叉流通路及其组合。区域可包括任何可用于例如液体样品保留、加工、反应、存储、孵育、转移、纯化等的范围。两个或多个液体加工通路可作为基本上相互平行的状态被提供，由此两个或多个基本上平行的液体加工通路的第二区域可被对齐，并可界定出下述这样的轴，该轴基本上垂直于由所述两个或多个基本上平行的液体加工通路所确定的轴。液体加工装置可包括不同水平和不同层的液体加工通路，它们可例如包括不同水平和不同层的通道和区域。例如，分层的多通道装置可包括一个或多个液体加工通路，它们在基底中横跨不同高度或水平。

[0079]根据多种不同的实施方案，液体加工装置可包括一个或多个通路，它们每一个可包括第一反应区域、第二反应区域和一个或多个其它区域。所述一个或多个其它区域可包括例如一个或多个纯化区域、分流器区域、产物收集区域、反应物装载区域、或其组合，等等，如2003年1月3日提交的美国专利申请10/336,274，以及2003年7月28日提交的10/628,781中所描述的，在此通过引用将这两篇文献整体并入本文。

[0080]根据多种不同的实施方案，所提供的液体加工装置可包括基底。该基底可包括不溶性支持物。该基底可包括任何不溶的或固体材料。例如硅、硅胶、玻璃(例如可控多孔玻璃(CPG))、尼龙、Wang树脂、Merrifield树脂、Sephadex.RTM.、Sepharose.RTM.、纤维素、金属面(例如，钢、金、银、铝和铜)、塑料材料(例如，聚乙烯、聚丙烯、聚酰胺、聚酯、聚偏氟乙烯(PVDF)、聚二甲基硅氧烷以及RTV′s。该基底可例如包括一个或多个扁平支持物，它们可包括一种或多种玻璃纤维滤器、硅表面、玻璃表面、金属表面(钢、金、银、铝和铜)以及塑料材料。该基底可包括任何希望的形式，例如，卡、板、芯片、膜、薄片以及其它几何形状和形式。基底可包括设计用来在分开位置接收或结合样品的平坦表面，例如用于接收、容纳或结合样品的具有疏水区域围绕亲水位置的平坦表面，其中基底可包括诸如卡或芯片的平面基底。基底可被蚀刻、切割、打磨、浇铸、机械制造或以其它方式形成，以便提供一个或多个至少部分地由所述基底限定的液体加工通路。可用于制造该基底的示例性基底制造技术包括Woudenberg等人的公开号为WO 2005/029041的国际专利申请中所描述的技术，其通过引用整体并入本文。该基底可包括一种或多种选自聚丙烯、环烯聚合物、或环烯共聚物、热传导聚合物、或填充物、聚对苯二甲酸乙酯、铝、金、铁、铜、锆、钛、这些金属的合金等的材料。

[0081]根据一些实施方案，一个或多个液体加工通路每一个可包括第一区域，例如预扩增区域，并且可包括一个或多个第二区域，例如一个或多个扩增区域。例如，每个液体加工通路可包括两个或多个第二区域，例如两个或多个扩增区域。第一区域或预扩增区域可包括预扩增反应组分。第二区域或扩增区域可包括扩增反应组分。第一区域或预扩增区域还可包括样品制备组分，例如裂解缓冲液，其中样品制备和对样品中含有的核酸的预扩增可基本上同时在第一区域中进行。

[0082]根据一些实施方案，提供了这样的液体加工装置，其中液体加工通路还可包括置于第一区域上游并与其液体相通的样品制备区域。该样品制备区域可包括样品制备组分。样品制备区域可通过阀与第一区域液体相通(其中阀可被置于其间)，或者它们可被油、被夹子或通过其它装置部件或材料隔开。可使用的示例性阀包括于2003年1月3日提交的美国专利申请10/336,274和于2003年7月23日提交的10/625,449中所描述的那些，通过引用将这些文献整体并入本文。

[0083]在一些实施方案中，样品制备区域或预扩增区域可包括适合于将核酸序列与样品的其它组分分开或分离的样品制备组分。一些样品制备组分可由最终使用者在使用前预装进区域或添加至区域。样品制备组分可例如包括适合于通过适当方法裂解细胞的组分。适当方法可例如包括：热裂解；机械裂解；声波裂解；化学裂解；酶学裂解；它们的组合等方法。样品制备组分可包括酸、碱、或可适合于调节液体样品pH的缓冲剂，和/或膜、附着表面、小珠等等。

[0084]根据一些实施方案，提供了这样的液体加工装置，其中液体加工通路可包括一个或多个第三区域，每一个都被置于各自对应的第二区域的下游并与其液体相通。所述一个或多个第三区域每一个可例如包括适合于进行序列反应或实时反应的各套序列反应组分。一种或多种扩增的靶核酸序列包含在各自对应的第二区域。第三区域可与各自对应的第二区域液体相通。根据不同实施方案，阀可被置于其间，或者所述液体相通可为无阀的，例如使用油来实现。

[0085]根据一些实施方案，提供了这样的液体加工装置，其中液体加工通路可包括一个或多个纯化区域，它们被置于例如样品制备区域、预扩增区域、扩增区域和测序区域中的一种或多种的下游，由此预扩增产物、扩增产物和测序产物中的一种或多种可被纯化。

[0086]在一些实施方案中，提供了这样的液体加工装置，其中液体加工通路可包括一个或多个存储区域，它们被置于各自对应的第二或扩增区域下游并与其液体相通，或者被置于各自对应的第三或测序区域下游并与其液体相通，由此经加工的液体可被保存或储存在存储区域，之后可从存储区域或从置于存储区域下游的出口区域得到或取出。例如，经加工的液体可储存在位于出口区域(例如死端出口区域)上游并与其液体相通的存储区域中。出口区域和各自的存储区域可通过阀或油分开。

[0087]根据一些实施方案，液体加工通路的一个或多个第二区域可包括一个或多个密封区域(其可包括例如氨气)。所述一个或多个密封区域可包括预装的氨气。或者，可由最终使用者在使用前向所述一个或多个密封区域中装载氨气。这种装载可例如从氨气储灌通过所述一个或多个密封区域的入口区或孔注入氨气。第一区域可与一个或多个密封区域或一个或多个第二区域液体相通并置于它们的上游。所述一个或多个液体加工通路可包括至少一个阀，该阀被设置为与第一区域液体相通并位于其下游以及与一个或多个第二区域液体相通并位于其上游。两个或多个第二区域可相互液体相通，例如两个或多个第二区域可被连续排列，或者可与例如第一区域死端(dead-end)液体相通。

[0088]根据多种不同的实施方案，液体加工通路可包括通过阀与一个或多个第二区域如一个或多个密封区域液体相通的第一区域。所述一个或多个密封区域可包括氨气。液体加工通路可包括通过阀与两个或多个第二区域液体相通的第一区域，其中液体加工通路可包括置于第一和两个或多个第二区域之间并与它们液体相通的阀。

[0089]在一些实施方案中，液体加工装置可包括设置在该装置的顶部表面或第一表面的至少一部分之上的覆盖层，以便将设置为与基底的顶部表面或第一表面的至少一部分相通的一个或多个液体加工通路的一个或多个暴露元件密封，例如，覆盖层可被设置在对应于一个或多个第二区域的开口之上，由此形成一个或多个密封区域。该一个或多个密封区域可包括氨气。

[0090]根据多种不同的实施方案，液体加工装置可包括覆盖物，其被设置在基底的顶部表面的至少一部分之上。例如，覆盖层可部分地覆盖一个或多个区域、通道、管等。该覆盖物可包括可去除的条带部分，其可被例如提供在一个或多个暴露区域之上。该覆盖物可包括一个或多个覆盖部分。通过一种或多种粘合剂密封、热密封、层压、表面修饰、化学键、静力等，覆盖物可包括一个或多个永久提供的覆盖部分、半永久提供的覆盖部分、以可去除方式提供的覆盖部分、可再密封的覆盖部分及其任意组合。可使用的示例性卡式装置密封部件和系统包括例如均于2005年3月22日提交的美国专利11/086,276，11/086,263，和11/086,264中所描述的那些，通过引用将它们整体并入本文。

[0091]根据一些实施方案，所述覆盖物可包括柔性材料、刚性材料、可弹性变形材料或其两种或两种以上的组合。所述覆盖物可包括透明的、半透明的或不透明材料。所述覆盖物可包括有粘性的柔性层。可在足以形成液密密封的条件下，将所述覆盖物设置在至少一部分顶部表面之上。可在足以形成密封，例如气密密封的条件下，将所述覆盖物设置在至少一部分顶部表面之上。可使用液密密封，并且可可包括例如多孔密封膜、层或覆盖物，或者无孔的可透气膜、层或覆盖物，例如在2004年1月22日提交的美国专利申请10/762,786中所描述的，在此通过引用将其整体并入本文。该密封可包括例如单层或多层结构。

[0092]覆盖层可包括例如在2004年1月22日提交的美国专利申请10/762,786和VANN等人的于2002年8月2日提交的公开号为US2003/0021734A1的美国专利申请中所描述的那些，在此通过引用将这些文献整体并入本文。

[0093]可弹性变形的覆盖层可包括PCR带材料。例如对于可弹性变形覆盖层而言，可使用聚烯烃膜，其它聚合物膜、共聚物膜及其组合。

[0094]根据一些实施方案，该微流装置可包括粘合层，其例如被设置在基底的顶部表面和覆盖物的下表面之间、基底的顶部表面之上、覆盖物的下表面之上或其任何组合。该粘合层可包括设置在基底和覆盖物之间的粘合垫圈层。粘合剂可包括任何适合的常规粘合剂。例如，粘合剂可包括一种或多种永久粘合剂、压敏粘合剂、热敏粘合剂、以及非永久粘合剂。可使用硅树脂压敏粘合剂、氟硅树脂压敏粘合剂以及其它多聚压敏粘合剂。粘合剂可被提供于整个表面或提供在至少一部分表面之上，例如基底的顶部表面或覆盖物的下表面之上。

[0095]根据一些实施方案，第一区域可包括置于其中的预扩增反应组分。该预扩增反应组分可包括适合于预扩增存在于样品(如生物样品)中的多种不同核酸序列的组分。预扩增反应组分可包括任何组分、试剂、反应物、缓冲剂、标记物、引物、探针、标签、zip code寡核苷酸、固定的zip code寡核苷酸、酶、核酸酶、催化剂、以及任何其它部分，其存在为进行预扩增反应或为进行要在第一区域下游进行的后续反应所需或所希望的。zip-coded寡核苷酸可包括这样的序列，例如与靶序列基本上无同源性的固定序列，和例如与zip-coded序列部分同源以及与靶序列部分同源的zip-coded引物序列。如上文所讨论的，zip code反应物和通用PCR可被用于，例如杂交测定或实时PCR。

[0096]根据一些实施方案，提供了这样的液体加工装置，其可包括：基底，其可包括第一表面和相反的第二表面；以及一个或多个液体加工通路，其可至少部分地由该基底限定，该一个或多个液体加工通路每一个可包括第一区域和两个或多个第二区域，该第一区域可包括置于其中的预扩增反应组分，其适合于预扩增存在于样品中的多种不同的核酸序列，以产生多种经预扩增的序列，第二区域每一个与第一区域液体相通并且每一个可包括置于其中的的扩增反应组分，其适合于扩增一种或多种所述的多种经预扩增序列，以产生一种或多种扩增的靶序列。在一些实施方案中，所述两个或多个第二区域每一个可与第一反应区域死端液体相通。根据一些实施方案，第二区域可开孔有例如出入口、排气口、可渗透层、多孔层、疏水塞，它们的组合，等等。在一些实施方案中，两个或多个第二区域每一个可与第一反应区域液体相通以及相互之间液体相通。在一些实施方案中，该液体加工装置还可包括提供在可包括一个或多个入口区的顶部表面或第一表面的至少一部分之上的覆盖物，其中入口区可对应于区域如第一区域，以形成一个或多个可进入的第一区域。

[0097]根据一些实施方案，提供了这样的液体加工装置，其中一个或多个液体加工通路可包括通过液体连接第一区域和两个或多个第二区域的通道。在一些实施方案中，该通道可包括至少一个置于第一区域和两个或多个第二区域之间的阀，并且第一区域和两个或多个第二区域的每一个可与该阀液体相通。该阀可包括开放阀或开放和关闭阀。根据一些实施方案，所述至少一个阀可包括热介导的、压力启动的阀。该热介导的、压力启动的阀可包括可爆裂阀。根据不同实施方案，可使用蜡质阀。根据不同实施方案，可使用可变形阀。可使用的示例性阀包括2003年1月3日提交的美国专利申请10/336,274和2003年7月23日提交的10/625,449中所描述的那些，通过引用将这些文献整体并入本文。

[0098]根据一些实施方案，提供了这样的液体加工装置，其中扩增反应组分可包括一种或多种下述组分，所述组分适合于扩增多种经预扩增序列中的两种或多种不同序列的至少一部分。在一些实施方案中，扩增反应组分可包括适合于扩增多种经预扩增序列的三种或多种不同序列的扩增反应组分。

[0099]在一些实施方案中，提供了这样的液体加工装置，其中第一或预扩增区域与装有一种或多种预扩增反应组分。

[0100]根据一些实施方案，提供了这样的液体加工装置，其中两个或多个第二或扩增区域可包括一个或多个密封区域，例如两个或多个密封区域。在一些实施方案中，该一个或多个密封区域可包括氨气。该一个或多个密封区域可包括预装的氨气，或者氨气可由最终使用者在使用前装入。在一些实施方案中，液体加工装置可包括设置在该装置的顶部表面或第一表面的至少一部分上的覆盖物，其可包括一个或多个入口区，其中入口区可对应于例如一个或多个第一和第二区域的区域，以形成一个或多个可进入区域。

[0101]根据一些实施方案，提供了这样的液体加工装置，其中第一区域可包括一种或多种缓冲组分，其存在量足以在液体样品与氨基混合后至少部分地调整和/或中和液体样品的pH。所述一种或多种缓冲组分可包括一种或多种酸、碱或中性缓冲组分。

[0102]根据一些实施方案，提供了这样的液体加工装置，其中第一区域可包括一种或多种样品制备组分。样品制备组分可包括例如任何必要的或期望的组分，它们能够使得：可获得存在于液体样品中的一种或多种核酸序列，用其参与下述过程。过程可包括例如预扩增反应、纯化过程、扩增反应、测序反应或其任意组合。在一些实施方案中，样品制备组分可包括一种或多种裂解缓冲剂、缓冲剂、酶、乙醇、其它醇、沉淀剂、掩蔽剂，等等。

[0103]根据一些实施方案，提供了这样的液体加工装置，其中两个或多个密封区域可包括一种或多种足以中和其中溶解有氨气的液体样品的pH的缓冲组分。

[0104]在一些实施方案中，提供了这样的液体加工装置，其中两个或多个第二区域的每一个可包括各自的扩增组分组，它们适合于扩增每一各自的第二区域中的一种或多种不同的经预扩增序列，并且每个各自的扩增组分组可与各自的扩增组分组的至少一个其它组不同。在一些实施方案中，两个或多个第二区域可包括三个或更多个第二区域。

[0105]根据一些实施方案，提供了这样的液体加工装置，其中第一反应区域可包括一种或多种预装的固定zip-coded寡核苷酸，两个或多个第二区域每一个可包括一组或多组预装的互补zip-coded寡核苷酸。根据不同实施方案可进行的采用通用PCR和/或zip code的各种方法，包括例如均于2005年3月24日提交的Andersen等人的美国专利申请11/090,830和Lao等人的11/090,468、Marmaro等人的美国专利6,605,451以及Andersen等人的公开号为WO 2004/051218的国际专利申请中所描述的方法和各组分的使用，在此通过引用将这些文献整体并入本文。实时PCR和再测序是可采用这些方法和装置进行的两种示例性方法。

[0106]根据一些实施方案，提供了这样的液体加工系统，其可包括：液体加工装置；检测器，其能够与液体加工装置的液体加工通路的两个或多个第二区域光学相通。该检测器可适合于检测两个或多个第二区域中的一种或多种扩增的靶序列，该靶序列的每一个可被各自的可检测标签所标记。可检测标签可包括荧光标签。

[0107]根据一些实施方案，检测器可包括例如LED激发源和光电二极管检测器，它们被排列为分别用来激发和检测荧光染料。激发源可检测器可包括在美国专利10/205,028，10/887,486，和10/887,528中描述的那些，在此通过引用这些文献都整体并入本文。检测器可包括分光光度计、荧光计、激发光源、电荷耦合器件、相机或其组合。检测器例如可包括对宽范围的荧光团提供快速检测的Applied Biosystems 7500快速实时PCR系统，这可从Applied Biosystems Corporation，Foster City，CA得到。

[0108]在一些实施方案中，提供了这样的液体加工系统，其包括液体加工装置和热循环装置。该液体加工系统可包括检测器。

[0109]根据多种不同的实施方案，提供了这样的液体加工装置，其可包括：具有第一表面和相反的第二表面的基底；和至少部分地由该基底所限定一个或多个液体加工通路，该一个或多个液体加工通路每一个可包括至少一个热介导的、压力启动的阀，当例如可为至少两个大气压的压力横向施加到阀上时，以及该阀可被加热至例如约100℃至约150℃、约105℃至约130℃、约110℃至约125℃、或高于约115℃的温度，阀适合爆裂。产生爆裂阀的压力可包括在高于100℃的温度加热样品约1秒至约3分钟，例如约10秒至约1分钟，和/或导致横跨阀的压力差为约0.01psi至约100psi，例如约1psi至约10psi。该阀可包括聚合的、有弹性的、橡胶的、硅树脂的、和/或塑料材料，例如为具有适合的爆裂强度和/或张力强度的薄层的形式。该阀可包括由NYLON、TEFLON、氧化铝、聚丙烯酰胺、聚对苯二甲酸乙酯、parylene、聚苯乙烯、铝、金、铁、铜、锆、钛、这些金属的合金等所制成的膜或塞子。阀可为环形的并具有约0.01mm至约10mm的直径，例如约0.1mm至约1mm。该阀可具有约1至约1000微米的厚度，例如约1至约500微米或约10至约100微米的厚度。该阀可包括例如聚二甲基硅氧烷材料的膜，其为约0.01至约3毫米的厚度。在一些实施方案中，一个或多个液体加工通路的每一个可包括置于所述至少一个热介导的、压力启动的阀上游并与其液体相通的第一区域。在一些实施方案中，所述一个或多个液体加工通路可包括一个或多个置于所述至少一个热介导的、压力启动的阀下游并与其液体相通的第二区域。在一些实施方案中，所述一个或多个第二区域可包括一个或多个密封区域(其可包括氨气)。氨气可被预装进所述一个或多个密封区域中，或者可由最终使用者在使用前不久装入所述将氨气一个或多个密封区域中，例如通过将氨气从氨基储罐注入密封区域的进入区或入口。在一些实施方案中，进入区或入口可包括膜，粘合覆盖物、粘合带、柔性可再密封的覆盖物或带、隔膜，等等。

[0110]根据多种不同的实施方案，提供了这样的液体加工装置，其可包括：具有第一表面和相反的第二表面的基底；和至少部分地由该基底所限定一个或多个液体加工通路，该一个或多个液体加工通路每一个可包括第一区域和一个或多个置于该第一区域下游并与其液体相通的密封区域，该一个或多个密封区域可包括氨气。在一些实施方案中，所述一个或多个密封装置可包括预装的氨气。在一些实施方案中，所述一个或多个液体加工通路还可包括至少一个液体连接第一区域和一个或多个密封区域的通道。在一些实施方案中，所述通道可包括至少一个被置于第一区域和所述一个或多个密封区域之间的阀，第一区域和所述一个或多个密封区域每一个都可与该阀液体相通。该阀可包括开放阀或开放和关闭阀。在一些实施方案中，第一区域可包括置于其中的适合于预扩增液体样品中存在的多种不同核酸序列的预扩增组分，由此在预扩增液体样品后产生多种经预扩增序列。第一区域还可包括一种或多种缓冲组分。第一区域可包括样品制备组分。所述一种或多种缓冲组分可至少包括酸性缓冲组分。所述一个或多个密封区域可包括一种或多种缓冲组分，在液体与氨气接触后其足以至少部分地中和液体的pH。在一些实施方案中，提供了这样的液体加工装置，其中一个或多个密封区域可包括多个密封区域，该多个密封区域的每一个可包括各自的扩增组分组，该扩增组分组适合于对所述多种经预扩增序列中的一种或多种不同靶核酸序列进行扩增。根据一些实施方案，每个各自的扩增组分组可与其它的各自的扩增组分组的至少一个不同。在一些实施方案中，所述至少一个阀可包括热介导的、压力启动的阀。该热介导的、压力启动的阀可包括可爆裂阀，当该可爆裂阀可被加热至例如100℃至约130℃、约105℃至约125℃、约110℃至约125℃、或高于约115℃的温度时，其适合于在横跨阀的压力差下爆裂，该压力差例如可为大于或等于约两个大气压。在一些实施方案中，所述一个或多个区域可包括两个或多个密封或至少三个密封区域。根据一些实施方案，所述至少三个密封区域的每一个可包括不同的扩增组分组，它们可适合于在每个各自的区域中扩增至少一种不同的靶预扩增序列，以产生总共至少三种不同的扩增的靶序列。

[0111]根据一些实施方案，所述一个或多个液体加工通路中的一个或多个可包括一个或多个阀。所述液体加工装置可包括一系列的区域，它们可与邻近区域液体相通，或者能够液体相通，其中邻接区域间的液体相通采用例如设置在液体加工通路的邻近区域之间的阀所控制。阀可被置于邻近区域之间以控制经由通道、流路、或液体加工通路的液体流动。

[0112]根据一些实施方案，所述阀可包括任何材料、结构或构造，在启动后，其能够控制经由通路、通道、区域或范围的液体移动。所述阀可包括可开放的阀或可开放和关闭的阀。所述阀可包括一种或多种可通过例如压力、形变、溶解、切割、受热以及力的一种或多种启动的阀。根据一些实施方案，所述一种或多种阀可包括光学阀、可溶解阀、可热融解阀、热介导的压力启动的阀、压力启动的阀、机械阀、可变形阀(如居间壁)的一种或多种。可变形阀以及启动这种阀的装置可包括在COX等人的于2003年3月31日提交的公开号为2004/0131502A1的美国专利申请中所公开的那些，在此通过引用将其整体并入本文。在微流装置中可使用的其它阀可包括在COX等人的于2004年11月16日公布的美国专利6,817,373B2和HARROLD，Michael，P.的于2003年7月28日提交的公开号为2004/0055956A1的美国专利申请中所公开的那些，在此通过引用将这些文献整体并入本文。装载可采用毛细作用、离心、真空、压力差或其它方法和/或条件来进行，这些为本领域技术人员所已知的。

[0113]在一些实施方案中，所述一个或多个液体加工路径可被设置为相互基本平行。液体加工通路可包括例如一个或多个区域、区、进入区、通道、分支和阀。区域可包括任何能够保留一定体积液体的形状或形式。例如，区域可包括表面区、区、凹处、室、凹陷、孔、空间等。区域可包括任何形状，例如圆形、泪状、方形、不规则形状、卵圆形、矩形等。区域或通道可包括任何横截面结构，例如方形、圆形、卵圆形、不规则形状、斜方形等等。例如，通道可包括纵横比即宽度/深度比例大于1的横截面区。通道可包括基底中的半卵圆形横截面区。该横截面区可包括大于1的纵横比，即宽度/深度比。通道可包括在基底中形成的细窄通道，其中横截面区具有小于1的纵横比，即宽度/深度比。通道可包括斜方形的横截面区并通常可包括小于1的纵横比。这些和其它的横截面设计可被用作通道，例如限流通道，并且根据一些实施方案可预先形成或在阀开放操作期间形成。

[0114]根据一些实施方案，可提供进入区或口，它们例如穿过液体加工装置的顶部表面或第一表面、穿过该装置的底部表面或第二表面、穿过该装置的侧部边缘或端部边缘、穿过基底、穿过覆盖层以及穿过这些部件的组合中的一个或多个。例如，该装置可包括穿过覆盖层并且与该装置的入口或第一区域相通的入口进入区。该装置可包括穿过覆盖层并且与出口区域相通的出口进入区。

[0115]在一些实施方案中，提供了这样的液体加工装置，其可包括一个或多个液体加工通路。液体加工通路可包括这样的流动，其将流路分为两个或多个分支通道。所述两个或多个分支通道可包括两个或多个基本上平行的分支通道。第一分支通道可包括例如第一扩增区域，第二分支通道可包括第二扩增区域。

[0116]根据一些实施方案，可在所述一个或多个液体加工通路的一个或多个中设置一个或多个分流器，用于将来自一个样品的液体样品沿液体加工通路的两个或多个分支通路分为两个或多个样品或等份(aliquots)，例如将样品分为2、3、6、12、24、48、96、192、或384个样品或等份。根据一些实施方案，分流器可被置于第一或与扩增区域的下游，以将通路分为两个或多个分支通道或流路。每一分支通道可以各自的区域为端部，该区域可为死端或端口开放的。

[0117]分支通道可被用于以所期望数量的部分或等份的方式获得等体积液体。分支通道可与诸如加工区域的区域液体相通，形成独立通路用于进一步加工每一等份。该通路可用于在等份上进行单一反应或过程，例如正向测序，或者可进行多重相同或多重不同的反应或过程，例如PCR。在通路的加工区域中进行某个反应或过程所需的组分可在制造该微流装置时被预装进各个区域或这在使用时被装入。

[0118]可用于液体加工装置中的液体加工通路可包括在DESMOND等人的于2003年1月3日提交的公开号为2004/0018116A1的美国专利申请中所公开的那些，在此通过引用将其整体并入本文。

[0119]根据一些实施方案，提供了这样的液体加工装置，其中在分布进多个一个或多个第二孔之前，预扩增区或孔被合并进卡中。根据不同实施方案，预扩增区可装有或预装有cDNA或gDNA。扩增可包括例如PCR或OLA。可根据所需的输入样品量和灵敏度来确定该预扩增孔的大小。输入材料的量可以比用于低拷贝表达分析或用于采用多个独立反应通过SNP分析的细菌检测所需的量小得多。多个小孔中的引物可包括靶特异的引物或可包括zip coded引物，使得能利用通用卡。如果在卡中使用靶特异性引物，则预扩增区可包括多重反应所需的完整引物池，也可预装。或者引物可与样品和mastermix一起装入。

III.方法：

[0120]根据一些实施方案，提供了这样的方法，其可包括：提供液体加工装置，其可包括一个或多个液体加工通路，每一个液体加工通路可包括与两个或多个第二区域液体相通的第一区域；向所述液体加工装置的第一区域引入包括多种不同核酸序列的液体样品；在第一区域中预扩增所述多种不同核酸序列中的两种或多种，以产生可包括两种或多种不同预扩增核酸序列的预扩增液体样品；将预扩增液体样品从第一区域转移至所述两个或多个第二区域；以及在所述两个或多个第二区域的每一个中对所述两种或多种不同的预扩增核酸序列中至少一种各自的靶序列进行扩增，以在所述两个或多个第二区域的每一个中产生至少一种各自的扩增的靶序列。在一些实施方案中，转移可包括将预扩增的液体样品从第一区域经由至少一个通道转移至所述两个或多个第二区域。

[0121]根据一些实施方案，提供了这样的方法，其可包括在预扩增之前或与其同时制备液体样品。该制备步骤可包括裂解包含在液体样品中的细胞。

[0122]根据一些实施方案，提供了这样的方法，其可包括使靶核酸反应以形成可检测标签。标记可包括使两种或多种不同的靶核酸序列和/或探针的每一种与不同的荧光标签反应，以便使单个第二区域中含有的两种或多种不同的扩增的靶核酸序列可在该单个区域中被检测到。

[0123]在一些实施方案中，提供了这样的方法，其可包括在各自对应的第三区域中对在各自对应的第二区域中含有的至少一种各自的扩增的靶核酸序列进行测序。该方法可包括将含有一种或多种扩增的靶核酸序列的扩增的液体样品从第二区域转移至各自对应的第三区域。

[0124]在一些实施方案中，提供了这样的方法，其中所述经由至少一个通道的转移可包括使预扩增的液体样品经由至少一个阀转移。所述经由至少一个阀的转移可包括启动至少一个阀。在一些实施方案中，所述至少一个阀可包括热介导的压力启动的阀，其可包括例如可爆裂阀。根据不同实施方案，启动可包括将第一区域中的经预扩增样品加热至足以产生足以使可爆裂阀爆裂的压力的温度。加热可包括将第一区域中的预扩增液体样品加热至例如100℃至约130℃、约105℃至约125℃、约110℃至约125℃、或高于约115℃的温度。在一些实施方案中，该压力可包括大于或等于约1.5大气压、2大气压、3大气压、5大气压或更高的压力。

[0125]根据一些实施方案，提供了这样的方法，其中转移可包括通过毛细作用、向心力、气动力、水力、离心力的一种或多种来转移经预扩增样品，其通过引起正压介导的预扩增液体样品流动以及引起负压介导的预扩增液体样品流动来实现。通过引起负压介导的流动进行的转移可包括产生将经预扩增样品从第一区域吸出的真空。在一些实施方案中，所述两个或多个第二区域可包括一个或多个可包括氨气的密封区域。在一些实施方案中，产生真空可包括使氨气与预扩增液体样品接触，其中当氨气溶解进预扩增液体样品时产生真空。

[0126]在一些实施方案中，提供了这样的方法，其中预扩增可包括对多种不同的核酸序列进行线性或指数预扩增。扩增可包括对所述多种不同经预扩增核酸序列的至少一种靶核酸序列进行指数扩增。根据不同实施方案，对核酸的预扩增和/或扩增可包括热循环核酸序列扩增过程或等温核酸序列扩增过程。如果采用热循环核酸序列扩增过程，则该过程可包括例如聚合酶链式反应(PCR)。核酸序列扩增反应可包括指数扩增过程，例如PCR，或线性扩增过程，例如在Sanger循环测序法中所发生的。

[0127]根据多种不同的实施方案，提供了这样的方法，其中预扩增可包括对第一区域中的液体样品进行热循环。预扩增的热循环可包括至少5个热循环。在一些实施方案中，提供了这样的方法，其中预扩增可包括一种或多种选自热反应和等温反应的反应。预扩增可包括连接酶链反应、聚合酶链反应、循环测序链反应和OLA反应的一种或多种。

[0128]根据一些实施方案，提供了这样的方法，其中扩增可包括对保留在两个或多个第二区域中的经预扩增液体样品进行热循环。扩增热循环可包括约10至约40个热循环。扩增可包括一个或多个指数扩增反应。经预扩增液体样品可包括缓冲组分。

[0129]根据一些实施方案，提供了这样的方法，其可包括多重扩增过程，例如多重PCR过程。该过程可包括采用靶区域外侧的引物预扩增包含核酸分子一个以上片段的大区域，接着可以是采用特异于每一位点的引物扩增每一靶区域。通过调整热循环条件以及进行的热循环次数，可使多重PCR过程适合于将多重PCR的一些缺点(例如PCR引物之间或PCR引物和其它引物或不同于靶位点的基因组DNA其它区域的部分结合)降至最小，由此使副产物和所需的PCR产物的产率降低降至最小。这类对多重PCR过程的改动和调整可由本发明所属领域普通技术人员容易地完成，无需过度的试验。根据本发明不同实施方案可进行的多重扩增包括例如均于2005年3月24日提交的Andersen等人的美国专利申请11/090,830和Lao等人的美国专利申请11/090,468、2005年3月10日提交的美国专利申请60/661,139、Marmaro等人的美国专利6,605,451、2004年9月9日提交的公开号为US 2004/0175733的美国专利申请以及Andersen等人的公开号为WO 2004/051218的国际专利申请中所描述的那些，在此通过引用将这些文献整体并入本文。

[0130]根据一些实施方案，提供了这样的方法，其可包括：提供液体加工装置，其可包括一个或多个液体加工通路，该液体加工通路可包括第一区域和至少一个被置于第一区域下游并与其液体相通的密封区域，其中所述至少一个密封区域可包括氨气；在第一区域中保留液体样品；使容纳在所述至少一个密封区域中的氨气与该液体样品接触，其中当氨气溶解进液体样品时液体样品被吸进所述至少一个密封区域中。

[0131]在一些实施方案中，提供了这样的方法，其中所述至少一个密封区域可包括预装的氨气。所述至少一个密封区域可被足以提供气密密封的不透气覆盖物所密封，由此容纳在所述至少一个密封区域中的氨气可被稳定地保留于其中。根据一些实施方案，提供了这样的方法，其可包括将氨气装入所述至少一个密封区域中。所述装入可包括从例如氨气罐将氨气经由入口或入口区注入所述至少一个密封区域中。在一些实施方案中，该入口或入口区可包括膜、隔膜、空隙、开口、可再密封覆盖物、粘合覆盖物、柔性粘合覆盖物或其任何组合。氨气可在例如环境压力下、低于环境压力下、高于环境压力下、一个大气压下、低于一个大气压下、高于一个大气压下、约环境压力至约两个大气压下或约环境压力至1.5个大气压下被预装进或装进至少一个密封区域。装进至少一个密封区域的氨气可以以环境压力、低于环境压力、高于环境压力、一个大气压、低于一个大气压、高于一个大气压、约环境压力至约两个大气压或约环境压力至1.5个大气压被保持在所述至少一个密封区域中。

[0132]根据一些实施方案，提供了这样的方法，其中阀可包括热介导的、压力启动的阀，该阀例如可包括可爆裂阀。在一些实施方案中，阀的打开可包括将液体样品加热至一温度，该温度足以产生可足以使所述热介导的、压力启动的阀爆裂的压力。加热可包括将液体样品加热至例如高于用于热循环的温度。加热可包括将液体样品加热至例如约100℃至约130℃、约105℃至约125℃、约110℃至约125℃、或高于约115℃的温度，以产生可例如高于或等于约两个大气压的压力，由此热介导的、压力启动的阀可爆裂。

[0133]根据一些实施方案，提供了这样的方法，其中液体样品可包括多种不同的核酸序列并且第一区域可包括适合于预扩增该多种不同的核酸序列的两种或多种的预扩增组分。在一些实施方案中，该方法可包括在第一区域中预扩增多种不同的核酸序列，以产生包含一种或多种靶核酸序列的经预扩增样品。在一些实施方案中，提供了这样的方法，其中一个或多个密封区域可包括扩增组分，其适合于对包含在经预扩增液体样品中的多种经预扩增的不同核酸序列的一种或多种靶核酸序列进行扩增。该方法可包括在第一区域和所述一个或多个密封区域之间形成液体相通，将经预扩增液体样品吸入打开的密封区域并在该一个或多个打开的密封区域中扩增一种或多种靶核酸序列，以产生一种或多种经扩增靶核酸序列。在一些实施方案中，该方法可包括形成可检测标签。该方法可包括检测一种或多种可检测标签。可检测标签可包括荧光团和/或荧光染料。根据不同实施方案，可在密封区域的每一个中进行第二反应，并且DNA样品的不同长度、序列或区域可在不同的各自的密封区域中被扩增和/或检测。

[0134]根据一些实施方案，方法可包括检测在微流装置中加工的产物。检测可包括采用一些实施方案的系统进行的检测，或者通过使用任一不同独立检测系统的检测。

[0135]根据一些实施方案，提供了这样的方法，其可包括在液体加工装置的液体加工通路的样品制备区域或第一或预扩增区域中制备核酸样品。样品的制备可包括通过多种方法的任一种从细胞的其它组分隔离出、分离出或提取出细胞的含有核酸序列的组分。例如，可首先例如采用样品制备组分来裂解细胞，该样品制备组分可包括一种或多种酶如蛋白酶K或溶菌酶、去垢剂如SDS、Brij、Triton X 100、Tween 10和DOC，化学品如氢氧化钠、盐酸胍、和/或异硫氢酸胍，内切核酸酶，或限制性内切核酸酶。可将产生的细胞碎片与含有核酸的样品分离。根据不同实施方案，可采用机械和/或声学装置如超声换能器来进行裂解。然后，可通过置于样品制备区域下游的层析仪来纯化含有核酸的液体样品。层析仪可包括例如本领域通常使用类型的或离子交换层析柱或Lau等人的于2003年4月14日提交的美国专利申请10/414,179中所描述的离子交换材料或离子交换柱，在此通过引用将该文献整体并入本文。根据不同实施方案，纯化可包括膜过滤，例如Moring等人的美国专利6,159,368中所描述的，在此通过引用将其整体并入本文。

[0136]根据一些实施方案，提供了这样的方法，其中预扩增和/或扩增可包括下列方法中的一种或多种：聚合酶链式反应(PCR)；实时(RT)PCR；连接酶链反应；等温扩增反应；或信号放大反应，如

测定法(可从Third Wave Technologies，Inc of Madison，Wisconsin获得)。尽管在本文中提到的是核酸序列扩增反应，但应当理解，可进行信号放大方法，例如

测定法的，而并且实际上扩增靶核酸序列或使其加倍。关于测定法的更多信息和用于进行这种测定法的方法和装置在公开号6,706,471的美国专利申请中有描述，在此通过引用将其整体并入本文。

[0137]根据不同实施方案，提供了这样的方法，其中核酸序列扩增和/或预扩增可包括复制反应。在一些实施方案中，扩增和/或预扩增的方法可包括在热稳定性DNA聚合酶和脱氧核糖核苷三磷酸存在下使一种或多种核酸模板与较小的互补“引物”核酸杂交。在引物和模板杂交以形成“经预处理的模板复合物”之后，DNA聚合酶能以模板引导的方式延伸引物，产生引物延伸产物。然后，引物延伸产物可用作核酸合成的模板。变性后，所述引物延伸产物可与引物杂交以形成可用作DNA聚合酶底物的经预处理的模板复合物。杂交、引物延伸和变性循环可重复多次，以便使得引物延伸产物的数量指数增加。

[0138]根据一些实施方案，提供了这样的方法，其中扩增和/或预扩增可包括热循环。在一些实施方案中，提供了这样的液体加工系统，其可包括液体加工通路和热循环装置。可采用该热循环装置通过使反应物循环经过不同温度而进行杂交、引物延伸和变性循环。所使用的特定温度可基于所需要的碱基配对效率，并且可由本领域技术人员基于核酸样品和引物的碱基组成推导出。

[0139]根据多种不同的实施方案，扩增可包括实时PCR(RT PCR)反应。RT PCR反应类似于PCR反应，除了可使用的一种或多种反应物、引物或其它“探针”被标记物如荧光染料标记物所标记。可使用任何适合的标记物，如荧光团。荧光团可包括那些可偶联至有机分子(尤其是蛋白和核酸)并且在应答可用激发源激发时可发出可检测量的辐射或光信号的荧光团。适合的标记物可包括例如具有荧光、磷光和/或其它电磁辐射发射的材料。对标记物的照射可导致它们发光，光的频率取决于所使用的标记物的类型。实时PCR和进行实时PCR的系统的进一步的细节可在例如Higuchi等人的美国专利6,814,934B1中找到，在此通过引用将其整体并入本文。

[0140]在一些实施方案中，标记的引物(探针)可进一步包括淬灭性分子，由此该探针经历荧光共振能量转移(FRET)。FRET是两个染料分子的电激发态之间的距离依赖性相互作用，其中激发被从供体分子转移至受体分子，而不发射光子。FRET的效率可依赖于分子间距离六次幂的倒数，使其在类似于生物大分子尺寸的距离上有用。

[0141]FRET类型的探针或引物可与适合的聚合酶一起使用。该聚合酶可拷贝核酸的互补链并消化探针。该消化可破坏FRET，使得可用现有技术中已知的设备观测报告染料。这些观测可用于跟踪核酸复制的进程。本领域技术人员可意识到，作为替代，可使用其它不使用FRET探针和引物的方法，例如使用嵌入染料或暗淬灭剂(dark quencher)的方法。

[0142]根据一些实施方案，提供了这样的方法，其包括对多种经预扩增靶序列中的至少一种进行扩增，以形成扩增产物。该扩增产物可包括核酸，该方法可包括使扩增产物经历核酸测序反应。核酸测序反应可包括Sanger循环测序反应、分段测序或引物参入的正向/反向测序反应。

[0143]根据一些实施方案，测序方法可包括直接测序、分段测序、Sanger测序、循环测序、合成测序、荧光原位测序(FISSEQ)、杂交测序(SBH)、正向/反向测序、焦磷酸测序、使用硼酸化寡核苷酸的测序、电泳或微电泳测序、毛细管电泳测序或其它现有技术中已知的可用于小体积样品的核酸测序方法。在不同体积中测序的示例性说明可见于Soper等人的美国专利5,846,727、Uhlen的美国专利5,405,746以及Soper等人Anal.Chem.70：4036-4043(1998)，通过引用将这些文献整体并入本文。

[0144]加工液体样品的方法可包括将液体样品装入装有预扩增组分的预扩增区域，对液体样品中含有的多种不同的核酸序列进行预扩增，使经预扩增的液体样品转移至例如装有扩增组分的扩增区域，并对包含在经预扩增液体样品中的一个或多种靶核酸序列进行扩增。阀可被置于预扩增区域和扩增区域之间并且可被启动，由此经预扩增产物可流至例如可包括纯化组分如纯化介质的预扩增纯化区域。纯化后，任选的阀可被启动，纯化的经预扩增液体样品可经过分流器(如果提供的话)流动并分布至多个基本上平行的分支通道。等份的经预扩增液体样品可流经各自的分支通道进入各自的扩增区域，该扩增区域可包括适合于对包含在经预扩增液体样品中的靶核酸序列中的一种或多种扩增组分进行扩增，所述等份的样品在其中被扩增。经扩增的产物可在扩增期间和/或纯化后被检测和/或阀可任选地被启动和/或通道可任选地被适当配置，以便扩增产物可流至例如各自对应的可包括纯化组分的扩增纯化区域。任选地，纯化的经扩增产物可被检测，或者接着可流至例如存储或出口区域。根据不同实施方案，纯化的经扩增产物可流至各自对应的可包括测序组分的测序反应区域，纯化的经扩增产物可在其中被测序。然后，可使经测序的产物例如通过一种或多种力、阀、或适当配置的通道而流至对应的测序纯化区域。纯化后，可使纯化的测序产物流至出口区域或置于出口区域下游的存储区域。可经例如提供在出口区域之上的覆盖层取出纯化的测序产物。可通过例如向心力、毛细作用、重力、气动力、压力、水力、负压介导的流动、正压介导的流动、任何两种或多种上述作用的组合等使过程中的液体样品或液体产物从一区域、通道、或阀流至邻近区域、通道或阀。

IV.附图

[0145]图1显示了示例性液体加工装置2，其可包括基底10和至少部分地由基底10限定的一个或多个液体加工通路4。所述一个或多个液体加工通路4可包括：第一区域28，例如预扩增区域或预扩增/样品制备区域；阀24，例如可爆裂阀(burstable valve)；通过液体连接第一区域28和阀24的第一通道26；通过液体连接阀24和多个分支通道18(例如五个基本上平行的分支通道18)的第二通道22，其中第二通道22可包括多个分流器36，该分流器36可将液体样品的一部分转向至每一分支通道18；以及多个第二区域16，例如扩增区域，每一个与各自的分支通道18液体连通。多个第二区域16与第一区域28可为死端或非死端型液体连通。第一区域可包括预扩增组件，其适合于液体样品中多个相同或不同核酸序列进行预扩增。第一区域28还可包括一个或多个样品制备组件，其适合于制备样品，以用于预扩增，使得存在于液体样品中的多种不同的核酸序列可用于通过预扩增组件来预扩增。应当理解，该图为示例性的，并非按比例绘制。例如，第一区域可具有与各个液体加工通路4的所有第二区域16的总体积相等的体积。在所显示的实施方案中，第一区域28的体积可为每一第二区域16的体积的五倍。

[0146]显示在图1中的阀24可包括仅设计为开放的阀或设计为开放和关闭的阀。阀24可包括热介导的、压力启动的阀，例如可爆裂阀。阀24可包括选自可变形阀、可分解阀、可融化阀、光学阀、pH敏感阀、压力启动的阀以及机械阀的阀。可变形阀例如可包括中间壁。每一分流器36(在每一液体加工通路4中显示三个)可沿液体加工通路4的两个或多个分支通道18将液体样品分成两个或更多样品或等份，并且可提供在一个或多个每个液体加工通路的一个或多个部分中，例如用于将样品分成2，3，4，5，8，12，16，24，48，96，192，384，1536，6144或更多个样品或等份。根据一些实施方案，以及如所显示的，每一分流器36可被置于第一区域28的下游。每个分支通道18可以各自的死端第二区域16为末端，或者以末端开放的第二区域为末端，例如以各自的最新反应位点为末端。液体加工装置2可包括多个液体加工通路4，例如2，4，8，16，24，48，96，或192个，等等，其中每一个液体加工通路4可包括独立的第一区域28和两个或多个第二或出口区域16。每个液体加工通路4可包括独立的第一区域28和一个或多个可容纳氨气的密封的第二区域16。

[0147]图2显示了液体加工装置2的平面图，其可包括一个或多个液体加工通路4，该液体加工通路4例如至少部分地由基底10的至少一部分所限定。液体加工装置2可包括提供在基底10的顶部表面或第一表面上的覆盖层14，并通过例如粘合层12将它们粘着在一起。覆盖层14可提供有对应于每个反应位点的排气口或孔，或者可包括可透气的覆盖层，例如在2004年1月22日提交的美国专利申请10/762,786中所描述的覆盖层，通过引用将该文献整体并入本文。如果覆盖层14提供有孔或排气口，则它们可在适当的时间被密封，例如以促进填料和防止蒸发。液体加工装置2还可在上样之前和/或之后包括密封件30，例如可移除带、可再密封带、PCR带或垫圈，其有利于进入液体加工通路4的第一区域28。液体加工通路4可包括第一区域28和多个与第一区域28液体连通的第二区域16。液体加工通路可包括至少一个通道，例如第一通道26，其通过液体将第一区域28与阀24连接，阀24例如为热介导的、压力启动阀。液体加工通路4可包括第二通道22和与第二通道22液体连通的多个分支通道18，其中每个第二区域16可通过各自的分支通道18与第一区域28液体连通。第二通道22可包括交叉点20，例如通过图1中附图标记36示例的分流器。

[0148]图3显示了图2的液体加工装置2依图2的III-III线的横截面图。图3显示了可包括液体加工通路的基底10，该液体加工通路被提供为与基底10的顶部表面或第一表面的一部分连通或至少部分地由其所限定。液体加工通路4可包括第一区域28，其与第一通道26液体相通，第一通道与阀24液体相通，阀24又与第二通道22液体相通，通道22又与交叉点20液体相通，交叉点20又与分支通道18液体相通，分支通道18又与第二区域16液体相通。尽管第一通道26和第二通道22被显示为与第一区域28有相同的深度，但是第一通道26和第二通道22可分别独立地比第一区域28更深或更浅。柔性的覆盖层14可被提供在基底10的第一表面或顶部表面的至少一部分之上，并且可包括对应的粘合层和/或由其所粘着。覆盖层14可包括一个或多个空穴区，其例如可对应于由一个或多个第一区域28限定的一个或多个开口。液体加工装置2还可包括密封件30，其可包括例如可除去和/或可再密封带。

[0149]图4显示了液体加工装置2的平面图，其可包括由基底10的至少一部分所限定的一个或多个液体加工通路4。液体加工装置2可包括提供在基底10的顶部或第一表面上的覆盖层14，其中粘合层12可被置于其间以将覆盖层14粘合至顶部表面。液体加工装置2还可包括密封件30，例如可移除带、可再密封带或PCR带，其有利于进入液体通路4的第一区域。液体加工通路4可包括第一区域28和多个与第一区域液体相通的第二区域16。该液体加工通路可包括至少一个通道，例如第一通道26，其与第一区域28液体相通，带有阀24，例如热介导的、压力启动阀。液体加工通路4可包括第二通道22和多个与第二通道22液体相通的主分支通道32。每个主分支通道32可与多个次分支通道34液体相通，其中每个第二区域16通过各自的次分支通道34、主分支通道32、第二通道22和第一通道26与第一区域28液体相通。第二通道22可包括很多交叉点20，它们每一个例如可包括分流器。

[0150]根据本发明其它实施方案的系统显示在图5至10中。该系统包括预扩增阵列100(图5)、混合阵列120(图6)以及微流卡160(图10)。如所显示的，例如，在图5中，预扩增阵列100包括多个预扩增反应室102，每个都提供有入口104。为了方便反应室102的加热，例如热循环，预扩增阵列100提供有热传导顶层106、热传导底层108和夹在两层106和108之间的基底层109。基底层108可包括聚合材料，例如聚碳酸脂或聚-环烯共聚物材料。如图7所示，预扩增阵列100可由多通道移液装置140供料，该多通道移液装置140例如包括数个排放嘴142，它们对应于反应室102的数量或其一部分。在向反应室102供入用于预扩增的反应组分(包括一种或多种待扩增的靶序列)后，预扩增阵列100可被例如PCR带或其它密封材料密封，以便关闭入口104。然后，密封的预扩增阵列100可用如图8所示的热循环器150循环控温。热循环器150可包括一个或多个加热板，尽管在图8中只显示了两个加热板152、154。热传导层106和108各自独立地包括金属，例如铝或铜，以促进从热循环器150到反应室102内容物的传热。

[0151]在预扩增阵列100中反应室102内容物热循环之后，来自反应室102的预扩增产物可被转移进混合阵列120的各个反应室122，如图9所示。如图9所示，混合阵列120提供有多个转移嘴126，每一个都具有配置为用于刺穿预扩增阵列100的热传导底层108的尖头，以在反应室102和对应的反应室122之间形成各自的液体连通。混合阵列120提供有顶层130和底层132，在不同的实施方案中，它们可包括热传导材料，例如金属，如铝或铜。在所显示的实施方案中，底层132被配置为容易被刺穿，如下文结合对图10的说明所描述的。通过多个O形圈可在预扩增阵列100和混合阵列120之间提供有多个密封件，每一个O形圈都环绕一个转移嘴126。可提供卡钳(未示出)，以便将预扩增阵列100和混合阵列120压在一起并维持反应室102和反应室122之间的密封液体相通。采用离心，反应室102中的预扩增产物可通过转移嘴126被转移至各自的反应室122。如图9所示，反应室122可在这种转移过程之前预先装有反应组分，例如扩增反应组分。对反应室122的预装可通过入口124(图6)来实现，该入口随后可被密封，例如采用PCR带。

[0152]在转移至混合阵列120之后，反应室122的内容物可经热处理，例如热循环，或者可被转移至微流卡160(图10)，而不经热处理。如图10所示，微流卡160可提供有多个反应室162，多个转移嘴164、多个O形圈166以及热传导顶层168，结构类似于为混合阵列120所显示的结构或与其相同。微流卡160和混合阵列可被钳在一起，如图10所显示的，以便转移嘴160刺穿混合阵列120的热传导底层132，以使反应室122和反应室162之间各自液体相通。采用离心力，反应室122的内容物可通过转移嘴164被转移进反应室162，用于随后的加工。该随后的加工可包括例如热循环反应室162的内容物。在图9和图10中，图的上部显示了加紧操作之间的排列，图的中部显示了加紧操作之后和离心之前的排列，图的下部显示了加紧和离心之后的排列。

[0153]利用图5至10显示的系统，提供了从预扩增阵列至混合阵列的无移液器转移，其减少或消除了邻近反应室之间交叉污染的任何风险。尽管显示了线性的阵列系统，但根据不同实施方案，也可使用多维阵列。

[0154]在显示在图5至10的实施方案中，所绘制的各个部件的示例性大小可包括6mm×6mm、深2.5mm的反应室。转移嘴可从混合阵列和/或微流卡的上部表面伸出约1.0mm至约1.5mm。

[0155]本发明的另一实施方案显示在图11中，其中在第一对反应室202、204中提供了用于预扩增的系统，在四对反应室206和207、208和209、210和211以及212和213中提供了扩增。该系统可提供热区220和冷区230。样品可从热区220转移至冷区230并返回，以实现样品的热循环。例如实现预扩增的热循环可通过将样品经由转移通道203在反应室202和204之间来回转移而发生。可例如根据美国专利5,270,183或美国专利5,720,923的说明来提供样品的转移，通过引用将这些文献整体并入本文。作为提供热区220和冷区230的备选热循环方案，可包括改变反应室下热板和/或冷板的位置，例如美国专利5,176,203中所描述的，通过引用将其整体并入本文。可提供阀以控制样品从热区220向冷区230的转移以及返回，和/或可使用离心力来转移样品。

V.实施例

实施例1：

[0156]可提供下述装置，其包括50个示例性的、显示在图2和3中的不同液体加工通路。使用者可将50个不同的鼻拭子样品每一个通过加样孔1-50装入各自的第一区域。可例如通过密封第一区域而将加样孔关闭，接着可按压起始按钮。第一区域可预装裂解缓冲液和20种不同的引物对、随机引物和酶(逆转录酶或聚合酶)，由此在加入样品时，可产生样品溶液。对于多种临床样品，用于来自直接裂解的实时PCR的示例性裂解缓冲液可从很多来源获得，例如从microzone、zipgen、biovision、和ambion获得，例如在www.microzone.co.uk、www.zipgen.com、www.biovision.com、www.ambion.com(RT-PCR相容的细胞裂解缓冲液)上获得。

[0157]可以起始热循环。接着，在每一个第一区域中都可进行裂解和预扩增。已经显示PCR可直接在很多裂解缓冲液中进行。预扩增可在体积为例如约100微升至约500微升的第一区域中发生。热循环可包括维持起始温度约95℃约10分钟，然后是进行10个循环，每一个包括加热至95℃约15秒，然后加热至约60℃1分钟。

[0158]热循环器可将样品溶液加热，直至约110-120℃。含水的样品溶液可沸腾并使爆裂阀爆裂。或者，该阀可被直接加热，例如使用可被设置在该装置中的加热元件(阀内或邻近阀)，由此可避免将大量样品加热至正常热循环温度以上。然后，在第一区域中所得到的经预扩增样品可经由各自的第一通道流至分流器，其中每个经预扩增样品可被分为五等份。接着，每一等份经由各自的分支通道流至各自的、对应的第二区域或第二反应区域。对应于单一液体加工通路的五个第二区域每一个可以干制剂的形式含有四种各自的预装巢式引物对和对应探针(特异于四种不同的病原体)、加上酶和缓冲剂。

[0159]然后可进行TaqMan循环。扩增可包括约30至约40个循环的热循环，每个循环包括加热至约95℃约15秒，然后是加热至约60℃约1分钟。第二区域的每一个可具有约1微升至约10微升的体积。可在每个第二区域中进行4x多重技术，以鉴定每个第二区域中四种病原体是否存在以及每个样品(5个第二区域)中20种病原体是否存在。检测和仪器几何(geometry)可包括使用Applied Biosystems(Foster City，California)、HT7900实时PCR检测设备。液体加工装置可含有总共300个区域，其可包括50个第一区域，每一个可对应五个第二区域，因而该液体加工装置可包括250个第二区域。

[0160]其它适合的液体加工装置、基底、覆盖层、微流制造方法、入口、输出室、通路、阀、试剂、限流器、阀启动器、切割工具以及使用方法在COX等人的于2003年3月31日提交的公开号为2004/0131502A1的美国专利申请；DESMOND等人的于2003年1月3日提交的公开号为2004/0018116A1的美国专利申请；HARROLD，Michael P.的于2003年7月28日提交的美国专利申请公开号为2004/0055956A1的美国专利申请；WOUDENBERG等人的于2003年2月24日提交的美国专利申请公开号为20030152994A1的美国专利申请；2005年1月5日提交的美国专利申请11/029,968；DESMOND等人的于2003年1月3日提交的公开号为2004/0018117A1的美国专利申请中有描述，通过引用将这些文献中的每一个整体并入本文。

[0161]在考察本说明书和实施本文公开的本发明之后，本发明的其它实施方案对本领域技术人员而言是显而易见的。本说明书和实施例应被认为是示例性的，本发明的真实范围和精神仅由所附的权利要求书和其等同物所指明。

Claims (20)

1.一种液体加工装置，其包括：

包括第一表面和相反的第二表面的基底；和

一个或多个至少部分地由所述基底所限定的液体加工通路；所述一个或多个液体加工通路的每一个可包括

第一区域，其包括被置于其中的预扩增反应组分，其适合于对存在于样品中的多种不同的核酸序列进行预扩增，以产生多种经预扩增序列的，和

两个或多个第二区域，它们每一个与所述第一区域液体相通，并且包括被置于其中的扩增反应组分，其适合于对所述多种经预扩增序列的一种或多种进行扩增，以产生一种或多种经扩增靶序列。

2.权利要求1的液体加工装置，其中所述两个或多个第二区域每个都被开孔。

3.权利要求1的液体加工装置，其中所述扩增反应组分包括适合于对所述多种经预扩增序列中的两种或多种不同序列的至少一部分进行扩增的扩增反应组分。

4.液体加工系统，其包括：

权利要求1的液体加工装置；和

能够与每一个液体通路的所述两个或多个第二区域光学相通的检测器，所述检测器适合于检测所述两个或多个区域中一种或多种经扩增靶序列，其中所述经扩增靶序列每一种被各自的可检测标签所标记。

5.液体加工装置，其包括：

具有第一表面和相反的第二表面的基底；和

一个或多个至少部分地由所述基底所限定的液体加工通路；所述一个或多个液体加工通路的每一个可包括

至少一个热介导的、压力启动的阀，当横跨所述阀施加至少两个大气压的压力以及所述阀被加热至约100℃至约130℃的温度时，所述阀适合于爆裂。

6.液体加工装置，其包括：

具有第一表面和相反的第二表面的基底；和

一个或多个至少部分地由所述基底所限定的液体加工通路；所述一个或多个液体加工通路的每一个可包括

第一区域；和

一个或多个置于所述第一区域下游并与其液体相通的密封区域，所述一个或多个密封区域包括氨气。

7.权利要求6的液体加工装置，其中所述一个或多个密封区域包括预装的氨气。

8.权利要求7的液体加工装置，其中所述第一区域还包括一种或多种缓冲组分，其足以在液体样品与所述氨气接触后至少部分地中和所述液体样品的pH。

9.权利要求7的液体加工装置，其中所述第一区域包括被置于其中的预扩增反应组分，其适合于对存在于液体样品中的多种不同的核酸序列进行预扩增，以在预扩增所述液体样品后产生多种经预扩增序列。

10.一种方法，其包括：

提供液体加工装置，其包括一个或多个液体加工通路，每一个液体加工通路包括与两个或多个第二区域液体相通的第一区域；

从至少一个模板向所述液体加工装置的第一区域引入包含多种不同核酸序列的液体样品；

在所述第一区域中对所述多种不同核酸序列中的两种或多种进行预扩增，以产生包含多种经预扩增核酸序列的经预扩增液体样品；

使所述经预扩增液体样品从所述第一区域转移至所述两个或多个第二区域；以及

在所述两个或多个第二区域每一个中对所述多种经预扩增核酸序列中的至少一种各自的靶核酸序列进行扩增，以在所述两个或多个第二区域每一个中产生包含至少一种各自的经扩增靶核酸序列的经扩增液体样品。

11.权利要求10的方法，其中所述一个或多个液体加工通路每一个还可包括至少一个液体连接所述第一区域和所述两个或多个第二区域的通道。

12.权利要求11的方法，其中转移包括使所述经预扩增液体样品从所述第一区域经至少一个通道转移进所述两个或多个第二区域。

13.权利要求10的方法，其中转移包括对所述液体加工装置进行离心。

14.权利要求10的方法，其中所述扩增包括指数扩增。

15.权利要求10的方法，其中所述预扩增包括在所述第一反应区域中对所述液体样品进行热循环。

16.一种方法，其包括

提供液体加工装置，其包括一个或多个液体加工通路，所述液体加工通路每一个包括第一区域和至少一个被置于所述第一区域下游并与其液体相通的密封区域，其中所述至少一个密封区域包含氨气；

在所述第一区域中保留液体样品；

使包含在所述至少一个密封区域中的所述氨气与所述液体样品接触，其中当氨气溶解进所述液体样品时，所述液体样品被吸进所述至少一个密封区域。

17.权利要求16的方法，其中所述至少一个密封区域包括预装的氨气。

18.权利要求16的方法，还包括将氨气装入所述至少一个密封区域。

19.权利要求16的方法，其中所述一个或多个液体加工通路还包括被置于所述第一区域和至少一个密封区域之间并与它们液体相通的阀。

20.权利要求19的方法，其中所述阀包括热介导的、压力启动的阀。

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