CN105849281A - 用于筛选在pcr测定中使用的试剂的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于筛选在聚合酶链式反应(PCR)测定的执行中使用的试剂的方法。本发明用于基因分型、病原体检测和体外诊断。

Description

用于筛选在PCR测定中使用的试剂的方法
技术领域
本发明涉及用于筛选在聚合酶链式反应(PCR)测定的执行中使用的试剂的方法。本发明用于基因分型、病原体检测和体外诊断。
背景技术
核酸扩增技术的开发已经彻底改变了遗传分析和工程科学。例如，聚合酶链式反应(PCR)通常用于使用选择的引物核酸扩增特定靶核酸，例如，以促进靶核酸的检测作为诊断、法医或其它应用的组成部分。引物通常成对地起作用，其被设计成向彼此延伸以覆盖选择的靶区域。一个典型PCR循环包括高温(例如，85℃或更高)变性步骤（其中双链核酸的链彼此分开）、低温(例如，45-65℃)对合步骤（其中引物与分离的单链杂交）和中间温度(例如，约72℃)延伸步骤（其中核酸聚合酶延伸引物）。还利用双温度热循环操作。这些通常包括高温变性步骤和低温对合-延伸步骤。
已经开发了多种用于检测扩增产物的策略，最广泛地使用的方法之一是5' 核酸酶或TaqMan®测定。在PCR过程中，5' 核酸酶测定通常利用某些DNA聚合酶的5'至3'核酸酶活性来切割5' 核酸酶寡核苷酸探针。该测定允许扩增靶标和释放标记进行检测，通常无需求助于扩增产物的多个操作步骤。5' 核酸酶探针通常包括标记部分，诸如荧光报道染料和淬灭剂染料。当探针是完整的时，报道染料向淬灭剂染料的靠近通常导致报道分子荧光的抑制。在5' 核酸酶反应过程中，探针的切割使报道染料和淬灭剂染料彼此分开，从而导致来自报道分子的荧光的可检测的增加。通常通过实时监测这种荧光增加来间接地检测PCR产物或扩增子的积累。
需要许多试剂来执行PCR测定，并且试剂诸如DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、寡核苷酸引物、探针和在维持pH的缓冲液(例如Tris-HCl)中的盐(镁、钾、氯化物)经常预混合在被称作主混合物的溶液中。还已知某些物质诸如明胶、牛血清白蛋白(BSA)、硫酸铵和非离子型去污剂充当稳定剂并改善PCR测定的性能。甘油(15-20%)向PCR混合物中的添加也可以如下增强PCR反应性能：通过增加DNA聚合酶的热稳定性，以及通过降低链分离所需的温度(参见Cheng, S. 等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 5695, 1994)。
发明概述
尽管甘油被用作PCR测定的稳定剂且经常被包含在主混合物溶液中，但是已经观察到，“坏”甘油样品在主混合物溶液中的存在可以导致失败的PCR测定，不会观察到模板核酸的扩增。因此，非常有用的是，具有可以检测“坏”甘油样品并避免它在主混合物溶液中的使用的方法。本发明提供了一种用于筛选甘油样品的方法，所述甘油样品适合用在试剂溶液内以执行聚合酶链式反应(PCR)测定，所述方法包括，提供所述甘油样品；提供所述试剂溶液；将所述甘油样品和所述试剂溶液混合以产生测试混合物；给所述测试混合物提供用荧光染料标记的寡核苷酸探针；将所述测试混合物在约65℃温育约16小时；将所述测试混合物加入液相层析系统，其中所述系统连接至荧光检测器；通过所述液相层析系统将所述寡核苷酸探针与所述寡核苷酸探针的降解产物分离；测量来自所述液相层析系统的分离的级分的荧光信号，其中来自与所述寡核苷酸探针的降解产物对应的级分的荧光信号的检测指示所述甘油样品不适合用于执行PCR测定，并且其中来自与所述寡核苷酸探针的降解产物对应的级分的荧光信号的不存在指示所述甘油样品适合用于执行PCR测定。
具体地，使用超效液相层析(UPLC)系统或柱执行根据本发明的方法应用的分离步骤。
在发明详述中和在附图中更详细地描述了本发明的实施方案和优点。
附图说明
图1A和1B显示了在实施例1所述的条件下穿过UPLC柱以后，来自13种测试混合物的FAM-标记的寡核苷酸探针的荧光峰，每种测试混合物含有不同的甘油样品。
图2显示了使用在“好”甘油样品中混合的寡核苷酸探针1(条A-F)、在“坏”甘油样品中混合的寡核苷酸探针1(条G)和在“坏”甘油样品中的寡核苷酸探针2和3(条H和I)，在0.3-0.8 min区域观察到的荧光的条形图。
发明详述
定义
除非另外定义，在本文中使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。下述参考文献给技术人员提供了在本发明中使用的许多术语的一般定义：Singleton等人, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (1994年第2版); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker编, 1988); TheGlossary of Genetics, 第5版, R. Rieger等人(编), Springer Verlag (1991)；以及Hale和Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。本文中使用的下述术语具有归于它们的含义，除非另有说明。
术语“核酸”表示核苷酸(例如，核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、核苷酸类似物等)的聚合物，并且包含脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、DNA-RNA杂交物、寡核苷酸、多核苷酸、适体、肽核酸(PNA)、PNA-DNA缀合物、PNA-RNA缀合物等，其包含以直链或支链方式共价连接在一起的核苷酸。核酸通常是单链的或双链的，并且一般含有磷酸二酯键，尽管在某些情况下，包括可以具有替代主链的核酸类似物，包括、例如，磷酰胺(Beaucage等人(1993),Tetrahedron 49(10):1925)；硫代磷酸酯(Mag等人(1991), Nucleic Acids Res. 19:1437；和美国专利号5,644,048)、二硫代磷酸酯(Briu等人(1989), J. Am. Chem. Soc.111:2321)、O-甲基亚磷酰胺键(参见Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: APractical Approach, Oxford University Press (1992))和肽核酸主链和键(参见，Egholm (1992), J. Am. Chem. Soc. 114:1895))。其它类似物核酸包括具有带正电荷主链的类似物核酸(Denpcy等人(1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6097)；非离子主链(美国专利号5,386,023、5,637,684、5,602,240、5,216,141和4,469,863)和非核糖主链，包括在美国专利号5,235,033和5,034,506中描述的那些。含有一个或多个碳环糖的核酸也被包括在核酸的定义内(参见Jenkins等人(1995), Chem. Soc. Rev. 第169-176页)，并且类似物也描述在，例如，Rawls, C & E News, 1997年6月2日, 第35页。可以完成核糖-磷酸主链的这些修饰，以促进另外部分(诸如标记)的添加或以改变这样的分子在生理环境中的稳定性和半衰期。
除了通常在核酸中发现的天然存在的杂环碱基(例如，腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶)以外，核苷酸类似物也可以包括非天然存在的杂环碱基，诸如在例如Seela等人(1999), Helv. Chim. Acta 82:1640中描述的那些。在核苷酸类似物中使用的某些碱基充当解链温度(Tm)改性剂。例如，这些中的一些包括7-脱氮嘌呤(例如，7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤等)、吡唑并[3,4-d]嘧啶、丙炔基-dN (例如，丙炔基-dU、丙炔基-dC等)等。参见，例如，美国专利号5,990,303。其它代表性的杂环碱基包括，例如，次黄嘌呤、肌苷、黄嘌呤；2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、次黄嘌呤、肌苷和黄嘌呤的8-氮杂衍生物；腺嘌呤、鸟嘌呤、2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、次黄嘌呤、肌苷和黄嘌呤的7-脱氮-8-氮杂衍生物；6-氮胞苷；5-氟胞苷；5-氯胞苷；5-碘胞苷；5-溴胞苷；5-甲基胞苷；5-丙炔基胞苷；5-溴乙烯基尿嘧啶；5-氟尿嘧啶；5-氯尿嘧啶；5-碘尿嘧啶；5-溴尿嘧啶；5-三氟甲基尿嘧啶；5-甲氧基甲基尿嘧啶；5-乙炔基尿嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶等。
“核苷”表示包含碱基或碱性基团(其包含至少一个同素环、至少一个杂环、至少一个芳基和/或类似基团)的核酸组分，所述碱基或碱性基团与糖部分(核糖糖或脱氧核糖糖)、糖部分的衍生物、或糖部分的功能等同物(例如碳环)共价地连接。例如，当核苷包括糖部分时，碱基通常连接至该糖部分的1'-位置。如上所述，碱基可以是天然存在的碱基或非天然存在的碱基。示例性的核苷包括核糖核苷、脱氧核糖核苷、二脱氧核糖核苷和碳环核苷。
“核苷酸”表示核苷的酯，例如，核苷的磷酸酯，其具有一个、两个、三个或更多个共价连接至核苷的糖部分的5'位置的磷酸酯基团。
术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”互换使用。“寡核苷酸”是有时用于描述较短多核苷酸的术语。寡核苷酸可以包含与指定的核苷酸序列的区域对应的至少6个核苷酸，例如至少约10-12个核苷酸，或至少约15-30个核苷酸。
术语“扩增反应”表示用于增加靶核酸序列的拷贝的任何体外方式。
“扩增”表示使溶液处于足以允许扩增的条件的步骤。扩增反应的组分可以包括、但不限于例如引物、多核苷酸模板、聚合酶、核苷酸、dNTP等。术语“扩增”通常表示靶核酸的“指数”增加。但是，本文中使用的“扩增”还可以表示选定的靶核酸序列的数目的线性增加，但是不同于一次性的、单引物延伸步骤。
“聚合酶链式反应”或“PCR”表示用于以等比数列扩增靶双链DNA的特定区段或子序列的方法。PCR是本领域技术人员众所周知的；参见，例如，美国专利号4,683,195和4,683,202；和PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis等人编,1990。
本文中使用的术语“寡核苷酸探针”表示这样的多核苷酸序列：其能够与目标靶核酸杂交或对合并且允许所述靶核酸的特异性检测。
术语“主混合物”或“主混合物溶液”与术语“试剂溶液”互换使用，且表示PCR发生所需的所有或大部分成分或因子的混合物，且在某些情况下，除了样品和扩增子特异性的模板和引物以外的全部。商购可得的主混合物经常是浓缩的溶液。主混合物可以含有多种样品共有的所有试剂，但是它也可以仅为一种样品构建。使用主混合物有助于减小由吸量的体积之间的差异引起的样品之间的吸量错误和变动。
术语“约”表示下面的时间或温度的近似范围。因此，“约16小时”可以表示时间范围，例如12小时至20小时之间，且“约65℃”可以表示温度范围，例如60℃至70℃之间。
“核酸聚合酶”表示催化核苷酸向核酸内的掺入的酶。示例性的核酸聚合酶包括DNA聚合酶、RNA聚合酶、末端转移酶、逆转录酶、端粒末端转移酶等。
“热稳定的DNA聚合酶”表示这样的DNA聚合酶：当遭受高温选定的时间段时，其为稳定的(即抵抗分解或变性)且保持足够的催化活性。例如，当遭受高温使双链核酸变性所需的时间时，热稳定的DNA聚合酶保留实现后续引物延伸反应的足够活性。核酸变性所需的加热条件是本领域众所周知的，并且在美国专利号4,683,202和4,683,195中举例说明。本文中使用的热稳定的聚合酶通常适用于温度循环反应诸如聚合酶链式反应(“PCR”)中。热稳定的核酸聚合酶的例子包括水生栖热菌Taq DNA聚合酶、栖热菌属(Thermus)种Z05聚合酶、黄栖热菌(Thermus flavus)聚合酶、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)聚合酶诸如TMA-25和TMA-30聚合酶、Tth DNA聚合酶等。
“经修饰的”聚合酶表示其中至少一个单体不同于参照序列的聚合酶，所述参照序列是例如所述聚合酶的天然或野生型形式或所述聚合酶的另一种修饰形式。示例性修饰包括单体插入、缺失和置换。经修饰的聚合酶还包括嵌合聚合酶，其具有衍生自两个或更多个亲本的可鉴定的组分序列(例如，结构或功能结构域等)。在经修饰的聚合酶的定义内还包括包含参照序列的化学修饰的那些。经修饰的聚合酶的例子包括G46E E678G CS5 DNA聚合酶、G46E L329A E678G CS5 DNA聚合酶、G46E L329A D640G S671F CS5 DNA聚合酶、G46EL329A D640G S671F E678G CS5 DNA聚合酶、G46E E678G CS6 DNA聚合酶、Z05 DNA聚合酶、ΔZ05聚合酶、ΔZ05-Gold聚合酶、ΔZ05R聚合酶、E615G Taq DNA聚合酶、E678G TMA-25聚合酶、E678G TMA-30聚合酶等。
术语“5'至3'核酸酶活性”或“5'-3'核酸酶活性”表示通常与核酸链合成相关的核酸聚合酶的活性，由此核苷酸从核酸链的5'末端除去。例如，大肠杆菌DNA聚合酶I具有该活性，而克列诺片段没有。一些具有5'至3'核酸酶活性的酶是5'至3'外切核酸酶。这样的5'至3' 外切核酸酶的例子包括：得自枯草芽孢杆菌(B. subtilis)的外切核酸酶，得自脾的磷酸二酯酶，λ外切核酸酶，得自酵母的外切核酸酶II，得自酵母的外切核酸酶V，和得自粗糙链孢霉(Neurospora crassa)的外切核酸酶。
利用5'至3'核酸酶活性的靶核酸的检测可以通过如以下文献所述的“TaqMan®”或“5′-核酸酶测定”来执行：美国专利号5,210,015、5,487,972和5,804,375；和Holland等人, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7276-7280。在TaqMan®测定中，在扩增区内杂交的标记的检测探针在扩增反应期间存在。探针如此进行修饰，以阻止探针充当DNA合成的引物。所述扩增使用具有5'至3′外切核酸酶活性的DNA聚合酶执行。在扩增的每个合成步骤期间，与来自待延伸引物下游的靶核酸杂交的任何探针通过DNA聚合酶的5'至3′外切核酸酶活性降解。因而，新靶链的合成也导致探针的降解，并且降解产物的积累会提供靶序列合成的量度。
适合用于检测降解产物的任何方法均可用在5'核酸酶测定中。通常，检测探针用两种荧光染料进行标记，其中之一能够淬灭另一种染料的荧光。所述染料附着至探针，通常报道或检测染料附着至5'末端，且淬灭染料附着至内部位点，使得当探针处于非杂交状态时，淬灭发生，并且使得通过DNA聚合酶的5'至3'外切核酸酶活性实现的探针切割发生在两种染料之间。扩增导致染料之间的探针切割，伴随淬灭的消除和来自最初淬灭的染料的可观察的荧光的增加。通过测量反应荧光的增加，监测降解产物的积累。美国专利号5,491,063和5,571,673描述了用于检测与扩增伴随发生的探针降解的替代方法。
荧光染料可以包括带负电荷的的染料，诸如荧光素家族的染料，或电荷中性的染料，诸如罗丹明家族的染料，或带正电荷的染料，诸如花青家族的染料。荧光素家族的染料包括，例如，6-羧基-荧光素(FAM)、2', 4, 4', 5', 7, 7'-六氯荧光素(HEX)、TET、JOE、NAN和ZOE。罗丹明家族的染料包括，例如，德克萨斯红、ROX、R110、R6G和TAMRA或罗丹明衍生物JA270 (参见，美国专利号6,184,379)。FAM、HEX、TET、JOE、NAN、ZOE、ROX、R110、R6G和TAMRA可商购得自，例如，Perkin-Elmer, Inc. (Wellesley, MA, USA)，且德克萨斯红可商购得自，例如，Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR)。花青家族的染料包括，例如，Cy2、Cy3、Cy5、Cy5.5和Cy7，且可商购得自，例如，Amersham Biosciences Corp. (Piscataway, NJ,USA)。
用于检测靶核酸的5'核酸酶测定可以采用具有5'至3′外切核酸酶活性的任何聚合酶。因此，在某些实施方案中，具有5'核酸酶活性的聚合酶是热稳定和热活性的核酸聚合酶。这样的热稳定的聚合酶包括、但不限于来自真细菌属栖热菌属、热袍菌属(Thermatoga)和栖热腔菌属(Thermosipho)的多个种的天然和重组形式的聚合酶以及其嵌合形式。例如，可以用于本发明的方法中的栖热菌属种聚合酶包括水生栖热菌(Taq)DNA聚合酶、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)(Tth)DNA聚合酶、栖热菌属种Z05(Z05)DNA聚合酶、栖热菌属种sps17(sps17)和栖热菌属种Z05(例如在美国专利号5,405,774、5,352,600、5,079,352、4,889,818、5,466,591、5,618,711、5,674,738和5,795,762中所述)。可以用于本发明的方法中的热袍菌属聚合酶包括例如海栖热袍菌DNA聚合酶和新阿波罗栖热袍菌(Thermatoganeapolitana)DNA聚合酶，而可以使用的栖热腔菌属聚合酶的一个例子是非洲栖热腔菌(Thermosipho africanus)DNA聚合酶。海栖热袍菌和非洲栖热腔菌DNA聚合酶的序列公开于国际专利公开号WO 92/06200中。新阿波罗栖热袍菌的序列可以在国际专利公开号WO97/09451中找到。
在5'核酸酶测定中，扩增检测通常与扩增同时发生(即，“实时”)。在某些实施方案中，扩增检测是定量的，并且扩增检测是实时的。在某些实施方案中，扩增检测是定性的(例如，靶核酸的存在或不存在的终点检测)。在某些实施方案中，扩增检测在扩增之后。在某些实施方案中，扩增检测是定性的，并且扩增检测在扩增之后。
提供以下实施例和附图以帮助理解本发明，本发明的真实范围在所附权利要求书中阐述。
液相层析
在液相层析中，样品穿过含有适当颗粒(固定相)的柱或筒装置。这些颗粒被称作层析填充材料。溶剂(流动相)流动穿过所述装置。在固相萃取(SPE)中，将样品加载到筒上，并且溶剂流携带样品穿过装置。样品中的不同化合物然后通过以不同的各个速度行进穿过装置而分离。
当利用筒形式时，存在几种实现流动的方式。可以为没有设计成耐受压力的柱使用重力或真空。通常，颗粒在该情况下具有较大的直径(> 50微米)，使得存在更少的流动阻力。开放玻璃柱是这类的一个例子。另外，可以给小塑料柱（通常呈注射器筒的形状）装入填充材料颗粒并用于执行样品制备。这被称作固相萃取(SPE)。在这里，使用层析装置（被称作筒）（经常与真空辅助的流动一起）来提纯非常复杂的样品，然后将它进一步分析。
需要较小的粒度(<10微米)来改善分离能力。但是，较小的颗粒具有较大的流动阻力，所以需要较高的压力来建立期望的溶剂流速。被设计成耐受高压的泵和柱是必要的。当使用中压至高压使溶剂流动穿过层析柱时，该技术被称作高效液相层析(HPLC)。
HPLC最初指示以下事实：使用高压来产生填充柱中的液相层析所需的流动。在开始时，泵仅具有500 psi的压力能力(35巴)。这被称作高压液相层析或HPLC。较新的HPLC仪器可以形成高达6,000 psi (400巴)的压力，并包括改进的注射器、检测器和柱。使用较小颗粒和甚至较高压力导致性能的持续改进。
高效液相层析现在是分析化学中最有利的工具之一。它具有分离、鉴定和定量存在于可以溶解在液体中的任何样品中的化合物的能力。目前，可以容易地鉴定低至万亿分之几(ppt)的痕量浓度的化合物。HPLC可以且已经应用于几乎任何样品，诸如药物、食品、营养制品、化妆品、环境基质、法医样品和工业化学品。
做出仪器和柱技术的进一步发展来实现液相层析的分辨率、速度和灵敏度的非常显著的增加。需要具有较小颗粒(1.7微米)的柱和具有被设计成在15,000 psi (1,000巴)递送流动相的专门能力的仪器来达到新的性能水平。这种用于执行超效液相层析的新系统被称作UPLC技术。
实施例
实施例1 超效液相层析(UPLC)条件
使用具有Empower 2软件、具有光电二极管阵列(PDA)检测器和荧光检测器的WatersAcquityTM UPLC仪器，执行UPLC。使用的柱是Acquity OST C18柱，其具有1.7 μM粒度、2.1 x50 mm内径。嵌入的柱加热器设定在60℃温度。流动相由100mM三乙基乙酸铵(TEAA) pH 7.0（对于缓冲液A）和100%乙腈（对于缓冲液B）组成。PDA检测器设定在254 nm的吸光度，20点/秒。荧光检测器设定成以495 nm的激发波长和510 nm的发射波长读出6-羧基-荧光素(FAM)的信号。对于要测试的每种反应混合物，将10 μl注射进柱中，且用于运行柱的梯度显示在表1上。
表1
步骤 时间(min) 流速(mL/min) %A %B
1 初始 1.000 95 5
2 3.00 1.000 40 60
3 3.05 1.000 5 95
4 3.30 1.000 5 95
5 3.35 1.000 95 5
6 4.00 1.000 95 5
实施例2 13种不同的甘油样品的测试
使用下述条件测试了13个不同批次的甘油样品(样品编号1-13)。将250 μl 80%甘油样品与250 μl 100 mM三(羟甲基)甲基甘氨酸pH 8.3缓冲液混合。将混合物剧烈涡旋以彻底混合。接着，将FAM-标记的寡核苷酸探针(探针编号1)以1 μM的终浓度加入混合物中。将所述混合物在65℃温育16小时，并使用在实施例1中描述的条件将10 μl注射进UPLC柱中。图1显示了通过荧光测量的测试的13批甘油样品的洗脱概况。在1.00 min级分洗脱的荧光峰代表完整的FAM-标记的探针。在0.30和0.80分钟标志之间出现的在甘油样品12和13中看到的较小荧光信号代表降解的寡核苷酸探针。这些降解产物的存在指示，甘油样品12和13不适合用在用于PCR测定的主混合物中。
实施例3 使用不同探针测试“好”和“坏”甘油样品
使用实施例2所述的实验所用的FAM-标记的寡核苷酸探针(探针编号1)测试了7种不同的甘油样品，并产生了测试混合物A-G。测试混合物G含有“坏”甘油样品(实施例2中的样品12)。另外，将“坏”甘油样品(样品12)与两种不同的FAM-标记的寡核苷酸探针（探针编号2、探针编号3）混合以分别产生测试混合物H和I。将所有测试混合物如在实施例2中所述温育，如在实施例1中所述通过UPLC分析。将在0.3分钟和0.8分钟之间的荧光峰值积分，并将计算的荧光峰面积转化为图2所示的条形图上的条。如预期的，仅在测试混合物G、H和I中测试的“坏”甘油样品(样品12)表现出指示寡核苷酸探针的降解产物的存在的峰值。

Claims (2)

1.一种用于筛选甘油样品的方法，所述甘油样品适合用在主混合物溶液内以执行聚合酶链式反应(PCR)测定，所述方法包括：
提供所述甘油样品；
提供所述主混合物溶液；
将所述甘油样品和所述主混合物溶液混合以产生测试混合物；
给所述测试混合物提供用荧光染料标记的寡核苷酸探针；
将所述测试混合物在约65℃温育约16小时；
将所述测试混合物加入液相层析系统，其中所述系统连接至荧光检测器；
通过所述液相层析系统将所述寡核苷酸探针与所述寡核苷酸探针的降解产物分离；
测量来自所述液相层析系统的分离的级分的荧光信号，
其中来自与所述寡核苷酸探针的降解产物对应的级分的荧光信号的检测指示所述甘油样品不适合用于执行PCR测定，并且
其中来自与所述寡核苷酸探针的降解产物对应的级分的荧光信号的不存在指示所述甘油样品适合用于执行PCR测定。
2.根据权利要求1所述的方法，其中使用超效液相层析系统执行所述分离步骤。
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