JP6510535B2

JP6510535B2 - Ｐｃｒアッセイに使用される試薬のスクリーニング方法

Info

Publication number: JP6510535B2
Application number: JP2016542191A
Authority: JP
Inventors: シェーンブルナーナンシー; アナクレートコンコルディオ
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2013-12-23
Filing date: 2014-12-22
Publication date: 2019-05-08
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Description

発明の分野
本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイの実施に使用される試薬のスクリーニング方法に関する。本発明は、ジェノタイピング、病原体検出及びインビトロ診断への適用を有する。

発明の背景
核酸増幅技法の開発は、遺伝子分析及び遺伝子工学科学に革命をもたらした。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、選択されたプライマー核酸を用いて特定の標的核酸を増幅するために、例えば診断、法医学又は他の使用の一環として標的核酸の検出を促進するために、通常使用される。プライマーは通常、選択された標的領域をカバーするために、互いに向かって伸長するように設計されるペアで機能する。典型的なＰＣＲサイクルは、二本鎖核酸の鎖がお互い分離する高温（例えば、８５℃又はそれ以上）の変性工程、プライマーが分離された一本鎖にハイブリダイズする低温（例えば、４５〜６５℃）のアニーリング工程、及び核酸ポリメラーゼがプライマーを伸長する中温（例えば、７２℃付近）の伸張工程を包含する。２つの温度の熱サイクル手順もまた利用される。それらは一般的に、高温変性工程及び低温アニール伸張工程を包含する。

増幅生成物を検出するための種々の方法が開発されており、そして最も広く使用される方法の１つは、５′ヌクレアーゼ又はＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイである。５′ヌクレアーゼアッセイは典型的には、ＰＣＲの間、５′ヌクレアーゼオリゴヌクレオチドプローブを切断するために特定のＤＮＡポリメラーゼの５′→３′ヌクレアーゼ活性を利用する。このアッセイは一般的に、増幅された生成物の複数工程に頼ることなく、標的の増幅及び検出のための標識の放出の両方を可能にする。５′ヌクレアーゼプローブは典型的には、標識部分、例えば蛍光レポーター色素及び消光色素を含む。プローブが損なわれていない場合、消光色素へのレポーター色素の近接性が一般的に、レポーター蛍光の抑制をもたらす。５′ヌクレアーゼ反応の間、プローブの切断は、お互いからのレポーター色素及び消光色素を分離し、レポーターからの蛍光の検出できる上昇をもたらす。ＰＣＲ生成物又はアンプリコンの蓄積は典型的には、リアルタイムでの蛍光のこの増加をモニターすることにより、間接的に検出される。

多くの試薬が、ＰＣＲアッセイを実施するために必要とされ、そして試薬、例えばＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、オリゴヌクレオチドプライマー、プローブ、及びｐＨ−維持緩衝液中の塩（マグネシウム、カリウム、塩化物）（例えば、トリス−ＨＣｌ）がしばしば、マスターミックスと呼ばれる溶液に予備混合される。特定の材料、例えばゼラチン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、硫酸アンモニウム及び非イオン性界面活性剤が安定化剤として作用し、そしてＰＣＲアッセイの性能を改善することはまた、知られている。ＰＣＲ混合物へのグリセロール（１５〜２０％）の添加がまた、ＤＮＡポリメラーゼの熱安定性を高めることにより、及びまた、鎖分離のために必要な温度を低下させることにより、ＰＣＲ反応性能を増強することができる（Cheng, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 5695, 1994を参照のこと）。

発明の要約
グリセロールはＰＣＲアッセイのための安定化剤として使用され、そしてしばしば、マスターミックス溶液に含まれているが、マスターミックス溶液中での「不良（bad）」のグリセロールサンプルの存在が失敗したＰＣＲアッセイをもたらし、結果的に、増幅が鋳型核酸について観察されないことが観察されている。従って、「不良」なグリセロールサンプルを検出でき、そしてマスターミックス溶液へのその使用を回避できる方法を有することは非常に有用であろう。本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイを実施するためのマスターミックス溶液内への使用のために適したグリセロールサンプルについてのスクリーニング方法を提供し、ここで前記方法は、前記グリセロールサンプルを提供し；前記マスターミックス溶液を提供し；前記グリセロールサンプルと前記マスターミックス溶液とを混合して試験混合物を生じさせ；蛍光色素で標識されるオリゴヌクレオチドプローブを前記試験混合物に提供し；前記試験混合物を、約６５℃で約１６時間インキュベートし；前記試験混合物を、液体クロマトグラフィーシステムに添加し、ここで前記システムは蛍光検出器に連結されており；前記液体クロマトグラフィーシステムによって、前記オリゴヌクレオチドプローブの分解産物から前記オリゴヌクレオチドプローブを分離し；前記液体クロマトグラフィーシステムの分離された画分から蛍光シグナルを測定することを含んで成り、ここで、前記オリゴヌクレオチドプローブの分解産物に対応する画分からの蛍光シグナルの検出は、前記グリセロールサンプルがＰＣＲアッセイを実施するためへの使用のために適していないことを示し、そして前記オリゴヌクレオチドプローブの分解産物に対応する画分からの蛍光シグナルの不在は、前記グリセロールサンプルがＰＣＲアッセイを実施するための使用のために適することを示す。

本発明の方法に従って適用される分離工程は、超高性能溶液クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）システム又はカラムを使用して、特に実施される。

本発明の実施形態及び利点は、本発明の特定の記載及び図面に、より詳細に記載される。

図１Ａは、実施例１に記載される条件下でＵＰＬＣカラムを通しての通過の後、異なったグリセロールサンプルを、それぞれ含む、１３種のテキスト混合物からのＦＡＭ−標識されたオリゴヌクレオチドプローブからの蛍光ピークを示す。図１Ｂは、実施例１に記載される条件下でＵＰＬＣカラムを通しての通過の後、異なったグリセロールサンプルを、それぞれ含む、１３種のテキスト混合物からのＦＡＭ−標識されたオリゴヌクレオチドプローブからの蛍光ピークを示す。図２は、「良好」なグリセロールサンプルに混合されたオリゴヌクレオチドプローブ１（バーＡ−Ｆ）、「不良」なグリセロールサンプルに混合されたオリゴヌクレオチドプローブ１（バーＧ）、及び「不良」なグリセロールサンプルに混合されたオリゴヌクレオチドプローブ２及び３（バーＨ及びＩ）を用いて、０．３〜０．８分・面積で観察される蛍光の棒グラフを示す。

定義：
特にことわらない限り、本明細書において使用される全ての技術的及び科学的用語は、当業者により通常理解される意味を有する。次の参考文献は、本発明で使用される用語の多くの一般的定義を、当業者に提供する：Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991);及びHale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。本明細書において使用される場合、次の用語は、特にことわらない限り、それらに与えられた意味を有する。

用語「核酸（nucleic acid）」とは、直鎖状又は分岐鎖状の様式で一緒に共有結合されるヌクレオチドを含む、ヌクレオチドのポリマー（例えば、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、等）を言及し、そしてデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、アプタマー、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ＰＮＡ−ＤＮＡ接合体、ＰＮＡ−ＲＮＡ接合体、等を包含する。核酸は典型的には、一本鎖又は二本鎖であり、そして一般的には、ホスホジエステル結合を含むが、但しある場合、別の主鎖、例えばホスホルアミド（Beaucage et al. (1993), Tetrahedron 49(10):1925）、ホスホロチオエート（Mag et al. (1991), Nucleic Acids Res. 19:1437; 及び米国特許第５，６４４，０４８号）、ホスホロジチオエート（Briu et al. (1989), J. Am. Chem. Soc. 111:2321）、Ｏ−メチルホスホルアミダイト結合（Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press (1992)を参照のこと）、及びペプチド核酸主鎖及び結合（Egholm (1992), J. Am. Chem. Soc. 114:1895を参照のこと）を有することができる核酸類似体が包含される。他の類似体核酸は、正に荷電された主鎖（Denpcy et al. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6097）；非イオン性主鎖（米国特許第５，３８６，０２３号、第５，６３７，６８４号、第５，６０２，２４０号、第５，２１６，１４１号及び第４，４６９，８６３号）及び非リボース主鎖を有するそれら、例えば米国特許第５，２３５，０３３号及び第５，０３４，５０６号に記載されたそれらを包含する。１又は２以上の炭素環式糖を含む核酸もまた、核酸の定義内に包含され（Jenkins et al. (1995), Chem. Soc. Rev. pp. 169-176を参照のこと）、そして類似体はまた、例えばRawls, C & E News Jun. 2, 1997, 35頁に記載されている。リボース−リン酸主鎖の修飾は、追加の部分、例えば標識の付加を促進するか、又は生理学的環境下でそのような安定性及び半減期を変えるために行われ得る。

核酸に、典型的には見出される天然に存在する複素環式塩基（例えば、アデニン、グアニン、チミン、シストシン、及びウラシル）の他に、ヌクレオチド類似体はまた、天然に存在しない複素環式塩基、例えば、Seela et al. (1999), Helv. Chim. Acta 82:1640に記載されるそれらも包含することができる。ヌクレオチド類似体に使用される特定の塩基は、融点（Ｔｍ）モディファイアとして作用する。例えば、それらのいくつかは、７−デアザプリン（例えば、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、等）、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、プロピニル−ｄＮ（例えば、プロピニル−ｄＵ、プロピニル−ｄＣ、等）、及び同等のものを包含する。例えば、米国特許第５，９９０，３０３号を参照のこと。他の代表的な複素環式塩基は、例えば次のものを包含する：ヒポキサンチン、イノシン、キサンチン; ２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、ヒポキサンチン、イノシン及びキサンチンの８−アザ誘導体；アデニン、グアニン、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、ヒポキサンチン、イノシン及びキサンチンの７−デアザ−８−アザ誘導体；６−アザシチジン; ５−フルオロシチジン；５−クロロシチジン; ５−ヨードシチジン; ５−ブロモシチジン; ５−メチルシチジン；５−プロピニルシチジン; ５−ブロモビニルウラシル; ５−フルオロウラシル;５−クロロウラシル; ５−ヨードウラシル；５−ブロモウラシル；５−トリフルオロメチルウラシル; ５−メトキシウラシル; ５−エチニルウラシル; ５−プロピニルウラシル、及び同等のもの。

「ヌクレオシド（nucleoside）」とは、糖部分（リボース糖又はデオキシリボース糖）、糖部分の誘導体、又は糖部分の機能的同等物（例えば、炭素環）に対して共有結合される塩基又は塩基性基（少なくとも１つの炭素環、少なくとも１つの複素環、少なくとも１つのアリール基、及び／又は同様のものを包含する）を含む核酸成分を意味する。例えば、ヌクレオシドが糖部分を含む場合、塩基は典型的には、糖部分の１′−位置に結合される。上記のように、塩基は、天然に存在する塩基又は天然に存在しない塩基であり得る。典型的にヌクレオシドは、リボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシド、ジデオキシリボヌクレオシド及び炭素環ヌクレオシドを包含する。

「ヌクレオチド（nucleotide）」とは、ヌクレオシドのエステル、例えばヌクレオシドの糖部分の５′位置に共有結合される、１，２，３又はそれ以上のリン酸基を有するヌクレオシドのリン酸エステルを言及する。

用語「ポリヌクレオチド（polynucleotide）」及び「オリゴヌクレオチド（oligonucleotide）」は、交換可能的に使用される。「オリゴヌクレオチド」は、より短いポリヌクレオチドを記載するために時々使用される用語である。オリゴヌクレオチドは、指定されたヌクレオチド配列の領域に対応する、少なくとも６個のヌクレオチド、例えば少なくとも約１０〜１２個のヌクレオチド、又は少なくとも約１５〜３０個のヌクレオチドを含んでも良い。

用語「増幅反応（amplification reaction）」とは、核酸の標的配列のコピーを増すための任意のインビトロ手段を意味する。

「増幅する（amplifying）」とは、増幅を可能にするのに十分な条件に溶液を提供する工程を意味する。増幅反応の成分は、例えばプライマー、ポリヌクレオチド鋳型、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、ｄＮＴＰ及び同様のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない。用語「増幅する」とは典型的には、標的核酸の「指数的（exponential）」上昇を意味する。しかしながら、「増幅する」とは、本明細書において使用される場合、核酸の選択標的配列の数の直線的上昇を意味するが、しかし１回の単一プライマー伸張工程とは異なる。

「ポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction）」又は「ＰＣＲ」とは、標的二本鎖ＤＮＡの特定セグメント又は下位配列が幾何学的成長下で増殖される方法を意味する。ＰＣＲは、当業者に良く知られており；例えば、米国特許第４，６８３，１９５号及び第４，６８３，２０２号；及びPCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al., eds, 1990を参照のこと。

用語「オリゴヌクレオチドプローブ（oligonucleotide probe）」とは、本明細書において使用される場合、目的の標的核酸にハイブリダイズできるか又はアニーリングできるポリヌクレオチド配列を意味し、そして標的核酸の特異的検出を可能にする。

用語「マスターミックス（mastermix）」又は「マスターミックス溶液（master mix solution）」とは、用語「試薬溶液（reagent solution）」と交換可能的に使用され、そしてＰＣＲの発生のために必要なすべての又はほとんどの成分又は要因の混合物を意味し、そしていくつかの場合、鋳型、及びサンプル及びアンプリコン特異的であるプライマーのすべては除かれる。市販のマスターミックスは通常、濃縮された溶液である。マスターミックスは複数のサンプルに共通するすべての試薬を含むことができる。しかしそれはまた、１つのサンプルのみのために構成されても良い。マスターミックスの使用は、ピペットされる体積間の差異のために、サンプル間でのピペッティング誤差及び変動の低減を助ける。

用語「約（about）」とは、以下のように時間又は温度のおおよその範囲のことである。従って、「約１６時間」とは、一定範囲の時間、例えば１２時間〜２０時間のことであり、そして「約６５℃」とは、一定範囲の温度、例えば６０℃〜７０℃のことであり得る。

「核酸ポリメラーゼ（nucleic acid polymerase）」とは、核酸中へのヌクレオチドの組込みを触媒する酵素を意味する。典型的な核酸ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、末端トランスフェラーゼ、逆転写酵素、テロメラーゼ及び同様のものを包含する。

「熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（thermostable DNA polymerase）」とは、選択された時間、高温に供される場合、安定し（すなわち、分解又は変性に対して耐性である）、そして十分な触媒活性を保持するＤＮＡポリメラーゼのことである。例えば、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、二本鎖核酸を変性するのに必要な時間、高温に供される場合、続くプライマー伸張反応をもたらすのに十分な活性を保持する。核酸変性のために必要な加熱条件は、当業界において良く知られており、そして米国特許第４，６８３，２０２号及び第４，６８３，１９５号に例示されている。本明細書において使用される場合、熱安定性ポリメラーゼは、典型的には、温度サイクリング反応、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）への使用のために適切である。熱安定性核酸ポリメラーゼの例は、サーマス・アクアティクス（Thermus aquaticus）ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、サーマスsp.Ｚ０５ポリメラーゼ、サーマス・フラバス（Thermus flavus）ポリメラーゼ、サーモトガ・マリチマ（Thermotoga maritima）ポリメラーゼ、例えばＴＭＡ−２５及びＴＭＡ−３０ポリメラーゼ、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、及び同様のものを包含する。

「修飾された（modified）」ポリメラーゼとは、少なくとも１つのモノマーが、参照配列とは異なるポリメラーゼ、例えば生来又は野生形のポリメラーゼ又は別の修飾された形のポリメラーゼを意味する。典型的な修飾は、モノマーの挿入、欠失及び置換を包含する。修飾されたポリメラーゼはまた、複数の親由来の識別可能な構成要素配列（例えば、構造的又は機能的ドメイン、等）を有するキメラポリメラーゼも包含する。参照配列の化学的修飾を含むそれらのポリメラーゼもまた、修飾されたポリメラーゼの定義内に包含される。修飾されたポリメラーゼの例は、G46E E678G CS5 ＤＮＡポリメラーゼ、G46E L329A E678G CS5 ＤＮＡポリメラーゼ、G46E L329A D640G S671F CS5 ＤＮＡポリメラーゼ、G46E L329A D640G S671F E678G CS5 ＤＮＡポリメラーゼ、G46E E678G CS6 ＤＮＡポリメラーゼ、Z05 ＤＮＡポリメラーゼ、ΔZ05 ポリメラーゼ、ΔZ05-ゴールドポリメラーゼ、 ΔZ05Rポリメラーゼ、E615G Taq ＤＮＡポリメラーゼ、E678G TMA-25 ポリメラーゼ、E678G TMA-30 ポリメラーゼ、及び同様のものを包含する。

用語「５′→３′ヌクレアーゼ活性」又は「５′−３′ヌクレアーゼ活性」とは、典型的には、ヌクレオチド核酸鎖の５′末端から除去される、核酸鎖合成に関連する核酸ポリメラーゼの活性を意味し、例えばＥ．コリＤＮＡポリメラーＩはこの活性を有するが、クレノウ（Klenow）フラグメントは有さない。５′→３′ヌクレアーゼ活性を有するいくつかの酵素は、５′→３′エキソヌクレアーゼである。そのような５′→３′エキソヌクレアーゼの例は、次のものを包含する：B.サブチリス（B. subtilis）からのエキソヌクレアーゼ、脾臓からのホスホジエステラーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、酵母由来のエキソヌクレアーゼII、酵母由来のエキソヌクレアーゼV、及びニュウロスポラ・クラサ（Neurospora crassa）からのエキソヌクレアーゼ。

５′→３′ヌクレアーゼ活性を利用しての標的核酸の検出は、米国特許第５，２１０，０１５号; 第５，４８７，９７２号; 及び第５，８０４，３７５号；及びHolland et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7276-7280に記載されるように、「ＴａｑＭａｎ（登録商標）」又は「５′−ヌクレアーゼアッセイ」により実施され得る。ＴａｑＭａｎ（登録商標）においては、増幅された領域内でハイブリダイズする、標識された検出プローブは、増幅反応の間、存在する。プローブは、プローブがＤＮＡ合成のためのプライマーとして作用することを妨げるために修飾される。増幅は、５′→３′エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いて実施される。増幅の各合成工程の間、伸張されるプライマーから下流の標的核酸にハイブリダイズする任意のプローブが、ＤＮＡポリメラーゼの５′→３′エキソヌクレアーゼ活性により分解される。従って、新規の標的鎖の合成はまた、プローブの分解をもたらし、そして分解性生物の蓄積は、標的配列の合成の指標を提供する。

分解産物の検出のために適切な何れかの方法が、５′ヌクレアーゼアッセイに使用され得る。しばしば、検出プローブは、２種の蛍光色素により標識され、それらの色素の１つは、他の色素の蛍光を消光することができる。色素は、典型的には、５′末端に結合されるレポーター又は検出体色素、及び内部部位に結合される消光色素と共に、プローブに結合され、結果的に、消光は、プローブがハイブリダイズされていない状態にある場合に発生し、そしてＤＮＡポリメラーゼの５′→３′エキソヌクレアーゼ活性によるプローブの切断は、前記２種の色素の間で生じる。増幅は、消光の同時排除及び最初に消光された色素から観察できる蛍光の上昇を伴って、色素間のプローブの切断をもたらす。分解産物の蓄積は、反応蛍光の上昇を測定することによりモニターされる。米国特許第５，４９１，０６３号及び第５，５７１，６７３号は、増幅と同時に生じるプローブの分解を検出するための別の方法を記載している。

蛍光色素は、負に荷電される色素、例えばフルオレセインファミリーの色素、又は中性電荷である色素、例えばロータミンファミリーの色素、又は正に荷電される色素、例えばシアニンファミリーの色素を包含する。フルオレセインファミリーの色素は、例えば６−カルボキシ−フルオレセイン（ＦＡＭ）、２′、４、４′、５′、７、７′−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＮＡＮ及びＺＯＥを包含する。ローダミンファミリーの色素は、例えばテキサス・レッド、ＲＯＸ、Ｒ１１０、Ｒ６Ｇ及びＴＡＭＲＡ又はローダミン誘導体ＪＡ２７０を包含する（米国特許第６，１８４，３７９号を参照のこと）。ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＮＡＮ、ＺＯＥ、ＲＯＸ、Ｒ１１０、Ｒ６Ｇ及びＴＡＭＲＡは、例えばPerkin-Elmer, Inc. (Wellesley, MA, USA)から市販されており、そしてテキサス−レッドは、例えばMolecular Probes, Inc. (Eugene, OR)から市販されている。シアニンファミリーの色素は、例えばＣｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５及びＣｙ７を包含し、そして例えばAmersham Biosciences Corp. (Piscataway, NJ, USA)から市販されている。

標的核酸の検出のための５′ヌクレアーゼアッセイは、５′→３′エキソヌクレアーゼ活性を有する任意のポリメラーゼを使用することができる。従って、いくつかの実施形態によれば、５′−ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼは、熱安定性及び熱活性核酸ポリメラーゼである。そのような熱安定性ポリメラーゼは、真正細菌族サーマス（Thermus）、サマートガ（Thermatoga）及びサーモシフォ（Thermosipho）の種々の種からのポリメラーゼの生来及び組換え形、及びそれらのキメラ型を包含するが、但し、それらだけには限定されない。例えば、本発明の方法に使用され得るサーマス種ポリメラーゼは、サーマス・アクアティクス（Thermus aquaticus）（Taq）ＤＮＡポリメラーゼ、サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）（Tth）ＤＮＡポリメラーゼ、サーマス種Z05（Z05）ＤＮＡポリメラーゼ、サーマス種sps17 (sps17)及びサーマス種Z05を包含する（米国特許第５，４０５，７７４号; 第５，３５２，６００号; 第５，０７９，３５２号; 第４，８８９，８１８号; 第５，４６６，５９１号; 第５，６１８，７１１号; 第５，６７４，７３８号；及び第５，７９５，７６２号に記載される）。本発明の方法に使用され得るサーマトガ（Thermatoga）ポリメラーゼは、例えばサーモトガ・マリチマ（Thermatoga maritima）ＤＮＡポリメラーゼ及びサーモトガ・ネアポリタナ（Thermatoga neapolitana）ＤＮＡポリメラーゼを包含し、そして使用されるサーモシフォ（Thermosipho）ポリメラーゼの例は、サーモシフォ・アフリカナス（thermosipho africanus）ＤＮＡポリメラーゼである。サーマトガ・マリチマ及びサーモシフォ・アフリカナスＤＮＡポリメラーゼの配列は、国際公開第９２／０６２００号に公開されている。サーマトガ・ネアポリタナの配列は、国際公開第９７／０９４５１号に見出され得る。

５′ヌクレアーゼアッセイにおいては、増幅検出は典型的には、増幅と同時である（すなわち、「リアルタイム (real-time)」）。いくつかの実施形態によれば、増幅検出は定量的であり、そして増幅検出はリアルタイムである。いくつかの実施形態によれば、増幅検出は定性的である（例えば、標的核酸の存在又は不在の終点検出）。いくつかの実施形態によれば、増幅検出は、増幅の後である。いくつかの実施形態によれば、増幅検出は定性的であり、そして増幅検出は増幅の後である。

次の実施例及び図は、本発明の理解を助けるために提供されており、真の範囲は添付の特許請求の範囲に記載されている。

液体クロマトグラフィー
液体クロマトグラフィーにおいては、サンプルは、適切な粒子（固定相）を含むカラム又はカートリッジ装置を通過する。それらの粒子は、クロマトグラフィー充填材料と呼ばれる。溶媒（移動相）が、その装置を通して流れる。固相抽出（ＳＰＥ）においては、サンプルはカートリッジ上に負荷され、そして溶媒流が装置を通してサンプルを運ぶ。次に、サンプル中の異なった化合物が、装置を通して異なった個々の速度で移動することにより分離される。

カートリッジ形式が利用される場合、流れを達成するためのいくつかの手段が存在する。重力又は真空が、圧力に耐えるように設計されていないカラムのために使用され得る。典型的には、この場合の粒子は、流れに対する抵抗が低いよう、５０ミクロン以上の大きさの直径である。さらに、典型的には、注射筒の形状をした小さなプラスチックカラムが、充填材料粒子により満たされ、そしてサンプル調製の実施のために使用される。これは、固相抽出（ＳＰＥ）と呼ばれる。従って、カートリッジと呼ばれるクロマトグラフィー装置は通常、サンプルがさらに分析される前、非常に複雑なサンプルをクリーンアップするために、真空補助の流れで使用される。

より小さな粒子サイズ（１０ミクロン以下）が、分離力を改善するために必要とされる。しかしながら、より小さな粒子は流れに対して高い抵抗を有し、結果的に、高い圧力が、所望する溶媒流速を創造するのに必要とされる。中位〜高い圧力がクロマトグラフィーカラムを通して溶媒を流すために使用される場合、この技法は、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）と呼ばれる。

ＨＰＬＣは当初、高圧が液体クロマトグラフィーのために必要とされる流れを生成するために使用された事実を示唆した。初めに、ポンプは５００psi（３５バール）の圧力能力を単に有した。これは、高圧液体クロマトグラフィー又はＨＰＬＣと呼ばれた。新規ＨＰＬＣ装置は、６，０００psi（４００バール）の圧力まで高めることができ、そして改良された噴射器、検出器及びカラムを組込むことができた。性能の継続的な進歩は、より小さな粒子及びさらに高い圧力を用いることによりもたらされた。

高性能液体クロマトグラフィーは、現在、分析化学において、最も強力なツールの１つである。それは、液体に溶解され得る任意のサンプルに存在する化合物を分離し、同定し、そして定量化する能力を有する。最近、パート・パー・トリオン（ｐｐｔ）ほどの低い微量濃度の化合物が容易に同定され得る。ＨＰＬＣは、ほぼ何れかのサンプル、例えば医薬品、食品、栄養補助食品、化粧品、環境マトリックス、法医学的サンプル及び光学薬品に適用され得、そしてそれらに適用されて来た。

計装及びカラム技法のさらなる進歩が、液体クロマトグラフィーにおける分解能、速度、及び感度の非常に有意な増強を達成するためになされた。より小さな粒子（１．７ミクロン）、及び１５，０００psi（１，０００バール）で移動相を送達するよう設計さらた特殊能力を備えた計測器を備えたカラムが、新規レベルの性能を達成するために必要とされた。

実施例１：超高性能液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）条件
ＵＰＬＣを、フォトダイオードアレイ（ＰＤＡ）検出器及び蛍光検出器を備えた、Waters Acquity（登録商標）ＵＰＬＣ装置（Empower２ソフトウェアを用いる）を用いて実施した。使用されるカラムは、１．７μMの粒子サイズ、２．１×５０ｍｍの内径を有するAcquity OST C18カラムであった。ビルトインカラムヒーターを、６０℃の温度で設定した。移動相は、緩衝液Ａのための１００ｍＭのトリエチルアンモニウムアセテート（ＴＥＡＡ）（ｐＨ７．０）及び緩衝液Ｂのための１００％アセトニトリルから成る。ＰＤＡ検出器は、２５４ｎｍで、毎秒２０点の吸光度に設定された。蛍光検出器は、４９５ｎｍで励起波長及び５１０ｎｍで発光波長を有する６−カルボキシ−フルオレセイン（ＦＡＭ）についてのシグナルを読み取るために設定された。試験される各反応混合物のために、１０μｌがカラム中に注入され、そしてカラムを実行するために使用されるグラジエントが表１上に示される。

実施例２：１３種の異なったグリセロールサンプルの試験
１３種の異なったロットのグリセロールサンプル（サンプル番号１〜１３）を、次の条件を用いて試験した。８０％グリセロールサンプル２５０μｌを、２５０μｌの１００ｍＭのトリシン（ｐＨ８，３）緩衝液と共に混合した。その混合物を、十分な混合物のために激しく渦動した。次に、ＦＡＭ−標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（プローブ番号１）を、１μＭの最終濃度で混合物に添加した。その混合物を、６５℃で１６時間インキュベートし、そして１０μｌを、実施例１に記載される条件を用いて、ＵＰＬＣカラム中に注入した。図１は、蛍光により測定される場合、１３種の試験されるロットのグリセロールサンプルについての溶出プロフィールを示す。１．００分の画分で溶出する蛍光ピークは、損なわれていないＦＡＭ標識されたプローブを表す。０．３０分マークと０．８０分との間に出現するグリセロールサンプル１２及び１３に見出される、より小さな蛍光シグナルは、分解されたオリゴヌクレオチドプローブを表す。それらの分解産物の存在は、グリセロールサンプル１２及び１３が、ＰＣＲアッセイのためのマスターミックスへの使用のために適切でないことを示唆する。

実施例３：異なったプローブを用いての「良好」及び「不良」グリセロールサンプルの試験
実施例２に記載される実験に使用される、ＦＡＭ−標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（プローブ番号１）を用いて、７種の異なったグリセロールサンプルを試験し、そして試験混合物Ａ〜Ｇを生成した。試験混合物Ｇは、「不良」グリセロールサンプル（実施例２におけるサンプル２）を含んだ。さらに、「不良」グリセロールサンプル（サンプル１２）を、２種の異なったＦＡＭ標識されたオリゴヌクレオチドプローブ、すなわちプローブ番号２、プローブ番号３と共に混合し、それぞれ試験混合物Ｈ及びＩを生成した。すべての試験混合物を、実施例２に記載されるようにしてインキュベートし、実施例１に記載されるようにＵＰＬＣにより分析した。０．３分と０．８分との間の蛍光ピーク値を統合し、そして計算された蛍光ピーク領域を、図２上に示される棒グラフ上にバーとして転換した。予想通り、試験混合物Ｇ、Ｈ及びＩにおいて試験された「不良」グリセロールサンプル（サンプル１２）のみが、オリゴヌクレオチドプローブの分解産物の存在を示唆するピーク値を示した。

Claims

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイを実施するためのマスターミックス溶液内における使用のために適したグリセロールサンプルのスクリーニング方法であって、
前記グリセロールサンプルを提供し；
前記マスターミックス溶液を提供し；
前記グリセロールサンプルと前記マスターミックス溶液とを混合して、試験混合物を生じさせ；
蛍光色素で標識されるオリゴヌクレオチドプローブを前記試験混合物に提供し；
前記試験混合物を、６０℃〜７０℃で１２時間〜２０時間インキュベートし；
前記試験混合物を、液体クロマトグラフィーシステムに添加し、ここで前記システムは蛍光検出器に連結されており；
前記液体クロマトグラフィーシステムによって、前記オリゴヌクレオチドプローブの分解産物から前記オリゴヌクレオチドプローブを分離し；
前記液体クロマトグラフィーシステムの分離された画分から蛍光シグナルを測定すること
を含んで成り、
ここで、前記オリゴヌクレオチドプローブの分解産物に対応する画分からの蛍光シグナルの検出は、前記グリセロールサンプルがＰＣＲアッセイを実施するための使用のために適していないことを示し、そして
前記オリゴヌクレオチドプローブの分解産物に対応する画分からの蛍光シグナルの不在は、前記グリセロールサンプルがＰＣＲアッセイを実施するための使用のために適することを示す、前記方法。
前記分離工程が、超高性能液体クロマトグラフィーシステムを使用して実施される、請求項１に記載の方法。