CN102399867A - 核酸定量方法和用于核酸扩增反应的微芯片 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种核酸定量方法和用于核酸扩增反应的微芯片，其中，一种核酸定量方法，使用用于核酸扩增反应的微芯片，该微芯片包括：入口，液体经该入口从外部被引入；多个反应区域，被设为核酸扩增反应的反应场所；以及，流路，从该入口引入的液体经由该流路被供应至多个反应区域中的每一个反应区域，其中，发生核酸扩增反应的可能性在各反应区域之间是不同的，该方法包括：使含有检测对象核酸链的溶液流经该流路，并且将该溶液引入该多个反应区域中的每一个反应区域以执行核酸扩增反应；以及，检测该多个反应区域中的每一个反应区域中的扩增产物，以确定其中发生了核酸扩增反应的反应区域。

Description

核酸定量方法和用于核酸扩增反应的微芯片
技术领域
本发明涉及核酸定量方法以及用于核酸扩增反应的微芯片。具体地，本发明涉及用于方便地测量样本中所包含的检测对象核酸链的近似量的核酸定量方法。
背景技术
诸如PCR(聚合酶链反应)的核酸扩增方法已经被用在许多应用中，包括传染和遗传性疾病的诊断、基因表达水平分析和克隆。基于用于测量的荧光染料或荧光染料标记的荧光探针的增加的荧光强度来实时测量检测对象核酸链的扩增量的实时核酸扩增方法也已经用于检测对象核酸链的原始量的定量。
Digital PCR，Proc.Natl.Acad.Sci.1999，Vol.96，p.9236-9241提出了被称为“数字PCR”的技术，用于准确地定量痕量的核酸链。在数字PCR中，包含检测对象核酸链的样本受到反应溶液的有限稀释，并且被分配到多个反应场所(井)供PCR反应。然后，使用(例如)荧光探针来对呈现有来自扩增产物的荧光的井(well，孔)数量进行计数。因为可以假定借助于每个井至多包含检测对象核酸链中的仅一个分子(一个副本)的有限稀释，所以包含在样本中的检测对象核酸链的副本数量可以基于呈现有荧光的井的数量来定量。
JP-A-2001-269196提出了一种基于数字PCR的核酸定量方法，该方法使用包括数百至数百万流路(反应场所)的平板，每个流路包含有样本中所包含的检测对象核酸链的一个副本。通过此方法，可以准确地定量检测对象核酸链的副本数量，这是因为该方法不涉及荧光井的数量和检测对象核酸链的副本数量之间的不匹配，其中，这种不匹配在一个流路包含检测对象核酸链的多于一个副本时出现。
发明内容
如上所述，数字PCR能够准确地定量样本中的检测对象核酸链的副本数量。考虑到核酸扩增方法旨在定量核酸链的量，需求测量样本中病原体基因组的近似量，尤其是在传染病的诊断方面，以检查病原体水平并且确定传染病或疾病的严重程度或发展阶段。在不是为了准确地测量mRNA副本数量而是为了简单地检查mRNA的表达水平的基因表达水平分析中期望使用这种半定量测量方法。
相应地，需要一种能够简单地测量样本中包含的检测对象核酸链的近似量的技术。
本发明的实施方式针对使用用于核酸扩增反应的微芯片的核酸定量方法，该微芯片包括：入口，液体经该入口从外部被引入；多个反应区域，被设为核酸扩增反应的反应场所；以及，流路，从该入口引入的液体经由该流路被供应至该多个反应区域中的每一个反应区域，其中，发生核酸扩增反应的可能性在各反应区域之间是不同的，该方法包括：使含有检测对象核酸链的溶液流经该流路，并且将该溶液引入该多个反应区域中的每一个反应区域以执行核酸扩增反应；以及，检测该多个反应区域中的每一个反应区域中的扩增产物，以确定其中发生了核酸扩增反应的反应区域。
核酸定量方法能够基于在确定的反应区域中的核酸扩增反应的可能性来测量溶液中的检测对象核酸链的近似量。具体地，当确定的反应区域是核酸扩增反应不太可能发生的反应区域时，核酸定量方法可以确定溶液包含较大量的检测对象核酸链。
在核酸定量方法中，用于核酸扩增反应的微芯片的反应区域可具有不同的内部容积或者可以以不同的量预先存储至少部分必要反应物质，以使各反应区域内发生核酸扩增反应的可能性不同。在该反应区域中预先存储的必要反应物质是寡核苷酸引物和/或酶。
本发明的另一实施方式针对一种用于核酸扩增反应的微芯片，该微芯片包括：入口，液体经该入口从外部被引入；多个反应区域，被设为核酸扩增反应的反应场所；以及，流路，从该入口引入的液体经由该流路被供应至该多个反应区域中的每一个反应区域，其中，发生核酸扩增反应的可能性在各反应区域之间是不同的。
用于核酸扩增反应的微芯片可被构造成使得反应区域具有不同的内部容积或者以不同的量预先存储至少部分必要反应物质，以使各反应区域内发生核酸扩增反应的可能性不同。
在用于核酸扩增反应的微芯片中，流路可以连接反应区域，使得被引入到多个反应区域中的一个反应区域的液体通过溢出流路而被依次引入到相邻反应区域。
在本文所使用的“核酸扩增反应”包括PCR反应和各种等温扩增反应，PCR反应涉及包括热变性、退火和延伸反应(extension reaction)三个步骤的温度循环，而各种等温扩增反应不涉及温度循环。等温扩增反应的例子包括LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification(环介导等温扩增))、SMAP(Smart Amplification Process(智能扩增处理))、NASBA(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification(基于核酸序列的扩增))、
Figure BDA0000090489520000031
(Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleicacids(等温及嵌合引物发起的核酸扩增))、TRC(transcription-reversetranscription concerted(转录逆转录协同))法，SDA(strand displacementamplification(链置换扩增))、TMA(transcription-mediated amplification(转录介导扩增))和RCA(rolling circle amplification(滚环扩增))。“核酸扩增反应”还包括涉及或不涉及温度改变并且旨在核酸扩增的宽范围的核酸扩增反应。
由本发明的实施方式提供的技术使得容易测量包含在样本中的检测对象核酸链的近似量。
附图说明
图1是说明根据本发明的第一实施方式的用于核酸扩增反应的微芯片A的结构的俯视图。
图2是说明微芯片A的结构的截面示意图。
图3是说明根据本发明的第二实施方式的用于核酸扩增反应的微芯片B的结构的俯视图。
图4A至图4C是说明在微芯片B的井中存在需要的核酸扩增反应物质的示意图。
图5是说明根据本发明的第三实施方式的用于核酸扩增反应的微芯片C的结构的俯视图。
图6是表示流感病毒基因组定量结果的曲线图。
具体实施方式
以下将参考附图描述本发明的优选实施方式。应当注意，下面的实施方式仅是本发明的示例说明，而不应解释为限制本发明的范围。将以如下顺序给出描述。
1.根据本发明的第一实施方式的核酸定量方法和用于核酸扩增反应的微芯片
(1)用于核酸扩增反应的微芯片
(2)核酸定量方法
2.根据本发明的第二实施方式的核酸定量方法和用于核酸扩增反应的微芯片
(1)用于核酸扩增反应的微芯片
(2)核酸定量方法
3.根据本发明的第三实施方式的核酸定量方法和用于核酸扩增反应的微芯片
(1)用于核酸扩增反应的微芯片
(2)核酸定量方法
1.根据本发明的第一实施方式的核酸定量方法和用于核酸扩增反应的微芯片
(1)用于核酸扩增反应的微芯片
图1和图2是说明根据本发明的第一实施方式的用于核酸扩增反应的微芯片(在下文中，也简称为“微芯片”)的结构的示意图。图1是俯视图；图2是在图1的P-P线截取的截面示意图。
微芯片A包括：通过其将液体(样本溶液)从外部引入的入口1、一端与入口1连通的主流路2、从主流路2分支出来的分支流路3以及作为核酸扩增反应的反应场所的多个井41～49(反应区域)。主流路2的另一端与出口5连通，样本溶液经该出口流出到外面。在从与入口1连通的部分到与出口5连通的部分的主流路2的整个距离，分支流路3从主流路2分支出来并且连接至井。注意，在微芯片A中，出口5不是基本元件，微芯片A可以被构造成不使经由入口1引入的样本溶液流出。
经由入口1输送到主流路2的样本溶液流过分支流路3，并且被依次引入进多个井(从邻近入口1的井41(液体流动方向的上游)到邻近出口5的井49(液体流动方向的下游))中。样本溶液包含检测对象核酸链，其可以是(例如)DNA、染色体RNA或mRNA。样本溶液还可以包含核酸扩增反应必要试剂，包括寡核苷酸引物(在下文中，还简称为“引物”)、酶、核酸单体(dNTP)和反应缓冲液(缓冲液)溶质。
井41～49在液体流动方向上从上游侧的井41到下游设置的井49在内部容积上逐渐变小，使得引入井的样本溶液的量从入口1朝着出口5逐渐变小。井41～49被形成为使得它们的内部容积沿着液体流动的方向以(例如)大约0.9～0.01的系数逐渐变小，系数优选地是0.5～0.1。
每个井中的核酸扩增反应的可能性(反应效率)取决于引入到井中的检测对象核酸链的量。引入到每个井中的检测对象核酸链的量取决于引入到井中的样本溶液的量，具体地是取决于井的内部容积。因此，随着逐渐地减少在液体流动方向上从上游侧的井41到下游设置的井49的各个井的内部容积，每个井中的核酸扩增反应变得越来越不可能发生。
微芯片A被构造为基板层a1和基板层a2的叠层。在基板层a1中形成入口1、主流路2、分支流路3、井41～49和出口5。基板层a1和a2可以由诸如玻璃和各种塑料(聚丙烯、聚碳酸酯、环烯烃聚合物、聚二甲基硅氧烷)的材料形成。对于井中的扩增产物的光检测，基板层a1和a2可以优选地由显示弱的自荧光性并具有较小的波长散射以及较小的光学误差的透光材料制成。入口1和其它元件可以在基板层a2中形成，或者可以在基板层a1和基板层a2两者中分开形成。进一步地，多于一个基板层可以用于形成微芯片。
(2)核酸定量方法
使用微芯片A的根据本发明的第一实施方式的核酸定量方法描述如下。
首先，样本溶液经由入口1输送进主流路2，并被引入到井41～49以根据通常的方法执行核酸扩增反应，诸如PCR反应和LAMP反应。例如，在PCR中，执行包括热变性、退火和延伸反应三个步骤的预定的温度循环以进行核酸扩增反应。例如，在LAMP中，以被维持的预定的反应温度来进行核酸扩增反应。
如上所述，微芯片A被构造为包括在液体流动方向上从上游侧的井41朝下游设置的井49在内部容积上逐渐变小的井，使得每个井中的核酸扩增反应以此顺序变得越来越不可能发生。因此，根据此方法，核酸扩增反应随着样本溶液中包含的检测对象核酸链的量的增加，沿着液体流动的方向向下游的井进一步继续进行。另一方面，该反应在包含在样本溶液中的检测对象核酸链的量很小时，沿着液体流动的方向的上游井之后不再进一步继续进行。
然后，对每个井中的扩增产物进行检测以确定其中发生了核酸扩增反应的井。使用荧光染料或荧光染料标记的荧光探针，通过检测响应于形成扩增产物而发出荧光的荧光染料的荧光来检测扩增产物。通过自动地测量来自每个井的荧光染料的荧光信号，通过使用图像处理系统分析获得的微芯片A的荧光图像，可确定涉及核酸扩增反应的井。还可以通过检查每个井的荧光的存在或不存在，或者通过视觉地检查图像或通过使用(例如)荧光显微镜观察微芯片A，来确定涉及核酸扩增反应的井。
最后，基于特定井中的核酸扩增反应的可能性来测量样本溶液中包含的检测对象核酸链的量。在微芯片A中，核酸扩增反应随着样本溶液中包含的检测对象核酸链的量的增加，沿着液体流动的方向向下游的井进一步继续进行。因此，通过确定其中发生了核酸扩增反应的井，可以确定样本溶液中所包含的检测对象核酸链的量。具体地，当已经在井41和42中发生了核酸扩增反应时，样本溶液可以被确定为包含比仅在井41中发生反应时更大量的检测对象核酸链。基于相同的理由，当已经在沿着液体流动的方向在井41之后的井中进一步发生了核酸扩增反应时，样本溶液可以被确定为包含更大量的检测对象核酸链。
当使用包含已知量的检测对象核酸链的溶液来预先获取检测对象核酸链的量和涉及核酸扩增反应的井(或井的容积)之间的关系时，可以更加准确地测量样本溶液中包含的检测对象核酸链的量。
如上所述，根据本实施方式的核酸定量方法可以通过确定涉及微芯片执行的核酸扩增反应的井来测量样本溶液中包含的检测对象核酸链的近似量，在微芯片中核酸扩增反应的可能性会改变。
通过在微芯片中均匀间隔地设置总共9个井(3行×3列)的情况描述了本实施方式。但是，可以在任何布局中设置任意数量的井，并且井的形状不限于图中所示的圆柱形。此外，将经由入口1引入的样本溶液供应到每个井的流路结构不限于如图所示的主流路2和分支流路3的结构。
此外，即使已经通过改变井的区域来减小(或增大)内部容积的情况描述了本实施方式，还可以通过改变深度来减小井的内部容积。此外，不同内部容积的井的顺序不限于沿着液体流动的方向从上游到下游逐渐地变成更小的容积。
2.根据本发明的第二实施方式的核酸定量方法和用于核酸扩增反应的微芯片
(1)用于核酸扩增反应的微芯片
图3是说明根据本发明的第二实施方式的用于核酸扩增反应的微芯片(在下文中，也简称为“微芯片”)的结构的俯视图。
微芯片B包括：通过其将样本溶液从外部引入的入口1、一端与入口1连接的主流路2，从主流路2分支出来的分支流路3，以及作为核酸扩增反应的反应场所的多个井41～49。主流路2的另一端与出口5连通，样本溶液经该出口流出到外面。在从与入口1连通的部分到与出口5连通的部分的主流路2的整个距离，分支流路3从主流路2分支出来并且连接至井。注意，在微芯片B中，出口5不是基本元件，微芯片B可以被构造成不使经由入口1引入的样本溶液流出。
经由入口1输送到主流路2的样本溶液流过分支流路3，并且被依次引入进多个井(从邻近入口1的井41(液体流动方向的上游)到邻近出口5的井49(液体流动方向的下游))中。样本溶液包含检测对象核酸链，其可以是(例如)DNA、染色体RNA或mRNA。
在井41～49中，以不同的量预先存储了至少部分核酸扩增反应必须的物质。在井中预先存储的物质是在核酸扩增反应中获得扩增产物必要的那些物质，具体地，例如，引物、酶、核酸单体和反应缓冲液溶质。这些物质中的一个或多个可以存储在井中，而其余物质经由入口1随着样本溶液一起被引入到井中。
图4A～图4C表示在井中存储不同量的引物和酶的实例。在井41～49中，在液体流动方向上从上游侧的井41到下游设置的井49，引物P和酶E的量逐渐变小。在图中，通过逐渐地减小井41、42和43中的引物P和酶E层的厚度来改变引物P和酶E的量。
以这样一种方式在井41～49中存储引物P和酶E，即，沿着液体流动的方向以(例如)大约0.9～0.01的系数，优选地是0.5～0.1的系数，来逐渐地减小引物和酶的量。
每个井中的核酸扩增反应的可能性(反应效率)取决于存储在井中的必要反应物质的量。因此，随着在液体流动方向上从上游侧的井41到下游设置的井49的引物P和酶E的量逐渐地减少，每个井中的核酸扩增反应变得越来越不可能发生。
(2)核酸定量方法
使用微芯片B的根据本发明的第二实施方式的核酸定量方法描述如下。
首先，样本溶液经由入口1输送进主流路2，并被引入到井41～49。结果，预先存储在井中的必要反应物质(这里，引物P和酶E)与样本溶液中所包含的其余物质和检测对象核酸链相混合。在引入样本溶液之后，根据通常方法来执行诸如PCR反应和LAMP反应的核酸扩增反应。例如，在PCR中，执行包括热变性、退火和延伸反应三个步骤的预定温度循环以进行核酸扩增反应。在LAMP中，例如，在被维持的预定反应温度进行核酸扩增反应。
如上所述，微芯片B被构造为包括在液体流动方向上从上游侧的井41朝下游设置的井49包含逐渐变小的量的必要反应物质的井，使得每个井中的核酸扩增反应以此顺序变得越来越不可能发生。因此，根据此方法，核酸扩增反应随着样本溶液中包含的检测对象核酸链的量的增加，沿着液体流动的方向向下游的井进一步继续进行。另一方面，该反应在包含在样本溶液中的检测对象核酸链的量很小时，在沿着液体流动的方向的上游井之后不再进一步继续进行。
然后，对每个井中的扩增产物进行检测以确定其中发生了核酸扩增反应的井。使用荧光染料或荧光染料标记的荧光探针，通过检测响应于形成扩增产物而发出荧光的荧光染料的荧光来检测扩增产物。通过自动地测量来自每个井的荧光染料的荧光信号，通过使用图像处理系统分析获得的微芯片B的荧光图像，可确定涉及核酸扩增反应的井。还可以通过检查每个井的荧光的存在或不存在，或者通过视觉地检查图像或通过使用(例如)荧光显微镜观察微芯片B，来确定涉及核酸扩增反应的井。
最后，基于特定井中的核酸扩增反应的可能性来测量样本溶液中包含的检测对象核酸链的量。在微芯片B中，核酸扩增反应随着样本溶液中包含的检测对象核酸链的量的增加，沿着液体流动的方向向下游的井进一步继续进行。因此，通过确定其中发生了核酸扩增反应的井，可以确定样本溶液中所包含的检测对象核酸链的量。具体地，当已经在井41和42中发生了核酸扩增反应时，样本溶液可以被确定为包含比仅在井41中发生反应时更大量的检测对象核酸链。基于相同的理由，当已经在沿着液体流动的方向在井41之后的井中进一步发生了核酸扩增反应时，样本溶液可以被确定为包含更大量的检测对象核酸链。
当使用包含已知量的检测对象核酸链的溶液来预先获取检测对象核酸链的量和涉及核酸扩增反应的井(或井的容积)之间的关系时，可以更加准确地测量样本溶液中包含的检测对象核酸链的量。
如上所述，根据本实施方式的核酸定量方法可以通过确定涉及微芯片执行的核酸扩增反应的井来测量样本溶液中包含的检测对象核酸链的近似量，在微芯片中核酸扩增反应的可能性会改变。
在本实施方式中，可以在任何布局中设置任意数量的井，并且井的形状不限于如前述第一实施方式中的图中所示的圆柱形。此外，包含不同量的必要反应物质的井的顺序可以不限于沿着液体流动的方向从上游到下游逐渐减小量。
进一步地，将经由入口1引入的样本溶液供应到每个井的流路的结构不限于如图所示的主流路2和分支流路3的结构。例如，如图5所示，可以使用没有分支流路的结构。在图5所示的微芯片C中，井41～49被设置成经由主流路2彼此连通，使得经由主流路2引入到一个井中的样本溶液通过溢出主流路2而被依次引入相邻的井。经由入口1输送到主流路2的样本溶液首先存储在邻近入口1的井41中，又从井41溢出到邻近的井42。以相同的方式，样本溶液溢出井42，并且被依次引入到液体流动方向中的下游的井。
与微芯片A一样，微芯片B可以被构造为两个基板层的叠层。可以在模制了入口1、主流路2、分支流路3、井41～49和出口5之后并且在粘合基板层之前，通过在井中滴下并且干燥诸如引物溶液和酶溶液的反应物来将核酸扩增反应必要物质存储在井中。
通过对玻璃基板层进行湿蚀刻或干蚀刻，或通过对塑料基板层进行纳米压印、注塑成型或切割，可以执行入口1和其它元件的模制。
优选地，通过(例如)空气干燥、真空干燥或冷冻干燥来逐渐地干燥诸如引物溶液和酶溶液的试剂。当存储在井中的物质是酶时，优选的是，滴下的酶溶液通过临界点干燥进行干燥，以防止酶活性被降低或被去激活。荧光染料或荧光染料标记的荧光探针也被存储在井中以检测扩增产物。这里，诸如引物溶液和酶溶液的试剂被滴下和干燥的顺序不受特别限制，并且引物和酶不要求一定要存储进如图4A至图4C的层中。
通过借助于(例如)氧等离子体处理或真空紫外线处理的激活基板层表面的方法可以粘合基板层。根据基板层的材料，在适当设定条件的情况下，可以执行氧等离子体处理和真空紫外线处理。
3.根据本发明的第三实施方式的核酸定量方法和用于核酸扩增反应的微芯片
(1)用于核酸扩增反应的微芯片
根据本发明的第三实施方式的用于核酸扩增反应的微芯片(在下文中，也简称为“微芯片”)描述如下。根据本实施方式的用于核酸扩增反应的微芯片的结构除了存储在微芯片中的物质之外与根据第二实施方式的微芯片B的结构实质上相同。因此，将参考图3来给出描述。
参考该图，根据本实施方式的微芯片除了井41～49中的至少一个井用作校正井之外实质上与根据第二实施方式的微芯片相同。因此，下述描述主要针对校正井。具体地，例如，将井49作为校正井来描述。如本文中所使用的，校正井是其中预先存储了已知浓度的核酸链的井。
校正井除了存储与其它井41～48中一样的酶E和引物P之外还存储了用于校正的已知浓度的核酸链。注意，校正核酸链可以具有与样本溶液中包含的检测对象核酸链完全相同或部分相同的序列。例如，当检测对象核酸链和校正核酸链具有相同序列时，RNA和DNA分别用作检测对象核酸链和校正核酸链。这里，井41～48存储逆转录酶和DNA聚合酶，并且校正井存储DNA聚合酶。另一方面，当检测对象核酸链和校正核酸链具有部分相同的序列时，对应于这些序列的不同的引物被存储在校正井和井41～48中。
(2)核酸定量方法
根据本发明的第三实施方式的核酸定量方法描述如下。根据第三实施方式的核酸定量方法除了井41～49中的井49被用作校正井之外与根据第二实施方式的核酸定量方法实质上相同。相应地，下述描述主要针对校正井的使用。
具体地，随着经由入口1输送的样本溶液被依次引入进液体流动方向上从上游侧的井41到下游设置的井49的井中，核酸扩增反应依次进行。在校正井中，用已知浓度的校正核酸链来进行核酸扩增反应。然后，使用荧光染料或荧光染料标记的荧光探针，通过检测响应于形成扩增产物而发出荧光的荧光染料的荧光来检测扩增产物。
存在引入到井41～49中的样本溶液包含诸如杂质和反应抑制剂的组分的可能性。这些杂质和反应抑制剂影响反应效率并且引起测量变化。但是，在根据本实施方式的微芯片中，提供存储了已知浓度的校正核酸链的校正井使得能够校正这种改变，并且可以从(例如)荧光强度来找出扩增产物的浓度。
如上所述，根据本实施方式的核酸定量方法使用一个或多个微芯片的井作为校正井，因此使得能够被掌握包含在检测对象核酸链的样本溶液中的诸如杂质和反应抑制剂的组分的影响。更具体地，源自样本的诸如杂质和反应抑制剂的组分可以影响反应效率，并且即使在包含相同量的检测对象核酸链的样本中仍可以改变荧光强度。可以用根据本实施方式的核酸定量方法来校正这种改变。
校正井被描述为是这些井中一个井，如井49。但是，可以使用多于一个的井作为校正井。例如，不同浓度的多个井可以用作校正井，并且当检测对象核酸链和校正核酸链具有相同序列时，可从基于测量的校正井的荧光强度而制作的标准曲线来测量样本溶液中所包含的检测对象核酸链的量。
被描述为本实施方式的微芯片B的井中一个井的校正井可以是根据本发明的第一实施方式的微芯片A的一个或多个井。
示例
使用通常的RT-PCR方法和根据本发明的实施方式的方法，根据如下步骤来定量核酸。
从可能感染了流行性感冒的病人获取的鼻腔擦拭液(17个样本)被悬浮在缓冲液(130μL)中。然后，悬浮液的一半量与可买到的流感病毒提取试剂(Eiken Chemical Co.；Cat.No.LMP801)混合。然后，使用可买到的引物集(Eiken Chemical Co.；Cat.No.PM0021)和RT-RAMP仪器(Eiken Chemical Co.；Cat.No.LMP244)，针对混合物中的流感基因组执行RAMP反应。使用实时RT-RAMP装置(4号染色体，Bio-Rad)和微芯片(9个井)来执行该反应。在从RAMP反应开始的30分钟内显示出增加的荧光强度的井被确定为流感基因组阳性。
分别地，使用可买到的RNA提取仪器(QIAGEN；Cat.No.52904)从鼻腔擦拭液的悬浮液的一半量的中提纯流感基因组，并且根据WHO推荐的实验方案(WHO information for laboratory diagnosis of pandemic(H1N1)2009 virus in human-revised，23 November 2009)来执行RT-PCR分析。
结果在图6中示出。垂直轴表示在从RAMP反应开始的30分钟内显示出增加的荧光强度的阳性的井的数量。水平轴表示RT-PCR分析中检测循环的数量。该结果示出了RT-PCR检测循环的数量与阳性的井的数量之间的关系，并且说明可以从阳性的井的数量来定量样本中的流感基因组。
根据本发明的实施方式的核酸定量方法可以方便地测量包含在样本中的检测对象核酸链的近似量。因此根据本发明的实施方式的核酸定量方法可被用于样本中病原体基因组的近似量测量以确定病原体等级，因此对于感染的严重程度和发展阶段的简单诊断特别地有用。
本发明包含涉及分别于2010年9月16日和2010年11月25日向日本专利局提交的日本优先权专利申请JP2010-207853和JP2010-261934中公开的主题，其全部内容结合于此作为参考。
本领域技术人员应当理解，根据设计需要和其它因素，可以出现各种修改、组合、子组合和替换，因为它们在随附的权利要求及其等效物的范围之中。

Claims (8)

1.一种核酸定量方法，使用用于核酸扩增反应的微芯片，所述微芯片包括：入口，液体经所述入口从外部被引入；多个反应区域，被设为所述核酸扩增反应的反应场所；以及流路，从所述入口引入的所述液体经由所述流路被供应至所述多个反应区域中的每一个反应区域，其中，发生核酸扩增反应的可能性在各反应区域之间是不同的，
所述方法包括：
使含有检测对象核酸链的溶液流经所述流路，并且将所述溶液引入所述多个反应区域中的每一个反应区域以执行核酸扩增反应；以及
检测所述多个反应区域中的每一个反应区域中的扩增产物，以确定其中发生了所述核酸扩增反应的反应区域。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述微芯片的所述反应区域具有不同的内部容积，以使各反应区域内发生核酸扩增反应的可能性不同。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述微芯片的所述反应区域中以不同的量预先存储至少部分必要反应物质，以使各反应区域内发生核酸扩增反应的可能性不同。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，在所述反应区域中预先存储的所述必要反应物质是寡核苷酸引物和/或酶。
5.一种用于核酸扩增反应的微芯片，
所述微芯片包括：
入口，液体经所述入口从外部被引入；
多个反应区域，被设为所述核酸扩增反应的反应场所；以及
流路，从所述入口引入的所述液体经由所述流路被供应至所述多个反应区域中的每一个反应区域，
其中，发生核酸扩增反应的可能性在各反应区域之间是不同的。
6.根据权利要求5所述的微芯片，其中，所述反应区域具有不同的内部容积，以使各反应区域内发生核酸扩增反应的可能性不同。
7.根据权利要求5所述的微芯片，其中，所述反应区域以不同量预先存储至少部分必要反应物质，以使各反应区域内发生核酸扩增反应的可能性不同。
8.根据权利要求5至7中任意一项所述的微芯片，其中，所述流路连接所述反应区域，使得被引入到所述多个反应区域中的一个反应区域的所述液体通过溢出所述流路而被依次引入到相邻反应区域。
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