JP2016049064A

JP2016049064A - マイクロチップを用いたｐｃｒ装置

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Publication number: JP2016049064A
Application number: JP2014176766A
Authority: JP
Inventors: 原　雄介; Yusuke Hara; 雄介原; 佳則山口; Yoshinori Yamaguchi
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 2014-09-01
Filing date: 2014-09-01
Publication date: 2016-04-11

Abstract

【課題】マイクロチップ内のＰＣＲ溶液の温度を、複数の温度に、短時間で、かつ容易に変更することができ、しかも小型化が可能なマイクロチップを用いたＰＣＲ装置を提供する。【解決手段】温度の異なる複数の熱源を利用するＰＣＲマイクロデバイス装置において、マイクロ流路内に内包された溶液を固定された熱源の上で前進と後退を繰り返すことにより、或いはマイクロ流路の位置を固定したまま熱源を移動させることにより、ＰＣＲを単純な機構のマイクロチップで行うことを可能とする。【選択図】図１

Description

本発明は、マイクロチップを用いたポリメラーゼ連鎖反応（以下、「ＰＣＲ」ということもある）装置に関し、特に、マイクロ流路内に内包された反応溶液を固定された熱源の上で行き来させることにより、或いはマイクロチップの位置を固定したまま熱源を移動させることでＰＣＲを効率的に起こすことができる装置に関する。

ポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction, ＰＣＲ）と呼ばれる手法は、ＤＮＡのある一部分だけを選択的に増幅可能な技術で、インフルエンザ、ＨＩＶ、クラミジア、結核、白血病等の検査を行う際には強力な手段となる。ＰＣＲを行うためには、増幅させたい特異な部分の遺伝子配列を持ったプライマー、増幅作用の触媒として機能するＤＮＡポリメラーゼ等が必要となる。すでにプライマーの受注生産や、高機能なＤＮＡポリメラーゼが試薬として販売され、またＰＣＲを行う際に必要な温度コントロールを簡便な操作で行うことできる装置が発売されている状況で、誰でも簡単にＰＣＲを行うことができる状況にある。

ＰＣＲは様々な生化学的な分析に応用可能なことから、病院内で手軽にＰＣＲとその後の分析を行うことが可能なマイクロチップの開発が望まれている。近年、ベットサイド診断と言われる、その場での迅速な診断が求められており、簡便・迅速・正確に分析が可能な小型装置およびマイクロチップの開発が切望される状況にある。

ＰＣＲ法はテンプレートＤＮＡの標的とするＤＮＡ中の特異的な標的とするＤＮＡ配列について、単一のテンプレート一組のＤＮＡから数百万コピーのＤＮＡ断片を原理的には生成することができる。ＰＣＲは、サーマルサイクルと呼ばれる三相の温度条件を繰り返すことにより、ＤＮＡの螺旋をほぐし二重螺旋構造から、一本鎖ＤＮＡの変性(反応温度約９４℃)、変性されたＤＮＡ一本鎖とプライマーのアニーリング（反応温度約５５〜６０℃）、および熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素によるプライマーの伸長（反応温度約７２℃）という個々の反応を順次繰り返す必要がある。原理上、ＰＣＲ１回のサイクルで、コピー数を倍にすることが可能で、ＰＣＲの熱サイクルをｎ回繰り返すことによって、２ｎ倍に特異的配列の増幅が可能である。ＰＣＲによる病原菌等の定性分析には最低でも熱サイクルが１０〜１５回程度必要で、約１０，０００倍程度まで増幅して測定する必要がある。近年においては、酵素や試薬の向上により、二相の温度条件を繰り返すのみで、三相の温度条件と同等に増幅させることが可能な技術も開発されている。

Koppら（非特許文献１）は、マイクロチップ内部で効率的にＰＣＲを行うため、マイクロチップ内部に蛇行流路を作製する方法を提案している。マイクロチップ内部の蛇行流路が９５℃（変性）、７２℃（伸長）、および６０℃（アニーリング）の３つの一定温度帯を通過するシステムで、Koppらは実際に蛇行流路を内包したマイクロチップを実際に作製しており、ヒーターの上にマイクロチップを置くだけでＰＣＲが可能なことを実証している。さらにKoppらの技術を用いて、酵素および試薬条件を変更することで、二相の温度条件においても蛇行流路内でPCRを起こすことが可能なことも確認されている。

しかしながらKoppらのシステムでは、チップ内部の蛇行流路内を反応溶液が一定の速度で前進する必要性があり、流速の制御が非常に難しいのが欠点として指摘されている。また、確実にＰＣＲを行うためには３０ターンから４０ターンの蛇行流路に溶液を流す必要性があるため、チップの作製が煩雑で高コストであるとともに、チップが長くなってしまう欠点があった。さらに３０〜４０ターンの蛇行流路内部を、ＰＣＲに必須の酵素を含有した反応溶液を流していくと、酵素が蛇行流路表面に吸着し、反応がうまく進行しなくなるといった致命的な欠陥を抱えていた。このような欠陥は三相および二相の温度条件で行った時にも共通であり、そのため、より簡便なチップ構造で実現できるマイクロチップで行うＰＣＲ機構の開発が切望される状況にあった。

このような状況を鑑み、特許文献１では、ＰＣＲ反応溶液を内部に貯めておけるマイクロチップを、固定された熱源の上で動かくすことによって、マイクロチップの構造を簡略化させることに成功している。また、リアルタイムＰＣＲにも対応するような装置構造も提案しており、チップ構造の簡略化を図っている。リアルタイムＰＣＲは増幅反応を経時変化を追えることがメリットとされているが、非特異的な二本鎖ＤＮＡも検出されるため、定量性について事前に確認する作業が多く、採取したサンプルをチップ内のみの処理で分析を行うベットサイド診断に適用するには問題が多い方法として知られている。特許文献１のように、ポンプ接続ができないマイクロチップ可動型のシステムを採用すると、ＰＣＲ後にポンプによる液体の輸送が必須であるゲル電気泳動法を用いることができない。ゲル電気泳動法は非特異的な二本鎖ＤＮＡの分離が可能であり、マイクロチップ内部で安価で簡便に行えるためベットサイド診断には非常に有効な手段であるが、特許文献１のようなシステムのようにマイクロチップを動かす方法ではポンプ接続ができないためゲル電気泳動を行うことが難しいことが問題視されていた。そのため、ポンプが接続可能で、マイクロチップの構造が簡略化可能な新たな方法論が切望される状況にあった。

さらに、これまでもＰＣＲを可能とするマイクロチップシステムは開発されてきたが、マイクロチップ内部でＰＣＲを行うためには複雑な機構が必要であるため、システム全体をいくら小さくしても大きなアタッシュケース１つ分ぐらいの大きさはあった（非特許文献２）。マイクロチップの分析装置が大きくなってしまう原因として、マイクロチップ内部の溶液をコントロールするためのポンプの大きさや、ポンプとマイクロチップとの接続を行うためのシステムが複雑であることが挙げられる。また、マイクロチップとポンプを接続する際には、生化学分析においては致命傷となるコンタミネーションが起こる可能性が大きくなり、その根本的な解決方法が切望される状況にあった。

Kopp et al., Science 280：1046−1048（1998）朝生川稔、荻原久、三品喜典、飯村靖男、応用物理第８１巻、第２号

特表２０１３−５２４８０８号公報

前述のとおり、マイクロチップ内部で行うＰＣＲはマイクロチップ内部に蛇行流路を作製する必要があり、煩雑で高いコストをかける必要性があった。また、蛇行流路を必ずしも作製しない場合においても、マイクロチップの温度条件を瞬時に変化させるための温度可変型の高性能熱源の必要性があるが、９５℃から６０℃の温度差を一気に変化させることは難しいのが現状であった。

本発明は、こうした現状を鑑みてなされたものであり、マイクロチップを用いたＰＣＲ装置において、マイクロチップ内のＰＣＲ溶液の温度を、複数の温度に、短時間で、かつ容易に変更することができ、しかも小型化が可能なマイクロチップを用いたＰＣＲ装置を提供することを目的とするものである。

本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、熱源を固定してマイクロチップ内部の流路に存在するＰＣＲ溶液を、温度の異なる複数の固定された熱源の上で、前進と後退を繰り返すことでマイクロチップ内部のＰＣＲ溶液温度を効率的に変化させてＰＣＲを行うことができることを見いだした。常識的には、非特許文献１のように流体を一方向に前進させて反応を起こすことを前提して流路が設計されているため、蛇行流路は長くなる。本発明によれば、ポンプによって流体を前進または後進させることにより、異なった温度に設定された熱源の上を前進と後退を繰り返すことにより、マイクロチップ内部の流路を大幅に簡便にすることができ、且つ大幅に短くすることができる。

また、本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、マイクロチップ内部でＰＣＲを行うためには流体に異なった複数の温度を順次かける必要性があるが、非特許文献１のようにこれまでは固定されることが常識的であった熱源を動かしてマイクロチップの温度を変化させることで、簡便なマイクロチップ構造であっても効率的なＰＣＲを行うことが可能であることを見出した。

一方、本発明者らは、先に、マイクロチップ内部にポンプ構造の一部であるゴム膜を設置し、直動式のアクチュエータを上下または止めることで、マイクロチップ内部のＰＣＲ溶液を前進および後退、またはストップさせることが可能な装置について提案しているが（特願２０１３−０５２７７０号）、該装置の構成を、本発明の装置と組み合わせることで、効率的なＰＣＲを行うことが可能である。マイクロチップ内部の溶液の進む方向は、マイクロチップ内の流路に設置された空気穴の位置によって簡便に制御可能である。

また本発明を用いれば、ＰＣＲ終了後には、特許文献１のデバイス装置では接続が難しいポンプを用いて、非特異的な二本鎖ＤＮＡを簡便に分離できる定量性が高いゲル電気泳動を続けて行うことも可能である。

本発明はこれらの知見に基づいて完成に至ったものであり、本発明によれば、以下の発明が提供される。
［１］マイクロチップと、該マイクロチップに接触するように配置された温度の異なる複数の固定された熱源を備え、ポンプを用いて、前記複数の熱源の上で、前記マイクロチップ内のＰＣＲ溶液の前進及び後退を繰り返すことによってＰＣＲ溶液の温度を変化させるようにしたことを特徴とするＰＣＲ装置。
［２］マイクロチップと、温度の異なる複数の可動式熱源を備え、前記マイクロチップ内のＰＣＲ溶液を停止させた状態で、前記可動式の熱源を、交互に前記マイクロチップと接触させることによってＰＣＲ溶液の温度を変化させるようにしたことを特徴とするＰＣＲ装置。
［３］［１］又は［２］に記載されたＰＣＲ装置において、
マイクロチップ内部に設置されたゴム膜、前記ゴム膜を押圧可能な直動式アクチュエータ、前記ゴム膜に接触する液溜まり、該液溜まりに連通する１つ又複数の流路を備え、前記流路のＰＣＲ溶液の到達点に空気孔を空けることにより逆止弁を不要としたことを特徴とするＰＣＲ装置。

本発明の第１の発明によれば、マイクロチップに接触させた状態で異なる温度の複数の熱源を固定し、マイクロデバイス内部の流体を前進および後退させることによって、流体の温度を変化させＰＣＲを行うマイクロデバイス装置を提供できる。また、本発明の第２の発明によれば、マイクロチップを固定した状態で、異なる温度の複数の熱源を交互にマイクロチップに接触させることにより、ＰＣＲ溶液の温度を変化させ、ＰＣＲを行うことができるマイクロデバイス装置を提供できる。さらに、本発明の第３の発明によれば、第１、２の発明の装置に加えて、マイクロチップの内部にゴム膜を設置して、直動式のアクチュエータを動かすことで流体の動きを前進と後退、または直動式アクチューエータを止めることで流体の動きを停止させることができる。

固定された温度の異なる３つの熱源を有する、本発明の第１の発明に係る装置を模式的に示す図。固定された温度の異なる２つの熱源を有する、本発明の第１の発明に係る装置を模式的に示す図。可動式の温度の異なる３つの熱源を有する、本発明の第２の発明に係る装置を模式的に示す図。可動式の温度の異なる２つの熱源を有する、本発明の第２の発明に係る装置を模式的に示す図。本発明の第２の発明における、可動式熱源の一例を模式的に示す図。本発明の第２の発明における、可動式熱源の他の一例を模式的に示す図。本発明の第３の発明に係る装置を模式的に示す断面図。直動式ポンプ上部の液だまりと空気穴を１つ空けたマイクロ流路の図。直動式ポンプ上部の液だまりと空気穴を２つ空けたマイクロ流路の図。実施例１に用いた装置を模式的に示す図。実施例１におけるＰＣＲ産物のキャピラリー電気泳動の結果を示す図。実施例２に用いた装置を模式的に示す図。実施例２におけるＰＣＲ産物のキャピラリー電気泳動の結果を示す図。

以下、図面を用いて、本発明について説明する。
図１，２は、本発明の第１の発明に係る装置を模式的に示す図であり、図１は、固定された温度の異なる３つ熱源を用いた場合を示し、図２は、固定された温度の異なる２つ熱源を用いた場合を示している。
図１および図２に示すように、本発明の第１の発明に係る装置は、固定したマイクロチップに接触する２つまたは３つの熱源に対して、ＰＣＲ溶液がポンプによって前進と後退を交互に繰り返すことによりＰＣＲ溶液の温度を順次変化させ、効率的にＰＣＲを行うことを可能とした装置である。このようなマイクロデバイス装置を採用すると、これまで非特許文献１で知られているような蛇行流路によるマイクロチップに比べて、通常３０〜５０ターン必要な蛇行流路が１ターンのみで済むようになるため、劇的にマイクロチップの構造が単純化され、またマイクロチップの製造単価が低くなるとともに、マイクロチップの長さを大幅に短くすることができる。

図３、４、５は、本発明の第２の発明に係る装置を模式的に示す図であり、図３は、可動式の温度の異なる３つ熱源を用いた場合を示し、図４は、可動式の温度の異なる２つ熱源を用いた場合を示している。また、図５は、該可動式熱源の例を模式的に示す図であり、（ａ）は、マイクロチップに対して水平方向に移動可能な熱源の一例を模式的に示す図であり、（ｂ）は、マイクロチップに対して垂直方向に移動可能な熱源の一例を模式的に示す図である。
図３、４、５（ａ）、５（ｂ）に示すように、本発明の第２の発明に係る装置は、固定されたマイクロチップに、可動式の２つもしくは３つの熱源を交互に接触させることにより、マイクロチップ内部のＰＣＲ溶液の温度を瞬時に変化させ、効率的にＰＣＲを行うことを可能とした装置である。このようなデバイス装置を用いると、非特許文献１で知られるような複雑な蛇行流路をマイクロチップ上に形成する必要がなく、マイクロチップの構造を劇的に簡略化することでマイクロチップ製造コストを大きく低下させることができる。

非特許文献１のような蛇行流路を用いた場合には、酵素等のＰＣＲ溶液中の物質が流路の壁面に吸着してしまい、ＰＣＲが効率的に起こることが阻害されていた。上記のような方法によってマイクロチップの構造を簡略化させることで、ＰＣＲ溶液が壁面と接触する面積が非常に小さくなるため、ＰＣＲ溶液中の物質が流路の壁面に吸着することを避けることができるため、効率の良いＰＣＲを行うことが可能である。

上記のようにマイクロチップ内部の溶液をポンプによって前進と後退を繰り返すことによってＰＣＲを行う場合、一般的なシリンジポンプによって流体の制御を行うことができる。また、上記のようにマイクロチップに可動式の熱源を交互に接触させる場合においても、ポンプによってマイクロチップ内部の所定の場所にＰＣＲ溶液を運び、ＰＣＲの終了後にはその先にあるマイクロチップ内部の分析セクションにＰＣＲ産物をポンプによって運び、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動などの分析を行うことが可能である。

図６、７（ａ）、７（ｂ）は、本発明の第３の発明に係る装置を模式的に示す図であり、図６は、断面図である。図中、６−１は、空気穴、６−２は、マイクロ流路、６−３は、マイクロチップに設置されたゴム膜、６−４は、流路へ導入するＰＣＲ溶液をためるための液溜り、６−５は、直動式アクチュエータ、をそれぞれ示している。
図７は、直動式ポンプ上部の液だまりと複数のマイクロ流路とを設けた例を示す平面図であり、（ａ）は、空気穴を１つ空けた例、（ｂ）は、空気穴を２つ空けた例、をそれぞれ示している。
本発明の第３の発明に係る装置は、ポンプとして、図６に示すような流体を押すことが可能な直動式アクチュエータを用いて、マイクロチップ内部に設置されたゴム膜を押すことで、液体を輸送するマイクロチップを備えた装置であって、密閉された液溜まりと、該液溜まりに隣接するポンプ機構と、液溜まりに連通する流路とを備え、該流路の液体の到達点に設けられた空気孔の１つのみを空けることにより逆止弁を不要としたことを特徴とし、直動式アクチュエータを上下に動かすことで前進後退を制御可能で、また直動式アクチュエータを停止させることで流体を停止させることが可能なことを特徴とする装置である。そして、該装置を用いて、図７（ａ）のように液溜まりから多数の流路が伸びている構造を作成したときには、空気穴を空ける部分を決めるだけで、流体が進む方向を、逆止弁を設定せずに決定できる。また、図７（ｂ）のようにたとえ空気孔が空いている流路が２つあったとしても、流体の進む方向は穴の開いた２つの流路へ流れる。
したがって、本発明の第３の発明に係る装置によれば、上記記載のマイクロチップ内部で溶液を前進と後退を繰り返すことによって行うＰＣＲや、固定したマイクロチップに稼働式の熱源を交互に接触させることによってＰＣＲを行うために反応溶液を停止させておくことが可能であるとともに、さらに直動式のポンプによってＰＣＲ産物をマイクロチップ内部に設計された次の分析セクションに運び、分析を行うことが可能である。

上記の直動式アクチュエータは、電磁モーターやピエゾアクチュエータ、ステッピングモーターや導電性アクチュエータ、電場応答型ゴムアクチュエータ、電場応答型ゲルアクチュエータ、光応答型ゲルアクチュエータ、磁場応答型ゲルアクチュエータ、化学反応を直接的に力学的なエネルギーに変換可能な自励振動ゲルアクチュエータ（特にｐＨ振動反応やＢＺ反応をエネルギー源として駆動する自励振動ゲルアクチュエータ）、ｐＨ応答型ゲルアクチュエータ、熱応答型ゲルアクチュエータ、電場応答型ゲルアクチュエータ、イオン応答型ゲルアクチュエータなど、アクチュエータの稼働部分を上下に動かすことができ、また止めることができれば種類を問わない。

また、上記のＰＣＲ用マイクロデバイス装置は、マイクロチップ内部にゴム膜を有し直動式アクチュエータで押すだけで流体を進行させることが可能であるため、ポンプとマイクロチップの接続が必要なく、生化学分析においては問題視されるコンタミネーションの問題を完全に回避できる特徴を有している。また、マイクロチップ内部に空気穴を設置するだけで、マイクロチップ内部の液体の進行方向を制御可能であることから、マイクロチップを作製する煩雑さが少なく、また簡便な構造であるため低コスト化を図ることが可能である。

さらに、上記のようなゴム膜を設置したマイクロチップ内部のＰＣＲ溶液を直動式アクチュエータによって溶液の動きを制御する方法に置いては、通常必要な逆止弁を必要とせず、チップ製造が大きく簡略化できる特徴も有している。

直動式のアクチュエータによるポンプ機構を採用する場合、特許文献１のようにマイクロチップを装置内部で動かすことはできない。また、一般的なシリンジポンプを用いる場合には、接続の煩雑さや接続時のコンタミネーションの問題があり、またポンプとマイクロチップを接続したチューブが、特許文献１のようにマイクロチップを動かしてしまうと外れやすい状況に陥るといった問題が生じる。また、たとえチューブが外れにくい状況を作り出したとしても、その構造は煩雑なものとなりチップ構造を複雑化するとともに製造コストや開発コストを大きくするものになり、さらには、コンタミネーションの問題に関しては未解決のままとなる。ポンプ機構とマイクロチップを接続した状況においては、ＰＣＲ後にゲル電気泳動やキャピラリー電気泳動、その他多数の分析方法を連結することが可能で、ベットサイド診断用の小型マイクロチップの作製においてはポンプ接続は必須の条件となることが多い。

本発明である複数の熱源を用いた効率的なＰＣＲによって生産されたＰＣＲ産物について、例えば、直動式アクチュエータ等のポンプ機構によって行うクロマトグラフィー、具体的には、順相・逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、キラルクロマトグラフィーなどの全体のサイズが数cm以内のプラスチックなどの基板での自己完結型の分離分析が可能となる。このようなＰＣＲを行った後にポンプが必要な分析事項は非特許文献１のようにポンプの接続を想定していないデバイス装置では実現することが不可能であり、本発明の進歩性、新規性がこのようなところにあるといえる。

マイクロ流路を形成する材質としては樹脂、金属、セラミック、ガラス、ヒューズドシリカ、シリコーンなどが例示できる。樹脂としては例えば、アクリル樹脂、ポリエステル樹脂、スチレン樹脂、エポキシ樹脂、ジエン系樹脂などが挙げられる。ガラスとしては例えば、ソーダガラス、石英ガラス、クリスタルガラスなど一般的なものが使用できる。

本発明におけるマイクロ流路の形成方法は、特に制限されず、公知の方法により製造すればよい。また、本発明は、その用途に応じで複数を組み合わせてもよく、また、反応、混合、分離、精製、分析、洗浄等の機能を有する装置や、回収装置、マイクロ流体デバイス等を組み合わせてもよい。

本発明において直動式ポンプ以外の通常のポンプも使用可能であることはいうまでもなく、例えばシリンジポンプ、ピストンポンプ、プランジャーポンプ、ダイヤフラムポンプ、ウイングポンプ、ギヤーポンプ、偏心ポンプ、ネジポンプ、スクリューポンプ、スネークポンプ、渦巻ポンプ、タービンポンプ、軸流ポンプ、斜流ポンプ、カスケードポンプ、噴射ポンプ、気泡ポンプ、無動力ポンプ、ハイドリックラムでもよい。

本発明においてＰＣＲ後の増幅されたＤＮＡをチップ内部で分析する手段としては特に限定しておらず、アガロースやアクリルアミド等のゲルを用いたゲル電気泳動法、ポリマー溶液やゲルを用いたキャピラリー電気泳動法、ハイブリダイゼーション法、ダイプライマー法、ダイターミネーター法などを用いてもよい。

本発明において、PCRを用いる場合の試薬（酵素、プライマー、バッファー溶液等）に特に制限はなく、また本発明は、原理的には温度を瞬時に可変させ、その後、ポンプによる圧力差を利用した分析技術に応用できるものであるため、今後新たに開発されるPCR用試薬（酵素、プライマー、バッファー溶液等）においても適応可能である。

以下、本発明について、実施例を用いて説明するが、本発明の一例について述べるものであり、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。

[実施例１：固定された熱源の上に設置されたマイクロチップ内部でＰＣＲ溶液を前進および後退させることによって行うＰＣＲ]
図８は、本実施例に用いた装置の概要を示す図であり、図中、（Ａ）は、ＰＣＲマイクロチップ、（Ｂ）は、ＰＣＲマイクロチップ内部のマイクロチャンネル（直動式のアクチュエータによるゴム膜の押引により、ＰＣＲ溶液がマイクロチャネル内部を前方および後方に移動することができるマイクロチャンネル）、（Ｃ）は、直動式アクチュエータによって押し引きされるゴム膜とゴム膜の上部に設置された液溜まり（内径５ｍｍ、深さ１．７ｍｍ）、（Ｄ）は、熱源（１：９５℃）、（Ｅ）は、熱源（２：６０℃）、（Ｆ）は、熱源を固定したステージ、（Ｇ）は、ＰＣＲマイクロチップを熱源ステージ（Ｆ）上に設置した状態、をそれぞれ示している。
該装置において、マイクロチャンネル内部の溶液は、直動式アクチュエータによってゴム膜（Ｃ）が押引され、熱源の上を目的の回数だけ前進と後退を繰り返し移動する。そのため、装置の小型化とマイクロチップ構造の単純化が可能であるばかりでなく、酵素等のＰＣＲ溶液中に含まれるサンプルの吸着を抑えることもできる。

図８に示すＰＣＲマイクロチップの液溜まり部分（C）に、下記の表１に記載のＰＣＲ溶液を封入し、（Ｃ）の下部から直動式アクチュエータを用いてゴム膜を押す、或いは引くことによって、マイクロチャンネル内部のＰＣＲ溶液を、熱源（Ｄ）（９５℃）及び熱源（Ｅ）（６０℃）を設置したステージ上に固定し、目的の回数だけ、熱源（Ｄ）及び熱源（Ｅ）の部分を往復させた。その際、熱源（Ｄ）及び熱源（Ｅ）にそれぞれ５秒、１５秒間のみ接触するようにＰＣＲマイクロチップの設置位置を工夫した。
ＰＣＲマイクロチップ内のマイクロチャンネル内部の溶液の過熱、冷却のサイクルを３０回繰り返したときのＰＣＲ溶液を、反対側のアウトレットから採取し、キャピラリー電気泳動によって分析した結果を図９に示す。なお、ＤＮＡ TemplateはPorphyromonas Gingivalis（ＰＧ）菌とした。図中、ピーク（ａ）は、primerを、ピーク（ｂ）は、PCR product (197 bp)を、それぞれ示している。

[実施例２：ＰＣＲ溶液を固定した熱源の上で前進および後退することによって行うＰＣＲ]
図１０は、本実施例に用いた装置の概要を示す図であり、図中、（Ａ）は、マイクロリアクターを内蔵したマイクロチップ、（Ｂ）は、液溜めとなるマイクロリアクター（内径５ｍｍ、深さ１．７ｍｍ）、（Ｃ）は、熱源(１：９５℃)、（Ｄ）は、熱源（２：６０℃）、（Ｅ）は、熱源（Ｃ）及び熱源（Ｄ）を固定した可動ステージ、（Ｆ）は、マイクロリアクターチップを熱源(Ｃ)に接触、設置した状態、（Ｇ）は、マイクロリアクターチップを熱源(Ｄ)に接触、設置した状態、をそれぞれ示している。

図１０に示した装置の、マイクロチップのマイクロリアクタ（チャンバー部分）(Ａ)に下記の表２に記載のＰＣＲ溶液をマイクロリアクター（Ｂ）内に封入し、熱源（Ｃ）（９５℃）、熱源（Ｄ）（６０℃）を設置した可動ステージを利用して、熱源（Ｃ）および熱源（Ｄ）にそれぞれ５秒、１５秒接触するように２つの熱源を移動させ、過熱、冷却のサイクルを３０回繰り返したときのＰＣＲ溶液をキャピラリー電気泳動によって分析した結果を図１１に示す。DNA TemplateはPorphyromonas Gingivalis（ＰＧ）菌とした。図中、ピーク（ａ）は、primerを、ピーク（ｂ）は、PCR product (197 bp)を、それぞれ示している。

６−１：空気穴
６−２：マイクロ流路
６−３：マイクロチップに設置されたゴム膜
６−４：流路へ導入するＰＣＲ溶液をためるための液溜り
６−５：直動式アクチュエータ

Claims

マイクロチップと、該マイクロチップに接触するように配置された温度の異なる複数の固定された熱源を備え、ポンプを用いて、前記複数の熱源の上で、前記マイクロチップ内のＰＣＲ溶液の前進及び後退を繰り返すことによってＰＣＲ溶液の温度を変化させるようにしたことを特徴とするＰＣＲ装置。
マイクロチップと、温度の異なる複数の可動式熱源を備え、前記マイクロチップ内のＰＣＲ溶液を停止させた状態で、前記可動式の熱源を、交互に前記マイクロチップと接触させることによってＰＣＲ溶液の温度を変化させるようにしたことを特徴とするＰＣＲ装置。
請求項１又は請求項２に記載されたＰＣＲ装置において、
マイクロチップ内部に設置されたゴム膜、前記ゴム膜を押圧可能な直動式アクチュエータ、前記ゴム膜に接触する液溜まり、該液溜まりに連通する１つ又は複数の流路を備え、前記流路のＰＣＲ溶液の到達点に空気孔を空けることにより逆止弁を不要としたことを特徴とするＰＣＲ装置。