JP2018191608A - 核酸増幅装置及び核酸増幅方法 - Google Patents

Abstract

【課題】簡便な構造により、マイクロ流路チップを加熱部に押さえつけることができ、かつ、反応溶液の送液開始のタイミングを制御できる核酸増幅装置等を提供する。【解決手段】第１開口部１１０と第２開口部１２０と第１開口部１１０から導入された反応溶液を第２開口部１２０に送液するためのマイクロ流路１３０とを有するマイクロ流路チップ１００を加熱することで反応溶液に含まれる標的核酸を増幅させるための核酸増幅装置１であって、マイクロ流路チップ１００が載置される加熱部１０と、弾性力による押圧によりマイクロ流路チップ１００を押さえるための押さえ部２０と、弾性力による押圧により第２開口部１２０を封止するための封止部３０と、押さえ部２０及び封止部３０に対して加熱部１０が昇降するように押さえ部２０及び加熱部３０の少なくとも一方を昇降させる昇降部４０とを備える。【選択図】図２

Description

本発明は、検体に含まれる核酸（デオキシリボ核酸、リボ核酸）を増幅させるための核酸増幅装置及び核酸増幅方法に関する。

飲料又は食品等に含まれる細菌等の微生物の検査においては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を利用したＰＣＲ検査法が知られている。ＰＣＲ検査法は、培養法と比べて大幅に検査工程を高速化及び簡略化することができる利点がある。

ＰＣＲ検査は、例えば核酸増幅デバイスを用いて行われる。この種の核酸増幅デバイスとして、マイクロ流路を有するマイクロ流路チップが知られている。マイクロ流路チップを用いてＰＣＲ検査を行う場合、検査対象となる微生物を含む検体（検体原液）と反応試薬（ＰＣＲ試薬等）とを含む反応溶液をマイクロ流路チップのマイクロ流路に流して、反応溶液に昇降温度サイクルを与える。これにより、検体に含まれる標的核酸を指数関数的に高速に増幅することができるので、迅速に検体の検査を行うことができる。

マイクロ流路チップに導入された反応溶液に温度サイクルを与える方法として、例えば、異なる温度に設定された複数の温度領域にマイクロ流路を通過させる方法が知られている（例えば特許文献１〜３）。

特開２００２−５８４７０号公報 特開２００２−９０３５７号公報 特開２００４−６１３２０号公報

マイクロ流路チップに導入された反応溶液に温度を与える方法として、ヒータブロック等の加熱部の上にマイクロ流路チップを載置する方法が知られている。この場合、加熱部にマイクロ流路チップを密着させて効率良く且つ精度よくマイクロ流路チップを加熱するために、マイクロ流路チップを治具によって押さえつけることが考えられる。

また、マイクロ流路における反応溶液の送液開始のタイミングを制御したい場合がある。この場合、マイクロ流路の出口（アウトレット）をテープなどで密閉することで、マイクロ流路チップに導入した反応溶液をマイクロ流路の入口（インレット）付近に一旦保持しておき、テープをはがすことによって反応溶液の送液を開始させることが考えられる。

しかしながら、マイクロ流路チップを加熱部に押さえつけたりマイクロ流路の出口を密閉したりするには、通常、治具を操作する等して手動で作業を行う必要があるため、手間を要する上に、検査バラツキが生じるという課題がある。特に、手作業でマイクロ流路チップを加熱部の上に載置する方法では、マイクロ流路と加熱部との位置合わせを精度良く行うことが難しい。また、マイクロ流路と加熱部との位置を精度良く合わせるには熟練した操作が必要になる。

一方、マイクロ流路チップを加熱部に押さえつけたりマイクロ流路の出口を密閉させたりすることを装置によって自動化しようとすると、駆動部として新たに２つのアクチュエータが必要になってしまい、装置の構造が煩雑になる。

本発明は、このような課題を解決するためになされたものであり、簡便な構造により、マイクロ流路チップを加熱部に押さえつけることができ、かつ、反応溶液の送液開始のタイミングを制御できる核酸増幅装置及び核酸増幅方法を提供することを目的とする。

上記目的を達成するために、本発明に係る核酸増幅装置の一態様は、第１開口部と第２開口部と前記第１開口部から導入された反応溶液を前記第２開口部に送液するためのマイクロ流路とを有するマイクロ流路チップを加熱することで前記反応溶液に含まれる標的核酸を増幅させるための核酸増幅装置であって、前記マイクロ流路チップが載置される加熱部と、弾性力による押圧により前記マイクロ流路チップを押さえるための押さえ部と、弾性力による押圧により前記第２開口部を封止するための封止部と、前記押さえ部及び前記封止部に対して相対的に前記加熱部が昇降するように前記押さえ部及び前記加熱部の少なくとも一方を昇降させる昇降部とを備える。

また、本発明に係る核酸増幅方法の一態様は、上記の核酸増幅装置を用いた核酸増幅方法であって、前記マイクロ流路チップを前記加熱部に載置する第一工程と、前記第一工程の後に、前記昇降部により前記マイクロ流路チップが載置された前記加熱部と前記押さえ部との少なくとも一方を昇降させることで、弾性力による押圧により前記マイクロ流路チップの一部を前記押さえ部で押さえる第二工程と、前記第二工程の後に、前記昇降部により前記マイクロ流路チップが載置された前記加熱部と前記封止部との少なくとも一方を移動させることで、弾性力による押圧により前記マイクロ流路チップの前記第２開口部を前記封止部で封止する第三工程と、前記第三工程の後に、前記昇降部により前記マイクロ流路チップが載置された前記加熱部と前記封止部との少なくとも一方を昇降せることで、前記封止部を前記第２開口部から離す第四工程とを含む。

本発明によれば、簡便な構造により、マイクロ流路チップを加熱部に押さえつけることができ、かつ、反応溶液の送液開始のタイミングを制御することができる。

実施の形態に係る核酸増幅装置にセットされるマイクロ流路チップの一例を示す図である。 実施の形態に係る核酸増幅装置の外観を模式的に示す斜視図である。 実施の形態に係る核酸増幅装置の上面図である。 実施の形態に係る核酸増幅装置の正面図である。 実施の形態に係る核酸増幅装置の側面図である。 図３のＶＩ−ＶＩ線における実施の形態に係る核酸増幅装置の断面図である。 図３のＶＩＩ−ＶＩＩ線における実施の形態に係る核酸増幅装置の断面図である。 実施の形態に係る核酸増幅方法における第一工程を示す図である。 実施の形態に係る核酸増幅方法における第二工程を示す図である。 実施の形態に係る核酸増幅方法における第三工程を示す図である。 実施の形態に係る核酸増幅方法における第四工程を示す図である。 変形例に係る核酸増幅方法に用いられる核酸増幅装置の断面図である。 変形例に係る核酸増幅方法において、検査済みのマイクロ流路チップを取り外した状態から初期状態に戻ったときの工程を示す図である。

以下、本発明の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施の形態は、いずれも本発明の好ましい一具体例を示すものである。したがって、以下の実施の形態で示される、数値、形状、材料、構成要素、構成要素の配置位置及び接続形態、並びに、ステップ（工程）及びステップの順序などは、一例であって本発明を限定する主旨ではない。よって、以下の実施の形態における構成要素のうち、本発明の最上位概念を示す独立請求項に記載されていない構成要素については、任意の構成要素として説明される。

各図は、模式図であり、必ずしも厳密に図示されたものではない。したがって、各図において縮尺等は必ずしも一致していないし、各図の装置及び部品等は省略して図示されている場合がある。なお、各図において、実質的に同一の構成に対しては同一の符号を付しており、重複する説明は省略又は簡略化する。

また、本明細書及び図面において、Ｘ軸、Ｙ軸及びＺ軸は、三次元直交座標系の三軸を表しており、本実施の形態では、Ｚ軸方向を鉛直方向とし、Ｚ軸に垂直な方向（ＸＹ平面に平行な方向）を水平方向としている。Ｘ軸及びＹ軸は、互いに直交し、且つ、いずれもＺ軸に直交する軸である。

（実施の形態）
まず、核酸増幅装置１にセットされるマイクロ流路チップ１００の構成について、図１を用いて説明する。図１は、実施の形態に係る核酸増幅装置１にセットされるマイクロ流路チップ１００の一例を示す図である。

図１に示すように、マイクロ流路チップ１００は、マイクロ流体である反応溶液が流れるマイクロ流体チップであり、第１開口部１１０と、第２開口部１２０と、マイクロ流路１３０とを有する。第１開口部１１０と第２開口部１２０とは、マイクロ流路１３０によって連結されている。

本実施の形態において、マイクロ流路チップ１００は、マイクロ流路チップ１００に導入される反応溶液に含まれる検体の標的核酸を増幅させるための核酸増幅デバイスである。

マイクロ流路チップ１００に導入される反応溶液は、例えば、標的核酸を含む検体と、標的核酸に反応する反応試薬とを含む水溶液である。検体は、例えば、検査対象となる微生物（細菌、ウイルス又は組織細胞等）から核酸抽出試薬により予め抽出された標的核酸を含む検体原液である。反応試薬は、例えば、蛍光物質を含むＰＣＲ試薬等の反応試薬溶液である。

マイクロ流路チップ１００は、下基板である第１基板１０１と上基板である第２基板１０２とによって構成されている。第１基板１０１及び第２基板１０２としては、例えば、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）やＰＣ（ポリカーボネート）、アクリル等の樹脂基板、ガラス基板、又は、シリコン基板等を用いることができる。

第１開口部１１０は、マイクロ流路１３０の一方の端部に設けられており、マイクロ流路１３０の始点になっている。第１開口部１１０は、マイクロ流路１３０の入口（インレット）であり、反応溶液が導入される導入口である。つまり、反応溶液は、第１開口部１１０を介してマイクロ流路１３０に導入される。第１開口部１１０は、例えば、第１基板１０１に設けられた凹部と第２基板１０２に設けられた円形の貫通孔とによって構成されるが、これに限らない。

また、マイクロ流路１３０の第１開口部１１０付近には、一定量の反応溶液を保持することができる保持部として、マイクロ流路１３０の底面を一段下げた凹部が設けられているとよい。

第２開口部１２０は、マイクロ流路１３０の他方の端部に設けられており、マイクロ流路１３０の終点になっている。つまり、第２開口部１２０は、反応溶液の送液の終点となる。第２開口部１２０は、マイクロ流路１３０の出口（アウトレット）である。第２開口部１２０は、第１開口部１１０と同様に、例えば、第１基板１０１に設けられた凹部と第２基板１０２に設けられた円形の貫通孔とによって構成されるが、これに限らない。なお、第２開口部１２０は、マイクロ流路１３０を流れる反応溶液の一部又は全部を排出することが可能な排出口であるが、反応溶液は第２開口部１２０から排出されなくてもよい。

マイクロ流路１３０は、第１開口部１１０から導入された反応溶液を第２開口部１２０に送液するための流路である。マイクロ流路１３０は、流路幅及び流路深さがマイクロオーダサイズの微細流路である。本実施の形態において、マイクロ流路１３０は１本で構成されており、マイクロ流路１３０には反応溶液が一方通行的に流れる。具体的には、反応溶液は、マイクロ流路１３０内を第１開口部１１０から第２開口部１２０に向かう方向に流れる。また、本実施の形態では、反応溶液は、マイクロ流路１３０内を毛管力（キャピラリ力）により送液される。例えばマイクロ流路１３０の内面を界面活性剤等でコーティングして親水性表面にすることによって反応溶液を毛管力によって送液することができる。

マイクロ流路１３０は、例えば第１基板１０１に形成された溝である。なお、マイクロ流路１３０は、第２基板１０２に形成されていてもよい。マイクロ流路１３０を構成する溝は、例えば、断面形状が矩形状であって、流路幅（溝幅）及び深さがマイクロ流路１３０全域において一定である。一例として、マイクロ流路１３０を構成する溝は、流路幅が２０〜３００μｍで、深さが５０〜１５０μｍである。

マイクロ流路チップ１００は、マイクロ流路１３０を流れる反応溶液に含まれる標的核酸を増幅させるための核酸増幅反応部１００ａ（核酸増幅領域）を有する。核酸増幅反応部１００ａにおけるマイクロ流路１３０は、核酸増幅装置１の加熱部１０により温度制御された２つ以上の温度領域を往復又は周期的に通過するように構成されている。本実施の形態において、核酸増幅反応部１００ａにおけるマイクロ流路１３０は、蛇行するように形成された蛇行流路であり、加熱部１０により形成される高温領域と低温領域との２つの温度領域を往復するように複数サイクルで折り返されている。なお、蛇行流路の折り返し回数は、例えば２０〜７０サイクル程度であるが、図１では、１０サイクル程度しか図示されていない。

次に、実施の形態に係る核酸増幅装置１の構成について、図２〜図７を用いて説明する。図２は、実施の形態に係る核酸増幅装置１の外観を模式的に示す斜視図である。図３は、同核酸増幅装置１の上面図である。図４は、同核酸増幅装置１の正面図である。図５は、同核酸増幅装置１の側面図である。図６は、図３のＶＩ−ＶＩ線における同核酸増幅装置１の断面図である。図７は、図３のＶＩＩ−ＶＩＩ線における同核酸増幅装置１の断面図である。なお、図２〜図７では、核酸増幅装置１にマイクロ流路チップ１００をセットした直後の状態（初期状態）を示している。

核酸増幅装置１は、マイクロ流路チップ１００に導入する反応溶液に含まれる検体の標的核酸を加熱して増幅させるための装置であり、図２〜図７に示すように、加熱部１０と、押さえ部２０と、封止部３０と、昇降部４０とを備える。本実施の形態において、核酸増幅装置１には複数（具体的には４つ）のマイクロ流路チップ１００をセットすることができる。これにより、複数のマイクロ流路チップ１００に対して同時に検査を行うことができる。

加熱部１０には、マイクロ流路チップ１００が載置される。本実施の形態において、マイクロ流路チップ１００は、加熱部１０の上面に接するようにして加熱部１０に載置される。加熱部１０は、載置されたマイクロ流路チップ１００を加熱する加熱装置である。具体的には、加熱部１０は、マイクロ流路チップ１００に導入された反応溶液を加熱する。

核酸増幅装置１において、加熱部１０は複数（具体的には４つ）設けられている。これにより、一度に複数（具体的には４つ）のマイクロ流路チップ１００を加熱することができる。各加熱部１０は、少なくともマイクロ流路チップ１００の核酸増幅反応部１００ａ（図１参照）に対応するように配置されており、核酸増幅反応部１００ａのマイクロ流路１３０に送液される反応溶液は、加熱部１０によって所定の温度が付与される。

本実施の形態において、各加熱部１０は、所定の異なる温度に設定された第１ヒータ１１と第２ヒータ１２とを有する。これにより、マイクロ流路チップ１００の核酸増幅反応部１００ａには、第１ヒータ１１及び第２ヒータ１２の２つのヒータによって、互いに異なる温度に設定された２つの温度領域が形成される。

具体的には、第１ヒータ１１の温度は第２ヒータ１２の温度よりも高くなるように設定されている。つまり、第１ヒータ１１に対応する領域が高温領域であり、第２ヒータ１２に対応する領域が低温領域である。これにより、マイクロ流路チップ１００において、第１ヒータ１１上の領域には高温領域が形成され、第２ヒータ１２上の領域には低温領域が形成される。

高温領域を形成するための第１ヒータ１１の設定温度は、例えば９０℃〜９８℃であり、本実施の形態では、核酸増幅反応の変性反応温度である約９５℃としている。一方、低温領域を形成するための第２ヒータ１２の設定温度は、例えば５０℃〜７５℃であり、本実施の形態では、アニール・伸長反応温度である約６０℃としている。

また、第１ヒータ１１と第２ヒータ１２とは所定の隙間をあけて並べられている。マイクロ流路チップ１００は、核酸増幅反応部１００ａが第１ヒータ１１と第２ヒータ１２との隙間を跨ぐように第１ヒータ１１及び第２ヒータ１２の上に載置される。これにより、核酸増幅反応部１００ａにおけるマイクロ流路１３０は、第１ヒータ１１及び第２ヒータ１２による２つの温度領域を複数サイクルで往復するように構成されることになる。この構成により、マイクロ流路１３０を流れる反応溶液に昇降温度サイクル（ヒートサイクル）が付与される。

第１ヒータ１１及び第２ヒータ１２は、例えばヒータブロックである。具体的には、第１ヒータ１１及び第２ヒータ１２は、直方体のアルミニウム又はステンレス等の金属からなる金属ブロックである。この場合、第１ヒータ１１及び第２ヒータ１２は、温度制御部（不図示）に接続されており、第１ヒータ１１及び第２ヒータ１２の各温度は、温度制御部によって制御される。

第１ヒータ１１及び第２ヒータ１２がヒータブロックである場合、マイクロ流路チップ１００の第１基板１０１（下基板）の裏面は第１ヒータ１１及び第２ヒータ１２の各々の上面に接している。

なお、第１ヒータ１１及び第２ヒータ１２は、ヒータブロックに限るものではなく、金属薄膜ヒータ等のその他のヒータであってもよい。

また、第１ヒータ１１及び第２ヒータ１２とマイクロ流路チップ１００との間に、加熱部１０の一部として高熱伝導シートを配置するとよい。つまり、マイクロ流路チップ１００を、高熱伝導シートを介して第１ヒータ１１及び第２ヒータ１２の上に載置してもよい。この場合、マイクロ流路チップ１００と第１ヒータ１１及び第２ヒータ１２とは、それぞれ高熱伝導シートに接している。高熱伝導シートとしては、例えば、高熱伝導率の樹脂製の弾性シートを用いることができる。

このように、マイクロ流路チップ１００と第１ヒータ１１及び第２ヒータ１２との間に高熱伝導シートを挿入することで、マイクロ流路チップ１００と高熱伝導シートとを密着させることができるとともに加熱部１０と高熱伝導シートとを密着させることができる。これにより、マイクロ流路チップ１００と第１ヒータ１１及び第２ヒータ１２との間に空気層が介在しなくなり、マイクロ流路チップ１００と第１ヒータ１１及び第２ヒータ１２との界面の密着性を向上させることができる。したがって、第１ヒータ１１及び第２ヒータ１２によって効率良くマイクロ流路チップ１００を加熱することができる。

押さえ部２０は、マイクロ流路チップ１００を押さえ付けることでマイクロ流路チップ１００を所定の高さ位置で固定するためのチップ固定用アーム（第１アーム）である。具体的には、押さえ部２０は、弾性力による押圧によりマイクロ流路チップ１００を押さえることでマイクロ流路チップ１００を所定の高さ位置で固定する。

本実施の形態において、押さえ部２０は、弾性変形する弾性部材２１ａを有する支持部材２１（第１支持部材）により支持されているので、弾性部材２１ａが弾性変形することで押さえ部２０の高さ位置が変化する。これにより、押さえ部２０は、弾性部材２１ａの弾性力による押圧によってマイクロ流路チップ１００を押さえ付けるので、マイクロ流路チップ１００を所定の高さ位置で容易に固定することができる。

弾性部材２１ａは、例えば、バネである。具体的には、弾性部材２１ａは、金属製のコイルバネである。これにより、コイルバネの伸縮によって、押さえ部２０の高さ位置を変化させることができる。なお、弾性部材２１ａを構成するコイルバネは、加熱部１０を最大に上昇させた場合でも弾性力を保持するストロークが確保されるように設計及び選定されるとよい。

押さえ部２０は、マイクロ流路チップ１００ごとに設けられている。本実施の形態では、４つのマイクロ流路チップ１００がセットされるので、押さえ部２０も４つ設けられている。なお、４つの押さえ部２０が一体化されたものであってもよいが、マイクロ流路チップ１００の個体バラツキ等を考慮すると、押さえ部２０は、マイクロ流路チップ１００ごとに分離している方が、より安定して各マイクロ流路チップ１００を固定することができる。

本実施の形態において、各押さえ部２０は、枠状の板体である。押さえ部２０は、マイクロ流路チップ１００の外周の全端部を押さえ付けることができる大きさ及び形状を有するとよい。この場合、押さえ部２０とマイクロ流路チップ１００との接触面積（押さえる部分の面積）が大きくなりすぎると、所定の温度で加熱されるべきマイクロ流路チップ１００から放熱を引き起こしてマイクロ流路チップ１００が所定の温度で加熱されなくなるおそれがある。このため、押さえ部２０とマイクロ流路チップ１００との接触面積は小さい方がよい。一方、押さえ部２０とマイクロ流路チップ１００との接触面積が小さくなりすぎると、押さえ部２０による押圧が小さくなってマイクロ流路チップ１００と加熱部１０との密着が不十分になるおそれがある。したがって、押さえ部２０とマイクロ流路チップ１００とは、面接触ではなく、多点接触になっているよい。この場合、押さえ部２０に、複数の突起を設けて、この複数の突起によってマイクロ流路チップ１００を押さ付けるとよい。これにより、例えば、面接触させたときと同じ面積となる面積で多点接触させることで、面接触させた場合と比べて、マイクロ流路チップ１００と加熱部１０との密着性を確保しつつ、押さえ部２０による熱引きを抑制することができる。

押さえ部２０の材料は特に限定されるものではないが、例えば金属材料又は樹脂材料によって構成することができる。この場合、マイクロ流路チップ１００を押さえ付けるとの観点では高い強度を有する材料であるとよく、また、押さえ部２０による熱引きを抑制するとの観点では熱伝導率が低い材料であるとよい。強度及び熱伝導率のバランスを考慮すると、押さえ部２０は、ステンレスによって構成されているとよい。

また、各押さえ部２０は、２つの支持部材２１によって支持されている。具体的には、押さえ部２０の長手方向の一方の端部には支柱２０ａが固定されており、押さえ部２０の長手方向の他方の端部には支柱２０ｂが固定されている。そして、２つの支柱２０ａ及び２０ｂの各々が弾性部材２１ａを介して２つの支持部材２１の各々に支持されることで、押さえ部２０が弾性部材２１ａの弾性力によって高さ位置が変位可能に支持部材２１に支持されている。

本実施の形態において、押さえ部２０は、マイクロ流路チップ１００が加熱部１０に載置された直後の状態（初期状態）のときにおいて、加熱部１０よりも高い位置に設けられている。また、押さえ部２０は、マイクロ流路チップ１００が加熱部１０に載置された状態のときに、上面視においてマイクロ流路チップ１００の一部と重なっている。

この構成により、マイクロ流路チップ１００が載置された加熱部１０を昇降部４０によって上昇させることで、マイクロ流路チップ１００の上面は押さえ部２０によって押さえ付けられる。このとき、押さえ部２０は、伸びた弾性部材２１ａのバネ復元力による弾性力によってマイクロ流路チップ１００の上面を押さえ付けている。これにより、マイクロ流路チップ１００は、所定の高さ位置で保持された状態で固定される。

また、マイクロ流路チップ１００が押さえ部２０で固定されている状態において、マイクロ流路チップ１００が載置された加熱部１０を昇降部４０によって下降させると、マイクロ流路チップ１００と押さえ部２０とが離される。これにより、マイクロ流路チップ１００と押さえ部２０との固定状態が解除される。

封止部３０は、マイクロ流路チップ１００の第２開口部１２０を封止するためのチップ封止用アーム（第２アーム）である。具体的には、封止部３０は、弾性力による押圧によりマイクロ流路チップ１００の第２開口部１２０を封止することで、第２開口部１２０は封止部３０で蓋をされて密閉される。つまり、封止部３０が第２開口部１２０を密閉する。

本実施の形態において、封止部３０は、弾性変形する弾性部材３１ａを有する支持部材３１（第２支持部材）により支持されているので、弾性部材３１ａが弾性変形することで封止部３０の高さ位置が変化する。これにより、封止部３０は、弾性部材３１ａの弾性力による押圧によってマイクロ流路チップ１００の第２開口部１２０を押さえ付けることができる。このため、封止部３０によって第２開口部１２０を容易に封止することができる。

弾性部材３１ａは、例えば、バネである。具体的には、弾性部材３１ａは、金属製のコイルバネである。これにより、コイルバネの伸縮によって、封止部３０の高さ位置を変化させることができる。なお、弾性部材３１ａを構成するコイルバネは、加熱部１０を最大に上昇させた場合でも弾性力を保持するストロークが確保されるように設計及び選定されるとよい。

封止部３０は、マイクロ流路チップ１００ごとに設けられている。本実施の形態では、４つのマイクロ流路チップ１００がセットされるので、封止部３０も４つ設けられている。なお、４つの封止部３０が４つのマイクロ流路チップ１００にまたがって一体化されたものであってもよいが、マイクロ流路チップ１００の個体バラツキ等を考慮すると、封止部３０は、マイクロ流路チップ１００ごとに分離している方が、より安定して各マイクロ流路チップ１００の第２開口部１２０を封止することができる。

本実施の形態において、封止部３０は、矩形状の板体である。封止部３０は、マイクロ流路チップ１００の第２開口部１２０を覆う大きさ及び形状を有するとよい。この場合、押さえ部２０と同様に、封止部３０とマイクロ流路チップ１００との接触面積が大きくなりすぎると、所定の温度で加熱されるべきマイクロ流路チップ１００から放熱を引き起こしてマイクロ流路チップ１００が所定の温度で加熱されなくなるおそれがある。このため、第２開口部１２０の密閉状態を維持することができれば、封止部３０とマイクロ流路チップ１００との接触面積は小さい方がよい。

封止部３０の材料は特に限定されるものではないが、例えば金属材料又は樹脂材料によって構成することができる。この場合、第２開口部１２０を押さえ付けて封止するとの観点では高い強度を有する材料であるとよく、また、封止部３０による熱引きを抑制するとの観点では熱伝導率が低い材料であるとよい。強度及び熱伝導率のバランスを考慮すると、封止部３０は、ステンレスによって構成されているとよい。

また、封止部３０は、１つの支持部材３１によって支持されている。具体的には、封止部３０には支柱３０ａが固定されており、支柱３０ａが弾性部材３１ａを介して支持部材３１に支持されることで、封止部３０が弾性部材３１ａの弾性力で高さ位置が変位可能に支持部材３１に支持されている。

なお、封止部３０に固定された支柱３０ａは、押さえ部２０と接触することなく押さえ部２０の一部に設けられた貫通孔を貫通している。これにより、支柱３０ａと押さえ部２０とが干渉することなく、封止部３０の高さ位置が変位可能となっている。

本実施の形態において、封止部３０は、マイクロ流路チップ１００が加熱部１０に載置された直後の状態（初期状態）のときにおいて、押さえ部２０よりも高い位置に設けられている。また、封止部３０は、マイクロ流路チップ１００が加熱部１０に載置された状態のときに、上面視においてマイクロ流路チップ１００の第２開口部１２０と重なっている。

この構成により、マイクロ流路チップ１００が載置された加熱部１０を昇降部４０によって上昇させることで、第２開口部１２０が封止部３０によって封止される。このとき、封止部３０は、伸びた弾性部材３１ａのバネ復元力による弾性力によって第２開口部１２０の周囲を押さえ付けている。これにより、第２開口部１２０が密閉状態となる。

また、マイクロ流路チップ１００が封止部３０で封止されている状態において、マイクロ流路チップ１００が載置された加熱部１０を昇降部４０によって下降させると、マイクロ流路チップ１００と封止部３０とが離される。これにより、封止部３０による第２開口部１２０の封止状態が解除される。

また、封止部３０は、第２開口部１２０を囲む位置に対応する環状のパッキン３０ｂを有している。これにより、封止部３０で第２開口部１２０を押さえ付けることで、封止部３０は、パッキン３０ｂで第２開口部１２０を封止することになる。これにより、封止部３０による押圧が小さくても、第２開口部１２０を容易に密閉することができる。例えば、本実施の形態のように、バネの弾性力による押圧であっても封止部３０で第２開口部１２０を容易に密閉して気密封止することができる。

パッキン３０ｂは、例えば、エラストマー材料によって構成されたＯリングである。このようなパッキン３０ｂとしては、シリコーンゴム、フッ素ゴム又はニトリルゴム等のゴム弾性を有する材料によって構成されたゴムパッキンを用いることができる。

昇降部４０は、押さえ部２０及び封止部３０に対して相対的に加熱部１０が昇降するように押さえ部２０及び加熱部１０の少なくとも一方を昇降させる昇降機構である。本実施の形態において、昇降部４０は、加熱部１０を鉛直方向（Ｚ軸方向）に昇降させる。つまり、昇降部４０は、加熱部１０を鉛直方向に上昇させたり下降させたりする。このように、加熱部１０を昇降部４０によって昇降させることで、押さえ部２０及びマイクロ流路チップ１００の接離状態と封止部３０及びマイクロ流路チップ１００の接離状態との２つの接離状態を制御している。

昇降部４０は、昇降機構として、加熱部１０を支持するリフター４１と、リフター４１を鉛直方向に昇降させるアクチュエータ４２とを有する。

本実施の形態において、リフター４１は、４つの加熱部１０を支持する支持板４１ａと、支持板４１ａの裏面に固定された略三角形部を有する梁４１ｂと、梁４１ｂに固定された略Ｌ字状部を有する支柱４１ｃとによって構成されている。４つの加熱部１０は、支持板４１ａに固定されている。これにより、１つのリフター４１によって４つの加熱部１０を同時に昇降させることできる。

また、アクチュエータ４２は、例えばモータ等である。一例として、アクチュエータ４２は、ステッピングモータによる昇降アクチュエータである。アクチュエータ４２を制御することによってリフター４１を昇降させることができる。つまり、アクチュエータ４２を制御することによって加熱部１０を上昇させたり下降させたりすることができる。具体的には、アクチュエータ４２によって支柱４１ｃを昇降させることで梁４１ｂ及び支持板４１ａが昇降し、これにより、支持板４１ａに支持された加熱部１０が昇降する。

このように、本実施の形態における昇降部４０には、アクチュエータ４２が用いられているので、自動で加熱部１０を昇降させることができる。なお、昇降部４０は、アクチュエータ４２を用いずに構成されていてもよい。つまり、昇降部４０は、手動により加熱部１０を昇降させるように構成されていてもよい。

また、本実施の形態では、１つのアクチュエータ４２によって加熱部１０を昇降させており、１つのアクチュエータ４２のみで押さえ部２０及びマイクロ流路チップ１００の接離状態と封止部３０及びマイクロ流路チップ１００の接離状態との２つの接離状態を制御している。

以上、本実施の形態における核酸増幅装置１は、マイクロ流路チップ１００が載置される加熱部１０と、マイクロ流路チップ１００を押さえるための押さえ部２０と、マイクロ流路チップ１００の第２開口部１２０を封止するための封止部３０と、加熱部１０を昇降させる昇降部４０とを備える。

これにより、加熱部１０を昇降させるだけで、マイクロ流路チップ１００を加熱部１０に押さえ付けることと第２開口部１２０を封止することとを行うことができる。これにより、マイクロ流路チップ１００に導入する反応溶液に対して核酸増幅反応処理を行う際に核酸増幅装置１を用いることによって、マイクロ流路チップ１００を加熱部１０に押さえつけることができ、かつ、マイクロ流路チップ１００に導入する反応溶液の送液開始のタイミングを制御することができる。

次に、実施の形態に係る核酸増幅方法について、図８〜図１１を用いて説明する。図８〜図１１は、実施の形態に係る核酸増幅方法を説明するための図であり、図８は第一工程、図９は第二工程、図１０は第三工程、図１１は第四工程を示している。なお、図８〜図１１の各々において、左側の（ａ）は、図５の断面図に対応し、右側の（ｂ）は、図６の断面図の一部に対応する。

本実施の形態に係る核酸増幅方法は、上記実施の形態における核酸増幅装置１を用いて行われる。

まず、図８に示すように、マイクロ流路チップ１００を核酸増幅装置１の加熱部１０に載置する（第一工程）。例えば、４つの加熱部１０の各々にマイクロ流路チップ１００を載置する。つまり、４つのマイクロ流路チップ１００をセットする。

このマイクロ流路チップ１００を加熱部１０に載置したときの状態が核酸増幅装置１の初期状態（チップセット時）である。この初期状態において、押さえ部２０及び封止部３０は、マイクロ流路チップ１００に接触しておらず、それぞれマイクロ流路チップ１００と所定の距離をあけて離れている。

次に、第一工程の後に、昇降部４０によりマイクロ流路チップ１００が載置された加熱部１０と押さえ部２０との少なくとも一方を昇降させることで、弾性力による押圧によりマイクロ流路チップ１００の一部を押さえ部２０で押さえる（第二工程）。

本実施の形態では昇降部４０は加熱部１０を昇降させるので、図９に示すように、この第二工程では、昇降部４０は、マイクロ流路チップ１００が載置された加熱部１０を鉛直方向に１段階上昇させる（１段階目の加熱部１０の上昇）。このとき、昇降部４０は、マイクロ流路チップ１００が押さえ部２０によって押圧が付与されるまで加熱部１０を上昇させる。

具体的には、加熱部１０を上昇させていくと、マイクロ流路チップ１００が押さえ部２０の初期の高さ位置で押さえ部２０と接触するが、この接触したときの位置から、さらに加熱部１０をわずかに上昇させる。これにより、支持部材２１の弾性部材２１ａが伸びるので、弾性部材２１ａに弾性力として復元力が発生する。

このとき、押さえ部２０は、弾性部材２１ａの弾性力による押圧によってマイクロ流路チップ１００を押さえ付けることになる。このように、マイクロ流路チップ１００は、押さえ部２０の初期の高さ位置から少し上側の位置において、押さえ部２０で押圧された状態（チップ固定状態）で固定される。なお、第二工程では、マイクロ流路チップ１００と封止部３０とはまだ接触していない。

次に、第二工程の後に、昇降部４０によりマイクロ流路チップ１００が載置された加熱部１０と封止部３０との少なくとも一方を昇降させることで、弾性力による押圧によりマイクロ流路チップ１００の第２開口部１２０を封止部３０で封止する（第三工程）。

本実施の形態では昇降部４０は加熱部１０を昇降させるので、図１０に示すように、この第三工程では、昇降部４０は、マイクロ流路チップ１００が載置された加熱部１０を鉛直方向にさらに１段上昇させる（２段階目の加熱部１０の上昇）。このとき、昇降部４０は、マイクロ流路チップ１００が封止部３０によって押圧が付与されるまで加熱部１０を上昇させる。

具体的には、マイクロ流路チップ１００が押さえ部２０で押圧された状態（チップ固定状態）から加熱部１０をさらに上昇させていくと、マイクロ流路チップ１００は、押さえ部２０で押圧された状態が維持されたまま、押さえ部２０よりも高い位置にある封止部３０の初期の高さ位置で封止部３０のパッキン３０ｂと接触するが、この接触したときの位置から、さらに加熱部１０をわずかに上昇させる。これにより、支持部材３１の弾性部材３１ａが伸びるので、弾性部材３１ａに弾性力として復元力が発生する。

このとき、封止部３０は、弾性部材３１ａの弾性力による押圧によってマイクロ流路チップ１００の第２開口部１２０を覆って封止することになる。このように、マイクロ流路チップ１００は、封止部３０の初期の高さ位置から少し上側の位置において封止部３０で押圧された状態となり、この状態において第２開口部１２０が封止部３０で封止される。これにより、第２開口部１２０が気密封止された状態（チップ封止状態）となる。

なお、チップ封止状態では、押さえ部２０を支持する支持部材２１の弾性部材２１ａがさらに伸びるので、マイクロ流路チップ１００は、押さえ部２０で押圧された状態が維持されている。

そして、このチップ封止状態において、反応溶液３をマイクロ流路チップ１００に導入する。例えば、標的核酸を含む検体と反応試薬とを予め混合させておいて予め秤量した反応溶液３をピペット２によって滴下することで、マイクロ流路チップ１００の第１開口部１１０に反応溶液３を導入する。このとき、４つのマイクロ流路チップ１００の各々に反応溶液３を導入するが、各マイクロ流路チップ１００の第２開口部１２０は封止部３０で封止されているので、第１開口部１１０に導入された反応溶液３は送液されずに、第１開口部１１０付近に滞留する。なお、標的核酸を含む検体と反応試薬とを予め混合させておくのではなく、標的核酸を含む検体と反応試薬とを順次第１開口部１１０に導入して第１開口部１１０付近で混合させてマイクロ流路チップ１００内で反応溶液３を生成してもよい。

次に、第三工程の後に、昇降部４０によりマイクロ流路チップ１００が載置された加熱部１０と封止部３０との少なくとも一方を移動させることで、封止部３０を第２開口部１２０から離す（第四工程）。

本実施の形態では昇降部４０は加熱部１０を昇降させるので、図１１に示すように、この第四工程では、昇降部４０は、マイクロ流路チップ１００が載置された加熱部１０を１段階下降させる。具体的には、加熱部１０を下降させることで、第二工程でマイクロ流路チップ１００を上昇させて押さえ部２０で押さえ付けたときの位置（図９の位置）まで、マイクロ流路チップ１００を下降させる。これにより、封止部３０が第２開口部１２０から離れて、第２開口部１２０の気密封止が解除された状態（チップ封止解除状態）となる。

このように、第四工程では、封止部３０が第２開口部１２０から離れて（本実施の形態では、封止部３０のパッキン３０ｂが第２開口部１２０から離れて）、第２開口部１２０の気密封止の状態が解除される。これにより、第１開口部１１０付近に滞留していた反応溶液３が毛管力によってマイクロ流路１３０内を自走し始める。つまり、第２開口部１２０から封止部３０が離れたときに、反応溶液３の送液が開始する。このように、第２開口部１２０の気密封止の解除を制御することで、反応溶液３の送液開始のタイミングを制御することができる。

また、反応溶液３を自走によって送液させることで、送液用のアクチュエータを用いる必要がないので、簡便な構成で反応溶液３を送液させることができる。しかも、４つのマイクロ流路チップ１００の各々について、各第２開口部１２０の気密封止の解除を同時に行うことで、各マイクロ流路チップ１００の反応溶液３の送液を同時に開始させることができる。

この場合、４つの封止部３０を一体化させておくことで、４つのマイクロ流路チップ１００の反応溶液３の送液を、容易に同時に開始させることができる。なお、４つの封止部３０を一体化せずに各マイクロ流路チップ１００ごとに分離しておくことで、各封止部３０の高さ位置を変えることによって、マイクロ流路チップ１００ごとに、送液開始のタイミングを異ならせることもできる。

その後、各マイクロ流路チップ１００では、反応溶液３が送液されてマイクロ流路１３０を進むことになり、反応溶液３は、マイクロ流路１３０の蛇行流路によって高温領域と低温領域とを通過する。これにより、反応溶液３に周期的な温度変化（温度サイクル）を与えることができる。

具体的には、反応溶液３は、第１ヒータ１１上と第２ヒータ１２上とを繰り返して往復するようにマイクロ流路１３０を通ることになる。つまり、反応溶液３は、高温領域（第１ヒータ１１）と低温領域（第２ヒータ１２）との２つの温度領域を交互に繰り返して通過するように送液されるので、反応溶液３には、加熱と冷却とが交互に繰り返して付与されることになる。これにより、反応溶液３に対してヒートサイクルを付与することができるので、反応溶液３に含まれる標的核酸は、高温領域での変性反応と低温領域でのアニール・伸長反応との繰り返しにより増幅することになる。

このように、送液しながら反応溶液３を昇降温させることができるので、非常に高速なフローＰＣＲを実現することができる。したがって、反応溶液３に含まれる標的核酸を高速に増幅させることができる。

このとき、第四工程では、第二工程でマイクロ流路チップ１００を上昇させて押さえ部２０で押さえ付けたときの位置（図９の位置）までしかマイクロ流路チップ１００を下降させていない。つまり、第四工程では、封止部３０はマイクロ流路チップ１００から離れるが、押さえ部２０はマイクロ流路チップ１００を押さえている。このため、チップ封止解除状態では、マイクロ流路チップ１００は、押さえ部２０で押圧された状態が維持されているので、マイクロ流路チップ１００は、押さえ部２０による押圧によって加熱部１０に密着している。これにより、マイクロ流路チップを効率良くかつ精度よく加熱することができるので、高い精度で標的核酸を高速に増幅させることができる。

なお、反応溶液３がマイクロ流路１３０の全域に行き渡った後は、光学検出装置を用いて、反応溶液３に含まれる標的核酸の増幅量を検出する。例えば、マイクロ流路１３０に交差する方向にレーザ光（励起光）をスキャンしながら反射光（蛍光）を受光し、受光した反射光量（蛍光量）に基づいて、蛇行流路のサイクル毎（温度サイクル毎）の核酸の増幅量を増幅曲線として検出する。具体的には、ＰＣＲサイクルの増加に従って核酸の増幅量が増加する増幅曲線が得られる。これにより、反応溶液３に含まれる標的核酸の増幅量を算出することができる。これにより、マイクロ流路チップ１００のＰＣＲ検査が完了する。

ＰＣＲ検査が終了した後は、図示しないが、昇降部４０により加熱部１０を下降させる。具体的には、第一工程の初期状態（チップセット時）の位置（図８の位置）まで、マイクロ流路チップ１００を下降させる。これにより、押さえ部２０がマイクロ流路チップ１００から離れる。その後、検査済みのマイクロ流路チップ１００を加熱部１０から取り外す。

このとき、図１２に示される核酸増幅装置１Ａのように、加熱部１０に載置されたマイクロ流路チップ１００を加熱部１０から分離するための分離部５０を設けておくとよい。分離部５０は、加熱部１０を下降させたときにマイクロ流路チップ１００を下から押し上げるためのチップ押し上げ用アーム（第３アーム）である。分離部５０は、マイクロ流路チップ１００を分離する際にマイクロ流路チップ１００に接触する接触部として、マイクロ流路チップを加熱部１０に載置する際（初期状態）に加熱部１０よりも低い位置に存在する部分を有する。

この構成により、図１２に示すように、昇降部４０により加熱部１０を初期状態（チップセット時）の位置よりも下降させることによって、分離部５０の一部（図１２では分離部の頂部）が加熱部１０よりも高い箇所に位置することになる。これにより、マイクロ流路チップ１００の一部が分離部５０の頂部（接触部）によって押し上げられて加熱部１０から浮き上がる。したがって、マイクロ流路チップ１００を加熱部１０に密着させていていたとしても、マイクロ流路チップ１００を加熱部１０から容易に取り外すことができる。つまり、マイクロ流路チップ１００の取り出し作業を容易に行うことができる。

そして、マイクロ流路チップ１００を加熱部１０から取り外した後は、図１３に示すように、昇降部４０により加熱部１０を上昇させる。具体的には、第一工程の初期状態（チップセット時）の位置まで、マイクロ流路チップ１００を上昇させる。これにより、次に検査するマイクロ流路チップ１００を加熱部１０に載置することで、次のマイクロ流路チップ１００の検査を行うことができる。

以上、本実施の形態における核酸増幅方法では、マイクロ流路チップ１００が載置される加熱部１０と、マイクロ流路チップ１００を押さえるための押さえ部２０と、マイクロ流路チップ１００の第２開口部１２０を封止するための封止部３０と、加熱部１０を昇降させる昇降部４０とを備える核酸増幅装置１を用いて行われる。

このように、簡便な構造の核酸増幅装置１を用いることによって、マイクロ流路チップ１００を加熱部１０に押さえ付けることと第２開口部１２０を封止することとを昇降部４０で自動制御している。つまり、２つの駆動部（アクチュエータ）を用いることなく、１つの駆動部として昇降部４０を用いて、マイクロ流路チップ１００に対する押さえ部２０及び封止部３０の接離状態を制御している。これにより、簡便な構造により、マイクロ流路チップ１００を加熱部１０に押さえつけることができ、かつ、マイクロ流路チップ１００に導入する反応溶液３の送液開始のタイミングを制御することができる。

（変形例）
以上、本発明に係る核酸増幅装置及び核酸増幅方法について、実施の形態に基づいて説明したが、本発明は、上記実施の形態に限定されるものではない。

例えば、上記実施の形態において、初期状態からチップ固定状態にするために加熱部１０を１段階上昇させる工程（第二工程）と、チップ固定状態からチップ封止状態にするために加熱部１０をさらに１段階上昇させる工程（第三工程）とを別々の工程で行ったが、第二工程と第三工程とを区別することなく、第二工程と第三工程とを連続して行う１つの工程であってもよい。この場合、初期状態から押さえ部２０がマイクロ流路チップ１００を押さえて封止部３０が第２開口部１２０を封止するまで加熱部１０を上昇し続けさせればよい。

また、上記実施の形態において、昇降部４０は、加熱部１０及び押さえ部２０のうち加熱部１０を昇降させることで、押さえ部２０及び封止部３０に対して相対的に加熱部１０を昇降させたが、これに限らない。例えば、昇降部４０は、押さえ部２０を昇降させることで、押さえ部２０及び封止部３０に対して相対的に加熱部１０を昇降させてもよい。この場合、昇降部４０は、押さえ部２０だけではなく、押さえ部２０とともに封止部３０を昇降させることで、押さえ部２０及び封止部３０に対して相対的に加熱部１０を昇降させてもよい。

また、上記実施の形態において、核酸増幅装置１にセットできるマイクロ流路チップ１００の数を４つとしたが、これに限らず、核酸増幅装置１にセットできるマイクロ流路チップ１００の数は、１つであってもよいし、４つ以外の複数であってもよい。

その他、各実施の形態及び変形例に対して当業者が思いつく各種変形を施して得られる形態や、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で実施の形態における構成要素及び機能を任意に組み合わせることで実現される形態も本発明に含まれる。

１、１Ａ 核酸増幅装置
１０ 加熱部
２０ 押さえ部
２１ 支持部材
２１ａ 弾性部材
３０ 封止部
３０ｂ パッキン
３１ 支持部材
３１ａ 弾性部材
４０ 昇降部
４１ リフター
４２ アクチュエータ
５０ 分離部
１００ マイクロ流路チップ
１１０ 第１開口部
１２０ 第２開口部
１３０ マイクロ流路

Claims (11)

1. 第１開口部と第２開口部と前記第１開口部から導入された反応溶液を前記第２開口部に送液するためのマイクロ流路とを有するマイクロ流路チップを加熱することで前記反応溶液に含まれる標的核酸を増幅させるための核酸増幅装置であって、
   前記マイクロ流路チップが載置される加熱部と、
   弾性力による押圧により前記マイクロ流路チップを押さえるための押さえ部と、
   弾性力による押圧により前記第２開口部を封止するための封止部と、
   前記押さえ部及び前記封止部に対して相対的に前記加熱部が昇降するように前記押さえ部及び前記加熱部の少なくとも一方を昇降させる昇降部とを備える、
   核酸増幅装置。
2. 前記押さえ部は、前記加熱部よりも高い位置に設けられており、かつ、前記マイクロ流路チップが前記加熱部に載置された状態のときに、上面視において前記マイクロ流路チップの一部と重なっている、
   請求項１に記載の核酸増幅装置。
3. 前記封止部は、前記押さえ部よりも高い位置に設けられており、かつ、前記マイクロ流路チップが前記加熱部に載置された状態のときに、上面視において前記第２開口部と重なっている、
   請求項２に記載の核酸増幅装置。
4. 前記押さえ部及び前記封止部は、弾性変形する弾性部材を有する支持部材により支持されている、
   請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸増幅装置。
5. 前記弾性部材は、バネである、
   請求項４に記載の核酸増幅装置。
6. 前記加熱部に載置された前記マイクロ流路チップを前記加熱部から分離するための分離部を備える、
   請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸増幅装置。
7. 前記分離部は、前記マイクロ流路チップを前記加熱部に載置する際に前記加熱部よりも低い位置に存在する部分を有する、
   請求項６に記載の核酸増幅装置。
8. 前記封止部は、前記第２開口部を囲む位置に対応する環状のパッキンを有し、
   前記封止部は、前記パッキンで前記第２開口部を封止する、
   請求項１〜７のいずれか１項に記載の核酸増幅装置。
9. 前記昇降部は、前記加熱部を支持するリフターと、前記リフターを鉛直方向に昇降させるアクチュエータとを有する、
   請求項１〜８のいずれか１項に記載の核酸増幅装置。
10. 前記加熱部は、複数設けられており、
    複数の前記加熱部の各々に、前記マイクロ流路チップが載置される、
    請求項１〜９のいずれか１項に記載の核酸増幅装置。
11. 請求項１〜１０のいずれか１項に記載の核酸増幅装置を用いた核酸増幅方法であって、
    前記マイクロ流路チップを前記加熱部に載置する第一工程と、
    前記第一工程の後に、前記昇降部により前記マイクロ流路チップが載置された前記加熱部と前記押さえ部との少なくとも一方を昇降させることで、弾性力による押圧により前記マイクロ流路チップの一部を前記押さえ部で押さえる第二工程と、
    前記第二工程の後に、前記昇降部により前記マイクロ流路チップが載置された前記加熱部と前記封止部との少なくとも一方を移動させることで、弾性力による押圧により前記マイクロ流路チップの前記第２開口部を前記封止部で封止する第三工程と、
    前記第三工程の後に、前記昇降部により前記マイクロ流路チップが載置された前記加熱部と前記封止部との少なくとも一方を昇降せることで、前記封止部を前記第２開口部から離す第四工程とを含む、
    核酸増幅方法。

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