JP2009509144A - マイクロ流体アレイアッセイのためのサーマルサイクラ - Google Patents

Abstract

複数のサンプルを熱サイクルするためのシステム。このシステムは、内容積を規定する流体に密な空洞を有するケースを含む。マイクロ流体アレイが内容積の中に配置され、アレイは、１対の対向表面と、厚さと、表面の間の厚さを通る複数の通し孔とを有するシート材料を含む。熱で制御される少なくとも１つの表面を有するサーマルサイクラが、ケースに熱接触するように適合される。本発明の１つの実施形態において、上記システムは、上記熱で制御される表面に熱接触するときに、特定の位置および配向で上記ケースを保持するための位置決め機構をさらに含む。

Description

（関連出願の引用)
本出願は、米国仮特許出願第６０／６１０，０３３号（２００４年９月１５日出願、発明の名称「Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ａｒｒａｙ Ａｓｓａｙｓ」）に対する優先権を主張する。本出願はまた、米国特許出願第１０／７４４，５８０号（２００３年１２月２２日出願、発明の名称「Ａｓｓａｙ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄ Ｕｓｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ａｒｒａｙｓ」）の一部継続出願であり、この出願は、米国仮特許出願第６０／４３４，９８８号（発明の名称「Ｃｈｉｐ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ Ｃｙｃｌｉｎｇ」、１２／２０／０２出願）；米国仮特許出願第６０／４６１，５５９号（発明の名称「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｐｒｏｂｅ Ｎａｎｏｔｉｔｅｒ Ａｒｒａｙ」４／９／０３出願）；米国仮特許出願第６０／５２８，４６１号（発明の名称「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ」１２／１０／０３出願）；および米国仮特許出願第６０／４６１，５５６号（発明の名称「Ｈｉｇｈ−Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｉｎｇ ｗｉｔｈ Ｓｔａｃｋａｂｉｌｉｔｙ」４／９／０３出願）からの優先権を主張する。この段落中で挙げたこれらの特許出願の各々は、本明細書によってその全体が参考として援用される。

（技術分野）
本発明は、ナノリットルの量のサンプルをアッセイするための、可能性として高スループットのスクリーニングを達成するための、および、低容量のサンプルを高密度でアッセイする能力が所望される他の目的のための装置および方法に関する。

（背景技術）
正常および病的状態での細胞の生存、成長および分化は、変化したパターンの遺伝子発現に反映され、特定遺伝子の転写量を数量化する能力は遺伝子機能のあらゆる研究の中核をなす。ヒトゲノム配列の最近の完成および分子医学の出現により、何百もの遺伝子および何千ものサンプルにわたってＲＮＡの量を数量化するより高いスループットの技法に対する必要性が増大した。この課題に直面して、オリゴヌクレオチドおよびｃＤＮＡマイクロアレイが、何千もの遺伝子における転写の量を同時に分析するための主たる数量化ツールとして現れた。この見かけの成功にもかかわらず、マイクロアレイデータが、プラットフォーム自体からの最大の寄与による種々の供給源からのエラーを伴うということが定着してしまっている。

リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｒｔ−ＰＣＲ）は、マイクロアレイデータの質を判断して正当性を確認するための指標である。ＰＣＲ自体は、単一分子まで下がったレベルで特異的ＤＮＡ配列を複製するための忠実度の高いプロセスである。分析におけるこの汎用性により、ＰＣＲは、多くの生物学的分析法の欠かせない要素になり、近代生物学で広く普及した。ＰＣＲは、配列相補体までハイブリダイズした１対のオリゴヌクレオチド配列（プライマ）によって確定される核酸配列（標的）の生体外での指数関数的な複製のための、温度調節された酵素増幅である。動的またはリアルタイムＰＣＲは、コピー数を伴う蛍光性の増幅信号の較正によりテンプレートＤＮＡのコピー数を定量化する。増幅信号がバックグラウンドよりかなり上のレベルに到達すると、蛍光またはサイクル数（Ｃ_Ｔ）が記録されて、この遺伝子の較正された標準曲線に基づいてテンプレートのコピー数に変換される。ＲＮＡの定量化には、リアルタイムＰＣＲ方法の適用の前に、ＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写が必要となる。

ＰＣＲは、９６または３８４ウェルマイクロプレートで行われる溶液相アッセイであり、従来の技術を用いた高スループットを達成するためのＰＣＲのスケール変更は、費用対効果がよいわけではなく、効率的でもない。その結果、必然的に、より多くの回数のＰＣＲアッセイを、データの質を妥協することなく、すなわち、言い換えると、高スループットの転写解析のための単一のマイクロ流体素子内において、マイクロアレイの並列性にｑＰＣＲの定量化、感度、ダイナミックレンジおよび特異性を組み合わせるために、より小さな反応体積内で同時に実施することができるかどうかを考慮するのが自然である。

マイクロリットル未満までのＰＣＲ反応体積の小型化により、高価な試薬の消費が低下し、反応体積の低減したサーマルマスのために増幅時間が減少する。シリアルまたはパラレルアレイのどちらかの処理手法により分析のスループットをスケール変更することにより、計画の選択に融通性が与えられる。これらの属性は、１つのマイクロプレートにおいて、低量のＰＣＲシステムからのデータの質が、より大きい量の反応、典型的には５〜１０μＬからのデータの質と等しくなるという要求に対してつり合いが保たれなければならない。このレベルの効率に達することにおける重大な課題は、熱サイクルをするならびにサンプルおよびプライマを装填する間の蒸発および隣接する容器間での流体のクロストークを防止するための反応体積の物理的な隔離である。同様に、相互汚染なしでの、１つのマイクロプレート内での個々のマイクロコンテナとウェルとの間でのプライマ対、サンプルおよびＰＣＲ試薬の液体伝達のための簡便法も重要である。減少された量でのＰＣＲアッセイの質に影響する別の要因は、増大された表面積の対体積比である。ＰＣＲの化学反応および運動性を付勢する表面相互作用は、最小化された反応性のための浸水表面の工学コーティングによって、または、表面を遮断する薬剤の補償を包含することによるＰＣＲの再配合によって緩和することができる。

小さい体積には、大きい体積より熱サイクルが速いという利益があるが。というのは、高い表面積の対体積比により、高速の熱伝達が促進されるからである。シリコンまたは金属のような高熱伝導性で低比熱の材料でのマイクロウェル構造体の製造により、低い熱伝導性および高い比熱を有する標準的なマイクロプレート熱可塑性樹脂での熱サイクル時間よりも短い熱サイクル時間が可能になる。

ＰＣＲのスループットを増大させるためのおよびコストを最小化するための計画は、典型的には、２部からなる手法：増幅のために必要となる反応体積を減少させること、および、所与の時間を超えて実行される反応の数を増大させること、に従う。平行のマイクロ流体アッセイアレイは、この計画を実施するための１つ方式であり、このようなアレイの１つの例として、マイアミ州、ウォーバーン（Ｗｏｂｕｒｎ）のからバイオトローブ，インコーポレイテッドから市場に出ているリビングチップ（ＬｉｖｉｎｇＣｈｉｐ）（商標）がある。機能および目的において、リビングチップ（ＬｉｖｉｎｇＣｈｉｐ）（商標）は、高スループットのスクリーニングおよび診断に現在使用されている９６および３８４ウェルマイクロタイタープレートと類似している。しかし、リビングチップ（ＬｉｖｉｎｇＣｈｉｐ）（商標）の各サンプルウェルに保持される約３３ｎｌのサンプル量は、９６ウェルプレート内の量のおよそ２０００分の１であり、３８４ウェルプレートのおよそ２００分の１である。

図１に、典型的な通し孔のマイクロ流体アレイの切取り図を示す。このようなアレイは、例えば、特許文献１および特許文献２に記載されており、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。サンプルアレイ１０は、１対の対向表面、および厚さを有する材料シート１４を含む。材料シート１４はプラテンであってよく、そうでない場合は、本明細書ではチップと称されてよく、例えば、導電性シリコンから作られてよく、あるいは、金属、ガラスまたはプラスチックなどの別のタイプの剛性材料から作られてよい。多数の通し孔１２（本実施形態では、１ｍｍ当たり２個の通し孔の密度で最大３０７２個の通し孔）が、一方の表面から他方の対向する表面（図示せず）までの厚さを通っている。

サンプルアレイ１０は、典型的には、０．１ｍｍから１０ｍｍを超える厚さ、例えば、およそ０．３から１．５２ｍｍの厚さであってよく、一般には０．５ｍｍである。通し孔１２の典型的な体積は、０．１ピコリットルから１マイクロリットルであってよく、一般的な体積は、０．２〜１００ナノリットルの範囲にあり、例えば約３３ナノリットルである。毛管作用または流体サンプルの表面張力は、サンプルを通し孔１２に導入するのに使用することができる。典型的なチップ寸法の場合、毛管力は、流体を定位置に保持するのに十分な強さである。サンプル溶液が装填されたチップは、空気中で揺り動かすことができ、サンプルを変位させることなく、中程度の速度で遠心することさえできる。

通し孔１２の吸上げパワーを増強するために、レセプタクル内部壁１３の標的領域は、流体サンプルを引き付ける親水性表面を有することができる。この表面は生体適合性であり、不可逆的には生体分子（例えば、タンパク質および核酸）に結合しないことが時折望ましいが、結合することはいくつかのプロセス（例えば、サンプルの精製および／または保管）に有用である場合がある。別法として、サンプル通し孔１２は、サンプル流体を引き付ける多孔性親水性材料を含むことができる。相互汚染（クロストーク）を防止するため、チップ１０の外平面およびサンプル通し孔１２の開口周囲の材料１５の層は、疎水性材料製であってよい。したがって、各々のサンプル通し孔１２は、いずれかの末端が疎水性領域によって境界付けられた内部親水性領域を有する。

通し孔１２の使用は、端部閉鎖ウェル構造体と比較して、他のマイクロプレート構造体に固有の閉じ込められた空気の問題を軽減する。疎水性および親水性のパターン形成を共に用いた通し孔の使用により、サンプル通し孔１２の自己計量される装填が可能になる。自己装填の機能性は、予め装填された試薬を有するアレイの製造を助け、水性サンプル材料と接触される場合にアレイがアレイ自身を充填することも助ける。

マイクロ流体アレイ上でＰＣＲを実行する場合、一連の加熱および冷却サイクルが、少量のＤＮＡをより大きな量に複製するのに使用される。ペルチェ装置などのサーマルサイクラを、このような一連の加熱および冷却サイクルを引き起こすのに使用することができる。リアルタイムＰＣＲの方法を実施するには、各反応容器（または、複数の容器）からの蛍光が、それぞれの加熱および冷却サイクルにおいて所定の温度で記録される必要がある。リアルタイムＰＣＲ方法の実施においてマイクロ流体アレイの適切な熱サイクルを確実にするため、種々の事象が起こる。これらには：サンプルの損失および／または汚染の防止すること；マイクロ流体サンプリングアレイの各通し孔から同時に放射される蛍光の正確および精密な記録を可能にするための、１つ以上のマイクロ流体サンプリングアレイのサーマルサイクラ上への適切な配置および位置決めすること；多くの通し孔から蛍光を同時に正確かつ精密に記録すること；自動化システムでの蛍光の記録を伴う熱サイクルを調整すること；マイクロ流体サンプリングアレイとサーマルサイクラとの熱接触を最適化すること；ならびに例えばシステム内の任意の光学要素上での凝縮または任意のマイクロ流体アレイでのＰＣＲ反応の阻止作用を防止する目的で、蒸発したあらゆる流体の漏れを防止することが含まれる。
米国特許第６，３８７，３３１号明細書 米国特許出願公開第２００２００９４５３３号明細書

（発明の要旨）
本発明の第１の実施形態では、分析のためのサンプルおよび試薬の少なくとも１つを保持するためのシステムを提供する。このシステムは１対の平行カバーを含む。少なくとも１組の１対の平行カバーは透光性であり、この対のうちの一方の透光性カバーが上部を形成し、他方が底部を形成する。フレームが、カバーに対して内容積を規定するためにカバーの間に配置される。フレームおよびカバーは互いに連結されて、流体に対して実質的に密であるケースを形成する。マイクロ流体アレイは、内容積の中に配置される。アレイは、１対の対向表面と、厚さと、表面の間の厚さを通る複数の通し孔とを有するシート材料を含む。通し孔は、サンプルおよび試薬の少なくとも１つを含む。

本発明の別の実施形態によると、分析のためのサンプルおよび試薬の少なくとも１つを保持するためのシステムを提供する。このシステムは１対の平行カバーを含み、それらの少なくとも１つは透光性であり、これは、透光性カバーが上部を形成し、他方が底部を形成する対である。フレームが、カバーに対して内容積を規定するためにカバーの間に配置される。フレームおよびカバーは互いに連結されてケースを形成する。ケースは、密封されているときにケースを流体に対して実質的に密にする密封可能な開口を含む。マイクロ流体アレイが内容積の中に配置され、これは、開口を介して取外し可能である。アレイは、１対の対向表面と、厚さと、表面の間の厚さを通る複数の通し孔とを有するシート材料を含む。通し孔は、サンプルおよび試薬の少なくとも１つを含む。

本発明のさらなる別の実施形態によると、複数のサンプルに対してアッセイを実行する方法を提供する。マイクロ流体アレイが用意される。このアレイは、１対の対向表面と、厚さと、表面の間の厚さを通る複数の通し孔とを有するシート材料を含む。通し孔のそれぞれは、１つのサンプル、および、アッセイのための光学効果をもたらす少なくとも１つの試薬を含む。アレイは、流体に対して実質的に密であるケース内に配置される。ケースは１対の平行カバーを含み、それらの少なくとも１つは透光性であり、これは、透光性カバーが上部を形成し、他方が底部を形成する対である。フレームが、アレイを受けるための内容積をカバーに対して規定するためにカバーの間に配置される。それぞれの通し孔の中の対応するサンプルは、通し孔の中の少なくとも１つの試薬と反応することが可能である。各通し孔に対して付随する光学効果をもたらす上部カバーを介して測定が行われ、この測定は、通し孔の中の対応するサンプルに対してのアッセイの結果を得るのに使用される。

本明細書に記載する本発明に関連する種々の実施形態では、スペーサ手段が、ケースの少なくとも１つのカバーとアレイの少なくとも１部分とを間の空間を保証するために用意される。上部カバーおよびスペーサ手段は、上部カバーの上側表面からアレイの近接する表面までが０．５ｍｍ未満の距離を実現するような寸法形状となされている。スペーサ手段は、（ｉ）アレイおよび（ｉｉ）少なくとも１つのカバーの１つに付けられる複数のビーズもしくはポスト、ならびに／または、アレイの規定された１セットの位置を超える、アレイの厚さの増大を含んでよい。１つ以上の位置決めガイドレールを、（ｉ）フレームおよび（ｉｉ）少なくとも１つのカバーの少なくとも１つに付けることができる。アレイは、各通し孔の開口に凹部を含むことができ、この凹部は、各通し孔内の流体が、これらの各通し孔が近接しているカバーに接触するのを防止する。ケースの寸法は、約２５×７６×＜２ｍｍであってよく、ケースが顕微鏡スライドのおよそのサイズおよび形状を有するようにする。ケースのフレームは、グリースなどの自己密封材料で充填される孔を規定する壁を含んでよく、フレームは、シリンジが貫通することができるガスケットであってよい。フレームおよびカバーは、エポキシまたは他の接着剤によって一体に結合されてケースを形成することができる。種々の実施形態において、フレームは、接着性ガスケット（ａｄｈｅｓｉｖｅ ｇａｓｋｅｔ）および／または圧縮ガスケットであってよく、あるいは、それらを含んでよい。

本明細書に記載する発明に関連するさらなる実施形態では、漏斗形ガイドをケースに結合することができ、漏斗形ガイドおよびケースの開口にアレイを通過させることにより、アレイをケース内に挿入することができる。漏斗形ガイドは、着脱自在にケースに取り付けられることができる。漏斗形ガイドは、スリットを規定する壁を含んでよく、アレイがそのスリットを通過することができるようにする。アレイがないときは、例えば界面エネルギーのおかげで、液体がスリットを通過するのを実質的に防止することができる。スリットを規定する壁は、アレイがスリットを通過するのを可能にするために変形できてよく、例えばプラスチックで作られてよい。スリットは、開かれるおよび閉じられることができてよい。漏斗形ガイドは、サンプルおよび試薬の少なくとも１つを拡散するためのブラシを含んでよい。透光性である少なくとも１つのカバーは、曇りを防止するために親水性層でコーティングされてよい。フレームおよびカバーの少なくとも１つは、アレイの装填の間にサンプルの拡散を促進するための親水性のストリップを含んでよい。アレイおよびケースの少なくとも１つは、バーコードなどの識別子を含んでよい。

本発明の別の実施形態は、熱サイクル装置および対応する方法を含む。流体分配システムが、第１の制御された温度と少なくとも第２の制御された温度との間で選択することができる、温度が制御された流体の流れを展開する。サンプルプレートカートリッジが、高密度のマイクロ流体サンプルプレートを保持するための空洞を有する。サイクリングヘッド（ｃｙｃｌｉｎｇ ｈｅａｄ）が、サンプルプレートカートリッジを保持し、サンプルプレートカートリッジ全体に流体の流れを分配する。

さらなる実施形態は、流体の流れの温度を感知するための熱センサを含むことができる。サンプルプレートカートリッジはまた、サンプルプレートを覆う少なくとも１つの透明カバーを含むことができ、サイクリングヘッドは、サンプルプレート内のサンプルを撮像するように配置される少なくとも１つの透明窓を含むことができる。ペルチェ装置が、流体の温度を制御するためにサイクリングヘッドに連結されてよい。

サイクリングヘッドは、サンプルプレートカートリッジの垂直配向のために調節することができる。サンプルプレートカートリッジは、サンプルプレートを保持するためのガイドレール構成を含んでよく、および／または、複数のサンプルプレートを保持可能であってもよい。別法としてまたは加えて、サイクリングヘッドが、サンプルプレートカートリッジを保持するためのガイドレール構成を含んでよい。

サンプルプレートカートリッジまたはサイクリングヘッドは、サンプルプレートカートリッジ全体に流体の層流を分配するように適合されてもよい。サイクリングヘッドは、サンプルプレートカートリッジ全体での流体の均一の流れを促進するための流量調整弁を含むことができる。流量調整弁は、サンプルプレートカートリッジの上流にあるサイクリングヘッド内に流れ絞り弁または流れ入口空洞を含むことができる。（水溶液のサンプルの場合に）ペルフルオロ化炭化水素液などのサンプルと非混和性のある量の流体は、挿入されたサンプルプレートを覆うためにサンプルプレートカートリッジ空洞内に供給することができる。

一実施形態では、サンプルプレートは、複数の通し孔によって接続される上面および底面を含むことができ、サンプルプレートカートリッジは、連結された上部カバーおよび底部カバーを含むことができる。このような実施形態では、サンプルプレートカートリッジおよびサイクリングヘッドは、流体の流れが、上部カバーおよび底部カバーの両方にわたって分配されるように適合されてもよい。

本発明の別の実施形態では、通し孔の高密度のマイクロ流体アレイを有するプラテンを含むマイクロ流体アレイを対象とする。生物適合性および／または親水性のコーティングが、アレイの少なくとも１つの通し孔ウェルの壁に結合される。通し孔へ導入されるサンプルのヌクレオチド配列を増幅させるためのプライマが、コーティング内に封入される。コーティングは、共有結合してあるいは乾燥して通し孔の内壁になることできる。生物適合性の材料は、ポリエチレングリコールなどのポリマーであってよい。プライマは、ＰＣＲアッセイ用であってよい。ポリマーの第２の層は、コーティングの上部に添加することができる。種々の実施形態において、アレイは、各通し孔を他の通し孔から隔離するために、各通し孔の開口周囲に疎水性材料の層を有することができる。プラテンは、各通し孔内での所望の化学反応を促進するために、別のプラテンと積み重なるように配置することができる。

種々の実施形態において、核酸を含有するサンプルは、ハイブリダイズしたサンプルのアレイを形成するために、捕捉プローブを有するアレイを含むサンプルプラテンに導入することができる。次いで、ＰＣＲ配列決定を、ハイブリダイズしたアレイ上で実施することができる。いくつかの実施形態では、これは、通し孔の高密度のマイクロ流体アレイを有する第２の試薬プラテンを設けることを含んでよく、ここでは、各通し孔がある量のＰＣＲ試薬を含んでおり、さらに、試薬プラテンが、サンプルプラテンに対応する構造的ジオメトリを有している。次いで、１つのプラテンを、ＰＣＲ試薬をハイブリダイズしたアレイ内のサンプルに分配するために、他のプラテンの上部に積み重ねることができる。種々の実施形態において、ハイブリダイズしたアレイは、積み重ねられる前に、非特定的に結合されている核酸を除去するために緩衝剤で洗浄することができる。

本発明の別の代表的な実施形態は、熱サイクルのためのマイクロ流体アレイを含む。プラタンは、生物適合性および／または親水性コーティングを含むアレイの通し孔の開口周りに疎水性材料の層を有しており、少なくとも１つの通し孔が、共有的にあるいは非共有的に固定化されたアッセイのための核酸成分を含む。核酸成分は、疎水性ポリマー内で、および／または、アッセイの間に溶融する溶融ポリマー内で固定化されてよく、少なくとも１つの通し孔の中の溶液内へ核酸成分を放出するようにする。例えば、ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をベースにしてよい。核酸成分は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイのためのプライマまたはプローブであってよい。

生化学アッセイの相当する方法は、核酸を含有するポリマー溶液を通し孔の高密度のマイクロ流体アレイ内の少なくとも１つの通し孔の中へ装填することから始め、このアレイは通し孔の開口を囲む疎水性材料の層を有しており、各通し孔は親水性材料を含んでいる。次いで、溶液は乾燥されて、核酸成分が少なくとも１つの通し孔内で固定化される。

この方法は、少なくとも１つの通し孔の中へ核酸の標的成分を装填、次いで、アレイの熱サイクルおよびＰＣＲアッセイの実施をさらに含んでよい。装填は、核酸の標的成分を含有する溶液内へアレイを浸漬することに基づいてよく、次いで、溶液からアレイを引き出す。別法として、核酸の標的成分は、少なくとも１つの通し孔内にピペットで移すことができ、あるいは、核酸の標的成分を含有する溶液の一滴を、少なくとも１つの通し孔の開口に対して移動させることができる。熱サイクルは、温度制御された流体の流れを展開させることと；高密度のマイクロ流体サンプルプレートを保持するための空洞を有するサンプルプレートカートリッジ内にアレイを装填することと；サンプルプレートカートリッジ全体に温度制御された流体の流れを分配することとを含んでよい。

本発明の別の実施形態によると、生化学アッセイの構造体および方法は、通し孔のマイクロ流体アレイを有するチップを含む。通し孔は：個々の通し孔内へ導入される液体サンプルからの１つ以上の対象の標的の捕捉と；捕捉された１つ以上の標的の化学的処理とのために適合される。

本発明の関連する実施形態では、標的の捕捉は、核酸プローブなどの、個々の通し孔内で固定化された捕捉構造体に基づいてよい。捕捉構造体は、タンパク質、抗体および／またはアプタマーであってよい。捕捉構造体は、共有的に固定化することができる。捕捉構造体は、抗体類、タンパク質類、ペプチド、ペプチド核酸およびオリゴヌクレオチドから選択することができる。化学的処理は、捕捉された１つ以上の標的の増幅を含んでよい。増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の増幅および逆転写の少なくとも１つを含んでよい。化学的処理は、捕捉された１つ以上の標的からの信号の検出を含んでよい。化学的処理は、捕捉された１つ以上の標的に対して特異的であってよい。構造体は、標的の病原体の溶解あるいはＥＬＩＳＡ分析を実施するように適合されてもよい。個々の通し孔は、標的の捕捉または化学的処理のための少なくとも１つの試薬を含有するワックスの層を含んでよい。ワックスは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含んでよく、および／または、４０℃を超える融点を有してよい。個々の通し孔は、少なくとも１つの層が少なくとも１つの試薬を含有する、ワックスの複数の層を含んでよい。ワックスの各層は、異なる融点および／または異なる試薬を有してよい。通し孔の表面は、バイオ分子への結合を回避するために生物適合性であってよい。

本発明に関連するさらなる実施形態では、アッセイ構造体および／または方法は、通し孔のマイクロ流体アレイを有する第１のチップ層および通し孔のマイクロ流体アレイを有する第２のチップ層をさらに含んでよい。第１のチップ層および第２のチップ層は、それぞれの通し孔が位置合わせされるように固定的に結合される。個々に位置合わせされた通し孔は、例えば、標的の捕捉および化学的処理のために適合されてもよい。第１および第２のチップ層は、接着剤、ねじ、ボルト、リベットおよび／または締め金によって結合することができる。

本発明の別の実施形態によると、複数のサンプルに対してのアッセイの実行方法は、１００を超えるサンプル部分を有するサンプルアレイ内の各サンプル部分でアッセイを実施することを含む。各アッセイは光学効果をもたらす。サンプル部位のそれぞれは、各部分の光学効果に関する画像データを生成するために同時に撮像される。

本発明の関連する実施形態では、サンプルアレイは、５００を超えるサンプル部分または１６００を超えるサンプル部分を有する。アッセイの実施は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による複製サイクルを実施することを含んでよい。撮像は、各複製サイクル間において各サンプル部分を同時に撮像することを含むことができる。各サンプル部分を、１つ以上のＬＥＤを使用して同時に照射することができる。この方法は、画像データを分析することをさらに含んでよい。

本発明の別の実施形態では、複数のサンプルに対するアッセイの実行方法は、サンプルアレイ内の複数のサンプル部分のそれぞれにおいてアッセイを実施することを含んでおり、このサンプルアレイは、２０ｍｍ^２につき１つのサンプル部分を超えるサンプル部分密度を有する。各アッセイは光学効果をもたらす。サンプル部分のそれぞれは同時に撮像され、各部分の光学効果に関する画像データが生成される。

本発明の関連する実施形態では、アッセイの実施は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による複製サイクルの実施を含む。撮像は、各複製サイクル間において各サンプル部分を同時に撮像することを含むことができる。各サンプル部分を、１つ以上のＬＥＤを使用して同時に照射することができる。この方法は、画像データを分析することをさらに含んでよい。

本発明の別の実施形態によると、複数のサンプルに対するアッセイの実行方法は、サンプルアレイ内の複数のサンプル部分のそれぞれにおいてアッセイを実施することを含む。各アッセイは光学効果をもたらす。各サンプル部分を、１つ以上の有色ＬＥＤを使用して同時に照射される。また、サンプル部分のそれぞれは同時に撮像され、各部分の光学効果に関する画像データを生成する。

本発明の関連する実施形態では、アッセイの実施は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による複製サイクルを実施することを含んでよい。各サンプル部分は、各複製サイクルの間に同時に撮像することができる。この方法は、画像データを分析することをさらに含んでよい。

本発明の別の実施形態によると、複数のサンプルに対してアッセイを実行するシステムは、内容積を規定する流体密封の空洞を有するケースを含む。マイクロ流体アレイが内容積の中に配置され、このアレイは、１対の対向表面と、厚さと、表面の間の厚さを通る複数の通し孔とを有するシート材料を含む。サーマルサイクラは、熱でケースに接触するように適合される。

本発明の関連する実施形態では、サーマルサイクラは、ケースへの熱による接触のために熱で制御される少なくとも１つの表面を有する平坦なブロックであってよい。熱で制御される表面は、平坦であってよく、さらに、照射されて撮像することができる領域を有してよい。照射されて撮像される領域は、マイクロ流体アレイと少なくとも同じ範囲であってよい。サーマルブロックは、照射されて撮像される領域に対してのマイクロ流体アレイの位置決めを視覚的に示すための印、および／または、熱で制御される表面上の固定された位置でマイクロ流体アレイを位置決めするための位置決め機構を含んでよい。位置決め機構は、熱で制御される表面上にくぼみを含んでよい。くぼみは傾斜表面を含んでよく、マイクロ流体アレイがくぼみに滑り込むことができるようにする。位置決め機構は、照射されて撮像される領域内にマイクロ流体アレイを配置するためにマイクロ流体アレイが接して位置決めされる隆起領域を含んでよい。熱伝達パッドは、ケースと熱で制御される表面との間に位置決めすることができる。

さらなる関連する実施形態では、システムは、少なくとも１つの特定の波長でマイクロ流体アレイを照射するための照射源を含んでよい。照射源は、通し孔のそれぞれを同時に照射することができてよい。照射源は少なくとも１つのＬＥＤを含んでよい。照射源は、マイクロ流体アレイおよびカメラに関連して配向される複数のＬＥＤを含んでよく、カメラに入るマイクロ流体アレイからの正反射が実質的になくなるようにする。少なくとも１つのＬＥＤは、励起フィルタによってフィルタ処理することができる。

別のさらなる関連する実施形態では、撮像装置は、通し孔のそれぞれを同時にあるいは順番に画像化して画像データを供給することができる。撮像装置は、例えば、カメラまたはスキャナであってよい。照射源は、撮像装置からの軸外に、アレイに対して対称に位置決めされる少なくとも２つの照射源を含んでよい。システムは、画像データを処理するためのプロセッサをさらに含んでよい。

本発明の別のさらなる実施形態では、ケースは、１対の平行カバーを含んでよく、それらの少なくとも１つは透光性であり、これは、透光性のカバーが上部を形成し、他方のカバーが底部を形成する対である。カバーの間に配置されるフレームが、カバーに対して、内容積と、フレームと、ケースを形成するために互いに連結されるカバーとを規定する。浸漬液は、内容積の中に配置することができる。

さらなる関連する実施形態では、サーマルサイクラが、装填またはサーマルブロックからの除去の前にマクロ流体アレイを配置するための、滑らかな表面であってよいデッキを含むことができる。デッキは、マイクロ流体アレイが配置することができる縁部を含むことができ、その上で、マイクロ流体アレイが、平坦なブロックの熱で制御される表面上へ回転することができる。サーマルサイクラは、マイクロ流体アレイをサーマルブロックに押圧するための指要素を含んでよい。指要素は、ケースと平坦なブロックとの熱接触を改良するのを助け、さらに、熱サイクルの間にケースが照明されて撮像される領域に対して移動するのを防止するのを助ける。指要素は可撓性であってよい。指要素は絶縁材料でコーティングされてよい。サーマルサイクラはリッド組立体を含んでよい。リッド組立体は指要素を含んでよい。指は、リッド組立体が閉じる前にマイクロ流体アレイに接触することができ、リッド組立体が閉じているときに力がマイクロ流体アレイに加えられるようにする。指要素は、リッド組立体の一部でなくてよく、リッドが閉じる前にケース上に配置されてよい。指要素は、１つ以上の点でケースに接触してよい。

関連する別のさらなる実施形態では、リッド組立体は、閉じているときにリッド組立体を密封するためのガスケットを含んでよい。リッド組立体は、リッド組立体の開または閉を制限する１つ以上の止め具を含んでよい。リッド組立体は、レンズを有することができる光学窓を含んでよい。１つ以上の温度制御要素が、サーマルブロックの温度を測定することができ、さらに、温度に応じてサーマルブロックの温度を制御することができる。温度制御ユニットは、比例積分微分（Ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｔｅｇｒａｌ ａｎｄ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ（ＰＩＤ））型の温度制御を実現する。温度制御ユニットは、サーマルブロックとマイクロ流体アレイとの間での昇温速度を補正するための補正値を含んでよい。温度制御ユニットはスローランプ形式を含んでよい。アレイは、１００を超える通し孔および／または２０ｍｍ^２につき１つの通し孔を超える通し孔密度を有してよい。

本発明の別のさらなる実施形態では、システムは、サーマルサイクラ、撮像装置および照射装置が中に位置決めされている筐体を含んでよい。筐体は、撮像を実施しているときに実質的に光を通さないようにすることができてよい。筐体は、マイクロ流体アレイを装填および除去するための扉を含んでよい。システムは、扉が閉じているときに照射源が作動するのを防止するための照射制御要素を含んでよい。

本発明の別の実施形態によると、複数のサンプルを熱サイクルする方法は、ケース内の流体に密な空洞の中にマイクロ流体アレイを保持することを含み、アレイは、１対の対向表面と、厚さと、表面の間の厚さを通る複数の通し孔とを有するシート材料を含む。ケースは熱で制御される表面に熱接触して配置される。

本発明の別の実施形態によると、システムは、内容積を規定する流体に密な空洞を有するケースを含む。マイクロ流体アレイは内容積の中に配置され、アレイは、１対の対向表面と、厚さと、表面の間の厚さを通る複数の通し孔とを有するシート材料を含む。システムは、それぞれの通し孔を同時に照射するための照射源、および、画像データを生成するためにそれぞれの通し孔を同時に撮像するためのカメラをさらに含む。

本発明の関連する実施形態では、照射源は、少なくとも１つの発光ダイオード（ＬＥＤ）を含む。少なくとも１つのＬＥＤは有色ＬＥＤであってよい。励起フィルタが少なくとも１つの有色ＬＥＤをフィルタ処理してよい。少なくとも１つのＬＥＤは、カメラからの軸外に、アレイに対して対称に位置決めされてよい。カメラは、電荷結合装置（ＣＣＤ）または相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）カメラのうちの１つであってよい。システムは、カメラに入る光をフィルタ処理するための発光フィルタを含んでよい。アレイは、１００を超える通し孔、または、５００を超える通し孔、または、１６００を超える通し孔を有してよい。アレイは、２０ｍｍ^２につき１つの通し孔を超えるあるいは２５ｍｍ^２につき１つのサンプル部分を超える通し孔密度を有してよい。種々の実施形態において、システムは、画像データを分析するためのプロセッサをさらに含むことができる。

本発明の別の実施形態によると、分析のためのサンプルおよび試薬の少なくとも１つを保持するためのシステムは、少なくとも１つが透光性である１対の平行カバーを含み、これは、透光性のカバーが上部を形成し、他方が底部を形成する対である。フレームが、内容積と、ケースを形成するために互いに連結されるフレームおよびカバーとをカバーに対して規定するためにカバーの間に配置される。ケースは密封可能な開口を有しており、この開口は、密封されているときにケースを液体に対して実質的に密にする。マイクロ流体アレイが内容積の中に配置され、これは、開口を通して取外し可能である。アレイは、複数のサンプル部分を有するシート材料を含んでおり、サンプル部分はサンプルおよび試薬の少なくとも１つを含む。

本発明の関連する実施形態では、アレイは、各サンプル部分の開口を囲む疎水性の表面を含んでよい。サンプル部分は、サンプルおよび試薬の少なくとも１つを引き付ける親水性の表面を含んでよい。シートは、１対の対向表面および厚さを有してよく、サンプル部分は、表面の間の厚さを通る複数の通し孔を含む。サンプル部分は、端が閉じている複数のウェルを含む。少なくとも１つの透光性のカバーは、曇りを防止するために疎水性層でコーティングされてよい。アレイは各サンプル部分に凹部のある開口を有してよく、この凹部は、各サンプル部分内の流体が、これらの各サンプル部分が近接しているカバーに接触するのを防止する。システムは、ＵＶで硬化可能なシーリング剤および開口を密封するためのグリースの１つをさらに含んでよい。フレームおよびカバーは、エポキシまたは他の接着剤の少なくとも１つによって一体に結合されてケースを形成することができる。フレームは、接着性ガスケットまたは圧縮ガスケットであってよく、または、それらを含んでよい。フレームは穴あけ可能であってよく、孔を規定する壁と、例えばグリースであってよい自己密封材料で充填された孔とを含むことができる。システムは、ケースに結合された漏斗形ガイドをさらに含み、アレイは、漏斗形ガイドおよび開口にアレイを通すことによりケース内に挿入することができる。漏斗形ガイドは、着脱自在にケースに取り付けられることができる。漏斗形ガイドは、スリットを規定する壁を含んでよく、アレイがそのスリットを通過することができるようにする。アレイがないときは、少なくとも部分的には界面エネルギーのおかげで、液体がスリットを通過するのを実質的に防止することができる。スリットを規定する壁は、アレイがスリットを通過するのを可能にするために変形されることができてよい。漏斗形ガイドは、サンプルおよび試薬の少なくとも１つを拡散するためのブラシを含んでよい。フレームおよびカバーの少なくとも１つは、アレイの装填の間にサンプルの拡散を促進するための親水性のストリップを含んでよい。

（特定の実施形態の詳細な説明）
定義
この説明および添付の特許請求の範囲で使用される場合、文脈が他のことを要求していない限り、以下の用語は指定された意味を有する：
「標的」は、対象の、任意の分子、核酸、タンパク質、ウィルス、細胞、または細胞状構造体であってよい。

「マイクロ流体アレイ」は、１０００ナノリットル以下の液体サンプルを保持するための任意の規則正しい構造体を指す。

本発明の実施形態は、マイクロ流体サンプルアレイを使用したサンプル液のアッセイのための装置および方法を対象とする。例えば、マイクロ流体サンプルアレイの、閉じ込め、装填、積み重ね、温度サイクリング、および、撮像のための種々の技法が提示される。本発明の別の実施形態は、捕捉、捕捉された標的の化学的処理、および／または、液体サンプルの多機能性処理にサンプルアレイの個々の通し孔を適合させることを含む。種々の実施例および実施形態を以下で詳細に考察する。

ケースに入れられるマイクロ流体アレイ
図２は、本発明の実施形態による、複数の通し孔および／またはウェルを含んでよいマイクロ流体サンプルアレイのためのケースの分解斜視図である。ケースは、フレーム２１、上部２２および底部２３を含み、これらは作動中に互いに密封する関係で配置されて、ケースが液体に対して実質的に密になりようにしており、さらに好適な実施形態では、これらは、水と混和しない鉱油またはペルフルオロ化液などの低界面エネルギーの流体に対して不浸透性である。これらの条件下で、前述の構成要素は、マイクロ流体サンプルアレイが中に配置される内容積２４を規定する。

上部２２および底部２３の少なくとも１つは、透光性であることが有利である場合があり、種々の実施形態において、上部および底部の両方は透光性である。上部および／または底部の透光性は、アレイがケースの内容積２４の中に配置されているときのアレイの個々の通し孔の光による読取りを促進する。曇りを防止するために、上部２２または底部２３の少なくとも１つが親水性層でコーティングされてよい。

いくつかの実施形態では、図２のケースが、顕微鏡スライドすなわち２５ｍｍ×７５ｍｍ×＜２ｍｍ（図２に示すＷ×Ｌ×Ｈの寸法に相当する）のおよその寸法を有し、ケースが顕微鏡スライド用操作装置により取り扱うことができるようにすることが望ましい。ケースの自動化された取り扱いを容易にするために、ケースは機械的に頑丈であることが望ましい。また、マイクロ流体アレイを用いて内容積の中に「カプセル封入」をセットすることがしばしば有用である。「浸漬液」という用語は、「浸漬液」という用語と互換性をもつように使用されて、カプセル封入用の流体が、必ずというわけではないが、アレイの通し孔の間で隔離を形成するのを助けることが有利である場合があるが、どちらかといえば、サンプルの蒸発を防止することとアレイ全体で温度を一様に維持することとを助けることができる、ということを表す。この流体は、水と混和しないことが望ましく、さらに、アレイの通し孔に配置されてよい反応物および分析対象物質と実質的に反応しないことが望ましい。単独または組合せで使用されてよい典型的な浸漬液は、限定しないが、鉱油と、シリコン油と、ペルフルオロ化アルカン（３Ｍから、電気試験用流体としての使用のために販売されているフロリナート（Ｆｌｕｏｒｉｎｅｒｔ）など）、または、ペルフルオロ化ポリエーテル（それぞれ、ソルベイ ソレクシス（Ｓｏｌｖａｙ Ｓｏｌｅｘｉｓ）（ニュージャージー州、ソロフェア（Ｔｈｏｒｏｆａｒｅ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ））およびデュポン（ＤｕＰｏｎｔ）（デラウェア州、ウィルミントン（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｄｅｌａｗａｒｅ））から、真空ポンプ用潤滑剤を含めた目的のために市販されている、例えばフォンブリン（Ｆｏｍｂｌｉｎ）（登録商標）およびクライトックス（Ｋｒｙｔｏｘ）（登録商標））などのペルフルオロ化炭化水素またはペルフルオロ化炭化水素の混合物を含む。種々の実施形態において、浸漬液は１を超える比重を有することが望ましい。種々の実施形態において、ケースは、内部圧力の変化を生み出す熱サイクルおよび場合によっては化学反応を含んでよいアッセイ条件にさらされるときは、密封されていることが望ましく、さらに、ケースは、予期される圧力変化の範囲にわたって寸法的に安定していることが望ましい。アッセイの温度範囲全体において浸漬液が液体のままでいることが望ましい場合があるが、これは、浸漬液が室温で実質的に不揮発性であり、室温より低い凝固点を有し、さらにアッセイで使用される最高温度（典型的には、ＰＣＲの場合は９５℃）より高い沸点を有することを必要とする。ハロゲン化された流体は、典型的には、サンプルの蒸発が他の流体よりも少なく、ＰＣＲに特に有用である。

以下で、さらに詳細に考察するように、多くの例において、アレイの内容積の中へのアレイの挿入およびアレイの挿入後の密封を可能にするために、ケースの６つの側面の１つが開いたままであるような形でケースを形成することが望ましい。これを行うための好都合な方式は、例えば、アレイの挿入を可能にするために全幅の１つの側面に沿って開いているＵ形のフレーム２１を作ることである。アレイの挿入後、フレームの残りの区間（および、ケースの開いた側面）を密封することができる。別法として、フレームの１つの側面にアレイの挿入を可能にするスロットを形成することができ、これのスロットは、次いでアレイの挿入後に密封することができ、そうでない場合には閉じることができる。

フレーム２１、上部２２および／または底部２３は、限定しないがエポキシまたは他の接着剤の少なくとも１つによって一体に結合されてケースを形成することができる。種々の実施形態において、フレーム２１は、（例えば、独立気泡アクリルフォームの）ガスケットとして実装することができ、このガスケットは、圧縮を受けて機能することができ、ならびに／または、上部２２および底部２３に接着するために両側に接着剤を備えていてよく、この接着剤は、ガラスまたはポリカーボネートプラスチックの上部２２または底部２３のどちらかに適合するように作られることができる。上部２２または底部２３の１つは、金属などの不透明材料で作られてよく、他方は光による読取りを可能にしている。不透明部分はステンレス鋼などの熱伝導性材料から作られることが有利である場合があり、熱サイクルの間にペルチェ装置などの加熱源に隣接して配置することができる。

アレイに対するケースのジオメトリは、システムの設計および実装においてしばしば重要である。例えば、アレイとケースとのギャップ、および、アレイの両側の表面処理は：原位置でチップ内にサンプルを装填する能力；熱サイクルの間でのガス気泡または蒸気泡の形成および動き；ならびに、生成する可能性があるガス気泡が、結果として起こるケース上またはチップ表面上での水蒸気の凝結を伴うサンプルの蒸発の原因となるかどうか、に影響する。

アレイとケースと間の適切な分離を確実にするため、内容積２４と向き合う上部２２および底部２３の表面は、表面から突出するシム、隆起および／またはポストなどのスペーシング手段を備えてよく、アレイが表面に接触しないようにする。別法として、アレイ自体が、その表面にシム、隆起および／またはポストを備えてもよく、サンプルが、内容積２４の中を向く上部２２および底部２３の表面と接触しないようにする。種々の実施形態において、間隔は、アレイ上での位置を選択するために適用される接着剤内にガラスビーズの混合物を与えることにより得ることができる。別の実施形態では、アレイは、アレイ自体の材料で形成された適当なスペーシング要素と合わせて製造されてよく、アレイの容積と上部２２および底部２３の内側対向部分との間に任意の所望の間隔を形成するようにする。

図３（ａ）および３（ｂ）は、それぞれ、本発明の実施形態による、センタリングガイドレール３２を備えるＵ形フレーム３６を含むケース３５を示す上面図および側面図である。種々の実施形態において、センタリングガイドレール３２は、カバー３３、３４またはフレーム３６、あるいはそれらの両方に取り付けられるまたは統合されてよい。センタリングガイドレール３２は、左側のカバー３３と右側のカバー３４との間の中に挿入されたアレイの側面をしっかりと保持する。具体的な実施形態では、アレイの通し孔は、左側のカバー３３と右側のカバー３４とのどちらとも接触することなく適位置に保持される。左側および右側カバー３３および３４の考え方は、ケース３５が垂直配向を有することを示唆する。別の実施形態では、ケース３５は、水平配向（この場合、カバーが図２の上部１２および底部１３に相当する）またはハイブリッド配向を有してよい。

本発明の例示的な実施形態では、ケースは、カプセル封入の液体の水準を指示する充填ラインを含んでよい。充填ラインは、シルクスクリーンされてよく、あるいはそうでない場合はケース上にプリントされてよい。プリントされたラインは、ケースのリムに沿って蛍光接着材料をマスクするのに使用されることもできる。

マイクロ流体アレイの準備と装填
図４は、マイクロ流体アレイ、ケース、および関連する構成要素を含むシステムを提供し、ユーザがシステムをしようしてアッセイを実施するのを可能にするための、本発明による方法のブロック図である。破線で囲まれたプロセス４１は、典型的には、アッセイシステムの供給者によって実施される。プロセス４２では、供給者は、アレイの通し孔内へ導入される内容物を備えており、ここでは、これらは３８４個のウェルを有するプレート内に用意される。内容物は反応物であってよく、別法としてあるいは加えて、例えば、サンプル、標準物質または分析対象物質を含んでよい。一方、プロセス４３では、供給者はまた、通し孔が中に形成されている、例えばシリコンまたは鋼のシート材料として未処理の形態のアレイを備えている。プロセス４４では、アレイは、例えば疎水性または親水性材料を用いて処理され、プロセス４５では、適切にバーコードを付けられる。プロセス４６では、アレイは、プロセス４３で得られるプレートから導かれる内容物で占められる。プロセス４７では、アレイは、プロセス４９で行われるパッケージングに備えて乾燥される。一方、プロセス４８では、図２に関連して上で考察したように、適当なケースが用意される。この状況下では、ケースは、上で考察した開いた側面を有して用意される。ユーザは、ケース内に格納されたアレイと、上で考察した浸漬液と、その後ユーザによってアレイが実装された後にケースを密封するための構成とを含むシステムを受け取る。例えば、密封する構成は、紫外光によって活性化されるシーリング剤、および、シーリング剤を活性化するのに使用される紫外光の供給源を含んでよい。流体、シーリング剤および光の供給品は、囲み４９１によって示される。

図５から１６は、一実施形態を示す図であり、この実施形態により、ユーザは図４に関連して説明したシステムを使用してアッセイを実施することができる。

図５および図６は、本発明の実施形態による、浸漬液５３のケース５１への添加を示す図である。アレイ５２はケース５１の外側に描かれている。図５では、浸漬液５３はディスペンサ５４内に用意されており、このディスペンサ５４は、例えばシリンジまたは類似の機器であってよい。ディスペンサ５２を使用して、図６に示すように、浸漬液がケース５１に添加される。

図７および図８は、本発明の実施形態による、浸漬液５３が既に添加された後での図５および６のケース５１へのサンプル７２の添加を示す図である。図７では、浸漬液５３はケース５１内に示されており、ディスペンサ７１（やはり、シリンジまたは類似の装置として実装することができる）は、サンプル７２をケース５１内に装填するのに使用される。図８では、水が主成分のサンプル７２が比重が１を超える浸漬液５３の上方に置かれているのが示されている。

図９および１０は、本発明の実施形態による、図５および６のケース５１へのマイクロ流体アレイ５２の挿入を示す図である。図９では、アレイは途中まで挿入されており、アレイ５２のいかなる通し孔も、浸漬液５３に到達するよりも前にサンプル７２を通過し、そこでサンプル７２を引き込むことができることが分かる。図１０では、アレイ５２はケース５１に完全に挿入されており、アレイのすべての通し孔がサンプル７２を通過している。この時点で、アレイ５２の通し孔は完全に実装される。

アレイ５２がケース５１に完全に挿入された後、いかなる過剰なサンプルは除去される。図１１は、本発明の実施形態による、ケース５１からの過剰なサンプル（図１０内の項目７２として示される）の除去を示す図である。図１０に示すようにサンプル７２は浸漬液５３の上部に置かれていることから、過剰なサンプルは簡単な方式で除去することができる。

図１１に示すように過剰なサンプルがケース５１から除去された後、ケース５１を密封することができる。種々の実施形態において、ケース５１は、密封の前にさらなる処理を受けてよい。例えば、ケースは、以下で詳細に説明するように、密封前に熱により循環させられてよい。分析を通して垂直位置を保つ場合、密封は完全に回避することができるが、ケースからこぼれやすくなる可能性がある。

図１２および１３は、本発明の実施形態による、ケース５１へのシーリング剤１２２の適用を示す図である。ディスペンサ１２１は、ケース５１の開いた側面にシーリング剤１２２を分注するのに使用することができる。

ここに示すシーリング剤は、紫外光への露出によって硬化する。したがって、図１４は、本発明の実施形態による、図１２および１３に示す方式によって適用されたシーリング剤を硬化させる紫外光の使用を示す図である。ここでは、紫外光源１４１は、シーリング剤を硬化させるために、シーリング剤に紫外光（概略的に項目１４２として示される）を与える。紫外光によって硬化しない代替のシーリング剤も使用することができる。種々の実施形態において、シーリング剤は、高真空グリースなどの適当に厚い不活性物質である。適当な高真空グリースはシリコンを含んでよく、また、ソルベイ ソレクシス（Ｓｏｌｖａｙ Ｓｏｌｅｘｉｓ）（ニュージャージー州、ソロフェア（Ｔｈｏｒｏｆａｒｅ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ））から出ているＰＴＦＥシックナーにより濃縮された高真空グリースを主成分とするペルフルオロポリマーのフォンブリン（Ｆｏｍｂｌｉｎ）（登録商標）ＶＡＣ（商標）３などのペルフルオロ化ポリエーテル／ＰＴＦＥ物質を含んでもよい。別法として、適当なワックスが適切な状況において使用されてよい。

図１５（ａ）は、密封後のケース５１を示す図である。ちょうど説明された装填構成の代替として、アレイはケース内に設置され、サンプルはアレイを充填するためにケースに添加され、過剰なサンプルは除去されてよく、次いで、浸漬液は、１つ以上の開いた側面と通して添加されることができ、あるいは、フレーム材料が自己密封材料である場合はフレーム材料を通して直接注入することができる。自己密封特性を有するために、フレーム材料内のギャップは真空グリースなどの第２の物質によって充填されてよい。この場合、浸漬液は、シリンジを使用してグリースを通って分注することができ、真空グリースが、針が引き抜かれた後にシリンジの針によって作られる孔を密封する。

図１５（ｂ）は、本発明の実施形態により、再密封可能なグリースロックを含むケース１５５を示す上面図である。ケース１５５は、フレーム１５８、上部カバーおよび底部カバー（図示せず）を含む。フレーム１５８は、限定しないが、シリンジまたは他のディスペンサによって貫通することができるアクリルフォームまたは他の適当な材料で作られるガスケットでよい。フレーム１５８は、グリースまたは他の自己密封材料で充填された孔１５９を含み、この孔１５９は、ケース１５５を形成するためにフレームが上部１５７および底部に結合されているときに取り囲まれる。浸漬液１５３などの流体は、次いで、シリンジを使用してフレーム１５８およびグリースで充填された孔１５９を通して分注される。シリンジが除去されると、自己密封するグリースで充填された孔１５９は、ケース１５５によって規定される内容積を十分に密封する。再密封可能なグリースロック１５６は、上述の実施形態のようなアレイ１５２の挿入のために使用することができるケース１５５の１つの側面上の密封可能な開口に付けられてよく。別法として、アレイ１５２は、ケース１５５の形成時にケース１５５の内容積の中に位置決めされてよい。

図１６（ａ）は、ケース内に乱入が導入された、本発明の実施形態による、マイクロ流体アレイの通し孔内へのサンプルの導入を可能にする本発明の実施形態を示す図である。アレイ１６２は、浸漬液１６３と水溶液のサンプル１６５との両方、または水溶液のサンプルのみを有するケース１６１内で密封することができる。アレイ１６２またはサンプルを前後に動かすことにより、核酸またはタンパク質などのサンプルをチップ内に装填することができる。捕捉プローブ（以下でより詳細に説明する）がアレイ１６２の通し孔内に含まれ、往復運動により、アレイ１６２の通し孔内でのサンプルの混合およびより迅速な捕捉がもたらされ、ＰＣＲまたはＥＬＩＳＡなどの増幅が引き続きいて起こることができる。流体は、望ましくは、ペルフルオロ化された液体であり、サンプルよりも濃度が高く、したがって、熱サイクルと併せてなされる混合は、好ましくは、アレイ１６１が底部にある垂直位置のケースを用いてなされる。混合は、ケースを振動させる、転がす、または回転させることにより引き起こすることができる。アレイ１６２は、その構造内に磁性材料を含むこと（例えば、アレイ１６２自体、または、付けられる磁性ビーズ）、および、近傍の磁石によりアレイを引くことなどの他の方法により前後に動かすことができる。磁気で引く機構は、サーマルサイクラ装置に統合されてよい。アレイ１６２が前後に引かれるときに乱流混合を起こさせるビーズまたはポストなどの構造体が、アレイ１６２に配置されてよい。この実施形態は、比較的低量の液体サンプルを使用すること、装填／濃縮に必要なステップの数を減少させること、なされるチップ処理が最小である点でよりエラーが起きにくくなること、および、自動化に起因する利便性という利点を有する。

図１６（ｂ）は、本発明の実施形態による、アレイを回転させることによるマイクロ流体アレイの通し孔内へのサンプルの導入を示す図である。アレイ１６５がチューブ１６６内に取り付けられる。チューブ１６６は、次いで、一部分がサンプルで充填されて、垂直に配向された回転ディスク（図示せず）上に配置される。ディスクの回転１６７により、サンプルが繰り返しアレイ１６５を通って流れて、アレイ１６５の通し孔内での迅速なサンプル濃縮がもたらされる。別の実施形態では、アレイ１６５は、スクリューキャップの上部内に成形されるブラケットに取り付けられることができ、次いで、キャップは、分析されるサンプルを含むプラスチックチューブに取り付けられることができる。さらなる別の実施形態では、アレイ１６５は、浸漬液および水溶液のサンプル１６５の両方を有するケース内で密封されることができ、ケースは回転ディスクに取り付けられる。

さらなる実施形態では、アレイの装填の間に必要なサンプルの量を最小化するためのシステムおよび方法が提供される。図７および図８で説明される方法の１つ制約は、アレイ５２がサンプル７２を通って下げられるとき、アレイ５２の充填により、サンプル７２の量が低減することである。ケース５１内の合計のサンプル量が臨界値より低い場合、サンプル７２は、アレイ５２がサンプル７２を通過するときに水平層としてとどまっておらず、縁部から後退し、不混和性流体の上部の中または上で１つの液滴または複数の液滴の形態をとる。その場合、アレイのすべての通し孔がサンプル７２に占められるようになるわけではない。使用されるサンプル７２の量は、ケース５１内の合計のサンプル量が臨界値より確実に高くなるようにするのに十分でなければならず、この方法は、必要となるサンプル７２の量の点で高価になる場合がある。それに応じて、種々の実施形態で、すべての装填手順の間においてケースの７１の全幅にわたって広がる薄い層の形態でサンプル７２が拡散した状態を確実に保つようにすることが有利である。このような拡散手段は、例えば、ケース７１の壁上の疎水性材料を背景に作られる親水性材料の領域であってよい。例えば、ケース７１の側面が、ＯＴＳ（オクタデシルトリクロロシラン（ｏｃｔａｄｅｃｙｌ ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｓｉｌａｎｅ））でシラン化されたガラスから作られてよく、次いで、マスクされ、親水性の縞を生成するためにＵＶ光に露出される。これらの親水性の縞は、ＰＥＧ−シランを用いてなどのさらなる処理によって生物適合性にすることができる。別の実施形態では、拡散手段は、コームまたはブラシの形態でよく、サンプルは、指またはブラシの毛によって形成される１つの縞内に保持される。図１７は、本発明の代替の実施形態による、マイクロ流体アレイ１７２の通し孔内へのサンプルの導入を容易にする本発明の実施形態を示す図である。この実施形態では、漏斗形ガイド１７４が、ケース１７１と隣接関係の状態で設けられている。この形では、図７および図８と併せて考察した方式でのサンプル材料の導入が容易にされ、必要となるサンプルの最小量が低減する。種々の実施形態において、漏斗形ガイド１７４はケース１７１に統合される。別法として、漏斗形ガイド１７４は分離した部品または取外し可能な部品であってよい。

漏斗形ガイド１７４は、種々の形状およびサイズであってよい。例えば、一実施形態では、漏斗形ガイド１７４は、狭いスリットを備えるくさびの形態をとってよい。このスリットは、サンプルが上方の漏斗形ガイド１７４に配置されたときにサンプルが通らないようにするのに十分な狭さの幅である。スリットは、アレイ１７２がスリットを通って下方に位置されたケース１７１内へ通過するのを可能にする。好ましい実施形態では、スリット付きのくさびは、アレイ１７２がスリットを通過するのを可能にするために変形する薄いプラスチックなどの可撓性材料で作られる。薄いプラスチックは、アレイ１７２に対してわずかに接触して圧力を加え、サンプルが漏斗形ガイド１７４から外に漏れるのを防止し、かつ、アレイ１７２内へのサンプルの装填およびアレイ１７２上の過剰サンプルの除去を容易にする。ユーザが、アレイ１７２にサンプルおよびスリットを通過させるとき、アレイ１７２はサンプルで充填されてケース１７１内へ通過する。ケース１７１が、アレイ１７２の挿入の前に浸漬液１７３で充填されると、充填されたアレイ１７２が空気に露出される時間の量およびサンプル蒸発量が、有利に最小化される。

アレイ１７２の通し孔へのサンプルの取り込みをさらに容易にするために、漏斗形ガイド１７４は、アレイ１７２の通し孔が動いて通過する一連の細かなブラシを備えてよく、その結果、毛管作用により、漏斗形ガイド１７４内のサンプルが迅速に通し孔内へ導かれる。ブラシは、独立しておよび／または漏斗１７４の形状にかかわらず使用されることができ、サンプルを垂直に外側へ広散し、それにより必要となるサンプルの量を最小化する効果があることに留意されたい。

図１７では、アレイ１７２とケース１７１との両方が、それぞれ、バーコード１７５および１７６を介して識別される。他の識別手段では、色もしくは形状が異なるプリントされたラベル、または、無線周波数トランスポンダを有するスマートのラベルなどの当技術分野で知られている手段も使用することができる。

熱サイクル／撮像／分析
図１８は、本発明の実施形態による、分析ソフトウェア１８３を使用して分析されるデータを提供するための、サーマルサイクラ１８１内およびスキャナ１８２内の図１５の密封されたケースの使用を示す図である。この形では、アレイ内のそれぞれの通し孔の内容物は、温度を交互に変化させることにより循環されることができ、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列決定法を使用して分析を施されことができる。

本発明の種々の実施形態において、サーマルサイクラ１８１は、限定しないが、温度制御された循環流体または温度制御されたサーマルブロックに基づいてよい。これらの手法の両方を以下でさらに詳細に説明する。

循環流体を用いたサーマルサイクラ
図１９は、本発明の実施形態による、高密度マイクロ流体の熱サイクルシステムを示す図である。上述の実施形態で説明したアレイを含むケース１９５が、温度が制御された循環流体の槽内にケース１９５を安全に浸す温度サイクリングヘッド１９１内へ挿入される。良質の循環流体は高い熱容量を有し、具体例では、空気、水およびシリコン油を含む。サイクリングヘッド１９１は、循環ポンプ１９４によって高温タンク１９２または低温タンク１９３のうちの１つのからポンプで汲み出される温度が制御された流体の循環流れを受ける。弁構成により、温度制御された２つの貯蔵タンクの間の選択を交互にすることが可能になる。図１９は、それぞれのタンク用の分離した入口弁および出口弁を示しているが、弁マニホルド構成、および、いずれの弁も手動で、空気圧で、または、電気により作動させることができるマルチポート弁などの同等の弁構成も使用することができる。

サイクリングヘッド１９１を通ってならびにケース１９５を通り越して循環される流体の温度はアレイに迅速に伝わり、多数のサンプルに一様に適用されるほぼ瞬間的な温度変化を可能にする。例えば、一実施形態では、１時間につき４０の熱サイクルを引き起こすことにより、２５，０００の並行するＰＣＲ反応が同時に起きる。

アレイを保持するケース１９５は、例えば、循環流体の流れ中の適位置に密封されたケース１９５を保持するガイドレール構成に沿ってケース１９５をサイクリングヘッド１９１内のスロット開口１９６に滑り込ませることにより装填することができる。このような構成により、アレイを水平に位置決めさせることに制限される従来技術の熱サイクルシステムでは不可能である、ケース１９１およびアレイ（例えば図１５に示した）の垂直配向が可能になる。アレイを垂直に配向することは、以下でより詳細に説明するように、例えば、気泡がアレイの下方で積み重なるのを防止するのに有利である可能性がある。

いくつかの具体的な実施形態では、特定のジオメトリのサイクリングヘッド１９１および特定の質量流量の循環流体が、ケース１９５の全体にわたる不一様な流体の流れにつながる可能性がある。例えば、図２０（ａ）に示すように、サーマルサイクラ１８１の入口ポート２０１および出口ポート２０２が滑腔円筒形チャンバである場合、ならびに、接続流れチャネル２０３が単純な平面壁を有する場合、循環流体は、入口ポート２０１の開口に最も近傍のケースの部分をまたがって優先的に流れることができる。このことは、流れチャネル２０３内に挿入されるケース１９５の全体にわたる不均一の温度勾配につながることから望ましくない場合がある。

このような流れ不整は、種々の形で実装することができる流れ調整弁構造体によって対処することができる。図２０（ｂ）は、流体チャネルを通る一様な流れを確実にするための、入口２０１の開口端に向かっている流れチャネル２０３の入口側面上の流れ絞り弁２０４の使用を示す。このような流れ絞り弁２０４の一変形形態は、流れチャネル２０３の壁に付けられた１つ以上の隆起部を利用して、入口ポート２０１の開口に最も近い流体の流れを制限する。このような構成により、流れ内の渦およびデッドゾーンが最小になり、ケース１９５の全体にわたっての一様なシート内の流体の層流が促進される。また、これは、より一様な温度を作り出して、気泡（サンプルの撮像を歪める）が形成されるのを防止するのを助ける。

別法として、図２０（ｃ）は、ケース１９５の上流にありかつ流れ絞り弁として機能する流れチャネル２０３の入口側面上にある流れ入口空洞２０５を示す。流れ入口空洞２０５は、ケーススロット１９６より幅が広くてよく、両側がより狭い領域によって境界付けられてよい。この構成は、ケース１９５の全体にわたる流体流れの均等化を促進する。ストレートスルー流れ構成などの他の流れ制御技法が、この問題に対処するために実装されてもよい。

図２を参照すると、ケース１９５が垂直位置にあるときにケース１９５の側面を形成するケース１９５の上部２２および底部２３は、全体がまたは部分的にガラスまたは他の透明材料で作られてよく、サイクリングヘッド１９１の対応する部分も透明であってよい。これにより、熱サイクルの間のリアルタイムの撮像、または、熱サイクルの前後での都合のよい撮像が可能になる。別の実施形態では、撮像は、ケース１９５が熱サイクルシステムから除去されるときに実施されることができ、あるいは、熱サイクルシステムとは別個に実施することができることに留意されたい。

再び図１９を参照すると、別の実施形態では、温度制御された２つの貯蔵タンク１９２、１９３より多いまたは少ない数のタンクを有してよい。別法として、いくつかのアッセイは、異なる温度に制御された３つ以上のタンクを有することにより利益を享受する場合がある。任意の構成の加熱装置または冷却装置を、各タンク内の流体を制御された所望の温度に維持するのに使用することができる。例えば、加熱コイルおよび／または冷却コイルは、いずれのタンクに浸されてもよい。

あるいは、温度制御された貯蔵タンクが１つのみであってもよく、これは、最も低い温度（例えば、ＰＣＲまたはＤＮＡ配列決定法では、これは５５℃のハイブリダイゼーション温度である）に設定される。次いで、より高温のサイクルは、サイクリングヘッド１９１に入れる前に循環流体を加熱することによって実現することができる。例えば、加熱コイルは、ポンプ１９４の出口とサイクリングヘッド１９１との間の管材料の一部分を回りに巻かれるまたは埋め込まれることができる。加熱コイル構成の代わりに、循環流体は、流体を加熱するためにサイクリングヘッド１９１に統合されるペルチェ装置などの１つ以上の加熱されたプレートを通り越して流れることができる。これらの実施形態のいずれにおいても、フィードバックループを、循環流体の温度を正確に制御するために使用することができる。

このような実施形態では、１つのタンクまたは複数のタンクの温度を一定に維持し、サイクリングヘッド１９１を出る流体が、１つのタンクまたは複数のタンクに再導入される前に冷却されるようにすることが有利である。循環流体は、サイクリングヘッド１９１と温度制御された貯蔵タンクとの間の管材料の一部分に巻かれたまたは埋め込まれたコイルによって冷却されることができ、あるいは、冷却コイル構成は、温度を制御するためのフィードバックループをやはり備えるタンク用に用意されてもよい。あるいは、ペルチェ装置などの冷却プレートがサイクリングヘッド１９１に統合されて、循環流体がサイクリングヘッドを出るときに循環流体を冷却することができる。

タンクが１つであるシステムの利点には、加熱時間が速いことと、設計がより小型になることと、費用が少なくなること（槽が少ない）とが含まれる。費用は、貯蔵タンクを室温に維持すること、および、循環流体がサイクリングヘッド１９１に接近したときに循環流体の温度を積極的に制御することによりさらに低減することができる。制御される温度が１つである環境は、例えば薬剤スクリーニングの場合では、それ自体が有用である。

温度センサを有する実施形態では、温度信号のフィードバック制御が、システムの自動化に使用することができる。例えば、自動の弁開閉は、所望の温度が感知されたときに起こるようにプログラムすることができる。このような自動化およびプログラム可能な操作は、サーマルサイクラの通常の特徴であると考えられる。一実施形態は、例えばＳＹＢＲグリーン（分子プローブ）（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ））を用いたＰＣＲ後の撮像による温度の関数として融解曲線データの自動生成を特徴とする。

熱サイクルブロックを備えるサーマルサイクラ
ケース２１１および／またはアレイを温度制御された循環流体の槽に浸すことの代わりに、ケース２１１および／またはアレイは、本発明の一実施形態に従って図２１に示された平坦なブロック２１２などの熱サイクルブロック上に配置することができる。熱サイクルの平坦なブロック２１２は、限定しないが、ペルチェ効果冷却装置などの熱電装置、または、カリフォルニア州フォスター市（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）のアプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から販売されているサーマルサイクラなどの他の市販されている平坦なブロックのサーマルサイクラでよい。ペルチェ効果冷却装置は、典型的には、２つの表面の間を直列に電気的に接続するｐ型およびｎ型の半導体材料を含む。電圧が半導体材料に印加されると、電子がｐ型の材料からｎ型の材料まで通過して、熱を一方の表面から他方へ伝達させる。熱伝達速度は、電流およびｐ−ｎ接合の数に比例する。

熱サイクルの反応で発生する問題は、サンプル内での温度変化が、しばしば、熱がペルチェ装置を出るまたはそれに入りサンプルに伝達され得る速度によって制限されることである。したがって、ケースと熱サイクルブロックとの間に１つ以上の追加の熱接触手段を含むことが有利である。熱接触手段は、ケースに圧力を加えるクリップなどの手段を含んでよい。熱伝達をさらに増大させる別の実施形態では、可撓性の熱伝達パッド２１５、グリースまたはペーストの使用が含まれる。例えば、熱伝達パッド２１５、グリースまたは、ペーストは、平坦なブロック２１２（または、流体のサーマルサイクラが使用される場合にはサイクリングヘッド）とアレイを保持するケース２１１との間に配置することができる。ギャップパッド（Ｇａｐ Ｐａｄ）（バーグキストカンパニー（Ｂｅｒｇｑｕｉｓｔ Ｃｏｍｐａｎｙ）、ミネソタ州チャンハッセン（Ｃｈａｎｈａｓｓｅｎ，ＭＮ））の商品名で販売されているパッドなどの可撓性の熱伝達パッド２１５は、典型的には、熱伝達を強化する材料を含むエラストマの薄いシートである。例えば、熱伝達パッド２１５は、限定しないが、以下の材料または以下の材料の組合せで作られる：シリコン、グラファイト、繊維ガラスおよび／または様々なポリマー。種々の実施形態において、パッド２１５は、一方または両方の側面上に接着剤を有してよく、あるいは、圧力がケース２１１と熱伝達パッド２１５と例えばサーマルブロック２１２との間に位置することができるように可縮性であってよく、良好な熱接触を確実にするのを助ける。

迅速な熱伝達は、最適なＰＣＲの生化学的組成およびスループットに不可欠である。ケースは、好ましくは、例えば熱サイクルブロックに接触する側面上では、高い熱伝導性、ならびに、流体流れの温度の変化に対する応答能を増大させるための低い熱質量を有する。サイクリングヘッドまたは平坦なプレートも、迅速な熱応答時間を確実にするための低い熱質量を有してよい。平坦なプレートまたはサイクリングヘッドのどちらの場合も、熱電対プローブなどの１つ以上の温度感知装置を含んでよい。

熱サイクルブロックは、比例積分微分型（ＰＩＤ）の温度制御を実現することができてサーマルブロックと１つのアレイまたは複数のアレイとの間の昇温速度の差を補正するようになされた補正値を含んでよい温度制御要素を含むことができる。熱サイクルブロックは、また核酸増幅反応の特異性を確認するのに使用される融解曲線分析におけるスローランプ形式を含んでよい。

加えて、ケースは熱伝達速度を増大させて必要となる不混和性流体の量を低減させるために薄くなることができるのが有利である場合がある。しかし、ケースがチップの厚さに対して薄すぎる場合、熱サイクル中にガス気泡が形成されてチップ表面からケースカバーまでを橋渡しする可能性があることに留意されたい。このガス気泡は、ＰＣＲプロセスおよびその画像化を妨害する可能性がある凝結の原因となる。しかし、ケースがチップの厚さに対して薄すぎる場合、チップとケースと間のギャップが、熱サイクルの間に形成する可能性があるガス気泡がチップ表面からケースカバーまでを橋渡しするのに十分なくらい小さくなる可能性があることに留意されたい。その場合、このガス気泡は、ＰＣＲプロセスおよびその画像化を妨害する可能性がある蒸発および凝結の原因になる場合がある。

撮像
本発明の一実施形態による透過撮像システムが、アレイの１つの側面、ケースおよび／またはサイクリングヘッドが白色光または他の光源で照射され、他方側の撮像装置（ＣＣＤカメラまたはスキャナなど）を、クリアでよく照射されているサンプルの画像を受け取る場合に、使用することができる。例えば、図２２に示すように、サイクリングヘッド１９１の１つの側面、または別法としてケース２２５のみが、熱サイクルの間の適切な時間または温度において光源２２３から投射される光ビーム２２２によって照らされる透過撮像システムを使用することができる。光源２２３は、限定しないが、アーク灯などの白色光源、および／または、レーザ走査システムであってよい。それにより、ケース２２５によって保持されるアレイ内のサンプル用通し孔が照射され、サイクリングヘッド１９１の明かりのつけられていない側の撮像センサ２２４（ＣＣＤカメラなど）が、クリアでよく照射されているサンプルの画像を受け取る。このようなシステムでは、アレイの材料は、反射性で不透明であってよく（例えばシリコン）、撮像光は、撮像センサ２２４内に反射あるいはにじみ出ることはない。アレイの照射は、検出器の入る迷光を最小化するためにカメラから軸外にあってよく、鏡または光ファイバー光導体の使用によってなされる複数の角度からであってよい。

本発明の他の実施形態では、エピ蛍光の撮像に関しては、撮像センサ２２４は照射源２２３と同じ側にある。透明のアレイ材料（例えば、ガラスまたはプラスチック、あるいは、表面に黒色ペイントを有するアレイなどの不透明で暗い材料）は、したがって、撮像センサに到達する反射を回避することが好ましい。光学マスクも、ケースまたは撮像システム内に組み込まれてよく、チャネルの外側から発散される光をブロックする。別の実施形態では、傾いた照射はカメラによって受け取られる反射を低減させることから、アレイは、例えば、傾いた照射と併せて使用される反射性の鋼を含んでよい。

図２３は、本発明の種々の実施形態による、マイクロ流体アレイ２３４を照射するための落射照明撮像システム、および、白色光源以外の照射源としての１つ以上の発光ダイオード（ＬＥＤ）２３１の使用を示す図である。白色光が使用される場合、励起フィルタが、サンプルを照射する波長の選択に使用され、蛍光が、発光フィルタを通してカメラまたは他の感光装置によって捕捉される。白色光源の代わりに、明るいＬＥＤまたはＬＥＤ２３１のグループを、励起フィルタ２３２と共に使用することができる。ＬＥＤ２３１は、それらの中心波長を所望の励起波長に適合させることにより選択される；ＬＥＤ２３１によって生成されるエネルギーの多くは、励起スペクトル内にあり、ほとんどのＬＥＤ光は励起フィルタ２３２を通過する。光のほとんどは励起帯域幅にあることから、励起フィルタ２３２用のカットオフの鋭さは、白色光を用いたときよりも重要ではないので、安価なフィルタ２３２を使用することができる。加えて、ＬＥＤ２３１のスペルトルが十分に狭い場合、励起フィルタ２３２は、完全にシステムから除去されてよい。したがって、ＬＥＤ２３１は、それらのコスト、サイズ、効率および簡単さという理由で、白色光より魅力的である。

熱サイクルの平坦なプレート２３６上に位置されるまたはサイクリングヘッド内に含まれるケース内にあってよいアレイ２３４の配向は、重力に対して任意の配向であってよい。種々の実施形態において、撮像される各励起波長に対してのＬＥＤ２３１の対称のセットは、カメラ２３５から軸外に配置される。ＬＥＤ２３１の対称の位置決めは、しばしば、立体的なアレイ２３６の通し孔内でのシャドウイングを回避するのに有利である。別法として、単一のセットのＬＥＤが、アレイ２３６の複数のまたはすべての通し孔を十分に照射するほぼ軸上に位置決めされてよい。ＬＥＤ２３１の各セットは、複数のＬＥＤを含んでよい。別法として、ＬＥＤ２３１の各セットは、限定しないが、最小出力が５０ｍＷの放射電力などの、複数の通し孔を照射するのに十分な出力を有する１つのＬＥＤのみを含んでよい。ＬＥＤ２３１からの光は、０度から９０度までの発散角を有する柱状である。励起フィルタ２３１は、典型的には、各ＬＥＤ源２３１に結合される。カメラ２３５は、ケース／アレイ２３６（および／またはサイクリングヘッド１９１）の表面に平行であり、発光フィルタ２３３は、カメラレンズの両側上で使用される。拡散体を形成する光は、ＬＥＤ２３１の出力上に位置されてよく、光を形成し、より良好な照射の均一性を実現する。

ＬＥＤ２３１は、アレイ２３６の全体を同時に照射する十分な照明を備えており、これは、限定しないが、１００から１６００を超える通し孔、および、例えば２５ｍｍ^２につき１つの通し孔を超える通し孔密度を含んでよい。例えば蛍光の撮像の間、各通し孔内のそれぞれのサンプルからの蛍光は、次いで、デジタル画像として同時にカメラ２３５に捕捉することができる。カメラ２３５は、例えば電荷結合装置（ＣＣＤ）または相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）カメラであってよく、これは、それぞれの通し孔または他のサンプル部分からからの画像を同時に受け取り、例えば、シリアルフォーマットのデジタル画像を送信またはそうでない場合は処理することができる。カメラ２３５の撮像レンズは、典型的な光学窓の代わりにカメラに直接取り付けられることができてさらに湿気および粉塵がカメラ２３５に入るのを防止するためにしっかりと密封することができるＭｅＶｉｓレンズであることが有利である場合がある。好ましい実施形態では、カメラ２３１は、アレイの個々の特徴を識別するのに十分に高解像度である。次いで、各サンプルに対しての強度測定が行われることができ、その強度は、所望のデータを生成するために分析ソフトウェアによって処理される。種々の実施形態において、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による複数の複製サイクルは、熱サイクルの間にアレイ２３６上で実施することができ、アレイ２３６全体が同時に照射されて各複製サイクルの間に撮像される。

熱サイクルシステム
図２４は、本発明の実施形態による、サーマルサイクラシステム３００の側断面図である。サーマルサイクラシステム３００を使用して、マイクロ流体アレイ内のそれぞれの通し孔の内容物は、限定しないが、温度を交互に変化させることによりサイクルされ、撮像されてもよく、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列決定法を使用して分析を施してもよい。

サーマルサイクラシステム２４１０は、限定しないが、上述のように種々の実施形態においてケース内で取り囲まれているマイクロ流体アレイを装填し／アレイに到達するための蝶番扉２４１６を有する適当な筺体２４１５を含んでよい。筺体２４１６は、扉２４１６が閉じているときに光を通さず、蛍光の読取りを行っているときなどの撮像の間におけてバックグラウンドを最小にするのを可能にすることが有利である場合がある。筺体は、筺体上にこぼれた液体が、安全に流れ出て、例えば筺体の側面に位置決めされてよい排気口に入らないようにするために配向される傾斜上部を含んでよい。

サーマルサイクラ２４１０は筺体２４１５内に位置決めされる。サーマルサイクラは、それぞれ上で説明した、循環流体と、マイクロ流体アレイ／ケースが上に配置されてよいサーマルブロックとを備える温度サイクリングヘッドを含んでよい。

種々の実施形態おいて、サーマルサイクラ２４１０は、特に迅速で特異的なＰＣＲ反応を実施するときは、できるだけ迅速に加熱および冷却を行うように設計される。サーマルブロックを使用する熱によるサーマルサイクラ循環システムに関しては、水冷ペルチェ装置は、空冷ペルチェ装置よりも速いが典型的にはより高価である。空冷ペルチェ装置を使用する場合、冷却ファンが使用されてよい。冷却ファンは、サンプルの撮像の質を低下させる可能性があるサンプルおよび／または光学素子に到達する振動を最小化するために、サーマルサイクラおよび／または筺体から離れて取り付けられるのが有利である場合がある。これは、振動が９６ウェルプレートのスケールでは典型的には振動が問題にならないことから、熱シンクとして機能する表面に直接取り付けられるファンを典型的には有する従来のサーマルサイクラとは異なる。ダクトが、ペルチェ装置の熱シンクにまたがって離れて取り付けられた冷却ファンからの空気の流れを導くために設けられる。熱シンク上を通過する空気は、格子を通ってサーマルサイクラシステムの外側へ逃がすことができる。

透過撮像システムが筺体２４１５内に位置決めされる。上述したように、透過撮像システムは、マイクロ流体アレイを照射するための種々の光学素子／光源２４２０と、上述した撮像装置とを含む。撮像装置は、クリアでよく照射されている複数のサンプルの画像を同時に受けるためのカメラ２４２１、または、各サンプルを順次撮像するスキャナでよい。カメラは冷却することができる。例えば、カメラ２４２１は熱電気的に冷却することができる。１つ以上の発光ダイオード（ＬＥＤ）は、上述したように、白色源またはレーザ源以外の照射源２４２０として使用される。

筺体２４１５内に位置決めされる他の構成要素２４４０は、限定しないが、１つ以上の電源、回路ボード、熱シンクおよび／または冷却用ダクトを含んでよい。図２４の例示的な実施形態に示すように、光学素子／光源２４２０は、サーマルサイクラ２４１０の上方に位置される上部プレート２４３０によって筺体内で支持することができ、これらは、その後、中央プレート２４３１上に位置決めされる。他の種々雑多の構成要素２４４０は、下部プレート２４３２上でサーマルサイクラ２４１０の下方に位置決めされてよい。

図２５は、本発明の一実施形態による、リッド組立体が開いた位置にあるサーマルサイクラの斜視図である。図２６は、リッド組立体が閉じた位置にある図２５のサーマルサイクラの斜視図である。図２７は、本発明の一実施形態による、リッド組立体の斜視図である。

本発明の例示的な実施形態では、１つ以上のマイクロ流体アレイ／ケースをサーマルサイクラ２５００のサーマルブロック２５０２上の固定位置に容易に位置決めするための位置決め機構が用意される。マイクロ流体アレイ／ケース２５０６の位置を固定することは、例えば照明および／またはカメラの視野に関しては有益である場合がある。位置決め機構は、限定しないが、マイクロ流体アレイ／ケース２５０６を位置決めするサーマルブロック２５０２上のくぼみ２５０４（マイクロ流体アレイケース２５０６が挿入された状態で図２５に示す）あってよい。適切に位置決めされた場合、マイクロ流体アレイ／ケース２５０６はくぼみ２５０６内に静止する。くぼみ（複数可）２５０４はまた、部分的にはケースの側面に接触する金属の追加することにより、マイクロ流体アレイ／ケース２５０６の加熱および冷却の速度および均一性を改良する機能をもつことが有利である場合がある。代替の位置決め機構にサーマルプレート上の突起が含まれてよく、マイクロ流体アレイ／ケースが突起の間で静止する。

サーマルブロック２５０２は、１つ以上のケース４０６がくぼみ２５０４内に滑り込むことができるように滑らかに研磨されてよい。くぼみ２５０４は、１つ以上のケース２５０６を保持してよく、サンプルの損失または保持されたサンプル間のクロストークの原因となる可能性がある物理的撹乱を最小にしてマイクロ流体アレイ／ケース２５０６がくぼみ２５０４内に滑り込むことができるようにするための傾斜部分をさらに特徴としてよい。

種々の実施形態において、サーマルサイクラ／システム２５００は、サーマルブロック２５０２からの装填および／または除去の前にマイクロ流体アレイ／ケース２５０６を配置するためのサーマルブロックに極めて接近したデッキも特徴としてよい。デッキ２５０２の表面は、マイクロ流体アレイ／ケース２５０６の滑り込みを容易にするように滑らかであることが好ましい。デッキ２５０２は、アレイ−ケース２５０６が上に配置されて次いでサーマルブロックの表面上で静かに回転することができる縁部を含んでよく、それにより、アレイ−ケースを表面上に落とすことにより起こる場合がありさらに液体サンプルをかき乱す可能性がある衝突力を防止する。例えば、ユーザは、サーマルサイクラ／システム２５００に対して扉を開いて、１インチ×３インチの長方形のケース上のバーコードまたはケースを通して可視であるアレイ上のバーコード（以下にさらに詳細に考察する）を走査して、デッキ上にケース２５０６を置き、ケース２５０６をおよそ３インチ×３インチのくぼみ内へ傾斜を下って滑り込ませる。このプロセスは、扉を閉じて熱サイクルを開始する前に、追加のアレイケース２５０６（サーマルブロックが保持するケースの数に応じて）を用いて繰り返すことができる。

上で考察したように、迅速で均一な加熱および冷却は、ＰＣＲなどの種々の反応のスループット、再現性、および全体的な成功にとって重要である。アレイ−ケースをサーマルブロック２５０２上に単純に置くことは、しばしば、アレイケース２５０６の迅速で均一な温度制御を最適に実現しない。

本発明の種々の実施形態において、サーマルサイクラ／システム２５００は、熱伝達の増強機構を含んでよい。増強機構は、限定しないが、アレイ−ケースをサーマルブロックに押圧してそれにより熱伝達を増強する機械的要素であってよい。例えば、図２５〜２７を参照すると、それぞれのアレイケース２５０６は、例えば、アレイ−ケース２５０６の少なくとも１つの、好ましくは２つ以上の縁部上に位置決めすることができる１セットの指２５１０を用いて押圧することができる。指２５１０は、好ましくは、可撓性であり、指が接触する領域の全体に規定された均等な量の力を加える。指は、限定しないが、鋼などの金属で作られてよい。指は、アレイ−ケース上で発生する圧力を制限するための、および、ケース側面とアレイとの接触の原因となりさらに保持されるサンプルを撹乱する可能性があるケースの曲げを防止するための十分な設置面積を有してよい。

指の熱容量は、アレイケースに接触しているとき、アレイ全体にわたっての温度の不均一性の原因となる可能性がある。指の熱による吸上作用を最小化するために、指は、ゴムなどの断熱材料２５１２で作られてよく、または、断熱材料２５１２でコーティングされてよい。

種々の実施形態では、指２５１０と組み合わせてまたは指２５１０に加えて、本発明の実施形態に従って図２８に示すように、ばね装置２８２０が、アレイケース２５０６を押下げるのに使用されてよい。ばね装置２５１０は、例えば、指２５１０を橋渡ししてアレイケース２５０６の中央に接触することができ、アレイ−ケースの中央領域をサーマルブロックに押圧する力を加える。

本発明の種々の実施形態では、サーマルサイクラ／システム２５００は、サーマルブロック２５０２に例えば蝶番式に取り付けられることができるリッド組立体２５２０を含む。指２５１０（および／または、ばね装置２５２０）は、蝶番式リッド組立体２５２０に統合されてよく、リッド組立体２５２０を閉める動作により、指２５１０がアレイ−ケース２５０６の縁部に接触し、アレイ−ケース２５０６は、好ましくは、サーマルブロック２５０２内の１つ以上のくぼみ４０４などの位置決め手段によって既に位置決めされている。指２５１０は、わずかに下方に角度が付けられており、リッド組立体２５２０が完全に閉まる前にケース２５０６に接触するようになっており、さらに、リッド組立体２５２０が閉まるときに曲げ動作を介して圧力を発生させる。

弾性ガスケットなどのガスケットが、熱により密封するためにリッド組立体２５２０の周囲に統合されてよく、さらに、蒸発した任意のカプセル封入の流体、または、漏れて可能性として不利益にシステムの光学部品上に凝結する場合があるサンプルを含むことができる。リッド組立体２５２０は、リッドが任意の位置で開いたままでいることを可能にして高速で閉めることによるサンプルの撹乱の可能性を低減させる摩擦蝶番などの閉鎖速度調整装置を統合してよい。また、リッド組立体は、リッド組立体を閉めた状態に保持するためのラッチ４４０を統合してよい。ラッチ２５４０は、片手で行える操作を可能にしており、弾性ガスケットを都合よく圧縮するための機械的利点をもたらすことが好ましい場合がある。

種々の実施形態において、リッド組立体２５２０は、リッド組立体が完全に開くのを防止する止め具を特徴としてよい。例えば、リッドは、約４５度のみ開くことができ、近接して位置決めされる光学部品にリッドが接触するのを防止する。このような設計により、より小型で光の効果がある設計が可能になる。

リッド組立体２５２０が複数の熱サイクルを経て熱くなりさらに経時的にアレイの平均温度を上げるのを防止するために、リッドまたはアレイ−ケース４０６の温度を測定することができる。限定しないが、マイクロプロセッサおよび関連するソフトウェアを含んでよい制御要素は、次いで、加熱および冷却時間または温度測定に応じた力を調節することができる。種々の実施形態において、リッド組立体２５２０は、鋼製輪を用いて補強することができるプラスチックなどの断熱性および／または低い熱質量の材料で作られてよい。リッド組立体２５２０は、カメラおよび照明光学素子などの残りの撮像システムに対してのリッド組立体２５２０の角度と高さ合わせて調節することができるプラットフォーム上に配置されることが有利である場合がある。

リアルタイム熱サイクルの間などでサンプルの撮像を実施するために、リッド組立体２５２０は、透明領域または光学窓２５５０をさらに含んでよい。窓２５５０は、保持されるすべてのサンプルの視覚化を可能にするために大型であることが有利である場合がある。光学窓とサーマルブロックとの間で均一で規定された距離を維持して、撮像の平面度を改良するために、規定された長さの１つ以上のポスト４６０などの上向きの止め具が、リッドまたはサーマルブロックに統合されてよい。アレイの撮像を改良するためにならびに装置の設置面積を低減させるために、透明窓２５５０はレンズを含んでよい。レンズは、より均等にアレイ全体にわたって励起光を方向づけることならびにより平坦な蛍光発光画像をカメラに供給することの両方によってより平坦な画像を供給する全視野平凹レンズを含んでよい。

ペルフルオロ化された液体などの部分的に揮発性の浸漬液を使用するときの潜在的な問題は、ケース内で液漏れが生じた場合に、このような液体が高温で蒸発して光学部品上に凝結し、データ収集および解析を妨害する曇りの原因となることである。この場合、本発明の実施形態による除曇機構が用意されてよい。除曇機構は、限定しないが、光学部品を加熱するための加熱要素、および、液体を凝結させるための低温表面要素を含んでよい。加熱要素は、電気加熱要素または／および赤外線ランプを含んでよい。低温表面要素は、熱電気的に冷却される表面を含んでよい。別の実施形態は、光学的に透明の親水性層を光学部品にコーティングして、凝縮液が光学表面上に液滴を形成するのを防止して、それにより、凝結した液体が光学表面上に存在していても撮像経路の完全性を確実にする。もちろん、これは、液体自体がアレイの照射および撮像を妨害しないことを前提とする。

熱サイクルシステムは、マイクロプロセッサと、温度制御、照明制御、データ収集および分析を実現する関連するソフトウェアとを含んでよい。小型化された反応を撮像するとき、スポット調査および積分アルゴリズムを使用して、生物−アレイの技術分野で知られるように、原画像をスポット強度へ変換してよい。リアルタイムＰＣＲ用途の場合、データ分析は、典型的には、サンプルの相対的な蛍光強度がしきい値と交差するときのサイクル回数が標的核酸の初期濃度と相関するようにしきい値設定することを含む。アルゴリズムが、このしきい値を設定するために使用されてよく、これは、複数の試験的しきい値を選択すること、および、既知の標的濃度のサンプルから生成された標準曲線にどの試験的値が最もフィットするかを決定することを含む。多数の試験的しきい値が使用されてよく、または、自動最適化手法が使用されてよい。

熱サイクル時のケースの配向は、熱サイクル時のファクタとなることができる。アレイの水平またはハイブリッド配向は多くの実施形態で許容可能であるが、ケース１９５の垂直配向は、有利に、ケース１９５内の不混和性流体の中に形成する気泡が、アレイの下に積み重なることなく浮上するのを可能にする。このような気泡はサンプルの撮像を歪める場合があり、さらに、ペルフルオロ化された液体を用いたときでさえ、アレイの内のサンプルの蒸発をもたらす場合もある。種々の実施形態において、垂直位置での熱サイクルは、ケース１９５の密封の前に実施されることができ、発生する場合があるあらゆるガス気泡または蒸気が密封の前に逃げることが可能になる。これは、少しの空気を逃がすことなく不混和性流体によってケース１９５を完全に充填するために典型的には入口および出口管構成が使用される水平配向の構造体とは異なる。別の実施形態では、垂直での熱サイクルは、この配向では内容物がこぼれることがないことから、ケースを密封することなく実施することができる。

ケース１９５を垂直、水平、または、ハイブリッド配向にした別の技法も、望ましくない気泡の形成を低減させるのに使用することができる。例えば、ケース１９５は剛性に作られてよく、ケース１９５が熱サイクルの間の上昇した温度によって膨張しないようにする。ケース１９５内の容積が一定に保持されることから、圧力が増大して、望ましくない気泡の形成を防止する。

種々の実施形態において、塩または他のオスモライトを、ケース内に含まれるサンプルまたは他の流体に添加することができる。オスモライトによって沸点が上昇することから、水の蒸発に加えて水溶液のサンプル内の空気のガス放出が低減する。限定しないが、塩は、アレイの浸漬の前のサンプルに添加することができ、あるいは、カプセル封入の間に導入されることもできる。グリセリンを含む砂糖などの小分子のオスモライトが一般には適当である。所望の反応を妨害しない小分子の他のオスモライトまたは親水性ポリマーも使用することができる。例えば、ＰＥＧ、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアクリレート、ＫＣｌ、ＮａＣｌ、または、トリス緩衝液が使用されてよい。０．１Ｍから３Ｍの範囲の、より好ましくは０．２Ｍと２Ｍとの間のグリシンなどのアミノ酸も適当である。最大約２Ｍのベタイン（アミノ酸）が、蒸発を防止するのに使用されてよく、さらに、Ｇ〜Ｃ（Ａ〜Ｔではなく）が豊富な標的配列でのＰＣＲ反応を改良するのに使用されてよい。

本発明の種々の実施形態において、特に熱サイクルの間はガス放出しない浸漬液が用意される。ガス放出しないという特性は、気泡が熱サイクルの間に浸漬液内に形成するならびにデータ収集を妨害するのを防止することおいて重要であり得る。

本発明の一実施形態によると、流体（複数可）からの溶解ガスを除去は、液体を雰囲気圧より低い圧力で真空中に露出することによって達成される。あらゆる溶解ガスは表面に移動して外に出て、それにより、液体内の溶解ガスの量が経時的に効果的に減少し、圧力差が増大する。流体に適用される最大圧力差は、ガス放出の間に浸漬液の過剰な蒸発を回避するために流体の蒸気圧を超えてはならない。

本発明の別の実施形態では、浸漬液は、流体内の溶解ガスを除去するために液体の沸点まで加熱されてよい。沸点温度における時間は、液体の過剰な蒸発を防止するために制限される。本発明のさらに別の実施形態は、液体をガス放出するために低下した圧力と上昇した温度を組み合わせることを含んでよい。

液体（複数可）から溶解ガスを除去する別の方法は、ヘリウムを散布し、次いで排気によってガスを除去することである。散布の間、ヘリウム気泡の流れが、例えば、浸漬液を通過して、流体液の外へ溶解空気を押し出し、それにより、熱サイクルの間での空気泡の形成を制限する。ヘリウムは、サーマルサイクラ内で使用されるすべての温度において可溶性のままであり、したがって、それ自体は気泡を作らない。この方法に従って用意されたペルフルオロ化アルカン液（３Ｍから出ているフロリナート（Ｆｌｕｏｒｉｎｅｒｔ）（商標）ＦＣ−７０など）は、有利には、ガス放出しないだけでなく、マイクロ流体アレイ内の水溶液のサンプルから放出されるガスを吸収する傾向があり、それにより、気泡がカプセル封入の流体または保持されるサンプル内で形成するのを防止する。便宜上、即座に開けられて使用することができる予めガス放出された液体のバイアルが用意されてよい。予めガス放出された液体を生成するために、流体が散布ガスを用いて散布されてよく、次いで、流体を保持する容器内に容器づめされて、選択的に空気を締め出すが、散布ガスは逃がすようにする。例えば、容器は、限定しないが、ヘリウムを用いて散布された約１ｍＬのペルフルオロ化アルカン液を保持するためのプラスチックバイアルであってよく、ヘリウムは容器づめの後にガス放出された液体から離れて漏れ出す。

サーマルサイクラシステムは、内部または取付けコンピュータのどちらかに動作可能に接続されたバーコードスキャナを含んでよい。バーコードスキャナは、例えば、サーマルブロックに対するデッキ（上述の）に位置決めされてよい。種々の実施形態において、バーコードスキャナは、限定しないが、ケース上のバーコードまたはケースを通るアレイ上のバーコード（ケースの互換性が可能になる）の読取りが可能であってよい。

ポリメラーゼ連鎖反応
別の実施形態では、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を、非常に少量の遺伝子材料を使用して実施することができる。ＰＣＲの間、サーマルサイクラを介した一連の加熱および冷却サイクルが、少量のＤＮＡを複製するのに使用される。種々のプローブおよび／または染料を使用することにより、この方法は、サンプル内に存在する特定の核酸配列の存在または量を分析的に決定するのに使用することができる。

具体的な実施形態では、プライマなどの試薬または蛍光プローブが、ワックス内でのカプセル封入によって通し孔の中で固定化される。このワックスは、ワックスが加熱により試薬を溶解して放出するように、親水性で生物適合性であることが好ましい。例えば、数千の遺伝子型判定またはＲＮＡ発現アッセイを含む、固定化されたプライマおよびＴａｑＭａｎプローブのアレイが、プライマおよびプローブを通し孔の壁上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）内にカプセル封入することにより生成される。次いで、分析される核酸を含むサンプルが導入され、アレイが、本明細書で説明する器具類によって実現できるリアルタイム分析と併せて熱サイクルされる。

遺伝子型判定の用途の場合、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる、０３年１２月１０日出願の、「改良された選択的ライゲーションおよび増幅アッセイ（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）」と題される米国仮特許出願６０／５２８，４６１に記載されているアッセイを、多くの特異的および安価のアッセイが敏速に設計することができるという点で有利なアッセイシステムを実現している。アッセイは、アレイの各通し孔の中にある核酸の標的配列内のヌクレオチド多形性の識別と分類を可能にする。アッセイは、２つが標的核酸配列と結合している３つ以上のプライマを有しており、ＳＮＰをフランキングして、１つ以上の第１のプライマの３’端が、第２のプライマの５’端に隣接して、その２つのプライマは選択的に連結されて、次いで、第３のプライマによって増幅されて、標的配列の相補鎖を指数関数的に生成するようにする。標的配列の他の鎖は、未連結の第１のプライマによって指数関数的に増幅される。したがって、マイクロ流体アレイを使用して、核酸の標的配列内のＳＮＰは、有利に識別される。種々の実施形態において、マイクロ流体アレイチップと、プライマ配列と、所望の標的核酸配列の増幅のために選択的にプライマを連結するのに必要な試薬を含むキットが用意されてよい。

別法として、カプセル封入される成分は、例えば、疫学的研究での使用のために固定化された患者のＤＮＡサンプルといった、１つまたはいくつかのアッセイを用いて調べるためのサンプルのアッセイであってよい。場合によっては、アレイ全体が、例えば限界希釈ＰＣＲによるハプロタイピングで使用することができるサンプルが固定化されたアッセイシステムを有してよい。いくつの用途の場合、サンプルの追跡に有利であってよい、患者のサンプルの場合と同じアレイにおいて、遺伝子型判定アッセイとＲＮＡ発現分析アッセイとの両方を組み合わせることが望ましい場合がある。

カプセル封入のマトリックスなしで通し孔の壁上に試薬を単に乾燥させることは、アレイを浸すこと、アレイ全体にわたって液滴を流すこと、または、サンプルを複数の通し孔に同時にさらす他の方法によってサンプルが装填される場合に、試薬が、隣接するチャネルを溶解および汚染する可能性があり、かつ、材料を消失したチャネルでの結果の信頼性が低減する可能性があるという点で、問題が多いということに留意することは重要である。患者集団の調査に関しては、標的分子はＰＣＲによって増幅されるが一方プライマおよびプローブは増幅されないことから、標的分子がアレイになるので、このことが非常に高い重要性をもつ。保護ワックスの第２の層を添加するなどの、このクロストークを低減する手段が、アレイ内に実装されてよい。この第２の層の構成は、第１の層と同じであってよく、あるいは違ってもよい。

多くのアッセイの場合に、通し孔（壁）の内側表面が生物適合性であり、それにより、アッセイ成分の吸収、変性、反応、または、触媒作用による破壊によって反応を妨害することがないようにすることが重要である。このため、壁を生物適合性の材料でコーティングすることが好適である。この材料は、例えば、共有的に連結されたＰＥＧ担持シランであってよい。このコーティングは、アッセイで使用される最高温度（ＰＣＲの場合、典型的には９５℃）で熱的に安定していなければならない。

アッセイの感度を増大させるために、配列状の捕捉ＰＣＲアレイ（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃａｐｔｕｒｅ−ＰＣＲ ａｒｒａｙ）が生成されてよい。図２８に示す通し孔などの、アレイ２８７２の通し孔は、本発明の一実施形態による、配列状の特定ハイブリダイゼーション捕捉プローブ（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｃａｐｔｕｒｅ ｐｒｏｂｅｓ）のアレイを備えてよい。プローブは、限定しないが、アレイ２８７２の通し孔の内側壁上でまたは通し孔内に埋め込まれた多孔性材料上で固定化されてよい。増幅される核酸を含むサンプルは、ハイブリダイゼーションアレイの場合に一般的であるプローブにハイブリダイズすることが可能である。アレイ２８７２は、非特定的に結合されている核酸を除去するようになされた緩衝液内で洗浄することができる。ＰＣＲ試薬は、次いで、第２の通し孔アレイを積み重ねることにより、または、他の手段により、サンプルアレイ２８７２に導入される。例えば、第２のアレイは、プロープに相補的な配列を特定的に増幅させるプライマを含んでよく、または、普遍的なプライマを含んでよい。次いで、熱サイクルおよび分析を実施することができる。アレイ２８７２の通し孔をサンプルの機能的処理に適合させること、および、アレイ２８７２を積み重ねることに関するさらなる詳細を、以下のセクションに示す。

具体的な一実施形態では、アレイ２８７２は、少なくとも３つの異なるオリゴヌクレオチド：
（１）標的ＤＮＡに対して高い特異性を有する通し孔壁上に固定化された捕捉プローブオリゴと、（２）フォワードＰＣＲプライマと、（３）標的ＤＮＡの増幅のためのリバースＰＣＲプライマとを含んでよい。このような手法は、適合しなければならない特異性のある３つの異なる領域に基づいた標的ＤＮＡに対しての高い特異性をもたらす。

このような実施形態の利点には、１０分の１を超えるテンプレートサンプル質量の必要基準の低減（実施形態によっては１００分の１を超える）、および、特定のハイブリダイゼーションをＰＣＲ配列決定法に固有の特異性と組み合わせることによる出力の特異性の増大を含む。また、類似の実施形態は、ＤＮＡ配列決定法または非熱性増幅システムなどの、ＰＣＲ以外の技法に適合する。

単および多機能性のアッセイ
本発明の例示的な実施形態では、サンプルアレイの個々の通し孔が、液体サンプルの単または多機能性処理に適合している。単または多機能性処理は、１つ以上の対象の標的の捕捉および／または捕捉された標的の化学的処理を含んでよい。標的の捕捉は、核酸プローブ、タンパク質抗体、アプタマー、または、通し孔内で固定化される物質の他の捕捉剤に基づいてよい。化学的処理は、捕捉された標的を修飾する働きをする固定化された試薬を使用してよい。

一実施形態では、化学的処理は、捕捉された標的からの信号を増幅および検出することを含む。例えば、化学的処理は、カプセル封入されたタクマン（ＴａｑＭａｎ）（登録商標）ＰＣＲ試薬、または、他のいくつかの核酸検出スキーム用の試薬を使用してよい。いくつかの実施形態では、化学的処理は、捕捉された標的に対して特異的であってよい。例えば、標的の捕捉は、ストリンジェントなハイブリダイゼーションなどによって、サンプル内の標的核酸を特定的に捕捉するために、通し孔内で固定化されたオリゴヌクレオチドを使用することができる。化学的処理は、次いで、プライマ、および、固定化されたオリゴヌクレオチドによって捕捉された標的核酸に特異的なプローブと共にタクマン（登録商標）試薬を使用することができる。

プライマ、分子プローブ、タンパク質類、抗体類、酵素、酵素−抗体接合体、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、蛍光基板、緩衝剤、塩類、遮断剤、または、他のいくつかのアッセイ成分などのアッセイ試薬を、種々の方式で通し孔内に固定化することができ、活性化により物質をサンプル通し孔の中の水溶液内へ放出する。活性化は、例えば、長期のインキュベーションを介して、あるいは、熱、光、溶媒、ｐＨ、酸化剤、還元剤または他のいくつかの誘因への露出によって引き起こすことができる。これらの固定化技法は、共有結合形成、非共有結合形成、および、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの良好な表面接着特性を有する材料内での固定化を含む。本明細書の以下において、これらの材料をワックスと称す。優先的に、ワックスは、界面エネルギーの使用によって通し孔の装填を容易にするために、親水性でなければならない。また、ワックスは、反応または検出システムを妨害しないために、生物適合性でなければならない。いくつかの用途においては、チップが、上昇した温度（例えば、約４０℃）に数時間さらされてよく、それにより、ワックスが、より高い融点を有する必要がある場合がある（あるいは、高融点のワックスの層によって中に密封される）。

プローブおよびプライマなどのアッセイ試薬はワックスと混合されてよく、さらに、例えば高精度のロボットピンツールの使用により、マイクロプレート内の試薬ストックから多機能性チップ内のサンプル通し孔内へ伝達させられてよい。用意されたチップは、次いで、サンプル通し孔の壁上のＰＣＲプライマおよびプローブを固定化するために乾燥される。ワックスが親水性である場合、ＰＣＲに必要な他の試薬と共に患者のＤＮＡおよびポリメラーゼ（Ｔａｑなど）などの対象の標的を含む溶液が、上述したように、浸されることによってあるいは他の手段によって通し孔内へ装填される。熱サイクル後、ワックスは溶けて溶解し、核酸成分を放出する。

いくつかの実施形態では、複数の試薬が、通し孔内のワックスの複数の層内で乾燥される。図２９（ａ）に、標的捕捉試薬を示しているワックスの第１の外側層２９４１と、化学的処理の試薬を有するワックスの第２の内側層２９４２とを有する通し孔２９４０を示す。図２９（ｂ）に、ワックスの第１の層２９４１およびワックスの第２の層２９４２が異なる位置で通し孔２９４０の内壁に付けられている代替の実施形態を示す。どちらの実施形態においても、ワックスの各層は、異なる温度におけるこれらの試薬の連続する活性化を可能にするために、異なる溶融温度（例えば、異なるポリマーの長さ）を有してよい。図２９（ａ）では、このことは、ワックスの第１の外側層２９４１がワックスの第２の内側層２９４２よりも低い融点を有することを意味する。このことは、単に、融点が高いワックスの後に融点が低いワックスを適用して乾燥させることにより容易に達成することができる。

いくつかの実施形態では、２重の層のワックス構造は、通し孔の選択された１つのサブセット内のみに与えられ、同一のチップ内でのＲＮＡおよびＤＮＡ分析、または、ＥＬＩＳＡおよびＰＣＲ分析などの複数の種類の分析を可能にしている。言い換えると、固定化される試薬は、１つ以上のサンプルについての複数の種類の情報（例えば、ＳＮＰ、遺伝子発現パターンなど）を供給するために、通し孔ごとに変わってよい。

このような層状のワックスチップは、例えば、定量ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）などの、ＤＮＡを増幅させる２段階の逆転写／ＰＣＲシステムにおいて有用であり、この２段階の逆転写／ＰＣＲシステムでは、逆転写によりサンプルＲＮＡがＤＮＡへコピーされ、次いで、ＰＣＲ処理により検出に関連するＤＮＡが増幅される。必要とされるＰＣＲプライマおよびプローブは、乾燥して、最初に、６５℃で溶解するワックス内のサンプル通し孔内を降りる。次いで、逆転写反応用のプライマが、４５℃で溶解するワックスの第２の上部層内で第１のワックス層の上に乾燥する。

熱安定性の逆転写酵素（例えば、カナダ、カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）のインヴィトロゲンコーポレーション（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）からスーパースクリプト（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ）（商標）として市販されている）を有するワンチューブＲＴ−ＰＣＲマスターミックスと共にＲＮＡサンプル（ＲＮＡウィルスからなど）が、次いで、加えられて、逆転写プライマを放出するために５０℃まで加熱され、さらに次いで、３７℃でインキュベートされて逆転写酵素反応が起こるのを可能にする。種々の用途において使用される最大温度は、酵素の温度安定性の限界内で変化してよい。次いで、チップは、熱的にサイクルしてＰＣＲプライマおよびプローブを放出し、さらに、ＰＣＲ増幅および分析を実施する。追加的レベルの特異性が、ＲＴおよび対応するＰＣＲに対する異なるプローブを使用することにより、アッセイ内で得られる。また、この技法は、試薬の時間または温度における逐次添加が必要となる別の種類のアッセイにおいても使用することができる。

また、融点が複数のワックスの層は、固定化された核酸がサンプルのディッピング／装填プロセスの間に通し孔の近傍へ移動することに起因する場合があるサンプルのクロストーク（相互汚染）を低減させる場合にも有用である可能性がある。これは、ワックスの下層（複数可）を保護しているワックスの外側保護層を含んでよい。このワックスの保護層は、下にある層（複数可）と組成が同じであってよく、または、違っていてもよい。

層状ワックスの実施形態は、優れた設計の融通性をもたらす。例えば、標的捕捉プロセスは、核酸プローブを有する必要がなく、固定化されて抗体を用いた親和性捕捉によってのようにウィルス粒子を直接分離するのに使用することができる。次いで、チップは洗浄されて、核酸が、熱、溶菌酵素、または他の手段により放出される。精製、特異性または核酸安定性がさらに必要な場合、オリゴ−捕捉プローブが抗体捕捉プローブと混合されてよい。この場合、オンチップの逆転写反応が必要である。溶菌酵素は、加熱により変性するように選択されてよく、それにより、ＰＣＲに必要な逆転写酵素またはポリメラーゼに影響しなくなる。

種々の実施形態において、複数の機能性は、相補性試薬を含む複数のチップを製造することによって多機能性チップに統合することができる。その場合、２つの（またはそれより多い）チップは、一体に層にされることができ、単一の一体型多機能性チップを形成する。いくつかの実施形態は、分離した捕捉専用および化学処理専用のチップを結合することから開始してよく、化学的処理チップの通し孔内の化学的処理機能性が、捕捉チップ内の適切な捕捉機能性と連携するようにする。いくつかの実施形態では、捕捉機能性と化学処理機能性との間の対応関係が維持される限り、２つのチップの間での捕捉機能性と化学的処理機能性との混合が可能であってよい。

図３０に、上部のチップ層３０５１が底部のチップ層３０５２上に直接積み重なっている実施形態を示す。図３０は２つの異なるチップ層を示しているが、別の実施形態では３つ以上のチップ層を有してもよい。チップ層は、それぞれのチップ層内の通し孔が一体に合致するように整列されており、２つのチップ層３０５１および３０５２は、互いに固定的に連結されて、単一に統合された層状構造体３０５３を形成する。複数のチップ層３０５１および３０５２は、接着剤、化学的架橋剤、ねじ止め具、ボルト締め、リベットかしめ、クランプなどの使用によってなどの視覚的に分かる種々の方式で互いに取り付けられることができる。あるいは、チップ層３０５１および３０５２の表面が研磨されているまたは十分に平坦である場合、これらは、圧力を使用してまたはファンデルワールス力の使用によって直接結合することができる。

ハイブリダイゼーションプローブおよびＰＣＲプライマのセットなどの多くの異なる核酸成分のセットが、迅速な分析のためにこのようにして層状チップ内に予め装填されることがきる。分析される核酸成分またはサンプルの装填は、核酸成分を含む溶液を直接サンプル通し孔へピペットで移すこと、または、核酸成分を含む溶液の一滴をサンプル通し孔の開口上で引き出すことによってなどの種々の方式で達成することができる。あるいは、チップ層は、核酸成分を含む溶液内に浸されてもよく、その後引き上げられる。別法として、多数の患者サンプルから得ることができる核酸標的のアレイが固定化されて、次いで、プライマおよびプローブを含むＰＣＲマスターミックスなどの試薬と共に装填されてもよい。ＤＮＡ検出アッセイの合計数が、所与の特定の用途に対して確立されると、通し孔の数は、最小化するために未使用の通し孔によって非特定に結合されて低減されてよい。未使用の通し孔の開口はワックスによって遮断されてよく、サンプル標的ＤＮＡの非特定の結合を防止する。

例えば、このような層状のチップは、ＤＮＡの捕捉および増幅を実現することができるが、ここでは、１つのチップ層が、通し孔の親水性表面と共有的に連結されたオリゴヌクレオチドのアレイと接触している液体サンプル内の対象のＤＮＡを捕捉し、一方、他のチップ層は、捕捉されたＤＮＡをＰＣＲなどによって増幅する。

第２のチップ層の通し孔のアレイ内でカプセル封入されたＰＣＲプライマおよびプローブは、これらの通し孔内のオリゴヌクレオチドによって捕捉された標的に対して特異的であってよい。例示の診断アッセイでは、このことは、複数の病原体に対して１つの病原体ごとの複数のアッセイを可能にし、データの品質を向上させるために分析を繰り返す。このような多機能性チップのフロースルーの性質は、標的の濃縮、精製および増幅を容易にするのに使用することができ、このことにより、以前の核酸分析法と比較して同じくらいまたはそれ以上の規模によって核酸検出の感度を増大させる。いくつかの実施形態は、複数のチップ層の組合せ、および、上述したワックスなどの試薬担持ワックスの１つ以上の層を有することができる。

ＤＮＡ捕捉および増幅の実施形態では、捕捉チップ層は、サンプル通し孔の側面に付けられた特定の核酸プローブ（例えば、４０〜６０量体のＤＮＡ）を有する。頑丈な内側オリゴヌクレオチド捕捉表面のコーティングは、非特定の結合を最小化するという目的と一致して使用される。オリゴヌクレオチドを表面上に固定化するために確立された化学作用を利用することができる。例えば、酸化物表面（ガラスなど）は、ウンデセニルトリクロロシランを用いて修飾されることができ、その端部にビニル基のカーボキシレートを露出している１重層を生成し、これは、水溶液中でＫＭｎＯ４／ＮａＩＯ４に露出することによりカルボン酸に官能化される。カルボン酸は、その後で１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルへの露出により活性化されてＮＨＳエステルになる。その端にアミン基を担持するオリゴヌクレオチドまたはｃＤＮＡ鎖は、次いで、表面上のＮＨＳエステルと鎖内のアミン基との間の反応を介してアミド結合を形成することにより表面に固定化することができる。アミド結合および下にあるウンデセニルトリクロロシランの１重層は、ハイブリダイゼーション状態において表面上で鎖を保持するのに十分に頑丈な結合をもたらすことが期待される。

異なるチップ層は、相補的ＰＣＲプライマおよびハイブリダイゼーションプローブを含む各層内の通し孔が位置合わせされるようにするために、高精度のアライメントで機械的に一体に結合されなければならない。気密封止された結合が望ましい場合があるが、接触しているチップ層表面が疎水性にコーティングされる場合は必ず必要であるわけではない。この場合、層結合プロセスも、隣接する通し孔の間の流体的分離を確実にするためにコーティングの疎水性を修正してはならない。１つの具体的な実施形態では、２つのチップ層の外側面が、アッセイプローブで充填される前に反応性の１重層で予めコーティングされており、次いで、触媒活性による架橋結合によって一体に結合される。

プローブが添加された後にまたはハイブリダイザーションステップの後に接着剤が塗布される場合、接着剤はＰＣＲを妨げるあるいは標的オリゴを結合させる場合があることから、接着剤塗布プロセスは、通し孔へのあふれ出しを最小化しなければならない。過剰な接着剤は、カプセル封入のワックスを溶解しない溶媒を用いて通し孔の内側から洗い出すことができる。また、結合プロセスは、少しのプローブ−カプセル封入のワックスも溶解しないようにするために室温付近で行われなければならず、さらに、理想的には、汚れまたは核酸の汚染要因物（ただし、洗浄は可能）によってチップを汚染しない方式でなされなければならない。これには、異なる感圧接着剤、および、均一な圧力を加える手段を発展させるためのスプレー、ローラおよびスタンプなどの分注機構の試験が必要である。アライメントは、チップ層の製造プロセスの間に正確にエッチングされるガイド孔と相補的なピンを有する正確なジグの使用によって達成される。必要な場合、チップは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの遮断剤によって遮断されることができ、結合プロセスの間に生成されるあらゆる結合部位をふさぐ。ハイブリダイゼーション緩衝剤およびＰＣＲマスターミックスは、接着層との適合性を改良するために、動的な遮断剤と配合されてよい。

捕捉チップ層は、標準ガラス−スライドスポットハイブリダイゼーションアレイと類似の方式で機能し、核酸は、ハイブリダイゼーションの速度および／または特異性を最適化するようになされた緩衝剤内で希釈されてよく、さらに、捕捉チップ層のすべてのサンプル通し孔へ移動する可能性を有しており、したがって、相相補的ハイブリダイゼーションの低自由エネルギー状態に達する。別法として、ハイブリダイゼーションは、鼻咽頭洗浄のサンプルなどの手をつけていないあるいは希釈された患者サンプル内で行われてよい。酵素は、ハイブリダイゼーションの前に病原体を崩壊させるのに使用されてよい。

捕捉チップ層は、標準的なマイクロアレイを用いたときのように、核酸サンプルを用いて６時間以上インキュベートされてよい。このインキュベーション時間は、サンプルをチップ内およびその周辺で循環させることにより低減することができるが、ＰＣＲプライマおよびプローブを閉じ込めるワックスのカプセル封入マトリックスが、９５℃にまで加熱することにより熱サイクルが開始されるまで溶解に耐える必要がある。加えて、ストリンジェンシーは、塩濃度を下げて結果的にインキュベート温度を下げることよって制御することができる。いくつかの用途では、２つの追加的な選択があってよい；（１）ハイブリダイゼーション温度を減少させて、ハイブリダイゼーションの特異性を犠牲にして、可能性として検出を制限する、あるいは、（２）ハイブリダイゼーションステップ後に増幅試薬を用いて捕捉チップの上へチップを手動によって積み重ねる。手動による積み重ねの方法は、２００１年５月７日に出願された、「マイクロウェルアレイ内の物質のスクリーニングの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ ｉｎ ａ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ａｒｒａｙ）」と題される、米国特許出願第０９／８５０，１２３号明細書に記載されており、これは、参照により本明細書に組み込まれる。手動による積み重ねは、例えば、各プラテンからの複数の通し孔の少なくとも１つが、互いに隣接するプラテンの通し孔と一致するような隣接様式で少なくとも２つのプラテンを一緒に積み重ねて少なくとも１つの連続したチャネルを形成するステップと、各連続したチャンネルに液体を移送するステップとを備えている。各プラテンは空隙によって各隣り合うプラテンから離しておくことができ、また液体を毛細管チューブ、または少なくとも１つのカニューレによって移送することもできる。

ハイブリダイゼーションの反応速度は、制限された拡散速度であり、核酸の拡散定数が小さく（〜１０^−６ｃｍ^２／ｓ）、通し孔内へのまたは通し孔の中の拡散が、迅速なハイブリダイゼーションに対して十分でなくてよいことを条件とする。この問題は、サンプルに繰り返し捕捉チップ層を通させるために積極的にサンプルを循環させるなどの各通し孔内の表面捕捉面積を増大させることによって処理することができる。また表面捕捉面積を、ハイブリダイゼーション捕捉プローブを用いて官能化することができる多孔性マトリックスを各通し孔内へ導入することによって増大することができる。マトリックスの気孔率は、表面積を最大にするように選択されなければならず、一方で、通し孔を通る液体の流れに必要な圧力を最小化する。例えば、多孔性ガラスは、ホルムアミドと混合されたケイ酸カリウムの混合物を通し孔に充填し、次いで１１０℃で１時間焼成することにより、通し孔内に統合することができる。ホルムアミドの濃度を変えることにより、あるいは、多孔性シリカまたはポリマービーズなどの粒子をケイ酸カリウム混合物内に含むことにより、マトリックスの気孔率が所望通りに調整することができる。また、本明細書で説明する固定化の化学作用は、捕捉プローブをガラス表面に付けるのに使用することができる。別の実施形態では、ポリアクリルアミド、寒天またはエアロゲルなどの代替物を使用することができる。

ハイブリダイゼーション速度を増大させるために、チップはスピン／回転させられることができる（例えば、図１６（ａ〜ｂ参照）。別法として、アドバリティックス（Ａｄｖａｌｙｔｉｘ）から市販されているハイブリダイゼーション器具のアレイブースター（ＡｒｒａｙＢｏｏｓｔｅｒ）（商標）を使用した表面弾性波によるサンプルの攪拌も同様に、ハイブリダイゼーション速度を上げることができる。

増幅チップ層は、捕捉チップ層内の対応するサンプル通し孔が捕捉する核酸をアッセイするのに適したＰＣＲのためのプローブおよびプライマを有する。例えば、プローブは、特定のウィルスゲノムまたはゲノム断片を捕捉するようになされてよく、ＰＣＲ試薬は、そのゲノム内の１つ以上の配列を増幅することができる。ワックスが固定化された試薬を使用するＤＮＡ捕捉および増幅の実施形態では、捕捉されたオリゴ標的核酸対が、熱サイクルの開始後に溶解し、増幅チップ層は、捕捉配列と重なるまたは独立しているのどちらかのプライマを有することができる。このような実施形態は、試薬コストをかなり節約する。例えば、タクマン（ＴａｑＭａｎ）（登録商標）ＰＣＲ試薬の標準的なチューブは、これらのチップ内で約１５０，０００回の試験が可能である。

準備された層状チップを使用は、精製および修飾の標準的な方法を使用して核酸サンプルを用意することから始まる。例えば、任意の潜在的な病原菌を溶解させた後、ユーザは、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ＲＮＡ／ＤＮＡキットを使用してゲノミック材料を抽出して、サンプルを分離して、サンプル断片上でランダムヘキサマープライムド逆転写（ＲＴ）を実施して、次いで、２つのサンプルを再結合する。いくつかの実施形態では、ウィルスＲＮＡはバクテリアＤＮＡよりかなり高い滴定濃度で存在する傾向があることから、ＲＴは、原サンプルの小さな断片上で実施することができる。

上述の実施形態でのように、層状チップは、種々の方式で準備されたサンプルが装填することができる。例えば、ある量の高密度浸漬液は、１側面が開いているチップホルダケースに添加することができる。核酸サンプルは、次いで、浸漬液の上部上の薄い層内を浮遊することができる。準備されたチップは、次いで、チップホルダケース内で下げられて、チップが浸漬液内でサンプル層を通過するときにサンプルを自己装填する。チップホルダケースは、次いで、サンプルの上部に分注されて硬化されるシーリング剤によってなどで密封される。

例えば上部チップ３１といった１つのチップ層内の捕捉プローブは、サンプル液体内の標的核酸と相互作用して標的核酸を捕捉する。非特定に結合されている核酸を取り除くための緩衝剤内での洗浄ならびに次いで洗浄用緩衝剤とＰＣＲマスターミックス（典型的に、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、緩衝剤、マグネシウム塩化物、および、動的な遮断剤を含む溶液）との入れ替え後、層状構造体３３は、熱サイクルシステム内に配置され、そこでは、ＰＣＲプロセスを始めるための温度の上昇により例えば底部チップ３２といった別のチップ層内のＰＥＧが溶解し、ＰＣＲプライマおよび／またはプローブが開放され、別のチップの通し孔内に捕捉された標的核酸のＰＣＲ増幅が開始される。

撮像／分析が、次いで、熱サイクル処理と共にあるいはそれとは別個にのどちらかで、チップ上において実施される。核酸は、エンドポイントＰＣＲを使用してチップ内で二者択一的に検出することができるが、定量ＰＣＲが、いくつかの用途の場合には抵抗しがたい利点をもたらす。熱サイクルおよび分析後、ＰＣＲチップおよびサンプルを含む使用されたチップホルダケースは処分されてよい。

エンドユーザにとっての完全なシステムでは、希釈バッファおよびマスターミックスと共に捕捉およびＰＣＲプライマが予め装填されている気密封止によって密封された層状チップと、チップ装填および密封溶液と、リアルタイムＰＣＲ用の小型で安価な撮像用サーマルサイクラとを含むことができる。１つの具体的な製品は、エンドポイント分析に基づくＰＣＲによる遺伝子型判定で使用するための１’’×３’’の顕微鏡スライド−フォーマットアレイチップに基づく。消耗品には、マスターミックスおよび密封試薬（ペルフルオロ化された液体およびＵＶ硬化シーリング剤）と共に、３０７２−孔チップおよびチップケースが含まれる。自動装填スライドスキャナ、および、１００，０００ドルより安い２０−スライドフラットブロックサーマルサイクラを用いて、１時間につき３０，０００のＳＮＰ分析を実施することができる。これは、１日を基準して、現在提供されている他のシステムよりもＳＮＰの規模の程度が小さく、サンプルの消費が低いという利点が加えられる。

層状チップ構造体は、例えば臨床サンプル内の病原体を検出するといった種々の他の特定用途で有用である可能性がある。１つのチップ層は、チップの内側の親水性表面上で固定化することができる、抗体を有する標的病原体を捕捉するように構成されることができ、さらに、別のチップ層は、ＰＣＲ増幅による捕捉された病原体の検出用に構成することができる。リゾチーム、リパーゼ、または、チモリアーゼなどの溶菌酵素は、ワックス内で固定化されることができ、捕捉された病原体の溶解を助ける。

酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）アレイの問題の１つは、現在では、アレイが、共通のアッセイ条件を有する必要があることである。上述した層状チップ構造体はこれを克服することができ、１つのチップ層内の緩衝塩などの固定化試薬によってＥＬＩＳＡの条件を変化させるのに有用である場合がある。ＥＬＩＳＡ手法を使用することができ、ここでは、病原体が、通し孔の一部分で固定化された抗体によって捕捉され、さらに、検出抗体が、通し孔の別の部分内の低融点ＰＥＧにカプセル封入され、溶液内へゆっくりと放出される。次いで、チップは、結合していない検出抗体を取り除くために洗い流され、ＥＬＩＳＡが、アルカル性ホスファターゼまたはワサビペルキオシダーゼなどの酵素に接合されさらに任意のいくつかの利用可能な色原性、蛍光性またはルミネンス性の基板の洗浄および添加によって検出される第２次抗体によって展開される。

別の実施形態では、捕捉チップ層は、ＳＡＲＳ、インフルエンザＡ、インフルエンザＢ、ＲＳウィルス（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ Ｖｉｒｕｓ）、パラインフルエンザ−１、パラインフルエンザ−２、パラインフルエンザ−３および炭疽菌などの病原体内で見られるウィルスＲＮＡおよびバクテリアＤＮＡ用のＤＮＡハイブリダイゼーションプローブを用いて導入することができる。相補的な増幅チップ層は、次いで、捕捉されたウィルス核酸内に存在すると見込まれるウィルス核酸配列に対する、乾燥してカプセル封入されたタクマン（ＴａｑＭａｎ）（登録商標）プライマおよびプローブが装填される。チップ層は結合されて、いくつかのパラメータ：検出限界、特異性、数量的精度、チップごとの変異性、数カ月にわたる１日ごとの変異性、ユーザごとの変異性、のために試験される。

上述したオリゴヌクレオチドの捕捉およびＰＣＲ増幅を伴うオフラインでのサンプルの調製に基づく実施形態が、そのものとして有用である一方で、別の実施形態では、オペレータに依存するステップを最小にして患者のサンプルから結果まで直接的に進める。例えば、一実施形態では、複数のウィルスを１つのチップ層内の抗体によって捕捉されることができ、さらにこれらのウィルスを温度および／または酵母的消化によって崩壊することができ（ウィルス核酸を劣化から保護しながら）、次いで、溶菌酵母を変性させることができ（熱により）、逆転写ＰＣＲを実施することができる。このような実施形態は、標準的な核酸サンプル調製手順の必要性を回避する。

したがって、本発明の実施形態は、逆転転写システムと、統合型ＲＴ−ＰＣＲアレイを生成するために複数のチップ層内でカプセル封入されるＰＣＲ増幅システムとを含む。また、種々の実施形態が、低濃度の複数の病原体核酸配列を検出することができる。また、具体的な実施形態では、ＳＡＲＳのＲＮＡを含む呼吸器病原体核酸の検出のための複数の現存するＰＣＲアッセイを統合する。

また、複数の実施形態は、高い試験の特異度を実現する。例えば、３つのプローブが、各標的ＤＮＡ配列、に対して与えられることができ、２つのＰＣＲプライマおよび捕捉プローブは相補的な配列からなる。場合によっては、タクマン（ＴａｑＭａｎ）（登録商標）プローブまたは分子指標として第４のプローブが使用されることもできる。これにより、無病誤診および有病誤診の発生が低減する。したがって、高濃度のマイクロ流体アレイフォーマット内でＰＣＲを実施できることにより、従来のＤＮＡマイクロアレイと比較して優れたデータ品質をもたらすことができる。加えて、病原体ごとの複数の配列は、容易にアッセイされることができ、信頼度をさらに増大させ、病原体の変性という結末を減少させる。

さらに、具体的な実施形態では、複数の病原体の検出を行うことができる。並行して反応を実施することにより、ワンポット多重試薬を開発する必要がなくなる。従来の多重化は、通常は２つまたは３つの配列のみの検出を可能にする複数の染料を使用するか、あるいは、コストおよび複雑さが増す電気泳動法などの後処理ステップを使用するかのどちらかであった。

さらに、いくつかの実施形態は、ポイントオブケア使用によく適している。低コストでコンパクトサイズで使用が簡単な具体的な実施形態は、アッセイベースの多重化されたＰＣＲが、多くの臨床環境およびポイントオブケア環境で実施されるのを可能にする。かなり低減されたプライマおよびプローブの量および低コストの材料ならびに開発された処理方法により、普及使用のための低コストの溶液が可能になる。

また、複数の実施形態は、非常にスケーラブルであり、１つの患者サンプルにつき少数または多数の測定を実施することが可能であり、および／または、複数の患者サンプルを並行に処理する。具体的な実施形態は、最大２４，５７６プローブまたはサンプルを含むチップフォーマットに対応する。複数の層状チップは、従来のＤＮＡマイクロアレイに類似した方式で並行に処理することができる。捕捉／ハイブリダイゼーションに対する進んだ考え方は、上流の精製プロセスを簡素化し、次期の集積素子を可能にすることができる。

一度作られると、層状構造体チップは、典型的には、パッケージ化されて、カプセル封入されたタンパク質および抗体の存在などのチップフォーマット全体に応じた適度な量の時間、おそらく数カ月の間、保存される。糖類および抗酸化剤などの種々の安定剤を用いた製剤が有益である場合がある。また、真空包装および種々の水分を有する不活性ガス内へのパッケージングが有用である場合があり、これは、冷蔵または冷凍保存であってよい。

カリブレーションダイ（Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｄｙｅ）の乾燥
リアルタイムＰＣＲを実施するとき、例えば、タクマンリアクション（ＴａｑＭａｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）内のＲＯＸといったカリブレーションダイを含んでいるのが一般的である。カリブレーションダイは、システムの励起および発光光学素子内の均一性の欠陥を補正する。タクマンリアクションでは、ＶＩＣのＲＯＣ蛍光強度に対する比として信号が示される。ＰＣＲ用の通し孔アレイを使用するとき、光学的欠陥だけでなく、マイクロ流体アレイ上のＰＣＲプローブおよび／またはプライマの装填、乾燥、および、再可溶化の非均一性を訂正することが望ましい。このことは、乾燥の前にカリブレーションダイをプライマ／ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）混合物に添加することにより達成される。実際に、カリブレーションダイの信号は、最初の数回の熱サイクル後も、一定の値に近似する傾向がある。種々の実施形態において、改良測定のために平衡に到達した後の数回のサイクル後に、正規化の値が測定される。

種々の実施形態において、開示したシステムおよび方法は、コンピュータシステムを用いた使用のためのコンピュータプログラム製品として実装することができる。このような実装形態は、コンピュータ読取り可能媒体（例えば、ディスケット、ＣＤ−ＲＯＭ、ＲＯＭ、または、固定ディスク）などの有形的表現媒体上に固定されるか、モデム、または、媒体を通してネットワークに接続される通信アダプタなどの他のインタフェースデバイスを介してコンピュータシステムに伝送できるかのどちらかの一連のコンピュータ命令を含んでよい。媒体は、有形表現媒体（例えば、光学またはアナログ通信線）か、あるいは、ワイヤレス技術（例えば、超短波電波、赤外線または他の伝送技術）を用いて実装される媒体からのどちらかであってよい。一連のコンピュータ命令は、システムに関して前に本明細書で説明した機能性のすべてまた一部を具体化する。当業者であれば、このようなコンピュータ命令は、多くのコンピュータアーキテクチャまたはオペレーティングシステムでの使用のために多数のプログラム言語で書き込まれることができることを理解するであろう。また、このような命令は、半導体、磁気、光学、または、他の装置などの任意の記憶装置内に保存されることができ、さらに、光学、赤外線、超短波電波、または、他の伝送技術などの任意の通信技術を使用して伝送することができる。このようなコンピュータプログラム製品は、添付の印刷されたあるいは電子化された説明書（例えば、収縮包装されたソフトウェア）を備えた取外し可能な媒体として配布されることができ、あるいは、コンピュータシステム（例えば、システムＲＯＭまたは固定ディスク）に予めロードされることができ、さらにあるいは、ネットワーク（例えば、インターネットまたはワールドワイドウェブ）を介したサーバまたは電子掲示板から配布することができる。

本発明の種々の例示的な実施形態を以下に開示したが、当業者は、本発明の真の範囲から外れることなく本発明のいくつかの利点を実現する種々の変形形態および修正形態が作られることができることを理解するであろう。

本発明のこれまでの特徴は、添付の図面を参照し、以下の詳細な記載を参照することによってより容易に理解されるであろう。
図１は、従来の技術による典型的な通し孔のサンプルアレイを示す図である。 図２は、本発明の実施形態による、サンプルアレイのためのケースの分解斜視図である。 図３（ａ）は、本発明の実施形態による、センタリングガイドレールを備えるＵ形フレームを含むケースを示す上面図である。図３（ｂ）は、本発明の実施形態による、図３（ａ）に示すケースを示す側面図である。 図４は、本発明の実施形態による、ユーザがアッセイを実施するのを可能にするために、アレイ、ケース、および、関連する構成要素を含むシステムを提供するための方法のブロック図である。 図５から１６は一実施形態を示す図であり、この実施形態によって、ユーザは、図２に関連して説明されるシステムを使用してアッセイを実施することができる。図５および図６は、本発明の実施形態による、ケースへの浸漬液の添加を示す図である。 図５から１６は一実施形態を示す図であり、この実施形態によって、ユーザは、図２に関連して説明されるシステムを使用してアッセイを実施することができる。図５および図６は、本発明の実施形態による、ケースへの浸漬液の添加を示す図である。 図５から１６は一実施形態を示す図であり、この実施形態によって、ユーザは、図２に関連して説明されるシステムを使用してアッセイを実施することができる。図７および図８は、本発明の実施形態による、図６のケースへのサンプルの添加を示す図である。 図５から１６は一実施形態を示す図であり、この実施形態によって、ユーザは、図２に関連して説明されるシステムを使用してアッセイを実施することができる。図７および図８は、本発明の実施形態による、図６のケースへのサンプルの添加を示す図である。 図５から１６は一実施形態を示す図であり、この実施形態によって、ユーザは、図２に関連して説明されるシステムを使用してアッセイを実施することができる。図９および１０は、本発明の実施形態による、図８のケースへのマイクロ流体アレイの挿入を示す図である。 図５から１６は一実施形態を示す図であり、この実施形態によって、ユーザは、図２に関連して説明されるシステムを使用してアッセイを実施することができる。図９および１０は、本発明の実施形態による、図８のケースへのマイクロ流体アレイの挿入を示す図である。 図５から１６は一実施形態を示す図であり、この実施形態によって、ユーザは、図２に関連して説明されるシステムを使用してアッセイを実施することができる。図１１は、本発明の実施形態による、図１０のケースからの過剰サンプルの除去を示す図である。 図５から１６は一実施形態を示す図であり、この実施形態によって、ユーザは、図２に関連して説明されるシステムを使用してアッセイを実施することができる。図１２および１３は、本発明の実施形態による、図１１のケースへのシーリング剤の適用を示す図である。 図５から１６は一実施形態を示す図であり、この実施形態によって、ユーザは、図２に関連して説明されるシステムを使用してアッセイを実施することができる。図１２および１３は、本発明の実施形態による、図１１のケースへのシーリング剤の適用を示す図である。 図５から１６は一実施形態を示す図であり、この実施形態によって、ユーザは、図２に関連して説明されるシステムを使用してアッセイを実施することができる。図１４は、本発明の実施形態による、図１３に示す方式で適用されたシーリング剤を硬化させるための紫外光の使用を示す図である。 図５から１６は一実施形態を示す図であり、この実施形態によって、ユーザは、図２に関連して説明されるシステムを使用してアッセイを実施することができる。図１５（ａ）は、本発明の実施形態による、図１４の方法の実施により得られる密封されたケースを示す図である。図１５（ｂ）は、本発明の実施形態による、グリースロック（ｇｒｅａｓｅ ｌｏｃｋ）を含む密封されたケースを示す上面図である。 図５から１６は一実施形態を示す図であり、この実施形態によって、ユーザは、図２に関連して説明されるシステムを使用してアッセイを実施することができる。図１６（ａ）は、ケース内に乱入が導入された、本発明の実施形態による、マイクロ流体アレイの通し孔内へのサンプルの導入を示す図である。図１６（ｂ）は、マイクロ流体アレイが回転する、本発明の実施形態による、ナノリットルアレイの通し孔内へのサンプルの導入を示す図である。 図１７は、本発明の実施形態による、漏斗を介してマイクロ流体アレイの通し孔内へのサンプルの導入を容易にする本発明の実施形態を示す図である。 図１８は、本発明の実施形態による、分析ソフトウェアで分析を施されるデータを供給するためのサーマルサイクラ内およびスキャナ内にある図１５の密封されたケースの使用を示す図である。 図１９は、本発明の実施形態による、熱サイクルシステムを示す図である。 図２０（ａ〜ｃ）は、本発明の種々の実施形態による、様々な特定のサイクリングヘッドの実施形態の構造的な細部を示す図である。 図２１は、本発明の実施形態による、熱サイクルの平坦なブロックを示す側面図である。 図２２は、本発明の実施形態による、撮像システムを示す図である。 図２３は、本発明の実施形態による、１つ以上の発光ダイオード（ＬＥＤ）を使用する透過撮像システムを示す図である。 図２４は、本発明の一実施形態による、サーマルサイクラシステムの側断面図である。 図２５は、本発明の一実施形態による、リッド組立体が開いた位置にある、サーマルサイクラの斜視図である。 図２６は、リッド組立体が閉じた位置にある、図４のサーマルサイクラの斜視図である。 図２７は、本発明の一実施形態による、リッド組立体の斜視図である。 図２８は、本発明の実施形態による、サンプルアレイを固着させるための、ばね機構を有するリッド組立体を備える熱サイクルの図である。 図２９（ａ〜ｂ）は、本発明の実施形態による、種々の材料の層を含むマイクロ流体アレイの通し孔を示す図である。 図３０は、本発明の実施形態による、層状のマイクロ流体アレイ構造体を示す図である。

Claims (28)

1. 複数のサンプルを熱サイクルさせるためのシステムであって、
   内容積を規定する流体に密である空洞を有するケースと；
   前記内容積の中に配置されるマイクロ流体アレイであって、１対の対向表面、厚さ、および、前記表面の間の前記厚さを通る複数の通し孔を有するシート材料を含むアレイと；
   前記ケースに熱接触するように適合された少なくとも１つの熱で制御される表面を有するサーマルサイクラと
   を有するシステム。
2. 前記熱で制御される表面に熱接触するときに特定の位置および配向で前記ケースを保持するための位置決め機構をさらに含む、請求項１に記載のシステム。
3. 前記位置決め機構が、前記熱で制御される表面上に突起およびくぼみのうちの１つを含む、請求項２に記載のシステム。
4. 前記マイクロ流体サンプルアレイが前記くぼみに滑り込むことができるようするために、前記くぼみが傾斜表面を有する、請求項３に記載のシステム。
5. 前記サーマルサイクラが、前記熱で制御される表面への装填および／またはそこからの除去の前に前記ケースを配置するためのデッキを有する、請求項１に記載のシステム。
6. 前記ケースが、前記デッキから前記熱で制御される表面上へ滑り込むことができる、請求項５に記載のシステム。
7. 前記デッキが、前記熱で制御される表面の平面に沿って回転することができる、請求項５に記載のシステム。
8. 前記サーマルサイクラが、前記ケースを前記熱で制御される表面に押圧する指要素を含む、請求項１に記載のシステム。
9. 前記ケースと前記熱で制御される表面との間に位置決めされる熱伝達パッドをさらに有する、請求項１に記載のシステム。
10. １つ以上の規定された波長で前記通し孔のうちの少なくとも１つを照射することができる照射源をさらに有する、請求項１に記載のシステム。
11. 前記照射源が、少なくとも１つのＬＥＤを含む、請求項１０に記載のシステム。
12. １つ以上の通し孔を撮像して画像データを供給するための撮像装置をさらに有し、前記照射源が、カメラから軸外に、前記アレイに対して対称に位置決めされる少なくとも２つの照射源を含む、請求項１０に記載のシステム。
13. １つ以上の通し孔を撮像して画像データを供給するための撮像装置をさらに有する、請求項１に記載のシステム。
14. 前記撮像装置が、カメラおよびスキャナのうちの１つであり、前記カメラが、前記通し孔のそれぞれを同時に撮像して画像データを供給するためのものであり、前記スキャナが、前記通し孔のうちの１つ以上を順番に撮像して画像データを供給するためのものである、請求項１３に記載のシステム。
15. 前記内容積の中に配置される浸漬液をさらに有する、請求項１に記載のシステム。
16. 前記アレイが、１００を超える通し孔を有する、請求項１に記載のシステム。
17. 前記アレイが、２０ｍｍ^２につき１つの通し孔を超える通し孔密度を有する、請求項１に記載のシステム。
18. 筺体であって、前記サーマルサイクラが内部に位置決めされる筺体と；
    前記筺体内に位置決めされて前記サンプルを撮像するための撮像装置と；
    前記筺体内に位置決めされて１つ以上の予め規定された波長で少なくとも１つのサンプルを照射するための照射システムと
    をさらに有する、請求項１に記載のシステム。
19. 複数のサンプルを熱サイクルさせる方法であって、
    ケース内の流体に密な空洞内にマイクロ流体アレイを保持するステップであって、前記アレイが、１対の対向表面、厚さ、および、前記表面の間の前記厚さを通る複数の通し孔を有するシート材料を含むステップと；
    熱で制御される表面と熱接触して前記ケースを配置するステップと
    を含む方法。
20. ある量の浸漬液を有する前記空洞内の前記マイクロ流体アレイを覆うステップをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
21. 前記熱で制御される表面に熱接触するときに前記ケースを特定の位置および配向に保持するための位置決め機構を使用するステップをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
22. １つ以上の確定された波長で前記通し孔のうちの前記少なくとも１つを照射するステップをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
23. 少なくとも１つの通し孔を撮像するステップをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
24. 照射するステップが、前記撮像装置から軸外に、前記アレイに対して対称に位置決めされた２つの照射源から照射するステップを含む、請求項２３に記載の方法。
25. 撮像するステップが、２つ以上の通し孔を順番に撮像するステップを含む、請求項２３に記載の方法。
26. 撮像するステップが、各通し孔を同時に撮像するステップを含む、請求項２３に記載の方法。
27. 前記アレイが、１００を超える通し孔を有する、請求項１９に記載の方法。
28. 前記アレイが、２０ｍｍ^２につき１つの通し孔を超える通し孔密度を有する、請求項１９に記載の方法。

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