JP2014509865A - シグナルの組合せ使用による多重化デジタルアッセイ - Google Patents

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Abstract

シグナルの組合せ使用を通してより多くの数の標的に関して多重化デジタルアッセイを行うための、方法、装置、および組成物を含むシステム。R個よりも多い標的を区画内で増幅するステップと；区画からのR個の異なる波長レジームで検出された光を表すR個のシグナルを生成するステップであって、R≧2であるステップと；R個のシグナルに基づいて、区画内の各標的の平均レベルを計算するステップであって、計算されたレベルが、存在する場合には異なる標的が同じ個々の区画内で同時発生することを説明するステップと；を含む。

Description

優先権出願の相互参照
本出願は、参照によりその全体が全ての目的で本明細書に組み込まれる2011年3月18日出願の米国仮特許出願第61/454,373号の、35U.S.C.§119(e)に基づくものでありかつその利益を主張するものである。
相互参照
本出願は、下記の資料:2006年5月9日発行の米国特許第7,041,481号;2010年7月8日公開の米国特許出願公開第2010/0173394A1号;2011年9月29日公開のPCT特許出願公開第WO2011/120006A1号;2011年9月29日公開のPCT特許出願公開第WO2011/120024A1号;2011年11月1日出願の米国特許出願第13/287,120号;2011年7月12日出願の米国仮特許出願第61/507,082号;2011年7月20日出願の米国仮特許出願第61/510,013号;およびJoseph R. Lakowicz、PRINCIPLES OF FLUORESCENCE SPECTROSCOPY (第2版、1999年)の全体を、参照により全ての目的で組み込む。
デジタルアッセイは、一般に、サンプル中の分析物の個々の複製物の存在または活性を検出する能力に依拠する。例示的なデジタルアッセイでは、サンプルを、一般に均等な容積の一組の区画に分離し、これらの区画のそれぞれは平均して分析物の約1個未満の複製物を含有している。分析物の複製物が区画内にランダムに分布する場合、一部の区画は複製物を含有すべきでなく、その他はただ1個の複製物を含有し、区画の数が十分多い場合には、さらにその他の区画が2個の複製物、3個の複製物、さらにより多くの数の複製物を含有すべきである。区画内の分析物の所与の平均濃度に基づいて、区画内に正確に0、1、2、3個、またはそれ以上の複製物を見出す確率は、ポアソン分布により表される。逆に言えば、区画内の分析物の平均濃度は、区画内で所与の数の複製物を見出す確率から推定することができる。
複製物がないことを見出す確率および1個または複数の複製物を見出す確率の推定は、デジタルアッセイで測定することができる。各区画は、その区画が分析物の少なくとも1個の複製物を含有する陽性区画であるか、または分析物の複製物を含有しない陰性区画であるかを決定するために、試験することができる。区画内に複製物がないことを見出す確率は、陰性の試験区画の割合(「陰性割合」)によって概算することができ、少なくとも1個の複製物を見出す確率は、陽性の試験区画の割合(「陽性割合」)によって概算することができる。次いで陽性割合または陰性割合をポアソンの方程式で利用して、区画内の分析物の濃度を決定することができる。
デジタルアッセイは、分析物の単一複製物の検出ができるように、区画内での核酸標的の増幅を頻繁に依拠する。増幅は、デジタルポリメラーゼ連鎖反応(PCR)アッセイを実現するために、PCRを介して実行されてもよい。増幅された標的は、分析物そのものであってもよく、または区画形成の前もしくは後に発生した分析物の代用物であってもよい。標的の増幅は、反応に含まれる蛍光プローブで光学的に検出することができる。特にプローブは、標的が増幅されたか否かを示す蛍光シグナルを提供する、色素を含むことができる。
デジタルPCRアッセイは、各区画内の2個以上の異なる標的の検出が可能になるように、多重化することができる。標的の増幅は、異なる検出チャネルで検出される蛍光、即ち放出(および/または励起)の異なる波長または波長領域(「色」)で蛍光を発する、異なる色素で標識された標的特異的プローブを利用することによって、区別することができる。デジタルPCRアッセイ用の検出器が、R種の異なる色素によって放出された蛍光を区別可能に測定できる場合、そのアッセイは、R種の異なる標的を効果的に測定することが可能である。しかし、より多くの色を検出するためにより多くのチャネルを有する機器は、より少ない検出チャネルを有する機器よりも費用がかかる。また、区別可能な色素の数が増えると費用がかかり、ある数を超えると非現実的になる。一方、多くの適用例は、特にサンプルが限られる場合、より高度な多重化から大きな利益を得ることができる。
デジタルアッセイの多重レベルを増大させる、新しい手法が求められている。
本開示は、シグナルの組合せ使用を通して、より多くの数の標的に関して多重化デジタルアッセイを行うための、方法、装置、および組成物を含むシステムを提供する。
本開示の態様による、デジタルアッセイを行う例示的な方法のフローチャートである。 本開示の態様による、図1のデジタルアッセイを行うための例示的なシステムの概略図である。 本開示の態様による、デジタル増幅アッセイで標的ごとに専用シグナルが生成されるように、検出することのできる放出された光を介して標的増幅が存在するか否かを報告することが可能な一対の標的およびそれに対応するプローブの概略図である。 本開示の態様による、液滴内で行われたデジタル増幅アッセイで、図3のプローブから放出された光を検出することによって生成され得るそれぞれの専用シグナルの、一対の例示的なグラフであり、各シグナルが、液滴を含有する流体の流れから同じ時間間隔にわたって検出された光から生成される、グラフである。 本開示の態様による、図4のそれぞれの専用シグナルの強度に基づいて、図3の一対の標的の複製物が図4内でそこから光が検出される液滴の間にどのように分布するかの概略図である。 本開示の態様による、デジタル増幅アッセイで一対の複合シグナルが生成されるように、検出することのできる放出された光を介して標的増幅が存在するか否かを報告することが可能な3個の標的およびそれに対応する例示的なプローブの概略図である。 本開示の態様による、液滴内で行われたデジタル増幅アッセイで、図6の3個のプローブからの蛍光放出を検出することによって生成され得る一対の複合シグナルの、一対の例示的なグラフであり、放出された光が、液滴を含有する流体の流れから同じ時間間隔にわたって2個の異なる波長レジームで検出される、グラフである。 本開示の態様による、図7のそれぞれの複合シグナルの強度に基づいて、図6の3個の標的の複製物が図7内でそこから光が検出される液滴の間にどのように分布するかの概略図である。 本開示の態様による、デジタル増幅アッセイで3個の標的の増幅を表す一対の複合シグナルのみが生成されるように、図6の第1および第2の標的プローブと併せて使用することのできる、放出された光を介して第3の標的増幅が存在するか否かを報告することが可能な図6の第3の標的および別の例示的なプローブ構成の概略図である。 本開示の態様による、デジタル増幅アッセイで3個の標的を表す一対の複合シグナルのみが生成されるように、図6の第1および第2の標的プローブと併せて使用することのできる、図6の第3の標的およびこの第3の標的に特異的なさらに別の例示的なプローブ構成の概略図である。 本開示の態様による、デジタル増幅アッセイで3個の標的の増幅を表す一対の複合シグナルのみが生成されるように、図6の第1および第2の標的プローブと併せて使用することのできる、放出された光を介して第3の標的増幅が存在するか否かを報告することが可能な図6の第3の標的およびさらに別の例示的なプローブ構成の概略図である。 本開示の態様による、デジタル増幅アッセイで3個の標的の増幅を報告するのに2個のプローブのみの使用を可能にする、3個の標的およびそれに対応する例示的なプライマーの概略図である。 本開示の態様による、デジタル増幅アッセイで3個の標的の増幅を報告するのに2個のプローブのみの使用を可能にする、図6の第3の標的ならびに別の例示的なプローブおよびプライマー構成の概略図である。 本開示の態様による、デジタル増幅アッセイで3個の標的の増幅を報告するのに2個のプローブ使用を可能にする、2個のプローブのみのさらに別の例示的な構成を備えた図6の3個の標的の概略図である。 本開示の態様による、一対の非結合標的T1、T2を含有する断片の集団の概略図である。 本開示の態様による、図14でのように得られた断片の集団であるが、一対の標的が同じ個々の断片上で常に互いに結合している状態の概略図である。 本開示の態様による、図14でのように得られた断片の集団であるが、一対の標的が集団内で互いに部分的にのみ結合している状態の概略図である。 本開示の態様による、デジタル増幅アッセイで使用される一組の例示的な多標識プローブの概略図である。 本開示の態様による、多標識プローブ分子存在下で標的増幅中にDNAポリメラーゼにより複製され、ポリメラーゼによるプローブ分解によってクエンチャーがプローブ分子の蛍光体から分離することを示す、鋳型分子の概略図である。 本開示の態様による、FAM、VIC、またはFAMおよびVICの両方でそれぞれ標識された単標識および二重標識プローブを組み合わせて行われる、3個の標的に関する多重化デジタル増幅アッセイで得ることができるクラスターを示す、液滴強度の例示的な二次元ヒストグラムである。 本開示の態様による、標的-3-陽性液滴に関するクラスターからの標的-1+2-陽性液滴に関するクラスターの部分分割とともに、図19のアッセイで得ることができるクラスターを示す液滴強度の別の例示的な二次元ヒストグラムである。 本開示の態様による、多標識FAM、VICプローブのみで行われるデジタル増幅アッセイで得ることができるクラスターを示す、液滴強度の例示的な二次元強度ヒストグラムである。 本開示の態様による、図21のように行われるデジタル増幅アッセイであるが、多標識FAM、VICプローブに加えて単標識FAMまたはVICプローブの対で補われるデジタル増幅アッセイで得ることができるクラスターを示す、液滴強度の別の例示的な二次元強度ヒストグラムである。
本開示は、シグナルの組合せ使用を通して、より多くの数の標的に関して多重化デジタルアッセイを行うための、方法、装置、および組成物を含むシステムを提供する。この方法は、多重化に向けた、色に基づく手法と記述することができる。
PCRアッセイなど、多重化デジタル増幅アッセイを行う方法が提供される。この方法では、R個よりも多い標的を区画内で増幅することができる。R個のシグナルを生成することができる。シグナルは、区画からのR個の異なる波長レジームで検出された光を表すことができ、ここでR≧2である。区画内での各標的の平均レベルは、R個のシグナルに基づいて計算することができ、計算されたレベルは、存在する場合には異なる標的が同じ個々の区画内で同時発生することを説明する。
多重化デジタル増幅アッセイを行う別の方法が、提供される。この方法では、R個よりも多くの標的を液滴内で増幅することができる。R個のシグナルを生成することができ、これらのシグナルは、液滴からのR個の異なる波長レジームで検出された光を表し、ここでR≧2である。R個よりも多い標的のそれぞれの平均レベルは、一組の連立方程式の解を見出すことによって計算することができる。
多重化デジタル増幅アッセイを行うさらに別の方法が提供される。この方法では、R個の標的を液滴内で増幅することができる。R個のシグナルを生成することができ(R≧2)、これらのシグナルは、液滴からのR個の異なる波長レジームで検出された光を表す。シグナルのそれぞれは、標的の少なくとも2個の異なる組合せの増幅を報告することができる。液滴内の各標的の平均レベルは、シグナルごとに少なくとも2個の標的のどれが、そのようなシグナルに関する個々の増幅陽性液滴内で増幅されたかを決定することなく、R個のシグナルに基づいて計算することができる。
組成物が提供される。組成物は、プローブを含有する液滴を含むことができる。プローブは、オリゴヌクレオチド、第1の蛍光体、第2の蛍光体、およびエネルギー伝達部分を含むことができる。エネルギー伝達部分は、第1および第2の蛍光体の一方または両方に関するクエンチャーおよび/またはエネルギー伝達パートナーであってもよい。
本開示のその他の態様を、以下のセクション:(I)システム概観および(II)実施例に示す。
I.システム概観
図1は、デジタルアッセイを行う例示的な方法40のフローチャートを示す。方法40に関して示されるステップは、任意の適切な順序でかつ任意の適切な組合せで行うことができる。さらにステップは、本開示の任意のその他の適切なステップ、態様、および/または特徴と組み合わせてもよく、かつ/またはそれらによって修正してもよい。
サンプルは、アッセイ用に調製することができ、これは42で示される。サンプルの調製は、とりわけ、収集、希釈、濃縮、精製、凍結乾燥、凍結、抽出、1種もしくは複数のアッセイ試薬の組合せ、アッセイの1つもしくは複数の反応に向けてサンプルを調製するための少なくとも1つの予備反応の実施、またはこれらの任意の組合せなど、サンプルの任意の適切な操作を含むことができる。サンプルの調製は、1つまたは複数の酵素触媒反応および/または結合反応など、1つまたは複数の反応の後続の実施に対してサンプルを適したものにすることを含んでいてもよい。
いくつかの実施形態では、サンプルの調製は、サンプルと、増幅用および増幅が生じたか否かの報告用の試薬とを組み合わせることを含むことができる。そのような試薬は、標的用のプライマー(例えば、各標的の順方向プライマーおよび逆方向プライマー)、標的、dNTP、および/もしくはNTPの増幅を検出するためのレポーター(例えば、プローブ)、または少なくとも1種の酵素(例えば、ポリメラーゼ、リガーゼ、逆転写酵素、またはこれらの組合せであり、そのそれぞれは熱安定性であってもそうでなくてもよい。)などの任意の組合せを含んでいてもよい。したがってサンプルの調製は、サンプル(またはその区画)によって、存在する場合にはサンプル(またはその区画)中の1個または複数の標的のそれぞれを増幅可能にすることができる。
サンプルは、区画に分離することができ、これは44で示される。サンプルの分離では、サンプルの任意の適切な部分または全てを区画に分布させることを含んでもよい。各区画は、その他の区画の流体容積から単離された流体容積であってもよく、かつ/またはそのような流体容積を含んでいてもよい。区画は、とりわけ、エマルジョンの連続相などのキャリア流体によって、容器の少なくとも1つの壁などの固相によって、またはこれらの組合せによって、互いに隔離されていてもよい。いくつかの実施形態では、区画は、液滴と連続相とがまとまってエマルジョンを形成するように、連続相内に配置された液滴であってもよい。
区画は、任意の適切な手順により、任意の適切な手法で、さらに任意の適切な性質を用いて形成することができる。例えば区画は、ピペットなどの流体ディスペンサで、液滴発生器で、またはサンプルのかきまぜ(例えば、振盪、撹拌、超音波処理など)などによって形成されてもよい。したがって区画は、連続的に、並列に、またはバッチ式に形成されてもよい。区画は、任意の適切な1つまたは複数の容積を有していてもよい。区画は、実質的に均一な容積であってもよく、または異なる容積であってもよい。実質的に同じ容積を有する例示的な区画は、単分散液滴である。区画に関する例示的な容積には、とりわけ、約100、10、もしくは1μL未満、約100、10、もしくは1nL未満、または約100、10、もしくは1pL未満の平均容積が含まれる。
区画は、形成される場合、区画内での1つまたは複数の反応の実施に適したものにすることができる。あるいは、1種または複数の試薬を、区画が形成された後に添加して、反応に適したものにしてもよい。試薬は、任意の適切なメカニズム、例えば流体ディスペンサ、または液滴の融合などによって、添加されてもよい。試薬のいずれかは、マクロ流体またはミクロ流体環境で区画(またはバルク相サンプル)と組み合わせてもよい。
1つまたは複数の反応は、区画内で行うことができ、これは46で示される。行われる各反応は、とりわけ区画の約2分の1、4分の1、または10分の1未満など、区画のサブセットでのみ選択的に(かつ/または実質的に)生じてもよい。反応は、例えば鋳型および/もしくは反応物(例えば、基材)であってもよい標的、ならびに/または結合パートナーを、反応中に含んでいてもよい。反応は、標的の少なくとも1個の複製物を含有する区画内で、選択的に生じてもよい(または選択的に生じなくてもよい。)。
反応は、酵素触媒反応であってもそうでなくてもよい。いくつかの実施例では、反応は、ポリメラーゼ連鎖反応および/またはリガーゼ連鎖反応などの増幅反応であってもよい。したがって、複数の標的に関する複数の増幅反応は、区画内で同時に行うことができる。
反応を行うことは、反応の出現を促進させる1つまたは複数の条件に区画を曝すことを含んでいてもよい。この条件には、室温よりも高い温度で区画を加熱することおよび/または区画をインキュベートすることを含めることができる。いくつかの実施例では、この条件は、区画を熱サイクルに供してポリメラーゼ連鎖反応および/またはリガーゼ連鎖反応を促進させることを含むことができる。
区画から検出された光を表すR個のシグナルを生成することができ、これは48で示される。R個のシグナルは、2、3、4個、またはそれ以上のシグナルであってもよい。いくつかの実施例では、各シグナルに対応する光は、明確に異なるセンサで検出してもよく、かつ/または少なくとも2個のシグナルに対応する光は、同じセンサで異なる時間に検出してもよい。R個のシグナルは、互いに異なるそれぞれの波長レジームで検出された光に対応すると考えられる。各波長レジームは、区画が照明される(例えば、励起光で)波長および/もしくは波長範囲によって、かつ/または、区画からの光が検出される(例えば、放出された光)波長および/もしくは波長範囲によって、特徴付けることができる。検出される光は、1個または複数の蛍光体から放出された光であってもよい。
R個のシグナルのそれぞれは、明確に異なる検出チャネル内で生成されてもよい。したがってR個のシグナルは、R個の検出チャネル内で生成することができる。
各シグナルは、2、3、4個、またはそれ以上の反応/アッセイ、したがって反応/アッセイの2、3、4個、またはそれ以上の標的を表す複合シグナルであってもよい。複合シグナルは、それぞれが異なる反応/アッセイおよび標的を表す2個以上の統合シグナル部分を含んでいてもよい。複合シグナルそのものの1つの解析によれば、その他の複合シグナルのからのデータの利益なしに、複合シグナルにより表される2個以上の標的に関して個々の濃度ではなくまとめた濃度の推定が可能になってもよい(または可能でなくてもよい。)。代わりに、以下にさらに記述されるように、複合シグナルの解析は一まとめになって、各標的の濃度の計算を可能にする(「推定」および「計算」という用語は、同義に使用される。)。
R個の複合シグナル(および/またはR個の検出チャネル)は、Rよりも多い反応および/または標的を表すことができ、この反応/アッセイおよび標的の数は、構成に依存する。例えばR個のシグナルは、3つの反応/アッセイおよび/または3個の標的(任意で1、2、および3と称する。)をまとめて表す2個の複合シグナル(任意でαおよびβと称する。)であってもよく、またはそれらを含んでいてもよく、各複合シグナルは、2つの反応/アッセイ/標的の異なる組合せ(例えば、αに関しては標的1および標的2であり、βに関しては標的1および標的3である。)を表している。あるいはR個のシグナルは、各複合シグナルがそれぞれ、最大4つの反応/アッセイ/標的の異なる組合せを表す(例えば、αに関しては標的1、標的2、標的3、および標的4;βに関しては標的2、標的4、標的5、および標的6;γに関しては標的3、標的4、標的6、および標的7)場合、最大7つの反応/アッセイ/標的(1から7)をまとめて表す3個の複合シグナル(任意でα、β、およびγと称する。)であってもよい。R個のシグナルは、各複合シグナルがそれぞれ最大8つの反応/アッセイ/標的の異なる組合せを表す場合、最大15の反応/アッセイ/標的を表す4個の複合シグナルであってもよい。
より一般的に、2R-1標的は、R個の複合シグナル(または波長レジーム)でアッセイすることができる。2R-1標的をR個の波長レジームでアッセイするために、各標的を、その他全ての標的とは異なる波長レジームまたは波長レジームの組合せにより表してもよい。一組の2R-1標的は、波長レジームの全てが個々にかつ全ての可能性ある組合せで利用されたときに、表しアッセイすることができる。
各複合シグナルは、区画内の1個または複数のプローブから放出された、検出された光に基づいて生成することができる。1個または複数のプローブは、シグナルにより表される2つ以上の特定の反応の少なくとも1つが区画内で生じたか否か、したがって2つ以上の特定の反応に対応する2個以上の特定の標的の少なくとも1個の少なくとも1個の複製物が区画内に存在するか否かを報告することができる。プローブに対応する複合シグナルの強度を解析して、特定の反応の少なくとも1つが生じたか否か、および特定の標的の1個の少なくとも1個の複製物が存在するか否かを決定することができる。強度は、特定の反応の少なくとも1つが生じたかまたは生じなかったか(例えば、閾値範囲を超えて)、および特定の標的の少なくとも1個が個々の区画のそれぞれに存在するか否かに応じて、区画間で変わり得る。
複合シグナルにより表されるプローブは、異なる蛍光体を含んでいてもよい。言い換えれば、異なる蛍光体から放出された光は、特定の波長レジームに関して複合シグナルの2つの異なる一体化部分が生成されるように、検出することができる。あるいはまたは追加として、同じ蛍光体を、複合シグナルにより表される少なくとも2個の標的に関して1個のプローブまたは2個以上のプローブに含めてもよい。ある場合には、同じ蛍光体を、複合シグナルにより表される各標的のプローブに含めてもよい。
各プローブは、核酸(例えば、オリゴヌクレオチド)および少なくとも1個の蛍光体を含んでいてもよい。異なるオリゴヌクレオチド配列および/または異なる蛍光体(または蛍光体の組合せ)を有する異なるプローブは、シグナルの、少なくとも2つの異なる一体化部分を生成するのに使用することができる。あるいはまたは追加として、同じプローブを、複合シグナルにより表される少なくとも2個の異なる標的のレポーターとして使用してもよい(実施例3〜5参照)。ある場合には、同じプローブを、複合シグナルにより表される各標的のレポーターとして使用してもよい。
各区画から検出された複合シグナル、および区画そのものは、シグナルまたは対応する波長レジームにより表される反応/アッセイ/標的に陽性であるかまたは陰性であるかを分類することができる。分類は、シグナルの強度に基づいてもよい。シグナル/区画が陽性であると分類された場合、シグナルにより表される反応/アッセイの少なくとも1つが生じたと見なされ、シグナルにより表される標的の少なくとも1個の少なくとも1個の複製物が区画内に存在すると見なされる。対照的に、シグナル/区画が陰性であると分類された場合、シグナルにより表される反応/アッセイのいずれも生じたとは見なされず、シグナルにより表される標的のいずれの複合物も区画内に存在するとは見なされない。
複合シグナルはまとまって、各検出チャネルでの標的の異なる組合せを表すことによって標的濃度の推定を可能にする。したがって各標的は、区画内に他の標的のいずれもない状態で存在する場合、波長レジーム間で固有の標的シグネチャーを生成することができる。例えば標的のいくつかは、区画内に単独で存在する場合、ただ1個の波長レジームに関してシグナル強度を選択的に変化させることができる。標的のその他のものは、区画内に単独で存在する場合、波長レジームの2個の固有の組合せに関してシグナル強度を選択的に変化させることができ、さらのその他の標的は、波長レジームの3個の固有の組合せに関してシグナル強度を選択的に変化させることができ、以下、任意選択で波長レジーム/検出チャネルの数に至るまで同様である。
区画の、ある割合では、異なる標的の同時発生があり、これらの区画のそれぞれは、同じ個々の区画内に2個以上の標的のそれぞれの複製物を含有する。さらに、これらの区画のそれぞれは、2個以上の明確に異なる標的のそれぞれの複製物を含有していてもよく、これは特定の区画に関し、まとまって、区画内に存在しない標的の場合と同じシグネチャーを生成することができるものである。しかし、2個以上の明確に異なる標的を含有する区画の割合は、区画が形成されたときに複数の標的分子を含有する区画のとりわけ約2分の1、5分の1、または10分の1未満など、希釈レジームで作用することによって比較的低く保持することができる(または保持されなくてもよい。)。いずれにせよ、以下に記述される濃度の適切な推定は、同じ個々の区画内での、同じ標的または異なる標的を表す2個以上の標的分子の出現を、考慮に入れることができる。あるいは、十分な希釈レジームで作用する場合、区画当たり2個以上の標的分子の出現は、濃度の所望の精度に向けて、無視されるように十分まれなことであると考えられる。
陽性である区画の数は、シグナルごとに決定することができ、これは50で示される。例えば、特定の複合シグナルまたは対応する波長レジーム/検出チャネルのそれぞれにのみ陽性である区画の数は、シグナルまたはチャネルごとに個々に決定する(例えば、カウントする)ことができる(即ち、チャネルごとの数)。また、複合シグナルまたは対応する波長レジームの特定の組合せのそれぞれ(または少なくとも1つの組合せもしくは2つ以上の組合せのそれぞれ)にのみ陽性である区画の数は、シグナルまたはチャネルの組合せごとに、個々に決定する(例えば、カウントする)ことができる(即ち、組合せごとの数、特に、特定の標的に対応する各組合せの数)。
各シグナル単独および各シグナル組合せに陽性である、区画の明確に異なる割合を、決定することができる。各シグナルまたはシグナルの組合せに関する割合は、50で決定される、シグナル/組合せに関する区画の数を、シグナルが検出される区画の総数で割ることによって、決定することができる。区画の総数は、カウントしても推定してもよい。
各標的のレベルは、計算することができ、これは52で示される。このレベルは、区画当たりの標的分子の平均濃度などの、平均レベルであってもよい。一般に、R個のシグナルがR個の波長レジーム内の区画から検出される場合、R個よりも多い標的(例えば、最大2R-1個の標的)のそれぞれの平均レベルを計算することができる。各標的のレベルは、各シグナル単独およびシグナルの組合せに陽性である区画のそれぞれの数に基づいて、計算することができる。計算は、区画間でポアソン分布を有する各標的の複製物に基づくことができる。濃度は、例えば、それぞれが同じ変数を有する一連の連立方程式(同義に、一組の連立方程式と称する。)の解を見出すことにより、計算することができる。連立方程式は、一次方程式であってもよい。あるいは、または追加として、各方程式は少なくとも2R-1個の変数を含有していてもよい。解は、数値近似とも呼ばれる数値解析によって見出すことができる。平均標的レベルを計算するさらなる態様を、実施例6および実施例7などの、本開示のその他の箇所に記述する。
図2は、図1のデジタルアッセイを行うための例示的なシステム60を示す。システム60は、とりわけ、液滴発生器62(「DG」)などの区画形成アセンブリ、サーモサイクラー64(「TC」)などの熱インキュベーションアセンブリ、検出アセンブリ(検出器)66(「DET」)、およびデータ処理アセンブリ(プロセッサ)68(「PROC」)、またはこれらの任意の組合せを含んでいてもよい。データ処理アセンブリは、アセンブリの任意な適切な組合せと通信しその組合せの動作を制御する、制御器であってもよくまたはその制御器に含まれていてもよい。アセンブリ間の矢印は、流体(例えば、エマルジョンの連続相)および/もしくは区画(例えば、液滴)またはシグナル/データの移動または伝達など、任意選択の移動または伝達を示す。アセンブリの任意の適切な組合せは、互いに動作可能に接続することができ、かつ/またはアセンブリの1個もしくは複数は、例えば材料/データが手動で伝達されるように他のアセンブリから切り離すことができる。
システム60は、下記の通り動作することができる。液滴発生器62は、連続相など、キャリア流体中に配置される液滴を形成することができる。液滴を、サーモサイクラー64を用いて熱サイクルに供することにより、液滴中の標的の増幅を促進させることができる。複合シグナルは、検出器66で液滴から検出することができる。シグナルをプロセッサ68により処理して、標的のレベルを計算することができる。
本明細書に開示される方法およびシステムに適切と考えられる、とりわけサンプル調製、液滴発生、アッセイ、試薬、反応、熱サイクル、検出、およびデータ処理のさらなる態様は、以下に記述され、かつ参照により本明細書に組み込まれる上記相互参照において列挙された文献、特に2010年7月8日公開の米国特許出願公開第2010/0173394A1号;2011年9月29日公開のPCT特許出願公開第WO2011/120006A1号;2011年9月29日公開のPCT特許出願公開第WO2011/120024A1号;および2011年11月1日出願の米国特許出願第13/287,120号に記述される。
(実施例)
このセクションは、多重化デジタルアッセイを行うための方法および組成物に関する、本開示の選択された態様および実施形態を提示する。これらの態様および実施形態は、例示のために含まれ、本開示の全範囲を限定しまたは画定しようとするものではない。
(実施例1)
専用シグナルおよび複合シグナルによるデジタル増幅アッセイ
この実施例は、(i)2個の標的用の一対の専用シグナル(図3〜図5参照)および(ii)3個の標的用の一対の複合シグナル(図6〜図8参照)を利用する例示的なデジタル増幅アッセイを比較し対比する。ここに説明する原理は、2R-1個の標的用のR個のシグナルにまで及ぶと考えられる。
図3は、デジタル増幅アッセイで各標的を増幅するための専用シグナルを生成するのに使用することができる、一対の核酸標的80、82(「標的1」および「標的2」)およびこれらに対応するプローブ84、86(「プローブ1」および「プローブ2」)を示す。各プローブは、オリゴヌクレオチド88、90、蛍光体92、94、およびクエンチャー96を含んでいてもよい。蛍光体およびクエンチャーは、共有結合などでオリゴヌクレオチドに関連付けられかつ/または結合されている。プローブは、同様にまたは代わりに、オリゴヌクレオチドに共役することができかつ短いほうのオリゴヌクレオチドをプローブ内で使用できるように機能することができる、DNA二重鎖の小溝用の結合部分(小溝結合剤)を含んでいてもよい。プローブは、TaqManプローブ、分子ビーコンプローブ、スコーピオンプローブ、またはロックド核酸プローブなどであってもよい。
各オリゴヌクレオチドは、2個の標的の一方のみの増幅によって生成されたアンプリコンに、主としてまたは少なくとも実質的に排他的にハイブリダイゼーションを行うことにより標的特異性を与えることができる。オリゴヌクレオチドの、それに対応する標的/アンプリコンへのハイブリダイゼーションを、98で概略的に例示する。
蛍光体92、94は、蛍光体ごとに明確に異なるハッチパターンにより概略的に示されるように、互いに光学的に区別できる。例えば蛍光体は、明確に異なる吸収スペクトルおよび/もしくは最大値、ならびに/または明確に異なる放出スペクトルおよび/もしくは放出最大値を有していてもよい。検出に使用される波長レジームの適正な選択により、蛍光体を区別することが可能になる。言い換えれば、その波長レジーム用のセンサによって受信され感知される、放出光の各波長レジームおよび/または波長もしくは波長帯域に使用される励起光の波長または波長帯域は、検出チャネル内の蛍光体の1個のみからの光を選択的に検出する。適切と考えられる例示的な蛍光体には、FAM、VIC、HEX、ROX、TAMRA、JOEなどが含まれる。
クエンチャー96は、近接依存的な手法で蛍光体92または94により生成されたシグナルを消光するように構成される。蛍光体から検出された光は、とりわけ、関連付けられたオリゴヌクレオチド88または90が増幅標的と結合して、蛍光体とクエンチャーとの間の分離距離が増大するときに、またはプローブが標的増幅中に切断されるときに、増大させることができる。ある場合には、クエンチャーは、蛍光体92または94とのエネルギー伝達が可能な蛍光体に置き換えることができまたはこの蛍光体で補うことができる。
図4は、液滴内で行われた標的1および標的2に関する例示的なデジタル増幅アッセイで収集されたデータの、一対の例示的なグラフ102、104を示す。各グラフは、それぞれのプローブ84、86(および/またはその1つもしくは複数の改質(例えば、切断)生成物)(図3参照)から検出された光を表す専用シグナル106(「信号1」)またはシグナル108(「信号2」)をプロットする。各専用シグナルは、液滴を含有しかつチャネルの検査領域内を流れる流体の流れから、同じ期間にわたって検出された光から生成される。シグナル1は、標的1が各液滴内に存在するか否かを報告し、シグナル2は、標的2が各液滴内に存在するか否かを報告する。特に、シグナル1(またはシグナル2)の強度が閾値110を超えて増大する場合、標的1(または標的2)は、対応する液滴内に存在(および増幅)すると考えられる。この例示において各液滴は、各標的に陽性であろうと陰性であろうと、特定可能なピーク112を形成する基準シグナルを超えたシグナル強度の増大をもたらす。したがって各シグナルは、液滴の存在または不在により、および対応する標的の存在または不在により、強度が変わる可能性がある。
各標的は、ここでは液滴内に約0.2の平均レベル(または頻度)で存在する。言い換えれば、各標的は、平均して5滴ごとに約1回増幅され検出される。したがって、両方の標的を含有する液滴の予測される頻度は、2つの液滴頻度の積であり、即ち約0.04(25滴ごとに1滴)である。この頻度に矛盾することなく、両方の標的に陽性の液滴は、ここで分析された20滴中に1回だけ存在し、これは、グラフ102、104で液滴のシグナルピークの周りに延びる114の破線枠により示される。
図5は、図4の液滴シグナルピークに対応しかつこのピークと同じ順序にある、一組の液滴116における標的1および2の分布を概略的に表す。118で示される液滴など、シグナル1に陽性の液滴には蛍光体92に準じてハッチングをかけ、120で示される液滴などシグナル2に陽性の液滴は、蛍光体94に準じてハッチングをかける(図3参照)。標的1および標的2の両方を含有する二重陽性液滴122には二重にハッチングをかけ、これは破線枠114により示される。
図6は、デジタル増幅アッセイで3個の標的に関して一対の複合シグナルを生成するのに使用することができる、3個の標的80、82、および140とこれらにそれぞれ対応する例示的なプローブ84、86、および142とを示す。標的およびプローブの2個、即ち標的80および82(標的1および標的2)とプローブ84および86(プローブ1およびプローブ2)は、図3〜図5に示され利用されたものと同じ標的およびプローブである。標的140(標的3)およびそれに対応するプローブ142(プローブ3)を図3〜図5の多重化アッセイに導入して、多重化のレベルと、検出チャネルの数を増やすことなくアッセイから抽出できる標的情報の量とを増大させることができる。
標的3の増幅は、プローブ3により報告される。プローブは、標的1および2に比べて標的3に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド144(および/またはそのアンプリコン)を含む。プローブは、標的1および標的2のそれぞれの増幅を報告するためにプローブ1およびプローブ2に個別に存在する同じ蛍光体(92、94)で、二重標識されてもよい。3個の標的のプローブは、各標的の専用検出チャネルの使用の際に必要と考えられる3個の検出チャネルではなく、2個の検出チャネルのみで標的増幅が検出されるように選択することができる。実施例2〜5は、多重化レベルの増大に適切と考えられるその他の例示的なプローブ構成について記述する。
図7は、一対の波長レジーム/検出チャネルで検出され得る一対の複合シグナル156、158の、一対の例示的なグラフ152、154を示す。任意にαおよびβで示される複合シグナルは、液滴内で行われたデジタル増幅アッセイで、図6の3個のプローブから検出された光を表す。各複合シグナルは、液滴を含有する流体の流れから、同じ期間にわたって検出された光から生成される。表現を簡略化するために、標的1および標的2は、図4および図5の場合と同じ頻度でかつ同じ液滴内に存在する。
各複合シグナルαまたはβ(156または158)は、一対の標的を表す。シグナルα(グラフ152)は、第1の対の標的、即ち標的1および標的3の少なくとも1つのメンバーに対して液滴が陽性か陰性かを示す、各液滴の強度を有する。シグナルβ(グラフ154)は、異なる第2の対の標的、即ち標的2および標的3の少なくとも1つのメンバー対して液滴が陽性か陰性かを示す、各液滴の強度を有する。したがって、単独で解析された各複合シグナルは、その対の標的の所与のメンバーがどの程度の頻度で液滴内に存在するかに関する情報を提供しない可能性がある。
組み合わせて解析された複合シグナルは、互いに隔離された状態では複合シグナルから推論することができない、標的頻度に関する追加の情報を提供する。各標的は、液滴内にその他の標的なしに存在する場合、個々にその他の各標的のシグネチャーとは明確に異なるシグナルシグネチャーを生成する。液滴内の標的1に関するシグネチャーは160で示され:シグナルαに陽性であり、シグナルβに陰性である。液滴内の標的2に関するシグネチャーは162で示され:シグナルαに陰性でありシグナルβに陽性である。さらに、液滴内の標的3に関するシグネチャーは、164の破線枠により描かれ:シグナルαとシグナルβの両方に陽性である。最後に、液滴内の標的1、2、および3のいずれでもないシグネチャーが166で示され:シグナルαとシグナルβの両方に陰性である。
図8は、図7の液滴シグナルピークに対応しかつこのピークと同じ順序にある、一組の液滴168における標的1、2、および3の分布を概略的に表す。118で示される液滴などの、シグナルαのみに陽性の単一陽性液滴には、蛍光体92に準じてハッチングがかけられ、120で示される液滴などの、シグナルβに陽性の液滴には、蛍光体94に準じてハッチングがかけられる(図6参照)。各二重陽性液滴170には、二重にハッチングがかけられ、破線枠164により示される。
160および162で示される単一陽性シグネチャーは、対応する液滴118、120がそれぞれ標的1または標的2の少なくとも一方の複製物を含有し、標的3の複製物を含有しないことを明確に識別する。したがって、各タイプの単一陽性液滴の数は、液滴の総数に対する比で使用されて、標的1および標的2の平均レベルが計算される。しかしこの推定では、標的1および/または標的2を含有するが標的3のシグネチャーを有するいかなる液体も無視されるので、液滴が多数の標的分子を含有する場合、この推定は十分に正確ではない可能性がある。これらの液滴は、標的1+2、標的1+3、または標的2+3を含有しながら、同じ標的3のシグネチャーを生成することができる。各標的の濃度が十分低い場合、少なくとも2個の異なる標的を含有する液滴の頻度は取るに足らないものでありかつ/または無視できる。この場合、標的1、2、および3の濃度は、20滴当たり標的1および2の両方を有する液滴が平均してわずかに約1滴であるものを生成するよう十分に高い(図4および図5参照)。したがって二重陽性液滴170の1個は、標的1および2の両方を含有することが予測され、その他の2個の二重陽性液滴は、標的3を含有することが予測される。
各二重陽性液滴の標的組成を知ることは、必要ではない。代わりに、各標的シグネチャーを有する液滴の頻度がわかれば十分である。次いでポアソン統計を利用して、各標的の平均レベルを計算することができる。計算は、ある場合には、とりわけ最良適合を得るために例えば数値的に一連の連立方程式の解を見出すことによって、または閉形式手法によって行ってもよい。
(実施例2)
複合シグナルに関する例示的な標的特異的プローブ
この実施例は、任意の適切な多重化デジタルアッセイで利用することができる、追加の例示的な標的特異性プローブについて記述する;図9A、図9B、および図10参照。ここに説明する原理は、任意の数のシグナルおよび/または標的にまで及ぶと考えられる。
図9A、図9B、および図10は、図6の第3の標的140と、標的3にそれぞれ特異的なプローブ180、182(プローブ3Aおよび3B)のその他の例示的なプローブ構成(および/またはそのアンプリコン)とを示す。プローブ3Aおよび3Bは、デジタル増幅アッセイで標的1から3に関する一対の複合シグナルのみが生成されるよう、図6のプローブ3の代わりにまた図6のプローブ1およびプローブ2と併せて、一緒に使用することができる。
プローブの1個(例えば、プローブ3A)は蛍光体92を含んでいてもよく、その他のプローブ(例えば、プローブ3B)は、蛍光体94を含んでいてもよい。したがってプローブ3Aにより放出された光は、図6のプローブ1からの光と同じ検出チャネルで検出することができ、プローブ3Bにより放出された光はプローブ2と同じチャネルで検出することができる。
図9Aおよび図9Bは、標的3の明確に異なる部位に特異的に結合しているプローブ3Aおよび3Bを示す。プローブは、標的の同じストランド上で、非オーバーラップ(または部分的にのみオーバーラップしている)部位に結合することができる(図9A)。あるいはプローブは、標的3の反対側のストランドに結合することができる(図9B)。
図10は、標的3(および/またはそのアンプリコン)の同じ部位に結合することが可能なプローブ3Aおよび3Bを示す。プローブのそれぞれは、同じオリゴヌクレオチド144を含有していてもよく、したがってオリゴヌクレオチド144に結合された特定の蛍光体(92または94)のみが異なっている。この実施例のプローブは、任意の適切な比で、または多重化アッセイ用に何組かの異なる比で、ブレンドすることができる。
(実施例3)
複合シグナル用の例示的なテイルドプライマーおよび共用プローブ
この実施例は、複合シグナルの生成が可能な例示的な共用プローブと、この共用プローブ用の結合部位を形成する例示的なテイルドプライマーについて記述する;図11参照。ここに説明する原理は、任意の適切な数の複合シグナルおよび/または標的にまで及ぶと考えられる。
図11は、デジタル増幅アッセイにおける、3個の標的80、82、および140(即ち、図6の標的1から3)と、それに対応するプライマーであって、わずか2個のプローブ、即ちプローブ190(プローブA)およびプローブ192(プローブB)で3個の標的のアッセイを可能にするプライマーとを示す。プローブAおよびプローブBは、それぞれ蛍光体およびクエンチャー(例えば、図3参照)を含んでいてもよい。
標的1は、一対の順方向および逆方向プライマー194、196で増幅されてもよい。順方向プライマー194は、標的1の領域に相補的な3結合部分198と、相補的ではない5'尾部200とを有するテイルドプライマーであってもよい。尾部は、結果的に得られるアンプリコンにプローブAの結合部位を導入することができ、これは202の破線により示され、その結果、プローブA(図6のプローブ1のような)は標的1の増幅を報告できるようになる。
標的2は、一対の順方向および逆方向プライマー204、206で増幅されてもよい。逆方向プライマー206は、標的1の順方向プライマー194と同様に構造化でき、3'結合部分は標的2の領域に相補的であり、5'尾部207はそうではない。尾部は、プローブBの結合部位を、結果的に得られるアンプリコンに導入することができ、その結果、プローブB(図6のプローブ2のような)は標的2の増幅を報告することができるようになる。
標的3は、一対の順方向および逆方向プライマー208、210で増幅されてもよい。プライマーの両方は、順方向プライマー194と同様に構造化することができ、3'結合部分は標的3の領域に相補的であり、5'尾部はそうではない。プライマー208、210の尾部200、207は、プローブAおよびBのそれぞれの結合部位を増幅生成物に導入することができ、その結果、プローブAとプローブBの両方の組合せ(図6のプローブ3のような)は標的3の増幅を報告するようになる。
(実施例4)
共用プローブを可能にするための例示的なライゲーション戦略
この実施例は、共用プローブの使用を可能にする例示的なライゲーション戦略について記述する;図12参照。ここに説明する原理は、任意の数の複合シグナルおよび/または標的にまで及ぶと考えられる。
図12は、図6のプローブ1および2(84および86の)のみを用いてデジタル増幅アッセイで図6の標的1から3のアッセイを可能にする、図6の標的3(140の)と、別の例示的なプローブおよびプライマー構成とを示す。以下に示されるライゲーション、伸長、および消化ステップは、任意の適切な順序で、かつ標的3を提供するサンプルを区画に分離する前または後に、行うことができる。
鋳型220(ならびに/またはその相補的ストランドおよび/もしくはアンプリコン)は、プローブ1および2のそれぞれを結合するように設計することができる。
また、鋳型220は、鋳型の対向する末端領域222、224を介して、標的3の隣接領域に結合するように設計されてもよい(鋳型は、分子反転「プローブ」と記述することができるが、一般に蛍光体には結合されていない。)。鋳型の5'および3'末端は、標的3に結合される場合はライゲーションによって互いに直接接合可能であってもよく、または、一致させた鋳型の5'および3'末端の間に1種もしくは複数のヌクレオチドのギャップ226を形成してもよい。ギャップは、鋳型のライゲーションによって閉ループが形成される前に、標的3に結合させながら、鋳型の3'末端を伸長することによって、閉じることができる。ライゲーションおよび任意選択の伸長後、ライゲーションに失敗した(したがって、結合用の標的3の複製物が見出されていない。)鋳型の複製物は、エキソヌクレアーゼによって分解する可能性がある。ライゲーションされた鋳型の複製物は、この分解に抵抗することができ、したがってライゲーションされた鋳型分子の数は、標的3分子の数に該当するようになる。
ライゲーションされた鋳型220(および/またはその相補的ストランド)は、少なくとも1個のプライマー228(または230)の結合のための1つまたは複数の部位を提供することができる。プライマーは、ローリングサークル増幅によって、ライゲーションされた鋳型を増幅することができる。あるいは、または追加として、一対のプライマー228、230(順方向および逆方向)は、増幅のカスケードを生成するために含めてもよい。いくつかの実施形態では、ライゲーションされた鋳型220を、所定部位232で切断することにより線形化した後に、プライマー228、230で増幅してもよい。いずれにせよ、区画内の標的3の存在は、この実施形態ではプローブ1および2の両方の組合せによって報告される。
(実施例5)
多標的特異性を有する例示的な共用プローブ
この実施例は、2個の異なる標的の配列領域にそれぞれ結合することが可能な、例示的な共用プローブについて記述する;図13参照。ここに説明する原理は、任意の数の複合シグナルおよび/または標的にまで及ぶと考えられる。
図13は、多標的特異性を有するプローブによって結合された標的80、82、140(即ち、標的1から3)を示す。特にプローブ240(プローブ1/3)は、標的1に存在する配列領域と、標的3に存在する別の配列領域とに結合することが可能な、オリゴヌクレオチド242を含む。また、別のプローブ244(プローブ2/3)は、標的2に存在する配列領域と、標的3に存在する別の配列領域とに結合することが可能なオリゴヌクレオチド246を含む。
(実施例6)
追加の検出チャネルなしにデジタル増幅で増大した多重レベル
この実施例は、多重化デジタル増幅アッセイの多重レベルを増大させるための、例示的な手法について記述する。
A.序論
デジタル増幅システムの全ての区画内で同時に(多重化)多重標的を測定する能力は、検出手法によってしばしば制約を受ける。一般に、区画を陽性(測定された蛍光が高い場合)または陰性(測定された蛍光が低い場合)に分類するために、蛍光を測定する。TaqManなどの一部の化学物質は、異なる色素で標識された標的特異的プローブを利用することによって、いくつかの標的を同時に測定できるようにする。検出器が、R種の異なる色素により放出された蛍光を測定できる場合、デジタル増幅システムは、R個の異なる標的を効果的に測定することが可能である。典型的には、より多くの色を検出可能な機器は、より少ない色を検出する場合よりも費用がかかる。検出可能な色素の数が増加すると費用がかかり、ある数を超えると非現実的である。一方、特にサンプルが限られる多くの適用例は、より高度な多重化から大きな利益を得ることができる。
この実施例は、機器が多数の色を検出可能であるならば、機器の検出光学部品にいかなる変更も必要とすることなく、同時に測定される標的の数を劇的に増加することができるという手法を提示する。アッセイを設計する標準的な手法は、単一の色素を有する単一プローブから生成された蛍光に基づいて、所与の標的を評価することである。したがって機器が、色素FAMおよびVICから放出された光などの2色を検出可能である場合、陽性FAMシグナルを有する区画の数をカウントすることによって1個の標的の濃度が測定され、陽性VICシグナルを有する区画の数をカウントすることによって別の標的の濃度が測定される。
アッセイは、多数のチャネル上で同時に蛍光を生成するものを設計することができる。多数の区画を有するデジタル増幅プラットフォーム上で処理する場合、これらのアッセイは、単一チャネルアッセイと一緒に多重化することができ、両方のチャネルで蛍光を有する区画の数をカウントすることによって測定することができる。
B.2色FAM-VIC検出による実施例
本発明者らが2つの非結合ローカス(標的1および標的2)を見ていると仮定し、かついくらかの数のFAMのみに陽性の液滴ならびにいくらかの数のVICのみに陽性の液滴が与えられるなら、本発明者らは、どれくらい多くのFAM-VIC二重陽性液滴を本発明者らが予測しているかを推定することができる。本発明者らが低濃度で操作する場合、この数は小さいものであるべきであり、明快なやり方で算定することができる。
本発明者らが、2個の追加のプローブ、即ち一方がFAMで標識され他方がVICで標識されたプローブを有するように、第3のアッセイ(標的3)を設定する場合、本発明者らは、推定と比較してどのくらい過剰なFAM-VIC二重陽性液滴を本発明者らが有しているかによって、この第3の標的ローカスの濃度を推定することができる。これは、全体的な精度を低下させる可能性があるが、それほどでもなく、基本的には本発明者らが希釈レジームで操作している場合には、全くない(即ち、液滴の総数は、陽性液滴の数よりも非常に大きい。)。以下、過剰なFAM-VIC二重陽性液滴(またはその他の区画)の濃度を決定するのに使用することができるアルゴリズムの例である。
同じ色素で標識された多数のプローブの使用は、陰性液滴の蛍光を増大させることになり、陰性液滴の蛍光が陽性液滴の蛍光に近付き始める極端な場合に、問題を提起する可能性がある。この問題には、十分に堅牢なアッセイを使用することによって効果的に対処することができる。共通のプローブを使用し(例えば、実施例3〜5参照)、陰性蛍光の上昇も全体として回避することができる。上記の例として、本発明者らは、テイルドプライマーまたはロックド核酸プローブを利用することにより、標的1および標的3には共通のFAMプローブを、標的2および標的3には共通のVICプローブを使用することを考える。
C.追加の考察
この手法から、4種以上の色が使用される場合にさらに大きな利点が得られる。選択するのに4種ある場合、2種の色の6つの組合せがある。単色と一緒になって、合計で10個のレポーターを与えることができる。本発明者らがさらに進んで三重の色を使用する場合、本発明者らは13個のレポーターで終わることになる。
この多色スキームを使用することの利点は、区画の数が増えるにつれてより明らかになる。そのような理由で、この手法は、液滴におけるデジタルPCRなどのデジタル増幅の、より最近の実用例と組み合わせた場合に、特に有用なものとなり、その場合は数千または数百万の区画を容易な費用効果のある手法で生成することができる。
いくつかのアッセイスキームを、多数の色を有する標的を同時に評価するのに用いることができる。多標識プローブを設計することができ、例えば単一プローブを、同じ分子上でFAMとVICの両方で標識することができる(例えば、図6参照)。別の例として、同じオリゴヌクレオチドをFAMおよびVICで別々に標識して、同じプローブのFAM標識タイプとVIC標識タイプとを生成し、次いでこれら2種のタイプを混合してもよい(例えば、図9B参照)。TaqManアッセイの場合のように、その他の場合には、2個のプローブを、同じアンプリコンストランドの異なる領域に結合するように設計することができる(例えば、図9A参照)。あるいはプローブは、アンプリコンの対向するストランドに結合することができ(例えば、図10参照)、したがって色素をクエンチャーから離して位置決めすることができ、結合されたプローブからの蛍光増大を促進させることができる。この手法は一般的であり、ライゲーション連鎖反応、分子ビーコン、スコーピオンプローブ、または分子反転プローブなどを含めたある範囲の化学物質と共に使用することができる。
D.過剰なFAM-VIC液滴を推定するための数学的手法
以下、接合FAM-VIC種(例えば、図6〜図8の標的3)の濃度を推定するのに使用することができるアルゴリズムの例である。
1.FAM対VICカウントの2×2表を得る。
2.明確に異なるFAMと、あたかも1種であるかのような接合FAM-VICとの濃度を算出する。
3.明確に異なるVICと、あたかも1種であるかのような接合FAM-VICとの濃度を算出する。
4.異なる濃度の接合FAM-VIC(そこから、明確に異なるFAMおよび明確に異なるVICの濃度を見出すことができる。)の試験をし、確率表(Table 1(表1))と観察されたカウント数との最良適合を見出す。
E.アルゴリズムのMATLABインプリメンテーション
以下、アルゴリズムのMATLABインプリメンテーションの一例である。アルゴリズムは、明快なやり方で、高次多重化にも拡張することができることに留意されたい。
% 3タイプのDNA断片:Fam-Vicが一緒のもの、Fam断片、Vic断片について考察
% する。本発明者らは、いくつかの確率(Fam-Vicクロスプロットにおけるカウン
% ト数)について観察し、その目的は濃度を推断することである。

% 最初に、順方向について行う。濃度が与えられたら、カウント数を算出する。
% 次いで逆方向について行い、単に濃度の異なる値について試験をし、実際のカ
% ウント数を与えるものを選択する。

N=20000;
A=10000;
B=20000;
AB=10000;% 一緒に合わせる

cA=A/N;
cB=B/N;
cAB=AB/N;

fprintf(1, '%f %f %f＼n', cAB, cA, cB);

pA=1-exp(-cA);
pB=1-exp(-cB);
pAB=1-exp(-cAB);

% クロスプロットにおいてAはXでありBはYである

p(2,1)=(1-pA)*(1-pB)*(1-pAB);% 左下
p(2,2)=pA*(1-pB)*(1-pAB);% 右下
p(1,1)=(1-pA)*pB*(1-pAB);% 左上
p(1,2)=1-p(2,1)-p(2,2)-p(1,1);% 右上

disp(round(p*N));

% 限度も直接算出する
cAorAB=(A+AB)/N;%=c_A+c_AB;
cBorAB=(B+AB)/N;%=c_B+c_AB;

pAorAB=1-exp(-cAorAB);% 同様にpから算出できる
pBorAB=1-exp(-cBorAB);

% 逆方向
H=p*N;% いくつかのヒットを得る

%H=[08000;20000];

% 確率を算出する
estN=sum(H(:));
i_p=H/estN;
i_pAorAB=i_p(1,2)+i_p(2,2);
i_pBorAB=i_p(1,1)+i_p(1,2);

i_cAorAB=-log(1-i_pAorAB);
i_cBorAB=-log(1-i_pBorAB);

maxVal=min(i_cAorAB, i_cBorAB);
delta=maxVal/1000;

errArr=[];
gcABArr=[];

forgcAB=0:delta:maxVal
gcA=i_cAorAB-gcAB;
gcB=i_cBorAB-gcAB;

gpA=1-exp(-gcA);
gpB=1-exp(-gcB);
gpAB=1-exp(-gcAB);

gp(2,1)=(1-gpA)*(1-gpB)*(1-gpAB);% 左下
gp(2,2)=gpA*(1-gpB)*(1-gpAB);% 右下
gp(1,1)=(1-gpA)*gpB(1-gpAB);% 左上
gp(1,2)=1-gp(2,1)-gp(2,2)-gp(1,1);% 右上

gH=gp*estN;

err=sqrt(sum((H(:)-gH(:)).^2));

errArr=[errArr;err];
gcABArr=[gcABArr;gcAB];

end

figure, plot(gcABArr, errArr);
minidx=find(errArr==min(errArr(:)));
minidx=minidx(1);
estAB=gcABArr(minidx);
estA=i_cAorAB-estAB;
estB=i_cBorAB-estAB;
fprintf(1, '%f %f %f＼n', estAB, estA, estB);

gpA=1-exp(-estA);
gpB=1-exp(-estB);
gpAB=1-exp(-estAB);

gp(2,1)=(1-gpA)*(1-gpB)*(1-gpAB);% 左下
gp(2,2)=gpA*(1-gpB)*(1-gpAB);% 右下
gp(1,1)=(1-gpA)*gpB*(1-gpAB);% 左上
gp(1,2)=1-gp(2,1)-gp(2,2)-gp(1,1);% 右上

gH=gp*estN;

disp(round(gH));

% シミュレーションを使用して結果を確認する

numMolA=round(estA*estN);
numMolB=round(estB*estN);
numMolAB=round(estAB*estN);

A=unique(randsample(estN, numMolA, 1));
B=unique(randsample(estN, numMolB, 1));
AB=unique(randsample(estN, numMolAB, 1));

U=1:estN;
notA=setdiff(U, A);
notB=setdiff(U, B);
notAB=setdiff(U, AB);
AorBorAB=union(A, union(B, AB));
none=setdiff(U, AorBorAB);

simcount(2,1)=length(none);
simcount(2,2)=length(intersect(A, intersect(notB, notAB)));
simcount(1,1)=length(intersect(B, intersect(notA, notAB)));
simcount(1,2)=length(AorBorAB)-simcount(2,2)-simcount(1,1);

disp(simcount);
(実施例7)
DNA断片を算出するためのまたはデジタル増幅多重化のためのアルゴリズム
この実施例は、多重化増幅アッセイでDNA断片のレベルおよび/または標的のレベルを算出する、例示的なアルゴリズムについて記述する。
A.序論
1.全体的に断片化された標的
2種の色素FAMおよびVICにそれぞれ対応する2個のDNA標的T1およびT2について考察する。T1およびT2が常に、図14に概略的に例示されるように個別のDNA断片上にあるようにする。T1およびT2標的を有するDNA断片の数を、それぞれM1およびM2とする。
FAMおよびVIC陽性区画のカウント数を、それぞれN1およびN2とする。N1およびN2は、区画内には多数のDN断片がある可能性があるのでM1およびM2よりも小さくなることに留意されたい。区画の総数をNとする。デジタル増幅区画を、単に区画と呼ぶことにする。この場合、Table 2(表2)に列挙された区画のカウント数がわかることが期待される。
本発明者らが、区画がFAM陽性であることがわかる確率をp1=N1/Nと表し、区画がVIC陽性であることがわかる確率をp2=N2/Nと表す場合、確率表は、Table 3(表3)により与えられる。
この場合、100%の断片化が存在すると言うことができる。
本発明者らは、T1およびT2分子、M1およびM2の数を、それぞれ下記の通り算出することができる(ここでlog=loge):
M1=-Nlog(1-p1)
M2=-Nlog(1-p2)
(N個のデジタル区画であり、そこでPが正であるなら、分子の数は
M=-Nlog(1-P/N)である。)。
2.断片化なし
次に、その他の極端な状態について考察する。標的T1およびT2は共に、同じDNA断片上に常に見出される(例えば、図15参照)。これらは、おそらくはそのローカスが染色体の同じ部分で互いに非常に近付いており、かつDNA単離中の染色体の断片化によってそのローカスが分離しなかったので、結合されている。したがって、N1=N2である。予測されるカウント数および確率を、それぞれTable 4(表4)およびTable 5(表5)に列挙する。
この場合、断片化の存在は0%と言うことができる。
本発明者らは、T1およびT2分子の数を、下記の通り算出することができ、ここでp1=N1/Nである:
M1=-Nlog(1-p1)
M2=-Nlog(1-p1)
3.部分断片化
中間状況において、標的がいくつかの断片上で一緒に存在し、しかし個別の断片上にもあるような場合には、部分断片化が生じる(例えば、図16参照)。
結合されたT1およびT2断片のM3分子、個別のT1断片のM1分子、ならびに個別のT2断片のM2分子があると想定する。
本発明者らは、区画のカウント数の表を作成することができる(Table 6(表6))。
4.問題点の記述
本発明者らは、どのように分子M1、M2、およびM3の数を見出し、それによって断片化の程度を得ることができるのであろうか。例えば、M1=M2=M3の場合、結合した分子の50%が断片化して個別の断片になり、50%は無傷のままであるので、50%の断片化が存在すると言うことができるであろう。
B.数種の色を使用した多くの標的に対するPCRの多重化
本発明者らには、上記問題に対する解決策を与えるアルゴリズムがあり、そのアルゴリズムに関する別の興味ある適用例がある。このアルゴリズムを用い、かつ標的T1にはFAMプローブを、標的T2にはVICプローブを、標的T3には互いに近付けて配置されたFAMおよびVICプローブの両方を使用することによって、本発明者らは、2色を使用して3個の標的の多重化を実現することができる。基本的に本発明者らは、第3の色を、アルゴリズムを使用して「自由に」得る。
次に、3種の色素がある場合について考察する。したがって本発明者らは、8つの観察されたカウント数の、2×2×2表を有することになる。
7個の異なる種類の標的:T1、T2、T3、T12、T23、T13、およびT123がある。ここで例えばT12は、色素1および色素2のプローブにより結合されたアンプリコンが生成されるように増幅した標的を意味し、T123は、3種全ての色素を含有する1個または複数のプローブによって結合されたアンプリコンが生成されるように増幅された標的を意味し、その他に関しても同様である。
4種の色素がある場合、24=16のカウント数があり、したがって24-1=15個の標的遺伝子の定量を多重化することができる。一般に、R種の色では、2Rの観察されたカウント数があり、2R-1個の標的を有することができる。
C.2種の色素および3個の標的に関する解決策
Table 7(表7)に列挙されたカウント数が与えられたと想定する。
下記の3つの場合について考察する:
1.あたかもVICが全く見られないかのように、VICを取り止める。
2.あたかもFAMが全く見られないかのように、FAMを取り止める。
3.あたかも唯一の色であるかのように、FAMとVICの両方について考察する。
下記の3つの観察事項が得られることになる:
1.VICを取り止める:T1およびT12は、あたかも1個の標的であるかのように、一まとめにかつ区別できない状態で見ることができる。分子T1およびT12の総数は、あたかも1つの標的種があるかのように与えられる。
2.FAMを取り止める:T2またはT12は、あたかも1個の標的があるかのように、区別できない状態でカウントすることができるようになる。分子T2およびT12の総数は、あたかも1つの標的種があるかのように与えられる。
3.区別できない状態にあるFAMおよびVICの両方について考察する:T1、T2、またはT12は、区別できない状態でカウントすることができるようになる。分子T1、T2、およびT12の総数は、あたかも1つの標的種があるかのように与えられる。
このようにすることによって、本発明者らは、3個の未知数の3個の方程式をステップ実行することが可能になる。本発明者らは、これらの3つの場合を表の形で示すことができる。
3個の未知数M1、M2、およびM12がある3個の一次方程式は下記の通りである:
本発明者らは上記方程式を解いて、M1、M2、およびM12の値を得る。
次いで本発明者らは、断片化の程度(単位:%)を下記の通り算出することができる:
M=(M1+M2)/2
F=M/(M+M12)*100
D.アルゴリズムのステップ
次に本発明者らは、Table 9(表9)の入力を使用して、明瞭にアルゴリズムのステップを書き留める。
アルゴリズム:
ステップ1.3つのエンティティを算出する:
M1または12=-N.log(1-N1/N)
M2または12=-N.log(1-N2/N)
M1または2または12=-N.log(1-(N01+N10+N11)/N)
ステップ2.下記の一次方程式を解く:
ステップ3.断片化の程度を算出する。
M=(M1+M2)/2
F=M/(M+M12)*100
ステップ4.濃度および予測される陽性カウント数とに基づいて信頼区間を算出する。Fの信頼区間を算出するには、2個のランダム変数の比であることに留意する。次いで本発明者らは技法を適用して、Fに関する2個のランダム変数の比の信頼区間を推定する。
出力は、M1、M2、およびFと、それらの信頼区間である。
E.代替の解決策の概要
次に本発明者らは、客観的基準の最適化として表される部分断片化の問題の、代替の解決策を提示する。最初に、下記の表を作成したい。どのタイプの分子が区画内にあるかに応じて、それに対応する区画のFAMおよびVICカラーが存在することになる。
Table 10(表10)は、分子とそれが発する区画の色をマップする。
M1、M2、およびM12を「推量」すると想定する。逆方程式:
p12=1-exp(-M12/N)
p1=1-exp(-M1/N)
p2=1-exp(-M2/N)
を使用してT1、T2、またはT12標的の複製物を有する区画の確率を算出することができる。
これらの確率から、Table 11(表11)に示されるように、予測されるカウント数を算出することができる。
上記確率は、区画の色を発する分子の存在をマップする、Table 10(表10)を使用して満たすことができる。
本発明者らの「推量」が実際に正しい場合、予測されるカウント数は、本発明者らが予測したカウント数に密接に「一致」することになる。したがって、最小限に抑える必要がある上記客観的基準の下でのアルゴリズムの最適化は、問題を解決するためにも使用することができる。
M1, M2, M12=最良推量=予測されたカウント数と実際のカウント数との最小偏差
次いで下記の通り、断片化の程度(単位:%)を算出することができる:
M=(M1+M2)/2
F=M/(M+M12)*100。
F.3種の色素および7個の標的に関する解決策
より多くの数の色素に関する問題を解決するには、より多くの未知数があるためにより多くの方程式を必要とする。3種の色素および7個の標的の場合、これらの7個の標的の濃度を見出すために7個の方程式が必要である。
ここにTable 12(表12)を示すが、どの色素が陽性となるかに応じた23=8列の区画カウント数が示されている。
3種の色素をD1、D2、およびD3により示す。
Table 13(表13)について考察する。
本発明者らは、第5、6、および7列で3回の再帰呼出しをする。
例えば、第5列では、3個の標的、即ち1個の標的として{T1, T13}、第2の標的として{T2, T23}、および第3の結合標的として{T12, T123}の場合である、2種の色素、D1およびD2について実際に解いている。
同様に、第6および7列では、2種の色素および3個の標的のより単純な問題を解くために、再帰呼出しをする。
方程式の系は、下記の通りである:
上記一次方程式の系は、7個の標的の濃度を見出すために解くことができる。
G.R種の色素および2R-1個の標的
次に、任意の数の色素にアルゴリズムを一般化するためのステップを示す。これは、再帰アルゴリズムである。本発明者らは、R=2の場合の解を有しているので、再帰を通して任意の数のRを解くことができる。
入力:
R種の色素の場合、区画内に色が存在するか否かの全ての可能性ある組合せを目的に、2R行を有する区画カウント数の表が得られる。
アルゴリズム:
ステップ1.2R-1個の一次方程式の系を設定する。これらの方程式を得るには、いくつかの色を目に見えないものにする種々の方法を考える。また、第1列を与える、全ての色が区別できない場合についても考える。2R-1個の標的濃度(未知数)で2R-1個の方程式が得られることを、示すことができる。ある色を、目に見えないものにする場合、その問題は、再帰的に解くことのできる、より少ない色の場合に還元され、さらには2種の色素および3個の標的がある場合にまで還元される。
ステップ2.方程式を解く。
ステップ3.濃度および予測される陽性カウント数に基づいて、信頼区間を算出する。
出力:
2R-1個の標的の濃度および信頼区間。
(実施例8)
多標識プローブ
この実施例は、例示的な多標識プローブと、このプローブを多重化デジタル増幅アッセイで使用する方法とについて記述する;図17〜図22参照。多標識プローブは、セクションIと実施例6および7に記述された、色に基づいた多重化アッセイに利用することができる。あるいは、または追加として、多標識プローブは、参照により本明細書に組み込まれる2011年7月12日出願の米国仮特許出願第61/507,082号;2011年7月20日出願の米国仮特許出願第61/510,013号に記載されるように、強度に基づいた多重化に利用することができる。
典型的な5'ヌクレアーゼアッセイ(TaqMan)プローブは、単一の蛍光体およびクエンチャーを有し、または2個の蛍光物を有して第2の蛍光物がFRET(例えば、TAMRA「クエンチャー」)により第1の蛍光体を消光するように作用する。蛍光体およびクエンチャーは、典型的にはオリゴヌクレオチドプローブの最も5'および3'側の塩基/ヌクレオチドに結合する。
オリゴヌクレオチド合成化学によって、蛍光体をプローブの内部ヌクレオチド/塩基に付加することが可能になる。多数の蛍光体を1個のオリゴヌクレオチドプローブに結合することによって、多重化能力を高めるのに使用することができる、より広い範囲のプローブを生成することが可能になる。多数の蛍光物を1個のプローブ上に配することができるので、結果的に得られる放出蛍光を「調整」して、単一の蛍光体で可能であるよりも多くの蛍光シグネチャーを実現することが可能になる。プローブのスペクトルは、一般に、含まれる多数の蛍光体の複合結果になる。共鳴することができまたはその他の方法で相互作用することができる蛍光体の場合、蛍光体と位置(内部または末端標識)との近接性により、さらなる調整を可能にすることができる。多数の蛍光体(またはクエンチャー)が異なることは、必要ではない。同じ蛍光物の多数の分子の付加により、プローブ1個当たりに異なる蛍光を出力することが可能になる場合がある。いくつかの適用例では、クエンチャーをオリゴヌクレオチドの5'-末端に配し、プローブの分解によってクエンチャーが除去されるように、しかしオリゴヌクレオチドの残りの部分に結合されたその他の蛍光体は残されるようにすることが、有益と考えられる。そのようにしてクエンチャーが切断されると、同じシグナルがプローブから得られるが、各プローブは異なるシグネチャーを有する可能性がある(例えば、プローブ1-FAM;プローブ2-FAM+Cy3;プローブ3-FAM+HEX;プローブ4-FAM+FAM;など)。
この手法は、その他の標的分子の多重化にも適用可能である。標的核酸の検出は、明らかに大きな関心が持たれている領域であるが、この概念をその他のタイプのプローブ(例えば、タンパク質標的の抗体プローブ)に適用することも可能である。
図17は、非標識オリゴヌクレオチド(A)と、オリゴヌクレオチドを含有する一組の例示的な多標識プローブ(B〜G)の概略図を示す。べた塗りの円および白抜きの円のそれぞれは、オリゴヌクレオチドに結合されたクエンチャー(クエンチャー部分とも呼ぶ。)および蛍光体をそれぞれ表す。F1からF4は、構造的に明確に異なる蛍光体を特定する。オリゴヌクレオチドは、とりわけ5から500、10から200、または15から100ヌクレオチドなど、任意の適切な長さを有していてもよい。
図17の多標識プローブは、下記の通りである:B)5'クエンチャーと、それぞれ内部および3'末端位置に蛍光体(F1およびF2)を有するオリゴヌクレオチド;C)5'クエンチャー部分と、3'および多数の内部位置に蛍光体(F1からF4)を有するオリゴヌクレオチド;D 5'クエンチャー部分と、3'および多数の内部位置に蛍光体(3×F1、F2)を有するオリゴヌクレオチド;E)5'クエンチャー部分と、内部クエンチャー部分、それに加えて3'および内部位置に蛍光体を有するオリゴヌクレオチド;F 5'クエンチャー部分と、3'および内部位置に蛍光体を有し、蛍光体同士の間がより大きく離れているオリゴヌクレオチド;ならびにG)5'末端および内部位置にある蛍光体と、3'末端位置にあるクエンチャーとを有するオリゴヌクレオチド。
図18は、標的増幅中の、プローブ分子のクエンチャーと蛍光体との分離を示す。鋳型分子は、例示的な多標識プローブ分子(図17B)の存在下、DNAポリメラーゼによって複製されている(相補的に)状態が示される。A)ポリメラーゼが、プローブ結合部位の上流で核酸鎖を伸長している。B)ポリメラーゼの5'ヌクレアーゼ活性が、プローブから最も5'側のヌクレオチド(この実施例ではクエンチャーを含む。)を除去し、クエンチャーおよび蛍光体を空間的に分離させる。C)ポリメラーゼは、プローブの結合が不安定になりかつ残りのプローブ断片が鋳型鎖から解離するまで、プローブから5'ヌクレオチドを除去し続ける。多数の蛍光体はさらに、プローブ断片内で互いに接続されていてもよいが、クエンチャーからは分離されている。
図19は、液滴強度の例示的な二次元ヒストグラムを示し、FAM、VIC、またはFAMとVICの両方でそれぞれが標識されている単一標識および二重標識プローブの組合せで行われる、3個の標的に関する多重化デジタル増幅アッセイで、得ることができる液滴クラスターを示している。この場合、標的3陽性により生成された液滴クラスターは、標的1および2の両方に二重陽性の液滴からは分割されない。
図20は、図19のアッセイで得ることができる、液滴強度の別の例示的な二次元ヒストグラムを示し、標的3に陽性の液滴のクラスターから、標的1+2に陽性の液滴のクラスターが部分的に分割される。
検出器の光学部品、特に励起源および光学フィルターは、クラスターの分離が最適化されるように選択することができる。例えば2個のクラスターは、第1の波長条件で実質的に重なり合っている可能性がある(分離が難しい。)が、第2の波長条件では実質的に重なり合っていない。分光光度計の格子または交換可能なフィルターのセットを備える検出器は、波長選択においてより大きな柔軟性をもたらすことができる。
図21は、液滴強度の例示的な二次元ヒストグラムであって、多標識プローブのみにより行われたデジタル増幅アッセイで得ることができる2個のクラスターのデータポイントを例示するヒストグラムを示す。
図22は、液滴強度の別の例示的な二次元ヒストグラムであって、図21のように行われたデジタル増幅アッセイであるが、多標識プローブに加えて(標的3の増幅を測定するために)一対の単一標識プローブで補われた(標的1および標的2の増幅を測定するために)アッセイで得ることができる、様々なクラスターのデータポイントを例示するヒストグラムを示す。多数の蛍光物を同じオリゴヌクレオチドに配することは、2個(またはそれ以上)の検出チャネルに異なるスペクトルのオーバーラップを有する異なるレベルのプローブおよび/または異なる蛍光物と組み合わせた場合に、より有利にすることができる。図22の例は、FAMのみおよびVICのみのプローブよりもわずかに高い蛍光を有する二重蛍光物プローブを示すが、これは、より高くてもまたはより低くても(または同じ)よい。ほぼ同じ(またはそうでない)場合、本明細書に開示される色に基づく多重化手法は、平均標的レベルを決定するのに有利に利用することができる。
標識されたデオキシヌクレオチド、クリックケミストリー、および様々なその他のリンカー化学反応を含めたいくつかの化学反応によって、本明細書に開示された多標識プローブを得ることができる。プローブは、オリゴヌクレオチドの供給業者による受託合成を経て生成することができる。内部蛍光体の組込みに関する例示的な合成経路について記述する参考文献を、以下に列挙し、参照により本明細書に組み込む。
(参考文献)
(実施例9)
選択された実施形態
この実施例は、一連の番号が付されたパラグラフとして限定することなく提示される、シグナルの組合せ使用によるデジタルアッセイに関する、選択された態様および実施形態について記述する。これらのパラグラフのそれぞれは、任意の適切な手法で、1つもしくは複数のその他のパラグラフおよび/または本開示における他の箇所での開示と組み合わせることができる。下記のパラグラフのいくつかは、明確にその他のパラグラフに言及しかつさらにその他のパラグラフを限定し、適切な組合せのいくつかの例を限定することなく提示する。
A1.(a)サンプルの複数の区画のそれぞれから検出された光を表す、R個のシグナルを生成するステップと;(b)R個のシグナルが区画間で互いに対してどのように変化するかに基づいて、区画内にあるR個よりも多い異なる標的の濃度を推定するステップとを含む、デジタルアッセイを行う方法。
B1.(a)サンプルを区画に分離するステップと;(b)区画から検出された光を表すR個のシグナルを生成するステップと;(c)R個のシグナルに基づいて、区画内にあるR個よりも多い標的の濃度を推定するステップとを含む、R個よりも多い標的に関してデジタルアッセイを行う方法。
B2.R個のシグナルの少なくとも1個が、R個のシグナルのその他それぞれ1個とは無関係に、各区画内での標的の存在または不在を報告する、パラグラフB1の方法。
B3.R個のシグナルのそれぞれが、R個のシグナルのその他それぞれ1個とは無関係に、各区画内での異なる標的の存在または不在を報告する、パラグラフB1またはB2の方法。
B4.R個のシグナルの2個以上の組合せが、各区画内でのR+1個の標的の存在または不在をまとめて報告する、パラグラフB1からB3のいずれかの方法。
B5.R個のシグナル単独のそれぞれに陽性である区画の数と、R個のシグナルの2個以上の少なくとも1つの組合せに陽性である数とを決定するステップをさらに含む、パラグラフB1からB4のいずれかの方法。
B6.各標的が区画間でポアソン分布を有する場合、濃度を推定するステップが、決定された陽性の数にまとまって該当するR個よりも多い標的のそれぞれの濃度を推定するステップを含む、パラグラフB5の方法。
B7.推定するステップが、一組の連立方程式の解を見出すステップを含み、方程式のそれぞれが同じ変数を有している、パラグラフB1からB6のいずれかの方法。
B8.連立方程式が一次方程式である、パラグラフB7の方法。
B9.解が数値解析によって得られる、パラグラフB7またはB8の方法。
B10.解を見出すステップが、少なくとも2R-1個の方程式に対する解を見出すステップを含む、パラグラフB7からB9のいずれかの方法。
B11.各方程式が、区画間でポアソン分布を有する各標的の複製物に基づく、パラグラフB7からB10のいずれかの方法。
B12.R個のシグナルのそれぞれが、個々の区画における異なる標的の存在または不在に対応する2個以上の統合シグナル部分を含む複合シグナルである、パラグラフB1からB11のいずれかの方法。
B13.サンプルを分離するステップが、区画当たりの平均濃度として、R個よりも多い標的それぞれの約1個未満の複製物を有する区画を形成する、パラグラフB1からB12のいずれかの方法。
B14.サンプルを分離するステップが、R個よりも多い標的それぞれに関して標的の複製物を含有しない1個または複数の区画を形成する、パラグラフB1からB13のいずれかの方法。
B15.区画が液滴である、パラグラフB1からB14のいずれかの方法。
B16.R個のシグナルのそれぞれが、検出される蛍光放出を表す、パラグラフB1からB15のいずれかの方法。
B17.R個のシグナルを生成するステップの前に、区画の1個または複数において増幅反応を行うステップをさらに含む、パラグラフB1からB16のいずれかの方法。
B18.増幅反応を行うステップが、区画を熱的サイクルに供するステップを含む、パラグラフB17の方法。
B19.各標的が核酸である、パラグラフB1からB18のいずれかの方法。
B20.区画が、個々の区画内での第1の標的分子の存在または不在を報告する第1のプローブ、個々の区画内での第2の標的分子の存在または不在を報告する第2のプローブ、および個々の区画内での第3の標的分子の存在または不在を報告する少なくとも1個の第3のプローブを含む、パラグラフB1からB19のいずれかの方法。
B21.少なくとも1個の第3のプローブが、単一の第3のプローブである、パラグラフB20の方法。
B22.区画が、個々の区画内での第1の標的分子の存在または不在を報告する第1のプローブ、個々の区画内での第2の標的分子の存在または不在を報告する第2のプローブを含み、第1および第2のプローブがまとまって、個々の区画内での第3の標的分子の存在または不在を報告する、パラグラフB1からB19のいずれかの方法。
B23.R個のシグナルのそれぞれが、異なる蛍光体から検出された光を少なくとも主として表す、パラグラフB1からB22のいずれかの方法。
B24.区画が全て、実質的に同じ容積を有する、パラグラフB1からB23のいずれかの方法。
B25.R個よりも多い標的の少なくとも1個が、その他のR個の標的の少なくとも2個の結合タイプである、パラグラフB1からB24のいずれかの方法。
C1.(a)サンプルを区画に分離するステップであって、各区画が、区画内に存在する場合にR個よりも多い標的を増幅可能なものであるステップと;(b)区画から検出された光を表すR個のシグナルを生成するステップであって、R個よりも多い標的の少なくとも1個に関しては、少なくとも1個の標的の区画内での増幅が、R個のシグナルの1個のみを選択的に変化させ、R個よりも多い標的の少なくともその他の1個に関しては、少なくともその他の1個の標的の区画内での増幅が、シグナルの2個以上を協働して変化させるステップと;(c)生成されたR個のシグナルに基づいて、R個よりも多い標的それぞれの濃度を推定するステップとを含む、デジタルアッセイを行う方法。
C2.増幅するステップが、生成するステップの前に、区画を熱的サイクルに供するステップを含む、パラグラフC1の方法。
C3.R個のシグナルが、検査領域内で液滴を運ぶ流体から検出された光を表す、パラグラフC1またはC2の方法。
C4.生成するステップが、異なる波長および/または異なる波長範囲の検出光を表す2個以上のシグナルを生成するステップを含む、パラグラフC1からC3のいずれかの方法。
C5.生成するステップが、2個以上のシグナルのそれぞれに関して異なる波長または異なる波長範囲で照明することにより生成された、同じ波長範囲の検出光を表す2個以上のシグナルを生成するステップを含む、パラグラフC1からC4のいずれかの方法。
D1.(a)R個よりも多い標的を区画内で増幅するステップと;(b)区画からのR個(R≧2)の異なる波長レジームで検出された光を表すR個のシグナルを生成するステップと;(c)R個のシグナルに基づいて、区画内の各標的の平均レベルを計算するステップであって、計算されたレベルが、存在する場合には異なる標的が同じ個々の区画内で同時発生することを説明するステップとを含む、多重化デジタル増幅アッセイを行う方法。例えば、Tが標的の数を示す場合、T>Rである。
D2.各標的の増幅が、個々に他の標的のいずれかとは異なるシグナルまたはシグナルの組合せによって報告される、パラグラフD1の方法。
D3.シグナルのそれぞれが、標的の少なくとも2個の異なる組合せの増幅を報告する、パラグラフD1またはD2の方法。
D4.区画が液滴であり、シグナルごとに少なくとも2個の標的のいずれかの増幅を示す液滴の数を決定するステップをさらに含み、計算するステップが、R個のシグナルのそれぞれに関して決定された数に基づく、パラグラフD3の方法。
D5.計算するステップが、一組の連立方程式の解を見出すステップを含む、パラグラフD1からD4のいずれかの方法。
D6.T個の標的があり、解を見出すステップが、T個の連立方程式の解を見出すステップを含み、R<T≦2R-1である、パラグラフD5の方法。
D7.解が数値解析によって得られる、パラグラフD5またはD6の方法。
D8.3個の標的があり、光を表すシグナルが、増幅中に、それぞれの標的のアンプリコンに結合するプローブに関連付けられた2個の蛍光体から検出される、パラグラフD1からD7のいずれかの方法。
D9.2個の蛍光体がVICおよびFAMである、パラグラフD8の方法。
D10.区画が、3個の標的の第1のものに関する第1のプローブ、3個の標的の第2のものに関する第2のプローブ、および3個の標的の第3のものに関する第3のプローブを含有し、第1のプローブがVICのみで標識され、第2のプローブがFAMのみで標識され、第3のプローブがVICとFAMの両方で標識される、パラグラフD8またはD9の方法。
D11.第3のプローブが、VICでは標識されていないFAM標識プローブ、およびFAMでは標識されていないVIC標識プローブを含む、パラグラフD10の方法。
D12.平均レベルが濃度である、パラグラフD1からD11のいずれかの方法。
D13.平均レベルを計算するステップが、各タイプの標的に関して増幅陽性区画の総数を決定するステップと、区画の総数を決定するステップとを含む、パラグラフD1からD12のいずれかの方法。
D14.いくつかの区画が、所与の標的の複数の複製物を含有するように、区画間で、R個よりも多い標的の複製物を分布させるステップをさらに含む、パラグラフD1からD13のいずれかの方法。
D15.少なくとも4個の標的がある、パラグラフD1からD13のいずれかの方法。
E1.(a)R個よりも多い標的を液滴内で増幅するステップと;(b)液滴からのR個(R≧2)の異なる波長レジームで検出された光を表すR個のシグナルを生成するステップと;(c)一連の連立方程式の解を見出すことによって、R個よりも多い標的のそれぞれの平均レベルを計算するステップとを含む、多重化デジタル増幅アッセイを行う方法。例えば、Tが標的の数を示す場合、T>Rである。
E2.各標的の増幅が、個々に、他の標的のいずれかとは異なるシグナルまたはシグナルの組合せによって報告される、パラグラフE1の方法。
E3.シグナルのそれぞれが、標的の少なくとも2個の異なる組合せの増幅を報告する、パラグラフE1またはE2の方法。
E4.各シグナルにより報告された少なくとも2個の標的のいずれかに増幅陽性である液滴の総数を決定するステップをさらに含み、計算するステップが、R個のシグナルのそれぞれに関して決定された総数に基づく、パラグラフE3の方法。
E5.T個の標的があり、計算するステップが、T個の連立方程式の解を見出すステップを含み、R<T≦2R-1である、パラグラフE1からE4のいずれかの方法。
E6.解が数値解析によって得られる、パラグラフE1からE5のいずれかの方法。
E7.レベルが、異なる標的が同じ個々の液滴内で任意に同時発生することを説明する、パラグラフE1からE6のいずれかの方法。
F1.(a)R個よりも多い標的を液滴内で増幅するステップと;(b)液滴からのR個の異なる波長レジームで検出された光を表すR個のシグナルを生成するステップであって、R≧2であり、シグナルのそれぞれが、標的の少なくとも2個の異なる組合せの増幅を報告するステップと;(c)R個のシグナルに基づいて、かつシグナルごとに少なくとも2個の標的のどれが、そのようなシグナルに関する個々の増幅陽性液滴内で増幅されたかを決定することなく、液滴内の各標的の平均レベルを計算するステップとを含む、多重化デジタル増幅アッセイを行う方法。例えば、Tが標的の数を示す場合、T>Rである。
F2.各シグナルにより報告された少なくとも2個の標的のいずれかに増幅陽性である液滴の総数を決定するステップをさらに含み、計算するステップが、R個のシグナルのそれぞれに関して決定された総数に基づく、パラグラフF1の方法。
F3.計算するステップが、一組の連立方程式の解を見出すステップを含む、パラグラフF1またはF2の方法。
G1.プローブを含有する液滴を含み、プローブが、オリゴヌクレオチド、第1の蛍光体、第2の蛍光体、およびエネルギー伝達部分を含んでおり、エネルギー伝達部分が、第1および第2の蛍光体の一方または両方に関するクエンチャーおよび/またはエネルギー伝達パートナーである、組成物。
G2.第1の蛍光体、第2の蛍光体、およびエネルギー伝達部分が、それぞれオリゴヌクレオチドに共有結合される、パラグラフG1の組成物。
G3.プローブを含有しかつキャリア流体中に配置される、複数の液滴をさらに含む、パラグラフG1またはG2の組成物。
G4.液滴が、鋳型分子と、鋳型分子の少なくとも1つの領域を増幅することが可能な増幅試薬とを含有し、プローブが、鋳型分子の領域の増幅により発生したアンプリコンに結合することが可能な、パラグラフG1からG3のいずれかの組成物。
G5.プローブが第1のプローブであり、液滴が、第1の蛍光体または第2の蛍光体を含むが第1の蛍光体と第2の蛍光体の両方は含まない第2のプローブをさらに含む、パラグラフG1からG4のいずれかの組成物。
G6.エネルギー伝達部分が、オリゴヌクレオチドの5'末端でヌクレオチドに結合されるクエンチャーである、パラグラフG1からG5のいずれかの組成物。
G7.第1の蛍光体、第2の蛍光体、およびエネルギー伝達部分のそれぞれが、オリゴヌクレオチドの異なるヌクレオチドに結合される、パラグラフG1からG6のいずれかの組成物。
G8.一対の第1の蛍光体、第2の蛍光体、およびエネルギー伝達部分が、オリゴヌクレオチドの同じヌクレオチドに結合される、パラグラフG7の組成物。
G9.第1の蛍光体、第2の蛍光体、およびエネルギー伝達部分の少なくとも1つが、第1の蛍光体、第2の蛍光体、およびエネルギー伝達部分の別のものを介してオリゴヌクレオチドのヌクレオチドに結合される、パラグラフG1からG8のいずれかの組成物。
G10.蛍光体またはクエンチャーが、オリゴヌクレオチドの5'末端に結合され、蛍光体またはクエンチャーが、オリゴヌクレオチドの3'末端に結合され、蛍光体またはクエンチャーが、5'末端および3'末端を介してヌクレオチドに結合される、パラグラフG1からG9のいずれかの組成物。
G11.第1の蛍光体、第2の蛍光体、およびエネルギー伝達部分の1つまたは複数が、オリゴヌクレオチドの5'末端および3'末端を介して配置された1つまたは複数の内部ヌクレオチドに結合される、パラグラフG1からG10のいずれかの組成物。
上述の開示は、独立した有用性を備えた多数の明確に異なる発明を包含することができる。これらの発明のそれぞれを、その好ましい形で開示してきたが、本明細書に開示され例示されるようなその特定の実施形態は、数多くの変形例が可能であるので限定する意味を持つものとは見なされない。本発明の主題は、本明細書に開示される様々な要素、特徴、機能、および/または性質の、全ての新規なかつ非自明の組合せおよびその下位の組合せを含む。下記の特許請求の範囲は、新規であり非自明であると見なされるある組合せおよびその下位の組合せを特に指摘する。特徴、機能、要素、および/または性質のその他の組合せおよびその下位の組合せに具体化される発明は、この優先権を主張する出願または関連出願において、特許請求の範囲に記載することができる。そのような特許請求の範囲は、異なる発明を対象としても同じ発明を対象としても、また当初の特許請求の範囲より広く、より狭く、均等であり、または異なっていても、本開示の発明の主題の範囲内に含まれると見なされる。さらに、特定された要素に関して第1、第2、または第3などの序数標識は、要素同士を区別するのに使用され、他に特に記述されない限り、そのような要素の特定の位置または順序を示すものではない。
80 標的
82 標的
84 プローブ
86 プローブ
88 オリゴヌクレオチド
90 オリゴヌクレオチド
92 蛍光体
94 蛍光体
96 クエンチャー
118 液滴
120 液滴
122 二重陽性液滴
156 複合シグナルα
158 複合シグナルβ
160 シグネチャー
162 シグネチャー
168 一組の液滴
170 二重陽性液滴

Claims (36)

  1. R個よりも多い標的を区画内で増幅するステップと;
    区画からのR個の異なる波長レジームで検出された光を表すR個のシグナルを生成するステップであって、R≧2であるステップと;
    R個のシグナルに基づいて、区画内の各標的の平均レベルを計算するステップであって、計算されたレベルが、存在する場合には異なる標的が同じ個々の区画内で同時発生することを説明するステップと
    を含む、多重化デジタル増幅アッセイを行う方法。
  2. 各標的の増幅が、個々にその他の標的のいずれかとは異なるシグナルまたはシグナルの組合せによって報告される、請求項1に記載の方法。
  3. シグナルのそれぞれが、標的の少なくとも2個の異なる組合せの増幅を報告する、請求項1または請求項2に記載の方法。
  4. 区画が液滴であり、シグナルごとに少なくとも2個の標的のいずれかの増幅を示す液滴の数を決定するステップをさらに含み、計算するステップが、R個のシグナルのそれぞれに関して決定された数に基づく、請求項3に記載の方法。
  5. 計算するステップが、一組の連立方程式の解を見出すステップを含む、請求項1に記載の方法。
  6. T個の標的があり、解を見出すステップが、T個の連立方程式の解を見出すステップを含む、請求項5に記載の方法。
  7. 解が数値解析によって得られる、請求項5または請求項6に記載の方法。
  8. 3個の標的があり、光を表すシグナルが、増幅中にそれぞれの標的のアンプリコンに結合するプローブに関連付けられた2個の蛍光体から検出される、請求項1に記載の方法。
  9. 2個の蛍光体がVICおよびFAMである、請求項8に記載の方法。
  10. 区画が、3個の標的の第1のものに関する第1のプローブ、3個の標的の第2のものに関する第2のプローブ、および3個の標的の第3のものに関する第3のプローブを含有し、第1のプローブがVICだけで標識され、第2のプローブがFAMだけで標識され、第3のプローブがVICとFAMの両方で標識される、請求項8または請求項9に記載の方法。
  11. 第3のプローブが、VICでは標識されていないFAM標識プローブおよびFAMでは標識されていないVIC標識プローブを含む、請求項10に記載の方法。
  12. 平均レベルが濃度である、請求項1に記載の方法。
  13. 平均レベルを計算するステップが、各タイプの標的に関して増幅陽性区画の総数を決定するステップと、区画の総数を決定するステップとを含む、請求項1に記載の方法。
  14. いくつかの区画が、所与の標的の複数の複製物を含有するように、区画間に、R個よりも多い標的の複製物を分布させるステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
  15. 少なくとも4個の標的がある、請求項1に記載の方法。
  16. R個よりも多い標的を液滴内で増幅するステップと;
    液滴からのR個の異なる波長レジームで検出された光を表すR個のシグナルを生成するステップであって、R≧2であるステップと;
    一組の連立方程式の解を見出すことによって、R個よりも多い標的のそれぞれの平均レベルを計算するステップと
    を含む、多重化デジタル増幅アッセイを行う方法。
  17. 各標的の増幅が、個々にその他の標的のいずれかとは異なるシグナルまたはシグナルの組合せにより報告される、請求項16に記載の方法。
  18. シグナルのそれぞれが、標的の少なくとも2個の異なる組合せの増幅を報告する、請求項16に記載の方法。
  19. 各シグナルによって報告された少なくとも2個の標的のいずれかに増幅陽性である液滴の総数を決定するステップをさらに含み、計算するステップが、R個のシグナルのそれぞれに関して決定された総数に基づく、請求項18に記載の方法。
  20. T個の標的があり、計算するステップが、T個の連立方程式の解を見出すステップを含む、請求項16に記載の方法。
  21. 解が数値解析によって得られる、請求項16に記載の方法。
  22. レベルが、異なる標的が同じ個々の液滴内で任意に同時発生することを説明する、請求項16に記載の方法。
  23. R個よりも多い標的を液滴内で増幅するステップと;
    液滴からのR個の異なる波長レジームで検出された光を表すR個のシグナルを生成するステップであって、R≧2であり、シグナルのそれぞれが、標的の少なくとも2個の異なる組合せの増幅を報告するステップと;
    R個のシグナルに基づいて、かつシグナルごとに少なくとも2個の標的のどれが、そのようなシグナルに関する個々の増幅陽性液滴内で増幅されたかを決定することなく、液滴内の各標的の平均レベルを計算するステップと
    を含む、多重化デジタル増幅アッセイを行う方法。
  24. 各シグナルによって報告された少なくとも2個の標的のいずれかに増幅陽性である液滴の総数を決定するステップをさらに含み、計算するステップが、R個のシグナルのそれぞれに関して決定された総数に基づく、請求項23に記載の方法。
  25. 計算するステップが、一組の連立方程式の解を見出すステップを含む、請求項23に記載の方法。
  26. プローブを含有する液滴を含み、プローブがオリゴヌクレオチド、第1の蛍光体、第2の蛍光体、およびエネルギー伝達部分を含み、エネルギー伝達部分が、第1および第2の蛍光体の一方または両方に関するクエンチャーおよび/またはエネルギー伝達パートナーである、組成物。
  27. 第1の蛍光体、第2の蛍光体、およびエネルギー伝達部分が、それぞれオリゴヌクレオチドに共有結合される、請求項26に記載の組成物。
  28. プローブを含有しかつキャリア流体内に配置された、複数の液滴をさらに含む、請求項26に記載の組成物。
  29. 液滴が、鋳型分子と、鋳型分子の少なくとも1つの領域を増幅することが可能な増幅試薬とを含有し、プローブが、鋳型分子の領域を増幅することによって発生したアンプリコンに結合することが可能である、請求項26に記載の組成物。
  30. プローブが第1のプローブであり、液滴が、第1の蛍光体または第2の蛍光体を含むが第1の蛍光体と第2の蛍光体の両方は含まない第2のプローブをさらに含む、請求項26に記載の組成物。
  31. エネルギー伝達部分が、オリゴヌクレオチドの5'末端でヌクレオチドに結合されたクエンチャーである、請求項26に記載の組成物。
  32. 第1の蛍光体、第2の蛍光体、およびエネルギー伝達部分のそれぞれが、オリゴヌクレオチドの異なるヌクレオチドに結合される、請求項26に記載の組成物。
  33. 一対の第1の蛍光体、第2の蛍光体、およびエネルギー伝達部分が、オリゴヌクレオチドの同じヌクレオチドに結合される、請求項32に記載の組成物。
  34. 第1の蛍光体、第2の蛍光体、およびエネルギー伝達部分の少なくとも1つが、第1の蛍光体、第2の蛍光体、およびエネルギー伝達部分の別のものを介してオリゴヌクレオチドのヌクレオチドに結合される、請求項26に記載の組成物。
  35. 蛍光体またはクエンチャーが、オリゴヌクレオチドの5'末端に結合され、蛍光体またはクエンチャーが、オリゴヌクレオチドの3'末端に結合され、蛍光体またはクエンチャーが、5'末端および3'末端を介してヌクレオチドに結合される、請求項26に記載の組成物。
  36. 第1の蛍光体、第2の蛍光体、およびエネルギー伝達部分の1つまたは複数が、オリゴヌクレオチドの5'末端および3'末端を介して配置された1つまたは複数の内部ヌクレオチドに結合される、請求項26に記載の組成物。
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