JP2016165276A - Dna検出方法、およびdna検出装置 - Google Patents
Dna検出方法、およびdna検出装置 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2016165276A JP2016165276A JP2016040939A JP2016040939A JP2016165276A JP 2016165276 A JP2016165276 A JP 2016165276A JP 2016040939 A JP2016040939 A JP 2016040939A JP 2016040939 A JP2016040939 A JP 2016040939A JP 2016165276 A JP2016165276 A JP 2016165276A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- aqueous solution
- flow rate
- fluorescent probe
- channel
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
【解決手段】DNA検出装置は、センサチップの表面上の流路を流れるサンプル液滴から出力される蛍光を検出して、検出対象となるDNAを検出するDNA検出装置であって、流路を流れるサンプル液滴から出力される蛍光を検出する蛍光検出部と、検出した前記蛍光の連続時間に基づいて、サンプル液滴それぞれに含まれる蛍光プローブ溶液の種類を判定し、蛍光の光強度のしきい値に対する大小関係に基づいて、サンプル液滴中に、検出対象となる前記DNAが含まれているか否かを判定するDNA検出手段DNA検出手段と、を備える。
【選択図】図1
Description
(a)DNA検出装置にセンサチップを設置し、
前記DNA検出装置は、
PCR処理部と、蛍光検出部と、DNA検出部とを備え、
前記センサチップは、
第1の流路と、第2の流路と、第3の流路と、第4の流路と、第5の流路と、第6の流路と、第7の流路と、第8の流路と、第9の流路とを備え、
前記第1の流路の一端および前記第2の流路の一端が、前記第3の流路の一端と接続され、
前記第3の流路の他端と前記第6の流路の一端とが接続され、
前記第4の流路および前記第5の流路は、前記第3の流路の一端と他端との間に接続され、
前記第6の流路の他端および前記第7の流路の一端が、前記第8の流路の一端と接続され、
前記第8の流路の他端は、前記PCR処理部と接続され、
前記PCR処理部は、前記第9の流路と接続され、
(b)前記第1の流路および第2の流路に、それぞれ、DNA水溶液およびDNA合成酵素水溶液を導入することにより、前記第3の流路に、前記DNA水溶液および前記DNA合成酵素水溶液の第1の混合水溶液を通過させ、前記DNA水溶液は、対象の1本鎖DNAを含み、
(c)前記第3の流路を前記第1の混合水溶液が流れているときに、前記第4の流路に、第1の流量で、第1の蛍光プローブ剤と第1のプライマとが混合された第1の蛍光プローブ水溶液を導入することにより、前記6の流路に、前記第1の混合水溶液および前記第1の蛍光プローブ水溶液の第2の混合水溶液を通過させ、前記第1の蛍光プローブ剤は、第1の一本鎖DNAと相補的に結合し、
(d)前記第7の流路に、第2の流量でオイル材料を導入することにより、第8の流路に、複数の第2の混合水溶液部および複数のオイル材料部を通過させ、前記前記複数の第2の混合水溶液部と前記複数のオイル材料部とは、前記8の流路に沿って、交互に並んでおり、
(e)前記第3の流路を前記第1の混合水溶液が流れているときに、前記第5の流路に、第3の流量で、第2の蛍光プローブ剤と第2のプライマとが混合された第2の蛍光プローブ水溶液を導入することにより、前記第6の流路に、前記第1の混合水溶液および前記第2の蛍光プローブ水溶液の第3の混合水溶液を流し、前記第2の蛍光プローブ剤は、前記第1の蛍光プローブ剤と異なり、かつ第2の一本鎖DNAと相補的に結合し、
(f)前記第7の流路に、第4の流量で前記オイル材料を導入することにより、前記8の流路に、複数の第3の混合水溶液部および複数のオイル材料部を通過させ、前記複数の第3の混合水溶液部と前記複数のオイル材料部とは、前記8の流路に沿って、交互に並んでおり、
(g)前記PCR処理部により、前記複数の第2の混合水溶液部および前記複数の第3の混合水溶液部をPCR処理し、前記第9の流路に通過させ、
(h)前記蛍光検出部により、前記第9の流路を流れる前記複数の第2の混合水溶液部および前記複数の第3の混合水溶液部のそれぞれから出力される蛍光の強度を検出し、
(i)前記DNA検出部により、前記透過光の強度と、前記第1の流量と、前記第2の流量と、第3の流量と、第4の流量とに基づいて、前記対象の一本鎖DNAは、前記第1の一本鎖DNA及び前記第2の一本鎖DNAから選択される少なくとも1つを含むか否かを検出する。
実施の形態1に係るセンサチップ201及びDNA検出装置210について、図を参照しながら説明する。図2は、実施の形態1に係るセンサチップ201及びDNA検出装置210の構成を示すブロック図である。
センサチップ201について説明する。センサチップ201は、凹部が形成された表面を有する基板である。基板の材料の例はシリコンなどである。凹部が流路(溝)に相当する。例えば、流路は、数百マイクロメートルオーダーの幅および深さを有する。この流路によって、混合溶液生成手段202、サンプル液滴を生成する一本の流路203、DNA増幅手段204、および光導波手段205がつながれている。以下に、センサチップ201を構成する各構成要素について説明する。
図3は、混合溶液生成手段202の構成の一例を示す概略図である。図3に示す混合溶液生成手段202は、複数の流路で構成される。混合溶液生成手段202の流路と流路との結合部には、バルブ306、307が設けられている。
図3に示す混合溶液生成手段202は、第1の流路311と、第2の流路312と、第3の流路313と、第4の流路314と、第5の流路315と、第6の流路316とを有する。第1の流路311は、DNA合成酵素301が流れる。第2の流路312は、DNAが含まれたサンプル302が流れる。第3の流路313は、DNA合成酵素301とDNAが含まれたサンプル302とが混合されたDNA混合液が流れる。第4の流路314は、第1の蛍光プローブ303および第1のプライマ303が流れる。第5の流路315は、第2の蛍光プローブ304および第2のプライマ304が流れる。第6の流路316は、DNA混合液と第1の蛍光プローブ303および第1のプライマ303とが混合された混合液、または、DNA混合液と第2の蛍光プローブ304および第2のプライマ304とが混合された混合液が流れる。 第1の流路311、第2の流路312、第4の流路314、および第5の流路315は、それぞれ、DNA合成酵素301、DNAが含まれたサンプル302、第1の蛍光プローブ303および第1のプライマ303、第2の蛍光プローブ304および第2のプライマ304を導入するためのポンプを有していても良い。
図3に示すように2種類の材料を含む場合は、それぞれの液が混合しないように順次流路に供給される。図3において、第1の蛍光プローブ第1の蛍光プローブ303および第1のプライマ第1のプライマ303第1のプライマ303が流路に供給されているときは、第2の蛍光プローブ第2の蛍光プローブ第2の蛍光プローブ304および第2のプライマ第2のプライマが供給される流路のバルブ307を閉じることにより、第2の蛍光プローブ第2の蛍光プローブ304および第2のプライマ第2のプライマ304が混合させない。
また、第2の蛍光プローブ第2の蛍光プローブ304第2の蛍光プローブ304および第2のプライマ第2のプライマ304を流路に供給する場合は、バルブ306を閉じ、バルブ307を開くことで、第1の蛍光プローブおよび第1のプライマが流路内に供給されない。このようにして、複数の種類の蛍光プローブとプライマとが用いられる場合は、その組み合わせの種類毎に流路が形成され、各流路と第3の流路とがバルブを介して接続される。各流路と第3の流路との間の各バルブのうち、いずれか1つのバルブのみが開けられるように制御することで、異なる種類の複数の種類の蛍光プローブとプライマとが混ざらないようにする。なお、図3のような構成を示したが、各液体を蛍光プローブやプライマの組み合わせの種類毎に別に混合させることができれば、その他の流路構成でも本開示の効果には何ら影響は与えない。例えば、第1の蛍光プローブおよび第1のプライマ第1のプライマ303を供給する流路と、第2の蛍光プローブおよび第2のプライマ第2のプライマ304を供給する流路とをDNAが含まれたサンプル302を流す流路について互いに対向して設けてもよい。
図4は、サンプル液滴を生成する一本の流路の構成の一例を示す概略図である。一例として図4に示すように、混合溶液生成手段202によって生成された混合溶液403を流すための第6の流路401と、オイル材料404が流れるための第7の流路402がT型に結合して一本の第8の流路に合流する。混合溶液403とオイル材料404とはT型部分で合流し、それぞれが混じりあうことがないために、オイル材料404で小さくちぎられた混合溶液の小さな液滴405が一本の流路(第8の流路)内に形成される。混合溶液の単位時間当たりの流量と、オイル材料の単位時間当たりの流量が安定していれば、ほぼ同じ大きさの液滴が連続して形成される。第7の流路402には、オイル材料を導入するポンプが配置され得る。
例えば、第1の流路311、第2の流路312、第4の流路314、第5の流路315、および第7の流路402に位置されるポンプにより、各流路に単位時間当たりの所定流量が導入されることにより、所定の大きさの液滴が形成される。
ここでは、図4のようにT型に結合した流路を説明したが、形はこれに限らず、混合溶液の供給用流路の両側からオイル材料が合流する構成などは別の構成であってもよい。つまり、混合溶液とオイル材料とがぶつかることで混合溶液の液滴が形成されるものであれば、別の流路構成であっても、効果には影響しない。
図5は、DNA増幅手段204の構成の一例を示す概略図である。DNA増幅手段204は、液滴が収められるチャンバ501を含む。チャンバ501の入口503はバルブ504で開閉され、チャンバ501の出口506はバルブ505で開閉される。液滴を導入される時は、入口503、および出口506とも開けられており、チャンバ501の内部が液滴で満たされた後、バルブ504及びバルブ505により入口503及び出口506を閉じる。チャンバ501内では、PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)というDNA増幅処理が行われる。この処理をPCR処理とも表記する。DNA増幅手段204の一例は、チャンバ及びヒーターである。チャンバ501は第8の流路および第9の流路の間に位置する。DNA増幅手段204はPCR処理部とも表記される。
図10Aに示すように、DNAは、相補的に並んだ塩基配列の二本鎖の構造(1001、1002が結合した状態)を持つ。このDNAは、ある温度まで加熱すると、この二本鎖が外れ、一本鎖のDNA(1001、1002)となる。この一本鎖のDNAを含むサンプルに対して、例えば一本鎖DNA1001がターゲットとなるDNAであった場合、ターゲットDNA1001の配列鎖の第一の領域に相補的な配列をもつプライマ(1003)と、同じターゲットDNAの配列鎖の第二の領域に相補的な配列を含む蛍光プローブ(蛍光色素で標識したオリゴヌクレオチド、1005)を接触させて、ハイブリダイゼーションを生じさせる条件にすると、プライマ1003、蛍光プローブ1005がターゲットDNA1001と二本鎖複合体を形成する。また、ターゲットDNAではない一本鎖DNA1002にも対応するプライマ1004が結合する。しかしターゲットDNAではないため、蛍光プローブは結合しない。
図10Bに示すように、その後、5‘→3’ヌクレアーゼ活性となる条件にすると、DNA合成酵素が働き始め、一本鎖DNA1001および1002に結合したプライマ1003および1004を基準として、DNA伸長が始まる。
図10Cに示すように、DNA伸長が進むと、ターゲットDNA1001に結合した蛍光プローブ1005が遊離する。蛍光プローブ1005に含まれる蛍光色素1006と消光剤1007は、遊離前は近接した領域に存在するため蛍光色素が光ることは無いが、DNA伸長によって蛍光プローブが遊離して、蛍光色素1006と消光剤1007が離れるので、蛍光が発色する。
この一連のサイクルによってターゲットDNA一本に対して、一つの蛍光色素が発光する。また、DNA伸長によって一本鎖DNAはそれぞれ二本鎖DNAとなるため、DNAは2倍に増幅される。つまり、この過程を繰り返すことで、繰り返し回数に応じて、DNAの鎖の数は2の累乗倍だけ増幅され、また同様に蛍光色素の遊離も2の累乗倍生じる。この過程を繰り返すことで蛍光強度が強くなっていく。
次に、DNA検出装置210について説明する。DNA検出装置210は、サンプル液滴からの蛍光を検出する蛍光検出手段207と、検出した蛍光の連続時間に基づいてサンプル液滴に含まれる蛍光プローブ溶液の種類を判定し、蛍光のしきい値に対する大小関係に基づいて、検出対象となるDNAの有無を判定するDNA検出手段208と、を備える。なお、蛍光検出のための励起用光源206をさらに備えてもよい。図6は、センサチップの光導波路手段の箇所とDNA検出装置210とを含む検出光学系の構成の一例を示す概略図である。以下に、センサチップの光導波路手段の箇所とDNA検出装置210とを含む検出光学系の各構成要素について説明する。
センサチップは、Si基板601上に数百μmの長さの溝を形成し、その上からガラス板602を陽極接合などの方法で貼りあわせることで構成されている。溝はガラス板602を貼りあわせることで、液滴が流れる流路603となる。流路603内を、DNA増幅処理後の液滴604が一列になって連続的に、かつ決められた一定の速度で流れてくる。液滴604に対して蛍光色素を励起する光を照射し、また、それによって発光する蛍光を蛍光検出手段に取り出す必要があるが、この構成のチップにおいてはガラス面を通して、光の入出力を行う。この構成では、このガラス面から液滴が流れている流路までの光学的な経路が光導波手段に相当する。
光源は、蛍光色素を効率的に励起するために色素の吸収スペクトルの最大吸収波長付近の波長のレーザ、もしくはLEDなどを用いる。特に光学系としてはできるだけ小型で高出力あることが好ましく、光源としては半導体レーザなどが好ましい。実施の形態1においては、波長490nmの半導体レーザ605を用いた。半導体レーザ605から出射するレーザ光はコリメータレンズ606によって平行光となり、ダイクロイックミラー607で反射される。
ダイクロイックミラーは、波長によって反射、透過を選択することが可能なミラーで、実施の形態1では、例えば、カットオフ505nmのダイクロイックミラーを用いる。505nmより短い波長の光を反射し、波長505nmより長い波長の光は透過される。反射したレーザ光は対物レンズ608によって流路603中の液滴通過位置に集光される。ターゲットDNAが含まれた液滴は、液滴中に大量の蛍光色素が遊離した状態となっているため、このレーザ照射によって蛍光色素が励起され、蛍光を発光する。液滴604から発した蛍光のうち一部を対物レンズ608を通して蛍光検出器側に取り出す。
対物レンズ608は、蛍光を出来るだけ効率よく取り込む必要があるため、開口数(NA)の大きいレンズが好ましい。実施の形態1では、例えば、NA0.85の対物レンズを用いる。対物レンズ608と透過してきた蛍光はダイクロイックミラー607を透過する。その後、蛍光波長の光を透過する光学フィルタ609を通して、蛍光以外の光(例えば励起光の漏れこみ、その他の材料から発する蛍光など)を除去した後、レンズ610によって蛍光検出器に集光される。レンズ610によって集光するポイントに、ちょうど絞り込んだ光が透過するサイズのピンホール611を設置することによって、センサチップに絞り込んだレーザ光のうち、焦点以外の領域から反射してきた迷光成分をカットすることが可能となる。そしてピンホールを透過した蛍光のみが蛍光検出器612に入力される。
蛍光検出器612は、励起光の1万分の1〜10万分の1くらいの大きさとなる蛍光を高感度に、そして高速に検出する必要があるため、フォトマルチプライア(PMT)やアバランシェフォトダイオード(APD)、フォトダイオード(PD)などの高感度検出器が用いられる。特に感度も良く応答速度の速いPMTが好ましい。実施の形態1においては、例えば、電流出力型PMTを用いる。
DNA検出手段208は、検出した蛍光の連続時間が所定値である場合にサンプル液滴に含まれる蛍光プローブ溶液の種類を判定する。蛍光の連続時間とは、閾値以上の強度を有する蛍光を検出し続けた時間である。
より具体的には、DNA検出手段208は、透過光と、オイルの流量と、混合溶液の流量とに基づいて、DNA混合液に、検出対象のDNAが含まれているか否かを検出する。オイルの流量及び混合溶液の流量は、サンプル液滴が第9の流路を流れる時間に対応する。よって、DNA検出手段208は、混合溶液の流量と連続時間とが対応付けられた基準を参照して、検出した連続時間に対応する混合溶液の流量を特定する。特定された混合溶液に含まれる蛍光プローブ剤の検出対象のDNAが、サンプル液滴に含まれているか否かを検出する。DNA検出手段208は、例えば、CPU、メモリ、記憶装置、入出力部、表示部、インタフェース等を備えたコンピュータによって実現してもよい。
2種類のターゲットDNAを検査するということは、ターゲットとなる塩基配列が2箇所あるということである。そのため、それぞれの塩基配列に対して相補的に結合する蛍光プローブを別々に準備する。蛍光プローブは、人工的に所望の塩基配列を構成することが可能である。それぞれの蛍光プローブには、その末端に蛍光色素と消光剤を修飾しておく。実施の形態1においては、2種類のターゲットDNAに対応する2種類の蛍光プローブを人工的に構成するが、修飾する蛍光色素は両者とも同じ蛍光色素を用いた。つまり蛍光プローブの塩基配列はそれぞれ異なるものの修飾されている蛍光色素はすべて同じである。実施の形態1では、蛍光色素として、励起波長495nm、蛍光波長520nmのフルオレセインと呼ばれる色素を用いた。ターゲットDNAのうちの一つに対応する蛍光プローブとプライマを第1の蛍光プローブと第1のプライマ、もう一つのターゲットDNAに対応する蛍光プローブとプライマを第2の蛍光プローブと第2のプライマと呼ぶことにする。
次に、第1の蛍光プローブおよび第1のプライマ、第2の蛍光プローブおよび第2のプライマを使用して、2種類のターゲットDNAを検出する方法について説明する。
混合溶液生成手段は、図3に示すとおり、第1の蛍光プローブおよび第1のプライマを供給する流路と、第2の蛍光プローブおよび第2のプライマを供給する流路が別々に設けられており、それぞれの流路の出口にはバルブが設けられ、それぞれを別々に供給できるようになっている。また、第1の蛍光プローブおよび第1のプライマを供給する流路と、第2の蛍光プローブおよび第2のプライマを供給する流路は、深さは両者とも30μmと同じ深さだが、幅は第1の蛍光プローブの流路は100μm、第2の蛍光プローブの流路は120μmと異なった設計としている。各蛍光プローブを送液するためのポンプの圧力は、同じ圧力のポンプを使用しており、混合溶液生成手段の出力における流量は、この蛍光プローブを供給する流路の幅の違いに応じて変化する。また、ここでは流路の幅を変えたが、深さを変えることによっても同じ効果が得られる。流路の断面積を変えられれば、実施の形態1における効果には影響を及ぼさない。
第一に、図3のバルブ306を開き、DNA合成酵素301とDNAサンプル302と第1の蛍光プローブおよび第1のプライマ第1のプライマ303を流路中で混合させ、生成した混合溶液305を次のサンプル液滴を生成する一本の流路へと送液する。このとき、混合溶液生成手段の出口での流量は、例えば、約100nL/minである。この混合溶液305は、図4に示すサンプル液滴を生成する一本の流路の入力流路401に送液される。図4のオイル材料402の供給流路でのオイル材料の流量は約100nL/minに設定した。このとき、サンプル液滴を生成する一本の流路のT型に結合した流路部分で、混合溶液とオイル材料が合流し、図4に示すようにオイル材料によって分離された混合溶液の液滴が順次生成される。混合溶液に含まれるDNAサンプルは大きく希釈されており、このとき生成される液滴中には、DNAが一分子以下の数だけ入るように調整されている。この条件では、生成される液滴の容量は、平均すると0.38nLであった。その後、この液滴は、次のDNA増幅手段へと送られる。
それぞれ順次生成された第1の蛍光プローブを含む液滴と、第2の蛍光プローブを含む液滴は図5に示すようなDNA増幅手段に送られ、DNA増幅チャンバ内に密集した形で満たされる。図5においては、DNAチャンバ内の液滴の数は少なく書かれているが、本実施の形態1においては、第1の蛍光プローブを含む液滴を約5000個、第2の蛍光プロープを含む液滴を約5000個ずつそれぞれ生成して、計約10000個の液滴がDNA増幅チャンバ内を満たしている。また、混合溶液内、あるいはオイル材料内には、界面活性剤が含まれており、このように液滴がチャンバ内で密集した状態においても、また、DNA増幅処理中の温度サイクルを実施しても、液滴同士が結合してしまうことは無い。所定の数の液滴が生成され、DNA増幅チャンバ内が液滴で満たされると、DNA増幅手段の入口、出口のバルブを両者とも閉じ、DNA増幅処理を行う。
DNA増幅処理後の液滴は、次の光導波手段へと導かれる。本実施の形態1においては、Si基板に掘られた幅50μm、深さ30μmの溝の上から厚み500μmのガラス板を貼りあわせた構造の光導波手段を構成した。この流路中にDNA増幅手段でDNA増幅処理を受けた液滴が、一個ずつ一列になって送液される。このときの送液レートは、蛍光検出手段で流れてくる液滴の数をカウントする間、常に一定に保たれる。図6に示す光学系を用いて、液滴の数をカウントした。
レーザは、今回用いた蛍光色素フルオレセインを励起するために490nmの半導体レーザを用い、蛍光検出器として高感度で高速応答性を有する電流出力型のPMT(フォトマルチプライア)を用いた。また対物レンズはより多くの蛍光を効率よく取り込むため、NA(開口数)0.85の石英の対物レンズを用いた。
図1の(a)は、光導波手段の流路101を流れてくる液滴102、103の様子を示す概略図である。図1の(b)は、図1の(a)の光導波手段の流路101を流れてくる液滴102、103について、PMTで検出される光信号の様子を示すグラフである。図1の(a)に示すように、光導波手段の流路101の中を液滴102、103が一個ずつ順番に流れてくる。実施の形態1では、2種類の蛍光プローブを用いて、それぞれ異なる容量の液滴を生成するので、4つのパターンの液滴が流路中を流れてくる。それは、第1の蛍光プローブを含む平均容量0.38nLの小さな液滴で、蛍光色素が遊離した液滴と、蛍光色素が遊離していない液滴、そして、第2の蛍光プローブを含む平均容量0.48nLの大きな液滴で、蛍光色素が遊離した液滴と蛍光色素が遊離していない液滴の4種類である。
102 ターゲットDNAを含まないサンプル液滴
103 ターゲットDNAを含むサンプル液滴
104 蛍光検出信号
105 信号検出しきい値
106 第二のしきい値
201 センサチップ
202 混合溶液生成手段
203 一本の流路
204 DNA増幅手段
205 光導波手段
206 光源
207 蛍光検出手段
301 DNA合成酵素
302 DNAサンプル
303 第1の蛍光プローブと第1のプライマを含む溶液
304 第2の蛍光プローブと第2のプライマを含む溶液
305 混合溶液
306 バルブ
307 バルブ
401 混合溶液入力流路
402 オイル材料入力流路
403 混合溶液
404 オイル材料
405 サンプル液滴
501 DNA増幅チャンバ
502 サンプル液滴
503 入力流路
504 バルブ
505 バルブ
506 出力流路
507 DNA増幅チャンバと周辺部材を分けるギャップ
601 Si基板
602 ガラス板
603 流路
604 液滴
605 レーザ
606 コリメートレンズ
607 ダイクロイックミラー
608 対物レンズ
609 光学フィルタ
610 レンズ
611 ピンホール
612 PMT(フォトマルチプライア)
901 混合溶液
902 オイル材料
903 バルブ
904 オイル材料
905 バルブ
906 オイル材料
907 バルブ
908 サンプル液滴
1001 一本鎖DNA
1002 一本鎖DNA
1003 フォワードプライマ
1004 リバースプライマ
1005 プローブ
1006 蛍光色素
1007 消光剤
Claims (12)
- DNA検出方法であって、
(a)DNA検出装置にセンサチップを設置し、
前記DNA検出装置は、
PCR処理部と、蛍光検出部と、DNA検出部とを備え、
前記センサチップは、
第1の流路と、第2の流路と、第3の流路と、第4の流路と、第5の流路と、第6の流路と、第7の流路と、第8の流路と、第9の流路とを備え、
前記第1の流路の一端および前記第2の流路の一端が、前記第3の流路の一端と接続され、
前記第3の流路の他端と前記第6の流路の一端とが接続され、
前記第4の流路および前記第5の流路は、前記第3の流路の一端と他端との間に接続され、
前記第6の流路の他端および前記第7の流路の一端が、前記第8の流路の一端と接続され、
前記第8の流路の他端は、前記PCR処理部と接続され、
前記PCR処理部は、前記第9の流路と接続され、
(b)前記第1の流路および第2の流路に、それぞれ、DNA水溶液およびDNA合成酵素水溶液を導入することにより、前記第3の流路に、前記DNA水溶液および前記DNA合成酵素水溶液の第1の混合水溶液を通過させ、前記DNA水溶液は、対象の1本鎖DNAを含み、
(c)前記第3の流路を前記第1の混合水溶液が流れているときに、前記第4の流路に、第1の流量で、第1の蛍光プローブ剤と第1のプライマとが混合された第1の蛍光プローブ水溶液を導入することにより、前記6の流路に、前記第1の混合水溶液および前記第1の蛍光プローブ水溶液の第2の混合水溶液を通過させ、前記第1の蛍光プローブ剤は、第1の一本鎖DNAと相補的に結合し、
(d)前記第7の流路に、第2の流量でオイル材料を導入することにより、第8の流路に、複数の第2の混合水溶液部および複数のオイル材料部を通過させ、前記前記複数の第2の混合水溶液部と前記複数のオイル材料部とは、前記8の流路に沿って、交互に並んでおり、
(e)前記第3の流路を前記第1の混合水溶液が流れているときに、前記第5の流路に、第3の流量で、第2の蛍光プローブ剤と第2のプライマとが混合された第2の蛍光プローブ水溶液を導入することにより、前記第6の流路に、前記第1の混合水溶液および前記第2の蛍光プローブ水溶液の第3の混合水溶液を流し、前記第2の蛍光プローブ剤は、前記第1の蛍光プローブ剤と異なり、かつ第2の一本鎖DNAと相補的に結合し、
(f)前記第7の流路に、第4の流量で前記オイル材料を導入することにより、前記8の流路に、複数の第3の混合水溶液部および複数のオイル材料部を通過させ、前記複数の第3の混合水溶液部と前記複数のオイル材料部とは、前記8の流路に沿って、交互に並んでおり、
(g)前記PCR処理部により、前記複数の第2の混合水溶液部および前記複数の第3の混合水溶液部をPCR処理し、前記第9の流路に通過させ、
(h)前記蛍光検出部により、前記第9の流路を流れる前記複数の第2の混合水溶液部および前記複数の第3の混合水溶液部のそれぞれから出力される蛍光の強度を検出し、
(i)前記DNA検出部により、前記透過光の強度と、前記第1の流量と、前記第2の流量と、第3の流量と、第4の流量とに基づいて、前記対象の一本鎖DNAは、前記第1の一本鎖DNA及び前記第2の一本鎖DNAから選択される少なくとも1つを含むか否かを検出する、
DNA検出方法。 - 前記(i)において、前記DNA検出部は、
前記蛍光検出部で第1の閾値以上の光の強度を検出し続けた連続時間を取得し、
前記連続時間の長さに、前記第1の流量及び第2の流量に対応する時間、または前記第3の流量および第4の流量に対応する時間があるか否かにより、前記DNA溶液に含まれる前記対象の一本鎖DNAは、前記第1の一本鎖DNA又は前記第2の一本鎖DNAを含むか否かを検出する、
請求項1に記載のDNA検出方法。 - 前記DNA検出部は、
前記連続時間が前記第1の流量及び第2の流量に対応する時間であった場合、前記対象の一本鎖DNAに、前記第1のDNAが含まれていると検出し、
前記連続時間が前記第3の流量及び第4の流量に対応する時間であった場合、前記対象の一本鎖DNAに、前記第2のDNAが含まれていると検出する、
請求項2に記載のDNA検出方法。 - 前記第1の流量及び第2の流量に対応する時間は、前記第9の流路における前記複数の第2の混合水溶液部の流量に対応し、
前記第3の流量及び第4の流量に対応する時間は、前記第9の流路における前記複数の第3の混合水溶液部の流量に対応し、
請求項3に記載のDNA検出方法。 - 前記第2の流量と前記第4の流量とが同じであり、かつ、前記第1の流量が、前記第3の流量と異なることにより、前記第2の混合水溶液と前記第3の混合水溶液との流量比が、前記第1の蛍光プローブ水溶液と前記第2の蛍光プローブ水溶液との流量比に対応して異なる流量比である、
請求項1に記載のDNA検出方法。 - 前記第4の流路の断面積と前記第5の流路の断面積とが異なることにより、前記第1の流量が前記第3の流量と異なる、請求項5に記載のDNA検出方法。
- 前記第2の流量と前記第4の流量とが異なる、請求項1に記載のDNA検出方法。
- 前記第1の蛍光プローブ水溶液および前記第2の蛍光プローブ水溶液に含まれる蛍光色素は、同一波長の蛍光を発色する蛍光色素である、請求項1に記載のDNA検出方法。
- 前記複数の第2の混合水溶液部の容量の平均値と、前記複数の第3の混合水溶液部の容量の平均値とが、25%以上異なる、請求項1に記載のDNA検出方法。
- センサチップの表面上の流路を流れる複数のDNA混合水溶液部から出力される蛍光に基づいて、DNAを検出するDNA検出装置であって、
前記DNA混合水溶液は、DNA混合溶液と第1の蛍光プローブ水溶液又は第2の蛍光プローブ水溶液とが混合された水溶液であり、
前記DNA混合溶液は、対象の1本鎖DNAを含むDNA溶液とDNA合成酵素とが混合された水溶液であり、
前記第1の蛍光プローブ水溶液は、第1の1本鎖DNAと相補的に結合する蛍光プローブ剤とプライマとが混合された水溶液であり、
前記第2の蛍光プローブ水溶液は、第2の1本鎖DNAと相補的に結合する蛍光プローブ剤とプライマとが混合された水溶液であり、
前記流路を流れる複数のDNA混合水溶液部から出力される蛍光の強度を検出する蛍光検出部と、
前記蛍光の連続時間に基づいて、複数のDNA混合水溶液部それぞれに含まれる蛍光プローブ水溶液の種類を判定し、前記蛍光のしきい値に対する大小関係に基づいて、前記対象の一本鎖DNAは、前記第1の一本鎖DNA及び前記第2の一本鎖DNAから選択される少なくとも1つを含むか否かを検出するDNA検出部と、
を備える、DNA検出装置。 - 前記DNA検出部は、第1の閾値以上の強度を有する蛍光を検出し続けた連続時間を取得し、
前記連続時間の長さに基づいて、前記対象の一本鎖DNAは、前記第1の一本鎖DNA及び前記第2の一本鎖DNAから選択される少なくとも1つを含むか否かを検出する、
請求項10に記載のDNA検出装置。 - 前記蛍光プローブ水溶液の種類ごとに生成される前記複数のDNA混合水溶液部による前記蛍光の連続時間の平均値を、短い方からT(n)(秒)(n=1、2、・・・)とすると、
T(n) × 1.25 ≦ T(n+1)
の関係が成り立つ、請求項10に記載のDNA検出装置。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2015042915 | 2015-03-04 | ||
JP2015042915 | 2015-03-04 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2016165276A true JP2016165276A (ja) | 2016-09-15 |
JP6172644B2 JP6172644B2 (ja) | 2017-08-02 |
Family
ID=56849618
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016040939A Expired - Fee Related JP6172644B2 (ja) | 2015-03-04 | 2016-03-03 | Dna検出方法、およびdna検出装置 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9523123B2 (ja) |
JP (1) | JP6172644B2 (ja) |
CN (1) | CN105936930A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2020198869A (ja) * | 2019-06-13 | 2020-12-17 | クレド ダイアグノスティックス バイオメディカル プライベート リミテッド | 1種類以上の蛍光シグナルをリアルタイムで検出するポリメラーゼ連鎖反応装置 |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2019006190A1 (en) | 2017-06-28 | 2019-01-03 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | SYSTEM AND METHOD FOR DROPLELET DETECTION |
US11045805B2 (en) | 2017-11-01 | 2021-06-29 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Microfluidic system and method for arranging objects |
CN108485909A (zh) * | 2018-03-21 | 2018-09-04 | 苏州锐讯生物科技有限公司 | 微流控芯片及其应用 |
WO2020178564A1 (en) * | 2019-03-01 | 2020-09-10 | Vidya Holdings Ltd | Improvements in or relating to an optical element |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2010535511A (ja) * | 2007-08-09 | 2010-11-25 | セルラ・インコーポレイテッド | 関連付け多パラメーター単一細胞測定および残留する生物学的材料の回収のための方法および装置 |
JP2013524169A (ja) * | 2010-03-25 | 2013-06-17 | クァンタライフ・インコーポレーテッド | 液滴によるアッセイ用の検出システム |
WO2014028378A2 (en) * | 2012-08-13 | 2014-02-20 | The Regents Of The University Of California | Methods and systems for detecting biological components |
JP2014509865A (ja) * | 2011-03-18 | 2014-04-24 | バイオ−ラッド・ラボラトリーズ・インコーポレーテッド | シグナルの組合せ使用による多重化デジタルアッセイ |
Family Cites Families (18)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5210015A (en) | 1990-08-06 | 1993-05-11 | Hoffman-La Roche Inc. | Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase |
DE102005037401B4 (de) * | 2005-08-08 | 2007-09-27 | MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Bildung einer Emulsion in einem fluidischen Mikrosystem |
US7816121B2 (en) * | 2006-04-18 | 2010-10-19 | Advanced Liquid Logic, Inc. | Droplet actuation system and method |
US8062903B2 (en) * | 2008-03-03 | 2011-11-22 | University Of Washington | Droplet compartmentalization for chemical separation and on-line sampling |
US8951939B2 (en) * | 2011-07-12 | 2015-02-10 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Digital assays with multiplexed detection of two or more targets in the same optical channel |
US8709762B2 (en) * | 2010-03-02 | 2014-04-29 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | System for hot-start amplification via a multiple emulsion |
US20120171683A1 (en) * | 2010-03-02 | 2012-07-05 | Ness Kevin D | Analysis of fragmented genomic dna in droplets |
US9132394B2 (en) * | 2008-09-23 | 2015-09-15 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | System for detection of spaced droplets |
US20130084572A1 (en) * | 2011-09-30 | 2013-04-04 | Quantalife, Inc. | Calibrations and controls for droplet-based assays |
WO2011120020A1 (en) * | 2010-03-25 | 2011-09-29 | Quantalife, Inc. | Droplet transport system for detection |
CA3021714C (en) * | 2009-09-02 | 2021-03-09 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | System for mixing fluids by coalescence of multiple emulsions |
CN102985552B (zh) * | 2009-11-25 | 2016-02-17 | 伯乐生命医学产品有限公司 | 用于检测遗传物质的方法和组合物 |
US10837883B2 (en) * | 2009-12-23 | 2020-11-17 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Microfluidic systems and methods for reducing the exchange of molecules between droplets |
EP3859011A1 (en) * | 2011-02-11 | 2021-08-04 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Methods for forming mixed droplets |
US8841071B2 (en) * | 2011-06-02 | 2014-09-23 | Raindance Technologies, Inc. | Sample multiplexing |
EP3216872B1 (en) * | 2011-06-02 | 2020-04-01 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Enzyme quantification |
US8658430B2 (en) * | 2011-07-20 | 2014-02-25 | Raindance Technologies, Inc. | Manipulating droplet size |
CN104198392A (zh) * | 2014-08-13 | 2014-12-10 | 中国科学技术大学 | 一种基于led的数字聚合酶链式反应pcr多窗口多路检测方法 |
-
2016
- 2016-01-28 CN CN201610059640.9A patent/CN105936930A/zh active Pending
- 2016-02-18 US US15/047,615 patent/US9523123B2/en active Active
- 2016-03-03 JP JP2016040939A patent/JP6172644B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2010535511A (ja) * | 2007-08-09 | 2010-11-25 | セルラ・インコーポレイテッド | 関連付け多パラメーター単一細胞測定および残留する生物学的材料の回収のための方法および装置 |
JP2013524169A (ja) * | 2010-03-25 | 2013-06-17 | クァンタライフ・インコーポレーテッド | 液滴によるアッセイ用の検出システム |
JP2014509865A (ja) * | 2011-03-18 | 2014-04-24 | バイオ−ラッド・ラボラトリーズ・インコーポレーテッド | シグナルの組合せ使用による多重化デジタルアッセイ |
WO2014028378A2 (en) * | 2012-08-13 | 2014-02-20 | The Regents Of The University Of California | Methods and systems for detecting biological components |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2020198869A (ja) * | 2019-06-13 | 2020-12-17 | クレド ダイアグノスティックス バイオメディカル プライベート リミテッド | 1種類以上の蛍光シグナルをリアルタイムで検出するポリメラーゼ連鎖反応装置 |
JP7162628B2 (ja) | 2019-06-13 | 2022-10-28 | クレド ダイアグノスティックス バイオメディカル プライベート リミテッド | 1種類以上の蛍光シグナルをリアルタイムで検出するポリメラーゼ連鎖反応装置 |
JP7162628B6 (ja) | 2019-06-13 | 2022-11-18 | クレド ダイアグノスティックス バイオメディカル プライベート リミテッド | 1種類以上の蛍光シグナルをリアルタイムで検出するポリメラーゼ連鎖反応装置 |
US11680291B2 (en) | 2019-06-13 | 2023-06-20 | Credo Diagnostics Biomedical Pte, Ltd. | PCR apparatus for real-time detecting of one or more fluorescent signals |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20160257992A1 (en) | 2016-09-08 |
CN105936930A (zh) | 2016-09-14 |
JP6172644B2 (ja) | 2017-08-02 |
US9523123B2 (en) | 2016-12-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6090490B2 (ja) | 複数の核酸ターゲットの解析方法 | |
JP6172644B2 (ja) | Dna検出方法、およびdna検出装置 | |
US10343167B2 (en) | Integrated microfluidic system, method and kit for performing assays | |
Cao et al. | Advances in digital polymerase chain reaction (dPCR) and its emerging biomedical applications | |
US8338166B2 (en) | Sorting, amplification, detection, and identification of nucleic acid subsequences in a complex mixture | |
JP5738597B2 (ja) | 核酸の配列決定のためのシステムおよび方法 | |
US8815576B2 (en) | Chip-based sequencing nucleic acids | |
JP6155418B2 (ja) | 多重エマルジョンの合体による、流体を混合するためのシステム | |
US20090042737A1 (en) | Methods and Devices for Correlated, Multi-Parameter Single Cell Measurements and Recovery of Remnant Biological Material | |
JP2015042182A (ja) | 核酸検出方法 | |
JP2021509024A (ja) | 多数の液滴の捕捉 | |
JP7066540B2 (ja) | デジタルpcrの測定方法および測定装置 | |
CN102311914A (zh) | 微通道、以及核酸杂交微芯片、柱、系统和方法 | |
JP6010029B2 (ja) | 蛍光粒子の検出方法 | |
JP6013339B2 (ja) | 膵液を含む生体試料中の標的粒子の検出方法 | |
US20190025183A1 (en) | Gene analysis method | |
JP5339838B2 (ja) | 遺伝子検査装置 | |
JP2022177832A (ja) | 液滴収集ユニット、液滴収集装置及び方法 | |
KR20130060914A (ko) | 유전자 분석장치 | |
Gösch | Microfluidic analysis and parallel confocal detection of single molecules | |
JP2012152182A (ja) | 核酸ハイブリダイゼーション用のマイクロ流路、マイクロチップ、カラム及び装置と核酸ハイブリダイゼーション方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20170228 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170328 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20170530 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170605 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20170620 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20170626 |
|
R151 | Written notification of patent or utility model registration |
Ref document number: 6172644 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R151 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |