CN102311914A - 微通道、以及核酸杂交微芯片、柱、系统和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种微通道、以及核酸杂交微芯片、柱、系统和方法。包含有目标核酸链的溶液能够穿过其中的微通道包括：琼脂糖凝胶载体，其具有光透射性能，支持具有互补于目标核酸链的碱基序列并固定在琼脂糖凝胶载体上的捕捉链，并且填充在微通道中；以及滤膜，当在溶液通过方向观测时，其排列在微通道中的下游侧并保留琼脂糖凝胶载体。

Description

微通道、以及核酸杂交微芯片、柱、系统和方法

技术领域

本发明涉及一种微通道，并且还涉及一种核酸杂交微芯片、柱、系统和方法。更具体地，本发明涉及一种带有琼脂糖凝胶载体的微通道，所述琼脂糖凝胶载体具有光透射性能并填充为核酸分离载体，并且还涉及如微芯片、柱、系统和方法。

背景技术

近年来，已开发了生物测定技术，其可用于分析基因的突变、多态性、表达水平、网络等，包括，例如，利用称作“DNA芯片”或“DNA微阵列”的集成基板的方法。由其上集成有蛋白质的DNA芯片或蛋白芯片表示的传感器芯片技术通过利用目标物质(靶物质)与它们相应的检测物质之间的特异性相互作用来分离和检测样品中的目标物质。

最近，已提出一种技术，以在通道或毛细管中进行目标物质与检测物质之间的相互作用。作为物质之间相互作用的应用，还提出了这样的技术，其允许在通道或毛细管中在核酸之间进行杂交反应。例如，日本专利公开号2005-130795披露了一种用于多核苷酸的分析构件，其中，待进行多核苷酸的扩增的部分，和杂交部分(其具有其上固定有检测寡核苷酸的多孔层)，经由通道彼此连接。日本专利公开号2004-121226披露了一种多核苷酸的分析方法，其将探针化合物固定在毛细管通道的内壁上并允许与测试多核苷酸进行杂交。

在允许在通道或毛细管中的物质之间进行相互作用之后，会产生以下问题：当样品溶液等通过时，通道或毛细管的内部压力会显著增加。尤其是当目标物质是核酸链时，在窄通道或毛细管中进行核酸链的杂交，使得通道或毛细管的实际体积会减小并且通道或毛细管的内部压力可能会升高。当不同于目标核酸链的核酸链被非特异性地吸附在通道或毛细管中时，会发生通道或毛细管的堵塞并且通道或毛细管的内部压力会升高。

本发明的发明人在日本专利公开号2009-268385(在下文中称作专利文献1)中提供了一种微通道系统，其可以避免通道或毛细管(其在下文中可以称作“微通道”)的堵塞并且因而可以防止内部压力的升高。该微通道系统填充有核酸分离载体，该载体包括多孔载体和捕捉链，上述捕捉链具有互补于目标核酸链并固定在多孔载体上的碱基序列(参见，专利文献1，权利要求6)。

发明内容

按照在专利文献1中披露的微通道系统，使用多孔载体(例如，灌注层析颗粒)作为核酸分离载体使得可以防止通道的内部压力的升高，从而在高流速下使溶液通过。

虽然依赖于荧光物质，在光学检测目标核酸链以后，使激发光照射在荧光物质上，并从荧光物质发射荧光。然而，如果载体不具有光透射性能，则这些激发光和荧光被多孔载体会阻挡、反射或散射。当激发光和荧光被载体阻挡时，则不能获得足够的荧光检测强度，从而导致目标核酸链的检测精度的降低。另一方面，当激发光和荧光被载体反射或散射时，在检测荧光时，背景噪声会变得更高并且动态量程(动态范围，dynamic range)会变得更小，因而会降低目标核酸链的检测精度。

因此期望提供一种技术，其在填充有核酸分离载体的微通道中可以防止激发光和荧光的阻挡、反射或散射(其在没有光透射性能的载体的情况下会发生)，并且可以以高精度进行目标核酸链的光学检测。

根据本发明的实施方式，提供了一种其中包含有目标核酸链的溶液能够穿过的微通道，该微通道包括：

琼脂糖凝胶载体，该载体具有光透射性能，支持具有互补于目标核酸链的碱基序列并固定在琼脂糖凝胶载体上的捕捉链，并填充在微通道中，以及

滤膜(filter)，当在溶液的通过方向观测时所述滤膜排列在微通道中的下游侧并保留琼脂糖凝胶载体。

借助于微通道，可以抑制激发光和荧光的阻挡、反射或散射，这是因为具有光透射性能的琼脂糖凝胶载体填充为核酸分离载体。另外，可以以非片段化状态使目标核酸链与捕捉链接触，这是因为当在溶液的通过方向观测时，用于保留琼脂糖凝胶载体的滤膜仅被排列在下游侧。

根据本发明的其它实施方式，还提供了一种核酸杂交微芯片和柱，各自包括：

形成在微芯片或柱中的上述微通道，

用于将溶液引入到微通道中的进口(入口)，以及

用于从微通道中排出溶液的出口。

根据本发明的另外的实施方式，还提供了一种核酸杂交系统，该系统包括：

上述微芯片，以及

以下中的至少一种：加热单元，用于加热待通过进口引入的溶液；以及温度控制单元，用于控制微通道中的温度。

根据本发明的又一种实施方式，还提供了一种核酸杂交方法，该方法包括：

使包含目标核酸链的溶液沿着添加琼脂糖的液相穿过微通道，其中具有光透射性能的琼脂糖凝胶载体支持具有互补于目标核酸链的碱基序列并固定在琼脂糖凝胶载体上的捕捉链，并以琼脂糖凝胶载体被当在溶液的通过方向观测时排列在微通道中的琼脂糖凝胶载体的下游侧的滤膜保留的状态填充。

核酸杂交方法可以抑制激发光和荧光的阻挡、反射或散射，这是因为具有光透射性能的琼脂糖凝胶载体被用作核酸分离载体。另外，可以以非片段化状态使目标核酸链与捕捉链接触，这是因为当在溶液的通过方向观测时用于保留琼脂糖凝胶载体的滤膜仅被排列在下游侧上。此外，添加琼脂糖的液相的使用可以和缓地将琼脂糖凝胶载体本身粘着在一起以稳定琼脂糖凝胶载体。

根据本发明的实施方式的微通道可以防止激发光和荧光的阻挡、反射或散射(其在没有光透射性能的载体的情况下会发生)，并且可以以高精度进行目标核酸链的光学检测。

附图说明

图1A和1B是示出了其上形成有根据本发明的第一实施方式的微通道的根据本发明的第二实施方式的核酸杂交微芯片的结构的示意图，其中图1A是顶部俯视图而图1B是在图1A的箭头P-P方向获取的剖视图；

图2是示出了物质固定在作为琼脂糖凝胶载体的琼脂糖凝胶珠之一的表面上的状态的示意图；

图3是示出了根据本发明的第四实施方式的核酸杂交方法的程序的流程图；

图4A至图4C是示出了在根据本发明的第四实施方式的核酸杂交方法的各个步骤中物质结合在琼脂糖凝胶珠的表面上的状态的示意图；

图5是示出了根据本发明的第三实施方式的核酸杂交系统的结构的示意图；

图6是示出了可见光通过在玻璃基板上聚集为层的琼脂糖凝胶微珠和聚苯乙烯微珠的透射谱的测量结果的谱图(测试1)；

图7是示出了可见光通过填充在形成在丙烯酸酯微芯片上的通道中的琼脂糖凝胶微珠和聚苯乙烯微珠的透射谱的测量结果的谱图(测试1)；

图8是示出了在使溶液通过滤膜前后，在核酸溶液中RNA链的碱基长度分布的测量结果的层析谱；以及

图9是示出了在核酸杂交的各个步骤中荧光测量的结果的谱图(测试3)。

具体实施方式

在下文中，将描述用于实施本发明的优选实施方式。应当注意，下文描述的实施方式仅是本发明的代表性实施例的实例，并且绝不应解释为限制本发明的范围。现在将按照以下顺序进行描述：

1.微通道、以及核酸杂交微芯片

(1)核酸杂交微芯片

(2)琼脂糖凝胶载体

2.核酸杂交方法

(1)调节

(2)使目标核酸链通过，接着洗涤

(3)使检测链通过，接着洗涤

(4)检测

3.核酸杂交系统

1.微通道、以及核酸杂交微芯片

(1)核酸杂交微芯片

参照图1A和图1B，将描述其上形成有根据本发明的第一实施方式的微通道的根据本发明的第二实施方式的核酸杂交微芯片的结构。

在图1A和图1B中，在以数字1标示的核酸杂交微芯片(在下文中称为“微芯片”)中形成以数字11标示的微通道，包含目标核酸链的溶液(在下文中称为“样品溶液”)通过上述微通道。以数字111标示的是用于样品溶液进入微通道11的进口。以数字112标示的是用于使样品溶液离开微通道11的出口。通过进口111引入的样品溶液流过微通道11，并通过出口112排出。

填充在微通道11中的是琼脂糖凝胶载体2，作为用于分离目标核酸链的核酸分离载体。当在样品溶液的通过方向观测时，滤膜113被排列在琼脂糖凝胶载体(琼脂糖凝胶珠)2的下游侧。滤膜113设置有在其中形成的孔，并且这些孔以一定的孔径尺寸形成，使得允许样品溶液和目标核酸链以及样品溶液中的物质如盐和表面活性剂通过，但不允许琼脂糖凝胶载体2通过。因此，滤膜113保留填充在微通道11中的琼脂糖凝胶载体2，并防止琼脂糖凝胶载体2与样品溶液一起被排出，其中上述样品溶液流过微通道11，通过出口112。可以根据需要来确定滤膜113的孔径尺寸，这取决于琼脂糖凝胶载体2的尺寸，但可以例如设定为0.5至20μm左右，其中10μm左右是更优选的。

当在样品溶液的通过方向观测时，滤膜113仅排列在填充在微通道11中的琼脂糖凝胶载体2的下游侧，并不排列在琼脂糖凝胶载体2的上游侧。如果另一个滤膜被排列在上游侧，则可以更稳定地将琼脂糖凝胶载体2保留在微通道11中。然而，会产生以下潜在的问题：在通过滤膜以后，包含在样品溶液中的目标核酸链可以被切成片段(参见下文随后待描述的测试2)。在它们与琼脂糖凝胶载体2接触以前，目标核酸链的片段化导致与固定在琼脂糖凝胶载体2上的捕捉链的杂交反应的效率的降低。

已通过将其上形成有微通道11的基板层1b和另一基板层1a(通过其形成进口111和出口112)结合在一起来构造微芯片1。作为基板层1a和1b的材料，选择具有光透射性能的材料，以用于目标核酸链的光学检测。例如，可以使用玻璃和各种塑料(PP、PC、COP、PDMS)。作为基板层1a和1b的材料，期望选择具有更小光学误差的材料，用于其低的自发荧光和小的波长依赖性色散。

可以通过玻璃制造的基板层的湿式蚀刻或干式蚀刻或塑料制造的基板层的纳米印刷或注射模塑以及切割加工，来在基板1b上形成微通道11以及形成通过基板1a的进口111和出口112。通过将基板层1a和1b与其上形成和通过其形成的微通道11和进口111和出口112粘合在一起，可以形成微芯片1。可以通过已知方法如熔融粘合、粘合剂、阳极粘合、利用自粘片进行的粘合、等离子体活化粘接、超声波粘合等，来进行基板层的粘合。应当注意，本文通过采取微芯片1设置有一个微通道11的情况作为实例进行描述，但微芯片1可以设置有两个或更多个微通道11。

(2)琼脂糖凝胶载体

参照图2，将描述在作为琼脂糖凝胶载体的琼脂糖凝胶珠2之一的表面上的物质的固定状态。

在琼脂糖凝胶载体(在下文中称为“琼脂糖凝胶珠”)2的表面上，固定捕捉链21以捕捉珠上的目标核酸链。应当注意，实际上将多个捕捉链21固定在每个琼脂糖凝胶珠上，但为了简化描述，在图2中仅示出多个捕捉链21中的一个(这同样将适用于随后的描述)。捕捉链21具有互补于目标核酸链的碱基序列，并且可以与目标核酸链相互作用以形成双链(杂交体)。在本发明中，除DNA和RNA链以外，这样的目标核酸链还可以是通过在它们的核糖部分修饰这样的核酸链的结构所获得的核酸类似物的链(例如，LNA(锁核酸))。作为捕捉链21，根据需要，可以使用那些选自DNA链、RNA链、核酸类似物链等的捕捉链，这取决于目标核酸链的种类。

对于每种捕捉链21的碱基序列的长度(碱基数目)并没有特别的限制，只要它具有互补于目标核酸链的至少一部分的碱基序列的碱基序列，并因此与目标核酸链相互作用以形成双链。捕捉链21的碱基数目通常可以为几个碱基至数百碱基，优选10个碱基至100个碱基左右，更优选15至30个碱基左右。另外，捕捉链21并不需要具有完全互补于目标核酸链的碱基序列的碱基序列，并且可以在它的碱基序列中包括一个或多个错配碱基(非互补碱基)，只要它可以与目标核酸链形成双链。可以优选设计捕捉链21的碱基序列，使得与目标核酸链的解离温度(Tm)具有与每种检测链(其随后将在下文描述)与目标核酸链之间的解离温度类似的水平。

可以通过已知方法，例如，通过亲和素-生物素结合或通过偶合反应(重氮偶合反应等)，将捕捉链21固定在琼脂糖凝胶珠2的表面上。为了使用亲和素-生物素结合，将链霉亲合素固定在琼脂糖凝胶珠2的表面上，并通过亲和素和生物素之间的结合来固定在其一端用生物素修饰的捕捉链21。作为另外的替换方式，捕捉链21的固定可以采用由本发明的发明人在专利文献1中所披露的离子交换结合方法。

上面的描述是采取根据本发明的第一实施方式的微通道实施为核酸杂交微芯片的情况作为实例。根据本发明的第一实施方式的微通道还可以实施为如在专利文献1中所披露的核酸杂交柱。

2.核酸杂交方法

接着参照图3的流程图，将描述根据本发明的第四实施方式的核酸杂交方法的程序。此外参照图4A至图4C，将描述在根据本发明的第四实施方式的核酸杂交方法的各个步骤中，在琼脂糖凝胶珠2的表面上的物质的结合状态。

(1)调节

在图3的步骤S1中，通过进口111引入杂交反应缓冲液，然后允许流过微通道11以进行琼脂糖凝胶珠2的调节。进行该调节以更换微通道11中的液体以及对微通道11进行除气。在步骤S1中捕捉链21固定在每个琼脂糖珠2的表面上的状态示在图4A中。

(2)使目标核酸链通过，接着洗涤

在图3的步骤S2中，通过进口111引入样品溶液，然后允许流过微通道11。在该步骤中，具有互补于目标核酸链的碱基序列的捕捉链21与目标核酸链形成双链，使得目标核酸链被捕捉在琼脂糖凝胶珠2的表面上。

在步骤S2以后，在琼脂糖凝胶珠2的表面上物质的结合状态示在图4B中。在该图中，字母T表示包含在样品溶液中的目标核酸链，而字母N表示不同于目标核酸链的核酸链(非目标核酸链)。

可以优选通过使用在步骤S1中采用的杂交反应缓冲液作为液相，更优选通过使用其中添加有琼脂糖的缓冲液作为液相，来进行样品溶液的引入。添加琼脂糖的液相的使用可以和缓地将微通道11中的琼脂糖凝胶珠2粘着在一起，因此可以稳定它们。在液相中琼脂糖的含量可以优选为0.02至0.2％左右，其中0.05％左右是更优选的。添加琼脂糖的液相还可以用于根据本发明的第四实施方式的核酸杂交方法的各个步骤中。

通过调节杂交反应缓冲液的组成(例如，盐和表面活性剂的浓度)以及在微通道11中的温度，在适当的杂交体形成条件下，进行捕捉链21和目标核酸链的杂交反应。为了抑制目标核酸链的自杂交，有效的是，在预先加热样品溶液以后，将样品溶液引入到微通道11中。另一方面，为了抑制目标核酸链非特异性地吸附在捕捉链21上，有效的是，在允许样品溶液流过以后，加热微通道11的内部。

在允许样品溶液流过以后，通过进口111引入洗涤溶液，然后允许流过微通道11以洗涤琼脂糖凝胶珠2。在保持在捕捉链21和目标核酸链之间形成的杂交体的条件下进行该洗涤，以从微通道11的内部除去非目标核酸链和已非特异性地吸附在捕捉链21上的目标核酸链。

(3)使检测链通过，接着洗涤

在图3的步骤S3中，随后通过进口111将用来检测被捕捉在琼脂糖凝胶珠2表面上的目标核酸链的检测链引入到微通道11中。在该步骤中，每种具有互补于目标核酸链的碱基序列的检测链和目标核酸链形成双链，使得形成捕捉链21-目标核酸链-检测链的夹心杂交体。应当注意，该步骤可以与上述步骤2同时进行。

类似于捕捉链21，检测链具有互补于目标核酸链的碱基序列，并与目标核酸链相互作用以形成双链。取决于目标核酸链的种类，根据需要，检测链还可以选自DNA链、RNA链、核酸类似物链等，并且可以使用。对于每种检测链的碱基序列的长度(碱基数目)并没有特别限制，只要它具有互补于至少目标核酸链的一部分的碱基序列的碱基序列，并因此可以与目标核酸链相互作用以形成双链。检测链还类似于捕捉链21，因为检测链并不需要具有完全互补于目标核酸链的碱基序列的碱基序列并且在它的碱基序列中可以包括一个或多个错配碱基(非互补碱基)，只要它可以与目标核酸链形成双链。可以优选设计检测链的碱基序列，使得与目标核酸链的解离温度(Tm)具有与捕捉链21和目标核酸链之间的解离温度类似的水平。

每种检测链标记有标记L如荧光物质、化学发光物质或放射性物质。在接着描述的步骤S4中，优选通过感测产生自标记L的荧光、发射或辐射来进行目标核酸链的检测。

在步骤S3以后，在琼脂糖凝胶珠2表面上物质的结合状态示在图4C中。在该图中，字母D表示检测链。当检测链D的溶液通过微通道11时，检测链D进一步杂交于每种目标核酸链T，其已与捕捉链21形成杂交体。因此，目标核酸链T与捕捉链21和检测链D形成杂交体，从而形成夹心杂交体(双杂交体)。

通过调节杂交反应缓冲液的组成(例如，盐和表面活性剂的浓度)以及微通道11中的温度，在适当的杂交体形成条件下，进行检测链和目标核酸链的杂交反应。另一方面，为了抑制检测链非特异性地吸附在目标核酸链上，有效的是，在允许检测链溶液流过以后加热微通道11的内部。

在允许检测链溶液流过以后，通过进口111引入洗涤溶液，然后允许流过微通道11以洗涤琼脂糖凝胶珠2。在保持在检测链和目标核酸链之间形成的杂交体的条件下进行该洗涤，以从微通道11的内部除去已非特异性地吸附在目标核酸链上的检测链。

(4)检测

在图3的步骤S4中，通过感测产生自标记在检测链上的标记的荧光、发射或辐射来检测被捕捉在琼脂糖凝胶珠2的表面上的目标核酸链。具体地说，当例如用荧光物质标记检测链时，将激发光照射在琼脂糖凝胶珠2上，并感测产生自激发荧光物质的荧光。荧光的强度等的测量使得可以基于荧光的强度等来定量地检测目标核酸链。

在本发明中，具有光透射性能的琼脂糖凝胶珠2被用作核酸分离载体。利用琼脂糖凝胶珠2，在照射激发光以后，激发光不会被上述珠阻挡、反射或散射。在其中填充有琼脂糖凝胶珠2的微通道11中，激发光可以达到一定深度，并产生强烈荧光。另外，可以减少来自激发光的返回光，从而使得可以设置光检测器的较宽的动态量程(动态范围)。此外，利用琼脂糖凝胶珠2，产生自荧光物质的荧光不会被载体阻挡、反射或散射。因此，可以避免所检测荧光强度的衰减或背景噪声的增加，由于通过载体阻挡激发光和荧光其以其他方式发生，从而可以以高灵敏度和高精度检测目标核酸链。

3.核酸杂交系统

参照图5，将描述根据本发明的第三实施方式的核酸杂交系统的结构。

该核酸杂交系统设置有：微芯片1；加热块(加热片，heat block)103，用于控制微芯片1的微通道11中的温度；供料装置，用于通过微芯片1的进口111供给溶液以及通过微芯片1的出口112排出溶液；以及光学检测装置，用于将激发光照射在填充在微芯片1的微通道11中的琼脂糖凝胶珠2上并检测产生的荧光。

加热块103作为温度控制单元，用于加热或冷却微芯片1的微通道11的内部。为了在上述步骤S2中抑制目标核酸链非特异性地吸附在捕捉链21上，在通过样品溶液以后，加热块103加热微通道11的内部。为了在上述步骤S3中抑制检测链非特异性地吸附在目标核酸链上，在通过检测链溶液以后加热块103还加热微通道11的内部。加热块103可以是常用加热器，其可替换为Peltier装置、Joule-Thomson装置等。加热块103的温度可以例如设定为60℃。

供料装置可以包括常用泵或注射泵、管、阀等。供料装置包括作为加热单元的管线加热器102，用于加热通过进口111引入的样品溶液。为了在上述步骤S2中抑制目标核酸链的自杂交，管线加热器102使得可以在预先加热以后将样品溶液引入到微通道11中。当在管线加热器102中加热(热变性)以后将样品溶液供给到微通道11中的琼脂糖凝胶珠2的填充区时，可以通过骤冷样品溶液来抑制目标核酸链的自杂交。管线加热器102的温度可以例如设定为95℃。

光学检测装置可以包括：激发光源；照射系统，包括聚光透镜、二向色镜、带通滤光器(滤波器)等，用于将激发光聚集和照射到填充在微通道11中的琼脂糖凝胶珠2上；以及检测系统，用于通过激发光的照射来检测产生自标记在检测链上的荧光物质的荧光。检测系统可以包括例如PMT(光电倍增管)，面积图像传感器如CCD或CMOS器件等。应当注意，在图5中仅示出聚光透镜101作为光学检测装置。还应当注意，可以分别将照射系统和检测系统排列在不同的光路中，虽然在图5中，沿着相同的光路来排列照射系统和检测系统。

测试1

1.琼脂糖凝胶微珠的光透射性能的评价

比较了商购的结合有链霉亲合素的聚苯乙烯微珠(“STREPTAVIDINCOATED MICROSPHERE PLAIN”，商品名称；Polysciences，Inc.的产品)和商购的结合有链霉亲合素的琼脂糖凝胶微珠(“STREPTAVIDINAGAROSE RESIN”，商品名称；Pierce Protein Research Products，Inc.的产品)的光透射性能。将各个类型的珠的悬浮液分别滴在玻璃制造的基板上以使它们处于聚集为层的状态，并且测量它们的可见光透射谱。

透射谱的测量结果示在图6中。与聚苯乙烯微珠的大约40％透射率相比，琼脂糖凝胶微珠显示出接近100％的透射率。

在将各个类型的珠填充在形成在丙烯酸酯微芯片中的通道(截面高度：0.3mm，截面宽度：0.5mm，通道长度：2mm)中的情况下，接着测量可见光透射谱。将可见光垂直照射在每个微芯片上以将珠暴露于通道中的可见光。

透射谱的测量结果示在图7中。通过其中填充有聚苯乙烯微珠的通道的透射率低于5％。相反，通过其中填充有琼脂糖凝胶微珠的通道可以获得高达80％左右的透射率。

根据该测试的结果，表明，琼脂糖凝胶微珠具有高的光透射性能，并且利用它们填充在其中的通道，可以抑制光的阻挡、反射或散射。

测试2

2.滤膜的排列位置和核酸链的片段化的评价

在其中填充有琼脂糖凝胶微珠并在测试1中制备的丙烯酸酯微芯片的通道中，排列孔径尺寸为5μm的滤膜。该通道设置有通道切换阀和注射泵。

从HeLa细胞提取总RNA以制备核酸溶液。利用注射泵，将核酸溶液供入到通道中，并回收穿过滤膜的核酸溶液。利用生物分析仪(由AgilentTechnologies，Inc.制造)，使核酸溶液经受电泳以测量在核酸溶液中RNA链的碱基长度分布。

碱基长度分布的测量结果示在图8中。应当明了，与穿过并发生RNA的片段化以前的核酸溶液相比，在穿过通道以后的核酸溶液的情况下，两个峰归因于降低的核糖体RNA。这些结果表明，如果滤膜排列在杂交反应场的上游侧，则在它们穿过滤膜以后，核酸链将被切成片段，并且杂交效率会降低。

测试3

3.核酸的杂交

(1)目标核酸链、捕捉链以及检测链的合成

合成为目标核酸链的是DNA，其碱基序列被随机确定。目标核酸链的碱基序列示在表1中。还合成了捕捉链，其具有互补于目标核酸链的5’-端部分的碱基序列的碱基序列；以及检测链，其具有互补于目标核酸链的3’-端部分的碱基序列的碱基序列(参见表1)。在其3’-端生物素化每种捕捉链。另外，在其5’-端用荧光染料(Cy3)标记每个检测链。

如后面在下文将描述的，在氯化钠的0.3M水溶液中捕捉链和检测链的解离温度(Tm)均计算为73℃。

表1

(2)样品溶液的制备

制备目标核酸链和检测链的100μM水溶液。将目标核酸链溶液(20μL)和检测链溶液(20μL)混合在一起。向所得的混合物中添加氯化钠的0.3M水溶液(310μL)，其包含0.05％琼脂糖和0.2％十二烷基硫酸钠(SDS)，接着混合成样品溶液。

(3)捕捉链固定在琼脂糖凝胶珠上

提供链霉亲合素固定在其上的琼脂糖凝胶珠(“STREPTAVIDINAGAROSE RESIN”，商品名称；Thermo Fisher Scientific Inc.的产品)的悬浮液。向琼脂糖凝胶珠的悬浮液(200μL)中添加捕捉链的100μM水溶液(50μL)。接着悬浮液。随后，进一步添加蒸馏水(250μL)，并搅拌所得的混合物。

(4)核酸杂交微芯片的制备

在形成在玻璃制造的微芯片中的通道(截面高度：0.5mm，截面宽度：0.5mm，通道长度：60mm)中，布置孔径尺寸为10μm的滤膜。将琼脂糖凝胶珠倒入通道中，并填充在其中。在通道中填充有琼脂糖凝胶珠的区域长度设定为30mm左右。通道设置有通道切换阀和注射泵。

(5)核酸杂交系统的结构

将保持为60℃的管线加热器排列在微芯片的通道与通道切换阀之间。将微芯片放置在保持为60℃的加热块上。

提供绿色LED光源，并连同Cy3激发滤膜一起，用作Cy3的激发光源。提供分光镜，并连同Cy3荧光滤膜一起，用作Cy3的荧光检测器。提供由两根同轴捆在一起的光纤形成的光纤电缆，将用于接收光的光纤连接至激发光源，并且将光接收光纤连接至荧光检测器。将排列在光纤电缆前导端(前端)的物镜相对通道中的琼脂糖凝胶珠设置。结果，构造了一种光学系统以将激发光照射到填充在通道中的琼脂糖凝胶珠上并检测所得的荧光。激发光的照射光斑直径设定为500μm。

(6)测量

管线加热器和加热块均设定为60℃。将杂交溶液(0.3M氯化钠溶液，其包含0.05％琼脂糖和0.2％SDS)供入到通道中以调节琼脂糖凝胶珠，然后进行荧光测量。进料速度设定为50μL/分钟。当观测通道时，观测到在琼脂糖凝胶珠之间的粘着，并且琼脂糖凝胶珠被稳定地保留在通道中。

供给样品溶液(350μL)以进行在捕捉链、目标核酸链以及检测链之间的夹心杂交。供给洗涤溶液(0.3M氯化钠溶液，其包含0.05％琼脂糖和0.2％SDS；1.5mL)，然后进行荧光测量。进料速度设定为50μL/分钟。

然后将管线加热器和加热块的温度设置分别升高至95℃和80℃。代替液相，供给纯化水(2.4mL)以解离(变性)杂交体。在变性操作以后，进行荧光测量。

在调节(A)以后、在供给样品溶液和洗涤溶液(B)以后、以及在变性操作以后的荧光测量结果示在图9中。因为与调节(A)以后的荧光强度相比，在供给样品溶液和洗涤溶液(B)以后荧光强度增加，所以证实了在捕捉链、目标核酸链以及检测链之间夹心杂交体的形成。此外，在变性操作(C)以后，荧光强度降低。因此，还已证实了，上述荧光强度的增加归因于在捕捉链、目标核酸链以及检测链之间的特异性杂交，但并不归因于任何非特异性吸附。

在相关领域中，核酸分离载体会引起激发光和荧光的阻挡、反射或散射。按照根据本发明的微通道等，可以防止激发光和荧光的阻挡、反射或散射，因而可以以高精度进行目标核酸链的光学检测。因此，本发明可以有助于核酸的分离操作和杂交反应操作的准确度的改善。

本申请包含了涉及于2010年7月7日在日本专利局提交的日本优先权专利申请JP 2010-154678中披露的主题，将其全部内容结合于本文中作为参考。

本领域的技术人员应当理解，根据设计要求和其他因素，可以进行各种修改、组合、子组合以及变型，只要它们在所附权利要求或其等同物的范围之内。

Claims (7)

1.一种微通道，包含有目标核酸链的溶液能够穿过所述微通道，所述微通道包括：

琼脂糖凝胶载体，所述琼脂糖凝胶载体具有光透射性能，支持具有互补于所述目标核酸链的碱基序列并固定在所述琼脂糖凝胶载体上的捕捉链，并且填充在所述微通道中；以及

滤膜，当在所述溶液的通过方向观测时，所述滤膜被排列在所述微通道中的下游侧并保留所述琼脂糖凝胶载体。

2.根据权利要求1所述的微通道，其中，所述滤膜设置有在其中形成的孔。

3.根据权利要求2所述的微通道，其中，所述孔以一定的孔径尺寸形成，使得允许样品溶液和目标核酸链以及样品溶液中的物质通过，但不允许所述琼脂糖凝胶载体通过。

4.一种核酸杂交微芯片，包括：

微通道，形成在所述微芯片中；

进口，用于将溶液引入到所述微通道中；以及

出口，用于从所述微通道中排出所述溶液，

包含有目标核酸链的溶液能够穿过其中的所述微通道包括：

琼脂糖凝胶载体，所述琼脂糖凝胶载体具有光透射性能，支持具有互补于所述目标核酸链的碱基序列并固定在所述琼脂糖凝胶载体上的捕捉链，并且填充在所述微通道中，以及

滤膜，当在所述溶液的通过方向观测时，所述滤膜被排列在所述微通道中的下游侧并保留所述琼脂糖凝胶载体。

5.一种核酸杂交系统，包括：

核酸杂交微芯片；以及

用于加热通过进口引入的溶液的加热单元和用于控制微通道中的温度的温度控制单元中的至少一种，

所述核酸杂交微芯片包括：

微通道，形成在所述微芯片中，

进口，用于将所述溶液引入到所述微通道中，以及

出口，用于从所述微通道中排出所述溶液，并且

包含有目标核酸链的溶液能够穿过其中的所述微通道包括：

琼脂糖凝胶载体，所述琼脂糖凝胶载体具有光透射性能，

支持具有互补于所述目标核酸链的碱基序列并固定在所述琼脂糖凝胶载体上的捕捉链，并且填充在所述微通道中，以及

滤膜，当在所述溶液的通过方向观测时，所述滤膜被排列在所述微通道中的下游侧并保留所述琼脂糖凝胶载体。

6.一种核酸杂交方法，包括：

使包含目标核酸链的溶液沿着添加有琼脂糖的液相穿过微通道，在所述微通道中，具有光透射性能的琼脂糖凝胶载体支持具有互补于所述目标核酸链的碱基序列并固定在所述琼脂糖凝胶载体上的捕捉链，并且以所述琼脂糖凝胶载体被一滤膜保留的状态填充，当在所述溶液的通过方向观测时，所述滤膜被排列在所述微通道中的下游侧。

7.一种核酸杂交柱，包括：

微通道，形成在所述柱中，

进口，用于将溶液引入到所述微通道中，以及出口，用于从所述微通道中排出所述溶液，包含有目标核酸链的溶液能够穿过其中的所述微通道包括：

琼脂糖凝胶载体，所述琼脂糖凝胶载体具有光透射性能，支持具有互补于所述目标核酸链的碱基序列并固定在所述琼脂糖凝胶载体上的捕捉链，并且填充在所述微通道中，以及

滤膜，当在所述溶液的通过方向观测时，所述滤膜被排列在所述微通道中的下游侧并保留所述琼脂糖凝胶载体。

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