JP6090490B2 - 複数の核酸ターゲットの解析方法 - Google Patents

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Description

本開示は、核酸ターゲットを解析する方法に関する。
これを実現するための基本技術としては、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）と呼ばれる技術を用いて、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸中の所望の核酸ターゲットを、検出に必要な量となるまで増幅させ、検出する方法が一般的である。また、その発展型としてｑＰＣＲ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ）と呼ばれる定量解析技術が用いられることが一般的である。これら核酸ターゲットの定量解析技術がマイクロ流路チップ内の小型リアクタなどに導入される。
特許文献１には、遺伝子を定量解析するｑＰＣＲについての基本的な実現方法が開示されている。この特許文献１には、一本鎖のＤＮＡからなるサンプルに対して、ターゲットＤＮＡの配列鎖の第一の領域に相補的な配列をもつオリゴヌクレオチド（長さの短いＤＮＡ／ＲＮＡの配列）と、同じターゲットＤＮＡの配列鎖の第二の領域に相補的な配列を含む標識オリゴヌクレオチドを接触させて、ハイブリダイゼーションを生じさせる条件で二本鎖複合体の混合物を形成して、５‘→３’ヌクレアーゼ活性によって、アニールした標識オリゴヌクレオチドを切断して標識断片を遊離させ、その遊離した標識断片を検出する方法が開示されている。標識オリゴヌクレオチドの標識断片として、蛍光色素と消光剤を用いれば、標識断片が遊離した際に初めて蛍光が発光するため、上記プロセスを繰り返すことで、蛍光強度が強くなっていく。一般的には、ハイブリダイゼーションを生じさせる条件や、ヌクレアーゼ活性を生じさせる条件などは、一定の温度条件に検体をさらすことによって実現される。つまり、上記プロセスを繰り返すということは、検体に対して、所定の温度の上げ下げ（温度サイクル）を繰り返すということである。この蛍光強度の強さを光検出器によって検出し、上記プロセスの繰り返し回数（温度サイクルの回数）と蛍光強度の強さの関係を調べることで、ターゲットＤＮＡの所望の配列鎖がどの程度含まれていたかを解析することが可能となる。一検体あたり複数部位のターゲットを検出する場合は、それぞれの配列鎖に相補的な標識オリゴヌクレオチドを準備し、標識となる蛍光色素の材料、波長をそれぞれの標識オリゴヌクレオチド毎に異ならしめることで、光検出器において蛍光波長の差で、分離解析することが可能となる。
また、特許文献２には、遺伝子を定量解析する手法についての実現方法の一例が開示されている。特に乳化技術を使ったハイスループットアッセイの改善技術についての開示がなされている。乳化技術を使って、生化学反応用の独立した反応チャンバとして機能する液滴を作り出し、それらを用いて個々のサブコンポーネント（細胞や核酸、タンパク質など）を処理し、検査する手法である。
ＤＮＡ／ＲＮＡなどからなる水滴を油中に懸濁させて、油の中に水が入っている状態の乳剤を作ることができる。この乳剤を界面活性剤によって安定化させて、加熱、冷却や、輸送中の液滴の結合を減らすか、または無くすことができ、それによって、ＰＣＲ技術などで行われる温度サイクリングを実施することができる。このため、ＰＣＲを利用した液滴中の核酸標的分子の単一コピー増幅は、乳剤を使用して実施している。これら液滴の内、ある標的に対して陽性である液滴をポアソン統計に基づいて解析して、試料中の標的の濃度を推定することができる。液滴によるアッセイでは、液滴中の標識として１種または複数種の蛍光体を用いて、増幅などの反応が起こったかどうかがわかる。液滴を生成し、反応させ、ついで各液滴からの放出光を測定することで液滴中に標的が存在するかどうかを判断しうる。区別可能な異なる蛍光体を、それぞれ異なる標的毎に対応させれば、複数の異なる標的が存在するかどうかを液滴毎に測定できる。このように複数の異なる標的を区別する場合、複数種の蛍光体、つまり波長の異なる蛍光を発する色素材料を用いて、その蛍光波長によって区別する手法を用いることが一般的である。特許文献２においては、２種類の蛍光色素を用いて、それぞれを区別して検出する方法が開示されている。第１の色素、第２の色素の各々に対応する検出構成（光源と検出器からなる）を設けて、液滴が流路の検出領域を通過するときに第１の色素に対応する検出構成と、第２の色素に対応する検出構成で交互に液滴を検出することによって実現している。
特許第２８２５９７６号公報 特表２０１３−５２４１６９号公報
しかしながら従来の構成では、ＤＮＡ／ＲＮＡなどの核酸のうち、目標とする複数の核酸ターゲットを同時検出する場合、それぞれの核酸ターゲットの塩基配列と相補的な塩基配列を有するプライマ、プローブなどの反応薬液を準備し、プライマやプローブなどを修飾する蛍光色素を、それぞれの核酸ターゲット毎に変更することで、分離検出することが必要となる。また、それぞれの蛍光色素を励起するための光源や、それぞれの蛍光色素の蛍光波長を検出するための光学系が必要となる。同時検出する核酸ターゲットの種類が増えるにしたがって、対応する蛍光色素の準備や、蛍光を検出する光学系が複雑になる課題を有している。
本開示は、同時検出する核酸ターゲットの種類が増えた場合でも、蛍光を検出する光学系が複雑になることなく、小型、安価な構成による複数の核酸ターゲットを解析する方法を提供することを目的とする。
本開示に係るマイクロ流路チップを用いて、第１の核酸ターゲットおよび第２の核酸ターゲットを検出する検出方法は、
（ａ）検出装置にマイクロ流路チップチップを設置し、
前記検出装置は、
ＰＣＲ処理部と、ＰＣＲリアクタと、蛍光検出部と、検出回路とを備え、
前記マイクロ流路チップは、
第１の流路と、第２の流路と、第３の流路と、第４の流路と、第５の流路とを備え、
前記第４の流路に、前記第１の流路の一端と、前記第２の流路の一端と、前記第３の流路の一端とが接続され、
前記ＰＣＲリアクタは、前記第４の流路及び前記第５の流路の間に位置し、
（ｂ）（ｉ）前記第１の流路の他端から、第１の水溶液、第１のオイル、および第２の水溶液を、この順で供給し、（ｉｉ）前記第２の供給流路の他端から、サンプル水溶液が供給し、および（ｉｉｉ）前記第３の供給流路の他端から、第２のオイルを供給することにより、前記第４の流路に、前記第１の水溶液および前記サンプル水溶液からなる第１の液滴と、前記サンプル水溶液からなる第２の液滴と、前記第２の水溶液および前記サンプル水溶液からなる第３の液滴と、前記サンプル水溶液からなる第４の液滴とを、この順に通過させ、
ここで、前記第１の水溶液は、前記第１の核酸ターゲットと相補的な配列を有する第１のＤＮＡを有し、前記第１のＤＮＡは第１の蛍光色素で修飾され、前記第２の水溶液は、前記第２の核酸ターゲットと相補的な配列を有する第２のＤＮＡを有し、前記第２のＤＮＡは第２の蛍光色素で修飾され、
（ｃ）前記第４の流路を通過して前記ＰＣＲリアクタに到達した前記第１の液滴から前記第４の液滴を、前記ＰＣＲ処理部によりＰＣＲ処理し、前記第５の流路に前記ＰＣＲ処理された前記第１の液滴から前記第４の液滴を通過させ、
（ｄ）前記第１の液滴から第４の液滴が前記第５の流路を流れているときに、前記蛍光検出部により、前記第１の液滴から前記第４の液滴から出力される蛍光強度を検出し、
（ｅ）前記蛍光強度に基づいて、前記第５の流路の流路を流れる前記第１の液滴から前記第４の液滴までのそれぞれの間の境界を取得し、
（ｆ）前記検出回路により、前記蛍光強度と、前記第１の液滴から前記第４の液滴までのそれぞれの間の境界とに基づいて、第１の閾値以上の蛍光強度を有する前記第２の液滴及び前記第４の液滴の数を取得し、かつ、前記第２の液滴及び前記第４の液滴の数に基づいて、前記サンプル水溶液に、前記第１の核酸ターゲット及び前記第２の核酸ターゲットからなる群から選択される少なくとも１つが含まれているか否かを検出する。
本開示の複数の核酸ターゲットの解析方法によれば、同時検出する核酸ターゲットが増えた場合でも、マイクロ流路チップの流路構成を複雑にすることなく、また、核酸ターゲットと一対一に反応する反応薬液を修飾する蛍光色素を同一波長のものを使用することができるため、蛍光を検出する光導波手段が簡単な構成で実現できる。このことから、小型で安価な装置構成を提供することができる。
上段は、マイクロ流路チップの光導波手段の一本の流路中を通流する複数の液滴群を示す概略図であり、下段は、複数の液滴群について計測される出力信号の一例を示す図である。 反応薬液ライブラリの構成の一例を示す概略図である。 実施の形態１に係るマイクロ流路チップの流路の一部の断面を切り出した斜視図である。 マイクロ流路チップの構成の一例を示す概略図である。 実施の形態１における流路合流部の構成の一例を示す概略図である。 実施の形態１における流路合流部の構成の一例を示す概略図である。 ＰＣＲ用リアクタの構成の一例を示す概略図である。 ＴａｑＭａｎプローブを用いたＰＣＲの各過程を示す概略図である。 ＴａｑＭａｎプローブを用いたＰＣＲの各過程を示す概略図である。 ＴａｑＭａｎプローブを用いたＰＣＲの各過程を示す概略図である。 実施の形態１におけるマイクロ流路チップの光導波手段及び核酸ターゲット解析装置の光学系の構成の一例を示す概略図である。 上段は、マイクロ流路チップの光導波手段の一本の流路中を通流する複数の液滴群を示す概略図であり、下段は、複数の液滴群について計測される出力信号の一例を示す図である。 実施の形態２における流路合流部の構成の一例を示す概略図である。 実施の形態２における流路合流部の構成の一例を示す概略図である。 実施例１の液滴の横断時間の分布を示す分布図である。 実施例１の液滴間のオイルの横断時間の分布を示す分布図である。 蛍光液滴の割合と液滴中の核酸ターゲットの平均個数の関係を示すグラフである。 実施例２の液滴の横断時間の分布を示す分布図である。 実施例２の液滴間のオイルの横断時間の分布を示す分布図である。
遺伝子の検索方法に関して説明する。遺伝子とは生物の遺伝情報を担う主要因子であり、あらゆる生物においてＤＮＡやＲＮＡなどの核酸を媒体として、その塩基配列にコードされている。近年、遺伝子を診断する技術の向上により、遺伝子の多様性解析や発現解析の進展が目覚しい。特に医療分野においては遺伝子情報と疾患の関係が注目されている。例えば、疾患に関連した個々の遺伝子情報（特定部位のＤＮＡやＲＮＡの塩基配列）を解析することで、患者個人毎に適切な治療や投薬を行うこと（テーラーメード医療）が可能になってきた。テーラーメード医療では、その場診断が最も望ましく、ＰＯＣＴ（Ｐｏｉｎｔ ｏｆ Ｃａｒｅ Ｔｅｓｔｉｎｇ）性が高く、迅速、簡便な手法が求められる。そのため、血液など、採取した検体から解析対象の遺伝子を含むＤＮＡやＲＮＡなどの核酸を抽出、増幅し、その塩基配列の情報あるいはその量の検出を迅速、簡便に行えるデバイスの実現が強く求められている。ここでは、解析対象である核酸のことを、核酸ターゲットと呼ぶ。核酸ターゲットとしては、ＤＮＡやＲＮＡの塩基配列の内の一部分も含まれるし、あるいは血液や体液に含まれるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）や、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）などのような短い核酸の断片も含まれる。
これらの要望に応える手段の一つとして、近年、μＴＡＳ（μ Ｔｏｔａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ）またはＬｏＣ（Ｌａｂ ｏｎ Ｃｈｉｐ）と呼ばれるデバイスが注目されている。μＴＡＳまたはＬｏＣは、基板内にマイクロメートルあるいはナノメートルオーダーの微細構造で構成されたマイクロ流路やポートを設け、その構造内で物質の混合、抽出、精製、化学反応および分析など各種の操作を行うデバイスで、一部は実用化もされている。このようなデバイスは各種の操作が微細構造内で行われるため、所謂専門の研究所、解析機関等で用いられる常用サイズの同種の装置に比べ、サンプルや試薬の使用量が著しく少なく、分析時間も短く、感度も高いなどの特長を有する。また小型のデバイス構成の実現も可能で、専門の研究所だけではなく、現場に携帯し、その場での解析も実現可能である。このような目的のために作製された、基板内にマイクロ流路およびポート等の微細構造を有し、各種機能が実装された構造物は総称してマイクロ流路チップまたはマイクロ流体デバイスとも呼ばれる。
マイクロ流路チップを用いて短時間で検体中の核酸ターゲットを解析するためには、チップ内に、検査対象である核酸ターゲットを含む核酸の抽出、増幅、検出の機能が組み込まれることが望まれる。特に、より多くの情報を短時間で得るために、同一チップ内で一度に複数個の検体を解析することや、あるいは一検体に含まれる複数の核酸ターゲットを増幅、検出すること（マルチプレックス増幅および検出）が求められる。また、用途によっては、検体に含まれる核酸ターゲットの量も解析（定量解析）することが求められる。
以下、本開示の実施の形態に係る核酸ターゲットを解析する方法及びマイクロ流路チップについて、添付図面を参照しながら説明する。
（実施の形態１）
本開示の実施の形態１における複数の核酸ターゲットを解析するマイクロ流路チップについて、図を参照しながら説明する。図３Ａは、実施の形態１に係るマイクロ流路チップの外観を示す斜視図であり、図３Ｂは、マイクロ流路チップの構成の一例を示す概略図である。マイクロ流路チップは、少なくとも、反応薬液と第１のオイルとが流れるための第１の供給流路と、核酸を含むサンプル溶液が流れるための第２の供給流路と、第２のオイルが流れるための第３の供給流路と、反応薬液を含む液滴群と反応薬液を含まない液滴群とが生成される流路合流部と、生成された液滴群が流れるための第４の流路と、液滴群における各液滴中に含まれ得る核酸を増幅する核酸増幅手段と、核酸増幅手段を通過した液滴群が流れるための第５の流路と、第５の流路中の液滴群の透過光又は反射光を外部に取出可能な光導波手段と、を備える。
流路合流部で、第１の供給流路と、第２の供給流路と、第３の供給流路とが合流することにより第１の供給流路から供給される液体の種類に応じて、反応薬液を含む液滴群と、反応薬液を含まない液滴群とが生成される。
反応薬液ライブラリは、複数の反応薬液（例えば、第１の反応薬液、第２の反応薬液）を保持する流路を有する。例えば、流路において第１の反応薬液と第２の反応薬液との間はオイルが配置されており、反応薬液ライブラリは、第１の反応薬液と第２の反応薬液とは分離して保持する。
複数の反応薬液のそれぞれは、異なる核酸ターゲットと一対一で反応し、かつ蛍光色素で修飾されている。
なお、反応薬液ライブラリは、マイクロ流路チップには必ずしも備えていなくてもよい。必要に応じて反応薬液ライブラリから第１の供給流路に反応薬液と第１のオイルとを供給すればよい。
一本の流路中（第５の流路中）を、増幅された核酸を含む複数の液滴が生成された順番に通流する。また、第５の流路は、増幅された核酸を含む液滴に外部からの光が透過可能であって、液滴を透過した透過光又は前記液滴を透過後に反射した反射光を外部に取出可能な材料により規定される。
以下に、反応薬液ライブラリ及びマイクロ流路チップについて説明する。
＜反応薬液ライブラリ＞
図２は、反応薬液ライブラリの構成の一例を示す概略図である。異なる複数の核酸ターゲットを解析する場合、それぞれの核酸ターゲットの塩基配列に相補的な塩基配列を有するプライマやプローブ、あるいは核酸ターゲットの増幅を行うための酵素などを含む反応薬液を個別に準備することが必要になる。薬液タンク２０１は、内部に設けられた仕切りによって、排出口２０２に向かって細い一本の流路が続いているような形に構成されており、その流路中には、反応薬液２０３が保持されている。図に示すように、異なる核酸ターゲットと反応する異なる複数の反応薬液（図の網掛け部分）がお互いに混じり合わないように、それぞれの間にオイル（第１のオイル）２０４を封入して保持されている。また、排出口２０２とは別に空気孔２０５も設けられており、薬液保存時は空気孔２０５をふさいでおくが、実際に使用する時にこの空気孔２０５を開放することによって、薬液タンク２０１内の反応薬液やオイルが排出口２０２から順次マイクロ流路チップに供給される。この構成をとることによって、薬液タンク２０１の排出口２０２から、その先にあるマイクロ流路チップに順に複数の反応薬液を交じり合うことなく順番に供給することができる。つまり、複数の反応薬液を供給可能な反応薬液ライブラリが構成されている。
この反応薬液ライブラリを用いることで、排出口２０２の先に繋がっているマイクロ流路チップ内に形成された流路に対して、反応薬液Ａ、オイル、反応薬液Ｂ、オイル、反応薬液Ｃのように異なる複数の反応薬液とオイルとが交互に供給される。図２では、反応薬液の種類をＡからＪまでの１０種類の場合について描いたが、本開示においては２種類以上の反応薬液であれば、その種類は何種類であってもよい。オイルを介して２種類以上の反応薬液を分離して保持する構成をとることで、反応薬液の種類が増減した場合においても同様に対応することが可能となる。また、ここでは薬液タンク２０１内に壁を設けて、細い一本の細い流路を形成したが、薬液タンク２０１の形状はこの形状に限らず、異なる複数の反応薬液とオイルが交互に保持され、かつ薬液タンクの排出口から、反応薬液とオイルが交互に供給されれば、この形でなくても効果には何ら影響を与えない。例えば、薬液タンク内に細い一本の管状のチューブを入れて、そのチューブ内に反応薬液とオイルを交互に封入する形であってもよい。
＜マイクロ流路チップ＞
図３Ａ及び図３Ｂは、実施の形態１におけるマイクロ流路チップの概略を示す図である。図３Ａは、マイクロ流路チップの流路の一部の断面を切り出した斜視図である。マイクロ流路チップは、Ｓｉ基板３０１などの基材に、ガラス板３０２などを貼りあわせた構造からなっている。Ｓｉ基板３０１などの基材は、表面をエッチングなどの技術によって所定の幅、深さに掘り込まれており、液体を流す流路となる溝が形成されている。Ｓｉ基板３０１などの基材の溝が形成されている面にガラス板３０２などを貼りあわせることで、サンプルや反応薬液などが流れる流路３０３が形成される。このように作製された流路を用いて、血や体液などの核酸を含むサンプルを流したり、図２に示した薬液タンクから供給される反応薬液を流したりできるようになる。また、これら流路を結合したり分岐したりすることで、これら液体を混合したり分離したりすることができるようになっている。また、同様のプロセスで、様々な処理を行うリアクタなどの任意の形状を基材に形成することも可能である。マイクロ流路チップは、これらリアクタなどの要素やそれらを繋ぐ流路を形成して、ポンプやバルブを用いて、小さなチップ内で少量の液体を流しながら、自動的に様々な処理をすることが可能となっている。また、図３Ａのように、Ｓｉ基板などの基材に貼りあわせた板がガラス板などの光を透過する材料であった場合、ガラス板側からは、レーザやランプの光を流路に照射したり、あるいは流路中を流れる液体からの反射光や蛍光などの光信号を計測したりできるようになっている。ここでは、Ｓｉ基板とガラス板を貼り合わせた構造を説明したが、両方ともガラス板などにして、両側から流路中を流れる反応薬液やサンプルに対して光を照射したり、光検出できるようにしても良い。少なくとも一方の板は、レーザやＬＥＤなどの光や、あるいは流路中を流れる蛍光色素からの蛍光などを透過する材料であれば良い。
実施の形態１におけるマイクロ流路チップ３０４は、図３Ｂに示すように、チップ３０４は、前処理手段３０５、流路合流部３０６、ＰＣＲ用リアクタ３０７、光導波手段３０８を有する。各要素は液体が流れる流路３０３で繋がっている。マイクロ流路チップ３０４は、血液や体液などの検体を入力するための検体供給口３０９、薬液タンクを接続して反応薬液ライブラリを供給する反応薬液供給口３１０、液滴生成のためのオイルを供給するオイル供給口３１１を有する。詳細は後述する。
前処理手段３０５において、血液や体液などの検体から検査対象である核酸を含むサンプル溶液が準備される。前処理手段３０５は、後述する核酸増幅処理（ＰＣＲ）を行うために、細胞などを破壊することにより、核酸を取り出す。または、前処理手段３０５は、検査するために必要な物質だけを後段に供給するためにフィルタリングする。前処理手段３０５では、後段でＰＣＲできる形にサンプル溶液が精製されさえすれば、どのような処理が行われても、本開示の効果には何ら影響を与えない。前処理手段３０５で精製されたサンプル溶液は、次の流路合流部３０６に送液される。
流路合流部３０６では、薬液タンクから供給された反応薬液とオイルとを用いて液滴及び液滴群が生成される。なお、流路合流部３０６における液滴及び液滴群の生成については後述する。
流路合流部３０６で生成された液滴群は、次のＰＣＲ用リアクタ３０７に供給される。ＰＣＲ用リアクタ３０７では、核酸ターゲットの核酸増幅処理（ＰＣＲ）が行われる。そこで、所望の核酸ターゲットが含まれる液滴内でのみ、核酸の増幅が行われるため、核酸ターゲットが含まれる液滴内は、蛍光を発する状態となり、核酸ターゲットが含まれない液滴内は、蛍光を発しない状態となる。ＰＣＲ後の液滴群は、次の光導波手段に送液される。ＰＣＲ用リアクタの例は、チャンバ及びヒーターである。
光導波手段では、一本の流路（第５の流路）を流れてくる液滴に対して、光学的に検出を行うところである。例えば、流れてくる液滴の数を光学的に計数し、液滴や、液滴間のオイルの横断時間を計測し、あるいは液滴に対して蛍光を励起する光を照射し、液滴から発せられる蛍光の強度を検出する。
図４Ａ及び図４Ｂは、流路合流部３０６の構成の一例を示す概略図である。図４Ａ及び図４Ｂに示すように、第１の供給流路４０１の一端と、第２の供給流路４０２の一端と、第３の供給流路４０３の一端とは、第４の流路の結合点４０４で接続される。流路合流部３０６とは、第１の供給流路４０１と、第２の供給流路４０２と、第３の供給流路４０３と、結合点４０４を含む第４の流路との総称を意味する。
第１の供給流路４０１には、複数の反応薬液４０５と、複数の反応薬液４０５の間に位置する第１のオイル４０６とが流れる。図４Ａは、第１の供給流路４０１から結合点４０４に反応薬液４０５が流れてきた状態を示す図である。図４Ｂは、第１の供給流路４０１から結合点４０４に第１のオイル４０６が流れてきた状態を示す図である。
第１の供給流路４０１の他端は、図２に示す薬液タンクと繋がっている。薬液タンクに含まれる複数の反応薬液４０５と、複数の反応薬液４０５の間に位置する第１のオイル４０６とが第１の供給流路４０１の他端から供給される。具体的には、第１の反応薬液、第１のオイル４０６、第２の反応薬液の順に、第１の供給流路４０１に供給される。第１の反応薬液、及び第２の反応薬液は、複数の反応薬液４０５に含まれる。例えば、第１の供給流路４０１は、複数の反応薬液４０５を含む液体が供給するためのポンプを有しても良い。第１の供給流路４０１の他端は、反応薬液供給口３１０に相当する。
第２の供給流路４０２の他端から検査対象である核酸を含むサンプル溶液が供給される。例えば、第２の供給流路４０２は、サンプル溶液を供給するためのポンプを有しても良い。第２の供給流路４０２の他端は、検体供給口３０９に相当する。
第３の供給流路４０３の他端から第２のオイル４０８が供給される。例えば、第３の供給流路４０３は、第２のオイル４０８を供給するためのポンプを有していても良い。第３の供給流路４０３の他端は、オイル供給口３１１に相当する。
第４の流路の一端は、結合点４１１に相当する。第１の供給流路４０１、第２の供給流路４０２、第３の供給流路４０３からは、各液体が各々一定の流速で流れてきて、流路の結合点４０４で、各液体を合流（衝突）する。水系のサンプル溶液４０７および反応薬液４０５と、第１のオイル４０６および第２のオイル４０８とが流路の結合点４０４で合流すると、水系のサンプル溶液４０７および反応薬液４０５が、第１のオイル４０６および第２のオイル４０８で引きちぎられて、液滴４０９が生成される。液滴４０９の大きさは、流路の結合点４０４における水系の溶液（たとえばサンプル溶液４０７および反応薬液４０５）と、オイル４０６、４０８との流量比によって決定される。オイル４０６、４０８の流量に対して、水系の溶液４０５、４０７の流量の比率が大きくなればなるほど、生成される液滴４０９の大きさは大きくなる。
第１の供給流路４０１からは、水系の反応薬液４０５と第１のオイル４０６が交互に流れてくる。流路の結合点４０４に、反応薬液４０５が到達した場合と、第１のオイル４０６が到達した場合で、液滴４０９の生成条件が異なる。図４Ａは、流路の結合点４０４に反応薬液４０５が到達している場合の状態を示している。流路の結合点４０４では、第１の供給流路４０１から水系の反応薬液４０５が、第２の供給流路４０２からは水系のサンプル溶液４０７が、そして第３の供給流路４０３からは第２のオイル４０８がそれぞれ流れてきて合流する。この場合、水系のサンプル溶液４０７と反応薬液４０５の混合液を第２のオイル４０８が引きちぎることになり、図４Ａに示すように、サンプル溶液４０７と反応薬液４０５とが混合した液滴４０９が、第２のオイル４０８を介して生成され、液滴群を構成される。
図４Ｂは、第１の供給流路４０１から、流路の結合点４０４に第１のオイル４０６が到達している場合の状態を示している。流路の結合点４０４では、第１の供給流路４０１から第１のオイル４０６が、第２の供給流路４０２からは水系のサンプル溶液４０７が、そして第３の供給流路４０３からは第２のオイル４０８がそれぞれ流れてきて合流する。この場合、水系のサンプル溶液４０７を、第１の供給流路４０１から流れてくる第１のオイル４０６と、第３の供給流路４０３から流れてくる第２のオイル４０８が引きちぎることになり、図４Ｂに示すように、サンプル溶液４０７だけで形成される液滴４１０が、第１のオイルと第２のオイルの混合液を介して生成され、液滴群が構成される。
第１の供給流路４０１、第２の供給流路４０２、および第３の供給流路４０３から、各液体が各々一定の流速を保ちながら流れてくるため、図４Ａのように第１の供給流路４０１から反応薬液４０５が流路の結合点４０４に到達している状態では、図４Ｂに示す第１の供給流路４０１から第１のオイル４０６が流路の結合点４０４に到達している状態に比べ、液滴生成時のオイルの流量に対する水系の溶液の流量の比率が大きくなるため、生成される液滴の大きさが大きくなる。つまり、図２のような薬液タンク（反応薬液ライブラリ）を構成し、図４に示す流路合流部に各液体を各々一定の流速を保って流した場合、反応薬液を含む液滴群４０９と、反応薬液を含まない液滴群４１０が交互に生成され、かつ、反応薬液を含む液滴４０９の大きさは、反応薬液を含まない液滴４１０に比べ大きく生成される。
また、図４Ａのように第１の供給流路４０１から反応薬液４０５が流路の結合点４０４に到達している状態では、図４Ｂに示す第１の供給流路４０１から第１のオイル４０６が流路の結合点４０４に到達している状態に比べ、オイルの流量に対する水系の溶液の流量の比率が大きくなるため、生成される液滴の大きさが大きくなるとともに、逆に液滴間のオイルの量は少なくなる。これは、流路の結合点４０４における液滴生成時の水系の溶液とオイルとの量のバランスによるものである。つまり、図４Ａ条件で生成される反応薬液４０５を含む液滴群４０９では、図４Ｂの条件で生成される反応薬液４０５を含まない液滴群４１０に比べ、液滴間のオイルの量が少なくなる。つまりオイル部分の大きさが小さくなる。
これらは、流路の結合点４０４における、液滴生成時の水系の溶液の流量と、オイルの流量とのバランスによって決定され、図４Ａ及びＢのように第１の供給流路４０１、第２の供給流路４０２、第３の供給流路４０３を結合させてなる流路合流部において、第１の供給流路４０１から、反応薬液とオイルを交互に流す反応薬液ライブラリを構成すれば、各供給流路からの液体の流量を異なる設定としても、それぞれの供給流路から流れてくる液体の流速をそれぞれ一定にしておけば、必ず、反応薬液４０５を含む液滴４０９の大きさが、反応薬液４０５を含まない液滴４１０の大きさに対して大きくなる。また、反応薬液４０５を含む液滴４０９群内のオイルの大きさが、反応薬液４０５を含まない液滴４１０群内のオイルの大きさに対して小さくなる。
また、ここでは図４Ａ及びＢに示す流路構成について説明したが、流路の結合の仕方に関しては、この図に示した形に限らず、どのような結合の仕方でもかまわない。例えば第１の供給流路と、第２の供給流路と、第３の供給流路がそれぞれ９０度ずつの角度を持って結合する、つまり十字状に結合するなどの形であってもかまわない。第１の供給流路と、第２の供給流路と、第３の供給流路から各液体が各々一定の流速を保って供給されさえすれば、結合の仕方が変わっても効果に影響を及ぼさない。
図５は、核酸ターゲットの増幅を行うＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）用リアクタの構成の一例を示す概略図である。ＰＣＲリアクタ内においても、流路合流部で生成された液滴群が、生成された順番を崩すことなく通流する必要がある。そのため、図５に示すようにＰＣＲリアクタ内も一本の流路が続いた形状となっており、液滴が一個ずつ順番を変えることなく流れてくる。このＰＣＲ用リアクタ内では、ＰＣＲによる核酸増幅処理が行われる。
このＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）の一例として、図６Ａ〜Ｃは、ＴａｑＭａｎプローブという蛍光プローブを用いたＰＣＲによる核酸増幅処理の各過程を示す図である。血液や体液などの検体は、図３Ｂに示した前処理手段であらかじめＰＣＲによる核酸増幅処理を行えるように処理がなされる。例えば、細胞を壊したり、エクソソームのような血液や体液に含まれる小胞体を壊したり、あるいはその中からフィルタリングなどの技術によって高濃度の核酸を濃縮したり、などの処理が含まれる。ＰＣＲによる核酸増幅処理をするためには、それらの処理を行った後、ある程度の長さの塩基配列（少なくとも反応薬液中のプライマやプローブよりも充分長い塩基配列）をもつ二本鎖の構造にする必要があるため、例えば、ｍｉＲＮＡのような２０塩基対程度の非常に短い核酸断片を核酸ターゲットとすると、そのｍｉＲＮＡを長い二本鎖のＤＮＡに変換する逆転写とよばれる処理が必要になるが、前処理手段ではこのような処理も含まれる。この前処理工程の手法に関しては効果に影響を及ぼすものではなく、どのような手法がとられてもかまわない。
図６Ａに示すように、ＰＣＲリアクタ内に到達した核酸は、相補的に並んだ塩基配列の二本鎖の構造（６０１、６０２が結合した状態）を持つ。この核酸をある温度まで加熱すると、この二本鎖が外れ、一本鎖の核酸（６０１、６０２）に分かれる。この一本鎖の核酸からなるサンプルに対して、例えば一本鎖核酸６０１が検出したい核酸ターゲットであった場合、核酸ターゲット６０１の配列鎖の第一の領域に相補的な配列をもつプライマ（６０３）と、同じ核酸ターゲットの配列鎖の第二の領域に相補的な配列を含む蛍光プローブ（蛍光色素で標識したオリゴヌクレオチド、６０５）を接触させて、ハイブリダイゼーションを生じさせる条件にすると、プライマ６０３、蛍光プローブ６０５が核酸ターゲット６０１と二本鎖複合体を形成する（図６Ａ参照）。また、核酸ターゲットではない一本鎖ＤＮＡ６０２にも対応するプライマ６０４が結合する。しかし、検出したい核酸ターゲットではないため、蛍光プローブ６０５は結合しない。
その後、５‘→３’ヌクレアーゼ活性となる条件にすると、核酸合成酵素が働き始め、一本鎖核酸６０１および６０２に結合したプライマ６０３および６０４を基点として、核酸の伸長が始まる（図６Ｂ参照）。
核酸の伸長が進むと、核酸ターゲット６０１に結合した蛍光プローブ６０５を遊離させる（図６Ｃ参照）。蛍光プローブ６０５に含まれる蛍光色素６０６と消光剤６０７は遊離前には近接した領域に存在するため蛍光色素が光ることは無いが、核酸の伸長によって蛍光プローブが遊離して、蛍光色素６０６と消光剤６０７が離れると、蛍光が発色できるようになる。この一連のサイクルによって核酸ターゲット一本に対して、一つの蛍光色素が遊離し、発光可能となる。また、核酸の伸長によって一本鎖核酸はそれぞれ二本鎖核酸となるため、核酸は２倍に増幅される。つまり、この過程を繰り返すことで、繰り返し回数に応じて、核酸の数は２の累乗倍だけ増幅され、また同様に蛍光色素の遊離も２の累乗倍生じる。検出対象である核酸ターゲットがサンプルに含まれていた場合、この過程を繰り返すことで発光可能な蛍光色素の量が増えていく。
なお、プライマや蛍光プローブの種類によって条件は異なるが、二本鎖核酸を一本鎖核酸に分離するには、９０℃前後の温度、プライマや蛍光プローブをハイブリダイゼーションさせるには、６０℃前後の温度、ヌクレアーゼ活性となり核酸合成酵素が働き、核酸の伸長をさせるには７０℃前後の温度に加熱することが多い。つまり、ＰＣＲによる核酸増幅処理は、このように９０℃前後から６０℃前後の間の温度で、加熱と冷却を繰り返す温度サイクルを行うことによって行われる。ＰＣＲ用リアクタは、高速にこの温度サイクルを繰り返す必要があるため、実施の形態１のように、Ｓｉ基板などの熱伝導率の良好な材料を基板として使用する場合では、例えば温度サイクルを行うべきリアクタの領域を周囲のＳｉ部材から切り離すなどの断熱手段が有効である。実施の形態１においても、図５のＳｉ基板に形成されたＰＣＲ用リアクタのリアクタ５０１の周囲には、エッチング等の方法で隙間（ギャップ）５０２を設けてある。この構成によって、リアクタを加熱した熱が周囲に拡散することなく、非常に高速な温度サイクルが実現されるようになっている。また、このリアクタ内の液滴全体に対してＰＣＲによる核酸ターゲットの増幅処理を行うため、ＰＣＲリアクタ全体の温度を変化させることができるように、ＰＣＲ用リアクタ全体をカバーするようにペルチェ素子などの温度制御デバイスを接触させてもよい。あるいは、ペルチェ素子に熱伝導率の高いＣｕやＡｌなどの金属プレートを接触させ、その金属プレートをＰＣＲリアクタ全体に接触するように設けてもよい。
このＰＣＲ用リアクタには、前段の流路合流部で生成した液滴群が供給口５０３から生成された順番に流れてくる。ＰＣＲを行う際は、このリアクタ５０１内に液滴群をとどめておくため、例えばＰＣＲリアクタの供給口５０３、および排出口５０４付近に設けたバルブなどを閉めておく。
また、反応薬液を含む液滴５０５内には、核酸を含むサンプル溶液とプライマやプローブ、酵素などの反応薬液が含まれている。ＰＣＲ用リアクタ内にある液滴（５０５あるいは５０６）は、ＰＣＲの温度サイクルを行っても、形状が崩れることはない。つまり、それぞれの液滴内で個別にＰＣＲによる核酸増幅処理が実施される。液滴内に検出対象である核酸ターゲットが含まれている場合は、その液滴内で核酸の増幅が行われ、遊離した蛍光色素の量が温度サイクルの回数に応じて増加する。つまり、蛍光を励起する波長の光を照射すれば、その液滴は蛍光発色する。また、液滴内に検出対象である核酸ターゲットが含まれていない場合は、ＰＣＲによる核酸増幅処理を行っても、蛍光色素が遊離することはなく、蛍光を励起する波長の光を照射しても、この液滴は蛍光発色しない。つまり、同じ種類の反応薬液を含む液滴群の全数に対して、蛍光発色する液滴の数の割合を計数すれば、元のサンプル内に検出対象である核酸ターゲットがどの程度の割合で含まれていたかを解析することができる。
ここでは図５に示す形状のＰＣＲリアクタについて説明を行ったが、生成された液滴の順番が変わらず、液滴が一個ずつ順番に通流することができ、かつＰＣＲリアクタ内全領域に対して、ＰＣＲの温度サイクルが実現できる構成であれば、図５に示す形状でなくても効果には何ら影響を与えない。
図７は、実施の形態１におけるマイクロ流路チップ７００の光導波手段及び核酸ターゲット解析装置の光学系の構成の一例を示す概略図である。
マイクロ流路チップ７００の光導波手段は、Ｓｉ基板７０１などの基材上に数百μｍの溝を形成し、その上からガラス板７０２を陽極接合などの方法で貼りあわせることで構成されている。溝は、ガラス板７０２を貼りあわせることで、液滴が流れる流路７０３となる。その溝からなる流路７０３内を、ＰＣＲ後の液滴７０４が一列になって連続的に、かつ決められた一定の速度で流れてくる。液滴７０４に対して蛍光色素を励起する光を照射し、また、それによって発光する蛍光を検出する必要がある。この構成のチップにおいてはガラス面を通して、光の入出力を行う。ＰＣＲ用リアクタで増幅された液滴が流れる流路７０３を、第５の流路とも表記する。
光源は、蛍光色素を効率的に励起するために蛍光色素の吸収スペクトルの最大吸収波長付近の波長のレーザもしくはＬＥＤなどを用いることが多い。特に光学系としてはできるだけ小型で高出力であることが好ましく、光源としては半導体レーザなどが好ましい。実施の形態１においては、例えば、波長６５０ｎｍの半導体レーザ７０５を用いた。
半導体レーザ７０５から出射するレーザ光はコリメータレンズ７０６によって平行光となり、ダイクロイックミラー７０７で反射される。ダイクロイックミラーは波長によって反射、透過を選択することが可能なミラーで、実施の形態１では、カットオフ６６０ｎｍのダイクロイックミラーを用いた。６６０ｎｍより短い波長の光を反射し、波長６６０ｎｍより長い波長の光は透過される。
反射したレーザ光は対物レンズ７０８によって第５の流路７０３中の液滴通過位置に集光される。核酸ターゲットを含む液滴７０４は、ＰＣＲによって、液滴中に大量の蛍光色素が遊離した状態となっているため、このレーザ照射によって蛍光色素が励起され、蛍光を発光する。液滴７０４から発した蛍光のうちの一部を対物レンズ７０８を通して蛍光検出器側に取り出す。対物レンズ７０８は、蛍光を出来るだけ効率よく取り込む必要があるため、開口数（ＮＡ）の大きいレンズが好ましい。実施の形態１では、ＮＡ０．８５の対物レンズを用いた。対物レンズ７０８を透過してきた蛍光はダイクロイックミラー７０７を透過する。その後、蛍光波長の光を透過する光学フィルタ７０９を通して、蛍光以外の光（例えば励起光の漏れこみ、その他の材料から発する自家蛍光など）の強度を抑制した後、レンズ７１０によって蛍光検出器に集光される。レンズによって集光するポイントに、ちょうど絞り込んだ光が透過するサイズのピンホール７１１を設置することによって、センサチップに絞り込んだレーザ光のうち、焦点以外の領域から反射してきた迷光成分をカットすることが可能となる。そしてピンホールを透過した蛍光のみが蛍光検出器７１２に入力される。
蛍光検出器は、一般的に励起光の１万分の１から１０万分の１くらいの大きさとなる蛍光を高感度に、そして高速に検出する必要があるため、フォトマルチプライア（ＰＭＴ）やアバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）、フォトダイオード（ＰＤ）などの高感度検出器が用いられる。特に感度も良く応答速度の速いＰＭＴが好ましい。実施の形態１においては電流出力型のＰＭＴを用いた。
境界検出部により、蛍光強度に基づいて、第５の流路の流路を流れる第１の液滴から第４の液滴までのそれぞれの間の境界を取得する。検出部は、蛍光強度と、第１の液滴から第４の液滴までのそれぞれの間の境界とに基づいて、第１の閾値以上の蛍光強度を有する第２の液滴及び第４の液滴の数を取得し、かつ、第２の液滴及び第４の液滴の数に基づいて、対象の核酸ターゲットに、第１の核酸ターゲット及び第２の核酸ターゲットからなる群から選択される少なくとも１つが含まれているか否かを検出する。
本開示において、境界検出部及び検出部は、半導体装置、半導体集積回路（ＩＣ）、又はＬＳＩ（large scale integration）を含む一つ又は一つ以上の電子回路によって実行されてもよい。ＬＳＩ又はＩＣは、一つのチップに集積されてもよいし、複数のチップを組み合わせて構成されてもよい。例えば、記憶素子以外の機能ブロックは、一つのチップに集積されてもよい。ここでは、ＬＳＩやＩＣと呼んでいるが、集積の度合いによって呼び方が変わり、システムＬＳＩ、ＶＬＳＩ(very large scale integration)、若しくはＵＬＳＩ(ultra large scale integration) と呼ばれるかもしれない。 ＬＳＩの製造後にプログラムされる、Field Programmable Gate Array (FPGA)、又はＬＳＩ内部の接合関係の再構成又はＬＳＩ内部の回路区画のセットアップができるreconfigurable logic deviceも同じ目的で使うことができる。
＜複数の核酸ターゲットの解析方法＞
以下に、異なる複数の反応薬液を含む液滴群を分離検出して、複数の核酸ターゲットの解析方法を説明する。
図４Ａ及びＢを用いて説明した通り、流路合流部において、反応薬液を含む液滴群と、反応薬液を含まない液滴群が交互に生成されている。また、反応薬液を含む液滴の大きさは、反応薬液を含まない液滴に対して必ず大きく生成される。流路合流部で生成された液滴は、ＰＣＲ用リアクタを通して、生成された順番を崩すことなく一本の細い流路を流れてきて、光導波手段の流路中の液滴通過位置を順番に通過していく。
図１の上段は、マイクロ流路チップの光導波手段の一本の流路中を通流する複数の液滴群を示す概略図であり、図１の下段は、図１の上段の複数の液滴群について計測される出力信号の一例を示す図である。つまり、図１の上段は、光導波手段の第５の流路中の液滴通過位置付近の液滴の状態を示している。図１の上段に示す通り、反応薬液を含む液滴群１０１あるいは１０２、反応薬液を含まない液滴群１０３あるいは１０４が交互に現れる。図１の上段では反応薬液を含まない液滴群１０３、反応薬液を含む液滴群１０１、反応薬液を含まない液滴群１０４、反応薬液を含む液滴群１０２が順に流れてくる様子を示している。この第５の流路中の一点を液滴通過位置と定め、その固定された位置に、蛍光励起光を対物レンズで絞り込んで照射すると、液滴とオイルの屈折率の違いにより液滴とオイルの境界部分で、対物レンズを通して取り込まれる蛍光波長付近の反射光の強度が変化する。つまり、蛍光励起光を対物レンズによって液滴のサイズと同等、好ましくは液滴のサイズよりも小さく絞り込んで、液滴通過位置に照射すると、液滴通過位置を液滴が通過するたびに、蛍光検出器（たとえばＰＭＴの電流出力）では、図１の下段に示すような信号の強弱が現れる。また、液滴は一定の流速を保って流れてくるため、液滴の大きさによって、液滴通過位置を横切る時の横断時間が変わる。例えば蛍光検出器の出力レベルに閾値を設け、閾値１１０と信号が交差した位置の情報を取得すると、液滴一個一個の横断時間（１１２、１１３）を計測することができる。反応薬液を含む液滴は、反応薬液を含まない液滴に比べ、液滴の大きさは大きくなるので、横断時間も長くなる。つまり反応薬液を含む液滴が液滴通過位置を流れている間は、比較的長さの長いパルス状の信号パターン１０７、１０８が液滴の個数分続く。その後、反応薬液を含まない液滴が液滴通過位置を流れてくるので、長さの短いパルス状の信号パターン１０９が液滴の個数分続く。液滴の横断時間を計測しておけば、長さの長いパルス状信号と、長さの短いパルス状信号の境界を判定することができる。境界検出部により、これらの処理は行われる。つまり、境界検出部により、蛍光強度に基づいて、第５の流路の流路を流れる第１の液滴から第４の液滴までのそれぞれの間の境界を取得する。
また、反応薬液を含む液滴群の中には、検出対象である核酸ターゲットを含む液滴が含まれることがある。検出対象である核酸ターゲットを含む液滴はＰＣＲ用リアクタでの核酸増幅処理によって多数の蛍光色素が遊離した状態となっており、照射した蛍光励起光で蛍光色素が励起され、液滴から蛍光を発する。つまり液滴群の中で、核酸ターゲットを含まない液滴からは、弱い信号１０８しか検出できず、核酸ターゲットを含む液滴からは、より大きな信号１０７を検出する。この蛍光検出器の出力信号の強度を、ある閾値を超えるか超えないかで分離することで、同じ反応薬液を含む液滴群の全個数に対して、蛍光を発する液滴の数の割合を計算で求めることができる。図１の下段では、閾値１１１を超える信号が検出された場合、核酸ターゲットを含む、蛍光液滴であると判断している。つまり、閾値１１０を超えるものを計数すると全液滴数が、閾値１１１を超えるものを計数すると蛍光液滴、つまり核酸ターゲットが含まれる液滴の数が計測される。検出部により、これらの処理は行われる。つまり、検出部は、蛍光強度と、第１の液滴から第４の液滴までのそれぞれの間の境界とに基づいて、第１の閾値以上の蛍光強度を有する第２の液滴及び第４の液滴の数を取得し、かつ、第２の液滴及び第４の液滴の数に基づいて、対象の核酸ターゲットに、第１の核酸ターゲット及び第２の核酸ターゲットからなる群から選択される少なくとも１つが含まれているか否かを検出する。
図２で示した反応薬液ライブラリを使った場合について、光導波手段及び複数の核酸ターゲットの解析方法における処理の方法について説明する。
まず、大きさの大きい（横断時間の長い）反応薬液Ａを含む液滴群が流れてくる。例えば、反応薬液Ａを含む液滴が１００個連続で流れてきたとする。光導波手段では、図１の下段のように液滴が通過するたびに蛍光検出器の出力信号は上下する。この上下する信号をある第１の閾値１１０でコンパレートして、第１の閾値１１０を横切る回数を計数することで液滴の数を把握することができる。液滴が１００個流れてくるので、このパルス状の信号は１００個連続で現れる。その後、大きさの小さい（横断時間の短い）反応薬液を含まない液滴群が流れてくる。この反応薬液を含まない液滴が５０個連続で流れてきたとする。反応薬液Ａを含んだ液滴群と反応薬液を含まない液滴群の境界部分では、蛍光検出器で検出されるパルス状の信号の長さ（横断時間）が変化するので、その信号の長さをモニタしておくことで、反応薬液Ａを含む液滴群が１００個目で終わることが判断できる。反応薬液Ａを含む１００個の液滴の内、いくつかは蛍光強度が強く検出される液滴が含まれ、その数が１０個あったとする。その１０個の液滴が液滴通過位置を通過すると、その他の液滴が流れてきたときの蛍光検出器の出力信号に比べ、非常に強い信号が検出される。これを第１の閾値１１０よりも強度が強い第２の閾値１１１でコンパレートすることで、蛍光強度が強く検出される液滴の数を検出することができる。つまり、この例の場合、反応薬液Ａと一対一で反応する核酸ターゲットは、反応薬液Ａを含む液滴の全数１００個に対して、１０個だけであるということが分かる。この全液滴数に対する蛍光液滴の数の割合から、もとのサンプル溶液に反応薬液Ａと一対一で反応する核酸ターゲットがどの程度の割合で含まれていたかを計算できる。
ただし、サンプル溶液は希釈され、液滴１個のなかに核酸分子が約１個入るように濃度調整を行うが、必ずしも液滴１個の中に核酸分子が１個ずつ入るとは限らない。例えば、ある液滴は核酸分子が入ってないかもしれないし、あるいは、ある液滴は核酸分子が２個入るかもしれない。しかし、これは確率統計的に処理することができ、ポワソン分布の考え方で推定することが可能となる。ポワソン分布の考え方を適応することで、全液滴数に対する蛍光液滴の割合から、液滴中に含まれる核酸分子数の平均値が求められる。全液滴数に対する蛍光液滴の割合をｐとすると、液滴中に含まれる核酸分子数の平均値は、−ｌｎ（１−ｐ）の数式で求めることができ、例えば先ほどの例では、全液滴数１００個に対して、蛍光液滴数は１０個であるため、全液滴数に対する蛍光液滴の割合は０．１となる。ポワソン分布の考え方から、一つの液滴中に含まれる核酸分子数の平均値は０．１１となるので、全液滴１００個分の容積のサンプル溶液中に核酸ターゲット分子が１１個入っていたと推定することができる。このように同じ種類の反応薬液からなる液滴群を、他の反応薬液からなる液滴群と明確に区別して、液滴数と蛍光液滴数を計数することができれば、サンプル溶液に含まれる核酸ターゲットの量を定量的に解析することができる。
反応薬液を含まない液滴５０個が流れてきた後、次は、反応薬液Ｂを含む大きさの大きい（横断時間の長い）液滴群が流れてくる。反応薬液を含まない液滴群と、反応薬液Ｂを含む液滴群の境界部分では、蛍光検出器で検出されるパルス状の信号の長さ（横断時間）が変化するので、その信号の長さをモニタしておくことで、反応薬液Ｂを含む液滴群の最初の液滴の位置が確認できる。反応薬液Ｂを含む液滴群でも、反応薬液Ａを含む液滴群で行ったのと同じ方法で、反応薬液Ｂを含む液滴の全数と、第２の閾値を超える蛍光液滴の数を計数すれば、反応薬液Ｂと一対一で反応する核酸ターゲットが、もとのサンプル溶液にどの程度の割合で含まれていたかを計算できる。
以降は、上記の繰り返しになる。図２のように１０種類の反応薬液（反応薬液ＡからＪまで）が薬液タンクに保持されていた場合は、この反応薬液を含む液滴群と反応薬液を含まない液滴群の繰り返しが１０回生じる。反応薬液を含む液滴群の最初と最後は、蛍光検出器で検出されるパルス状の信号の長さ（横断時間）の変化を確認すれば把握できるため、それぞれの反応薬液毎の液滴数に対する蛍光液滴の数を計数すれば、１０種類の核酸ターゲットについて順番に解析することが可能になる。
この実施の形態１では、例えば、第１のオイルと、第２のオイルとは、同じ材料を用いている。第１のオイルと、第２のオイルと、は水系の溶液を明確に分離できさえすれば、必ずしも同じ材料でなくても問題は無いが、流路合流部で第１のオイルと第２のオイルを混合した場合、同じ材料で構成した方が、混合時の薬液の安定性や、液滴生成条件が変化することが無い。そこで、第１のオイルと、第２のオイルとは、同じ材料を用いることがより好ましい。
また、実施の形態１では、例えば、異なる複数の反応薬液に含まれる蛍光色素は同じ一つの蛍光色素を用いている。必ずしも蛍光色素は一つである必要は無いが、全ての反応薬液に対して同じ波長の蛍光を発する蛍光色素を用いた方が、光導波手段及び複数の核酸ターゲットの解析装置の光学系の構成が非常に簡単になるため、より効果が大きくなる。
また、図１の下段では、液滴の大きさの情報（液滴の横断時間）１１２、１１３によって反応薬液を含む液滴群１０１、１０２と、反応薬液を含まない液滴群１０３、１０４との境界を判定した。これに限られず、例えば、図８の上段及び下段のように、反応薬液を含む液滴群８０１、８０２内のオイルの横断時間８１２と、反応薬液を含まない液滴群８０３、８０４内のオイルの横断時間８１３を計測することによっても境界の判定が可能である。図８は、図１と同様、光導波手段で検出される信号のパターンと、異なる複数の反応薬液を含む液滴群を分離検出する方法を説明する図である。図４を用いて説明した通り、流路合流部において、反応薬液を含む液滴群８０１、８０２と、反応薬液を含まない液滴群８０３、８０４が交互に生成されている。また、反応薬液を含む液滴群８０１、８０２内のオイル部分の大きさは、反応薬液を含まない液滴群８０３、８０４内のオイル部分の大きさに対して必ず小さく生成される。流路合流部で生成された液滴は、ＰＣＲ用リアクタを通して、生成された順番を崩すことなく一本の細い流路を流れてきて、光導波手段の流路中の液滴通過位置を順番に通過していく。図８の上段は、光導波手段の流路中の液滴通過位置付近の液滴の状態を示している。図８の上段に示す通り、反応薬液を含む液滴群８０１あるいは８０２、反応薬液を含まない液滴群８０３あるいは８０４が交互に現れる。図８の上段では反応薬液を含まない液滴群８０３、反応薬液を含む液滴群８０１、反応薬液を含まない液滴群８０４、反応薬液を含む液滴群８０２が順に流れてくる様子を示している。先ほどと同様、液滴群内のオイル部分の横断時間は、反応薬液を含む液滴群と、反応薬液を含まない液滴群とで異なるため、その情報を元に、反応薬液を含む液滴群の最初と最後を把握することが出来る。その情報を元に反応薬液の種類毎に液滴群を分離して、同じ種類の反応薬液を含む液滴群の全数に対して、第２の閾値を超える蛍光液滴の数を計数することによって、もとのサンプル溶液に核酸ターゲットがどの程度の割合で含まれていたかを計算することが出来る。
（実施の形態２）
本開示の実施の形態２では、液滴を生成する流路合流部の構造だけが、実施の形態１と異なる。その他の構成については実施の形態１と同じため、説明を省略する。
図９Ａは、実施の形態２における流路合流部の構成の一例を示す概略図であって、第１の供給流路から結合点９０４に反応薬液が流れてきた状態を示す図であり、図９Ｂは、第１の供給流路から結合点９０４に第１のオイルが流れてきた状態を示す図である。
図に示すとおり実施の形態２における液滴を生成する流路合流部は、図２に示した薬液タンクの排出口から繋がっており、複数の反応薬液と第１のオイルが交互に流れてくる第１の供給流路９０１と、血液や体液などの検体から、検査対象である核酸を含むサンプル溶液を作製する前処理手段から繋がっており、核酸を含むサンプル溶液が流れてくる第２の供給流路９０２とが結合点９０４で結合している。その結合流路と、第２のオイルが流れてくる第３の供給流路９０３とが結合点９１１で結合した形状となっている。第１の供給流路、第２の供給流路、第３の供給流路からは、各液体が各々一定の流速で流れてきて、流路の結合点９０４、および結合点９１１で各液体が合流する。水系のサンプル溶液９０７や反応薬液９０５と、オイル９０６、９０８が流路の結合点で合流すると、水系のサンプル溶液９０７や反応薬液９０５が、オイルで引きちぎられて液滴９０９が生成される。この液滴９０９の大きさは、流路の結合点における水系の溶液（たとえばサンプル溶液や反応薬液）と、オイルとの流量比によって決定される。オイルの流量に対して、水系の溶液の流量の比率が大きくなればなるほど、生成される液滴の大きさは大きくなる。
第１の供給流路９０１からは、水系の反応薬液９０５と第１のオイル９０６が交互に流れてくる。流路の結合点９０４に、反応薬液９０５が到達した場合と、第１のオイル９０６が到達した場合で、液滴の生成条件が異なる。図９Ａは、流路の結合点９０４に反応薬液９０５が到達している場合の状態を示している。流路の結合点９０４では、第１の供給流路９０１から水系の反応薬液９０５が、第２の供給流路９０２からは水系のサンプル溶液９０７が流れてきて合流する。両者とも水系の溶液のため、両者が混じりあいながら、次の結合点９１１に向かって流れる。そして第３の供給流路９０３から流れてきた第２のオイル９０８と結合点９１１で合流する。結合点９１１では、反応薬液９０５とサンプル溶液９０７とが混じりあった混合溶液が第２のオイル９０８で引きちぎられて、図に示すように、サンプル溶液と反応薬液が混合した液滴群９０９が、第２のオイル９０８を介して生成される。
図９Ｂは、第１の供給流路９０１から、流路の結合点９０４に第１のオイル９０６が到達している場合の状態を示している。流路の結合点９０４では、第１の供給流路９０１から第１のオイル９０６が、第２の供給流路９０２からは水系のサンプル溶液９０７が流れてきて合流する。この場合、水系のサンプル溶液９０７が第１の供給流路９０１から流れてくる第１のオイル９０６によって引きちぎられて、図に示すようにサンプル溶液だけで構成される液滴群９１０が、第１のオイル９０６を介して生成される。その後、第３の供給流路９０３から流れてくる第２のオイル９０８と結合点９１１で合流するが、既に小さい液滴９１０となったサンプル溶液９０７は、第３の供給流路９０３から流れてくる第２のオイル９０８で引きちぎられること無く、液滴間の第１のオイルと、第２のオイルの混合オイルによって液滴間が広げられた状態で流れていく。図に示すようにサンプル溶液だけで構成される液滴群９１０が、第１のオイルと第２のオイルの混合液を介して生成される。
第１の供給流路９０１、第２の供給流路９０２、および第３の供給流路９０３から、各液体が各々一定の流速を保ちながら流れてくる。各供給流路から流れてくる各液体の流量設定は、一般的には次のような比率に設定されることが多い。後段の核酸増幅処理で、核酸ターゲットを増幅するためには、一般的には、核酸を含むサンプル溶液に対して多量の反応薬液（プライマやプローブ、酵素など）が必要であり、第１の供給流路９０１からは、第２の供給流路９０２に対して大きな流量設定がなされる。例えば、１０倍から１５倍程度に設定されることが考えられる。また、安定した液滴生成のために、第３の供給流路からは、結合点９０４で混合した混合溶液と同程度の流量の第２のオイルを供給する設定にすることが考えられる。すなわち、第２の供給流路９０２から流れてくるサンプル溶液９０７の単位時間当たりの流量を１とすると、第１の供給流路９０１からは流量１５の反応薬液９０５あるいは第１のオイル９０６が、第３の供給流路９０３からは、流量１６の第２のオイル９０８が流れてくる。このように一般的にはサンプル溶液に対して、反応薬液や第１のオイル、および第２のオイルの流量は大きく設定されることが想定される。図９Ａのように第１の供給流路９０１から反応薬液９０５が流路の結合点９０４に到達しており、その混合溶液が結合点９１１に到達している状態では、混合溶液と、第２のオイルの流量比は、ほぼ１：１であり、図９Ｂに示す第１の供給流路９０１から第１のオイル９０６が流路の結合点９０４に到達している状態での流路の結合点９０４のサンプル溶液と第１のオイルの流量比が１：１５であると考えると、液滴群９０９の方が、液滴群９１０に比べ、各液滴の大きさが大きくなる。つまり、図２のような薬液タンク（反応薬液ライブラリ）を構成し、図９に示す流路合流部に各液体を各々一定の流速を保って流した場合、反応薬液を含む液滴群９０９と、反応薬液を含まない液滴群９１０が交互に生成され、かつ、反応薬液を含む液滴の大きさは、反応薬液を含まない液滴に比べ大きく生成される。
また、図９Ａの状態で生成される液滴群９０９内の液滴間のオイルの量は、図９Ｂの状態で生成される液滴群９１０内の液滴間のオイルの量に比べ少なくなる。つまりオイル部分の大きさが小さくなる。
これらは、流路の結合点９０４や結合点９１１における、液滴生成時の水系の溶液の流量と、オイルの流量とのバランスによって決定される。つまり、図９Ａのように流路合流部を構成し、サンプル溶液に対する反応薬液や、第１のオイル、第２のオイルの流量が大きければ、各供給流路からの液体の流量を異なる設定としても、それぞれの供給流路から流れてくる液体の流速をそれぞれ一定にしていれば、必ず、反応薬液を含む液滴９０９の大きさが、反応薬液を含まない液滴９１０の大きさに対して大きくなる。一方、反応薬液を含む液滴９０９群内のオイルの大きさは、反応薬液を含まない液滴９１０群内のオイルの大きさに対して小さくなる。
本実施の形態２においても、反応薬液を含む液滴群と、反応薬液を含まない液滴群が交互に流れ、かつ反応薬液を含む液滴の大きさが、反応薬液を含まない液滴の大きさに対して大きく、また反応薬液を含む液滴群内のオイルの大きさが、反応薬液を含まない液滴群内のオイルの大きさに対して小さくなるため、本実施の形態１で説明したことと同様の方法で、光導波手段を用いて、異なる種類の核酸ターゲットの定量解析が可能となる。
また、ここでは図９に示す流路構成について説明したが、流路の結合の仕方に関しては、この図に示した形に限らず、どのような結合の仕方でもかまわない。例えば第１の供給流路と、第２の供給流路が９０度の角度を持って結合し、また第３の供給流路が９０度の角度を持って結合する形であってもかまわない。第１の供給流路と、第２の供給流路と、第３の供給流路から各液体が各々一定の流速を保って供給されさえすれば、結合の仕方が変わっても効果に影響を及ぼさない。
（実施例１）
実施例１では、図４に示す流路合流部を用いた具体例について説明する。薬液タンクには種類の異なる３種類の反応薬液Ａ、Ｂ、Ｃをオイルを介して保持した。オイルは、Ｂｉｏｒａｄ社のオイルミックスを用いた。また、反応薬液は、Ｂｉｏｒａｄ社のマスターミックスをベースに、所望の核酸ターゲットにあったプライマおよび、蛍光標識プローブを人工的に作製して、混合させた。また、蛍光標識プローブはそれぞれの核酸ターゲットに合った所定の塩基配列を人工的に作製したものを混合させており、修飾した蛍光色素はいずれも同じＣｙ５色素を用いて作製した。
マイクロ流路チップは、Ｓｉ基板とパイレックス（登録商標）ガラスを陽極接合によって貼りあわせて構成されており、Ｓｉ基板に掘り込んだ約３０μｍ幅、２０μｍ深さの流路が構成されている。検体供給口から、光導波手段に至るまで、同じ大きさの流路が繋がった構成となっている。検体供給口から血液を注入し、前処理手段において、バッファ溶液などからなる溶媒と混合した後、加熱処理を行うことによって細胞を破壊し、検査対象となる核酸を抽出している。抽出された核酸を含むサンプル溶液は、外部に設けられたポンプを用いて、流路合流部の第２の供給流路を通して、流路合流部に供給される。サンプル溶液は５ｎＬ／ｍｉｎの一定の流速で第２の供給流路から供給した。
薬液タンクの排出口は、マイクロ流路チップの反応薬液供給口に接続され、外部に設けられたポンプによって一定の流速で流路合流部の第１の供給流路を通して供給される。流速は、７５ｎＬ／ｍｉｎに設定した。
マイクロ流路チップのオイル供給口からは、薬液タンク内に封入したオイルと同じオイル材料を外部に設けられたポンプを用いて供給した。流速は、７５ｎＬ／ｍｉｎに設定した。
図４に示す構造の流路合流部に３つの供給流路から、それぞれの液体が供給され、流路の結合点において、順次液滴が生成された。
まず、反応薬液Ａが流路の結合点に供給された。このとき、流路の結合点では、第１の供給流路から７５ｎＬ／ｍｉｎの流速で反応薬液Ａが、第２の供給流路からサンプル溶液が５ｎＬ／ｍｉｎの流速で、第３の供給流路からオイルが７５ｎＬ／ｍｉｎの流速で流れてきており、それらが合流していた。このとき生成される液滴は、サンプル溶液と反応薬液Ａの混合液からなり、約１０００個の液滴群を生成した。流路中を流れる反応薬液Ａを含む液滴の長さは約８７±４μｍ、液滴間にあるオイル部分の長さは約２３±１μｍであった。反応薬液Ａを含む液滴の容量を流路中の液滴の長さから計算すると５２±２ｐＬの大きさの液滴群が形成されていた。
次に、第１の供給流路からオイルが流路の結合点に供給された。このとき流路の結合点では、第１の供給流路からオイルが７５ｎＬ／ｍｉｎの流速で、第２の供給流路からサンプル溶液が５ｎＬ／ｍｉｎの流速で、第３の供給流路からオイルが７５ｎＬ／ｍｉｎの流速で流れてきており、それらが合流していた。このとき生成される液滴は、サンプル溶液のみからなり、いずれの反応薬液も含まれなかった。このサンプル溶液からなる反応薬液を含まない液滴は、約１００個生成された。流路中を流れる反応薬液を含まない液滴の長さは約３０±２μｍ、液滴間にあるオイル部分の長さは約８０±３μｍであった。液滴の容量を流路中の液滴の長さから計算すると１８±１ｐＬの大きさの液滴群が形成されていた。
この後、同様に、第１の供給流路からは反応薬液Ｂ、オイル、反応薬液Ｃ、オイルの順に順次流路の結合点に７５ｎＬ／ｍｉｎの流速で液体が供給された。反応薬液Ｂ、Ｃが流路の結合点に到達している場合は、反応薬液Ａのときと同様に、約５０ｐＬ程度の液滴群が形成され、オイルが流路の結合点に到達している場合は、約２０ｐＬ程度の液滴群が形成された。
流路合流部で生成された液滴は、生成された順番に流路を流れていき、ＰＣＲ用リアクタに供給された。本実施例１では、３ｍｍ×６ｍｍの範囲に形成されたＰＣＲ用リアクタを用いた。ＰＣＲ用リアクタ内は、図５に示すように３０μｍ幅の流路が、２０μｍの間隔を隔てて折りたたまれるように配置されている。リアクタ内には約３ｍｍの長さの流路が１２０本並んだような形状となっている。このＰＣＲ用リアクタは、３ｍｍ×３ｍｍの面積のペルチェ素子を２個用いた温度制御デバイスをＳｉ基板側から接触させ、加熱冷却を高速に行うことが出来る。このＰＣＲ用リアクタ内に、流路合流部で生成した液滴群が生成された順番に満たされる。液滴がＰＣＲ用リアクタ内を満たした時点で、ＰＣＲ用リアクタの入口と出口に設けられたバルブを閉じ、ＰＣＲによる核酸増幅処理が行われる。ここでは、９０℃５秒、５７℃５秒、６８℃５秒を１サイクルとして、４０サイクルの核酸増幅処理を行った。このプロセスにより、所望の核酸ターゲットが含まれた液滴中でのみ、核酸増幅処理が進み、液滴中に蛍光色素が遊離される。所望の核酸ターゲットが含まれない液滴中では、蛍光色素の遊離は生じない。
その後、ＰＣＲ用リアクタの入口、出口のバルブを開き、ポンプを用いて、液滴を生成した順番に次の光導波手段に送る。
本実施例１の光導波手段は、光源として波長６５０ｎｍの半導体レーザ、蛍光検出器として電流出力型ＰＭＴを用いて構成した。ＰＭＴからの電流出力は、ＡＤコンバータを用いてデジタル変換され、パソコンにデータを取り込んだ。取得したデータから、液滴の横断時間や、蛍光強度を解析し、液滴数の計数や、蛍光が発光している液滴の計数などを行い、核酸ターゲットの含有量を定量的に解析する。対物レンズは液滴通過位置にレーザ光が照射されるように固定されている。
光導波手段での液滴数を計数する際は、外部に設けられたポンプで、約４００ｎＬ／ｍｉｎの流速で液滴を流した。これは毎秒１００個の液滴を計数することができる流速である。
図１０は、液滴通過位置を通過した液滴の横断時間の分布を示す分布図である。液滴の横断時間は、図１で説明した通り、取得した蛍光検出器の出力信号において、閾値レベル１１０を設定し、液滴が通過したときに信号が立上りながら閾値１１０を横切るタイミングと、立下りながら横切るタイミングの間の時間を計測することで得られる。図１０に示す通り、横断時間は、３ｍｓｅｃ以下の集団と、７ｍｓｅｃ以上の集団に明確に分かれて検出されている。７ｍｓｅｃ以上の横断時間を持つ液滴は反応薬液を含む液滴であり、３ｍｓｅｃ以下の横断時間を持つ液滴は反応薬液を含まない液滴である。液滴は生成された順番を崩すことなく液滴通過位置を通過するため、横断時間の大きな変化点が、反応薬液を含む液滴群と、反応薬液を含まない液滴群の境界部分であることが分かる。この横断時間の変化点をもとに、反応薬液Ａを含む液滴群、反応薬液Ｂを含む液滴群、反応薬液Ｃを含む液滴群をそれぞれ分離して解析することが可能になり、それぞれの液滴群内での全液滴数に対する蛍光液滴の数の割合を解析することで元のサンプルに対して核酸ターゲットがどれくらい含まれていたかを判断できる。
また、図１１は、液滴通過位置を通過した液滴間のオイル部分の横断時間を示す分布図である。オイルの横断時間は液滴の場合と逆に、図８に示す通り、閾値８１０を立下りながら横切るタイミングと、立上りながら横切るタイミングの間の時間を計測することで得られる。図１１に示す通り、オイルの横断時間も６ｍｓｅｃ以上の集団と、３ｍｓｅｃ以下の集団に明確に分かれて分布している。オイルの横断時間によっても、反応薬液Ａを含む液滴群、反応薬液Ｂを含む液滴群、反応薬液Ｃを含む液滴群を明確に分離して解析することが可能である。
また、各反応薬液毎の解析は次のようにして行われる。図１０において計測開始から約５０個付近に液滴横断時間の変化点が現れる。この変化点から次の変化点（計測開始から約１０５０個付近）までの液滴が、反応薬液Ａが含まれた液滴群と判断できる。この間の約１０００個の液滴の計測データに対して、図１に示した閾値１１０と、閾値１１１の２つの閾値レベルを用いて、液滴の計数を行う。閾値１１０を立ち上がりながら横切る回数を計数することで、反応薬液Ａが含まれた全液滴数を得ることができる。その中で、閾値１１１を立ち上がりながら横切る回数を計数することで、蛍光を発する液滴、つまり検出対象である反応薬液Ａと反応することができる核酸ターゲットを含む液滴の数を得ることができる。本実施例１では、反応薬液Ａを含む液滴の総数は、１００５個であり、そのうち蛍光を発する液滴の数は、５４個であった。液滴数から割合を求めると、５．４％が核酸ターゲットを含む液滴であったことが分かる。しかし、１個の液滴中に１個の核酸ターゲットが含まれているかどうかは分からないため、ポワソン分布の考えを適応し、確率的に、１つの液滴に含まれる核酸ターゲットの個数を推定する。図１２は、蛍光液滴の割合と液滴中の核酸ターゲットの平均個数の関係を示すグラフである。図１２に示す通り、ポワソン分布の考えでは、全液滴数に対する蛍光液滴の割合から、１つの液滴に含まれる核酸ターゲットの数を想定できる。蛍光液滴の割合が５．４％の場合、１つの液滴に含まれる核酸ターゲットの数は０．０５６個と想定できる。反応薬液Ａを含む全液滴数が１００５個であるから、核酸ターゲットの数は、１００５×０．０５６＝５５．８個であることが分かる。つまり１００５個の液滴生成に使われたサンプル溶液の容量中に、反応薬液Ａと反応する核酸ターゲットが５５．８個入っていたことがわかる。
以上のようにして、反応薬液Ｂおよび反応薬液Ｃに対しても同様のプロセスを行うことによって、それぞれの反応薬液が反応する核酸ターゲットの量を測定することができる。
なお、ここでは反応薬液Ａ、Ｂ、Ｃの３種類で実験したが、反応薬液を３種類より増やしていっても同様のプロセスを行うことでそれぞれを分離検出することができる。
（実施例２）
本実施例２では、図９に示す流路合流部を用いた具体例について説明する。流路合流部以外は、実施例１で説明したものと同様の条件で測定を行った。実施例１と同様に、液滴の横断時間、および液滴間のオイル部分の横断時間を計測した。図１３は、液滴の横断時間の分布を示す分布図である。図１４は、液滴間のオイル部分の横断時間の分布を示す分布図である。図１３、図１４ともに横断時間の分布に明確な変化点が見られる。この変化点は、反応薬液を含む液滴群と、反応薬液を含まない液滴群の境界であり、この横断時間の情報を得ることによって、反応薬液毎の液滴群を分離し検出できる。それぞれの反応薬液毎の核酸ターゲットの定量解析については実施例１と同様のプロセスによって行うことができる。
（各態様に係る方法）
第１の態様に係る複数の核酸ターゲットを解析する方法は、マイクロ流路チップを用いて、複数の核酸ターゲットを解析する方法であって、
前記マイクロ流路チップは、
蛍光色素で修飾され、かつ異なる核酸ターゲットと一対一で反応する第１の反応薬液及び第２の反応薬液と、第１のオイルとが流れるための第１の供給流路と、
核酸を含むサンプル溶液が流れるための第２の供給流路と、
第２のオイルが流れるための第３の供給流路と、
前記第１の供給流路の一端と、前記第２の供給流路の一端と、前記第３の供給流路の一端とが接続される結合部である一端を有する第４の流路と、
前記第４の流路の他端と接続され前記核酸を増幅する処理を行う核酸増幅手段と、
前記核酸増幅手段と接続され、前記核酸を増幅された液滴が流れる第５の流路と、
前記第５の流路を流れる液滴を透過した透過光又は前記液滴を透過後に反射した反射光を外部に取出可能な光導波手段とを備え、
前記第１の流路の他端から前記第１の反応薬液、前記第１のオイル、前記第２の反応薬液の順に供給され、前記第２の供給流路の他端から前記核酸を含むサンプル溶液が供給され、かつ、前記第３の供給流路の他端から前記第２のオイルが供給されることにより、前記第４の流路に、少なくとも、前記第１の反応薬液および前記サンプル溶液を含む第１の液滴、前記サンプル溶液の第２の液滴、前記第２の反応薬液および前記サンプル溶液を含む第３の液滴、前記サンプル溶液の第４の液滴とが順に供給され、
前記第４の流路を流れて前記核酸増幅手段に到達した前記第１の液滴から第４の液滴が、前記核酸増幅手段により増幅され、
前記核酸増幅手段により増幅された前記第１の液滴から第４の液滴が第５の流路を流れているときに、前記光導波手段により、前記液滴群内の液滴の大きさと、前記液滴の蛍光の強度とを検出し、
検出した前記液滴群内の液滴の大きさに基づいて、所定以上の大きさを有する前記反応薬液を含む第１の液滴及び第３の液滴を含む液滴群を識別し、
検出した前記液滴の蛍光の強度に基づいて、前記サンプル溶液は、前記反応薬液を含む第１の液滴及び第３の液滴のうち、定められた閾値以上の強度の蛍光を発する液滴に含まれる反応薬液に対応するターゲットであることを解析する。
第２の態様に係る複数の核酸ターゲットを解析する方法は、一本の流路で構成された薬液タンクに、蛍光色素で修飾され、かつ異なる核酸ターゲットと一対一で反応する複数の反応薬液が前記反応薬液の種類ごとに第１のオイルを介して分離、保持された反応薬液ライブラリから前記反応薬液と前記第１のオイルとを第１の供給流路に交互に供給し、核酸を含むサンプル溶液を第２の供給流路に供給し、第２のオイルを第３の供給流路に供給する供給工程と、
前記第１の供給流路と前記第２の供給流路と前記第３の供給流路とを一本の流路に合流させて、前記第１の供給流路から供給される液体の種類に応じて、前記反応薬液を含む液滴群と、前記反応薬液を含まない液滴群と、を生成する液滴生成工程と、
前記液滴を導入し、前記液滴中の核酸を増幅する核酸増幅工程と、
通流する液滴群からの蛍光を検出して、前記液滴群内の液滴の大きさと、前記液滴の蛍光の強度とを検出する蛍光検出工程と、
検出した前記液滴群内の液滴の大きさに基づいて、前記反応薬液を含む液滴群内の液滴と、前記反応薬液を含まない液滴群内の液滴とを識別して、前記反応薬液を含む液滴群と、前記反応薬液を含まない液滴群との境界を取得する境界検出工程と、
前記境界により分離検出された前記反応薬液を含む液滴群内の、全液滴数と、定められた閾値以上の強度の蛍光を発する液滴の数とを計数する計数工程と、
を含む。
第３の態様に係る複数の核酸ターゲットを解析する方法は、一本の流路で構成された薬液タンクに、蛍光色素で修飾され、かつ異なる核酸ターゲットと一対一で反応する複数の反応薬液が前記反応薬液の種類ごとに第１のオイルを介して分離、保持された反応薬液ライブラリから前記反応薬液と前記第１のオイルとを第１の供給流路に交互に供給し、核酸を含むサンプル溶液を第２の供給流路に供給し、第２のオイルを第３の供給流路に供給する供給工程と、
前記第１の供給流路と前記第２の供給流路と前記第３の供給流路とを一本の流路に合流させて、前記第１の供給流路から供給される液体の種類に応じて、前記反応薬液を含む液滴群と、前記反応薬液を含まない液滴群と、を生成する液滴生成工程と、
前記液滴を導入し、前記液滴中の核酸を増幅する核酸増幅工程と、
通流する液滴群からの蛍光を検出して、前記液滴群内の液滴を区切るオイルの大きさ、並びに、前記液滴の蛍光の強度を検出する蛍光検出工程と、
検出した前記液滴群の液滴を区切るオイルの大きさに基づいて、前記反応薬液を含む液滴群内の液滴を区切る前記第２のオイルと、前記反応薬液を含まない液滴群内の液滴を区切る前記第１のオイルと前記第２のオイルとの混合液とを識別し、前記反応薬液を含む液滴群と、前記反応薬液を含まない液滴群の境界を取得する境界検出工程と、
前記境界により分離検出された前記反応薬液を含む液滴群内の、全液滴数と、定められた閾値以上の強度の蛍光を発する液滴の数を計数する計数工程と、
を含む。
第４の態様に係る複数の核酸ターゲットを解析する方法は、一本の流路で構成された薬液タンクに、蛍光色素で修飾され、かつ異なる核酸ターゲットと一対一で反応する複数の反応薬液が前記反応薬液の種類ごとに第１のオイルを介して分離、保持された反応薬液ライブラリから前記反応薬液と前記第１のオイルとを第１の供給流路に交互に供給し、核酸を含むサンプル溶液を第２の供給流路に供給し、第２のオイルを第３の供給流路に供給する供給工程と、
前記第１の供給流路と前記第２の供給流路とを合流させた後、さらに前記第３の供給流路を一本の流路に合流させて、前記第１の供給流路から供給される液体の種類に応じて、前記反応薬液を含む液滴群と、前記反応薬液を含まない液滴群と、を生成する液滴生成工程と、
前記液滴を導入し、前記液滴中の核酸を増幅する核酸増幅工程と、
通流する液滴群からの蛍光を検出して、前記液滴群内の液滴の大きさと、前記液滴の蛍光の強度とを検出する蛍光検出工程と、
検出した前記液滴群内の液滴の大きさに基づいて、前記反応薬液を含む液滴群内の液滴と、前記反応薬液を含まない液滴群内の液滴とを識別して、前記反応薬液を含む液滴群と、前記反応薬液を含まない液滴群との境界を取得する境界検出工程と、
前記境界により分離検出された前記反応薬液を含む液滴群内の、全液滴数と、定められた閾値以上の強度の蛍光を発する液滴の数とを計数する計数工程と、
を含む。
第５の態様に係る複数の核酸ターゲットを解析する方法は、上記第２又は第４の態様において、前記蛍光検出工程では、通流する前記液滴群内の液滴の通過時間によって前記液滴の大きさを検出してもよい。
第６の態様に係る複数の核酸ターゲットを解析する方法は、一本の流路で構成された薬液タンクに、蛍光色素で修飾され、かつ異なる核酸ターゲットと一対一で反応する複数の反応薬液が前記反応薬液の種類ごとに第１のオイルを介して分離、保持された反応薬液ライブラリから前記反応薬液と前記第１のオイルとを第１の供給流路に交互に供給し、核酸を含むサンプル溶液を第２の供給流路に供給し、第２のオイルを第３の供給流路に供給する供給工程と、
前記第１の供給流路と前記第２の供給流路とを合流させた後、さらに前記第３の供給流路を一本の流路に合流させて、前記第１の供給流路から供給される液体の種類に応じて、前記反応薬液を含む液滴群と、前記反応薬液を含まない液滴群と、を生成する液滴生成工程と、
前記液滴を導入し、前記液滴中の核酸を増幅する核酸増幅工程と、
通流する液滴群からの蛍光を検出して、前記液滴群内の液滴を区切るオイルの大きさ、並びに、前記液滴の蛍光の強度を検出する蛍光検出工程と、
検出した前記液滴群の液滴を区切るオイルの大きさに基づいて、前記反応薬液を含む液滴群内の液滴を区切る前記第２のオイルと、前記反応薬液を含まない液滴群内の液滴を区切る前記第１のオイルと前記第２のオイルとの混合液とを識別し、前記反応薬液を含む液滴群と、前記反応薬液を含まない液滴群の境界を取得する境界検出工程と、
前記境界により分離検出された前記反応薬液を含む液滴群内の、全液滴数と、定められた閾値以上の強度の蛍光を発する液滴の数を計数する計数工程と、
を含む。
第７の態様に係る複数の核酸ターゲットを解析する方法は、上記第３又は第６の態様において、前記蛍光検出工程では、通流する前記液滴群内の液滴を区切るオイルの通過時間によって前記オイルの大きさを検出してもよい。
第８の態様に係る複数の核酸ターゲットを解析する方法は、上記第１から第７のいずれかの態様において、前記第１のオイルと、前記第２のオイルとは、同一材料で構成されていてもよい。
第９の態様に係る複数の核酸ターゲットを解析する方法は、上記第１から第８のいずれかの態様において、前記反応薬液ライブラリ内の前記蛍光色素は、単一種類の材料で構成されていてもよい。
第１０の態様に係る複数の核酸ターゲットを解析する方法は、上記第１から第９のいずれかの態様において、さらに、前記一本の流路中を生成された順番に通流する前記増幅された核酸を含む液滴に光を照射する光照射工程を含んでもよい。
第１１の態様に係るマイクロ流路チップは、一本の流路で構成された薬液タンクに、蛍光色素で修飾され、かつ異なる核酸ターゲットと一対一で反応する複数の反応薬液が前記反応薬液の種類ごとに第１のオイルを介して分離、保持された反応薬液ライブラリから前記反応薬液と前記第１のオイルとが交互に供給される第１の供給流路と、核酸を含むサンプル溶液が供給される第２の供給流路と、第２のオイルを供給する第３の供給流路とを、一本の流路に合流させて、前記第１の供給流路から供給される液体の種類に応じて、前記反応薬液を含む液滴群と、前記反応薬液を含まない液滴群と、を生成する流路の合流部と、
前記液滴群を導入し、前記液滴群内の液滴中の核酸を増幅する核酸増幅手段と、
前記一本の流路中を生成された順番に通流する前記増幅された核酸を含む液滴に外部からの光が透過可能であって、前記液滴を透過した透過光又は前記液滴を透過後に反射した反射光を外部に取出可能な光導波手段と、
を備える。
第１２の態様に係る核酸ターゲット解析装置は、核酸を含むサンプル溶液と、蛍光色素で修飾され且つ異なる核酸ターゲットと一対一で反応する反応薬液とからなる液滴からの蛍光を検出して、核酸ターゲットを検出する核酸ターゲット解析装置であって、
一本の流路内を通流する前記反応薬液を含む液滴群と、前記反応薬液を含まない液滴群とからの蛍光を検出して、前記液滴群内の液滴の大きさと、前記液滴の蛍光の強度とを検出する蛍光検出手段と、
検出した前記液滴群内の液滴の大きさに基づいて、前記反応薬液を含む液滴群内の液滴と、前記反応薬液を含まない液滴群内の液滴とを識別して、前記反応薬液を含む液滴群と、前記反応薬液を含まない液滴群との境界を取得する境界検出手段と、
前記境界により分離検出された前記反応薬液を含む液滴群内の、全液滴数と、定められた閾値以上の強度の蛍光を発する液滴の数とを計数する計数手段と、を備える。
本開示に係る核酸ターゲットの解析方法は、血液など採取した検体から解析対象の核酸ターゲットの量を定量的に解析するマイクロ流路デバイスに活用できる。特に、複数の解析対象の核酸ターゲットの含有量を同時に解析する場合に有用である。本開示によって、複数の核酸ターゲットを同時に解析する場合でも、マイクロ流路デバイスの流路構成、および蛍光検出を行う光学検出系を非常に簡単な構成で実現することができるため、テーラーメード医療の現場で利用でき、迅速、簡便な診断装置として特に有用である。
１０１ 反応薬液を含む液滴群
１０２ 反応薬液を含む液滴群
１０３ 反応薬液を含まない液滴群
１０４ 反応薬液を含まない液滴群
１０５ 核酸ターゲットを含み蛍光を発する液滴
１０６ 蛍光を発しない液滴
１０７ 蛍光を発する液滴からの光信号
１０８ 蛍光を発しない液滴からの光信号
１０９ 反応薬液を含まない液滴からの光信号
１１０ 液滴数を計数するための閾値レベル
１１１ 蛍光を発する液滴数を計数するための閾値レベル
１１２ 反応薬液を含む液滴の横断時間
１１３ 反応薬液を含まない液滴の横断時間
２０１ 薬液タンク
２０２ 薬液タンクの排出口
２０３ 反応薬液
２０４ 第１のオイル
２０５ 空気孔
３０１ Ｓｉ基板などの基材
３０２ ガラス板
３０３ 流路
３０４ マイクロ流路チップ
３０５ 前処理手段
３０６ 流路合流部
３０７ ＰＣＲ用リアクタ（核酸増幅手段）
３０８ 光導波手段
３０９ 検体供給口
３１０ 反応薬液供給口
３１１ オイル供給口
４０１ 第１の供給流路
４０２ 第２の供給流路
４０３ 第３の供給流路
４０４ 流路の結合点（第４の流路の一端）
４０５ 反応薬液
４０６ 第１のオイル
４０７ サンプル溶液
４０８ 第２のオイル
４０９ 反応薬液を含む液滴
４１０ 反応薬液を含まない液滴
５０１ ＰＣＲ用リアクタ
５０２ ギャップ
５０３ 供給口
５０４ 排出口
５０５ 反応薬液を含む液滴
５０６ 反応薬液を含まない液滴
６０１ 一本鎖核酸
６０２ 一本鎖核酸
６０３ フォワードプライマ
６０４ リバースプライマ
６０５ プローブ
６０６ 蛍光色素
６０７ 消光剤
７００ マイクロ流路チップ
７０１ Ｓｉ基板などの基材
７０２ ガラス板
７０３ 第５の流路
７０４ 液滴
７０５ レーザ

７０６ コリメータ
７０７ ダイクロイックミラー
７０８ 対物レンズ
７０９ 光学フィルタ
７１０ レンズ
７１１ ピンホール
７１２ ＰＭＴ
８０１ 反応薬液を含む液滴群
８０２ 反応薬液を含む液滴群
８０３ 反応薬液を含まない液滴群
８０４ 反応薬液を含まない液滴群
８０５ 核酸ターゲットを含み蛍光を発する液滴
８０６ 蛍光を発しない液滴
８０７ 蛍光を発する液滴からの光信号
８０８ 蛍光を発しない液滴からの光信号
８０９ 反応薬液を含まない液滴からの光信号
８１０ 液滴数を計数するための閾値レベル
８１１ 蛍光を発する液滴数を計数するための閾値レベル
８１２ 反応薬液を含む液滴の横断時間
８１３ 反応薬液を含まない液滴の横断時間
９０１ 第１の供給流路
９０２ 第２の供給流路
９０３ 第３の供給流路
９０４ 流路の結合点
９０５ 反応薬液
９０６ 第１のオイル
９０７ サンプル溶液
９０８ 第２のオイル
９０９ 反応薬液を含む液滴
９１０ 反応薬液を含まない液滴
９１１ 流路の結合点

Claims (13)

  1. マイクロ流路チップを用いて、第１の核酸ターゲットおよび第２の核酸ターゲットを検出する検出方法であって、
    （ａ）検出装置にマイクロ流路チップを設置し、
    前記検出装置は、
    ＰＣＲ処理部と、ＰＣＲリアクタと、蛍光検出部と、検出回路とを備え、
    前記マイクロ流路チップは、
    第１の流路と、第２の流路と、第３の流路と、第４の流路と、第５の流路とを備え、
    前記第４の流路に、前記第１の流路の一端と、前記第２の流路の一端と、前記第３の流路の一端とが接続され、
    前記ＰＣＲリアクタは、前記第４の流路及び前記第５の流路の間に位置し、
    （ｂ）（ｉ）前記第１の流路の他端から、第１の水溶液、第１のオイル、および第２の水溶液を、この順で供給し、（ｉｉ）前記第２の流路の他端から、サンプル水溶液が供給し、および（ｉｉｉ）前記第３の流路の他端から、第２のオイルを供給することにより、前記第４の流路に、前記第１の水溶液および前記サンプル水溶液からなる第１の液滴と、前記サンプル水溶液からなる第２の液滴と、前記第２の水溶液および前記サンプル水溶液からなる第３の液滴と、前記サンプル水溶液からなる第４の液滴とを、この順に通過させ、
    ここで、前記第１の水溶液は、前記第１の核酸ターゲットと相補的な配列を有する第１のＤＮＡを有し、前記第１のＤＮＡは第１の蛍光色素で修飾され、前記第２の水溶液は、前記第２の核酸ターゲットと相補的な配列を有する第２のＤＮＡを有し、前記第２のＤＮＡは第２の蛍光色素で修飾され、
    （ｃ）前記第４の流路を通過して前記ＰＣＲリアクタに到達した前記第１の液滴から前記第４の液滴を、前記ＰＣＲ処理部によりＰＣＲ処理し、前記第５の流路に前記ＰＣＲ処理された前記第１の液滴から前記第４の液滴を通過させ、
    （ｄ）前記第１の液滴から第４の液滴が前記第５の流路を流れているときに、前記蛍光検出部により、前記第１の液滴から前記第４の液滴から出力される蛍光強度を検出し、
    （ｅ）前記蛍光強度に基づいて、前記第５の流路の流路を流れる前記第１の液滴から前記第４の液滴までのそれぞれの間の境界を取得し、
    （ｆ）前記検出回路により、前記蛍光強度と、前記第１の液滴から前記第４の液滴までのそれぞれの間の境界とに基づいて、第１の閾値以上の蛍光強度を有する前記第２の液滴及び前記第４の液滴の数を取得し、かつ、前記第２の液滴及び前記第４の液滴の数に基づいて、前記サンプル水溶液に、前記第１の核酸ターゲット及び前記第２の核酸ターゲットからなる群から選択される少なくとも１つが含まれているか否かを検出する、
    検出方法。
  2. 前記工程（ｂ）において、（ｉｖ）前記第１の流路を流れる前記第１の水溶液、前記第１のオイル、および前記第２の水溶液の流速と、（ｖ）前記第２の流路を流れる前記サンプル水溶液の流速と、（ｖｉ）前記第３の流路を流れる前記第２のオイルの流速とは、一定である、
    請求項１に記載の核酸ターゲットの検出方法。
  3. 前記第４の流路の一端は、前記第１の流路の一端、前記第２の流路の一端、および前記第３の流路の一端と接続されている、
    請求項１に記載の核酸ターゲットの検出方法。
  4. 前記第４の流路の一端は、前記第１の流路の一端、および前記第２の流路の一端と接続されており、
    前記第３の流路の一端は、前記第４の流路の前記一端及び前記他端の間と接続されている、
    請求項１に記載の核酸ターゲットの検出方法。
  5. 前記工程（ｄ）において、複数の蛍光強度の変化を検出し、ここで、前記複数の蛍光強度の変化は、第２の閾値以上の前記蛍光強度の変化であり、
    前記工程（ｅ）において、前記複数の蛍光強度の変化を検出した位置のそれぞれに基づいて、（ｖｉｉ）前記第１の液滴及び前記第２の液滴の間の境界、（ｖｉｉｉ）前記第２の液滴及び前記第３の液滴の間の境界、（ｖｉｉｉ）前記第３の液滴及び前記第４の液滴の間の境界、および（ｉｘ）前記第４の液滴及び前記第１の液滴の間の境界からなる群から選択される少なくとも１つの境界として取得することにより、複数の境界を取得する、請求項１に記載の核酸ターゲットの検出方法。
  6. 前記複数の蛍光強度の変化は、第１の蛍光強度の変化と、第２の蛍光強度の変化とを含み、
    前記工程（ｅ）において、前記第１の蛍光強度の変化が検出された時刻と、前記第２の蛍光強度の変化が検出された時刻との間の時間間隔に基づいて、前記第２の液滴及び前記第４の液滴を特定することにより、前記第１の液滴から前記第４の液滴までのそれぞれの間の境界を取得する、
    請求項５に記載の核酸ターゲットの検出方法。
  7. 前記工程（ｅ）において、前記時間間隔が所定時間以上である場合、前記第２の蛍光強度の変化に対応する境界を、（ｖｉｉｉ）前記第２の液滴及び前記第３の液滴の間の境界、又は（ｘ）前記第４の液滴及び前記第１の液滴の間の境界として取得する、
    請求項６に記載の核酸ターゲットの検出方法。
  8. 前記工程（ｅ）において、前記時間間隔が所定時間より短い場合、前記第２の蛍光強度の変化に対応する境界を、（ｖｉｉ）前記第１の液滴及び前記第２の液滴の間の境界、または
    （ｉｘ）前記第３の液滴及び前記第４の液滴の間の境界として取得する、
    請求項６に記載の核酸ターゲットの検出方法。
  9. 前記第１のオイルと前記第２のオイルとは、同じ材料である、
    請求項１に記載の核酸ターゲットの検出方法。
  10. 前記第１の蛍光色素と前記第２の蛍光色素とは、同じ材料である、
    請求項１に記載の核酸ターゲットの検出方法。
  11. さらに、前記（ｃ）と前記（ｄ）の間に、光源により、前記第５の流路の流路を流れる前記第１の液滴から前記第４の液滴に光を照射する、
    請求項１に記載の核酸ターゲットの検出方法。
  12. マイクロ流路チップを用いた検出装置であって、
    前記マイクロ流路チップは、流路を有し、
    前記流路は、前記第１の水溶液液および前記サンプル水溶液からなる第１の液滴と、前記サンプル水溶液からなる第２の液滴と、前記第２の水溶液および前記サンプル水溶液からなる第３の液滴と、前記サンプル水溶液からなる第４の液滴とが流れ、
    ここで、前記サンプル溶液は、対象の核酸ターゲットを含み、
    前記第１の水溶液は、前記第１の核酸ターゲットと相補的な配列を有する第１のＤＮＡを有し、前記第１のＤＮＡは第１の蛍光色素で修飾され、前記第２の水溶液は、前記第２の核酸ターゲットと相補的な配列を有する第２のＤＮＡを有し、前記第２のＤＮＡは第２の蛍光色素で修飾され、
    前記流路を流れる前記第１の液滴から前記第４の液滴に、ＰＣＲ処理するＰＣＲリアクタと、
    前記ＰＣＲ処理後の前記第１の液滴から前記第４の液滴から出力される蛍光強度を検出する蛍光検出部と、
    （ｘｉ）前記蛍光強度に基づいて、前記第５の流路の流路を流れる前記第１の液滴から前記第４の液滴までのそれぞれの間の境界を取得し、（ｘｉｉ）前記蛍光強度と、前記第１の液滴から前記第４の液滴までのそれぞれの間の境界とに基づいて、第１の閾値以上の蛍光強度を有する前記第２の液滴及び前記第４の液滴の数を取得し、かつ、（ｘｉｉｉ）前記第２の液滴及び前記第４の液滴の数に基づいて、前記対象の核酸ターゲットに、前記第１の核酸ターゲット及び前記第２の核酸ターゲットからなる群から選択される少なくとも１つが含まれているか否かを検出する検出回路とを備える、
    検出装置。
  13. マイクロ流路チップを用いて、第１の核酸ターゲットおよび第２の核酸ターゲットを定量する定量方法であって、
    （ａ）定量装置にマイクロ流路チップを設置し、
    前記定量装置は、
    ＰＣＲ処理部と、ＰＣＲリアクタと、蛍光検出部と、定量回路とを備え、
    前記マイクロ流路チップは、
    第１の流路と、第２の流路と、第３の流路と、第４の流路と、第５の流路とを備え、
    前記第４の流路に、前記第１の流路の一端と、前記第２の流路の一端と、前記第３の流路の一端とが接続され、
    前記ＰＣＲリアクタは、前記第４の流路及び前記第５の流路の間に位置し、
    （ｂ）（ｉ）前記第１の流路の他端から、第１の水溶液、第１のオイル、および第２の水溶液を、この順で供給し、（ｉｉ）前記第２の流路の他端から、サンプル水溶液が供給し、および（ｉｉｉ）前記第３の流路の他端から、第２のオイルを供給することにより、前記第４の流路に、前記第１の水溶液および前記サンプル水溶液からなる第１の液滴と、前記サンプル水溶液からなる第２の液滴と、前記第２の水溶液および前記サンプル水溶液からなる第３の液滴と、前記サンプル水溶液からなる第４の液滴とを、この順に通過させ、
    ここで、前記サンプル溶液は、前記第１の核酸ターゲットおよび前記第２の核酸ターゲットを含み、前記第１の水溶液は、前記第１の核酸ターゲットと相補的な配列を有する第１のＤＮＡを有し、前記第１のＤＮＡは第１の蛍光色素で修飾され、前記第２の水溶液は、前記第２の核酸ターゲットと相補的な配列を有する第２のＤＮＡを有し、前記第２のＤＮＡは第２の蛍光色素で修飾され、
    （ｃ）前記第４の流路を通過して前記ＰＣＲリアクタに到達した前記第１の液滴から前記第４の液滴を、前記ＰＣＲ処理部によりＰＣＲ処理し、前記第５の流路に前記ＰＣＲ処理された前記第１の液滴から前記第４の液滴を通過させ、
    （ｄ）前記第１の液滴から第４の液滴が前記第５の流路を流れているときに、前記蛍光検出部により、前記第１の液滴から前記第４の液滴から出力される蛍光強度を検出し、
    （ｅ）前記蛍光強度に基づいて、前記第５の流路の流路を流れる前記第１の液滴から前記第４の液滴までのそれぞれの間の境界を取得し、
    （ｆ）前記定量回路により、前記蛍光強度と、前記第１の液滴から前記第４の液滴までのそれぞれの間の境界とに基づいて、第１の閾値以上の蛍光強度を有する前記第２の液滴及び前記第４の液滴の数を取得し、かつ、前記第２の液滴及び前記第４の液滴の数に基づいて、前記サンプル水溶液に含まれる前記第１の核酸ターゲットの量及び前記第２の核酸ターゲットの量を定量する、
    検出方法。
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