CN113028993B - 一种用于描述微滴式数字pcr液滴相对位置的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种用于描述微滴式数字PCR液滴相对位置的方法，该方法是利用液滴与靶标的相对位置关系的唯一性，以靶标为中心，依据靶标与液滴的相对位置关系，得出一种位置描述符，依据该位置描述符，可提高微滴式数字PCR图像的拼接速度，同时，还可以量化各个图像之间微液滴移动的程度，进而提供一种实验可靠性的描述。

Description

一种用于描述微滴式数字PCR液滴相对位置的方法

技术领域

本发明涉及微滴式数字PCR技术领域，尤其涉及一种用于描述微滴式数字PCR液滴相对位置的方法。

背景技术

微滴式数字PCR是一种核酸分子绝对定量技术，该技术首先通过将大量稀释后的核酸溶液分散至微液滴中(每个微液滴的核酸模板数少于或者等于1个)，然后经过PCR扩增，有一个核酸分子模板的液滴就会发出荧光信号，而没有核酸分子模板的液滴就没有荧光信号，最后根据相对比例和液滴的体积，基于泊松分布模型，就可以推算出原始溶液的核酸浓度。而为了提高检测能力，一般会检测多个靶点的荧光信号，因此，需要多个荧光通道的图像对样本进行分析。

荧光信号由CCD相机拍照取得，但由于微液滴平铺在专用的芯片上，相对CCD相机的成像面积较大。如果一次性拍摄整个芯片，得到的图像可能会出现曝光不均匀的现象，进而导致测得的荧光信号值不准确。因此，在实际操作时，常常采用多幅图像拼接的方式，得到整张芯片的图像。

而传统的图像拼接技术主要是采用SIFT、ORB等算法来做特征匹配。但是，由于数字PCR图像上的液滴与液滴之间、靶标与靶标之间的差异极小，这些算法运用在数字PCR图像上，可能会因为区分度太低，进而导致拼接失败，此外，数字PCR图像分辨率很高，图片较大，应用传统的特征提取算法运算量大，进而降低拼接速度。而微液滴浸泡在专用的液滴检测油中，可能会因受到环境因素影响，产生移动，因此，实际需要一种方法来描述这种变化程度，以给出量化指标，进而提高图像的拼接速度。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于描述微滴式数字PCR液滴相对位置的方法，该方法是利用液滴与靶标的相对位置关系的唯一性，以靶标为中心，依据靶标与液滴的相对位置关系，得出一种位置描述符，依据该位置描述符，可提高微滴式数字PCR图像的拼接速度，同时，还可以量化各个图像之间微液滴移动的程度，进而提供一种实验可靠性的描述。

为实现上述目的，采用以下技术方案：

一种用于描述微滴式数字PCR液滴相对位置的方法，包括以下步骤：

S1：基于CCD相机获取包含有靶标和若干液滴的芯片部分区域的若干图像信息；

S2：基于S1获取的其中一图像信息，对其进行预处理；

S3：基于S2预处理后的图像信息，检测出该图像信息中的靶标和若干液滴的位置；

S4：以靶标作为参考点，计算每一液滴与靶标之间的相对偏移量信息；

S5：基于S4获取的每一液滴与靶标之间的相对偏移量信息，排除位于靶标周侧外围的外围液滴，外围液滴指该液滴中心与靶标中心之间的连线与其他相邻的液滴相交；

S6：将外围液滴排除后，依据余下的液滴与靶标之间的相对偏移量信息，获取该图像信息的位置描述符，该位置描述符指将余下的每一液滴与靶标之间的相对偏移量信息作为其内部元素的向量；

S7：对S1中获取的若干图像信息，依次执行S2～S6，进而获取每一图像信息的位置描述符，并计算相邻两张图像信息的位置描述符之间的欧式距离。

进一步地，所述S1中的图像信息包括：

明场图像信息：在成像过程中依靠透射光直接成像而得到的图片；

荧光通道图像信息：在成像过程中放置滤镜而得到的图片。

进一步地，所述S2包括以下步骤：

S21：对图像信息进行灰度变换处理；

S22：基于高斯滤波算法对图像信息进行滤波降噪处理；

S23：基于canny边缘检测算法，获取图像的边沿信息。

进一步地，所述S21包括以下步骤：

S211：针对明场图像信息，采用以下公式将其转换成灰度图像；

I＝0.299×R+0.587×G+0.114×B，

其中，R、G、B分别代表彩色图像的红色、绿色和蓝色的通道信号；

S212：针对荧光通道图像信息，依据荧光信号的波长范围，选择彩色图像中的固定通道作为灰度图像。

进一步地，所述S3包括以下步骤：

S31：基于Hough变换的圆检测算法检测靶标在图像信息中的位置；

S32：针对明场图像信息，通过Hough变换的圆检测算法检测液滴在图像信息中的位置；

S33：针对荧光通道图像信息，通过连通区域计算算法检测液滴在图像信息中的位置，并排除干扰信息。

进一步地，所述S33中排除干扰信息包括以下步骤：

S331：通过以下公式计算获取每一液滴的圆度，并预设第一阈值，且当该圆度小于该第一阈值时，将其排除；

其中，C为液滴的圆度，S和P分别为液滴的面积和周长；

S332：预设最低阈值和最高阈值，当液滴的直径不在最低阈值和最高阈值之间时，将该液滴排除。

进一步地，所述S4中的液滴与靶标之间的相对偏移量信息包括：

距离信息：液滴中心与靶标中心之间连线的长度；

角度信息：液滴中心和靶标中心的连线，与以靶标中心为起点水平向右的水平线之间的夹角。

进一步地，所述S5包括以下步骤：

S51：基于获取的每一液滴中心与靶标中心的距离信息，查找离靶标中心距离最小的液滴的位置，并将该液滴作为第一参考液滴；

S52：以第一参考液滴为起点，按顺时针方向将位于靶标周侧的液滴依次排列，得到液滴集合S＝{d₁、d₂、d₃、d₄、d₅Λ}；

S53：依次将集合S中的液滴的中心与靶标中心连线，并判断该连线是否会与集合S中的其他液滴相交，若相交，则将该液滴视为外围液滴，并从集合S中将该液滴排除，若不相交，则在集合S中保留该液滴，并继续判断下一液滴的中心与靶标中心的连线是否与集合S中的其他液滴相交，直至将集合S中的外围液滴全部排除。

进一步地，所述S6包括以下步骤：

S61：查找集合S中离靶标中心距离最小的液滴的位置，并该液滴作为第二参考液滴；

S62：以第二参考液滴为起点，按顺时针方向将集合S中的液滴依次排列，得到新的液滴集合S’＝{d₁’、d₂’、d₃’、d₄’、d₅’Λ}；

S63：将集合S’中的每一液滴的中心与靶标中心的距离信息作为描述符的元素，得到图像信息的位置描述符。

进一步地，所述S7中的欧式距离的计算公式如下：

其中，D_i和D_j分别表示第i个和第j个位置描述符，d_ik和d_jk表示描述符的第k个元素分量。

采用上述方案，本发明的有益效果是：

该方法是利用液滴与靶标的相对位置关系的唯一性，以靶标为中心，依据靶标与液滴的相对位置关系，得出一种位置描述符，依据该位置描述符，可提高微滴式数字PCR图像的拼接速度，同时，还可以量化各个图像之间微液滴移动的程度，进而提供一种实验可靠性的描述。

附图说明

图1为本发明的流程性框图；

图2为本发明的其中一实施例中，一个可用三维向量表示的位置描述符的示意图；

图3为本发明的其中一实施例中，外围液滴的示意图；

图4为本发明的其中一实施例中，液滴相对靶标的角度的示意图；

其中，附图标识说明：

1—靶标；2—液滴。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例，对本发明进行详细说明。

参照图1至4所示，本发明提供一种用于描述微滴式数字PCR液滴相对位置的方法，包括以下步骤：

S1：基于CCD相机获取包含有靶标1和若干液滴2的芯片部分区域的若干图像信息；

S2：基于S1获取的其中一图像信息，对其进行预处理；

S3：基于S2预处理后的图像信息，检测出该图像信息中的靶标1和若干液滴2的位置；

S4：以靶标1作为参考点，计算每一液滴2与靶标1之间的相对偏移量信息；

S5：基于S4获取的每一液滴2与靶标1之间的相对偏移量信息，排除位于靶标1周侧外围的外围液滴，外围液滴指该液滴2中心与靶标1中心之间的连线与其他相邻的液滴2相交；

S6：将外围液滴排除后，依据余下的液滴2与靶标1之间的相对偏移量信息，获取该图像信息的位置描述符，该位置描述符指将余下的每一液滴2与靶标1之间的相对偏移量信息作为其内部元素的向量；

S7：对S1中获取的若干图像信息，依次执行S2～S6，进而获取每一图像信息的位置描述符，并计算相邻两张图像信息的位置描述符之间的欧式距离。

其中，所述S1中的图像信息包括：

明场图像信息：在成像过程中依靠透射光直接成像而得到的图片；

荧光通道图像信息：在成像过程中放置滤镜而得到的图片。

所述S2包括以下步骤：

S21：对图像信息进行灰度变换处理；

S22：基于高斯滤波算法对图像信息进行滤波降噪处理；

S23：基于canny边缘检测算法，获取图像的边沿信息。

所述S21包括以下步骤：

S211：针对明场图像信息，采用以下公式将其转换成灰度图像；

I＝0.299×R+0.587×G+0.114×B，

其中，R、G、B分别代表彩色图像的红色、绿色和蓝色的通道信号；

S212：针对荧光通道图像信息，依据荧光信号的波长范围，选择彩色图像中的固定通道作为灰度图像。

所述S3包括以下步骤：

S31：基于Hough变换的圆检测算法检测靶标1在图像信息中的位置；

S32：针对明场图像信息，通过Hough变换的圆检测算法检测液滴2在图像信息中的位置；

S33：针对荧光通道图像信息，通过连通区域计算算法检测液滴2在图像信息中的位置，并排除干扰信息。

所述S33中排除干扰信息包括以下步骤：

S331：通过以下公式计算获取每一液滴2的圆度，并预设第一阈值，且当该圆度小于该第一阈值时，将其排除；

其中，C为液滴2的圆度，S和P分别为液滴2的面积和周长；

S332：预设最低阈值和最高阈值，当液滴2的直径不在最低阈值和最高阈值之间时，将该液滴2排除。

所述S4中的液滴2与靶标1之间的相对偏移量信息包括：

距离信息：液滴2中心与靶标1中心之间连线的长度；

角度信息：液滴2中心和靶标1中心的连线，与以靶标1中心为起点水平向右的水平线之间的夹角。

所述S5包括以下步骤：

S51：基于获取的每一液滴2中心与靶标1中心的距离信息，查找离靶标1中心距离最小的液滴2的位置，并将该液滴2作为第一参考液滴；

S52：以第一参考液滴为起点，按顺时针方向将位于靶标1周侧的液滴2依次排列，得到液滴2集合S＝{d₁、d₂、d₃、d₄、d₅Λ}；

S53：依次将集合S中的液滴2的中心与靶标1中心连线，并判断该连线是否会与集合S中的其他液滴2相交，若相交，则将该液滴2视为外围液滴，并从集合S中将该液滴2排除，若不相交，则在集合S中保留该液滴2，并继续判断下一液滴2的中心与靶标1中心的连线是否与集合S中的其他液滴2相交，直至将集合S中的外围液滴全部排除。

所述S6包括以下步骤：

S61：查找集合S中离靶标1中心距离最小的液滴2的位置，并该液滴2作为第二参考液滴；

S62：以第二参考液滴为起点，按顺时针方向将集合S中的液滴2依次排列，得到新的液滴集合S’＝{d₁’、d₂’、d₃’、d₄’、d₅’Λ}；

S63：将集合S’中的每一液滴2的中心与靶标1中心的距离信息作为描述符的元素，得到图像信息的位置描述符。

所述S7中的欧式距离的计算公式如下：

其中，D_i和D_j分别表示第i个和第j个位置描述符，d_ik和d_jk表示描述符的第k个元素分量。

本发明工作原理：

继续参照图1至4所示，该方法中涉及到的专业术语解释如下：

明场图像信息：在成像过程中依靠透射光直接成像而得到的图片；

荧光通道图像信息：在成像过程中放置滤镜而得到的图片；

靶标1：制作芯片时，在芯片上固定位置预留的圆形标记，其边缘特征明显，易于图像识别；

外围液滴：指该液滴2中心与靶标1中心之间的连线与其他相邻的液滴2相交，如图3中的1号液滴；

位置描述符：用一个向量作为图像中的关键点的描述；

欧式距离：指在n维空间中两个点之间的真实距离；

该方法首先通过CCD相机获取芯片部分区域的若干图像信息，并对每一图像信息进行预处理，以保证图像的清晰度；预处理包括灰度变换处理和滤波降噪处理，具体地，对于明场图像信息，采用以下公式将其转换成灰度图像，

I＝0.299×R+0.587×G+0.114×B，

其中，R、G、B分别代表彩色图像的红色、绿色和蓝色的通道信号。

而对于荧光通道图像信息，则依据荧光信号的波长范围，选择彩色图像中的固定通道作为灰度图像；随后，再利用高斯滤波算法对图像信息进行滤波降噪处理，以滤除部分噪声，此时，图片相对比较清晰，最后再经canny边缘检测算法，即可获取图像的边沿信息。

在对图像进行预处理后，随后需要检测图像中的靶标1和液滴2的位置，对于靶标1，通过Hough变换的圆检测算法即可检测其位置，而对于液滴2位置的检测，则分为两种情况：其一是针对明场图像信息，通过Hough变换的圆检测算法即可，而对于荧光通道图像信息，则需要通过连通区域计算算法检测液滴2在图像信息中的位置，并排除干扰信息；排出干扰信息的方式有两种：

其一是通过以下公式计算液滴2的圆度，并预设第一阈值，且当该圆度小于该第一阈值时，认定其为干扰点，将其排除。本实施例中，该第一阈值为0.9。

其中，C为液滴2的圆度，S和P分别为液滴2的面积和周长。

其二是通过判断液滴2的直径是否位于预设的最低阈值和最高阈值之间，若不是，则视为干扰点，将其排除，本实施例中，最低阈值为35，最高阈值为38。

在找到靶标1和液滴2的位置后，就可以将靶标1作为参考点，计算每一液滴2与靶标1之间的相对偏移量信息，该相对偏移量信息包括距离信息(液滴2中心与靶标1中心之间连线的长度)和角度信息(液滴2中心和靶标1中心的连线，与以靶标1中心为起点水平向右的水平线之间的夹角，夹角取值为0～360°)；随后，为降低描述符的维度，本方法将外围液滴排除，具体的，首先基于获取的每一液滴2中心与靶标1中心的距离信息，查找离靶标1中心距离最小的液滴2的位置，并将该液滴2作为第一参考液滴，随后，以第一参考液滴为起点，按顺时针方向将位于靶标1周侧的液滴2依次排列，得到液滴集合S＝{d₁、d₂、d₃、d₄、d₅Λ}，最后，依次将集合S中的液滴2的中心与靶标1中心连线，并判断该连线是否会与集合S中的其他液滴2相交，若相交，则将该液滴2视为外围液滴(如图3中的1号液滴)，并从集合S中将该液滴2排除，若不相交，则在集合S中保留该液滴2，并继续判断下一液滴2的中心与靶标1中心的连线是否与集合S中的其他液滴2相交，直至将集合S中的外围液滴全部排除。

在外围液滴排除后，就可以依据集合S中余下的液滴2与靶标1之间的距离信息，获取该图像的位置描述符，具体的，首先查找集合S中离靶标1中心距离最小的液滴2的位置，并该液滴2作为第二参考液滴，以第二参考液滴为起点，按顺时针方向将集合S中的液滴2依次排列，得到新的液滴集合S’＝{d₁’、d₂’、d₃’、d₄’、d₅’Λ}，最后，将集合S’中的每一液滴2的中心与靶标1中心的距离信息作为描述符的元素，得到图像信息的位置描述符D，随后，对获取的其他图像依次执行上述步骤，进而可获取每一图像的位置描述符，然后计算位置描述符之间的欧式距离，进行匹配，得到相邻两张图像之间的相对位置关系，同时，将其作为液滴2移动程度的量化指标，其中，欧式距离的计算公式为：

其中，D_i和D_j分别表示第i个和第j个位置描述符，d_ik和d_jk表示描述符的第k个元素分量。

以上仅为本发明的较佳实施例而已，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种用于描述微滴式数字PCR液滴相对位置的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：基于CCD相机获取包含有靶标和若干液滴的芯片部分区域的若干图像信息；

S2：基于S1获取的其中一图像信息，对其进行预处理；

S3：基于S2预处理后的图像信息，检测出该图像信息中的靶标和若干液滴的位置；

S4：以靶标作为参考点，计算每一液滴与靶标之间的相对偏移量信息；

S5：基于S4获取的每一液滴与靶标之间的相对偏移量信息，排除位于靶标周侧外围的外围液滴，外围液滴指该液滴中心与靶标中心之间的连线与其他相邻的液滴相交；

S6：将外围液滴排除后，依据余下的液滴与靶标之间的相对偏移量信息，获取该图像信息的位置描述符，该位置描述符指将余下的每一液滴与靶标之间的相对偏移量信息作为其内部元素的向量；

S7：对S1中获取的若干图像信息，依次执行S2～S6，进而获取每一图像信息的位置描述符，并计算相邻两张图像信息的位置描述符之间的欧式距离；

所述S4中的液滴与靶标之间的相对偏移量信息包括：

距离信息：液滴中心与靶标中心之间连线的长度；

角度信息：液滴中心和靶标中心的连线，与以靶标中心为起点水平向右的水平线之间的夹角；

所述S5包括以下步骤：

S51：基于获取的每一液滴中心与靶标中心的距离信息，查找离靶标中心距离最小的液滴的位置，并将该液滴作为第一参考液滴；

S52：以第一参考液滴为起点，按顺时针方向将位于靶标周侧的液滴依次排列，得到液滴集合S＝{d₁、d₂、d₃、d₄、d₅Λ}；

S53：依次将集合S中的液滴的中心与靶标中心连线，并判断该连线是否会与集合S中的其他液滴相交，若相交，则将该液滴视为外围液滴，并从集合S中将该液滴排除，若不相交，则在集合S中保留该液滴，并继续判断下一液滴的中心与靶标中心的连线是否与集合S中的其他液滴相交，直至将集合S中的外围液滴全部排除。

2.根据权利要求1所述的用于描述微滴式数字PCR液滴相对位置的方法，其特征在于，所述S1中的图像信息包括：

明场图像信息：在成像过程中依靠透射光直接成像而得到的图片；

荧光通道图像信息：在成像过程中放置滤镜而得到的图片。

3.根据权利要求2所述的用于描述微滴式数字PCR液滴相对位置的方法，其特征在于，所述S2包括以下步骤：

S21：对图像信息进行灰度变换处理；

S22：基于高斯滤波算法对图像信息进行滤波降噪处理；

S23：基于canny边缘检测算法，获取图像的边沿信息。

4.根据权利要求3所述的用于描述微滴式数字PCR液滴相对位置的方法，其特征在于，所述S21包括以下步骤：

S211：针对明场图像信息，采用以下公式将其转换成灰度图像；

I＝0.299×R+0.587×G+0.114×B，

其中，R、G、B分别代表彩色图像的红色、绿色和蓝色的通道信号；

S212：针对荧光通道图像信息，依据荧光信号的波长范围，选择彩色图像中的固定通道作为灰度图像。

5.根据权利要求4所述的用于描述微滴式数字PCR液滴相对位置的方法，其特征在于，所述S3包括以下步骤：

S31：基于Hough变换的圆检测算法检测靶标在图像信息中的位置；

S32：针对明场图像信息，通过Hough变换的圆检测算法检测液滴在图像信息中的位置；

S33：针对荧光通道图像信息，通过连通区域计算算法检测液滴在图像信息中的位置，并排除干扰信息。

6.根据权利要求5所述的用于描述微滴式数字PCR液滴相对位置的方法，其特征在于，所述S33中排除干扰信息包括以下步骤：

S331：通过以下公式计算获取每一液滴的圆度，并预设第一阈值，且当该圆度小于该第一阈值时，将其排除；

其中，C为液滴的圆度，S和P分别为液滴的面积和周长；

S332：预设最低阈值和最高阈值，当液滴的直径不在最低阈值和最高阈值之间时，将该液滴排除。

7.根据权利要求1所述的用于描述微滴式数字PCR液滴相对位置的方法，其特征在于，所述S6包括以下步骤：

S61：查找集合S中离靶标中心距离最小的液滴的位置，并该液滴作为第二参考液滴；

S62：以第二参考液滴为起点，按顺时针方向将集合S中的液滴依次排列，得到新的液滴集合S’＝{d’₁、d’₂、d’₃、d’₄、d’₅Λ}；

S63：将集合S’中的每一液滴的中心与靶标中心的距离信息作为描述符的元素，得到图像信息的位置描述符。

8.根据权利要求7所述的用于描述微滴式数字PCR液滴相对位置的方法，其特征在于，所述S7中的欧式距离的计算公式如下：

其中，D_i和D_j分别表示第i个和第j个位置描述符，d_ik和d_jk表示描述符的第k个元素分量。

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