JP2011200245A - 酸素反応及び／又は分子生物学反応を実施するための装置および核酸を増幅するための方法および充填のためのプロセス - Google Patents

Abstract

【課題】酸素反応及び／又は分子生物学反応を実施するための装置および核酸を増幅するための方法および充填のためのプロセスの提供。
【解決手段】反応チャンバ内で予め分配される、増幅すべき標的配列に特異的なプライマーを含み、タンクは、分析対象核酸の標本、プライマーを除いてポリメラーゼ連鎖増幅反応のために必要とされる試薬で構成された流体を収容し、加熱用プレートは、ポリメラーゼ連鎖増幅サイクルの３つの段階に対応する３つの異なる温度まで加熱できる３つの別個のゾーンを含む、少なくとも２つの異なるインキュベーション温度を必要とする、酵素反応及び／又は分子生物学反応を実施するための装置。
【選択図】なし

Description

発明の詳細な説明

本発明は、遺伝学の分野に関する。

より厳密に言うと、本発明は、標的核酸配列を増幅するための装置、装置内で使用するための反応カートリッジ及びこの装置の応用方法に関する。

本発明の目的は、１以上の標本中の標的核酸配列の検出、そして必要な場合にはその実時間定量にある。

標的核酸配列の検出は、数多くの分野で増々広範囲に使用されつつある技術であり、この技術の応用範囲は、それがより信頼性が高く安価でかつ高速になるにつれて広がるものと予測されている。人間の保健の分野では、或る種の核酸配列を検出することにより、一部のケースにおいて、ウイルス又は細菌感染の信頼性の高い迅速な診断を提供することができる。同様にして、或る種の遺伝的特性を検出することによって、或る種の疾病に対する罹病性を識別すること又は遺伝病又は新形成疾患の早期診断を提供することを可能にすることができる。同様に、標的核酸配列の検出は、農産物加工業の分野でも、特に製品トレーサビリティーを提供し、遺伝的に変更された生体の存在を検出してそれらを同定するか、又は食品検査を行なうためにも使用できる。

核酸に基づく検出手順は、ほぼ一貫して、標的核酸配列とその標的配列に相補的な１以上の核酸配列との間の分子ハイブリダイゼーション反応が関与している。かかるプロセスは、当業者にとって「トランスファー技術」として知られている技術（ブロット、ドットブロット、サザンブロット、制限フラグメント長多型現象など）、又は、標的配列の相補的配列がその上に予め固定されている小型化されたシステム（マイクロアレイ）といったようないくつかの変形形態を有している。このような技術において、相補的核酸配列は、一般にプローブと呼ばれている。それ自体診断手順の基礎を構成しうるか又は単に上述の技術の１つにおける補足的なステップとなり得るあるさらなる変形形態（特に、標的配列の濃度ひいては診断の感度を増大させる目的をもつ）は、ターゲティングされた核酸配列を増幅することから成る。特に１つの核酸配列を増幅できるいくつかの技術が、これまでに記述されてきており、最も一般的な技術は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。この技術においては、プライマーと呼ばれる標的配列の相補的核酸が、これらの標的配列を増幅するために使用される。

ＰＣＲ反応には、一般に２０〜５０といった回数反復するサイクルが関与し、各々は３つの連続的段階、すなわち、変性、プライマーアニール、ストランド伸長段階で構成されている。第１段階は、２本鎖核酸から１本鎖核酸への変換に対応し；第２段階は、標的配列と前記配列のための相補的プライマーとの間の分子ハイブリダイゼーションであり、第３段階は、ＤＮＡポリメラーゼを用いた、標的配列に対しハイブリッド形成された相補的プライマーの伸長に対応する。これらの段階は、使用されるプライマーの融解温度（Ｔｍ）に応じて、一般に変性については９５℃，伸長については７２℃及びアニーリングについては３０℃〜６５℃の間、という特定の温度で行なわれる。同じ温度（一般に６０℃）でアニーリング及び伸長ステップを実施することも同じく可能である。

かくして、ＰＣＲ反応は、その間に鋳型として作用する標的ＤＮＡ分子の数が各サイクルについて理論的に２倍になる反復的熱サイクルシーケンスから成る。実際には、ＰＣＲ収率は１００％未満であり、したがってｎサイクルの後に得られた産物Ｘｎの数量は、以下の通りである。

Ｘｎ＝Ｘｎ−１（１＋ｒｎ） ここで、
Ｘｎ−１は、先行サイクルにおいて得られた産物の数量であり、ｒｎはサイクルｎ（０＜ｒｎ≦１）内のＰＣＲ収率である。

収率が一定である、すなわち各サイクルについて同一であると仮定すると、初期数量Ｘ０からｎサイクル後に得られた産物Ｘｎの数量は次のとおりである：
Ｘｎ＝Ｘ０（１＋ｒ）ｎ （Ａ）

実際には、増幅のために必要な試薬のうちの少なくとも１つの制限ある数量、９５℃でのその反復されたパスによるポリメラーゼの不活性化、又は、反応により生成されたピロリン酸塩によるその阻害といったようないくつかの要因に起因して、収率ｒは、ＰＣＲ反応中に減少する。

この収率の減少のため、ＰＣＲ反応動力学は、まず最初に指数期（ｒが一定である段階）を示し、次に、これは、ｒが減少する水平期に変わる。

指数期の間、以上の等式（Ａ）があてはまり、これを次のように表わすこともできる：
ｌｏｇ（Ｘｎ）＝ｌｏｇ（Ｘ０）＋ ｎ ｌｏｇ（１＋ｒ）

かくして、ＰＣＲの指数期において、サイクル数の関数として対数目盛上に産物の数量を示す曲線は、初期濃度の対数に等しい値で縦座標と交差するところでの勾配（１＋ｒ）をもつ直線である。

かくして、得られた産物の数量の実時間測定が、例えば患者の体内のウイルス量を測定するとき、又は、トランスクリプトームの可変性を決定する目的で、多数の利用分野において特に重要なものである鋳型の初期濃度を提供する。

一般に、ＰＣＲは、２μｌ〜５０μｌの反応体積を利用し、「マイクロプレート」（マイクロチューブの一体アセンブリ）として当該技術分野で知られている試験管、マイクロチューブ、毛細管又はシステムの中で行なわれる。かくして、各々の試験管又は同等のコンテナの各々のバッチは、望ましいサイクル数について、ＰＣＲの異なる段階に対応する３つの温度まで連続的に加熱されなくてはならない。

試験管又は類似のシステムを利用することで、ＲＡＰＤ（無作為増幅多形ＤＮＡといったような複数の標的配列とハイブリッド形成できる低特異性プライマーを用いるか、或いは、使用される各プライマー対が単一の標的配列を増幅するよりも多くの数の特異的プライマーを使用するかして、同じコンテナ内で同時に複数の標的配列を増幅する多重増幅手順を除いて、単一の核酸標本を使用するときでさえ、存在する増幅すべき標的配列と同数の試験管及び溶液を調製するべく（当該技術分野で混合ＰＣＲとして知られている）数多くの操作をオペレータが、行なうことを余儀なくされる。多重増幅は、特定のケースに対応し、日常的に使用されるものではない。さらに、これらは、１つの増幅反応ともう１つの増幅反応との相互作用を無くすことを保証するものではなく、プライマー間でハイブリダイゼーションが起こる可能性があるために、コンテナ１個あたりに増幅される標的配列数に関し非常に制限されたものでしかあり得ない。

これらの異なる操作は、いくつかの欠点をひき起こす。

まず第１に、これらの操作には時間がかかる。第２に、一の試験管から他へ又は外部環境（塵埃、細菌、エアゾル又は、増幅反応の効率に影響を及ぼしうる１以上の核酸分子を含有しうるその他の汚染物質）から発生し得る汚染に関して、危険性が無いわけではない。さらに一の試験管から他への体積及び試薬濃度の均一性が保証されていない。最後に、体積は必然的に手で操作され、一般に１μｌより大きく、これは、利用される試薬が高価であることから、ＰＣＲの実施コストに影響を与える。

かかる操作を少なくとも部分的に自動化するために設計された装置を使用することにより、これらの欠点のうちのいくつかを克服することができる。しかしながら、これらの器具は比較的高価であり、したがってその使用は、例えばゲノム配列決定といったような数多くのＰＣＲ増幅を実施した場合にのみ経済的に妥当なものにする。

動的ＰＣＲ増幅を実施できるいくつかの器具も存在している。以上で見てきたように、動的ＰＣＲは、増幅された標的配列の実時間特異的定量を必要とする。反応混合物内で、蛍光リポーターを使用することにより、その混合物中で測定されるべき２本鎖ＤＮＡの合計数量の増大が可能となる。しかしながら、この方法は、起こり得る非特異的増幅から又は背景雑音から標的配列の増幅を弁別することができない。設定された標的配列の増幅を特異的に測定する複数のプローブシステムが最近記述された。これらは、その配列の相補的オリゴヌクレオチドに基づいており、蛍光体基又は蛍光体／消光剤の対に結合させられ、かくしてプローブのその標的に対するハイブリダイゼーション及び連続的増幅サイクルは、標的配列の増幅に正比例する、ケースに応じた混合物の合計蛍光の増減をひき起こすことになる。

動的ＰＣＲを実施するために使用可能なプローブの例として挙げられるのは、ＴａｑＭａｎＴＭ（ＡＢＩ（登録商標）），ＡｍｐｌｉＳｅｎｓｏｒＴＭ（ＩｎＧｅｎ）及びＳｕｎｒｉｓｅＴＭ（Ｏｎｃｏｒ （登録商標），Ａｐｐｌｉｇｅｎｅ （登録商標））システムである。

最も広く用いられているシステムはＴａｑＭａｎＴＭシステムである。

この手順は、ＰＣＲ中のＴａｑポリメラーゼの５′→３′ヌクレアーゼ及びＤＮＡポリメラーゼの活性を組合わせるものである。原理は以下の通りである：増幅されるべき標的の配列と相補的な配列をもつ２つのプライマーに加えて、リポータープローブが反応媒体に添加される。これは、増幅された配列の本体内で標的とハイブリッド形成する能力をもつが、それ自体増幅され得ない。プローブの３′末端に添加されたホスホリル基は、それがＴａｑポリメラーゼにより拡張されるのを防ぐ。フルオレセイン誘導体及びローダミン誘導体が、それぞれ５′及び３′末端でプローブ内に取込まれる。このプローブは、小さく、したがって、フルオレセインの近くにあるローダミン誘導体は、フルオレセインが励起されたときに発出するエネルギーを吸収する（消光）。

プライマーが伸長反応中にひとたび標的にハイブリッド形成されたならば、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼは、その５′ヌクレアーゼ活性を介してプローブを攻撃し、消光剤基を放出しかくして蛍光を再度確立する。発出された蛍光の強度は、このとき形成されたＰＣＲ産物の数量に正比例し、これが定量的結果を提供する。発出された蛍光は、標的分子の初期数に比例する。蛍光発達動態は、増幅反応中に実時間で追跡可能である。

この技術には、容易に自動化できるという利点がある。この技術を実施できる器具、ＡＢＩＰｒｉｓｍ７７００ＴＭは、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社から販売されている。この器具はサーモサイクラと蛍光計を組合わせたものである。これは、ＰＣＲ中に遊離された蛍光基により発出されたシグナルを実時間で検出するＣＣＤカメラに接続されかつ各試験管の下にある光ファイバを用いて、ＴａｑＭａｎＴＭ手順を用いた定量試験中に生成される蛍光の増加を検出することができる。定量的データは、増幅産物からのシグナルがオペレータにより決定された所定の閾値に達するサイクルを決定することによって引き出される。いくつかの研究が、サイクル数が初期材料の数量に正比例することを実証してきた（Ｇｉｂｓｏｎ，Ｈｅｉｄ ｅｔａｌ．， １９９６；Ｈｅｉｄ， Ｓｔｅｖｅｎｓｅｔ ａｌ．，１９９６； Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｇｉｌｅｓ ｅｔａｌ．， １９９８）。

かかる器具の潜在的利用分野の数は、人間の保健、農産物加工業の分野及び品質管理において莫大なものである。残念なことに、ＡＢＩＰｒｉｓｍ７７００ＴＭ及び現在市場に出ているいくつかのその他の競合する器具は極めて高価である。さらに、これらは、訓練されたオペレータしか使用できないものである。実際には、かかる器具は、いくつかの高度に専門化された分野においてのみ使用されている。

かくして、上述の先行技術のもつ欠点をもたず、必要とあらば実時間で測定する核酸増幅システムに対するニーズが存在している。

本発明は、複数の標的配列上で増幅する方法を実施するのに必要とされる操作数を著しく低減でき、結果としてこの作業に必要な時間を削減するためのシステムを提供することを目的としている。

本発明は同様に、コンテナ間の汚染の危険性を最小限におさえるシステムをも提供する。

本発明はさらに、使用される試薬の体積を低減させかくして関与するコストを削減するようなシステムを提供する。

さらにまた、本発明は、コンテナ内のＰＣＲのために必要とされる試薬の均等な体積分布及び濃度を最適化するようなシステムを提供する。

さらに又、本発明は、全ての可能性のあるユーザー、特に病院、医学分析研究所、農作物加工業者及び健康診断のために、使用及びメンテナンスが容易な、実時間定量的核酸増幅を日常的に行なうための装置を提供する。

本発明で使用されている用語のいくつかは、次のような意味をもつ：

・ 「核酸増幅反応」というのは、当該技術分野において既知のあらゆる核酸増幅用方法を意味する。挙げることのできる制限的意味のない例としては、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応），ＴＭＡ（転写媒介増幅）、ＮＡＳＢＡ（核酸配列ベースの増幅）、３ＳＲ（自己保持型配列複写）、ＳＤＡ（ストランド置換増幅）及びＬＳＲ（リガーゼ連鎖反応）がある。

初期増幅鋳型は、あらゆるタイプの核酸、ＤＮＡ，又はＲＮＡ，ゲノミック、プラスミド、組換え型、ｃＤＮＡ，ｍＲＮＡ，リボソームＲＮＡ，ウイルスＤＮＡなどでありうる。初期鋳型がＲＮＡである場合、初期逆転写ステップは一般に、ＤＮＡ鋳型を生成するように実施される。当業者であればこのステップをいつどのように行なうかを正確に知っていることから、本文中、このステップについては全般的に言及されない。明らかに本発明の装置は、ＲＮＡ配列ならびにＤＮＡ配列を増幅し、可能であればそれを特異的に定量するために使用可能である。かくして本明細書の残りの部分では、「ＰＣＲ」という語は、ＰＣＲ自体及びＲＴ−ＰＣＲ（逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応）の両方を指すものとして使用されることになる。

・ 上述の増幅反応のうちのいくつかは、等温反応である。その他の反応、特にＰＣＲ及びＬＣＲは、周期的方法の異なる時点で異なる温度まで反応混合物を加熱することを必要としている。かかる反応は、「熱依存性核酸増幅反応」と呼ばれる。本明細書の残りの部分では、本発明の装置は、主としてＰＣＲに対するその応用に関して記述されることになる。ただし、この装置はこの技術に制限されず、これをあらゆる核酸増幅反応さらにはその他の酵素及び／又は分子生物学反応のためにさえ使用することもできるということは明白である。この装置は、以下の記述から明白となるように、反応混合物を複数の温度で循環させる少量の体積しか必要としない反応に特に適している。

・本発明の目的の１つは、定量的増幅反応すなわち、反応混合物中に当初存在する標的配列の濃度を決定できるようにする反応を実施するための新規の器具を提供することにある。いくつかのタイプの定量的増幅反応が記述されてきた。以上にその原理を記述した標的配列の数量の増大の実時間測定から成る、外部標準の使用に基づく定量的増幅、内部標準を用いた競合増幅、そして動的増幅を区別することができる。このタイプの増幅は、「（核酸の）動的増幅」、「動的ＰＣＲ」、「（核酸の）実時間定量的増幅」又は「実時間ＰＣＲ」と呼ばれる。カッコ内の用語は、時として省略される。

・ 本出願では、「試薬」という語は、増幅反応自体又はその検出のいずれかのために必要なあらゆる要素を意味するものとして、その広い意味で解釈されるべきである。この定義に従うと、塩、ｄＮＴＰ，プライマー及びポリメラーゼは、ＰＣＲに必要とされる試薬である。同様にして、蛍光リポーター又はプローブもここでは、増幅された産物の検出に関与する試薬とみなされるが、これらは、定義上は反応しない。

本発明の器具のある要素を示すその他の用語については、以下で、本発明の詳細な説明の中で記述される。

器具のいくつかの要素は、本発明の複数の制限的意味のない実施形態及び変形形態を例示する図面の中で示されている。

第１の態様では、本発明は、少なくとも２つの異なるインキュベーション温度を必要とする酵素及び／又は分子生物学反応を実施するための装置であって：
・ 複数の反応チャンバ（１３）及びタンク（１１）を有し、この反応チャンバが流路（１２）を介してタンクに連結されている、少なくとも１つのプレート又はカートリッジ（１）；
・ 少なくとも２つの異なる温度まで加熱され得る少なくとも２つの別個のゾーンを有する少なくとも１つの加熱用プレート（２）；
・ 反応チャンバの温度の周期的変動を可能にする、前記カートリッジと前記プレートの間の相対的変位用手段、
を含むことを特徴とする装置に関する。

プレートの各ゾーンの中の温度は、均一であってもよいし、或いは必要とあらば温度はある変化率で変化してもよい。

複数のタイプの分子生物学反応は、さまざまな時点で反応混合物を異なる温度にすることを必要とする。このことは、例えば、酵素が使用後不活性化されなくてはならない（例えば制限ヌクレアーゼ）場合、又は複合体の安定性をテストする目的がある場合に言えることである。後者の場合、１つの要素が蛍光体に結合され、他の要素が蛍光消光剤に結合されている複合体（例えば、抗原／抗体複合体又はレセプタ／リガンド複合体）を、器具の反応チャンバの１つの中に入れることができる。その後プレートは、必要とあらば勾配の形で、増加順に複数の温度を生成するべくプログラミングされる。このとき、複合体の安定性は、プレート上のカートリッジを変位させ、かくして反応チャンバの温度を次第に増加させ、反応チャンバに面する蛍光励起／測定手段を用いて蛍光の増加を観察することによりテストされる。蛍光の増加は、複合体の解離に等しい。

本発明の装置、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又はリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）といった或る種の核酸増幅反応について言えるように、反応チャンバの温度の周期的変動を必要とする反応に特に適している。

特に本発明は、標的核酸配列の熱依存性連鎖増幅のための装置であって：
・ 複数の反応チャンバ（１３）及びタンク（１１）を有し、この反応チャンバが流路（１２）を介してタンクに連結されている、少なくとも１つのカートリッジ（１）；
・ 前記標的核酸のための増幅サイクルに対応する、少なくとも２つの異なる温度まで加熱され得る少なくとも２つの別個のゾーンを有する少なくとも１つの加熱用プレート（２）；
・ 反応チャンバの温度の周期的変動を可能にする、前記カートリッジと前記プレートとの間の相対的変位用手段（３）、
を含むことを特徴とする装置に関する。

本発明のこのようなシステムは、連鎖増幅サイクルに必要な温度が、温度が一定の別個ゾーンにより提供され、温度が変動する１つの区画によって提供されるのではないという点において、先行技術のシステムほど複雑ではない。

熱依存性連鎖増幅反応には、標本を少なくとも２つの温度にすることが必要とされる、ということに留意することが大切である。一例を挙げると、各々のＰＣＲは、標的ＤＮＡを変性させるための約９５℃の段階、そしてその後ハイブリダイゼーション／ライゲーションを生成するための５５℃〜６５℃の間（プローブのＴｍに依存する）の段階を必要とする。ＰＣＲに関しては、各サイクルは一般に３つの段階、すなわち、約９５℃での変性、プライマーＴｍに依存する温度のアニーリング、及び通常７２℃で行なわれる伸長という３段階から成る。ただし、ＰＣＲは、アニーリングと伸長とが同じ温度で行なわれ、かくして各サイクルが異なる２つの温度しか必要としない単純化されたサイクルで実施することもできる。

上述の装置におけるさまざまな変形実施形態を考慮することができる。本発明の好ましい変形形態においては、システムは以下の特長を含んでいる：
・ 増幅すべき標的配列に特異的なプライマーが、反応チャンバ（１３）内で予め分配されること、
・ タンク（１１）は、分析対象核酸の標本と、プライマーを除いて、ポリメラーゼ連鎖増幅反応のために必要とされる試薬とで構成された流体を収容することを意図されたものであること；
・ 加熱用プレート（２）が、ポリメラーゼ連鎖増幅サイクルの３つの段階、に対応する３つの異なる温度まで加熱できる３つの別個のゾーンを有すること。

好ましい変形形態においては、増幅すべき標的核酸配列のための特異的プライマーの入った複数の反応チャンバ内でＰＣＲのために必要な試薬と、分析対象核酸標本を含有する流体とをタンクから分配し、かつ、異なる温度まで加熱しうる２つ又は３つの別個のゾーンを有する前記加熱用プレートと前記反応チャンバを含むカートリッジとの間の相対的運動を用いて複数回、次々と異なる温度（すなわち変性、アニーリング及び伸長に必要とされる温度）にチャンバの中味を、連続的にすることにより、増幅プロセスをひき起こすことが可能である。

必要な場合には、反応チャンバ（１３）は、上述のプライマー以外の実時間ＰＣＲ反応に必要な試薬を収容することができる。本発明の器具の好ましい実施形態においては、反応チャンバは同様に、増幅すべき配列に特異的な１以上のプローブを含むこともできる。反応チャンバ内のプローブの分配は、同様に、あるチャンバが増幅すべき配列に特異的なプローブを含み、かつ、その他のチャンバが、増幅すべき配列を先験的に認識しない対照プローブを含むことになるようなものであってもよい。これらのプローブは、標識づけされ得、１つの同じ反応チャンバ内に複数のプローブが存在する場合には（例えば、増幅すべき配列に特異的なプローブと対照プローブ）、これらのプローブは好ましくは異なる蛍光体で標識づけされることになる。

器具のさらなる変形形態においては、ｄＮＴＰ又は塩といったような補充的試薬が、当初、反応チャンバ内に置かれる。これらの試薬はその後、タンク（１１）内に置かれた流体の中で存在しないか又はより少ない量で存在する。極端な例では、ＰＣＲ反応のために必要な試薬は全て、鋳型を除いて、反応チャンバ（１３）内に置かれ、かつ、タンク（１１）内に置かれた流体は、このとき、増幅すべきＤＮＡ（又はＲＮＡ）標本のみを含むことになる。

上述の変形形態は、異なるプライマー及び／又はプローブを用いて同じ標本について並行して複数の反応が実施されるということを仮定している。このとき、このことは、複数の基準に従った唯一の標本（又はタンクが数個のサブタンクに分割される場合には複数の標本）の特徴づけに関係する。これとは対照的に、いくつかの応用分野では、単一の基準又は少数の基準に従った多数の標本の特徴づけが必要とされる。これは、例えば、ファージ又は細菌のライブラリを一定の与えられた遺伝子の存在についてスクリーニングしなければならない研究の場合に言えることである。この場合、一定の与えられたプライマー対からの多数の標本について、ＰＣＲを実施しなければならない。本発明の装置は、このタイプの操作にも適合されている。この目的では、標本は、反応チャンバ（１３）内に置かれる。プライマーは、ＰＣＲのために必要とされるその他の試薬と共に、タンク（１１）内に入った流体の中に導入され得る。明らかに、この構成では、分析対象標本以外の或る種の試薬を予め反応チャンバ（１３）内に置くことができるという事実が除外されるわけではない。

器具の選択された変形形態の如何に関わらず、又反応チャンバ（１３）内に置かれる試薬の如何に関わらず、これらは有利にも単に、液体を置き続いて乾燥させることだけで設置可能である。タンク（１１）から流体が到達することで次にこれらの試薬を溶解させることができる。置かれた各々の試薬の量は、試薬の溶解が各チャンバについての所望の最終濃度を生み出すような形で各々の反応チャンバ（１３）内に進入することになる流体の体積の関数として計算される。反応チャンバ（１３）の少なくとも一部分が、液体の設置とそれに続く乾燥によってその中に投入された試薬を含み、かくして反応チャンバ内に流体の到着によりこれらの試薬が溶解させられるようになっている上述のもののようなカートリッジも同様に、本発明の一部を成すものである。

上述の器具は、全ての反応チャンバを同時に充填するという利点をもち、このため調製時間及び１つのチャンバからもう１つのチャンバへの汚染の危険性は削減される。この器具は、小型化が可能であるという利点をも有し、先行技術において一般的であった体積よりも少ない体積の試薬を使用できることになる。

最後に、推奨される特定の加熱用プレートのため、先行技術の場合のように加熱用プレート又は大気の温度を変動させることによって異なる段階（変性、アニーリング、伸長）が行なわれず、カートリッジとプレートとの間の相対的運動により反応チャンバの各々の中味が急速かつ連続的にこれらの段階の３つの異なる温度にされることを可能にすることから、本発明はＰＣＲサイクルを加速することができる、ということも指摘できる。低い反応体積及びカートリッジ（１）のための薄い底の使用も又、反応チャンバ内の熱慣性を制限することができ、かくして反応の迅速性に寄与する。

本発明は同様に、実時間で測定される標的核酸配列の熱依存性増幅のための装置であって、上述の装置のうちのいずれか１つの場合と同じ要素を含み、しかも各サイクルのための反応チャンバの中味の蛍光を励起し測定するべく配置された光学蛍光励起／測定用手段（５）をも含んでいる。

上述の装置の特に独創的な要素の１つは、プレート又は反応カートリッジ（１）のいずれかで呼称される要素である。この要素は、再生可能であっても（好ましくは）使い捨てであってもよく、かくして、本発明のさらなる態様を構成している。本発明は同様に、複数の反応チャンバ（１３）と少なくとも１つのタンク（１１）とを含み、
・ 各反応チャンバが直径３ｍｍ未満の円内に含まれた断面を有する流路（１２）を介してタンクに接続されていること；
・ タンクの容量が１０ｍｌ未満であること；
・ タンクとの関係における反応チャンバと流路との配置が、タンクから反応チャンバ内に流体を均等に分配できるようにしていること、
を特徴とする反応カートリッジを提供する。

流路の直径は、好ましくは、タンク内に存在する流体が重力下で反応チャンバに分配されるのを許容せずかつチャンバの再現不能な充填を防ぐのに充分なものとなるように選択される。この直径は好ましくは約０．２ｍｍ以下である。この直径に関しては、流路の横断面が好ましくは円形であることに注意すべきであるが、これはその他のあらゆる形状、特に多角形であってよく、流路の「直径」は、最大断面寸法を示す。

核酸標本とＰＣＲのために必要な試薬とを収容するよう意図されたタンクのためには、例えば約０．１ｍｌ〜約１ｍｌの範囲内のさまざまな容量を利用することかできる。

カートリッジは、好ましくは約２０個〜約５００個の反応チャンバ，より好ましくは６０個〜１００個の反応チャンバを含む。

これらのチャンバの容積は、実施形態により左右される。有利には、これらのチャンバの容積は、約０．２μｌ〜５０μｌ，好ましくは１μｌ〜１０μｌの範囲内にある。

本発明のカートリッジにおいては、流路（１２）とタンク（１１）との間の接合部は、好ましくは、タンクの周囲に生成され、前記タンクのベースは、タンクの中に入った流体を流路の入口へ確実に分配するべく傾斜しかつ／又は凸状になっている。

本発明のカートリッジが多くの形状を有する可能性があるということに注意すべきである。しかしながら、本発明の好ましい変形形態においては、このカートリッジは形状が円形であり、このときタンクは実質的にカートリッジの中心にあり、反応チャンバはタンクのまわりに円形に分布させられ、タンクをチャンバに連結する流路は、基本的に半径方向にある。かかる構造は、中央タンクからの反応チャンバの充填を最適化することができる。

円形カートリッジを伴う１つの特定の実施形態においては、タンク（１１）のベースは円錐形である。

ここでも好ましくは、前記反応チャンバは、前記チャンバの相対的周囲に設けられている。カートリッジ内に設けられかつ中央タンクから充填され得る反応チャンバの数を最適化することが可能である。

本発明の一変形形態においては、かかるカートリッジは、反応チャンバと同数の流路を含んでいる。ただし、一部の実施形態においては、流路の複数の区分が、複数の反応チャンバに共通してもよい。

本発明の１つの利点は、装置を容易に小型化できるという点にある。かくして有利には、カートリッジが、回転の幾何学的形状を有するとき、好ましくは約１〜１０ｃｍの範囲内の直径を有する。

代替的には、本発明のカートリッジは、タンク（１１）がカートリッジの一方の側に位置付けられ、カートリッジのもう一方の側で反応カートリッジ（１３）が整列され、タンクをチャンバに連結する流路が基本的に互いに平行であるような平行移動形態を有することもできる。かかるカートリッジの一般的形状は、このときカートリッジを移動させうる手段にカートリッジを連結することを意図されたいくつかの突起及び／又は中空部分を除き、基本的に矩形である。かかるカートリッジの一例が図１１Ａに示されている。かかるカートリッジの場合には、タンク（１１）の底面は好ましくは傾斜した平面であり、これが反応流体を、流路（１２）への入口に向かって誘導する。

上述の本発明のカートリッジの一変形形態においては、タンク（１１）はその形態の如何に関わらず、同じカートリッジ上で複数の標本を同時に分析するため、２〜２０個、好ましくは２〜８個のサブタンクに分割される。この場合、反応チャンバ（１３）の各々は、流路（１２）を介してこれらのサブタンクの１つのみに連結されている。この変形形態の一例は、図１１Ａに示されている。この図に示されているカートリッジは、１１１〜１１８の番号が付された８つのサブタンクを含んでおり、各サブタンクは５本の流路（１２）を介して５個の反応チャンバ（１３）に連結されている。この図では、サブタンク１１１に連結されている流路のみが示されている。ここで、本明細書全体にわたり、「タンク（１１）」という語が、タンク（１１）全体及びサブタンクの両方を示すことを注意しておくことが重要である。

（流路と比較した）反応チャンバの深さも同じく本発明の実施形態に応じて変動しうる。好ましい変形形態においては、これらのチャンバの深さは約０．５ｍｍ〜１．５ｍｍの範囲内にある。

同様に、カートリッジの厚みが、特にその構成材料といったようないくつかの要因により左右されるということも注意しておくべきである。実際には、このカートリッジは、好ましくはプラスチック、好ましくは、本発明に適した物理的特性、光学特性及び熱特性を有するポリカーボネートで構成されている。本発明のカートリッジの厚みは、好ましくは０．５〜５ｍｍの範囲内にある。

反応チャンバとプレートとの中味の間の熱交換を容易にするため、その「底」は好ましくは可能なかぎり薄いものである。その厚みは、カートリッジを製造するのに用いられる材料によって左右される。好ましくは、それは０．０５〜０．５ｍｍの範囲内、例えば約０．２５ｍｍである。

本発明のカートリッジのための反応チャンバは、好ましくは、ＧＭＰ条件下での反応流体の蛍光の励起及び測定を可能にするため、例えば透明プラスチックの透明な上部壁（１７）により閉鎖される。

本発明の特定の実施形態においては、チャンバには、タンクからの流体が充填された時点で、これらのチャンバに入った空気を漏出できるようにするべント（開放型システム）が設けられている。

チャンバ（１３）にベント（１４）が設けられている上述のケースでは、流路（１２）は好ましくは、異なる直径（１２１及び１２２）を有する少なくとも２つの部分により構成されており、第２の部分（１２２）の直径は、第１の部分（１２１）の直径より小さく、流路（１２）内に圧力降下を作り出す。１本の流路が圧力の作用下で他の流路よりも速く充填される場合には、圧力降下の効果は、全ての流路が同じように充填されてしまうまで、第１の部分（１２１）が充填されている１以上の流路内での流体の進行を止めることになる。こうして異なる反応チャンバの均等な充填を確保するべく、各流路についての体積を「予備較正」することができる。流路（１２２）の第２の部分は、例えば、第１の部分（１２１）の直径よりもはるかに小さい直径を有するガラス毛細管で構成され得、この毛細管はプラスチック製カートリッジ内に含まれている。

同様に、反応チャンバのベント（１４）がその中に向かって開いているセル（１５）を設けることも可能である。これらのセルは、カートリッジの外部に対す開口部（１６）（開放型システム）を有し、まず第１にベント（１４）を介して反応チャンバから離れることのできるあらゆる余剰流体の汚染のない回収という利点、第２にこれらは、反応チャンバの充填後に閉鎖できるという利点を有する。これらのセルを例えば、接着テープを用いて閉鎖して、増幅を適切に実施するべく閉鎖型システムを作り出すことができる。こうして、カートリッジ（１）内に収容された流体の蒸発を回避するか又は少なくとも制限することができる。この実施形態は、例３に記述され、図１１Ａ及び１２に例示されている。

代替的には、反応チャンバが充填された時点から閉鎖型システムプロトコルを使用し、以下で記述するように、カートリッジ内に負圧を発生させその後圧力を回復させることもできる。反応チャンバが流路入口（１２）（「閉鎖型」反応チャンバ）以外の開口部を全く有していないカートリッジも、本発明の範囲の中に含まれる。

開放型システム内で使用するためか又は閉鎖型システム内で使用するためのいずれかの目的で設けられる上述のカートリッジは、好ましくは、タンク内に存在する流体を反応チャンバに向かって変位させるため、タンク（１１）内の圧力を調整する手段（４）に適合し得る開口部を含む。

本発明は同様に、閉鎖型システム内で以上の段落内で記述されたようなカートリッジ（１）の反応チャンバ（１３）を充填するための方法であって、カートリッジの反応チャンバが閉鎖されており、かつ：
・ タンク（１１）に少なくとも部分的に流体を充填する段階；
・ 圧力を調整するための手段（４）にカートリッジ（１）を接続する段階；
・ カートリッジの内部に負圧を加え、次に圧力を回復する段階、
を含む方法、にも関する。

本発明のカートリッジの一変形形態においては、タンク（１１）との接合部において各流路（１２）に逆流防止キャビティ（１２３）が設けられ、前記逆流防止キャビティは、流路（１２）の直径以上の直径を有する実質的に垂直な流路部分により構成されている。この変形形態は２つの主たる利点を有する。まず第１に、これらの逆流防止キャビティは、タンク（１１）に対して流体が偶発的に戻る場合又は流路内に全ての流体が引込まれているわけではない場合に、相互汚染を防止することができる。さらに、これらは、反応流体の分配後で増幅反応に先立ち流路を覆うするべく、これらの垂直入口と嵌合するへこみをもつキャップを本発明の器具に設けることも可能にする。こうして、システムを完全に閉鎖したシステムとして作動させることができ、かくしてあらゆる汚染及び蒸発の危険性を防止する。ただし、逆流防止キャビティとタンク側で流路に対する入口を遮断するためのタンク内のキャップの使用とは、反応チャンバにベントが設けられている上述のもののような開放型システムの場合にも利用できる、ということに注意することが大切である。

本発明のカートリッジの好ましい一実施形態においては、反応チャンバ（１３）の少なくとも一部分がオリゴヌクレオチドを含んでいる。さらに一層好ましくは、反応チャンバ（１３）の各々は、増幅すべき核酸配列に特異的な２つのプライマー、そして任意には、前記配列に特異的な１以上の標識づけされたプローブを含んでいる。かかるプローブは、その標的配列（ＳｕｎｒｉｓｅＴＭシステム）とハイブリッド形成された時点でそのシグナルが増大するように、又は、それがハイブリッド形成されたストランドから拡張がシグナル内の増減をひき起こすような形で（それぞれＡｍｐｌｉＳｅｎｓｏｒＴＭ又はＴａｑＭａｎＴＭシステム）標識づけされ得る。反応チャンバ内のこのようなプローブの存在により、上述のように蛍光励起／測定手段が設けられた本発明の器具を用いて定量的実時間増幅を実施することが可能になる。増幅すべき配列に特異的でなく特異的プローブのものとは異なる方法で標識づけされた対照プローブも同様に、あらゆる汚染を検出するべく使用可能である。

反応チャンバがプライマー及び１以上の光学プローブを含んでいる上述の本発明の実施形態においては、これらの異なるプローブ及びプライマーは、好ましくはそのそれぞれの融点（Ｔｍ）が接近しているような形で選択されている。特に、異なるプライマーのＴｍは、好ましくは、約５℃の範囲内にある。同様にして、異なるプローブは、好ましくは、プライマー範囲とは異なるものでありうる約５℃の範囲内のＴｍを有することになる。この場合、プローブは、そのＴｍがプライマーのものよりも高くなるように選択されることになり、このとき、異なるオリゴヌクレオチドカテゴリのＴｍの間の差異は、好ましくは約５℃である。このとき、増幅を実施するために用いられるハイブリダイゼーション温度は、最低のプライマー融点に対応している。

プライマー及び光学プローブに加えて、本発明のカートリッジの反応チャンバ（１３）は、同様に、ＰＣＲ反応又は増幅測定に必要とされる１以上のその他の試薬を含むことができる。その例としては、塩、ｄＮＴＰ，又はＳｙｂｒＧｒｅｅｎタイプ（登録商標）の蛍光２本鎖ＤＮＡリポーターがある。上述のように、これらの試薬は全て、有利には、液体を置いた後乾燥することにより反応チャンバ（１３）内に置かれる。

本発明のカートリッジの１変形実施形態においては、カートリッジは、少数の基準に従って多数の標本をスクリーニングするように意図されている。このことは、カートリッジのユーザーが反応チャンバ（１３）の各々の中に自らの標本を置くことができるということを意味している。この目的のため、カートリッジは、例えば、持上げられた時点で反応チャンバに対する直接的アクセスを提供する取外し可能なカバーを有することができる。かかるカートリッジは、同様に、予め装てんされ反応チャンバ内での増幅及び／又は検出のために必要とされる試薬のうちの１以上のものを含んでもよい。

明らかに、上述の本発明の装置は、上述のカートリッジのいずれかに対応する１以上のカートリッジを含むことができる。

カートリッジが円形である本発明の装置の特定の実施形態においては、加熱用プレート（２）内の別個の加熱ゾーンは、好ましくは円盤（図２Ａ）又は環（図２Ｂ）の複数の区分である。カートリッジ（１）と加熱用プレート（２）との間の相対的変位のための手段によって、所望の別個の温度まで反応チャンバの中味を連続的に加熱するべく、各部分を別個の温度まで加熱することができる。カートリッジ（１）内の蒸発及び凝縮に伴う問題を制限するため、サーモブロックは、好ましくは、例えば矩形カートリッジという状況の下で図１１に示されている通り、流路の一部分をも加熱するのに充分な幅を有している。

別個の加熱ゾーンの数は、２，３又はそれ以上であるということに注意しておくことが重要である。一例として、２温度ＰＣＲの場合、プレートは、２本鎖核酸を変性するための９５℃のゾーンとプライマーのアニーリング及び伸長のための６０℃のゾーンとを有することができる。３温度ＰＣＲの場合、プレートは９５℃のゾーン（変性）、４０℃と７０℃との間のゾーン（プライマーアニーリング）及び７２℃のゾーン（伸長）を有することになる。最終的に、プレートは、例えば各サイクル内の所定の間に反応を一時的に遮断するため３つ以上のゾーンを有することができる。プレート上のゾーン数は、同様に２つ又は３つのゾーンの倍数であっても良く、かくしてカートリッジ１回転が数回のＰＣＲサイクルに対応するようになっている。最後に、異なる加熱ゾーンの相対的サイズが、有利にはそのゾーンの温度での反応流体のために望まれるインキュベーション期間に正比例するように選択されるということに注意することが重要である。図２Ｂに示されているプレート内では、変性ステップ専用のサーモブロック２１の表面積は、ハイブリダイゼーション及び伸長ステップ（それぞれブロック２２及び２３）のために意図されたサーモブロックの表面積の半分である。３６０°の一回転が１５０秒で実施されるようにプレート上のカートリッジに対する回転速度を選択することにより、変性に３０秒、ハイブリダイゼーションに１分そして伸長に１分かかるサイクルが得られる。

変位手段に関しては、本発明の好ましい実施形態においては、プレート（２）が固定され、カートリッジ（１）が変位手段（３）により移動させられるということに注意すべきである。

ただし、その他の実施形態においては、カートリッジを固定することができ、かつ、加熱用プレートを変位手段により移動させることもできる。

カートリッジが円形である本発明の特に好ましい実施形態においては、変位手段（３）は前記カートリッジ及び／又は前記プレートを回転させる。

カートリッジと加熱用プレートとの間には、導電性要素を設けることができる。ただし、本発明の好ましい変形形態においては、前記カートリッジは前記加熱用プレートと直接接触状態にある。この場合、前記プレートには、有利には、前記カートリッジと前記プレートとの間に変位を促進するコーティングが設けられている。かかるコーティングは例えばテフロン（登録商標）で構成され得る。

上述のように、システムの加熱用プレートは、別個の温度まで加熱可能な少なくとも２つ又は３つのゾーンを有することができる。好ましくは、このプレートは、その温度をプログラミングするための手段に連結された２つ又は３つの別個の独立した熱ブロック（サーモブロック）で構成されている。プレートが３つのサーモブロック（２１〜２３）を含む場合には、これらのサーモブロック（２１）のうちの第１のものは、変性温度まで加熱され、第２のもの（２２）はハイブリダイゼーション温度まで加熱され、第３のもの（２３）は伸長温度まで加熱される。かかる定温サーモブロックの使用により、加熱用プレートの生産が単純になる。

プレートに対するカートリッジの相対的変位のための手段は、数多くの形状で製造できる。図１０に示されている１つの好ましい実施形態においては、カートリッジ（１）の底面は、その突出部分（１８１）が加熱用プレート（２）内に入れ子状に収まり、マイクロモータ（３１）を用いて移動させられる駆動機構又は車軸（３２）において変位手段（３）にカートリッジ（１）を連結させることになるように、切欠き（１８２）を含む中央突出部分（１８１）を有する。突出部分（１８１）は、図２Ｂに示されているもののようなプレート（２）に対してカートリッジを位置づけするように作用し、それと移動手段（３）の連結を確実にする。

図１及び３に示されている一変形実施形態においては、カートリッジは少なくとも１つのラグ（１８３）を有し、変位手段（３）は、前記このラグと連動して前記カートリッジを回転運動させる少なくとも１本の車軸（３２）を含む。

プレートとカートリッジとの間の相対的変位モードは、実施形態に応じて変わり得る。これには、連続速度での又は間欠的な変位に関与しうる。変位速度は、一定であってもよいし、或いは経時的に変化してもよい。

矩形カートリッジの場合、カートリッジは、好ましくは、例３に記述され図１１に示されているように、並進運動によりプレート（２）に対して変位させられる。

有利には、本発明のシステムは同様に、例えば前記カートリッジの上又はその側面上に設けられた光学的蛍光励起／測定手段をも含んでいる。本発明の好ましい変形形態においては、これらの手段は、単一の固定システムを構成することになる。カートリッジが円形で回転運動する本発明の好ましい変形形態の１つの利点は、それが連続的に光学系の下の位置に各反応チャンバを運ぶことができ、かくしてその複雑性を低減する、という点にある。例えばカートリッジ（１）上に位置づけられた指示システムにより、光学系の反対側にどの反応チャンバがあるかを定めることができる。

前記反応チャンバに対し前記タンク内に存在する流体を供給するための手段は、異なる形態で生産することができる。上述のように、反応チャンバに流体を分配するモードの２つのカテゴリを区別することができる。すなわち、タンク内の圧力の増加と反応チャンバ内のベント（１４）の存在とを仮定する開放型システム分配、及びカートリッジ（１）内に負圧を確立することから始めて、その後その圧力を回復する閉鎖型システム分配である。

反応チャンバに流体を供給するための手段（４）は、選択された実施形態に応じて異なる。開放型システムにおいては、タンク内に入った流体は、チャンバに均等な形で充填できるようにするべく加圧下で反応チャンバに分配される。この場合、供給手段（４）は、好ましくは、反応チャンバの適正な充填を促進するように計算されたタンク内への進入速度をもつピストン装置（４１）を含む。代替的には、これらの供給手段は、タンク（１１）内の圧力を増大するべく連結されたポンプを含む。

以上で見てきたように、本発明のさらなる好ましい変形形態には、閉鎖型システム内での作動が関与している。このとき、タンク内に収容された流体は、以下のように反応チャンバへと分配される：まず第１に、必要とあらば今度はカートリッジ（１）内の圧力を低減させるように連結されたピストン装置又はポンプ（４２）を用いて、カートリッジの内側に負圧が形成される。この圧力はその後回復されて、流体が流路内に引込まれ周囲の反応チャンバを充填できるようにする。

本発明は同様に、上述のようなシステムを使用したあらゆる核酸増幅プロセスであって、
・ プライマーそして任意には蛍光挿入剤を除いて、増幅反応のために必要とされる全てのもの及び分析対象核酸標本を含む流体をタンク（１１）に少なくとも部分的に充填する段階；
・ プライマーそして任意には標識核酸配列に特異的な１以上の標識づけされたプローブが中に分配されているカートリッジ（１）内に設けられた反応チャンバ（１３）内にまで前記流体を分配する段階；
・ カートリッジと加熱用プレートとの間の相対的変位のための手段（３）を利用して、所望の回数だけ前記加熱用プレートの２つ、３つ又はそれ以上のゾーンにより画定された温度まで各チャンバの中味を連続的に誘導する段階、
を含むことを特徴とするプロセスにも関する。

上述の変形形態においては、増幅反応用に及び／又はプライマー及びプローブとは別個の増幅産物を検出するために必要とされる試薬は、カートリッジ（１）の反応チャンバ（１３）内に予め分配されている。タンク（１１）内に導入された流体はこのとき、これらの試薬を含まない。

反応チャンバ（１３）内に流体を分配するためのステップは、カートリッジの内部に負圧を加え、次にその圧力を回復することによって（閉鎖型システム）又は、反応チャンバにベントが設けられていることを条件として（開放型システム）タンク（１１）内の圧力を増大させることによって実施される。

本発明及びそのさまざまな利点は、図中に例示されたいくつかの制限的意味のない実施形態についての以下の記述からより良く理解できるだろう。

例１： 本発明の器具の単純化された実施形態
図１に示されている標的核酸配列を検出しかつ定量するためのシステムは、直径５ｃｍで厚み２ｍｍのプラスチック材料の円形カートリッジを含む。このカートリッジ（１）には中央タンク（１１）が設けられており、これについては、図３及び４を参考にしてより詳しく記述する。当該実施形態においては、タンクの容量は４００μｌである。その底は平坦であるが、その他の実施形態においては、特にタンクがほぼ空になる分配の終りで気泡が形成されることなく流路内に流体が容易に通過できるように半球形をしていてもよい。

システムは同様に、カートリッジ（１）の下部表面と直接接触する加熱用プレート（２）と、この加熱用プレート（２）に対してカートリッジ（１）を変位させるための手段（３）と、も含む。これらの変位手段は、静止状態にとどまる加熱用プレート（２）上で回転運動させるべく、カートリッジ（１）上の２つのラグ（１８３）と連動する２本の車軸に連結されたマイクロモータ（３１）を含む。

記述されているシステムは同様に、前記タンク（１１）と連動するためのピストン（４１）と、カートリッジ（１）及び加熱用プレート（２）より上で位置付けられ固定された光学蛍光励起／測定装置（５）（所定のプログラム可能な波長で励起させるための発光源及び発出された蛍光のための受光部）とをも含む。

図２Ａからわかるように、加熱用プレート（２）は、円盤の部分の形をした３つの金属ブロック（２１，２２，２３）（以下サーモブロックと呼ぶ）で構成されている。ここで、この実施形態においては、これらのサーモブロックは実質的に同じサイズであるが、その他の実施形態では、これらが異なるサイズのものであってもよい（なおここで「サイズ」は、上から見たその角度範囲を意味する）ということに留意すべきである。各サーモブロック（２１，２２，２３）は、増幅サイクル（ＰＣＲ）の段階（変性、プライマーアニーリング又は伸長）のうちの１つに対応する一定にプログラム可能な温度、すなわち一般的にはそれぞれ変性については９４℃，伸長については７２℃、そして使用されるプライマーのＴｍ（ハイブリダイゼーション温度）に応じてプライマーアニーリングについては３０〜４０℃及び６５〜７０℃の間の温度に導くことができるように設計されている。サーモブロックの温度は、当該技術分野において既知のあらゆる手段を用いて制御可能である。

図３を参照すると、カートリッジの周囲全体にわたり均一に分布した同数の流路（１２）により３６個の反応チャンバ（１３）に連結された４００μｌの容量を有する中央タンク（１１）が、カートリッジ（１）に設けられている（図３は、流路及びチャンバのうちのいくつかのみを示している）。これらの反応チャンバ（１３）には、カートリッジ（１）の縁部で開放するベント（１４）が設けられている。当該実施形態においては、流路の直径は０．２ｍｍであり、反応チャンバの容積は２．５マイクロリットルである。その他の実施形態においては、この直径及び容積は当然のことながら異なっていてよい。

すでに記述したように、このカートリッジ（１）には、マイクロモータ（３１）に連結された車軸（３２）の通過を可能にするためのオリフィスが各々あけられた２つのラグ（１８３）も設けられている。

図４においては、反応チャンバは、１ｍｍの深さを有する。その底の厚みは約０．２ｍｍである。これは、チャンバ（１３）とサーモブロック（２１，２２及び２３）との間の優れた熱交換を容易にするため充分薄いものである。反応チャンバ（１３）の上部部分は、同じくタンク（１１）の壁を形成する透明な壁によって閉じられている。

例示された装置は、以下のように使用される。

中央タンク（１１１）は、各々の周辺反応チャンバ（１０）内に予め置かれるプライマーを除き、分析対象核酸標本ならびに増幅反応のために必要とされる全ての成分、及び任意には蛍光核酸リポーター（この集合体を流体と呼ぶ）を収容するように意図されている。

当該実施形態においては、オペレータは、中央タンク内に７５ｎｇの核酸を含む９０μｌ（すなわち２．５μｌの３６倍）の流体を入れる。前記流体内の試薬の濃度は以下の通りである：
ｄＮＴＰ： ２００μＭ
Ｔａｑ緩衝液： １ｘ
ＭｇＣｌ_２ ： １５ｍＭ
Ｔａｑ： ４Ｕ
ＳｙｂｒＧｒｅｅｎ（登録商標）： １ｘ
Ｈ_２Ｏ： 充分量

各チャンバ（１０）は、負の制御を伴ういくつかのものとは別に、増幅すべき標的配列のための２つの特異的プライマー、及び、任意には、特異的なその後の蛍光測定を可能にする１以上の標識づけされたプローブを含む。当該実施形態においては、１０ｎｇの各プライマーが、負の制御として作用するものとは別に、各チャンバ内に置かれた。

タンク（１１）に部分的に流体を充填した後、なおここで容積は、チャンバの容積の合計であり（１つのチャンバの容積は「底」の表面積にその深さを乗じた積と定義づけされる）、複数の反応チャンバ（１３）内に流体を分配するためピストン（４１）が作動される。このピストンは、タンク（１１）内の圧力を増大でき、チャンバに向かっての流路内への流体の通過を可能にする。タンク内のピストンの変位速度は、毎秒約１ｍｍであり、前記変位は、チャンバに分配すべき流体の体積に左右されるレベルで停止される。

流路（１２）の直径が小さいことにより、重力下でのタンク（１１）から流路（１２）とチャンバ（１３）とへの流体の拡散が防止される（この規模では、毛管力といったように通常は無視できるプロセスが重要になり、この場合、タンク内に流体を保持するのに充分なものである）。ベント（１４）のため、チャンバ（１３）内に存在する空気は排出され、これがチャンバの充填を保証する。

サーモブロック（２１，２２，２３）は、ＰＣＲの各段階の３つの温度（又は加熱用プレート（２）とカートリッジ（１）との間のあらゆる熱損失を補償するためそれよりわずかに高い温度）に対応する３つの温度まで加熱され、各々の反応チャンバを連続的にかつ３つのサーモブロックにわたり所望の回数、通過させるべくカートリッジ（１）を移動させるように、変位手段（３）が作動させられる。

より厳密に言うと、ブロック（２１）は、変性段階に対応する温度（９４℃）まで加熱され、サーモブロック（２２）は、アニーリング段階に対応する温度（３６℃）まで加熱され、サーモブロック（２３）は伸長段階に対応する温度（７２℃）まで加熱される。

当該実施形態においては、変位手段（３）のためのマイクロモータ（３１）は、２．５秒毎に１０度ずつカートリッジ（１）の回転をひき起こすように設計されている（すなわち１．５分以内で１回のＰＣＲサイクル）。ただし、その他の実施形態においては、この動作は、異なる速度でもよく、間欠的ではなく連続的でもよい。

光学装置（５）が、伸長温度に対応する温度まで加熱された対応するブロック２３の上に、より特定的には、伸長段階の終りに対応する位置に設けられている点に注意すべきである。明らかに、光学装置（５）は、まず第１に使用される化学物質の関数として選択される異なる位置に位置づけることも可能である。一例を挙げると、ＴａｑＭａｎ化学物質又は非特異的蛍光を用いると、上述のように拡張段階の終りで測定を行なうことが必然的である。これとは対照的に、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｅａｃｏｎｓＴＭタイプの化学物質を使用すると、測定をアニーリング段階で行なわなくてはならなくなる。

該システムは、多数の反応チャンバを迅速にかつ、再現性ある手法で充填できるようにし、さらに、チャンバの中味がＰＣＲを受けることができるようにする。これは同様に、各ＰＣＲサイクルについて蛍光測定を行なうことができるようにする。

上述の実施形態は、本発明の範囲を制限することを意図したものではない。かくして、本発明の範囲から逸脱することなくこれに対しいくらかの修正を加えることが可能である。

例２： 改善された円形カートリッジ
図５〜１０は、例１のカートリッジに対するいくつかの修正を伴う円形カートリッジの例を示している。

このカートリッジは、閉鎖型システムにおいて使用するために提供される。すなわち反応チャンバ（１３）は、流路（１２）用入口以外の開口部をもたない。カートリッジは、互いに嵌合する２つの要素で構成されている。下部部分つまりベースは、図５及び６に示されており、上部部分又はカバーは、図７及び８に示されている。２つの部分のアセンブリは、図９及び１０に示されている。

このカートリッジは、以下のように装てんされる：すなわち、オペレータは、中央タンク内に分析対象核酸の抽出物を入れる。使い捨てカートリッジを器具の中に置く。この器具は、例えばポンプ（４２）を用いてカートリッジ内に負圧（およそＰ＝０．０５バール）を作り出す。圧力はその後回復され、こうして流体を流路内に引込み、周辺反応チャンバを充填させることができるようになる。かくして、例１の器具と比べ、流体はもはや圧力増加により分配されず、負圧によって分配され、このことは、ベントを必要とせずかくして閉鎖型システムとしてシステムを作動させることができるという利点をもつ。

必要とあらば、単一のタンクではなくむしろ複数のサブタンクを設けることもでき、こうして、同時に複数の標本を処理するという利点が得られる。

タンクの底面は、流体をその周囲につまり流路への入口の近くに分配できるようにするため円錐形である。

流路とタンクとの間の接合部には、まず第１に、中央部分に向かって流体が偶発的に戻る場合、又は流路内に全ての流体が引込まれていない場合に相互汚染を防止し、それと同時に、分配がひとたび完了しかつＰＣＲの前の時点で、閉鎖型システムとして（無汚染、無蒸発）の作動を可能にするべくこれらの垂直入口に整合するへこみをもつキャップを用いて流路を遮断することのできる垂直流路部分（１２３）によって構成された逆流防止システムが設けられている。

カートリッジはプラスチック好ましくはポリカーボネートであるが、これは、この重合体が有利な物理的及び光学的特性及び有利な熱特性を有するからである。

流路の寸法は、例えば断面が０．４×０．２ｍｍ（半円形）である。

使い捨てカートリッジは、例えば直径が１００ｍｍであり、８０個のチャンバ及び１〜８個のサブチャンバを伴う。

図１０に示されているように、カートリッジ（１）の底面は、切欠き（１８２）を含む中央突出部分（１８１）を有し、かくして突出部分（１８１）は加熱用プレート（２）内に入れ子状に収まり、マイクロモータ（３１）によって動かされる駆動機構又は車軸（３２）において変位手段（３）とカートリッジ（１）を連結するようになっている。突出部分（１８１）は、図２Ｂに示されているもののようなプレート（２）に対してカートリッジを位置づけできるようにしている。

反応チャンバには、標的配列のための特異的プライマー、そして必要とあらば前記標的に特異的なＴａｑＭａｎＴＭタイプ又はその他のプローブが装てんされる。利用分野に応じて、標的は、ウイルス又は細菌遺伝子、或る種の遺伝子修飾などを検出及び／又は同定するための植物のゲノムとトランスジーンの間の接合部などとなる。

８μｌの容積を有する３６個の反応チャンバ及び直径０．３ｍｍの流路を含む上述のカートリッジの一変形形態が、サルモネラ菌を検出するためのテストを実施するために使用された。以下の溶液２８８μｌ（すなわち８μｌの３６倍）を中央タンク内に入れた：
ＤＵＴＰ： ４００μＭ
ｄＮＴＰｓ： ２００μＭ
Ｔａｑ緩衝液： １ｘ
ＭｇＣｌ２ ： ３ｍＭ
Ｔａｑ： １５Ｕ
ＴＷＥＥＮ（登録商標）：０．００７％
ＳｙｂｒＧｒｅｅｎ（登録商標）： ０．１ｘ
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓからのゲノミックＤＮＡ：１ｎｇ
Ｈ２Ｏ： 充分量

Ｃｏｈｅｎ， Ｍｅｃｈａｎｄａ ｅｔ ａｌ．， １９９６により記述されたＦｉｎＡ１及びＦｉｎＡ２プライマー１．６ピコモルを反応チャンバ内に置いた。

この実験は、予想通りの陽性結果を生み出した。

例３： 矩形カートリッジ
図１１に例示されているこの例においては、タンクはもはや中央にはなく、一方の側にあり、カートリッジの運動はもはや必ずしも回転運動ではなく並進運動でもあり得る。

分配及び閉鎖モードは、まさに例２について記述した回転モードで記述したものであり得る。

代替的には、流体は、圧力を増加させることによって分配可能である。これらは、容積の合計が分析対象標本（核酸抽出物）の体積よりもわずかに少ない流路（１２１）の第１の部分の中に入る。流路（１２２）の第２の部分は、図１２に示されているようにプラスチックシステム内に内蔵されたはるかに小さな直径を有するガラス製毛細管により構成されている。その利点は、圧力降下現象を作り出し、流路の第１の部分を均一に充填できるようにすることにある（圧力が増大するにつれて１本の流路がもう一方の流路よりも速く充填される場合、この現象は、その他の流路が充填し終わるまで充填された流路の中を流体が前進するのを停止させる）。こうして、各流路についての容積を「予め較正」することができ、異なる下流側チャンバ（１３）は確実に均一に満たされることになる。チャンバの端部には、あらゆる余剰の流体が回収されるようなベントを介して取り去るようにしかつ接着テープを用いて閉鎖して蒸発を防止できるようにするための穴を上面にもつセル（１５）内に開放するベントが存在する。チャンバの容積（及び形状）は、流路の第１の部分のものに等しい。

流路の直径は０．４ｍｍである。すなわち流路間の空間が０．６ｍｍである場合、１ｍｍにつき１本の流路となる。かくして、８ｃｍの長さのカートリッジは、８０個のチャンバを収納している。

タンクにおいて流路を閉じるためには２つの可能性が考えられる：すなわち

最初の可能性は、例２にあるような、へこみをもつキャップを用いることから成る。圧力を増大させるピストン及び前記キャップは、このとき一体である。この場合、ピストンを、圧力によって流体を分配するための閉鎖ステップとこの閉鎖ステップとの間で解放して、閉鎖により、流体をチャンバから越流させることになる圧力の新たな増加がひき起こされることがないようにする。

第２の可能性は、流体より上に（余剰の）油を置くことから成る。チャンバがひとたび充填されたならば、流路（１２１）が少なくとも部分的に油で満たされ、汚染及び蒸発を防ぐ。

本発明の器具の単純化された実施形態の側面図を示す。 ブロック（２１〜２３）が円盤内の扇形である場合加熱用プレートの上面図である。 ブロック（２１〜２３）が環状の扇形で構成されている場合の加熱用プレートの上面図である。 反応チャンバが設けられたカートリッジ（１）と変位手段の一部分との第１の実施形態の斜視図である。 ラインＡＡに沿ったカートリッジの断面を示す。 本発明のカートリッジの第２の特定の実施形態の下部部分（ベース）の上面図を示す。寸法は、例示を目的として記されており、いかなる形であれ制限的意味をもつものではない。 図５中のラインＡＡに沿った下部カートリッジの断面を示す。 図５及び６に示されたカートリッジの上部部分（カバー）の上面図を示す。 図７中のラインＢＢに沿ったこの上部カートリッジの断面を示す。 図５及び６に示されたベース（実線）及び図７及び８で示されたカバー（破線）からなる完全なカートリッジを示す。 蛍光励起／測定手段（５）である上述の図９のカートリッジの３つの実施形態を示す。 矩形カートリッジ及びそのカートリッジのための２つの使用モードを示す。８つのサブタンク（１１１〜１１８）及び４０個の反応チャンバを含むカートリッジ（１）を示す。サブタンク１１１に連結された５本の流路のみを、対応する反応チャンバ（１３）と共に示す。 矩形カートリッジ及びそのカートリッジのための２つの使用モードを示す。矩形カートリッジ（１）と３つの平行な要素（２１〜２３）からなる加熱用プレート（２）を含む本発明の機械を示す。 矩形カートリッジ及びそのカートリッジのための２つの使用モードを示す。要素（２２）はその他のものに対してオフセットされている。このときカートリッジはＰＣＲサイクルを実施するべく三角形の経路内で移動させられなくてはならない。 圧力降下装置を伴う流路（１２）の概略図を示す。

Claims (40)

1. 少なくとも２つの異なるインキュベーション温度を必要とする、酵素反応及び／又は分子生物学反応を実施するための装置において：
   前記複数の反応チャンバ、タンク、流路を備える円形カートリッジであって、
   （ｉ）前記円形カートリッジは、回転幾何学的配置を有し、前記タンクは、実質的に前記カートリッジの中心に配置され、前記反応チャンバは、前記タンクの周りで円状に配置され、前記チャンバに前記タンクを連結させる前記流路は、基本的に放射状になっており、
   （ｉｉ）前記流路と前記タンクとの間の接合部は、前記タンクの周りで形成され、
   （ｉｉｉ）各反応チャンバは、前記流路を介して前記タンクに連結され、前記流路は、３ｍｍ未満の直径に嵌合し、
   （ｉｖ）前記タンクの容量は、１０ｍｌ未満である；
   前記円形カートリッジと；
   少なくとも２つの異なる温度まで加熱され得る少なくとも２つの別個のゾーンを有する固定された加熱用プレートと；
   前記カートリッジを回転させ、前記反応チャンバの温度の周期的変動を可能にする、相対的変位用手段と；
   を含む、装置。
2. 前記酵素反応は、核酸配列の熱依存性連鎖増幅であり、かつ、加熱用プレートのゾーンは、核酸増幅サイクル内の段階に対応する少なくとも２つの異なる温度まで加熱され得る、請求項１に記載の装置。
3. 前記反応チャンバ内で予め分配される、増幅すべき標的配列に特異的なプライマーを含み、
   前記タンクは、分析対象核酸の標本、プライマーを除いてポリメラーゼ連鎖増幅反応のために必要とされる試薬で構成された流体を収容し、
   前記加熱用プレートは、ポリメラーゼ連鎖増幅サイクルの３つの段階に対応する３つの異なる温度まで加熱できる３つの別個のゾーンを含む、請求項２に記載の装置。
4. 各サイクル内で前記反応チャンバの中味の蛍光を励起しかつ測定するべく配置された蛍光励起／測定用の光学手段を含む、核酸配列の実時間熱依存性連鎖増幅のための、請求項２又は３に記載の装置。
5. 前記プレートを加熱するための別個のゾーンが、少なくとも２つの円盤部分に対応して配置される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の装置。
6. 前記プレートを加熱するための別個のゾーンが、少なくとも２つ又は３つの円盤部分に対応して配置される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の装置。
7. 前記カートリッジが加熱用プレートと直接接触している、請求項１〜６のいずれか一項に記載の装置。
8. 前記加熱用プレートは、前記カートリッジと前記プレートとの間の相対的変位を促進するコーティングを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の装置。
9. 前記加熱用プレートは、その温度を定めるための手段に接続された２つ又は３つの別個のサーモブロックを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の装置。
10. 前記カートリッジの底面は、切欠きを含む中央突出部分を有し、かつ、前記変位手段は、前記カートリッジを回転運動で移動させるように前記切欠きと連動する少なくとも１つの駆動機構を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の装置。
11. 前記カートリッジの上に又は側面に配置された蛍光励起／測定のための光学手段を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の装置。
12. 前記タンク内に存在する流体を前記反応チャンバに供給するための手段をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の装置。
13. 前記供給手段がピストン装置を含み、かつ、前記圧力を増大させることにより前記反応チャンバに対し前記流体が供給される、請求項１２に記載の装置。
14. 前記供給手段がポンプを含み、かつ、負圧を確立した後に前記圧力を回復することにより前記反応チャンバに前記流体が供給される、請求項１３に記載の装置。
15. 前記カートリッジの前記反応チャンバが閉鎖される、請求項１４に記載の装置。
16. 請求項１〜１５のいずれか一項に記載の装置を用いて核酸を増幅するための方法であって、
    プライマーそして任意には蛍光核酸リポーターを除いて、増幅反応を実施するのに必要な成分及び分析対象核酸標本を含む流体をタンクに少なくとも部分的に充填する段階と；
    プライマー及び任意の１以上の標識づけされたプローブが中で位置付けられたカートリッジの反応チャンバまで前記流体を分配する段階と；
    カートリッジと加熱用プレートとの間の相対的変位のための手段を利用して、所望の回数だけ前記加熱用プレートの２つ、３つ又はそれ以上のゾーンにより画定された２つ、３つ又はそれ以上の温度まで各反応チャンバの中味を連続的に導く段階と；
    を含む、核酸を増幅するための方法。
17. 前記反応チャンバに流体を分配するための段階が、前記カートリッジ内部で負圧を加え、その後、前記圧力を回復することによって実施される、請求項１６に記載の核酸を増幅するための方法。
18. 閉鎖システムにおいて請求項２３に記載のカートリッジ内の反応チャンバの充填のためのプロセスであって、
    前記タンクに少なくとも部分的に流体を充填する段階と；
    圧力を調整するための手段にカートリッジを接続する段階と；
    カートリッジの内部に負圧を加え、次に圧力を回復する段階と；
    を含む、充填のためのプロセス。
19. 少なくとも２つの異なるインキュベーション温度を必要とする、酵素反応及び／又は分子生物学反応を実施するための装置であって：
    （ｉ）プライマーが予め堆積される複数の反応チャンバを備える円形カートリッジと、
    （ｉｉ）タンク及び流路であって、前記円形カートリッジは、回転幾何学的配置を有し、前記タンクは、実質的に前記カートリッジの中心に設置され、前記反応チャンバは、前記タンクの周りで円状に配置され、前記チャンバに前記タンクを連結させる前記流路は、基本的に放射状になっている、前記タンク及び流路と、
    （ｉｉｉ）少なくとも２つの異なる温度まで加熱され得る少なくとも２つの別個のゾーンを有する固定された加熱用プレートと、
    （ｉｖ）前記カートリッジを回転させ、前記反応チャンバの温度の周期的変動を可能にする、相対的変位用手段と、を備える、前記装置。
20. 前記カートリッジの流路の直径は、０．２ｍｍ以下である、請求項１に記載の装置。
21. 前記カートリッジのタンクの容量は、０．１ｍｌから１ｍｌの範囲内にある、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の装置。
22. ２０から５００個のカートリッジの反応チャンバを備える、請求項１，２０〜２１のいずれか一項に記載の装置。
23. 前記カートリッジの反応チャンバの前記容積が、０．２μｌ〜５０μｌの範囲内にある、請求項１，２０〜２２のいずれか一項に記載の装置。
24. 前記タンクの前記ベースは、円錐形である、請求項１，２０〜２３のいずれか一項に記載の装置。
25. 前記反応チャンバは、前記カートリッジの周りで配置される、請求項１，２０〜２４のいずれか一項に記載の装置。
26. １ｃｍから１０ｃｍの範囲内の直径を有する、請求項１，２０〜２５のいずれか一項に記載の装置。
27. 前記タンクが２〜８個のサブタンクに分割され、かつ、前記反応チャンバの各々が流路を介して前記サブタンクの１つのみに連結されている、請求項１，２０〜２６のいずれか一項に記載の装置。
28. 前記反応チャンバの深さが０．５〜１．５ｍｍの範囲内にある、請求項１，２０〜２７のいずれか一項に記載の装置。
29. プラスチック材料から製造されている、請求項１，２０〜２８のいずれか一項に記載の装置。
30. 厚みが０．５〜５ｍｍの範囲内にある、請求項１，２０〜２９のいずれか一項に記載の装置。
31. 前記反応チャンバの底が０．０５〜０．５ｍｍの範囲内の厚みをもつ、請求項１，２０〜３０のいずれか一項に記載の装置。
32. 前記反応チャンバが上部透明壁によって閉じられる、請求項１，２０〜３１のいずれか一項に記載の装置。
33. 前記反応チャンバにはベントが設けられている、請求項１，２０〜３２のいずれか一項に記載の装置。
34. 前記反応チャンバが閉じられている、請求項１，２０〜３３のいずれか一項に記載の装置。
35. 前記タンクが、前記タンク内の圧力を調整するための手段に適合されうる開口部を含む、請求項１，２０〜３４のいずれか一項に記載の装置。
36. 各流路が、異なる直径を有する少なくとも第１の部分と第２の部分によって構成され、前記第２の部分の直径が、前記流路内で圧力降下が生じるように前記第１の部分の直径よりも小さい、請求項１，２０〜３５のいずれか一項に記載の装置。
37. タンクとの接合部で各流路に逆流防止キャビティが具備され、前記逆流防止キャビティが前記流路の直径以上の直径を備えた実質的に垂直な流路部分により構成されている、請求項１，２０〜３６のいずれか一項に記載の装置。
38. 前記反応チャンバの少なくとも一部分がオリゴヌクレオチドを含む、請求項１，２０〜３７のいずれか一項に記載の装置。
39. 各反応チャンバが、増幅すべき核酸配列に特異的な２つのプライマー、及び場合により前記配列に特異的な標識付けされたプローブを含む、請求項１，２０〜３８のいずれか一項に記載の装置。
40. 前記反応チャンバの少なくとも１部分は、液体を置いた後に乾燥させることで内部に置かれている試薬を収容しており、かくして前記反応チャンバ内に流体が到達したことで前記試薬が再び溶液内に取込まれるようになっている、請求項１，２０〜３９のいずれか一項に記載の装置。

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