ES2372027T3

ES2372027T3 - Dispositivo para la amplificación en cadena termo-dependiente de secuencias de �?cidos nucleicos diana.

Info

Publication number: ES2372027T3
Application number: ES01956628T
Authority: ES
Inventors: Gabriel Festoc
Original assignee: GeneSystems SA
Current assignee: Pall Genedisc Technologies SAS
Priority date: 2000-07-28
Filing date: 2001-07-20
Publication date: 2012-01-13
Anticipated expiration: 2021-07-20
Also published as: EA004719B1; AU7855401A; JP4979873B2; EA200300203A1; FR2812306B1; FR2812306A1; JP2011200245A; ATE532583T1; WO2002009877A1; EP2269738A1; JP2004504828A; CA2416756C; AU2001278554B2; BR0112789A; US20050026277A1; CN1458866A; CN1248781C; ZA200300700B; EP1305115A1; CA2416756A1

Abstract

Cartucho de reacción que comprende varias cámaras de reacción (13), un reservorio (11) y canales (12), presentando el cartucho (1) las características siguientes: - el cartucho posee una geometría de revolución, en el cual el reservorio (11) está situado sensiblemente en el centro de dicho cartucho, las cámaras de reacción (13) están repartidas en círculo alrededor de dicho reservorio, y los canales (12) que unen dicho reservorio a dichas cámaras son esencialmente radiales; - el empalme entre los canales (12) y el reservorio (11) se hace en la periferia del reservorio; estando el cartucho de reacción caracterizado porque - cada cámara de reacción está unida al reservorio por un canal (12) que tiene una sección recta comprendida en un círculo de diámetro inferior a 3 mm; - la capacidad del reservorio es inferior a 10 ml; y - el fondo del reservorio es convexo, de manera a asegurar el reparto de un fluido contenido en el reservorio a nivel de la entrada de los canales

Description

Dispositivo para la amplificación en cadena termo-dependiente de secuencias de ácidos nucleicos diana

La presente invención se refiere al campo de la genética.

Más precisamente, la presente invención se refiere a un dispositivo para la amplificación de secuencias nucleicas diana, cartuchos de reacción utilizables en este dispositivo, y modos de utilización de este dispositivo.

La presente invención tiene como objetivo principalmente permitir la detección y, llegado el caso, la cuantificación en tiempo real, de secuencias de ácido nucleico diana en una o varias muestras.

La detección de secuencias nucleicas diana es una técnica cada vez más utilizada en numerosos campos, y el abanico de aplicaciones de esta técnica está llamado a extenderse a medida que sea más fiable, más económica y más rápida. Así, en salud humana, la detección de ciertas secuencias de ácido nucleico permite en ciertos casos un diagnóstico fiable y rápido de infecciones virales o bacterianas. Igualmente, la detección de ciertas particularidades genéticas puede permitir identificar susceptibilidades a ciertas enfermedades, o establecer un diagnóstico precoz de enfermedades genéticas o neoplásicas. La detección de secuencias nucleicas diana se utiliza también en la industria agroalimentaria, principalmente para asegurar la trazabilidad de los productos, para detectar la presencia de organismos genéticamente modificados e identificarlos, o para efectuar un control sanitario de los alimentos.

Los procedimientos de detección basados en los ácidos nucleicos hacen intervenir casi sistemáticamente una reacción de hibridación molecular entre una secuencia nucleica diana y uno o varias secuencias nucleicas complementarias de dicha secuencia diana. Estos procedimientos presentan numerosas variantes como las técnicas conocidas por el experto en la técnica bajo las expresiones “técnicas de transferencia” (blot, dot blot, Southern blot, Polimorfismo de longitud del fragmento de restricción, etc.), o también como los sistemas miniaturizados sobre los que se fijan previamente las secuencias complementarias de las secuencias diana (“biochips”). Dentro del marco de estas técnicas, las secuencias nucleicas complementarias se llaman generalmente sondas. Otra variante, que puede constituir en si la base de un procedimiento de diagnosis o no ser más que una etapa suplementaria en una de estas técnicas mencionadas anteriormente (con el fin principalmente de aumentar la concentración de la secuencia diana y por lo tanto la sensibilidad del diagnóstico), consiste en amplificar la secuencia de ácido nucleico diana. Se han descrito varias técnicas que permiten la amplificación específica de una secuencia de ácido nucleico, siendo la más utilizada la Reacción en Cadena de la Polimerasa (RCP), o Polymerase Chain Reaction (PCR). Dentro del marco de esta última técnica, se utilizan secuencias nucleicas complementarias de secuencias diana, llamadas cebadores, para amplificar dichas secuencias diana.

Las reacciones de PCR implican una repetición de ciclos, cuyo número varía generalmente de 20 a 50, y que están compuestos cada uno de tres fases sucesivas, a saber: desnaturalización, hibridación, elongación. Respectivamente, la primera fase corresponde a la transformación de los ácidos nucleicos bicatenarios en ácidos nucleicos monocatenarios, la segunda fase a la hibridación molecular entre la secuencia diana y los cebadores complementarios de dicha secuencia, y la tercera fase a la elongación de los cebadores complementarios hibridados en la secuencia diana, por una ADN polimerasa. Estas fases se llevan a temperatura específicas: generalmente 95ºC para la desnaturalización, 72ºC para la elongación, y entre 30ºC y 65ºC para la hibridación, según la temperatura de hibridación (Tm) de los cebadores utilizados. También es posible efectuar las etapas de hibridación y la elongación a la misma temperatura (generalmente 60ºC).

Una reacción de PCR consiste, por lo tanto, en un encadenamiento de ciclos térmicos repetitivos a lo largo del cual el número de moléculas de ADN diana que sirve de matriz se duplica teóricamente en cada ciclo. En realidad, el rendimiento de la PCR es inferior a 100%, si bien la cantidad del producto Xn obtenido después de n ciclos es:

Xn= Xn-1 (1 + rn), donde

Xn-1 es la cantidad de producto obtenido en el ciclo anterior, y rn el rendimiento de la PCR en el ciclo n (0 < rn ≤ 1).

Considerando el rendimiento constante, es decir idéntico para cada ciclo, la cantidad de producto Xn obtenido después de n ciclos a partir de una cantidad inicial Xo es entonces:

Xn= X0(1 + r)n (A)

En realidad, el rendimiento r disminuye a lo largo de la reacción de PCR, por el hecho de varios factores, tal como una cantidad limitante de al menos uno de los reactivos necesarios para la amplificación, la inactivación de la polimerasa por esos pasos repetidos a 95ºC, o su inhibición por los pirofosfatos producidos por la reacción.

Por el hecho de esta disminución del rendimiento, la cinética de una reacción de PCR presenta primero una fase exponencial (tanto que r es constante), que evoluciona luego hacia una fase plato cuando r disminuye.

A lo largo de la fase exponencial, la ecuación (A) anterior es válida, y puede escribirse también: log (Xn) = log (Xo) + n log (1 + r)

Así, en la fase exponencial de la PCR, la curva que presenta la cantidad de producto, en escala logarítmica, en función del número de ciclos, es una recta de pendiente (1 + r) y que corta el eje de las ordenadas en un valor igual al logaritmo de la concentración inicial.

La medida en tiempo real, de la cantidad de producto obtenido, puede permitir por lo tanto conocer la concentración inicial de la matriz, lo que es particularmente útil en un gran número de aplicaciones, por ejemplo para medir la carga viral de un enfermo, o también para conocer la variabilidad de un transcriptoma.

Generalmente, las PCR implican volúmenes de reacción que van de 2 a 50 l y se efectúan en tubos, microtubos, capilares o sistemas conocidos por el experto en la técnica bajo el término “microplacas” (es decir conjuntos de micro-tubos solidarizados). Cada lote de tubos o de contenedores equivalentes debe llevarse por lo tanto a tres temperaturas que corresponden a las diferentes fases de la PCR, y esto tantas veces como ciclos deseados.

La utilización de tubos o de sistemas similares obligan al usuario a efectuar múltiples manipulaciones para preparar tantos tubos y soluciones (conocidas por el experto en la técnica bajo la expresión “mix PCR”) como secuencias diana se deseen amplificar incluso a partir de una muestra única de ácidos nucleicos, con la excepción de los procedimientos de amplificación “multiplex”, que permiten la amplificación de varias secuencias diana simultáneamente en el mismo contenedor, bien por la utilización de cebadores dichos poco específicos que pueden hibridarse con varias secuencias diana como por ejemplo la técnica RAPD -polimomorfismo del ADN amplificado aleatoriamente por sus siglas en inglés, bien por la utilización de cebadores específicos pero en un número más importante, permitiendo cada pareja de cebadores utilizada la amplificación de una secuencia diana. Estas amplificaciones multiplex corresponden a casos particulares y no son la norma. Además, no garantizan la ausencia de interacciones de una reacción de amplificación sobre otra, y por razones principalmente de posibles hibridaciones entre los cebadores, no pueden ser limitadas más que en el número de secuencias diana amplificadas por continente.

Estas diferentes manipulaciones implican numerosos inconvenientes.

En primer lugar, son consumidoras de tiempo. En segundo lugar, no están exentas de riesgo desde el punto de vista de eventuales contaminaciones de un tubo a otro o desde el medioambiente exterior (polvo, bacteria, aerosol o cualquier otro contaminante susceptible de contener moléculas de ácidos nucleicos o moléculas susceptibles de influir sobre la eficacia de la reacción de amplificación). Además, no aseguran una homogeneidad de volumen y de concentración en reactivos de un tubo a otro. Finalmente, imponen la utilización de volúmenes manipulables manualmente, generalmente superiores a 1 μl, lo que tiene una incidencia sobre los costes ligados a la realización de las PCR, siendo los reactivos utilizados caros.

La utilización de dispositivos concebidos para automatizar al menos parcialmente tales manipulaciones permite paliar algunos de estos inconvenientes. Sin embargo, tales sistemas automatizados son relativamente caros y su utilización generalmente no se ve justificada económicamente, por lo tanto, más que en el caso de las PCR en grandes series, por ejemplo para la secuenciación de los genomas.

También existen ciertos sistemas automatizados que permiten realizar reacciones de PCR cinéticas. Como se ha visto anteriormente, la realización de una PCR cinética necesita cuantificar en tiempo real, y de manera específica, la secuencia diana amplificada. La utilización de un intercalante fluorescente en la mezcla de reacción permite medir el aumento de la cantidad total de ADN de doble hebra en dicha mezcla. Sin embargo, este método no permite discriminar la amplificación de la secuencia diana con respecto al ruido de fondo o a una eventual amplificación no específica. Se han descrito varios sistemas de sondas recientemente para permitir medir específicamente la amplificación de una secuencia diana determinada. Se basan en oligonucleótidos complementarios de dicha secuencia, y ligados a parejas de grupos fluoróforos o fluoróforos/amortiguadores), de tal manera que la hibridación de la sonda a su diana, y los ciclos de amplificación sucesivos conllevan, dependiendo del caso, un aumento o una disminución de la fluorescencia total de la mezcla, proporcionalmente a la amplificación de la secuencia diana.

A título de ejemplos de sondas utilizables para realizar PCR cinéticas, se pueden citar el sistema TaqManTM (ABI ®), el sistema AmpliSensorTM (InGen), y el sistema SunriseTM (Oncor ®, Appligène ®).

El sistema más utilizado actualmente es el sistema TaqManTM.

Este procedimiento asocia las actividades de ADN polimerasa y nucleasa 5’→3’ de la Taq polimerasa a lo largo de la PCR. Su principio es el siguiente: además de los cebadores de secuencia complementaria de la diana a cuantificar, una sonda, llamada sonda indicadora, se añade en el medio de reacción. Tiene la capacidad de hibridarse a la diana en el cuerpo de la secuencia amplificada, pero no puede ser amplificada ella misma. En efecto, un grupo fosforilo añadido en el extremo 3’ de la sonda impide su extensión por la Taq polimerasa. Un derivado de la fluoresceína y un derivado de la rodamina se incorporan a la sonda, respectivamente en el extremos 5’ y 3’. La sonda es de menor tamaño, también el derivado de la rodamina, situado en la proximidad de la fluoresceína, absorbe la energía emitida por la fluoresceína sometida a una fuente de excitación (fenómeno de extinción).

Una vez que los cebadores hibridados a la diana, a lo largo de la reacción de extensión, la Taq ADN polimerasa ataca la sonda por su actividad 5’ nucleasa, liberando el grupo extintor y reestableciendo así la emisión de fluorescencia. La intensidad de la fluorescencia emitida es proporcional entonces a la cantidad de productos de PCR formados, lo que permite obtener un resultado cuantitativo. La fluorescencia emitida es proporcional al número de moléculas diana de partida. La cinética de desarrollo de la fluorescencia puede seguirse en tiempo real a lo largo de la reacción de amplificación.

Esta técnica presenta la ventaja de ser fácilmente automatizable. Un aparato que permite realizar esta técnica, el ABI Prism 7700TM, es comercializado por la sociedad Perkin-Elmer. Este aparato combina un termociclador y un fluorímetro. Es capaz de detectar el aumento de fluorescencia generada a lo largo de un ensayo de cuantificación según el procedimiento TaqManTM, esto gracias a fibras ópticas situadas por debajo de cada tubo y unidas a una cámara CCD que detecta, en tiempo real, la señal emitida por los grupos fluorescentes liberados a lo largo de la PCR. Los datos cuantitativos se deducen a partir de la determinación del ciclo en el cual la señal del producto de amplificación alcanza un cierto umbral determinado por el usuario. En efecto, varios ensayos han mostrado que este número de ciclos era proporcional a la cantidad de material inicial (Gibson, Heid et al. 1996; Heid, Stevens et al. 1996; Williams, Giles et al. 1998).

El número de aplicaciones potenciales de tal aparato es considerable, tanto en salud humana como en agroalimentaria y en control de calidad. Desgraciadamente, el ABI Prism 7700TM y los otros pocos aparatos competidores comercializados actualmente son extremadamente caros. Además, solo pueden ser utilizados por un manipulador cualificado. En la práctica, por lo tanto tales aparatos no son utilizados más que en ciertas estructuras muy especializadas.

Por lo tanto, hoy existe una necesidad real por un sistema de amplificación de ácidos nucleicos, llegado el caso medido en tiempo real, y que no presente los inconvenientes citados anteriormente del estado de la técnica.

El objetivo de la presente invención es proponer tal sistema que permite disminuir considerablemente el número de manipulaciones necesarias en la realización de un método de amplificación sobre una pluralidad de secuencias diana y, en consecuencia, disminuir el tiempo necesario a esta operación.

Otro objetivo de la presente invención es proponer tal sistema que minimiza los riesgos de contaminación de un continente a otro.

Otro objetivo de la presente invención es proponer tal sistema que reduce los volúmenes de reactivos utilizados y por lo tanto los costes.

Otro objetivo de la presente invención es proponer tal sistema que optimiza una repartición homogénea en volumen y en concentración de los reactivos necesarios en la PCR en los continentes.

Otro objetivo es proporcionar a todos los usuarios potenciales, principalmente en los centros hospitalarios, en los laboratorios de análisis médicos, en los industriales de la agroalimentación y en los laboratorios de control sanitario, un aparato de uso y mantenimiento cómodos, para efectuar en rutina amplificaciones de ácidos nucleicos cuantificados en tiempo real.

En esta solicitud, se emplean varios términos, cuyo significado es el siguiente:

● Una “reacción de amplificación de ácidos nucleicos” hace referencia a cualquier método de amplificación de ácidos nucleicos conocido por el experto en la técnica. Se puede citar, a título de ejemplos, y de manera no restrictiva, la Reacción en Cadena de la Polimerasa (RCP), más comúnmente designada por el experto en la técnica bajo el acrónimo anglófono, PCR (Polymerase Chain Reaction), la TMA (amplificación mediada por transcripción por sus siglas en inglés), la NASBA (amplificación de secuencia de ácido nucleico por sus siglas en inglés), la 3SR (replicación de secuencias automantenidas por sus siglas en inglés), la amplificación por desplazamiento de hebra, o SDA por sus siglas en inglés y la LCR (reacción en cadena de la ligasa por sus siglas en inglés).

La matriz inicial de la amplificación puede ser cualquier tipo de ácido nucleico, ADN o ARN, genómico, plasmídico, recombinante, ADNc, ARNm, ARN ribosomal, ARN viral u otro. Cuando la matriz inicial es un ARN, una primera etapa de transcripción reversa se realiza en general para obtener una matriz ADN. Esta etapa no se mencionará en general en este texto, ya que el experto en la técnica sabe exactamente cuando y como realizarla. Se entiende que los dispositivos de la invención son utilizables para amplificar y eventualmente cuantificar específicamente secuencias de ARN tanto como de ADN. En los que sigue de texto, el término “PCR” será por lo tanto el término genérico utilizado para designar tanto la PCR propiamente dicha como la RT-PCR (transcripción inversa-Reacción en Cadena de la Polimerasa por sus siglas en inglés).

● Entre las reacciones de amplificación citadas anteriormente, ciertas son isotérmicas. Otras, principalmente la PCR y la LCR, implican llevar la mezcla de reacción a diferentes temperaturas a lo largo del tiempo, de manera cíclica. Tales reacciones se llaman aquí “reacciones de amplificación de ácidos nucleicos termo-dependientes”. En lo que sigue de este texto, el dispositivo de la invención se describirá principalmente en su aplicación a la PCR. Sin embargo, es bien evidente que este dispositivo no está limitado a esta técnica, y que puede utilizarse también para cualquier reacción de amplificación de ácidos nucleicos, véase para otras reacciones enzimáticas y/o de biología molecular. Este dispositivo está adaptado particularmente a las reacciones que necesitan volúmenes bajos y el paso cíclico de la mezcla de reacción a varias temperaturas, como aparecerá claramente en lo que sigue.

● Uno de los objetivos de la presente invención es proporcionar un nuevo dispositivo para efectuar reacciones de amplificación dichas “cuantitativas”, es decir que permiten determinar la concentración de secuencia diana inicialmente presente en la mezcla de reacción. Se han descrito varios tipos de reacciones de amplificación cuantitativas. Se pueden distinguir las amplificaciones cuantitativas basadas en el empleo de un patrón externo, las amplificaciones competitivas, utilizando un patrón interno, y finalmente las amplificaciones cinéticas, cuyo principio se ha mencionado anteriormente, y que consisten en medir en tiempo real, el aumento de la cantidad de la secuencia diana. Este tipo de amplificación será designado aquí indiferentemente bajo las expresiones “amplificación cinética (de ácidos nucleicos)” “PCR cinética”, “amplificación (de ácidos nucleicos) cuantificada en tiempo real”, o también “PCR en tiempo real”. Las expresiones entre paréntesis a veces son omitidas.

● En esta solicitud, el término “reactivo” debe comprenderse en su sentido amplio, como designando cualquier elemento necesario bien en la reacción de amplificación propiamente dicha, bien en su detección. Siguiendo esta definición, las sales, las dNTP, los cebadores o también la polimerasa, son reactivos necesarios para la PCR. Igualmente, un intercalante fluorescente, o una sonda, se consideran en este texto como reactivos participantes en la detección de los productos amplificados, aunque no reaccionen en el sentido literal.

Se definirán otros términos que designan ciertos elementos del dispositivo de la invención más adelante en la descripción detallada de la invención.

Ciertos elementos del dispositivo están numerados en referencia a los dibujos, que ilustran algunos modos y variantes no limitativas de la realización de la invención, y en las que:

● la figura 1 representa una vista lateral de una realización simplificada del dispositivo según la presente

invención;

●: la figura 2 representa una vista superior de la placa calefactora, en el caso en el que los bloques (21 a 23) son sectores de disco (figura 2A), y en el caso en el que están constituidos por sectores de corona (figura 2B);

●: la figura 3 representa una vista en perspectiva de un primer ejemplo de realización del cartucho (1), provisto de las cámaras de reacción y de una parte de los medios de desplazamiento;

● la figura 4 representa una vista transversal de este cartucho en acuerdo parcial con la invención según la

línea AA;

● la figura 5 representa una vista superior de la parte inferior (base) de un segundo modo de realización particular del cartucho según la invención. Las cotas están dadas a título puramente indicativo, y no son en ningún caso limitantes;

●: la figura 6 representa una vista transversal de este cartucho inferior, según la línea AA de la figura 5;

●: la figura 7 representa una vista superior de la parte superior (tapa) del cartucho representado en las

figuras 5 y 6;

●: la figura 8 representa una vista transversal de este cartucho superior, siguiendo la línea BB de la figura 7;

●: la figura 9 representa un cartucho completo, constituido por la base representada en las figuras 5 y 6

(trazos continuos), y de la tapa representada en las figuras 7 y 8 (trazos discontinuos);

● la figura 10 muestra tres modelizaciones del cartucho de la figura 9, por encima del cual se encuentran los medios de excitación/medida de la fluorescencia (5);

● la figura 11 muestra un corte esquemático de un canal (12), que posee un dispositivo de “pérdida de

carga”.

La invención se refiere en primer lugar a cualquier dispositivo para efectuar reacciones enzimáticas y/o de biología molecular que necesita al menos dos temperaturas de incubación diferentes, caracterizado porque comprende:

-: al menos una placa o cartucho (1), según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, que presenta una pluralidad de cámaras de reacción (13) y un reservorio (11), estando unidas dichas cámaras de reacción al reservorio por canales (12);

-: al menos una placa calefactora (2) que presenta al menos dos zonas distintas que pueden llevarse al menos a dos temperaturas diferentes;

-: medios (3) de desplazamiento relativo entre dicho cartucho y dicha placa, que permite una variación cíclica de la temperatura de las cámaras de reacción.

La temperatura de cada zona de la placa puede ser homogénea o, llegado el caso, esta temperatura puede variar siguiendo un gradiente.

Varios tipos de reacción de biología molecular necesitan situar la mezcla de reacción a diferentes temperaturas en función del tiempo. Esto es el caso por ejemplo cuando se desea inactivar una enzima después de haberla utilizado (por ejemplo, una nucleasa de restricción), o para ensayar la estabilidad de un complejo. En este último caso, se puede prever situar un complejo (por ejemplo, un complejo antígeno/anticuerpo, o receptor/ligando), estando uno de los elementos acoplado a un fluoróforo y el otro a un amortiguador de fluorescencia, en una de las cámaras de reacción del dispositivo. La placa se programa entonces para presentar varias temperaturas en un orden creciente, llegado el caso en forma de un gradiente. La estabilidad del complejo se ensaya entonces desplazando el cartucho sobre la placa, de manera a que la temperatura de la cámara de reacción suba progresivamente, y observando el aumento de la fluorescencia, con ayuda de medios de excitación/medida de fluorescencia situados en frente de la cámara de reacción. El aumento de la fluorescencia traduce entonces la disociación del complejo.

El dispositivo de la invención está adaptado particularmente a reacciones que necesitan una variación cíclica de la temperatura de las cámaras de reacción, lo que es el caso para ciertas reacciones de amplificación de ácidos nucleicos, por ejemplo para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), o para la reacción en cadena de ligasa (LCR).

La invención se refiere por lo tanto en particular a un dispositivo para la amplificación en cadena termo-dependiente de secuencias de ácidos nucleicos diana, caracterizado porque comprende:

-: al menos un cartucho según una de las reivindicaciones a 1 a 22.

-: al menos una placa calefactora (2) que presenta al menos dos zonas distintas que pueden llevarse a al menos dos temperaturas diferentes, que corresponden a las fases de los ciclos de amplificación de dichos ácidos nucleicos diana;

Tal sistema según la invención es menos complejo que los sistemas de la técnica anterior, en la medida en la que las temperaturas necesarias en los ciclos de amplificación en cadena están aseguradas por zonas distintas de temperaturas constantes y no por una placa de la que hay que variar la temperatura.

Es importante notar que las reacciones de amplificación en cadena termo-dependientes necesitan el paso de las muestras a al menos dos temperaturas. Por ejemplo, la LCR necesita en cada ciclo un fase a aproximadamente 95ºC para desnaturalizar el ADN diana, luego una fase entre 55 y 65ºC (en función de la Tm de las sondas), para dar lugar a la hibridación/ligación. En lo que se refiere a la PCR, cada ciclo se descompone en general en tres fases, a saber la desnaturalización a aproximadamente 95ºC, la hibridación cuya temperatura depende de la Tm de las sondas, y la elongación, habitualmente realizada a 72ºC. Sin embargo es posible realizar PCR que tienen ciclos simplificados, en los que la hibridación y la elongación se hacen a la misma temperatura, aunque cada ciclo necesite solamente dos temperaturas diferentes.

Se podrá prever diferentes variantes del dispositivo descrito anteriormente. Según una variante preferente de la invención, el sistema comprende las características siguientes:

-: se reparten previamente cebadores específicos de secuencias diana a amplificar en las cámaras de reacción (13),

-: el reservorio (11) está destinado a recibir un fluido compuesto principalmente de una muestra de ácidos nucleicos a analizar y reactivos necesarios a una reacción de amplificación en cadena de la polimerasa, con la excepción de los cebadores.

-: la placa calefactora (2) presenta tres zonas distintas que pueden llevarse a tres temperaturas diferentes, que corresponden a las tres fases de los ciclos de la reacción en cadena de la polimerasa.

Según una variante preferente, es posible distribuir, a partir de un reservorio, un fluido que contiene una muestra de ácidos nucleicos a analizar y los reactivos necesarios para la PCR en una pluralidad de cámaras de reacción que contienen los cebadores específicos de secuencias diana de ácidos nucleicos a amplificar, y autorizar el procedimiento de amplificación sometiendo el contenido de las cámaras sucesivamente a diferentes temperaturas ( a saber las necesarias para la desnaturalización, la hibridación y la elongación) una multitud de veces gracias a un movimiento relativo entre el cartucho que incluye dichas cámaras de reacción y dicha placa calefactora que presenta dos o tres zonas distintas que pueden llevarse a temperaturas diferentes.

Llegado el caso, las cámaras de reacción (13) pueden contener reactivos necesarios para una reacción de PCR en tiempo real distintos a los cebadores mencionados anteriormente. En una realización preferida del dispositivo de la invención, las cámaras de reacción comprenden igualmente, además de los cebadores, una o varias sonda(s) específica(s) de la secuencia a amplificar. La distribución de las sondas en las cámaras de reacción puede ser también de manera que ciertas cámaras contengan sondas específicas de las secuencias a amplificar y otras cámaras que comprenden sondas control, no reconociendo a priori la secuencia a amplificar. Estas sondas pueden estar marcadas y, si están presentes varias sondas en una misma cámara de reacción (por ejemplo una sonda específica de la secuencia a amplificar y una sonda control), estas sondas estarán marcadas preferentemente por fluoróforos diferentes.

En otra variante del dispositivo, se depositan inicialmente reactivos suplementarios, tal como los dNTP o sales, en las cámaras de reacción. Estos reactivos estarán entonces ausentes, o presentes en menor cantidad, en el fluido depositado en el reservorio (11). En el caso extremo, todos los reactivos necesarios para la reacción de PCR, con la excepción de la matriz, se depositarán en las cámaras de reacción (13), y el fluido depositado en el reservorio (11) comprenderá entonces únicamente la muestra de ADN (o ARN) a amplificar.

Las variantes descritas anteriormente suponen que varias reacciones se realicen en paralelo, con cebadores y/o sondas diferentes, sobre una misma muestra. Por lo tanto se trata de la caracterización de una muestra única (o de algunas muestras si el reservorio está dividido en algunos sub-reservorios) siguiendo varios criterios. En ciertas aplicaciones, se desea por el contrario caracterizar una multitud de muestras siguiendo un criterio único o un bajo número de criterios. Esto es el caso por ejemplo en investigación, cuando se desea cribar un banco de fagos o de bacterias para la presencia de un gen dado. En este caso es necesario efectuar una PCR sobre un gran número de muestras, a partir de una pareja de cebadores dados. El dispositivo de la invención se adapta también a este tipo de manipulaciones. Para ello, las muestras se depositan en las cámaras de reacción (13). Los cebadores pueden introducirse en el fluido depositado en el reservorio (11), con los otros reactivos necesarios para la PCR. Por supuesto, esta configuración no excluye tampoco que ciertos reactivos distintos a la muestra a analizar sean depositados previamente en las cámaras de reacción (13).

Cualquier que sea la variante del dispositivo elegido, y cualquiera que sean los reactivos depositados en las cámaras de reacción (13), pueden depositarse ventajosamente por un simple depósito líquido, seguido de un secado. La llegada del fluido proveniente del reservorio (11) permite luego la puesta en disolución de estos reactivos. La cantidad de cada reactivo depositada se calcula en función del volumen de fluido que penetrará en cada cámara de reacción (13), de tal manera que la puesta en solución de los reactivos conduzca a la concentración final deseada para cada uno de ellos. Estos cartuchos tal como se han descrito anteriormente, en los que al menos una parte de las cámaras de reacción (13) comprenden reactivos que han estado cargados con un depósito fluido, seguido de un secado, de tal manera que estos reactivos se vuelvan a poner en disolución con la llegada de un fluido en estas cámaras de reacción, son igualmente parte integrante de la invención.

El dispositivo descrito anteriormente presenta la ventaja de autorizar un rellenado concomitante de todas las cámaras de reacción, lo que disminuye el tiempo de preparación y los riesgos de contaminación de una cámara a otra. Este dispositivo presenta igualmente la ventaja de poder ser miniaturizado e implicar la utilización de volúmenes de reactivos más bajos que en el estado de la técnica.

Finalmente se notará también que, gracias a la placa calefactora específica que propone, la invención permite acelerar los ciclos de la PCR, ya que no es necesario para efectuar las diferentes fases (desnaturalización, hibridación, elongación) hacer variar la temperatura de la placa calefactora o la atmósfera como en el estado de la técnica, permitiendo el movimiento relativo entre el cartucho y la placa someter rápidamente y sucesivamente el contenido de cada una de las cámaras de reacción a tres temperaturas distintas dedicadas a cada una de estas fases. La utilización de volúmenes bajos de reacción, y de un suelo de bajo espesor para el cartucho (1), permite también limitar la inercia térmica a nivel de las cámaras de reacción, y contribuyen por lo tanto a la rapidez de la reacción.

La invención se refiere igualmente a un dispositivo para la amplificación en cadena termo-dependiente de secuencias de ácidos nucleicos diana, medida en tiempo real, caracterizado porque comprende los mismos elementos que uno cualquiera de los dispositivos descritos anteriormente, y comprendiendo además medios ópticos

(5) de excitación/medida de la fluorescencia, dispuestos de manera a excitar y medir en cada ciclo la fluorescencia del contenido de las cámaras de reacción.

Uno de los elementos particularmente originales de los dispositivos descritos anteriormente es el elemento denominado indiferentemente placa o cartucho de reacción (1). Este elemento puede ser reciclable o, de manera preferente, consumible, y constituye en si un aspecto de la presente invención. Así, la invención se refiere igualmente a un cartucho de reacción según la reivindicación 1.

La disposición de las cámaras de reacción y de los canales con respecto al reservorio permite repartir un fluido de manera homogénea en las cámaras de reacción, a partir del reservorio. El documento DE-A-19852835 divulga un cartucho de reacción del mismo tipo.

Preferentemente el diámetro de los canales se elegirá suficientemente bajo para no permitir una distribución por gravedad del fluido presente en el reservorio en las cámaras de reacción, esto de manera a evitar un rellenado no reproductible de estas cámaras. Este diámetro será, así, preferentemente inferior o igual a aproximadamente 0,2 mm. Respecto a este diámetro, se notará que la sección de estos canales será preferentemente circular pero podrá ser igualmente de cualquier otra forma y principalmente poligonal, previendo el “diámetro” de los canales entonces su anchura más grande en sección.

El reservorio destinado a recibir la muestra de ácidos nucleicos y los reactivos necesarios para la PCR podrá presentar una capacidad variable, comprendida por ejemplo entre aproximadamente 0,1 ml y aproximadamente 1 ml.

El cartucho comprende preferentemente entre aproximadamente 20 y aproximadamente 500 cámaras de reacción y, de manera más preferida, entre 60 y 100 cámaras de reacción.

El volumen de estas cámaras podrá variar igualmente según los modos de realización. Ventajosamente, estas cámaras presentan un volumen comprendido entre aproximadamente 0,2 y 50 μl, preferentemente entre 1 μl y 10 μl.

En los cartuchos de la invención, el empalme entre los canales (12) y el reservorio (11) se hace en la periferia del reservorio, y el fondo de dicho reservorio es convexo, de manera a asegurar la repartición de un fluido contenido en el reservorio a nivel de la entrada de los canales.

Se notará que un cartucho según la invención puede presentar múltiples formas. Sin embargo, según una variante preferente de la invención, este cartucho presenta una forma circular. El reservorio está previsto sensiblemente en el centro del cartucho, estando repartidas las cámaras de reacción en círculo alrededor del reservorio, y estando previstos los canales uniendo el reservorio a las cámaras, esencialmente de forma radial. Tal arquitectura permite optimizar el rellenado de las cámaras de reacción a partir del reservorio central.

En una realización particular de los cartuchos circulares de la invención, el fondo del reservorio (11) es cónico.

Igualmente, preferentemente, dichas cámaras de reacción están previstas relativamente en la periferia de dicho cartucho. Así, es posible optimizar el número de cámaras de reacción que pueden ser previstas sobre el cartucho y rellenas a partir del reservorio central.

Igualmente de forma preferente, dichas cámaras de reacción están previstas relativamente a la periferia de dicho cartucho. Así, es posible optimizar el número de cámaras de reacción que pueden preverse sobre el cartucho y rellenarse a partir del reservorio central.

Según una variante de la invención, tal cartucho comprende tantos canales como cámaras de reacción. Sin embargo, en ciertos modelos de realización, se podrán prever segmentos de canales comunes a varias cámaras de reacción.

Una de las ventajas de la presente invención es permitir una miniaturización del dispositivo que propone. Así, ventajosamente, el cartucho presenta preferentemente un diámetro comprendido entre aproximadamente 1 y 10 cm.

Una variante de los cartuchos de la invención descritos anteriormente, cualquiera que sea su geometría, consiste en dividir el reservorio (11) en 2 a 20, preferentemente 2 a 8 sub-reservorios, permitiendo analizar simultáneamente varias muestras sobre un mismo cartucho. En este caso, cada una de las cámaras de reacción (13) está unida a uno solo de estos sub-reservorios por un canal (12).

La profundidad de las cámaras de reacción (con respecto a los canales) puede variar también en función de los modos de realización de la invención. Según una variante preferente, estas cámaras presentan una profundidad comprendida entre aproximadamente 0,5 mm y 1,5 mm.

Se notará además que el espesor del cartucho depende de varios factores y principalmente del material que lo constituye. En la práctica, este cartucho está constituido preferentemente en materia plástica, preferentemente en policarbonato, cuyas propiedades físicas, ópticas y térmicas, son apropiadas para la realización de la presente invención. El espesor de los cartuchos de la invención está comprendido preferentemente entre 0,5 y 5 mm.

Con el fin de facilitar los intercambios térmicos entre el contenido de las cámaras de reacción y la placa, el espesor del “suelo” de estas deberá ser, de forma preferente, tan bajo como sea posible. Este espesor depende del material utilizado para realizar el cartucho. Preferentemente, está comprendido entre 0,05 y 0,5 mm, por ejemplo aproximadamente 0,25 mm.

Las cámaras de reacción de los cartuchos de la invención están cerradas preferentemente con una pared superior transparente (17), por ejemplo en plástico transparente, con el fin de permitir la excitación y la medida de la fluorescencia del fluido de reacción, en buenas condiciones.

En una realización particular de la invención, las cámaras están provistas de respiraderos (sistema abierto), que permite al aire que contienen escaparse durante el rellenado con el fluido que proviene del reservorio.

En el caso anterior, en el que las cámaras (13) están provistas de respiraderos (14), los canales (12) están constituidos preferentemente por al menos dos partes de diámetros diferentes (121 y 122), siendo inferior el diámetro de la segunda parte (122) al de la primera parte (121), de manera a crear una pérdida de carga en el canal (12). Así, si un canal se rellena más rápidamente que otro bajo el efecto de la presión, el fenómeno de pérdida de carga permite parar la progresión del fluido en el o los canales cuya primera parte (121) está llena, hasta que todos los canales estén rellenos de la misma manera. Esto permite “pre-calibrar” los volúmenes para cada canal, con el fin de asegurar un rellenado homogéneo de las diferentes cámaras de reacción. La segunda parte del canal (122) puede estar constituida por ejemplo por un capilar de vidrio, de diámetro mucho más bajo que la primera parte (121), estando dicho capilar incluido en un cartucho de plástico.

También es posible prever recintos (15) donde desembocan los respiraderos (14) de las cámaras de reacción. Estos recintos poseen una apertura (16) hacia el exterior del cartucho (sistema abierto), y presentan el interés, por una parte, de recuperar sin contaminación los eventuales excesos de fluido que saldrían de las cámaras de reacción por los respiraderos (14) y, por otra parte, de poder cerrarse después del rellenado de las cámaras de reacción. Este cierre puede hacerse por ejemplo utilizando una banda adhesiva, y permite pasar en sistema cerrado para efectuar la amplificación propiamente dicha. Esto permite evitar o al menos limitar la evaporación del fluido contenido en el cartucho (1). Esta realización de la invención está en la figura 11.

Alternativamente, es posible trabajar en sistema cerrado desde el rellenado de las cámaras de reacción, provocando en el cartucho una depresión seguida de un reestablecimiento de la presión, como se detallará más adelante. Estos cartuchos en los que las cámaras de reacción no poseen otra apertura que la llegada del canal (12) (cámaras de reacción dichas “cerradas”) hacen por lo tanto igualmente parte de la invención.

Los cartuchos descrito anteriormente, previstos bien para un uso en sistema abierto, bien para un uso en sistema cerrado, comprenden preferentemente una apertura adaptable a medios (4) de modulación de la presión en el reservorio (11), permitiendo desplazar el fluido presente en el reservorio hacia las cámaras de reacción.

La invención se refiere igualmente a un procedimiento de rellenado en sistema cerrado de las cámaras de reacción

(13) de un cartucho (1) tal como se ha descrito en el párrafo anterior, en la variante en la que las cámaras de reacción están cerradas, comprendiendo este procedimiento las etapas siguientes:

-: rellenar al menos parcialmente el reservorio (11) con un fluido,

-: conectar el cartucho (1) a los medios (4) de modulación de la presión,

-: aplicar un depresión en el inferior del cartucho, luego restablecer la presión

En una variante de los cartuchos de la invención, cada canal (12) está equipado con una cavidad anti-reflujo (123) a nivel de su empalme con el reservorio (11), estando constituida dicha cavidad anti-reflujo por una porción de canal sensiblemente vertical, de un diámetro superior o igual al del canal (12). Esta variante presenta dos ventajas principales. Por una parte, estas cavidades anti-reflujo permiten prevenir las contaminaciones cruzadas en caso de retorno intempestivo del fluido hacia el reservorio (11), o en el caso en el que todo fluido no habría entrado en los canales. Por otra parte, estas cavidades permiten prever, en los dispositivos de la invención, un tapón cuyos dientes vienen a casar en estas entradas verticales, con el fin de taponar los canales después del direccionamiento del fluido de reacción pero antes de la reacción de amplificación. Esto permite trabajar en sistema perfectamente cerrado, y por lo tanto evitar todo riesgo de contaminación y de evaporación. Sin embargo, es importante notar que las cavidades anti-reflujo, y la utilización de un tapón a nivel del reservorio para taponar la entrada de los canales del lado del reservorio, pueden ser empleadas también en el caso de sistemas abiertos tal como se han descrito anteriormente, en donde las cámaras de reacción están provistas de respiraderos.

En una realización preferida de los cartuchos de la invención, una parte al menos de las cámaras de reacción (13) comprende oligonucleótidos. De manera más preferida, cada una de las cámaras de reacción (13) comprende dos cebadores específicos de una secuencia de ácido nucleico a amplificar y, facultativamente, una o varias sonda(s) marcada(s) específica(s) de dicha secuencia. Tal sonda puede estar marcada de manera que su señal aumente cuando se hibrida a su secuencia diana (sistema SunriseTM), o de manera a que la elongación a partir de una hebra sobre la cual se hibrida conlleva una disminución o un aumento de la señal (sistema AmpliSensorTM o sistema TaqManTM, respectivamente). La presencia de tales sondas en las cámaras de reacción permite realizar amplificaciones cuantificadas en tiempo real, con un dispositivo de la invención que dispone de medios (5) de excitación / medida de la fluorescencia, tal como se ha descrito anteriormente. Sondas no específicas de la secuencia a amplificar, y marcadas de una manera diferente a las sondas específicas, pueden ser utilizadas también, para detectar eventuales contaminaciones.

En la realización de la invención descrita anteriormente, donde las cámaras de reacción comprenden cebadores y, facultativamente una o varias sonda(s), estas sondas y cebadores diferentes se elegirán preferentemente de tal forma que sus temperaturas de fusión (Tm) respectivas sean próximas. En particular, la Tm de diferentes cebadores estará comprendida preferentemente en un mismo intervalo de aproximadamente 5ºC. De la misma manera, las diferentes sondas tendrán preferentemente una Tm comprendida en un mismo intervalo de 5ºC, que puede ser diferente del intervalo de las Tm de los cebadores. En este caso, las sondas se elegirán de tal forma que su Tm sea superior a la de los cebadores, siendo entonces la diferencia entre Tm de diferentes categorías de oligonucleótidos preferentemente del orden de 5ºC. La temperatura de hibridación retenida para efectuar la amplificación corresponde entonces a la más baja de las temperaturas de fusión de los cebadores.

Las cámaras de reacción (13) de los cartuchos de la invención pueden comprender también, además de los cebadores y las sondas eventuales, uno o varios otros reactivos necesarios para la reacción de PCR o a la medida de amplificación. Se puede tratar, por ejemplo, de sales, de dNTP, o de un intercalante fluorescente del ADN de doble hebra, de tipo SybrGreen (marca registrada). Como se ha mencionado anteriormente, todos estos reactivos están depositados ventajosamente a nivel de las cámaras de reacción (13) por el depósito de una solución líquida, seguida de secado.

Según un modo de realización alternativo de los cartuchos de la invención, los cartuchos están previstos para el cribado de un gran número de muestras siguiendo un bajo número de criterios. Esto implica que el usuario de estos cartuchos puede depositar fácilmente estas muestras en cada una de las cámaras de reacción (13). Por ello, el cartucho puede poseer por ejemplo una tapa móvil que, cuando se retira da acceso directamente a las cámaras de reacción. Tales cartuchos pueden cargarse también previamente y comprender, a nivel de las cámaras de reacción (13), uno o varios reactivos necesario(s) para la amplificación y/o para su detección.

Por supuesto, los dispositivos de la invención mencionados anteriormente pueden comprender uno o varios cartuchos que corresponden a cualquier cartucho descrito anteriormente.

En la realización particular del dispositivo de la invención, donde el cartucho es circular, las zonas distintas de calentamiento de la placa calefactora (2) están preferentemente repartidas según porciones de disco (figura 2A) o de corona (2B). Cada porción puede calentarse a una temperatura distinta para llevar sucesivamente el contenido de las cámaras de reacción a las temperaturas distintas deseadas, gracias a los medios de desplazamiento (3) relativos entre el cartucho (1) y la placa calefactora (2). Con el fin de limitar los problemas de evaporación y de condensación en el cartucho (1), los termobloque son de forma preferente suficientemente grandes para calentar también una parte de los canales, como está representado por ejemplo en la figura 11, dentro del marco de un cartucho rectangular.

Es importante notar que el número de zonas de calentamiento distintas puede ser igual a dos, tres, o más. Por ejemplo, en el caso de una PCR a dos temperaturas, la placa podrá presentar una zona a 95ºC para la desnaturalización de los ácidos nucleicos de doble hebra, y una zona a 60ºC para la hibridación de los cebadores y la elongación. En el caso de una PCR a tres temperaturas, la placa presentará una zona a 95ºC (desnaturalización),

una zona entre 40 y 70ºC (hibridación de los cebadores), y una zona a 72ºC (elongación). Finalmente, la placa

puede presentar un número de zonas superior a tres, por ejemplo para bloquear provisionalmente la reacción en un momento dado de cada ciclo. La placa puede presentar también un número de zonas que sea múltiple de dos o tres, de tal manera que una vuelta del cartucho corresponde a varios ciclos de PCR. Finalmente, es importante notar que el tamaño relativo de las diferentes zonas de calentamiento se elige de forma ventajosa proporcionalmente a la duración de incubación deseada para el fluido de reacción a la temperatura de dicha zona. Así, en la placa representada en la figura 2B, el termobloque 21, dedicado a la etapa de desnaturalización, tiene una superficie dos veces menor que la de los termobloques destinados a las etapas de hibridación y de elongación (bloques 22 y 23, respectivamente). Eligiendo una velocidad de rotación relativa del cartucho sobre la placa tal que una rotación de 360º se efectúa en 150 segundos, se obtiene por lo tanto ciclos en los que la desnaturalización dura 30 segundos, la hibridación 1 minuto y la elongación 1 minuto.

Sobre los medios de desplazamiento se notará que, según un modo preferente de realización de la invención, la placa (2) está fija y el cartucho (1) es movido gracias a los medios de desplazamiento (3).

Sin embargo, en otros modos de realización, se podrá igualmente prever un cartucho fijo y una placa calefactora puesta en movimiento gracias a dichos medios de desplazamiento.

En el modo de realización particularmente preferido de la invención, según el cual el cartucho es circular, los medios de desplazamiento (3) permiten la puesta en rotación de dicho cartucho y/o de dicha placa.

Se puede prever un elemento conductor entre el cartucho y la placa calefactora. Sin embargo, según una variante preferente de la invención, dicho cartucho está en contacto directo con dicha placa calefactora. En este caso, dicha placa está provista ventajosamente de un revestimiento que favorece el desplazamiento entre dicho cartucho y dicha placa. Tal revestimiento puede estar constituido por ejemplo por Teflón (marca registrada).

Tal como se ha indicado anteriormente, la placa calefactora del sistema puede presentar al menos dos o tres zonas que pueden ser llevadas a temperaturas distintas. Preferentemente, esta placa está constituida por dos o tres bloques térmicos independientes (“termobloques”) distintos unidos a medios de programación de su temperatura. En el caso en el que la placa comprende tres termobloques (21 a 23), el primero de estos termobloques (21) se calienta a la temperatura de desnaturalización, el segundo (22) a la temperatura de hibridación, el tercero (23) a la temperatura de elongación. La utilización de tales termobloques de temperatura constante simplifica la realización de la placa calefactora.

Los medios de desplazamiento relativo del cartucho con respecto a la placa podrán ser realizados bajo múltiples formas. Según un modo de realización preferido, ilustrado en la figura 10, el cartucho (1) presenta por debajo una parte saliente central (181) que comprende una muesca (182), de tal manera que la parte saliente (181) se encastra en la placa calefactora (2) y une el cartucho (1) con los medios de desplazamiento (3) a nivel de un taco o eje (32) puesto en movimiento por un micromotor (31). La parte saliente (181) permite por lo tanto por una parte, posicionar el cartucho con respecto a una placa (2) tal como la representada en la figura 2B, y por otra parte, asegurar su unión con los medios de puesta en movimiento (3).

Según un modo de realización alternativo, representado en las figuras 1 y 3, el cartucho presenta al menos una oreja

(183) y los medios de desplazamiento (3) incluyen al menos un eje (32) cooperando con dicha oreja para inculcar a dicho cartucho un movimiento rotativo.

El modo de desplazamiento relativo entre la placa y el cartucho podrá variar según los modos de realización. Podrá tratarse de un desplazamiento de velocidad continua o a golpes. La velocidad de desplazamiento podrá ser constante o variar en el tiempo.

Ventajosamente, el sistema según la invención comprende igualmente medios ópticos de excitación/medida de la fluorescencia, previstos por ejemplo por encima o sobre el lado de dicho cartucho. Según una variante preferida de la invención, estos medios constituirán un sistema único y fijo. Una ventaja de una variante preferente de la invención según la cual el cartucho es circular y movido según un desplazamiento rotativo es de poder llevar sucesivamente cada cámara de reacción bajo dicho sistema óptico, reduciendo así su complejidad. Un sistema de reparación, situado por ejemplo sobre el cartucho (1), permite determinar a cada instante qué cámara de reacción está situada frente al sistema óptico.

Los medios de conducción del fluido presente en dicho reservorio hacia dichas cámaras de reacción pueden realizarse bajo diferentes formas. Como ya se ha descrito anteriormente, se pueden distinguir dos categorías de modo de direccionamiento del fluido hacia las cámaras de reacción: el direccionamiento en sistema abierto, que

supone un aumento de presión a nivel del reservorio y la presencia de respiraderos (14) a nivel de las cámaras de

reacción, y el direccionamiento en sistema cerrado, que empieza por el contrario por el establecimiento de una depresión en el cartucho (1), seguido de un reestablecimiento de esta presión.

Los medios (4) de conducción del fluido a las cámaras de reacción difieren según el modo de realización elegido. Así, en sistema abierto, el fluido contenido en el reservorio está distribuido bajo presión en las cámaras de reacción de manera a permitir un rellenado uniforme en estas cámaras. En este caso, los medios de conducción (4) incluyen preferentemente un dispositivo de pistón (41) cuya velocidad de penetración en el reservorio se calculará para

favorecer el buen rellenado de las cámaras de reacción. Alternativamente, estos medios de conducción incluyen una bomba unida de manera a aumentar la presión en el reservorio (11).

Como se ha visto anteriormente, otra variante preferida de la invención implica trabajar en sistema cerrado. El fluido contenido en el reservorio se distribuye entonces en las cámaras de reacción de la manera siguiente: en un primer tiempo, se crea una depresión en el interior del cartucho, llegado el caso por un dispositivo de pistón o una bomba (42), conectada esta vez de manera a disminuir la presión en el cartucho (1). Entonces la presión se restablece, lo que permite al fluido entrar en los canales y rellenar las cámaras de reacción periféricas.

La invención se refiere igualmente a todo procedimiento de amplificación de ácido nucleico gracias a un sistema tal como se ha descrito anteriormente, caracterizado porque comprende las etapas que consisten en:

-: rellenar al menos parcialmente el reservorio (11) con un fluido que contiene una muestra de ácidos nucleicos a analizar así como todo lo necesario para una reacción de amplificación, con la excepción de los cebadores, y facultativamente, un intercalante fluorescente de ácidos nucleicos;

-: repartir dicho fluido en las cámaras de reacción (13) previstas en el cartucho (1), en las cuales previamente se reparten cebadores y, facultativamente, una o varias sondas marcadas específicas de la secuencia nucleica diana;

-: poner en marcha los medios de desplazamiento relativo entre el cartucho y la placa calefactora para llevar sucesivamente, y tantas veces como se desee, el contenido de cada cámara a las temperaturas definidas por las dos, tres o más zonas de dicha placa calefactora.

En una variante del procedimiento anterior, se reparten previamente, reactivos necesarios para la reacción de amplificación y/o para la detección de los productos de amplificación, y distintos de los cebadores y de las sondas, en las cámaras de reacción (3) del cartucho (1). El fluido introducido en el reservorio (11) no contiene entonces estos reactivos.

La etapa de repartición del fluido en las cámaras de reacción (13) se efectúa bien aplicando una depresión en el interior del cartucho, luego reestableciendo la presión (sistema cerrado), bien aumentando la presión a nivel del reservorio (11), a condición que las cámaras de reacción estén provistas de respiraderos (sistema abierto).

La invención, así como las diferentes ventajas que presenta, se comprenderán mejor gracias a la descripción que seguirá de algunos modos no limitativos de realización de esta, ilustrados en las figuras.

Ejemplo 1: modo de realización simplificado del dispositivo de la invención.

El sistema de detección y de cuantificación de secuencias nucleicas diana representadas en la figura 1 comprende un cartucho circular en materia plástica de 2 mm de espesor que presenta un diámetro de 5 cm. Este cartucho (1) está provisto de un reservorio central (11) y se describirá más en detalle en referencia a continuación en las figuras 3 y 4. La capacidad del reservorio es, dentro del marco del presente modo de realización, de 400 μl. Su suelo es plano pero se notará que en otros modos de realización podrá estar abombado para facilitar el paso del fluido hacia las cámaras sin formación de burbujas de aire, principalmente con el fin del direccionamiento cuando el reservorio está prácticamente vacío.

El sistema comprende además una placa calefactora (2) en contacto directo con la cara inferior del cartucho (1) y medios de desplazamiento (3) del cartucho (1) con respecto a la placa calefactora (2). Estos medios de desplazamiento incluyen un micromotor (31) unido a dos ejes (32) que cooperan con dos orejas (183) del cartucho

(1) para inculcar a este un movimiento rotativo sobre la placa calefactora (2), quedando esta en cuanto a ella fija.

El sistema descrito comprende igualmente un pistón (41) destinado a cooperar con dicho reservorio (11) así como un dispositivo óptico (5) de excitación/medida de fluorescencia (fuente emisora que permite una excitación a una longitud de onda dada y programable y receptor de fluorescencia emitida) fijo y situado encima del cartucho (1) y de la placa calefactora (2).

Como se puede ver en la figura 2A, la placa calefactora (2) está constituida por tres bloques metálicos (21, 22 y 23) (a continuación denominados termobloques) en forma de porciones de discos. Se notará que en este modo de realización, estos termobloques presentan sensiblemente el mismo tamaño pero que, en otros modos de realización, podrán presentar un tamaño diferente, entendiéndose el tamaño como la superficie angular ocupada en vista desde arriba. Cada termobloque (21, 22 y 23) está concebido para poder ser llevado a una temperatura constante y programable, correspondiente a una de las fases (desnaturalización, hibridación o elongación) de los ciclos de amplificación (PCR), en general bien respectivamente a 94ºC para la desnaturalización, 72ºC para la elongación, y entre 30-40 y 65-70ºC para la hibridación según la Tm (temperatura de hibridación) de los cebadores utilizados. Las temperaturas de los termobloques podrán controlarse por cualquier medio conocido por el experto en la técnica.

En referencia a la figura 3, el cartucho (1) está provisto de un reservorio central (11) de capacidad 400 μl unido a 36 cámaras de reacción (13) por tantos canales (12), repartidos uniformemente sobre toda la periferia del cartucho (sobre la figura 3, no se ha representado el conjunto de los canales y de las cámaras sino solamente algunos de ellos). Estas cámaras de reacción (13) están provistas además de respiraderos (14) que dan sobre el borde del cartucho (1). En el modo presente de realización, los canales presentan un diámetro de 0,2 mm y el volumen de las cámaras de reacción es de 2,5 microlitros. En otros modos de realización, este diámetro y este volumen, por supuesto, podrán ser diferentes.

Como se ha precisado, este cartucho (1) está provisto igualmente de dos orejas (183) agujereadas cada una por un respiradero para dejar pasar un eje (32) unido al micromotor (31).

Según la figura 4, las cámaras de reacción presentan una profundidad de 1 mm. Su suelo presenta un espesor de

0,2 mm aproximadamente. Este espesor es suficientemente bajo para facilitar buenos intercambios térmicos entre las cámaras (13) y los termobloques (21, 22 y 23). Las cámaras de reacción (13) están cerradas en su parte superior por una pared (17) transparente, formando igualmente la pared del reservorio (11).

La utilización del dispositivo representado es la siguiente:

El reservorio central (11) está destinado a recibir la muestra de ácidos nucleicos a analizar así como todo lo necesario para una reacción de amplificación, y facultativamente un intercalante fluorescente de ácidos nucleicos (el conjunto se denomina de ahora en adelante fluido), con la excepción de los cebadores repartidos previamente en cada cámara de reacción periférica 10.

Dentro del marco del presente modo de realización, el usuario sitúa en el reservorio central 90 μl (es decir 36 veces 2,5 μl) de fluido, de los cuales 75 ng de ácidos nucleicos. Las concentraciones de reactivos en dicho fluido son las siguientes:

dNtP: 2 00 μM Tampón Taq: 1 x

MgCl2: 1,5 mM

Taq: 4U

SybrGreen (marca registrada): 1 x

H2O: csc

Cada cámara 10, salvo algunas con fines de controles negativos, contiene dos cebadores específicos de una secuencia diana a amplificar, y facultativamente una o varias sondas marcadas, que permite una medida específica posterior de fluorescencia. En el presente modo de realización, se ha repartido 10 ng de cada cebador en cada cámara salvo en las que sirven de control negativo.

Después de haber rellenado parcialmente el reservorio (11) con el fluido cuyo volumen es igual a la suma de los volúmenes de las cámaras (el volumen de una cámara está definido como siendo el producto de su superficie de

“suelo” por su profundidad), se acciona el pistón (41) para distribuir este fluido en la pluralidad de cámaras de

reacción (13). Este pistón permite aumentar la presión en el seno del reservorio (11) y permite el paso del fluido a los canales hacia las cámaras. La velocidad de desplazamiento del pistón en el reservorio es de aproximadamente 1 mm por segundo y dicho desplazamiento se para a un nivel que depende del volumen de fluido a direccionar a las cámaras.

El bajo diámetro de los canales (12) permite impedir la difusión del fluido desde el reservorio (11) hacia los canales

(12) y las cámaras (13) bajo el efecto de la gravedad (a esta escala, los procesos habitualmente despreciables como las fuerzas de capilaridad se hacen importantes), y en el caso presente bastan para mantener el fluido en el

reservorio). Gracias a los respiraderos (14), el aire presente en las cámaras (13) es evacuado, lo que asegura el

rellenado de estas.

Lo termobloques (21, 22, 23) se llevan a tres temperaturas que corresponden a las tres temperaturas de las fases de la PCR (o a temperaturas ligeramente superiores teniendo en cuenta eventuales pérdidas térmicas entre la placa calefactora (2) y el cartucho (1)) y se utilizan los medios de desplazamiento (3) de manera a animar el cartucho (1) por un movimiento giratorio para hacer pasar sucesivamente y tantas veces como se desee, cada cámara de reacción por encima de los tres termobloques.

Más precisamente, el bloque (21) se lleva a la temperatura correspondiente a la fase de desnaturalización (94ºC), el termobloque (22) se lleva a la temperatura correspondiente a la fase de hibridación (36ºC) y el termobloque (23) se lleva a la temperatura correspondiente a la fase de elongación (72ºC).

En el modo de realización presente, el micromotor (31) de los medios de desplazamiento (3) está concebido para inculcar una rotación de 10 grados cada 2,5 segundos al cartucho (1) (es decir un ciclo de PCR en 1,5 min). Sin embargo, en otros modos de realización, este movimiento podrá presentar una velocidad diferente y ser continuo en lugar de ser discontinuo.

Se notará que el dispositivo óptico (5) está previsto por encima del bloque correspondiente 23 llevado a una temperatura correspondiente a la temperatura de elongación, y más particularmente a un emplazamiento que corresponde al final de la fase de elongación. Por supuesto, el dispositivo óptico (5) puede situarse en un emplazamiento diferente, elegido principalmente en función de la química utilizada. Por ejemplo, utilizando la química TaqManTm o de fluorescencia no específica, es lógico efectuar la medida al final de la fase de elongación, como se ha descrito anteriormente. Sin embargo, la utilización de una química del tipo Molecular BeaconsTM implica que la medida se haga más bien en el momento de la hibridación.

El sistema presentado permite rellenar rápidamente y de manera reproducible una gran cantidad de cámaras de reacción y efectuar sobre su contenido una PCR y medidas de fluorescencia en cada ciclo de la PCR.

El modo de realización descrito aquí no tiene por objeto reducir el alcance de la invención. Por lo tanto, se podrán aportar numerosas modificaciones sin salir de su marco.

Ejemplo 2: Cartucho circular mejorado

Las figuras 5 a 10 representan un ejemplo de cartucho circular que presenta ciertas modificaciones con respecto al cartucho del ejemplo 1.

Este cartucho está previsto para una utilización en sistema cerrado, es decir que las cámaras de reacción (13) no tienen otra apertura más que la entrada del canal (12). El cartucho está constituido por dos elementos que encajan el uno dentro del otro: la parte inferior, o base, está representada en las figuras 5 y 6, y la parte superior, o tapa, está representada en las figuras 7 y 8. El ensamblaje de las dos está ilustrado en las figuras 9 y 10.

La carga de este cartucho se efectúa de la manera siguiente:

El usuario sitúa en el reservorio central el extracto de ácidos nucleicos a analizar. Sitúa el consumible en el sistema automatizado. Este último crea una depresión en el interior del cartucho (P= 0,05 bar aproximadamente), por

ejemplo por la utilización de una bomba (42). Luego la presión se restablece, lo que permite la conducción de los

fluidos en los canales y rellenar las cámaras de reacción periféricas. Así, con respecto al dispositivo del ejemplo 1, el fluido ya no es conducido por un aumento de la presión sino por depresión, lo que presenta la ventaja de no necesitar respiraderos y por lo tanto trabajar en sistema cerrado.

Llegado el caso, se pueden prever distintos sub-reservorios y no ya un reservorio único, lo que presenta la ventaja de tratar simultáneamente varias muestras.

El fondo del reservorio tiene una forma cónica que permite al fluido repartirse en su periferia, es decir cerca de la entrada de los canales.

En el empalme de los canales y el reservorio, se encuentra un sistema anti-reflujo, constituido por una porción de canal vertical (123), lo que, por una parte, previene las contaminaciones cruzadas en caso de retorno intempestivo de fluido hacia la parte central o en caso de que todo el fluido no se hubiera dirigido por el canal y, por otra parte, permite una vez el direccionamiento efectuado pero antes de la PCR, venir a taponar lo canales por medio de un tapón cuyos dientes casan con estas entradas verticales, con el fin de trabajar en sistema cerrado (sin contaminación, sin evaporación).

El cartucho es de plástico, preferentemente en policarbonato ya que este polímero presenta características físicas, ópticas y de comportamiento térmico interesantes.

El tamaño de los canales es por ejemplo de 0,4 x 0,2 mm (medialuna) en la sección.

El tamaño del consumible es por ejemplo de 100 mm (diámetro), el número de cámaras es de 80, el número de subreservorios está comprendido entre 1 y 8.

Como se ilustra en la figura 10, el cartucho (1) presenta en la parte superior una parte saliente central (181) comprende una muesca (182) de tal manera que la parte saliente (181) encaja en la placa calefactora (2) y une el cartucho (1) con los medios de desplazamiento (3) a nivel de un taco o eje (32) puesto en movimiento por un micromotor (31). La parte saliente (181) permite por lo tanto por una parte, posicionar el cartucho con respecto a una placa (2) tal como la representada en la figura 2B, y por otra parte, asegurar su unión con los medios de puesta en movimiento (3).

Las cámaras de reacción se cargan con cebadores específicos de secuencias diana y, llegado el caso, con sondas de tipo TaqManTM u otras específicas de dichas dianas. Dependiendo de las aplicaciones, las dianas serán genes virales o bacterianos, uniones entre un transgen y el genoma de una planta para detectar y/o identificar ciertos OGM, etc.

Una variante del cartucho descrito anteriormente, que comprende 36 cámaras de reacción de un volumen de 8 μl y canales de un diámetro de 0,3 mm, ha sido utilizada para efectuar un ensayo de detección de bacterias Salmonellas. Se situaron 288 μl (es decir 36 veces 8 μl) de la disolución siguiente en el reservorio central:

DUTP 400 μM

dNTP : 200 μM

Tampón Taq : 1 x

MgCl2 : 3 mM

Taq: 15 U

TWEEN (marca registrada): 0,007%

SybrGreen (marca registrada): 0,1 x

ADN genómico de Salmonella enteritidis (salmonella): 1 ng

H2O : csc

Se depositaron 1,6 picomoles de los cebadores FinA1 y FinA2 descritos en Cohen, Mechanda et al. 1996 en las cámaras de reacción.

Este experimento dio resultados positivos, como esperado.

Claims

REIVINDICACIONES

1.-Cartucho de reacción que comprende varias cámaras de reacción (13), un reservorio (11) y canales (12), presentando el cartucho (1) las características siguientes:

-

el cartucho posee una geometría de revolución, en el cual el reservorio (11) está situado sensiblemente en el centro de dicho cartucho, las cámaras de reacción (13) están repartidas en círculo alrededor de dicho reservorio, y los canales (12) que unen dicho reservorio a dichas cámaras son esencialmente radiales;

-

el empalme entre los canales (12) y el reservorio (11) se hace en la periferia del reservorio; estando el cartucho de reacción caracterizado porque -cada cámara de reacción está unida al reservorio por un canal (12) que tiene una sección recta

comprendida en un círculo de diámetro inferior a 3 mm; -la capacidad del reservorio es inferior a 10 ml; y -el fondo del reservorio es convexo, de manera a asegurar el reparto de un fluido contenido en el reservorio

a nivel de la entrada de los canales 2.-Cartucho según la reivindicación 1, en la cual el diámetro de los canales (12) es inferior o igual a 0,2 mm. 3.-Cartucho según la reivindicación 1 ó 2, en el cual la capacidad del reservorio (11) está comprendida entre 0,1 ml

y 1 ml.
4.-Cartucho según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque comprende entre 20 y 500 cámaras de reacción. 5.-Cartucho según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el volumen de las cámaras de

reacción está comprendido entre 0,2 y 50 μl, preferentemente entre 1 y 10 μl. 6.-Cartucho según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el cual el fondo del reservorio (11) es cónico. 7.-Cartucho según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el cual las cámaras de reacción (13) están

situadas en la periferia de dicho cartucho.
8.-Cartucho según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que presenta un diámetro comprendido entre 1 y 10 cm. 9.-Cartucho según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el cual el reservorio (11) está dividido en 2 a 8

sub-reservorios (111 a 118), y cada una de las cámaras de reacción (13) está unida a uno solo de estos sub

reservorios por un canal (12). 10.-Cartucho según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el cual las cámaras de reacción presentan una profundidad comprendida entre 0,5 y 1,5 mm.
11.-Cartucho según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque es de material plástico, y

preferentemente de policarbonato. 12.-Cartucho según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, cuyo espesor está comprendido entre 0,5 y 5 mm.
13.-Cartucho según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el cual el suelo de las cámaras de reacción

(13) presenta un espesor comprendido entre 0,05 y 0,5 mm, de forma preferente aproximadamente 0,25 mm.
14.-Cartucho según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el cual las cámaras de reacción (13) están cerradas por una pared superior transparente (17). 15.-Cartucho según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el cual las cámaras de reacción (13) están

provistas de respiraderos (14).
16.-Cartucho según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el cual las cámaras de reacción (13) están cerradas. 17.-Cartucho según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el cual el reservorio (11) comprende una

apertura adaptable a medios (4) de modulación de la presión en dicho reservorio.
18.-Cartucho según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en el cual cada canal (12) está constituido por al menos dos partes de diámetros diferentes (121 y 122), siendo el diámetro de la segunda parte (122) inferior al de la primera parte (121), de manera a crear una pérdida de carga en el canal (12).
19.-Cartucho según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizado porque cada canal (12) está equipado por una cavidad anti-reflujo (123) a nivel de su empalme con el reservorio (11), estando constituida dicha cavidad anti-reflujo por una porción de canal sensiblemente vertical, de un diámetro superior o igual al del canal (12).
20.-Cartucho según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en el cual una parte al menos de las cámaras de reacción (13) comprende oligonucleótidos.
21.-Cartucho según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en el cual cada una de las cámaras de reacción

(13) comprende dos cebadores específicos de una secuencia de ácido nucleico para amplificar y, facultativamente, una sonda específica de dicha secuencia.
22.-Cartucho según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, en el cual al menos una parte de las cámaras de reacción (13) comprenden reactivos que han sido cargados por depósito líquido seguido de secado, de tal manera que la llegada de un fluido en dichas cámaras de reacción vuelva a poner dichos reactivos en disolución.
23.-Dispositivo para efectuar reacciones enzimáticas y/o de biología molecular que necesita al menos dos temperaturas de incubación diferentes, caracterizado porque comprende:

-

al menos un cartucho (1) según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22;

-

al menos una placa calefactora (2) que presenta al menos dos zonas distintas que pueden llevarse a al menos dos temperaturas diferentes;

-

medios (3) de desplazamiento relativo entre dicho cartucho y dicha placa, que permite una variación cíclica de la temperatura de las cámaras de reacción.

24-. Dispositivo según la reivindicación 23, en el cual la reacción enzimática es una amplificación en cadena termo-dependiente de secuencias de ácidos nucleicos, y en el cual las zonas de la placa calefactora (2) pueden llevarse a al menos dos temperaturas diferentes, correspondientes a las fases de los ciclos de amplificación de dichos ácidos nucleicos
25.-Dispositivo según la reivindicación 24, caracterizado porque:

-

se reparten previamente cebadores específicos de secuencias diana a amplificar en las cámaras de reacción (13),

-

el reservorio (11) está destinado a recibir un fluido compuesto principalmente por una muestra de ácidos nucleicos a analizar y reactivos necesarios a una reacción de amplificación en cadena de la polimerasa, con la excepción de los cebadores,

-

la placa calefactora (2) presenta tres zonas distintas que pueden llevarse a tres temperaturas distintas, que corresponden a las tres fases de los ciclos de amplificación en cadena de la polimerasa.
26.-Dispositivo según la reivindicación 24 ó 25, para la amplificación en cadena termo-dependiente de secuencias de ácidos nucleicos medida en tiempo real, caracterizado porque comprende medios ópticos (5) de excitación / medida de la fluorescencia, dispuestos de manera a excitar y medir en cada ciclo la fluorescencia del contenido de las cámaras de reacción.
27.-Dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 26, en el cual las zonas distintas de calentamiento de la placa (2) están repartidas según al menos dos o tres porciones de disco.
28.-Dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 27, en el cual dicha placa de calentamiento (2) está fija y dicho cartucho (1) es movido gracias a dichos medios de desplazamiento (3).
29.-Dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 27, en el cual dicho cartucho (1) está fijo y dicha placa calefactora (2) es movido gracias a dichos medios de desplazamiento (3).
30.-Dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 29, en el cual dichos medios de desplazamiento

(3) permiten la rotación de dicho cartucho (1) y/o de dicha placa de calentamiento (2).
31.-Dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 30, en el cual el cartucho (1) está en contacto directo con la placa calefactora (2).
32.-Dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 31, en el cual la placa (2) está provista de un revestimiento que favorece el desplazamiento relativo de dicho cartucho (1) y dicha placa (2).
33.-Dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 32, en el cual la placa calefactora (2) comprende dos o tres termobloques distintos (21, 22 y llegado el caso, 23) unidos a medios de programación de su temperatura.
34.-Dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 33, en el cual el cartucho (1) presenta en la parte superior una parte saliente central (181) que comprende una muesca (182) y los medios de desplazamiento (3) incluyen al menos un taco (32) que coopera con dicha muesca (182) para inculcar a dicho cartucho (1) un movimiento rotativo.
35.-Dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 34, que comprende medios ópticos (5) de excitación/medida de la fluorescencia dispuestos encima o sobre el lado del cartucho.
36.-Dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 35, que comprende además medios (4) que permiten conducir el fluido presente en el reservorio (11) a las cámaras de reacción (13).
37.-Dispositivo según la reivindicación 36, en el cual dichos medios de conducción (4) incluyen un dispositivo de pistón (41), y el fluido es conducido a las cámaras de reacción por un aumento de la presión.
38.-Dispositivo según la reivindicación 36, en el cual dichos medios de conducción (4) incluyen una bomba (41), y el fluido es conducido a las cámaras de reacción por un reestablecimiento de la presión después del establecimiento de una depresión.
39.-Dispositivo según la reivindicación 38, en el cual las cámaras de reacción (13) del cartucho (1) están cerradas.
40.-Procedimiento de amplificación de ácido nucleico gracias a un dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 39, que comprende las etapas siguientes:

-

rellenar al menos parcialmente el reservorio (11) con un fluido que contiene una muestra de ácidos nucleicos a analizar, así como todo lo necesario para una reacción de amplificación con la excepción de los cebadores y, llegado el caso, un intercalante fluorescente de los ácidos nucleicos;

-

repartir dicho fluido en las cámaras de reacción (13) del cartucho (1), en las que se han depositado previamente cebadores y, llegado el caso, una o varias sondas marcadas;

-

poner en marcha los medios (3) de desplazamiento relativo entre el cartucho y la placa calefactora para conducir sucesivamente y tantas veces como se quiera el contenido de cada cámara de reacción a dos, tres o más temperaturas definidas por las dos, tres o más zonas de dicha placa calefactora (2).
41.-Procedimiento de amplificación según la reivindicación 40, en el que la etapa de repartición del fluido en las cámaras de reacción (13) se efectúa aplicando una depresión en el interior del cartucho, luego restableciendo la presión.
42.-Procedimiento de rellenado en sistema cerrado de las cámaras de reacción (13) de un cartucho (1) según la reivindicación 17, que comprende las etapas siguientes:

-

rellenar al menos parcialmente el reservorio (11) con un fluido,

-

conectar el cartucho (1) a los medios (4) de modulación de la presión,

-

aplicar una depresión en el interior del cartucho, luego restablecer la presión.

Fig. 2B

Fig. 7 Fig. 9 Fig. 10 Fig. 11