ES2261781T3 - Dispositivo para sujetar un soporte de bibliotecas de sustancias. - Google Patents

Abstract

Dispositivo (1) para sujetar un soporte de bibliotecas de sustancias que comprende dos elementos de sujeción (101 y 102) que pueden fijarse entre sí, que forman un conjunto de capas constituido por (i) un elemento de tapa (200) que en su lado inferior tiene una superficie de detección con una biblioteca de sustancias (201) y que, al menos en la zona de la superficie de detección, es ópticamente transparente, (ii) un elemento intermedio (300) que tiene una escotadura hermetizante y cerrada, y (iii) un elemento de fondo (400) ópticamente transparente, como mínimo en la zona de la superficie de detección del elemento de tapa. con lo cual se forma una cámara (500) ópticamente transparente con un espacio de cámara.

Description

Dispositivo para sujetar un soporte de bibliotecas de sustancias.

La invención se refiere a un dispositivo de construcción modular para sujetar portadores de bibliotecas de sustancias y su utilización para la detección cualitativa y cuantitativa de determinadas moléculas objetivo moleculares.

Las pruebas biomédicas se basan a menudo en la detección de una interacción entre una molécula, que está en una posición y en una cantidad conocidas (de la sonda molecular), y una molécula o moléculas desconocidas que hay que detectar (la molécula objetivo). En las pruebas modernas las sondas están dispuestas en forma de una biblioteca de sustancias sobre portadores, los llamados micro-harías o chips, de modo que una muestra puede analizarse paralelamente al mismo tiempo en varias sondas (D.J. Lockhart, E.A. Winzeler, Genomics, gene expresión and DNA arrays; Nature 2000, 405, 827-836). Para la fabricación de los micro-arrays deben inmovilizarse, por lo general de un modo prefijado, en una matriz adecuada que se describe, por ejemplo, en WO 00/12575 (véase por ejemplo US 5 412 087, WO 98/36827) o producirse sintéticamente (véase por ejemplo US 5 143 854).

La detección de una interacción entre la sonda y la molécula portadora se realiza de la manera siguiente:

La sonda o las sondas se fijan de un modo prefijado en un matriz conocida en forma de un micro-array. Los objetivos se ponen después en contacto con las sondas en una solución y se incuban en condiciones definidas. Debido a la incubación, entre la sonda y el objetivo se produce una interacción específica. El enlace que se produce es claramente más estable que el enlace de las moléculas objetivo a las sondas, que no son específicas para el material objetivo. Para retirar las moléculas objetivo, que no se han ligado específicamente, el sistema se lava o calienta con las correspondientes soluciones.

La detección de la interacción específica entre un objetivo y su sonda puede producirse entonces mediante una pluralidad de procedimientos, que por regla general dependen del tipo de marcador que antes, durante o después de la interacción de la molécula objetivo con el micro-array es llevado a la molécula objetivo. Los marcadores de esta clase son típicamente grupos fluorescentes, de modo que interacciones específicas de objetivo-sondas pueden seleccionarse con mayor resolución local y, en comparación con los métodos convencionales de detección (sobre todo métodos sensibles a la masa), con un esfuerzo reducido (A. Marshall, J. Hodgson, DNA chips: An array of posibilitéis, Nature Biotechnology 1998, 16, 27-31; G. Ramsay, DNA Chips: State of the art, Nature Biotechnology 1998, 16, 40-44).

Dependiendo de la biblioteca de sustancias inmovilizada en el micro-array y de la naturaleza química de las moléculas objetivo, basándose en este principio de ensayo se pueden estudiar las interacciones entre ácidos nucleicos y ácidos nucleicos, entre proteínas y proteínas y entre ácidos nucleicos y proteínas (para un resumen, véase F. Lottspeich, H. Zorbas, 1998, Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg Berlin).

Como bibliotecas de sustancias que pueden inmovilizarse en micro-arrays o chips, están las bibliotecas de anticuerpos, las bibliotecas de receptores, las bibliotecas de péptidos y las bibliotecas de ácidos nucleicos. Las bibliotecas de ácidos nucleicos desempeñan con mucho el papel más importante.

Se trata de micro-arrays sobre los que hay inmovilizadas moléculas de ácido desoxirribonucleico (ADN) o moléculas de ácido ribonucleico (ARN). El requisito para la fijación de una molécula objetivo (molécula de ADN o moléculas de ARN) marcada con un grupo fluorescente a una molécula de ácido nucleico del micro-array es que, tanto la molécula objetivo como también la molécula sonda, estén presentes en forma de un ácido nucleico de cadena simple.

Sólo entre moléculas de este tipo puede tener lugar una hibridación específica y eficiente. Las moléculas objetivo de ácido nucleico de cadena simple y las moléculas sonda de ácido nucleico se obtienen por lo general mediante desnaturalización térmica y parámetros que deben seleccionarse de manera óptima (temperatura, densidad iónica, concentración de moléculas desestabilizadoras de la hélice), lo cual garantiza que con la secuencia objetivo sólo se aparean sondas con secuencias casi perfectamente complementarias (equivalentes entre sí) (A.A. Leitch, T. Schwarzacher, D. Jackson, I.J. Leitch, 1994, In vitro Hybridisierung, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg Berlin Oxford).

Un ejemplo típico de la utilización de micro-arrays en los procedimientos de ensayos biológicos es la detección de microorganismos en muestras en el diagnóstico biomédico. Para ello se utiliza el hecho de que los genes del ARN ribosómico (ARNr) están distribuidos de manera ubiquista y disponen de secciones de secuencia características de la correspondiente especie. Estas secuencias características de la especie se llevan al micro-array en forma de oligonuclótidos de ADN de cadena simple. Las moléculas de ADN objetivo que deben estudiarse primero se aíslan de la muestra en estudio y se dotan de marcas fluorescentes. Después, las moléculas de ADN objetivo marcadas se incuban en una solución con las sondas puestas en el micro-array, mediante los pasos de lavado correspondientes se eliminan las interacciones producidas de modo no específico y se detectan las interacciones específicas mediante una valoración óptica de fluorescencia. De este modo, con una única prueba es posible detectar al mismo tiempo en una muestra, por ejemplo varios microorganismos. Teóricamente, en este procedimiento de ensayo el número de microorganismos detectables depende sólo del número de sondas específicas que se han llevado al
micro-array.

Para la realización práctica de esta prueba se fijan los micro-arrays o chips en cámaras cerradas, que disponen de entradas y salidas para cambiar los líquidos necesarios para los pasos de lavado y los pasos de hibridación. Sistemas de este tipo se describen, por ejemplo, en US 6 287 850 y PCT/EP00/06103.

La cámara descrita en US 6 287 850 no dispone de grupos con los que calentar o enfriar las cámaras. Pero esto sería deseable para un control selectivo de la hibridación. Además, la construcción de la cámara de reacción que contiene el chip es complicada y comprende varios pasos de uso de adhesivos para hermetizarla, con lo cual se producen riesgos de contaminación.

En PCT/EP00/06103 se describen cámaras que contienen igualmente micro-arrays. Estas cámaras pueden calentarse, aunque no pueden enfriarse. También en este caso la construcción de la cámara se produce mediante varios pasos y se necesitan pasos con uso de adhesivo para hermetizarla. Por consiguiente, las cámaras indicadas en las memorias señaladas permiten influir sólo de manera limitada sobre los parámetros (calentamiento, enfriamiento, etc.), la construcción es sensible a la contaminación y para automatizar la reacción de detección no existen las deseables conexiones periféricas o sólo pueden conseguirse con un elevado esfuerzo constructivo y económico.

En muchas pruebas de diagnóstico biomédico surge el problema de que antes del procedimiento de ensayo propiamente dicho, deben existir primero en forma suficiente las moléculas objetivo y hay que multiplicarlas a menudo a partir de la muestra. La multiplicación de las moléculas de ADN se produce mediante una reacción en cadena de polimerasa (PCR). Para la multiplicación del ARN, las moléculas de ARN deben transformarse mediante transcripción inversa en el ADN complementario (ADNc) correspondiente. Este ADNc puede multiplicarse (amplificarse) entonces igualmente mediante la PCR. La PCR es un método estándar de laboratorio (J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A laboratory manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor, N.Y., Cold Spring Harbor Laboratory Press).

La multiplicación del ADN mediante PCR es relativamente rápida, permite mediante procedimientos miniaturizados una producción elevada de muestras en volúmenes reducidos y mediante la automatización es eficiente en cuanto a trabajo. Sin embargo, no es posible una caracterización de ácidos nucleicos mediante una única multiplicación. Es necesario, después de la amplificación, utilizar métodos de análisis, tales como determinación de secuencias de ácidos nucleicos o procedimientos electroforéticos de separación y aislamiento, para caracterizar los productos PCR.

De los documentos US 5 716 842, DE 19519015A1, WO 94/05414 y US 5 498 392 se conocen distintos procedimientos y aparatos (Thermocyler) miniaturizados o miniaturizables para realizar la PCR. La integración de un micro-array o la integración de un chip de ADN no es un tema tratado en estos documentos.

En los documentos US 5 716 842, WO 91/16966 y WO 92/13967 se presentan Thermocycler miniaturizados o miniaturizables, que funcionan según el principio de que en ellos el líquido de muestras es bombeado continuamente a través de tres zonas de temperatura. La integración de un chip de ADN tampoco está prevista en estos Thermocycler de funcionamiento continuo.

La desventaja de las soluciones arriba citadas está en que en la detección en línea sólo puede obtenerse la información de si hay que amplificar ácidos nucleicos y, eventualmente, en qué medida. No es posible una caracterización amplia de los productos de amplificación.

La memoria de patente US 5 856 174 describe un sistema con el que es posible bombear en uno u otro sentido entre tres cámaras miniaturizadas. En una cámara de este sistema se produce la PCR, en la siguiente se lleva a cabo una reacción de preparación y en la tercera se detectan los productos de reacción, por ejemplo, en un chip de ADN. El recipiente de PCR miniaturizado se trata de un recipiente estándar, tal como se ha descrito hace tiempo en la bibliografía (S. Poser, T. Schulz, U. Dillner, V. Baier, J.M. Köhler, D. Schimkat, G. Mayer, A. Siebert, Chip element for fast thermocycling, Sensors and Actuators A, 1997, 62672-675). La desventaja de este sistema radica en que es necesario construir un complicado sistema de fluido propulsado por presión, que se puede averiar y que resulta complejo desde el punto de vista de la técnica de control, para transportar el líquido de muestra desde la cámara PCR a la cámara de detec-
ción. Además, la separación de la amplificación y de la detección conduce a un aumento del tiempo total de análisis.

En PCT/EP00/06103 se describe una unidad con la que la PCR y la rehibridación del ácido nucleico puede realizarse en un chip de ADN como reacción unicameral en una cámara de la muestra con sistema calefactor integrado. Sin embargo, esta unidad tiene la desventaja de que no puede enfriarse, que es necesario un complicado sistema cuadropolar para mezclar las muestras y que la construcción de esta unidad exige pegar piezas. Además, debido a los elevados costes de fabricación, esta unidad no es rentable como producto desechable.

En R.C. Anderson, X. Su, G.J. Bogdan, J. Fenton (A miniatura integrated device for automated multistep genetic assays, Nucleic Acids Research, 2000, Vol. 28, No. 12) se describe un cartucho del grosor de un dedo en el que pueden realizarse pasos de purificación de ADN, PCR, una preparación enzimática e hibridación en un chip de ADN. Las distintas reacciones tienen lugar en cámaras de reacción diferentes. A través de una compleja mímica propulsada por aire comprimido se bombea la solución de muestra de cámara de reacción a cámara de reacción para realizar los diferentes pasos del proceso. La desventaja de este sistema es que se requiere un gran esfuerzo constructor para preparar un sistema fluido propulsado por presión, es sensible a las averías y faltan grupos de calefacción y enfriamiento integrados. Además, sólo la PCR y la preparación enzimática son automatizables.

Sobre la base del estado actual de la técnica señalado, está claro que existe una gran necesidad de aparatos que permitan la realización totalmente automática de pruebas de detección basadas en micro-array. Existe en especial la necesidad de aparatos para realizar pruebas basadas en micro-array en los que puedan controlarse de manera totalmente automática parámetros como la regulación de la temperatura, el enfriamiento y el control del flujo. Existe, además, la necesidad de aparatos para realizar pruebas basadas en micro-array que permitan, por ejemplo, sintetizar in situ mediante PCR componentes necesarios para la prueba, como moléculas objetivo, y utilizar en el sistema de ensayo directamente, sin preparación manual, los productos de amplificación. Existe en general una necesidad de aparatos para realizar pruebas basadas en micro-array que se caractericen por una construcción sencilla, fácil manejabilidad, evitación de fuentes de contaminación, realización reproducible de las pruebas y bajos costes de fabricación.

Por lo tanto, el objetivo de la presente invención es facilitar un dispositivo que permita la realización de pruebas basadas en micro-array de una manera totalmente automatizada y regulada por medio de parámetros. Otro objetivo de la presente invención es facilitar un dispositivo que se caracterice por una construcción sencilla, una fácil manejabilidad y, con ello, una fabricación económica. Además, un objetivo de la presente invención es facilitar un dispositivo que permita la realización simultánea de pruebas basadas en micro-array y PCR en un sistema unicameral evitando fuentes de contaminación. Otro objetivo de la presente invención es facilitar una estación de llenado manual para cargar la cámara de la muestra que contenga el micro-array.

Estos y otros objetivos de la presente invención se consiguen preparando los objetos indicados en las reivindicaciones. En otras reivindicaciones se definen también formas de realización preferidas. Los objetivos se consiguen cuando, comprimiendo un conjunto de capas (400, 300, 200) mediante dos elementos de sujeción (101, 102) que pueden fijarse entre sí, surge un dispositivo (1) que contiene una cámara (500) ópticamente transparente, que tiene a su vez una superficie de detección con una biblioteca de sustancias (201) y en la que pueden realizarse pruebas basadas en micro-array y reacciones como la PCR.

Este tipo de construcción y la esencia de los componentes del conjunto de capas, que consisten en un elemento de fondo (400), un elemento intermedio (300) y un elemento de tapa (200), son responsables de los efectos ventajosos de la cámara (500) producida, que de ahora en adelante se designará también como cámara de la muestra y de reacción. Todo el dispositivo (1) se designará a continuación también como cartucho (1).

La construcción según la invención del cartucho (1) y de la cámara de reacción (500) hace posible fabricar cartuchos (1) y cámaras de reacción (500) en los que puedan cambiarse sin gran esfuerzo los portadores de bibliotecas de sustancias. Otra ventaja de este principio de construcción es que la cámara de reacción (500) surgida es hermética, sin tener que pegarla, lo cual ahorra varios pasos de trabajos en comparación con el ensamblaje convencional de la cámara de reacción (500) según el estado actual de la técnica. Con ello, el dispositivo según la invención es más favorable, y se impide además una potencial contaminación del espacio de muestra mediante los pasos con uso de adhesivos. Estas y otras características ventajosas de la cámara de reacción (500) surgida se basan en la esencia de los elementos de fondo, intermedio y de tapa que forman la cámara de reacción.

Como elemento de tapa (200) se designa según la invención un elemento portante (202) que sobre una superficie de detección presenta una biblioteca de sustancias (201) y que es ópticamente transparente, como mínimo en la zona de la superficie de detección, y no es fluorescente. Por superficie de detección debe entenderse la zona del elemento portante (202) sobre el que está inmovilizada la biblioteca de sustancias (201). En una forma de realización preferida de la invención la biblioteca de sustancias (201) está colocada directamente sobre el elemento de tapa (200).

En otra forma de realización preferida la biblioteca de sustancias (201) está colocada sobre un chip ópticamente transparente y no fluorescente, que a su vez está firmemente unido al elemento portante (202) que es ópticamente transparente y no fluorescente como mínimo en la zona de detección definida por el chip. Las dimensiones del chip son menores que las dimensiones del elemento portante (202). En este caso el chip que lleva la biblioteca de sustancias (201) y el elemento portante (202) forman juntos el elemento de tapa (200).

El elemento portante (202) es de materiales ópticamente transparentes, no fluorescentes. Con los materiales se trata preferentemente de vidrio, Borofloat 33 (Schott), cristal de cuarzo, CaF_{2} monocristalino (Schott), silicio monocristalino, fenilmetilmetacrilato y/o policarbonato.

Si la biblioteca de sustancia no está colocada directamente sobre el elemento portante (202) sino sobre un chip, el chip es asimismo de materiales ópticamente transparentes y no fluorescentes. Con los materiales se trata preferentemente de vidrio, Borofloat 33 (se adquiere en Schott), cristal de cuarzo, CaF_{2} monocristalino (se adquiere en Schott), silicio monocristalino, fenilmetilmetacrilato y/o policarbonato.

La biblioteca de sustancias puede estar sobre el elemento de fondo (400). El experto sabe que en este caso el elemento de tapa (200) es un elemento portante (202) que tiene una zona cuya posición, tamaño y forma vienen definidos por la posición, el tamaño y la forma de la biblioteca de sustancias (201) sobre el elemento de fondo (400). Si la evaluación de la interacción objetivo-sondas se realiza mediante procedimientos de detección ópticos, el elemento de tapa, al menos en esta zona, es en este caso ópticamente transparente y no fluorescente.

Con las bibliotecas de sustancias (201) puede tratarse de bibliotecas de sustancias proteicas, bibliotecas de sustancias peptídicas y bibliotecas de sustancias de ácidos nucleicos. En el caso de las bibliotecas de sustancias proteicas puede tratarse en especial de bibliotecas de anticuerpos, de bibliotecas de moléculas receptoras y de bibliotecas de proteínas de membrana. En el caso de las bibliotecas peptídicas puede tratarse en especial de bibliotecas de ligandos receptores, puede tratarse de bibliotecas peptídicas farmacológicamente activas y de bibliotecas de hormonas. En el caso de la bibliotecas de sustancias de ácidos nucleicos puede tratarse en especial de bibliotecas de moléculas de ADN y de bibliotecas de moléculas de ARN. En el caso de las bibliotecas de moléculas de ADN puede haber colocadas sobre el elemento de tapa (200) en especial secuencias de ADN ribosómico de microorganismos. Además, puede tratarse de bibliotecas de sustancias de ácidos nucleicos para análisis SNP. También puede tratarse de bibliotecas de sustancias proteicas o bibliotecas de sustancias de ácidos nucleicos que permiten un denominado "Expresión profiling". Puede tratarse también de bibliotecas de sustancias combinatorias.

Las bibliotecas de sustancias (201) pueden estar colocadas sobre el elemento portante (202) de modo que entran en contacto con el espacio de muestras de la cámara resultante. El elemento de tapa (200) de la cámara de reacción surgida, por consiguiente, se caracteriza según la invención porque en su lado inferior tiene una superficie de detección con una biblioteca de sustancias y es ópticamente transparente, como mínimo en la zona de detección.

Una configuración ventajosa de la invención es que la cámara de reacción (500) surgida es hermética y las muestras acuosas pueden calentarse durante varias horas a temperaturas de hasta 100ºC sin que se produzca una salida de líquido o las muestras se evaporen.

Estos efectos ventajosos se consiguen mediante las características de hermeticidad del material del elemento intermedio (300). Además, el elemento intermedio es elástico y se puede atravesar varias veces con cánulas, pudiéndose extraer las cánulas sin que se produzca una salida de líquido del elemento intermedio después de la extracción de la cánula. El elemento intermedio es preferentemente de polidimetilsiloxano (se obtiene bajo las denominaciones de Sylgard 184 ó 182), de caucho natural, caucho-butadieno, caucho-cloropreno, caucho-nitrilo-butadieno, caucho-butilo, caucho-isopreno-estirol, caucho-polinorborneno, caucho-etileno-propileno, caucho-flúor (se obtiene bajo las denominaciones de Biton, Tecnolflon, Fluorel, Daiel), caucho-perflúor (se obtiene bajo la denominación de Klarez), caucho-metil-fenil-silicona, caucho-metil-vinil-silicona, caucho-metil-flúor-silicona, caucho-flúor-silicona, caucho-polisulfuro, caucho-uretano, prepolímeros de poliéster o poliéter a base de 4,4'-metilendi(fenilisotiocianato) o toluoldiisocianato (se obtiene bajo las denominaciones de Adipren, Elastothane, Genthane, Urepan, Vibrathan).

Al elemento intermedio (300) se le designa dentro del marco de la invención también como septo o septo hermético.

El elemento intermedio (300) se caracteriza porque tiene una escotadura (301). Debido a esta escotadura (301), que define el volumen del espacio de reacción (dado por 301) de la cámara de reacción (500), tanto la geometría como también el volumen del espacio de reacción pueden variar. Al espacio de reacción (301) se le designará en adelante también como espacio de la muestra o espacio de la cámara.

Mediante el septo hermético (300) se forma ventajosamente un espacio de reacción (301) con volúmenes entre 5 y 100 \mul, ventajosamente entre 10 y 50 \mul ó entre 15 y 40 \mul, entre 15 y 35 \mul ó entre 15 y 25 \mul.

Dependiendo de la geometría de la escotadura (301) del septo hermético (300), sobre el elemento de tapa (200) se pueden colocar bibliotecas de sustancias (201) en diferentes disposiciones geométricas. La geometría de la disposición de la biblioteca de sustancias (201) depende sólo de la geometría de la escotadura (301) del septo hermético (300).

La configuración ventajosa del septo hermético (300) hace posible un llenado sin burbujas de aire del espacio de reacción (301). La geometría del espacio de reacción definido por el septo hermético (300) tendrá preferentemente forma de D, siendo también ventajosa una forma similar a media luna, similar a un cuarto creciente o a un gajo de mandarina.

Una configuración ventajosa de la invención es que la forma geométrica del espacio de reacción viene definida por el septo hermético (300) y, con ello, puede modificarse sin modificar constructivamente el dispositivo (1) global y adaptarlo a posiciones problemáticas individuales.

Otra configuración ventajosa de la invención radica en que el encapsulamiento de la cámara de reacción (500) conseguido mediante el septo hermético (300), por un lado se aumenta la capacidad de almacenamiento del chip y, por otro lado, se reduce el peligro de contaminación durante el análisis. Otra configuración ventajosa más de la invención consiste en que, según la configuración del septo hermético (300), sobre el elemento de tapa (200) se pueden colocar y utilizar bibliotecas de sustancias (201) con dimensiones geométricas exteriores diversas.

Otra configuración ventajosa más de la invención consiste en que el septo hermético (300) tiene una escotadura de geometría (301) opcional. El septo hermético (300) es preferentemente de un material elástico hermetizante, de modo que la cámara de la muestra puede cargarse pinchando lateralmente varias veces el septo hermético, cerrándose herméticamente el septo hermético después de la retirada de las cánulas, con las que se carga la cámara de la muestra, de modo que no sale ningún líquido. El septo hermético (300) es preferentemente de materiales tales como polidimetilsiloxano (se obtiene bajo las denominaciones de Sylgard 184 ó 182), de caucho natural, caucho-butadieno, caucho-cloropreno, caucho-nitrilo-butadieno, caucho-butilo, caucho-isopreno-estirol, caucho-polinorborneno, caucho-etileno-propileno, caucho-flúor (se obtiene bajo las denominaciones de Biton, Tecnolflon, Fluorel, Daiel), caucho-perflúor (se obtiene bajo la denominación de Klarez), caucho-metil-fenil-silicona, caucho-metil-vinil-silicona, caucho-metil-flúor-silicona, caucho-flúor-silicona, caucho-polisulfuro, caucho-uretano, prepolímeros de poliéster o poliéter a base de 4,4'-metilendi(fenilisotiocianato) y toluoldiisocianato (se obtiene bajo las denominaciones de Adipren, Elastothane, Genthane, Urepan, Vibrathan).

El elemento de fondo de la cámara de la muestra (400) está configurado ventajosamente de modo que dispone de un sustrato calefactor/sensor integrado. El sustrato calefactor/sensor integrado consiste en general en sistemas calefactores reguladores de la temperatura. Los sustratos calefactor/sensor integrados de este tipo se describen en PCT/EP00/06103.

El elemento de fondo (400) es ópticamente transparente y no fluorescente en la zona del espacio de la muestra definido por la escotadura del septo hermético (300) o en la zona definida por la superficie de tapa del elemento de tapa. Preferentemente es de materiales tales como Borofloat 33 (se adquiere en Schott), cristal de cuarzo, CaF_{2} monocristalino (se adquiere en Schott) y/o silicio monocristalino. Mediante el sustrato calefactor/sensor integrado en el elemento de fondo (400) se puede ajustar la temperatura a +/- 1ºC en el dominio de 0ºC a 100ºC, preferentemente de 0ºC a 95ºC y/o de 50ºC a 95ºC.

En una forma de realización de la invención, la biblioteca de sustancias (201) está sobre el elemento de fondo (400). El elemento de fondo (400) debe ser igualmente ópticamente transparente y no fluorescente en la zona cuyo tamaño, forma y posición vienen definidos por la superficie de detección de la biblioteca de sustancias (201). Si la biblioteca de sustancias está sobre un chip y éste va fijado al elemento de fondo (400), el chip debe ser ópticamente transparente y permeable.

En una forma de realización especial de la invención la biblioteca de sustancias (201) se encuentra directamente sobre el elemento de fondo (400). El elemento de fondo (400) puede tener en este caso una estructura de electrodos que hace posible detectar la interacción de las moléculas objetivo con las moléculas sonda de la biblioteca de sustancias, no mediante procedimientos de detección ópticos sino mediante dimensiones de medida electrónica tales como impedancia, conductividad, potencial, capacidad, etc. (US 6 013 166, US 628 590, US 6 245 508, US 5 965 452, Tu et al. (2000) Electrophoresis, 21). En este caso ni el elemento de fondo (400) ni el elemento de tapa (200) deben ser necesariamente óptimamente transparentes y no fluorescentes en las zonas definidas por la biblioteca de sustancias (201), aunque pueden serlo.

La cámara de reacción (500) falciforme, formada por el elemento de fondo (400), elemento intermedio (300) y el elemento de tapa (200), se designa también como unidad central (500). Para fijar y alinear la unidad central, el elemento de fondo (400), el elemento intermedio (300) y el elemento de tapa (200) se disponen superpuestos en escotaduras (117) que van colocadas en los elementos de sujeción (101 y 102) acoplables entre sí.

Apretando entre sí los dos elementos de sujeción, la unidad central formada por los elementos de fondo, intermedio y tapa es presionada hasta quedar hermética. Para ello, en una forma de realización preferida las escotaduras de los elementos de sujeción (101 y 102) que pueden fijarse entre sí tienen estribos (118). El septo hermético (300) es presionado hacia un lado. Para no impedir este proceso, el septo hermético (300) está construido de modo que dispone de juntas de dilatación (302). Para asegurar un posicionamiento seguro del septo hermético (300) en los elementos de sujeción (101 y 102) a pesar de las juntas de dilatación (302), el septo hermético tiene tubos de ajuste (304) en sus esquinas.

En otra forma de realización el elemento de tapa (200), el elemento intermedio (300) y el elemento de fondo (400) pueden estar pegados entre sí.

Para inyectar libre de volúmenes muertos el espacio de reacción (301) cerrado herméticamente de esta manera, se clavan en una posición lateral precisa del septo hermético (300) dos cánulas fijas a una distancia definida. Las agujas penetran entonces en la esquina del lado plano de la escotadura en forma de D o en la esquina de la escotadura en forma de luna nueva del espacio de reacción (301). Con ello, el espacio de reacción (301) y la cámara de reacción (500) tienen una entrada y una salida. La muestra se transporta ahora a la cámara de reacción (500) mediante una jeringa. De la misma manera, la cámara puede vaciarse o el líquido de muestra puede cambiarse, por ejemplo, por un tampón de lavado.

La forma del espacio de reacción (301) está desarrollada desde el punto de vista de los fluidos de modo que es posible, con una elevada reproducibilidad, el llenado libre de burbujas con un líquido de muestra. Después del llenado se retiran de nuevo las agujas, de modo que se cierran los agujeros de punción en el septo hermético elástico (300) y la muestra queda encerrada en la cámara de reacción (500) de manera hermética y resistente a la presión. Todo el líquido de muestra se encuentra en el espacio de reacción (301) y no en los canales de entrada o salida, por lo cual el cartucho (1) funciona libre de volúmenes muertos.

Mediante el cierre hermético de la cámara de reacción (500), la biblioteca de sustancias (201), sensible a los esfuerzos mecánicos, está protegida frente a cualquier daño. Otra ventaja según la invención es que en una detección de sustancias muy sensibles frente a la contaminación, hasta el análisis el espacio de reacción (301) se puede llenar con sustancias protectoras tales como líquidos protectores y gases protectores. Los gases protectores de este tipo pueden ser preferentemente argón, nitrógeno y gases inertes. Si la biblioteca de sustancias ligada a la superficie es, por ejemplo, de moléculas de ARN sensibles a la ARNasa, la cámara de la muestra (500) puede protegerse hasta el análisis con inhibidores de la ARNasa (por ejemplo agua-DEPC). Al llenar con el material de muestra, la sustancia protectora se elimina por simple desalojo.

Durante el proceso de fabricación puede haber sustancias estándar en el espacio de reacción (301). Para la PCR sería adecuada, por ejemplo, una mezcla de nucleótidos, iniciadores (primer), polimerasa y tampón PCR.

Una realización ventajosa de la invención prevé enfriar la unidad central (500). Para ello, los elementos de sujeción (101 y 102) contienen canales refrigerantes (105) que pueden llevar distintos medios refrigeradores. Los medios refrigeradores pueden ser preferentemente hidrocarburos fluorados, R134, amoniaco, hidrocarburos volátiles como por ejemplo propano, aire enfriado, gases enfriados como por ejemplo CO_{2} licuado o gasificado. Esta configuración ventajosa permite en especial una realización precisa de la PCR.

Utilizando por ejemplo CO_{2} ó R134 se puede termostatizar la muestra en el cartucho también a temperaturas notablemente por debajo de la temperatura ambiente, una función que, particularmente en la reacción de hibridación, es deseable. En una realización ventajosa de la invención se insuflan medios refrigeradores en la unidad central (500) a través de las entradas de medio refrigerador (112 y 117) y la salida de medio refrigerador (116) que van integradas de modo correspondiente en los elementos de sujeción (101 y 102). Utilizando por ejemplo CO_{2} u otro medio refrigerador (R134), se puede enfriar la unidad central a temperaturas por debajo de la temperatura ambiente. Mediante el sustrato calefactor/sensor (400) puede regularse a +/- 1ºC una temperatura por debajo de la temperatura ambiente. El rango de trabajo disponible de los cartuchos es entonces de -30ºC a 100ºC, preferentemente 0ºC a 95ºC y/o 50ºC a 95ºC.

Una realización preferida de la invención prevé que los dos elementos de sujeción (101 y 102) que pueden fijarse entre sí constituyen dos medios cascos que encajan entre sí. Los elementos de sujeción fijados entre sí o los medios cascos fijados entre sí forman, junto con la unidad central (500), un dispositivo que también se designa como cartucho (1).

Según la invención, el cartucho puede formarse desde un lado mediante la simple superposición de los distintos componentes, que consisten en el elemento de sujeción superior (101), el elemento de tapa (200), el elemento intermedio (300), el elemento de fondo (400) y el elemento de sujeción inferior (102).

El cartucho está configurado ventajosamente de modo que todas las conexiones para medios (para medios refrigeradores (105) y contactos del sistema calefactor (403)) están en un lado (120).

El cartucho está configurado ventajosamente de modo que en el lado sobre el que se encuentran las conexiones para medios (120) tiene igualmente una escotadura (103), a través de la cual puede cargarse la cámara de reacción (500) conduciendo, mediante el clavado lateral en el septo hermético (300), como mínimo dos cánulas.

En una realización preferida de la invención, la escotadura (103) está concebida de modo que puede conducirse con precisión un talón de guía (1103) en la escotadura. Para inyectar la muestra en la cámara de reacción (500), en una realización ventajosa de la invención pueden clavarse desde un lado en posición exacta en el septo hermético (300) como mínimo dos cánulas, fijas a una distancia definida, por medio de un talón de guía (1103) que puede introducirse en la escotadura (113) del cartucho (1) y de dos agujeros de guía del cartucho (guía de cánulas (103)). La muestra se inyecta en el espacio de reacción (301) de la cámara de la muestra (500), e igualmente la cámara de la muestra (500) se puede vaciar a través de dos cánulas o el líquido de muestra se puede cambiar, por ejemplo, por un tampón de lavado.

En una configuración ventajosa de la invención el cartucho (1) está concebido de modo que en el lado de la escotadura (103) y de las conexiones de medios (120) tiene cierres de resorte (106). Con ello es posible enchufar el cartucho (1) en cualquier enchufe de tipo de construcción definida (por ejemplo 1000) y tener disponible inmediatamente todas las conexiones de medios. El enchufe (1000) adecuado para esta realización ventajosa de la invención tiene un pasador (1100) que lleva las cánulas enchufables (1201) junto con el talón de guía (1103). El pasador (1100) se presiona en el cartucho (1) mediante un servomotor para abrir la cámara de la muestra (500) para el llenado o el lavado. Extrayendo el pasador (1100) vuelve a cerrarse la cámara de la muestra (500).

Mediante el pasador (1000), para el llenado del cartucho (1) se pueden conectar aparatos externos controlados por ordenador como bombas y válvulas. También el regulador de temperatura controlado por ordenador se conecta con el cartucho (1) en los contactos del elemento calefactor (403) mediante el enchufe (1000). Además, el suministro de medio refrigerador puede conectarse a través del enchufe (1000) a la conexión de medios (105) del cartucho (1) prevista al efecto.

El enchufe (1000) está construido preferentemente plano y pequeño para poder montarlo de modo universal en distintos aparatos y dispone de los correspondientes agujeros de fijación (1002) y agujeros de pasadores de ajuste (1001) para su atornillamiento y fijación.

Además, el canal refrigerante (1300) está fabricado de material aislante para proteger los medios refrigeradores contra el calentamiento. A través de un tubo de medio refrigerador (1204), que a través de una conexión de medio refrigerador (1205) está unido al canal refrigerante (1300) aislado, se comprime en caso necesario el medio refrigerador en el canal refrigerante (105).

Para el suministro eléctrico del cartucho (1), el enchufe (1000) dispone de un cable eléctrico (1206) y una conexión eléctrica (1207).

Una configuración ventajosa de la invención permite operar el cartucho (1) de manera totalmente automática mediante el enchufe (1000).

El pasador (1100) apoya de manera móvil a través de cojinetes lineales deslizantes (1003), de modo que el talón de guía (1103) puede introducirse en la escotadura (103) del cartucho (1) dispuesta al efecto. Las cánulas están conectadas con tubos de llenado (1202) a través de los cuales se pueden bombear distintas soluciones en la cámara de la muestra (500). Para poder propulsar electromecánicamente el pasador, dispone de una biela de pasador (1210) que va equipada con una rosca (1211) para fijar la propulsión. La biela de pasador (1210) va equipada con una amortiguación (1212) mecánica para poder compensar los movimientos de retroceso de la propulsión electromecánica. Pueden utilizarse entonces propulsiones económicas.

Además pueden montarse en paralelo varios de estos enchufes (1000), de modo que es posible el análisis simultáneo de varias muestras en distintos cartuchos.

En una configuración ventajosa de la invención el cartucho está concebido de tal manera que dispone de agujeros de pasadores de ajuste (108) mediante los cuales puede posicionarse en un lector de ADN, de modo que es innecesario adaptar el campo de visión o el punto de enfoque.

En una realización ventajosa de la invención los elementos de sujeción (101 y 102) que pueden fijarse entre sí son dos medios cascos que encajan entre sí, que pueden mantenerse juntos simplemente presionando uno contra otro mediante un ajuste de prensado (115).

En otras realizaciones preferidas de la invención los dos elementos de sujeción (101 y 102) del cartucho están atornillados entre sí.

En otra realización preferida de la invención los dos elementos de sujeción (101 y 102) que pueden fijarse entre sí están concebidos de modo que pueden fabricarse favorablemente de plástico mediante un procedimiento de moldeo por inyección y, por consiguiente, son económicos. Los materiales utilizados para la fabricación de los elementos de sujeción son preferentemente plásticos de policarbonato (por ejemplo se obtiene bajo la denominación de Makrolon), poliestiroles que contienen fibras de vidrio como sustancias adicionales, plexiglas que puede estar o no tintado, ó SPS GF30 (se obtiene en la empresa Schulatec).

El cartucho (1) está concebido en una realización ventajosa de modo que después de usarlo una vez puede desecharse. Con ello resulta innecesaria cualquier forma de limpieza después de la utilización.

Los dos elementos de sujeción (101 y 102) del cartucho (1) están construidos según la invención de modo que tienen por encima y por debajo de la unidad central (500) ventanas de visualización, de modo que se asegura la transparencia óptica de la cámara de reacción.

En una realización ventajosa de la invención el cartucho está construido de tal manera que en el lado del elemento de sujeción (101) dirigido a la óptica selectora se encuentra una estructura antirreflectante (109) que suprime la luz dispersa. Esta estructura tiene preferentemente la forma de cavidades (ranuración) paralelas y estrechas. Otras formas utilizables como estructura de reflexión son botones, rugosidades o disposiciones piramidales. Mediante esta característica ventajosa del cartucho (1) se pueden utilizar una pluralidad de procedimientos ópticos (medición de fluorescencia de campo oscuro, de luz incidente, de luz transversal y de luz transmitida, medición con focal de fluorescencia, medición de luminiscencia, medición de fosforescencia, medición de absorción) para evaluar la interacción analizada en la cámara de la muestra.

En otra realización ventajosa de la invención cada cartucho (1) se caracteriza individualmente mediante una matriz de datos (600). Para ello, al montar el cartucho se guarda un conjunto de datos en un banco de datos, que además de los valores característicos para el sustrato calefactor/sensor (400) contiene informaciones sobre cómo debe evaluarse la biblioteca de sustancias (201) incluida y cómo debe tratarse la muestra en el cartucho (1) para tener éxito en el diagnóstico. Este conjunto de datos contiene un número, que se coloca sobre el cartucho en forma de la matriz de datos (600). El número indicado en la matriz de datos (600) llama al conjunto de datos colocado en el montaje. Basándose en el protocolo allí establecido, se procesa la muestra de modo totalmente automático. Al usuario sólo le queda inyectar la muestra y leer los resultados del análisis. En otra realización ventajosa de la invención la cámara de la muestra (500) puede cargarse manualmente mediante una estación de llenado manual (2000), que a partir de ahora se designará como inyector (2000). Este asume en el dispositivo para la proyección de la muestra sólo la función del enchufe y tiene, lo mismo que éste, un enchufe de cierre rápido integrado (2106).

Tiene en especial cavidades para cargar y airear la cámara de la muestra (500) del cartucho (1) así como cavidades para extraer el cartucho (1). Puede tratarse preferentemente de cavidades para colocar una jeringa (2401) desechable llena de líquido de muestra, con cánula enchufada (2402) y una cánula de aireación (2403) única, de modo que al enchufar el cartucho (1) las cánulas penetran al mismo tiempo en la cámara de reacción (301) de la cámara de la muestra (500). La muestra se puede inyectar entonces en la cámara de la muestra (500) del cartucho (1), produciéndose la aireación de la cámara de la muestra (500) a través de la cánula de aireación (2403). Después de cargar la cámara de la muestra (500), se extrae el cartucho (1) del inyector (2000) y se enchufa en el enchufe (1000) para el posterior tratamiento. Ya que la jeringa (2401) y las cánulas (2402 y 2403) son artículos desechables, se evita una contaminación del espacio de la muestra con sustancias no deseadas.

La estación de llenado manual (2000) consta de dos partes, una tapa (2200) y un cuerpo de base (2100) que a través de las correspondientes escotaduras para fijar el dispositivo (1) según la invención disponen de una unidad de llenado y una unidad de aireación. La unidad de llenado es preferentemente una jeringa con cánula (2401 y 2402) y la unidad de aireación una cánula (2403). La tapa (2200) y el cuerpo de base (2100) pueden fijarse mediante cualquier dispositivo. Esta fijación se produce preferentemente mediante imanes.

El dispositivo (1) según la invención puede utilizarse en principio para todos los procedimientos de ensayo basados en la interacción específica de una molécula objetivo con una sonda fijada en un micro-array. Puede tratarse de interacciones proteína-proteína, interacciones proteína-ácido nucleico e interacciones ácido nucleico-ácido nucleico.

El dispositivo (1) según la invención se utilizará preferentemente para procedimientos de ensayo en los que se trata de estudios de interacción entre proteínas o péptidos con una biblioteca de anticuerpos fijada sobre un chip. En otra aplicación preferida se utiliza el dispositivo para estudios de interacción entre un ácido nucleico objetivo y una sonda de ácido nucleico basados en micro-array. En una utilización especialmente preferida se utiliza el dispositivo según la invención para la detección de microorganismos en muestras clínicas.

En otra forma de realización especialmente preferida se utiliza el dispositivo (1) según la invención para la detección de la presencia de secuencias de ADN. A partir de la detección de determinadas secuencias de ADN puede deducirse, por ejemplo, la presencia de agentes patógenos y su resistencia frente a los medios terapéuticos. Especialmente preferida es asimismo el uso del dispositivo (1) para determinar el estado genético de células u organismos como, por ejemplo, para detectar mutaciones que provocan enfermedades hereditarias (por ejemplo mucoviscidosis, fenilcetonuria, infertilidad, etc.) o detectar polimorfismos. Un campo de aplicación igualmente preferido es la detección de diferencias genéticas que conducen a la identificación de individuos (por ejemplo aplicaciones en el campo forense, pruebas de paternidad, etc.).

La detección de interacciones entre sondas y objetivos puede realizarse en general mediante métodos habituales tales como evaluaciones ópticas utilizando marcadores fluorescentes como Cy3; Texas Red, etc., o marcadores radioactivos o también mediante reacciones químicas como por ejemplo precipitación de plata (WO 98/04740).

Especialmente preferida es también la utilización del dispositivo para detectar el estado fisiológico de células, por ejemplo mediante "expresión profiling". En este caso se prefiere una amplificación lineal, por ejemplo mediante amplificación PCR lineal.

Especialmente preferida es también la utilización del dispositivo junto con otros procedimientos de amplificación para cuya realización se necesita un régimen de temperaturas cíclico, como por ejemplo la reacción en cadena de la ligasa (LCR) o la reacción de detección de la ligasa (LDR), en especial cuando ésta va ligada a un análisis basado en array.

El procedimiento según la invención permite operar de manera totalmente automática, controlada por la temperatura y controlada por el flujo, los procedimientos de ensayo basados en micro-array. El dispositivo según la invención permite, además, realizar procedimientos de ensayo basados en micro-array y al mismo tiempo una PCR sin acabar los productos intermedios.

El dispositivo según la invención se utiliza preferentemente para multiplicar al mismo tiempo ácidos nucleicos mediante PCR y analizar los productos de la PCR mediante una prueba basada en micro-array, en la que se utilizan ácidos nucleicos como sondas.

En el dispositivo (1) según la invención se pueden realizar también reacciones tales como la reacción en cadena de ligasas (LCR) y/o la reacción de detección de la ligasa (LDR).

La construcción según la invención del dispositivo (1) permite fabricar de manera económica como artículo desechable un cartucho que puede utilizarse para la realización de procedimientos de prueba basados en micro-array.

Los ejemplos siguientes sirven para visualizar la invención sin que por ello se limite en ningún sentido.

Ejemplo 1 PCR

Se construyó un cartucho (1) según la Figura 2. Todos los datos técnicos correspondientes a este cartucho y los protocolos se guardaron en un banco de datos. Se asignó al cartucho un número individual, que permite relacionar automáticamente el cartucho (1) con el correspondiente conjunto de datos del banco de datos. El número se imprimió como matriz de datos (600) y se pegó sobre el cartucho (1).

En una jeringa de inyección (2401) con cánula (2402) se cultivó una mezcla PCR formada por 1 \mul de ADN genómico de Corynebacterium glutamicum (5 pg/\mul), 1 \mul de iniciador (AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG) (10 pg/\mul), 1 \mul de iniciador (TAC CGT CAC CAT AAG GCT TCG TCC CTA) (10 pg/\mul), 1 \mul MgCl_{2} (25 mM), 5 \mul tampón PCR, 1 \mul dNTP x50 (10 mM cada base), 0,5 \mul polimerasa Tag (5 unidades/\mul) y 39,5 \mul de agua.

La jeringa de inyección y la cánula de aireación (2401, 2402 y 2403) se colocaron en el cuerpo de base (2100) del inyector (2000), se colocó la tapa (2200) y se introdujo el cartucho (1) en la bolsa de cartuchos (2001). Finalmente se inyectaron 20 \mul de la mezcla PCR en la cámara de la muestra (500) y se extrajo el cartucho (1) del inyector (2000).

El resto de la mezcla PCR se añadió a los tubos de ensayo para amplificar en un Thermocycler convencional y se amplificó.

Se enchufó el cartucho (1) en el enchufe (1000) y se leyó y transmitió automáticamente al programa de control el número individual de cartucho codificado en la matriz de datos (600). A partir de este número se leyeron del banco de datos los datos técnicos y el protocolo necesario para la PCR. Los datos técnicos sobre el control de temperatura se transmitieron al regulador de temperatura. El pasador (1100) no se introdujo en el cartucho (1) de modo que el espacio de reacción (301) permaneció cerrado. En el cartucho se realizó la PCR. Se utilizó el siguiente protocolo de temperatura: desnaturalización inicial durante 240 s a 45ºC. Ciclos de elongación, cada uno con 60 s a 95ºC, 60 s a 58ºC y 150 s a 72ºC, así como una extensión final de 420 s a 72ºC.

Para acelerar los tiempos de enfriamiento se bombeo en el cartucho aire comprimido como medio refrigerador a través del tubo refrigerador y el canal refrigerante aislado. En combinación con la PCR, para abrir la cámara de la muestra (500) se introdujo el pasador (1000) en el cartucho (1) y se bombeo hacia fuera la muestra de la PCR. La muestra se aplicó sobre un gel de electroforesis para detectar la funcionalidad del cartucho. En la Figura 9 se documenta el éxito del experimento en comparación con los resultados en los Thermocycler convencionales.

Ejemplo 2 Hibridación y PCR

Se construyó un cartucho (1) conforme a la Figura 2. Todos los datos técnicos correspondientes a este cartucho y los protocolos se guardaron en un banco de datos. Se asignó al cartucho (1) un número individual, que permite relacionar automáticamente el cartucho (1) con el correspondiente conjunto de datos del banco de datos. El número se imprimió como matriz de datos (600) y se pegó sobre el cartucho (1).

El elemento de tapa (200) montado en el cartucho, que también se designará como array, llevaba una biblioteca de sustancias formada por 4 sondas distintas y dispuesta sobre la superficie en forma de un tablero de ajedrez. Cada elemento del array tiene un tamaño de 256x256 \mum. Cada sonda se dispuso redundante, es decir, en 16 puntos. Debido a la estructura de la superficie cada uno de los puntos presenta un reticulado. La biblioteca de ADN constaba de la secuencia P1 (complementaria al fragmento PCR) y tres variantes de deleción distintas:

P1:5' CCTCTGCAGACTACTATTAC3'

P1del9_11:5' CCTCTGCAATACTATTAC3'

P1del10_12:5' CCTCTGCAGCACTATTA3'

P1del9_10_11_12:5' CCTCTGCAACTATTAC3'

En una jeringa de inyección (2401) se cultivó una mezcla PCR formada por 5 \mul Advantage2 PCR Buffer (Clontech, Palo Alto, USA), 1 \mul dNTP Mix 20mM, 1 \mul Taq-polimerasa (Advantage2, Clontech, PloAlto, USA), 1 \mul iniciador P1 (10 pmol/\mul) (5' CCTCTGCAGACTACTATTAC3') (MWG, Ebersberg, Alemania), 1 \mul iniciador P2, (10 pmol/\mul) en el extremo 5' acoplado con el tinte fluorescente Cyanine 3 (5' CCTGAATTCTTGCTGTGACG3') (MWG, Ebersberg, Alemania), 1 \mul molde (Template) 106-mer producto PCR (1 ng/\mul) con la secuencia 5'CCTCTGCAGACTACTATTA
CATAATACGACTCACTATAGGGATCTGCACGTATACTTCTATAGTGTCACCTAAATAGGCAGTCTGTCGTCA
CAGCAAGAATTCAGG3', 40 \mul agua desionizada.

La jeringa de inyección y la cánula de aireación (2401, 2402 y 2403) se colocaron en el cuerpo de base del inyector (2000), se colocó la tapa (2200) y se introdujo el cartucho (1) en la bolsa de cartuchos (2001). Finalmente se inyectaron 20 \mul de la mezcla PCR en la cámara de la muestra (500) y se extrajo el cartucho (1) del inyector (2000).

Se puso en contacto el cartucho a través del enchufe (1000), se leyó el número de cartucho individual codificado en la matriz de datos (600) y se transmitió automáticamente al programa de control. A partir de este número se leyeron del banco de datos los datos técnicos y el protocolo necesario para la PCR. Los datos técnicos sobre el control de temperatura se transmitieron al regulador de temperatura. El pasador (1100) no se introdujo en el cartucho (1) de modo que el espacio de reacción (301) del cartucho (1) permaneció cerrado. En el cartucho se realizó la PCR. Se realizó el siguiente protocolo de temperatura:

Desnaturalización inicial 120 s a 95ºC, ciclos de elongación cada uno de 35 s a 95ºC, 40 s a 42ºC y 40 s a 72ºC, finalmente extensión de 240 s a 72ºC. Para acelerar los tiempos de enfriamiento se bombeo en el cartucho (1) aire comprimido como medio refrigerador a través del tubo refrigerador y el canal refrigerante aislado.

Junto con la PCR se produjo la hibridación del producto PCR en la biblioteca de ADN ligado a la superficie sobre el array de ADN. Se temperó el cartucho durante 5 min a 95ºC y a continuación se incubó durante 1 h a 30ºC. Para retirar de la superficie el ADN ligado de modo no específico y del cartucho el Fluorophore no ligado, siguió un proceso de aclarado. Para ello se introdujo el pasador (1100) en la escotadura (103) del cartucho (1) y se reemplazó la muestra de PCR en la cámara de la muestra (500) mediante bombeo continuo de 500 \mul de tampón de lavado 1 (2xSSC, 0,2%SDS) (velocidad de flujo aprox. 0,1 ml por minuto). Se temperó el cartucho (1) a 30ºC. A continuación se enjuagó el cartucho a la misma velocidad y temperatura con 500 \mul de tampón de lavado 2 (2xSSC). Al final del proceso de lavado, la cámara de la muestra (500) quedó llena de tampón de lavado 2. Las conexiones fluidas se eliminaron de la cámara de la muestra (500) moviendo el pasador (1100).

La detección de las señales de hibridación se realizó en tampón de lavado 2 (2xSSC) bajo un microscopio de fluorescencia Zeiss (Zeiss, Jena, Alemania). La estimulación se produjo en luz incidente con una fuente de luz blanca y un juego de filtros adecuado para Cyanine 3. Las señales se grabaron mediante una cámara CCD (PCO-Sensicam, Kehlheim, Alemania). El tiempo de iluminación fue de 5000 ms (Fig. 10).

Descripción de las ilustraciones Figura 1

Representación del cartucho (1) montado, formado por dos medios dispositivos (101 y 102), lado de conexión de medios (120) con matriz de datos (600), estructura antirreflectante (109) y cierre de resorte (106) en el lado de conexión de los medios. Se representan además agujeros de pasadores de ajuste (108).

Figura 2

Representación de los distintos componentes del cartucho (1) en un dibujo despiezado. En la parte superior de la imagen se ve un dispositivo de sujeción (102), en el centro la unidad central (500), formada por el elemento de fondo (400), el elementos intermedio (300) y el elemento de tapa (200), en la parte inferior de la imagen el segundo dispositivo de sujeción (101).

Figura 3

Representación del cartucho (1) conectado al enchufe (1000).

Figura 4

Representación del enchufe (1000) con rotulación del listón de conexiones del cartucho.

Figura 5

Representación general de la apertura del espacio de reacción (301) a través de cánulas (1201) mediante un pasador.

Figura 6

Representación detallada de la apertura del espacio de reacción (301) a través de cánulas (1201), que atraviesan el septo hermético (300) y forman en el espacio de reacción (301) una entrada (1202) y una salida (1203). Las cánulas se posicionan hacia la cámara de la muestra a través del talón de guía (1103) del pasador (1100) y la guía de cánulas (113) del cartucho.

Figura 7

Representación de la estación de llenado (2000) con la jeringa de inyección (2401) colocada, la tapa (2200) colocada y el cartucho (1) colocado. La estación de llenado (2000) se encuentra sobre el pie de la estación de llenado (2300), sujeto mediante imanes.

Figura 8

Representación del cuerpo de base (2100) de la estación de llenado con la jeringa de inyección (2401) colocada con cánula (2402) y cánula de aireación (2403).

Figura 9

Foto de un gel de electroforesis. En la banda A se aplicó la referencia de masa de ADN (cada 100 pares de bases un fragmento), en la banda B y D los productos PCR que se generaron en un Themocycler convencional y en las bandas C y E los productos PCR generados en el cartucho. Se amplificó ADN genómico de Corynebacterium glutamicum. El producto de amplificación presenta una longitud de aproximadamente 500 pares de bases. Se ve en la Figura 9 que el cartucho (1) puede utilizarse para la amplificación de ADN mediante PCR y que su eficiencia es equivalente a la un Themocycler convencional.

Figura 10

Análisis de la reacción PCR realizada en el Ejemplo 2. Las señales de hibridación intensas sólo se detectan en los puntos ocupados por la secuencia P1 perfectamente complementaria a la cadena marcada de la PCR.

Lista de referencias

1

cartucho

101

elemento de sujeción superior

102

elemento de sujeción inferior

103

escotadura para recoger un talón/pesador

104

ventanilla

105

conexión de medios para líquidos refrigeradores

106

cierre de resorte

108

agujeros de pasadores de ajuste

403

contactos para elemento calefactor

120

lado de conexiones de medios

109

estructura antirreflectante

600

matriz de datos

117

salida del canal refrigerante

118

estribo

400

elemento de fondo con sustrato calefactor/sensor integrado

401

soporte del sustrato calefactor/sensor integrado

402

escotadura ópticamente transparente

403

contactos para sustrato calefactor/sensor

404

contactos para sustrato calefactor/sensor

300

elemento intermedio hermetizador, elástico, que puede traspasarse repetidas veces

301

escotadura comprendida en 300, define el espacio de reacción

302

juntas de dilatación

304

tubos de ajuste

200

elemento de tapa

202

elemento portante recubridor

201

biblioteca de sustancia o chip portador de biblioteca de sustancias

500

unidad central o cámara o cámara de reacción o cámara de la muestra

105

canal refrigerante

109

cierre de resorte

110

cierre de resorte

111

escotadura para contactos del sustrato calefactor/sensor (403)

112

entrada de medio refrigerador

116

salida de medio refrigerador

117

entrada de medio refrigerador

115

ajuste de prensado

1000

enchufe

1100

pasador

1103

talón de guía

1001

agujeros de pasadores de ajuste

1002

agujeros de fijación

1206

cable eléctrico

1207

conexión eléctrica

1202

tubos de llenado

1210

biela de pasador

1211

rosca

1212

amortiguación

1204

tubo de medio refrigerador

1205

conexión de medio refrigerador

1300

canal refrigerante

1201

cánulas enchufables

2000

estación de llenado manual

2106

enchufe de cierre rápido

2401

jeringa desechable

2404

cánula

2403

cánula de aireación

2402

punta de una cánula

2403

punta de una cánula

2100

cuerpo de base de la estación de llenado manual

2200

tapa de estación de llenado manual

2101

depresión de agarre

2102

depresión de agarre

Claims (30)

1. Dispositivo (1) para sujetar un soporte de bibliotecas de sustancias que comprende dos elementos de sujeción (101 y 102) que pueden fijarse entre sí, que forman un conjunto de capas constituido por

(i) un elemento de tapa (200) que en su lado inferior tiene una superficie de detección con una biblioteca de sustancias (201) y que, al menos en la zona de la superficie de detección, es ópticamente transparente,

(ii) un elemento intermedio (300) que tiene una escotadura hermetizante y cerrada, y

(iii) un elemento de fondo (400) ópticamente transparente, como mínimo en la zona de la superficie de detección del elemento de tapa.

con lo cual se forma una cámara (500) ópticamente transparente con un espacio de cámara.

2. Dispositivo (1) según la reivindicación 1, caracterizado porque el elemento de fondo (400) comprende un dispositivo de calefactor-sensor de temperatura integrado.

3. Dispositivo (1) según las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque el elemento de fondo (400) es de Borofloat 33, cristal de cuarzo, CaF_{2} monocristalino y/o silicio monocristalino.

4. Dispositivo (1) según una de las anteriores reivindicaciones, caracterizado porque el elemento de tapa (200) es de vidrio, Borofloat 33, cristal de cuarzo, CaF_{2} monocristalino, silicio monocristalino, fenilmetilmetacrilato y/o policarbonato.

5. Dispositivo (1) según una de las anteriores reivindicaciones, caracterizado porque el elemento intermedio (300) es elástico y puede traspasarse lateralmente repetidas veces con cánulas y porque al extraer las cánulas el espacio de cámara queda herméticamente cerrado.

6. Dispositivo (1) según una de las anteriores reivindicaciones, caracterizado porque el elemento intermedio (300) es de polidimetilsiloxano (se obtiene bajo las denominaciones de Sylgard 184 ó 182), de caucho natural, caucho-butadieno, caucho-cloropreno, caucho-nitrilo-butadieno, caucho-butilo, caucho-isopreno-estirol, caucho-polinorborneno, caucho-etileno-propileno, caucho-flúor (se obtiene bajo las denominaciones de Biton, Tecnolflon, Fluorel, Daiel), caucho-perflúor (se obtiene bajo la denominación de Klarez), caucho-metil-fenil-silicona, caucho-metil-vinil-silicona, caucho-metil-flúor-silicona, caucho-flúor-silicona, caucho-polisulfuro, caucho-uretano, prepolímeros de poliéster o poliéter a base de 4,4'-metilendi(fenilisotiocianato) o toluoldiisocianato (se obtiene bajo las denominaciones de Adipren, Elastothane, Genthane, Urepan, Vibrathan).

7. Dispositivo (1) según una de las anteriores reivindicaciones, caracterizado porque la escotadura (301) del elemento intermedio define la forma geométrica del espacio de cámara.

8. Dispositivo (1) según una de las anteriores reivindicaciones, caracterizado porque el espacio de cámara (301) puede llenarse sin que queden burbujas de aire.

9. Dispositivo (1) según una de las anteriores reivindicaciones, caracterizado porque el espacio de cámara (301) definido por el elemento intermedio (300) tiene forma de D, de luna nueva o falciforme.

10. Dispositivo (1) según una de las anteriores reivindicaciones, caracterizado porque la cámara (500) formada por el elemento de tapa (200), el elemento intermedio (300) y el elemento de fondo (400), puede enfriarse.

11. Dispositivo (1) según una de las anteriores reivindicaciones, caracterizado porque los dos elementos de sujeción (101 y 102) son medios cascos que encajan entre sí, que al apretar mediante ajuste de prensado (115) se mantienen unidos.

12. Dispositivo (1) según una de las anteriores reivindicaciones, caracterizado porque los elementos de sujeción (101 y 102) unidos disponen de canales (105) para enfriar la cámara (500).

13. Dispositivo (1) según una de las anteriores reivindicaciones, caracterizado porque los elementos de sujeción (101 y 102) unidos disponen de una escotadura (103) para recoger un pasador (1100) o talón (1103) para cargar la cámara de la muestra (500).

14. Dispositivo (1) según una de las anteriores reivindicaciones, caracterizado porque las conexiones de medios para calentar (403) la cámara (500) y para enfriar (105) la cámara (500) y las escotaduras (103) para recoger un aparato de inyección se encuentran situados en un lado del dispositivo (120).

15. Dispositivo (1) según una de las anteriores reivindicaciones, caracterizado porque el dispositivo puede enchufarse en un enchufe (1000).

16. Dispositivo (1) según una de las anteriores reivindicaciones, caracterizado porque el dispositivo puede operarse de manera totalmente automática a través de un enchufe (1000).

17. Dispositivo (1) según una de las anteriores reivindicaciones, caracterizado porque el dispositivo puede enchufarse en una estación de carga manual (2000).

18. Dispositivo (1) según una de las anteriores reivindicaciones, caracterizado porque la biblioteca de sustancias (201) es una biblioteca de proteínas.

19. Dispositivo (1) según la reivindicación 18, caracterizado porque la biblioteca de proteínas es una biblioteca de anticuerpos, una biblioteca de proteínas receptoras o una biblioteca de proteínas de membrana.

20. Dispositivo (1) según una de las reivindicaciones 1 a 17, caracterizado porque la biblioteca de sustancias (201) es una biblioteca de péptidos.

21. Dispositivo (1) según la reivindicación 20, caracterizado porque la biblioteca de péptidos es una biblioteca de ligantes receptores, una biblioteca de péptidos farmacológicamente activos o una biblioteca de hormonas peptídicas.

22. Dispositivo (1) según una de las reivindicaciones 1 a 17, caracterizado porque la biblioteca de sustancias (201) es una biblioteca de ácidos nucleicos.

23. Dispositivo según la reivindicación 22, caracterizado porque la biblioteca de ácidos nucleicos es una biblioteca de moléculas de ADN.

24. Dispositivo según la reivindicación 22, caracterizado porque la biblioteca de sustancias es una biblioteca de moléculas de ARN.

25. Utilización de un dispositivo (1) según una de las reivindicaciones 1 a 17, para realizar pruebas basadas en micro-array.

26. Utilización de un dispositivo (1) según una de las reivindicaciones 1 a 17, para realizar pruebas de hibridación.

27. Utilización de un dispositivo (1) según una de las reivindicaciones 1 a 17, para realizar una PCR, una LCR o una LDR.

28. Utilización de un dispositivo según una de las reivindicaciones 1 a 17, para realizar al mismo tiempo pruebas basadas en micro-array y una PCR.

29. Dispositivo (2000) para llenar un dispositivo (1) según una de las reivindicaciones 1 a 22, caracterizado

(i) porque el dispositivo (2000) consta de un cuerpo de base (2100) y una tapa (2200) que puede fijarse en el cuerpo de base, conteniendo el cuerpo de base (2100) escotaduras para una unidad de llenado, una unidad de aireación y para un dispositivo (1) según una de las reivindicaciones 1 a 22

(ii) y las escotaduras están dispuestas de modo que la cámara de la muestra (500) del dispositivo (1) según una de las reivindicaciones 1 a 22 se puede cargar y airear traspasando lateralmente el elemento intermedio (300).

30. Dispositivo (2000) según la reivindicación 29, caracterizado porque la unidad de llenado es una jeringa (2401) con cánula (2402) y la unidad de aireación una cánula (2403).