ES2219374T3 - Dispositivo de matriz de microchip para la multiplicacion y la caracterizacion de acidos nucleicos. - Google Patents

Abstract

Dispositivo para la multiplicación y la caracterización de ácidos nucleicos en un recinto de reacción, caracterizado porque un cuerpo de cámara (1) ópticamente transparente, que contiene un chip (2) ópticamente transparente con ácidos nucleicos ligados a él y un área de detección (12), está dispuesto en forma de junta sobre un portador de cámara (5) ópticamente transparente, da tal manera que se forma una cámara de muestras (3) con una ranura capilar (7) entre el portador de cámara (5) y el área de detección (12) del chip (2), que es controlable en cuanto a la temperatura y al caudal de flujo circulante.

Description

Dispositivo de matriz de microchip para la multiplicación y la caracterización de ácidos nucleicos.

La invención se refiere a un dispositivo para la multiplicación y la caracterización de ácidos nucleicos.

Desde hace décadas se conoce que la amplificación (multiplicación) de ácido desoxirribonucleico (ADN), las moléculas que contienen la clave del genoma (la información hereditaria) de organismos, se realiza in vivo (en la célula) mediante transcripción e in vitro (fuera de la célula) puede efectuarse mediante el procedimiento de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Ahora ya es rutina de laboratorio multiplicar los ácidos nucleicos mediante PCR, clonar los productos de la PCR (insertarlos en una molécula portadora e introducirlos en un microorganismo), amplificar los productos de PCR clonados en microorganismos y aislar los productos de PCR amplificados (Sambrook, J; Fritsch, E. F. y Maniatis, T., 1989; Molecular cloning: a laboratory manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor, N. Y., Cold Spring Harbor Laboratory). Esta multiplicación rutinaria en dos etapas posibilita producir una cantidad enorme de moléculas iguales a partir de unas pocas moléculas de partida de ácido nucleico, pero tiene la desventaja de que cuesta mucho trabajo y mucho tiempo, presenta un rendimiento de muestras muy bajo (la cantidad de ácidos nucleicos procesados por una unidad de tiempo) y por ello es muy costoso.

En cambio, la multiplicación en una etapa mediante PCR es relativamente rápida, mediante procedimientos miniaturizados posibilita un alto rendimiento de muestras en volúmenes bajos de preparación de muestra, y por la automatización no implica tanto trabajo.

Mediante una sola multiplicación no es posible una caracterización de ácidos nucleicos. Más bien es necesario usar procedimientos de análisis, como determinaciones de secuencias de ácidos nucleicos o exámenes electroforéticos de los productos de la PCR o de sus fragmentos individuales producidos de forma enzimática, después de la multiplicación, para caracterizar los productos de la PCR.

De los documentos US 5,716,842; DE 19519015 A1; WO 94/05414; US 5,587,128; US 5,498,392; WO 91/16966; WO 92/13967; F 9009894, así como de las publicaciones de S. Poser, T. Schulz, U. Dillner, V. Baier, J. M. Köhler, D. Schimkat, G. Mayer, A. Siebert (Chip elementes for fast thermocycling, Sensors and Actuators A, 1997; 62 672-675) y M. U. Kopp, A. J. de Mello, A. Manz (Chemical amplification: Continuous-flow PCR on a chip, Science, 1998: 280 1046-1048) se conocen diversos procedimientos y aparatos (termocicladores) miniaturizables o miniaturizados para llevar a cabo la PCR.

En los documentos DE 19519015 A1; WO 94/05414; US 5,587,128; US 5,498,392 y en la publicación de S. Poser, T. Schulz, U. Dillner, V. Baier, J. M. Köhler, D. Schimkat, G. Mayer, A. Siebert (Chip elementes for fast thermocycling, Sensors and Actuators A, 1997: 62 672-675) están descritos termocicladores que están compuestos por cámaras con tapa que reciben las muestras.

Los termocicladores miniaturizables o miniaturizados, presentados en los documentos US 5,716,842; DE 19519015 A1; WO 91/16966; WO 92/13967; F 9009894 y en la publicación M. U. Kopp, A. J. de Mello, A. Manz (Chemical amplification: Continuous-flow PCR on a Chip, Science, 1998; 280 1046-1048), funcionan mediante el principio del bombeo continuo del líquido de muestra a través de tres zonas de temperatura.

La desventaja de todas las soluciones antes citadas es que mediante la detección durante el funcionamiento sólo puede obtenerse la información de si se ha amplificado ácido nucleico y, dado el caso, cuánto ácido nucleico se amplificó. Otra caracterización de los productos de amplificación no es posible.

En el documento US-PS 5,856,174 se da a conocer un sistema con el que es posible bombear líquidos de muestra en vaivén entre, por ejemplo, tres cámaras miniaturizadas. En una cámara de este sistema se efectúa la PCR, en la siguiente se realiza una reacción de tratamiento y en la tercera se detectan los productos de reacción, por ejemplo, con un chip de ADN. En el caso de la cámara de PCR se trata de un recipiente estándar, como está descrito suficientemente en la bibliografía (S. Poser, T. Schulz, U. Dillner, V. Baier, J. M. Köhler, D. Schimkat, G. Mayer, A. Siebert; Chip elementes for fast thermocycling, Sensors and Actuators A, 1997:62, 672-67). La desventaja de este sistema consiste en que se debe construir un sistema complicado, propenso a trastornos y costoso en cuanto a la técnica del control, de una fluidez accionada por presión, para transportar el líquido de muestra de la cámara de PCR hacia la cámara de detección. Además, la separación de la amplificación y de la detección conduce a una prolongación del tiempo total de análisis.

Las caracterizaciones genéticas, por ejemplo, para la identificación y la clasificación taxonómica de microorganismos, hoy en día se efectúan mediante estudios de hibridaciones ADN-ADN, comparaciones de secuencias de genes de ARNr (ARN ribosomal) (por ejemplo, mediante tramos de ARN ribosomal 16 S o 23 S de genes), después de la secuenciación efectuada de estos tramos, así como mediante análisis de polimorfismo de longitudes de fragmentos de restricción (RFLP) o análisis mediante PCR con cebadores específicos, mediante separación y detección por electroforesis en gel de los productos de restricción o de PCR (T. A. Brown, 1996, Gentechnologie für Einsteiger, Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg, Berlín, Oxford).

Los exámenes RFLP conocidos se basan en una distribución de sitios de intersección de endonucleasas de restricción, específica de los individuos, que se refiere a diferencias de secuencia de ADN en el ámbito de ADN genómico que posee una homología alta a una sonda de ADN marcada, usada para la hibridación (T. A. Brown, 1996, Gentechnologie für Einsteiger, Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg, Berlín, Oxford).

El examen RFLP, que, por ejemplo, puede usarse en el diagnóstico por antígeno humano de leucocitos (AHL) en la inmunología, previamente a transplantes o transfusiones (véanse Cesbron A., Moreau P., Milpied H., Muller JY., Harousseau JL., Bignon JD., "Influence of HLA-DP mismatches on primary MLR responses in unrelated HLA-A, B, DR, DQ, Dw identical pairs in allogeneic bone marrow transplantation" Bone Marrow Transplant 1990, Nov 6:5, 337-40 o Martell RW., Oudshoom M., May RM., du Toit ED., "Restriction fragment length polymorphism of HLA-DRw53 detected in South African blacks and individuals of mixed ancestry" Hum. Immunol. 1989, Dec 26:4, 237-44), comprende el aislamiento de ADN genómico, la escisión de la endonucleasa de restricción del ADN, una desintegración en los fragmentos de ADN, una transferencia y una inmovilización de los fragmentos de ADN, la preparación y el marcado de las sondas de hibridación, la hibridación, la detección, así como la correlación y la interpretación. La desventaja de este examen, que hasta ahora no es automatizable, es que tal análisis implica un gran costo de trabajo y de tiempo (comprende de 5 a 10 días de trabajo) y presenta un rendimiento de muestras muy bajo (un trabajador sólo tipifica hasta 50 muestras de forma paralela), de manera que es muy costoso.

Desde hace varios años se lleva a cabo de forma rutinaria la caracterización de tramos de genoma, que puede efectuarse usando moléculas de ADN o moléculas de ácido ribonucleico (moléculas de ARN), mediante la hibridación con sondas génicas específicas (Leitch, A. R., Schwarzacher, T., Jackson, D. y Leitch I. J., 1994, In situ-Hybridisierung, Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg, Berlín, Oxford). Sondas génicas son moléculas monocatenarias de ácido nucleico de secuencia conocida de bases de nucleótidos, con una longitud óptima de 100 hasta 300 bases que conducen de forma específica con tramos de ácido nucleico monocatenarios, por ejemplo, de un gen, a un apareamiento de ácidos nucleicos bicatenario y generalmente están provistos de un elemento informativo (marcador) no radioactivo o radioactivo o, dado el caso, de un colorante fluorescente o de un radionucleótido, que sirven para la detección de las sondas génicas. Se distinguen sondas de ADN bicatenarias, sondas de ARN monocatenarias, sondas sintéticas de oligonucleótidos confeccionadas a medida, con una longitud de 10 a 50 bases, sondas de genoma y sondas de ADN producidas mediante PCR (Leitch, A. R., Schwarzacher, T., Jackson, D. y Leitch I. J., 1994, In situ-Hybridisierung, Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg, Berlín, Oxford).

En la hibridación se distingue la hibridación de sondas con ácido nucleico monocatenario aislado (ADN o ARN) y la llamada hibridación in situ (hibridación en el lugar, en tejidos, células, núcleos celulares y cromosomas), en la que la sonda génica se acopla a un ácido nucleico (ADN o ARN) (monocatenario) disperso (Leitch, A. R., Schwarzacher, T., Jackson, D. y Leitch I. J., 1994, In situ-Hybridisierung, Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg, Berlín, Oxford). En esta hibridación in situ es especialmente importante que la secuencia diana y la morfología del tejido se conserven y que el tejido conservado sea permeable a la sonda y a los reactivos detectores. Esta permeabilidad no siempre existe, lo que representa una desventaja de este procedimiento.

La hibridación de sondas con cromosomas aislados y dispersos, que también se denomina hibridación in situ, esquiva la desventaja de la barrera de permeabilidad porque los cromosomas están libremente accesibles para las sondas, por ejemplo, estando fijados a un portador. (T. A. Brown, 1996, Gentechnologie für Einsteiger, Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg, Berlín Oxford).

Para la hibridación es esencial la existencia de moléculas diana de ácido nucleico y moléculas de sonda de ácido nucleico monocatenarias, lo que la mayoría de las veces ocurre por desnaturalización térmica, así como el rigor óptimo elegido (ajuste de los parámetros: temperatura, fuerza iónica, concentración de moléculas desestabilizantes de hélice), que garantiza que sólo sondas con secuencias (correspondientes unas a otras) complementarias aproximadamente de forma perfecta permanezcan apareadas con la secuencia diana (Leitch, A. R., Schwarzacher, T., Jackson, D. y Leitch I. J., 1994, In situ-Hybridisierung, Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg, Berlín, Oxford).

Aplicaciones clásicas de la técnica de sondas, que posibilitan la identificación de organismos desconocidos o, dado el caso, la detección de determinados organismos en una mezcla de organismos, son, por ejemplo, estudios filogenéticos o la detección de gérmenes en el diagnóstico médico. En ambos ámbitos la detección de los organismos con frecuencia se basa en el análisis de los genes en cuanto a ARN ribosomal (ARNr, ADNr) que por su expansión ubiquitaria y la existencia de tramos de secuencia específicos de las especies son particularmente apropiados para este fin. Además de estas propiedades, el ADNr contiene tramos de secuencia flanqueadores que están muy conservados dentro del respectivo reino de organismos. Para la amplificación independiente de la especie del ADNr pueden usarse secuencias de cebador dirigidas contra estos tramos (G. Van Camp, S. Chapelle, R. De Wachter; Amplification and Sequencing of Variable Regions in Bacterial 23S Ribosomal RNA Genes with conserved Primer Sequences, Current Microbiology, 1993, 27: 147-151 y W. G. Weisburg, S. M. Barns, D. A. Pelletier, D. J. Lane; 16S ribosomal DNA Amplification for Phylogenetic studies. J. Bactertiol, 1991, 173: 697-703), por lo que se aumenta considerablemente la sensibilidad de procedimientos de detección conectados a continuación.

Dependiendo de la meta concreta, están a disposición varios procedimientos establecidos para la identificación de organismos con la ayuda de ADNr.

Para la identificación de organismos desconocidos, normalmente se amplifica todo el ADNr (generalmente 16S) con dos cebadores universales, mediante PCR, y a continuación se secuencia. De esta manera se formaron voluminosos bancos de datos de ADNr, que actualmente contienen secuencias de varios miles de organismos (por ejemplo, RDP/ Ribosomal Database Project (Proyecto de base de datos ribosómicos) II, Universidad del estado de Michigan, http://www.cme.msu.edu/RDP) y permiten la clasificación filogenética de secuencias nuevas. Este procedimiento en principio permite la detección de cualquier organismo, sin embargo, implica mucho tiempo y por ello no es apropiado para usos diagnósticos. Además, el procedimiento adolece de una serie de fuentes de error (F. Wintzingerrode, U. B. Göbel, E. Stackebrand; Determination of microbial diversity in environmental samples: pitfalls of PCR-based rRNA analysis. FEMS Microbiology Reviews, 1997, 21: 213-229), en el que especialmente procesos de recombinación y mutaciones puntuales durante la amplificación por PCR conducen a resultados falsos.

Para usos de diagnóstico fueron desarrolladas una serie de técnicas alternativas. Mattson y Johansson (J. G. Mattson, K. E. Johansson; Oligonucleotide probes complementary to 16S rRNA for rapid detection of mycoplasma contamination in cell cultures. FEMS Microbiiol Lett., 1993: 107 139-144) describen un procedimiento en el que se aisla ARN ribosomal de micoplasmas, se inmoviliza sobre filtros y se detecta por hibridación de tres oligonucleótidos específicos diferentes. Este procedimiento es relativamente rápido, sin embargo, la cantidad de organismos que se pueden identificar y la sensibilidad de la detección son limitadas.

McCabe y colaboradores (K. M. McCabe, Y. H. Zhang, B. L. Huang, E. A. Wagar, E. McCabe; Bacterial species identification after DNA amplification with a universal Primer pair. Mol. Genet. Metab. 1999; 66: 205-211) describen un procedimiento en el que se amplifica ADNr de bacterias clínicas aisladas lisadas en sitios de filtro, usando cebadores universales y, a continuación, se identifica por hibridación con sondas específicas. Este procedimiento es sensible; sin embargo, la cantidad de especies que se pueden identificar también está relativamente limitada de forma estrecha.

En un procedimiento usado por Oyarzabal y colaboradores (O. A. Oyarzabal, I. V. Wesley, K. M. Harmon, L. Schroeder-Tucker, J. M. Barbaree, L. H. Lauerman, S. Backert, D. E. Conner; Specific identification of Campylobacter fetus by PCR targeting variable regions of the 16S rDNA. Vet. Microbiol. 1997, 58: 61-71) en el que se amplifica ADNr 16S de una especie de Campylobacter mediante sondas específicas y se determina el tamaño del producto, sólo puede generarse una respuesta de sí/no para un germen específico individual.

El documento WO-A-9533846 describe un dispositivo que presenta un chip que porta ácidos nucleicos, en una cámara de reacción, en el que la pared de la cámara que enfrenta al chip es de un material ópticamente transparente.

La invención se basa en el objetivo de indicar un dispositivo para la multiplicación y la caracterización de ácidos nucleicos, que posibilite una multiplicación y caracterización casi simultáneas con un rendimiento alto de muestras y, de esta manera, evite las desventajas del estado de la técnica.

Se alcanza el objetivo mediante la parte caracterizadora de la reivindicación 1. Las reivindicaciones subordinadas comprenden configuraciones ventajosas.

La esencia de la invención consiste en que mediante el dispositivo la PCR y la hibridación paralela con ácido nucleico fijado al chip están reunidas en el espacio de una celda (cámara) controlable en cuanto a la temperatura y al caudal del flujo circulante. La cámara en su interior porta un chip, que entre el piso de la cámara y la superficie de detección del chip genera una ranura capilar que recibe el líquido de muestra, efectuándose la mezcla del líquido de muestra mediante un flujo electroosmótico inducido.

De forma ventajosa, la cámara alrededor de la ranura capilar y del chip forma un depósito de gas, a través del que un saliente del depósito de gas conduce hacia la ranura capilar, que separa una entrada de una salida, de manera que sobre la entrada se puedan inyectar las muestras, debido a las fuerzas capilares, desde la entrada llegan a la ranura capilar y desde ésta pueden descargarse a través de la salida. Con la ranura capilar llena, debido a efectos de tensión superficial se genera una ranura de aire en forma de anillo alrededor del chip colocado en la cámara y de la ranura capilar (que sirve como depósito de muestras), de manera que el chip y la ranura capilar sean aislados térmicamente del cuerpo de la cámara, lo que conduce a que las muestras en la ranura de la cámara puedan ser rápidamente calentadas y enfriadas, que junto con sensores de temperatura y electrodos está dispuesta sobre un portador de cámara que sostiene la cámara y está con ella en contacto conductor de calor a través del piso de la cámara. Debido a que la ranura capilar sirve como depósito de muestras, está fuertemente reducida la tasa de evaporación del líquido de muestra, aún a temperaturas cercanas al punto de ebullición, porque la muestra sólo puede evaporarse a través del borde de la ranura capilar.

La ranura capilar (el depósito de muestras) es el lugar de la amplificación de ácidos nucleicos en el líquido de muestra mediante PCR con cebadores específicos, así como de la caracterización genética de la muestra. Los productos de PCR marcados son pescados del líquido de muestra mediante sondas específicas inmovilizadas que están ligadas al chip de ácido nucleico. La cámara y el chip son ópticamente transparentes y debido a su realización posibilitan la detección en línea de la señal de marcado de los productos de PCR fijados a las sondas.

El dispositivo conforme a la invención frente a los procedimientos usados hasta ahora posee la ventaja de que es posible una tipificación genética máxima en un tiempo de diagnóstico mínimo con volúmenes mínimos de muestra, usando sondas específicas, de forma automatizable y con alto rendimiento de muestras, en una celda controlable en cuanto a temperatura y al caudal de flujo circulante, en la que mediante PCR frente a un fondo de secuencias se destacan estructuras genéticas relevantes para el diagnóstico, y mediante la hibridación casi simultánea, paralela, de los productos de PCR con el ácido nucleico ligado al chip se efectúa una detección específica.

El dispositivo conforme a la invención, por ejemplo, puede usarse para el reconocimiento simultáneo de diferentes agentes patógenos microbianos (por ejemplo, basado en el análisis de ARNr 16S o 23S), la selección según resistencias de microorganismos patógenos individuales o una tipificación genómica de estructuras alelas de células eucarióticas, relevantes para el diagnóstico, posibilitándose un reconocimiento paralelo mediante el chip mediante sus sondas diferentes, específicas para las distintas secuencias diana.

A continuación, la invención será explicada en más detalle mediante los dibujos esquemáticos y los ejemplos de aplicación. Las figuras muestran:

Figura 1: una representación en principio de una realización posible de un dispositivo conforme a la invención para la multiplicación y la caracterización de ácidos nucleicos

Figura 2: una sección transversal a lo largo del plano A-A conforme a la figura 1,

Figura 3: una vista de plano sobre el dispositivo conforme a la figura 1,

Figura 4: una representación esquemática de la vista del lado inferior del dispositivo conforme a la figura 1,

Figura 5: una sección transversal a lo largo del plano B-B conforme a la figura 4,

Figura 6: una representación esquemática de la vista de plano sobre el portador de cámara del dispositivo conforme a la figura 1,

Figura 7: una sección transversal a lo largo del plano C-C conforme a la figura 6,

Figura 8: una representación esquemática de una posible disposición en tetrapolo en el portador de
cámara del dispositivo conforme a la figura 1,

Figura 9: una sección transversal a lo largo del plano D-D conforme a la figura 8,

Figura 10a: una representación esquemática de una posible ubicación de un líquido de muestra dentro del dispositivo conforme a la figura 1,

Figura 10b: una sección transversal a lo largo del plano E-E conforme a la figura 10a,

Figura 11: una representación esquemática en bloque de una posible instalación del dispositivo conforme a la figura 1 en un sistema analítico,

Figura 12a: una indicación de las medidas de un dispositivo conforme a la figura 1 en milímetros,

Figura 12b: una indicación de las medidas de un dispositivo conforme a la figura 2 en milímetros,

Figura 12c: una indicación de las medidas de un dispositivo conforme a la figura 3 en milímetros,

Figura 13: una representación esquemática del recorrido de rayos ópticos a través del dispositivo conforme a la figura 1,

Figura 14: una representación esquemática de una realización de un chip del dispositivo conforme a la figura 1 y

Figura 15: una representación esquemática de productos secundarios y terciarios de amplificación del chip conforme a la figura 14.

El dispositivo 20, que se muestra en la figura 1, para la multiplicación y la caracterización de ácidos nucleicos, está compuesto por un cuerpo de cámara 1 y un portador de cámara 5. El cuerpo de cámara 1 está provisto de una superficie de soporte 4, a través de la cual está en conexión con el portador de cámara 5 en forma de junta, de manera que se forma una cámara de muestra 3. Esta cámara de muestra 3 está compuesta por un depósito de gas 6, así como por una ranura capilar 7 y está provista al menos de una entrada 81 y al menos de una salida 82. La entrada 81 y la salida 82 conducen a la cámara de muestra 3 y están distanciadas mediante un saliente 9 del depósito de gas 6, introducido en el medio. El cuerpo de cámara 1 que está en conexión no disoluble en forma de junta con un portador de cámara 5, por ejemplo, mediante adhesión o soldadura, porta un chip 2, por ejemplo, un chip de ácido nucleico. Este chip 2, que porta áreas de detección 12 en forma de manchas 13, está sujeto de tal manera en el cuerpo de la cámara 1 que las áreas de detección 12 en forma de manchas 13 están ubicadas enfrentando la superficie del portador de cámara 5 y están uniformemente distanciadas del portador de cámara 5 mediante el borde 42 del cuerpo de cámara 1, de manera que el chip 2 y el portador de cámara 5, como se muestra en la figura 2, generan la ranura capilar 7, que sirve como depósito de muestra. Esta ranura capilar 7 recibe el líquido de muestra 19. El cuerpo de cámara 1, por ejemplo, está compuesto por plástico o vidrio ópticamente transparente, pudiéndose introducir mediante fresado la cámara de muestras 3, que representa un espacio para el llenado del líquido de muestra 19, en el cuerpo de la cámara 1, y la entrada 81, así como la salida 82, que representan conductos para el líquido de muestra, mediante perforación.

De manera conocida, el chip de ácido nucleico 2 está compuesto por un portador ópticamente transparente cuyo material, por ejemplo, puede ser silicio o vidrio, y por moléculas de ácido nucleico de secuencia específica (por ejemplo, sondas), inmovilizadas sobre este portador.

La cámara de muestra 3 comprende el depósito de gas 6 y la ranura capilar 7, formándose gas y burbujas de aire en el depósito de gas 6 al introducir el líquido de muestra 19, debido a efectos de tensión superficial, de manera que el chip 2 y la ranura capilar 7 son aislados térmicamente del cuerpo de cámara 1. La ranura capilar 7 que forma el depósito de muestra (por ejemplo, con un volumen de 1,8 \mul), garantiza que el área de detección 12 sea totalmente mojada por el líquido de muestra 19.

La entrada 81 y la salida 82 sirven para conducir el líquido de muestra 19 por lo que se posibilita un llenado y vaciado de la cámara de muestra 3 y con ello, como consecuencia de las fuerzas capilares, también un llenado y vaciado de la ranura capilar 7.

La entrada 81 y la salida 82 que como, por ejemplo, se muestra en la figura 1, pueden correr de forma paralela, están separadas en el espacio mediante el saliente 9 del depósito de gas, de manera que se impide que el líquido de muestra 19 fluya de la entrada 81 a la salida 82, sin llegar a la ranura capilar 7.

El portador de cámara 5, que es ópticamente transparente y es buen conductor del calor, está compuesto, por ejemplo, por vidrio y está provisto, como se muestra en las figuras 4, 6 y 8, de medios para aumentar la temperatura 17, por ejemplo, en forma de calefactores miniaturizados y de sensores de temperatura miniaturizados 16, así como de electrodos de un tetrapolo 18, de manera que se posibilita el templado del líquido de muestra 19, así como un mezclado del líquido de muestra 19, mediante un flujo electroosmótico inducido. En otra realización, no representada individualmente, del dispositivo 20, el cuerpo de cámara 1 puede estar provisto de medios para aumentar la temperatura 17 y de los sensores de temperatura miniaturizados 16, así como de los electrodos del tetrapolo 18.

Los sensores de temperatura 16 pueden, por ejemplo, estar configurados como sensores de temperatura de resistencia de película gruesa de níquel-cromo. La longitud de los sensores de temperatura 16, por ejemplo, en el caso de que el portador de cámara 1 presente una superficie de 8 x 8 mm y el chip 2 posea una superficie de 3 x 3 mm o menos, asciende a 10,4 mm y la anchura de los sensores de temperatura 16 en este ejemplo asciende a 50 \mum, de manera que la resistencia a 20ºC asciende 4 kiloohmios y el coeficiente de temperatura TK_{R} a 0º asciende a 1500 ppm. Alternativamente, los sensores de temperatura 16 también pueden estar configurados como capas delgadas ópticamente transparentes.

Los medios para aumentar la temperatura 17, por ejemplo, pueden estar realizados en forma de calefactores de resistencia de película gruesa de níquel-cromo. Con las dimensiones del ejemplo anterior, los medios para aumentar la temperatura 17 tienen una longitud de 2,6 mm y una anchura de ocho vías individuales de 50 \mum de anchura cada una, de manera que la resistencia a 20ºC asciende a 300 ohmios. Alternativamente, los medios para aumentar la temperatura 17 también pueden estar configurados como capas delgadas ópticamente transparentes.

El tetrapolo 18 puede estar configurado, por ejemplo, como electrodos de oro-titanio. Con las dimensiones del ejemplo anterior, estos electrodos tienen una longitud de 2,2 mm y una anchura de 0,5 mm. El tetrapolo sirve para la inducción de un flujo electroosmótico, lo que conduce a la mezcla del líquido de muestra 19 en la cámara de muestra 1. Alternativamente, el tetrapolo 18 también puede estar realizado como capa delgada ópticamente transparente.

La figura 2 muestra el cuerpo de cámara 1 que está en unión rígida indisoluble con el portador de cámara 5, a través de la superficie de soporte 4. Esta unión puede estar realizada, por ejemplo, mediante adhesión. Alternativamente, también existe la posibilidad de que el portador de cámara 5 y el cuerpo de cámara 1 estén unidos por fusionamiento o estén confeccionados en una sola pieza. Entre el portador de cámara 5 y el chip 2, sujeto por el cuerpo de cámara 1, a través de su borde 42, se encuentra la ranura capilar 7 (que sirve como depósito de muestra), que por su efecto capilar es capaz de aceptar líquido de muestra de la cámara de muestra 3.

A través del cuerpo de cámara 1 la entrada 81 y la salida 82 conducen hacia el depósito de gas 6 de la cámara de muestra 3, de manera que el líquido de muestra 19 puede introducirse en la ranura capilar 7 a través de la entrada 81, a través del depósito de gas 6 y puede descargarse a través de la salida 82. El chip 2, como el portador de cámara 1, está compuesto por material ópticamente transparente como, por ejemplo, vidrio, de manera que son posibles evaluaciones ópticas y fotométricas como, por ejemplo, mediciones de fluorescencia del área de detección 12, a través de una abertura cónica en el cuerpo de cámara 1 en una escotadura continua 11 que forma un cono de visibilidad.

La figura 3 muestra la entrada 81 y la salida 82, así como la escotadura 11, a través de la cual se puede acceder ópticamente al área de detección 12 con manchas 13 del chip 2. Este acceso óptico posibilita las evaluaciones ópticas y fotométricas antes mencionadas, de las señales que parten del área de detección 12, en el ejemplo, las señales de fluorescencia no representadas.

En la figura 4 se muestran los medios para aumentar la temperatura 17 que se encuentran en el lado inferior del portador de cámara transparente 5, incluyendo vías conductoras 1517 y superficies de conexión 1417. Los medios para aumentar la temperatura 17 en el ejemplo están compuestos por ocho conductos calefactores de resistencia microestructurados 171, conectados individualmente de forma paralela, mediante los cuales se pueden calentar homogéneamente el portador de cámara 5, que se encuentra debajo del cuerpo de cámara 1, y con él el líquido de muestra 19, introducido en la ranura capilar 7. Los conductos de resistencia 171 de los medios para aumentar la temperatura 17, que pueden aumentar la temperatura de forma diversa, indicable de forma definida, poseen tales dimensiones que esté garantizada la accesibilidad óptica antes mencionada a las áreas de detección 12 del chip 2.

La figura 5 muestra la ubicación de los medios para aumentar la temperatura 17 en el lado opuesto al cuerpo de cámara 1 del portador de cámara 5, que porta el cuerpo de cámara 1 con el chip 2 sujeto.

En la figura 6 está representado un sensor de temperatura 16, incluyendo vías conductoras 1516 y superficies de conexión 1416, colocado en el lado superior del portador de cámara transparente 5. El sensor de temperatura 16 está colocado alrededor del área de detección 12 del chip 2, de manera que esté garantizada la accesibilidad óptica mencionada del área de detección 12. El sensor de temperatura 16 está aislado eléctricamente de los elementos contiguos del dispositivo 20 y frente al líquido de muestra 19, mediante una capa inactivante no representada en la figura.

La figura 7 muestra la ubicación del sensor de temperatura 16 en la superficie del portador de cámara 5, que enfrenta al cuerpo de cámara 1, que al mismo tiempo es el lado de superficie del portador de cámara 5, con el que el chip 2 sujeto por el cuerpo de cámara 1 genera la ranura capilar 7.

La figura 8 muestra un tetrapolo 18 aplicado sobre la capa inactivante del sensor de temperatura 16, no representada aquí en detalle, incluyendo vías conductoras 1518 y superficies de conexión 1418. El tetrapolo 18 está en contacto conductor de electricidad con el líquido de muestra 19, de manera que por la aplicación alternante de una tensión de + 1 V en dos electrodos 181 del tetrapolo 18 se pueda generar un torbellino inducido por el flujo electroosmótico, en la ranura capilar 7, llenada con el líquido de muestra 19. Si se somete otro par de electrodos 181 del tetrapolo 181 a tensión, se modifican las condiciones del torbellino. Por constante alternación de los pares de electrodos 181 que son sometidos a tensión, se efectúa una mezcla eficaz del líquido de muestra 19. Por la tensión baja aplicada de sólo un voltio se impide que el líquido de muestra 19 en la ranura capilar 7 sucumba a alteraciones electroquímicas y, por ejemplo, se formen burbujas de gas. Aquí el tetrapolo 18, como está representado en esta figura, está configurado de tal manera que se garantice la accesibilidad óptica del área de detección 12. Alternativamente, el tetrapolo 18 también puede estar realizado como capa fina ópticamente transparente.

La figura 9 muestra la ubicación del tetrapolo 18 en el lado superficial del portador de cámara 5, que enfrenta al cuerpo de cámara 1. Las figuras 10a y 10b muestran de forma esquemática el líquido de muestra 19 depositado en la ranura capilar 7 debido a las fuerzas capilares entre el cuerpo de cámara 1 y el portador de cámara 5.

Debido al tamaño del depósito de gas 6, pueden desviarse eventuales burbujas de aire, no representadas individualmente, desde la ranura capilar 7 al depósito de gas 6 de la cámara de muestra 3, impulsadas por la minimización de la energía superficial. De esta manera, alrededor del líquido de muestra 19 se forma un anillo de aire que aisla térmicamente a éste y al chip 2 del cuerpo de cámara 1, de manera que el líquido de muestra 19 en la ranura capilar 7 pueda ser calentado y enfriado rápidamente con poco gasto de energía. Al mismo tiempo, por esto se reduce fuertemente la tasa de evaporación del líquido de muestra 19, aún a temperaturas cercanas al punto de ebullición, porque el líquido de muestra 19 sólo puede evaporarse en el borde de la ranura capilar 7. Se suma que la necesidad de líquido de muestra 19 es baja (en el ámbito de los \mul) en el depósito de muestra 7, porque la ranura capilar 7 sólo forma un espacio de volumen bajo, por lo que los volúmenes de muestra necesarios son muy bajos.

Debido al aislamiento térmico bueno descrito del chip 2 y del líquido de muestra 19, frente al cuerpo de cámara 1, así como del bajo volumen del líquido de muestra 19, pueden alcanzarse las tasas de calentamiento y de enfriamiento usuales para micro-termocicladores, de Posner y otras descritas (S. Poser, T. Schulz, U. Dillner, V. Baier, J. M. Köhler, D. Schimkat, G. Mayer, A. Siebert; Chip elementes for fast thermocycling, Sensors and Actuators A, 1997, 62: 672-675). Al mismo tiempo, debido a la alta relación de superficie de calefacción respecto al volumen de muestras, está garantizada en alto grado la homogeneidad de temperaturas del líquido de muestra 19 y de la introducción de calor en el líquido de muestra 19, que está ubicado en la ranura capilar 7, entre el chip 2 y el portador de cámara 5 templable.

La figura 11 muestra la instalación del dispositivo 20 para la multiplicación y la caracterización de ácidos nucleicos en un sistema de análisis 200. El sistema de análisis 200 está compuesto por un regulador de la temperatura 21, un control de mezclado 22, líneas eléctricas 23, 24, 33, 34, una entrada general 25, un recipiente de residuos 26, un acondicionador 27, válvulas/bombas 28, recipientes de reservas 29, mangas de comunicación 30, un control de acondicionadores 31, un control de dispositivos automáticos 32, un ordenador de conducción 35, una vía de transferencia de información de ordenadores 36 y un dispositivo automático para pipetear 37. El dispositivo 20 está en comunicación directa con el acondicionador 27 y el recipiente de residuos 26 a través de la entrada 81 y de la salida 82, así como con el regulador de temperatura 21 y el control de mezclado 22 a través de las líneas eléctricas 23 y 24, estando acoplado el regulador de temperatura con los sensores de temperatura 16 y con los medios para aumentar la temperatura 17, y el control de mezclado está acoplado con el tetrapolo 18.

En el dispositivo 20 para la multiplicación y la caracterización de ácidos nucleicos, instalado en el sistema de análisis 200 se puede pipetear el líquido de muestras 19 mediante el dispositivo automático para pipetear 37 desde microplacas, no representadas individualmente, hacia la entrada general 25. Mediante las válvulas y las bombas, que están en comunicación con la entrada general por conducción de líquido, puede conducirse el líquido de muestra 19 a través de mangas de comunicación 30 hacia el acondicionador 27, sirviendo el acondicionador 27 para el tratamiento del líquido de muestra 19 (por ejemplo, ajuste del valor de pH y separación por filtración de sustancias que estorban). Los líquidos reguladores de pH y las soluciones de reacción para este tratamiento pueden suministrarse desde los recipientes de reserva 29 que están en comunicación con el acondicionador 29 por conducción de líquido. El dispositivo pipeteador automático 37 y el acondicionador 29 están conectados con el control de acondicionadores 31 y el control de dispositivos automáticos 32 mediante las líneas eléctricas 33 y sirven para el control y la regulación de éstos. La entrada 81 y la salida 82 del cuerpo de cámara 1, que conducen hacia el depósito de gas 6, sirven para conducir el líquido desde el acondicionador 29, pasando por la ranura capilar 7, hasta los residuos 26.

En el dispositivo 20 puede templarse y mezclarse el líquido de muestra 19 en el ámbito de la ranura capilar 7, mediante el regulador de temperatura 21 y el control de mezclado 22. La ranura capilar 7 por ello es el lugar del refuerzo y de la caracterización de un ácido nucleico, en el ejemplo del ADN diana.

Las figuras 12a hasta c en el ejemplo de una realización del dispositivo 20 muestran que el cuerpo de cámara 1 presenta una longitud y una anchura de 8 mm, así como una altura de 3 mm, el depósito de gas posee una longitud y una anchura de 5,4 mm, así como una altura de 0,5 a 0,8 mm, el portador de cámara 5 posee un grosor de 0,9 mm, la escotadura 11 en su lado que enfrenta el chip 2 posee un diámetro de 2,8 mm y la entrada 81 y la salida 82 poseen un diámetro de 0,5 mm, presentando la entrada 81 y la salida 82, así como la escotadura 11 una inclinación de 70 respecto al portador de cámara 5.

En la figura 13 se muestra el camino óptico a través de otra realización del dispositivo 20, en la que la superficie de soporte 4 está unida de forma reversible y hermética al portador de cámara 5 a través de una superficie de junta adicional 43 para la figura fluorescente de campo oscuro del área de detección 12 del chip 2. La luz estimulante es conducida, como está representado, mediante el espejo de campo oscuro 38 al área de detección 12 a lo largo de la marcha de los rayos de la luz estimulante 39. La luz fluorescente que parte del área de detección 12 es conducida a lo largo de la marcha de los rayos de luz de detección 40 sobre un objetivo de microscopio 41. En el ejemplo la distancia entre el espejo de campo oscuro 38 y el área de detección 12 asciende a aproximadamente 4,6 mm y la distancia entre el área de detección 12 y el objetivo del microscopio 41 asciende a aproximadamente 22,0 mm.

La lectura óptica de la señal de interacción entre el ADN diana 50, mostrado en la figura 14, y el ADN de las sondas 56, 57, 58, 59 sobre la superficie del chip 2 puede efectuarse en línea debido a la construcción del dispositivo 20.

El chip 2 está sujeto de tal manera en el cuerpo de cámara 1 que puede ser atravesado en un amplio ángulo sólido por rayos de luz, de manera que se pueda observar en línea o in situ la hibridación mediante las sondas marcadas 56, 57, 58, 59, por ejemplo, mediciones de fluorescencia. La disposición y el tamaño del sensor de temperatura 16 y del tetrapolo 19 están realizados de tal manera que la marcha de los rayos para la detección en línea o la detección in situ subsiguiente, no sea perturbada y la detección de las interacciones en las manchas 13 pueda ser evaluable mediante todas las formas de detección óptica o espectroscopia (por ejemplo, fotometría, fotometría diferencial, medición confocal de fluorescencia, medición de fluorescencia en campo oscuro, medición de fluorescencia a trasluz, medición de fluorescencia con luz incidente, etc.), teniendo que estar adaptados el uno al otro el marcado 60 y el procedimiento de medición.

La figura 14 muestra la representación esquemática del chip 2, que porta los cebadores 54 (A) y 53 (B'), correspondiendo éstos al ámbito específico de secuencia del ADN diana 50, es decir, a las secuencias A,X,S1,X,B y B',X,S1',X,A'. Las secuencias A y B o A' y B', definen el ámbito idéntico para todas las especies del ADN diana 50 o el AB-ADN diana 51 y el A'B'-ADN diana 52 monocatenarios. En el chip 2, en el ejemplo están inmovilizadas las sondas 56, 57, 58 y 59 mediante espaciadores 55, portando secuencias que son específicas para el ADN diana 50 de un determinado origen, es decir, en el ejemplo representado sólo se hibridan las sondas 56 y 57 con las secuencias S1 y S1' con los productos amplificados del ADN diana 50 (se muestra en la figura 15). En cambio, en las sondas 58 y 59 con las secuencias S2 y S2' no ocurre ninguna hibridación.

Los cebadores 53 y 54, por ejemplo, portan una marca de fluorescencia 60 que puede introducirse en los productos secundarios de amplificación 61 y 62 mediante el proceso de amplificación, por lo que puede detectarse la hibridación en las sondas 56 y 57 durante la amplificación mediante la medición de la fluorescencia, de manera que se posibilita la decisión de si el ADN diana 50 entre los ámbitos de secuencias A y B o A' y B' presenta la secuencia S1 o S1' y/o la secuencia S2 o S2'.

Como las secuencias de sondas, por ejemplo, pueden ser específicas para un determinado material, con este procedimiento puede comprobarse la presencia de un determinado material en una muestra.

La figura 15 muestra la representación esquemática de los productos secundarios y terciarios de amplificación 61, 62 y 63, que pueden producirse mediante el dispositivo 20. La cantidad de producto de amplificación secundario 61 y 62, a partir del segundo ciclo de reacción dentro de la ranura capilar 7 se duplica aproximadamente en cada ciclo, de manera que la concentración de producto secundario de amplificación después de algunos ciclos alcanza para hibridarse con las sondas 56, 57, que están inmovilizadas en las manchas 13, con lo que se produce una prolongación de las sondas 56, 57, de forma complementaria con el producto secundario de amplificación 61, 62. Este producto de amplificación terciario 63 de las sondas 56, 57 y productos secundarios de amplificación 61, 62, por ejemplo, puede detectarse mediante una marcación 60, que está acoplada a los cebadores usados 53, 54, mediante detección de fluorescencia.

En un primer ejemplo de aplicación se describirá la detección específica de especies individuales de microorganismos:

El chip 2 del dispositivo 20 en este ejemplo es un chip de ADN y durante o después de la amplificación de ADN sirve para la detección de los productos de amplificación y, dado el caso, también para proporcionar cebadores de ADN acoplados en fase sólida (figuras 14 y 15). Por ejemplo, desde una gran cantidad de dianas posibles se copia tantas veces una secuencia S1 que es específica para una especie (por ejemplo, Escherichia coli), mediante el proceso térmico de amplificación (por ejemplo, PCR), que se posibilite el reconocimiento seguro de esta secuencia mediante hibridación con las sondas 56, 57, 58 y 59 y medición de fluorescencia en el área de detección 12. Si se conocen varias secuencias que respectivamente son específicas para, por ejemplo, una especie, una cepa o una enfermedad y que en todos los casos se encuentran entre dos ámbitos idénticos conservados, mediante la inmovilización de las sondas correspondientes en el chip 2 pueden detectarse todas las especies, cepas o enfermedades, de forma paralela con sólo una reacción de amplificación térmica en el dispositivo 20. Usando varios pares de cebadores 53, 54 puede ampliarse el ámbito de aplicación. La detección de fluorescencia de los productos terciarios de amplificación 63, en el caso más sencillo se efectúa por marcado con fluorescencia 60 del cebador 53, 54. Por ella no quedan excluidos otros tipos de marcado como, por ejemplo, intercaladores, radioisótopos, sistemas FRET, nucleótidos marcados con fluorescencia, etc.

El proceso molecular biológico que se desarrolla en el dispositivo 20 será descrito a continuación con ayuda de las figuras 14 y 15.

Se coloca el ADN diana 50, que procede de una muestra biológica, junto con cebadores 53, 54, que pueden estar marcados 60, en el depósito de muestra (la ranura capilar) 7. Las manchas 13 del chip 2 en el área de detección a través de espaciadores 55 portan ADN de sondas con secuencias S1, S1', S2, S2', etc., que se caracterizan porque pueden ser complementarias a las que existen en el ADN diana 50. En el ejemplo representado en la figura 14 el ADN diana 50 contiene secuencias que son complementarias a las sondas 56 y 57. Cada secuencia S1, S1' y S2, S2', etc. de las sondas (56, 57, 58, 59) fue seleccionada de tal manera que sea específica para una incógnita especial que se ha de averiguar. Si se trata, por ejemplo, de detectar determinados agentes patógenos mediante el dispositivo 20, S1 y S1' pueden ser específicos para el agente Bacillus cereus, S2 y S2' para el agente Campylobacter jejuni, etc. Si sólo se encuentra el agente Bacillus cereus en una muestra de materia fecal, después del tratamiento correspondiente de la muestra se encontrará un ADN diana 50 en el líquido de muestra que sólo contiene las secuencias S1 y S1'. Para lograr la hibridación detectable en el área de detección, en general debe aumentarse significativamente la cantidad de copias del ADN diana 50. Por ello se efectúa un procedimiento de amplificación específico de ADN con supresión de ruido en el depósito de muestra (ranura capilar) 7. A este fin, se seleccionan dos cebadores 53, 54, con secuencias A y B' que son iguales para todos los agentes, que enmarcan todas las secuencias posibles de sondas específicas de agentes (S1, S2, S3...) (así como en la figura 14 las secuencias S1 o S1' son enmarcadas por las secuencias A y B'). Entonces, como en la PCR, se desnaturaliza el ADN diana 50 a aproximadamente 90ºC, los cebadores 53, 54 se fusionan aproximadamente a 65ºC con B o A' y a aproximadamente 70ºC se efectúa una reacción de extensión de cebadores que convierte el ADN diana 51, 52 en bicatenario. El producto obtenido entonces es el producto primario de amplificación con la secuencia A,X,S1,X,B,Y o B',X,S1',X,A',Y. Se repite el ciclo de desnaturalización, fusionamiento y extensión, con lo que se obtiene el producto secundario de amplificación 61, 62 (véase la figura 15). Por nueva repetición múltiple del ciclo de amplificación se duplica aproximadamente la cantidad de productos secundarios de amplificación 61, 62. De este modo aumenta de tal manera la concentración de ADN que contiene las secuencias S1 y S1' que se posibilita una detección segura de la hibridación con las sondas 56, 57. El ADN que todavía se encuentra en el líquido de muestra y que se enlaza a las manchas de forma no específica, no es involucrado en el proceso de amplificación, por lo que aumenta fuertemente la selectividad del procedimiento en total. De esta manera se detecta Bacillus cereus de forma altamente específica y altamente sensible. En lugar del protocolo de PCR también pueden usarse otros procedimientos de amplificación. Por la instalación del dispositivo 20 para la multiplicación y la caracterización de ácidos nucleicos en el sistema de análisis 200 (figura 11) existe la posibilidad de llevar a cabo de forma automática y continua los procesos de tratamiento de las muestras.

En un segundo ejemplo de aplicación se describirá una detección paralela de agentes bacterianos en muestras de materia fecal:

El chip 2 del dispositivo 20 en este ejemplo es un chip de ADN y sirve para la detección paralela de varios agentes bacterianos en muestras de materia fecal humanas o animales.

De cada muestra de materia fecal se aisla el ADN total mediante técnicas estándar (por ejemplo, con la ayuda de equipos previstos para ello de la empresa Qiagen). Se incorpora el ADN en un volumen apropiado para el uso en el dispositivo 20, de un sistema tampón estandarizado, dado el caso, disponible en el comercio, en el que puede llevarse a cabo una amplificación por PCR. Éste, además del componente tampón, al menos contiene una polimerasa termoestable, una mezcla, dado el caso, isomolar de los cuatro trifosfatos de desoxinucleótidos naturales, una sal bivalente, dado el caso, componentes para aumentar la efectividad de la PCR, así como elementos de construcción para marcar los productos de PCR (por ejemplo, trifosfatos de desoxinucleótidos marcados con fluorescencia, biotina o de manera similar).

Para detectar organismos puede usarse un chip 2, en cuya superficie están inmovilizadas sondas de oligonucleótidos 56, 57, 58, 59, que son complementarias a uno o varios ámbitos variables de los genes 16SrARN y/o de los genes 23SrARN y/o de los ámbitos intergénicos entre genes 16S y 23S ARNr de diversos organismos que se han de detectar. Las sondas 56, 57, 58, 59, por ejemplo, están dirigidas contra una o varias secuencias correspondientes de Aeromonas spec. y/o Bacillus cereus y/o Campylobacter jejuni y/o Clostridium difficile y/o Clostridium perfringens y/o Plesiomonas shigelloides y/o Salmonella spec. y/o Shigella spec. y/o Staphylococcus aureus y/o Tropheryma whippelii y/o Vibrio cholerae y/o Vibrio parahaemolyticus y/o Yersinia enterocolitica.

Se disponen las sondas de oligonucleótido 56, 57, 58, 59 en manchas 13, de manera que cada una de las manchas 13 contenga un gran número de sondas de oligonucleótido (por ejemplo la sonda 56) de igual secuencia. La inmovilización de las sondas 56, 57, 58, 59 es efectúa en su extremo 3' o en su extremo 5' o, dado el caso, en una posición interna, en la que, dado el caso, el extremo 3' de las sondas 56, 57, 58, 59, por ejemplo, es bloqueado por aminación, de manera que no pueda servir como sustrato para las ADN-polimerasas.

La selección de las sondas 56, 57, 58, 59 se efectúa de tal manera que, por un lado, cada una de las sondas presente una alta especificidad de secuencia para el organismo que se ha de detectar y, por el otro lado, en los genomas de los gérmenes a corta distancia del sitio de enlace de las sondas específicas existan señales que posean igual secuencia para todos o para grupos de los organismos que se han de detectar.

Contra estas señales se dirigen cebadores universales 53, 54, que son apropiados para amplificar mediante PCR un tramo de secuencia que contenga el sitio de enlace de las sondas inmovilizadas en el chip 2, en todos los organismos que se han de detectar. Estos cebadores 53, 54 se adicionan al ADN aislado de la muestra de materia fecal, incorporado a la solución de amplificación (líquido de muestra 19). Dado el caso, el cebador 53, 54, que durante la amplificación subsiguiente por PCR especifica la síntesis del cordón que contiene la secuencia complementaria a la muestra inmovilizada en el chip 2, puede ser adicionado como componente marcado.

La mezcla de amplificación es introducida en el dispositivo 20, provisto de un chip 2 descrito. Se somete la solución en el dispositivo 20 a un régimen cíclico de temperaturas, de manera que el ADN diana 50 es amplificado mediante un típico mecanismo de PCR y, dado el caso, es marcado simultáneamente. Después de suficiente amplificación, se efectúa un paso de hibridación en el que se hibridan las secuencias diana amplificadas con los cebadores universales 53, 54, con las sondas específicas 56, 57, 58, 59, inmovilizadas en el chip 2.

Después de finalizada la reacción, sigue un paso de enjuague en el que se eliminan moléculas de ADN no enlazadas con el chip y enlazadas de manera no específica.

A continuación, se efectúa la detección del marcado remanente en el chip 2. Se identifican organismos presentes en la muestra de materia fecal mediante el marcado de las manchas 13 específicas para ellos sobre el chip 2.

Para obtener líquidos de muestra 19, por ejemplo, a partir de muestras de materia fecal o tejidos, son necesarios un gran número de pasos de tratamiento. Se deben desintegrar células, desprender proteínas, lípidos y sustancias sólidas y se debe tratar y purificar el ADN. Las enzimas, los cebadores y otras sustancias, necesarios para el uso del dispositivo, también deben ser suministrados al líquido de muestra 19. Estos pasos pueden llevarse a cabo de forma automática y continua por la instalación del dispositivo 20 para la multiplicación y la caracterización de ácidos nucleicos en el sistema de análisis 200, que, entre otras cosas, está compuesto por bombas y válvulas 28 que mueven y dirigen los líquidos, por filtros y cámaras de reacción (acondicionadores 27), en los que se llevan a cabo uno tras otro los distintos pasos de procedimiento, y por recipientes de reserva 29 que proveen las sustancias químicas necesarias para éstos (se muestran en la figura 11). Las muestras son introducidas en la entrada general 25 mediante los robots pipeteadores 37, desde un sistema estándar de suministro no representado individualmente, para el acondicionamiento. Las muestras tratadas mediante el sistema de análisis 200 llegan a través de la entrada 81 al dispositivo 20, de manera que se pueda efectuar de forma automatizada una multiplicación y caracterización de ácidos nucleicos de las muestras. Todo el proceso es vigilado por un ordenador de control 35 que está conectado con reguladores y aparatos de control electrónicos 21, 22, 31, 32, a través de una vía de transferencia de información de ordenadores 36.

Todas las características representadas en la descripción, en las siguientes reivindicaciones y en el dibujo pueden ser esenciales de la invención tanto de forma individual como en cualquier combinación unas con otras.

Lista de referencias

1	- Cuerpo de cámara
2	- Chip
3	- Cámara de muestra
4	- Superficie de soporte
5	- Portador de cámara

6	- Depósito de gas
7	- Ranura capilar
81	- Entrada
82	- Salida
9	- Saliente del depósito de gas
11	- Escotadura
12	- Área de detección
13	- Mancha
14	- Áreas de conexión
15	- Vía de conducción
16	- Sensor de temperatura
17	- Medio para aumentar la temperatura
171	- Líneas de resistencia
18	- Tetrapolo
181	- Electrodos
19	- Líquido de muestra
20	- Dispositivo
21	- Regulador de temperatura
22	- Control de mezclado
23	- Líneas eléctricas para la regulación de la temperatura
24	- Líneas eléctricas para la regulación del tetrapolo
25	- Entrada general
26	- Residuos
27	- Acondicionador
28	- Bombas/válvulas
29	- Recipiente de reservas
30	- Mangas de comunicación
31	- Control del acondicionador
32	- Control de dispositivos automáticos
33	- Líneas eléctricas para el control del acondicionador
34	- Líneas eléctricas para el control de dispositivos automáticos
35	- Ordenador de control
36	- Vía de transferencia de información de ordenadores
37	- Dispositivo automático pipeteador (robot pipeteador)
38	- Espejo de campo oscuro
39	- Marcha de rayos de luz estimulante
40	- Marcha de rayos de luz detectora
41	- Objetivo del microscopio
42	- Borde
43	- Superficie de junta
50	- ADN diana
51	- AB-ADN diana
52	- A'B'-ADN diana
53	- B' de cebador
54	- A de cebador
55	- Espaciador
56	- Sonda S1
57	- Sonda S1'
58	- Sonda S2
59	- Sonda S2'
60	- Marcado
61	- Producto secundario de amplificación
62	- Producto secundario de amplificación
63	- Producto terciario de amplificación
200	- Sistema de análisis

1416	- Superficies de conexión del sensor de temperatura
1417	- Superficies de conexión del calefactor
1418	- Superficies de conexión del tetrapolo
1516	- Vía conductora del sensor de temperatura
1517	- Vía conductora del calefactor
1518	- Vía conductora del tetrapolo
A-A	- Plano de sección
B-B	- Plano de sección
C-C	- Plano de sección
D-D	- Plano de sección
E-E	- Plano de sección

Claims (19)

1. Dispositivo para la multiplicación y la caracterización de ácidos nucleicos en un recinto de reacción, caracterizado porque un cuerpo de cámara (1) ópticamente transparente, que contiene un chip (2) ópticamente transparente con ácidos nucleicos ligados a él y un área de detección (12), está dispuesto en forma de junta sobre un portador de cámara (5) ópticamente transparente, da tal manera que se forma una cámara de muestras (3) con una ranura capilar (7) entre el portador de cámara (5) y el área de detección (12) del chip (2), que es controlable en cuanto a la temperatura y al caudal de flujo circulante.

2. Dispositivo según la reivindicación 1, caracterizado porque los medios para regular la temperatura están conectados con el portador de cámara (5) y permiten un calentamiento y/o un enfriamiento rápido de la cámara de muestra (3) con la ranura capilar (7).

3. Dispositivo según la reivindicación 2, caracterizado porque los medios para regular la temperatura se encuentran en el lado del portador de cámara (5) que enfrenta al cuerpo de cámara (1).

4. Dispositivo según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque los medios para regular la temperatura (16, 17) están realizados en forma de capas delgadas ópticamente transparentes y/o están estructurados de manera tan fina que no se influya sobre la transparencia óptica del chip (2), al menos en el ámbito de los ácidos nucleicos ligados sobre el área de detección (12) en manchas, no sea influenciada.

5. Dispositivo según la reivindicación 4, caracterizado porque los medios para regular la temperatura comprenden elementos de calefacción microestructurados (17), preferentemente, calefactores de resistencia de película gruesa de níquel-cromo y/o sensores de temperatura microestructurados (16), preferentemente, sensores de resistencia de película gruesa de níquel-cromo.

6. Dispositivo según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el portador de cámara (5) comprende sistemas para mezclar del líquido de muestra, que están realizados en forma de capas delgadas ópticamente transparentes y/o están estructurados de forma tan fina que no se influya sobre la transparencia óptica del chip (2), al menos en el ámbito de los ácidos nucleicos ligados al área de detección (12) en manchas, tratándose preferentemente de un sistema de tetrapolo para la inducción de un flujo electroosmótico.

7. Dispositivo según la reivindicación 6, caracterizado porque el sistema de tetrapolo está realizado como electrodos de oro-titanio.

8. Dispositivo según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el portador de cámara (5) y el cuerpo de cámara (1) preferentemente están compuestos por vidrio o por un plástico ópticamente transparente, muy preferentemente, por policarbonato y/o por etilacrilato de polimetano.

9. Dispositivo según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el portador de cámara (5) está compuesto por un material conductor del calor.

10. Dispositivo según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el chip está compuesto por vidrio y/o por silicio.

11. Dispositivo según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el cuerpo de cámara (1), al menos en el ámbito del chip (2) presenta una escotadura cónica ópticamente transparente.

12. Dispositivo según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el cuerpo de cámara dispone de una entrada (81) y una salida (82), separadas en el espacio, para cargar la cámara de muestra (3) y la ranura capilar (7).

13. Dispositivo según la reivindicación 12, caracterizado porque la entrada (81) y la salida (82) están dispuestas de forma unilateral respecto al chip (2) y están separadas por un saliente (9) del depósito de gas.

14. Dispositivo según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el cuerpo de cámara (1) está unido con el portador de cámara (5) en forma de junta, de manera indisoluble, mediante adhesión y/o soldadura, o de forma reversible mediante un área de junta (43) adicional.

15. Dispositivo según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el área de detección (12) está configurado en forma de manchas, en las que están inmovilizadas sondas (56, 57, 58, 59) en forma de moléculas de ácidos nucleicos, tratándose en el caso de las moléculas de ácidos nucleicos preferentemente de moléculas de ADN y/o de moléculas de ARN.

16. Dispositivo según la reivindicación 15, caracterizado porque las sondas (56, 57, 58, 59) están inmovilizadas mediante espaciadores (55).

17. Dispositivo según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la evaluación de la caracterización de ácidos nucleicos basada en el chip puede efectuarse mediante formas de detección óptica y/o espectroscopia, muy preferentemente, mediante medición de fluorescencia a trasluz, medición de fluorescencia en campo oscuro, medición confocal de fluorescencia, medición de fluorescencia con luz incidente, fotometría y/o fotometría diferencial.

18. Uso de un dispositivo según una de las reivindicaciones precedentes para efectuar de forma casi simultánea la amplificación y la caracterización basada en el chip, de ácidos nucleicos.

19. Uso de un dispositivo según una de las reivindicaciones precedentes 1 a 17 para efectuar de forma casi simultánea la amplificación mediante PCR y la caracterización basada en el chip, de ácidos nucleicos.