BR112017004506B1 - Microchip de ensaio para a medição de coagulação em uma amostra de sangue ou plasma, dispositivo de microensaio para a medição de coagulação em uma amostra de sangue ou plasma de um indíviduo e método para medição de tempo de coagulação - Google Patents

Abstract

dispositivo de microensaio, e, método para a medição de tempo de coagulação. um dispositivo de ensaio à base de chip microfluídico foi desenvolvido para a medição de propriedades físicas de um analito (particularmente, sangue total ou derivados de sangue total). as tecnologias podem ser aplicadas para medir tempos de coagulação de sangue total ou derivados de sangue total, determinar os efeitos de fármacos anticoagulantes sobre a cinética de coagulação/formação de coágulo, bem como avaliar o efeito de agentes de reversão de anticoagulante. essas tecnologias podem ser adicionalmente usadas para otimizar a dosagem de fármacos de anticoagulação e/ou seus agentes de reversão. o ensaio é independente da presença de anticoagulante; a coagulação é ativada pela exposição da amostra de sangue no dispositivo a uma superfície de vidro (ou outro material carregado negativamente, como silício oxidado), que ativa a rota intrínseca e pode ser acelerada ainda mais pela aplicação de fluxo de cisalhamento através da superfície de materiais de ativação. a ausência de agentes químicos de ativação e o microambiente altamente controlado e reproduzível rendem um ensaio de coagulação universal no local de atendimento.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDO RELACIONADO

[001] Este pedido reivindica o benefício e a prioridade do Pedido Provisório no U.S. 62/048.183, depositado em 9 de setembro de 2014, que está incorporado em sua totalidade a título de referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] A presente invenção refere-se a um dispositivo de ensaio de coagulação universal à base de chip microfluídico no local de atendimento e leitor que podem ser usados para medir a situação de coagulação geral de pacientes saudáveis normais, com coagulação prejudicada, anticoagulados e com anticoagulante invertido.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO:

[003] A coagulação (formação de coágulos) é o processo através do qual o sangue muda de um líquido para um gel. A mesma resulta potencialmente em hemostasia, a cessação de perda de sangue de um vaso danificado, seguida por reparo. O mecanismo de coagulação envolve a ativação, adesão e agregação de plaquetas juntamente com a conversão de fibrinogênio em fibrina, que se deposita e amadurece em uma rede robusta. Os distúrbios de coagulação são estados de doença que podem resultar em sangramento ou coagulação obstrutiva (trombose).

[004] A coagulação começa muito rapidamente após uma lesão no vaso sanguíneo ter danificado o endotélio que reveste o vaso. A exposição de sangue ao espaço sob o endotélio inicia duas categorias de processos: mudanças em plaquetas, e a exposição de fator de tecido subendotelial ao Fator de plasma VII, que, em última instância, leva à formação de fibrina. As plaquetas formam imediatamente um tampão no local de lesão; isso é chamado hemostasia primária. A hemostasia secundária ocorre simultaneamente: fatores de coagulação adicionais ou fatores de formação de coágulo além do Fator VII, respondem em uma cascata complexa para formar cordões de fibrina, que fortalecem o tampão plaquetário.

[005] A cascata de coagulação de hemostasia secundária tem duas trajetórias que levam à formação de fibrina. Essas são a rota de ativação de contato (também conhecida como a rota intrínseca), e a rota de fator de tecido (também conhecida como a rota extrínseca). Anteriormente, pensava-se que a cascata de coagulação consistia em duas trajetórias de igual importância unidas a uma rota comum. Sabe-se que a rota para a iniciação de coagulação de sangue é a rota de fator de tecido. As rotas são uma série de reações, nas quais um zimogênio (precursor de enzima inativo) de uma serina protease e seu cofator de glicoproteína são ativados para se tornares componentes ativos que, então, catalisam a próxima reação na cascata, que, em última instância, resulta em fibrina reticulada. Os fatores de coagulação são geralmente indicados por algarismos romanos, com um “a” minúsculo anexado para indicar uma forma ativa.

[006] Os fatores de coagulação são geralmente serina proteases que atuam clivando-se proteínas a jusante. Há algumas exceções. Por exemplo, FVIII e FV são glicoproteínas, e o Fator XIII é uma transglutaminase. Os fatores de coagulação circulam como zimogênios inativos. A cascata de coagulação é classicamente dividida em três rotas. As rotas tanto de fator de tecido quanto de ativação de contato ativam a “rota final comum” de fator X, trombina e fibrina.

Rota de fator de tecido (extrínseca)

[007] O papel principal da rota de fator de tecido é gerar uma “explosão de trombina”, um processo através do qual a trombina, o constituinte mais importante da cascata de coagulação em termos de seus papéis de ativação de retroalimentação, é liberada muito rapidamente. O FVIIa circula em uma quantidade mais alta que qualquer outro fator de coagulação ativado. O processo inclui as etapas a seguir:

[008] Após o dano ao vaso sanguíneo, o FVII deixa a circulação e entra em contato com o fator de tecido (TF) expressado em células portadoras de fator de tecido (fibroblastos e leucócitos do estroma), o que forma um complexo ativado (TF-FVIIa).

[009] O TF-FVIIa ativa FIX e FX.

[0010] O próprio FVII é ativado por trombina, FXIa, FXII e FXa.

[0011] A ativação de FX (para formar FXa) por TF-FVIIa é quase imediatamente inibida pelo inibidor de rota de fator de tecido (TFPI).

[0012] O FXa e seu cofator FVa formam o complexo de protrombinase, que ativa protrombina para trombina.

[0013] A trombina, então, ativa outros componentes da cascata de coagulação, que incluem FV e FVIII (que ativa FXI, que, por sua vez, ativa FIX), e ativa e libera FVIII de estar ligado a vWF.

[0014] O FVIIIa é o cofator de FIXa e, juntos, formam o complexo “tenase”, que ativa FX; e, assim, o ciclo continua. (“Tenase” é uma contração de “ten” e o sufixo “ase” usado para enzimas).

Rota de ativação de contato (intrínseca)

[0015] A rota de ativação de contato começa com a formação do complexo primário em colágeno por cininogênio de alto peso molecular (HMWK), pré-calicreína e FXII (fator Hageman). A pré-calicreína é convertida em calicreína e FXII se torna FXIIa. FXIIa converte FXI em FXIa. O fator XIa ativa FIX, que com seu cofator FVIIIa formam o complexo tenase, que ativa FX para FXa. O papel menor que a rota de ativação de contato tem na iniciação de formação de coágulos pode ser ilustrado pelo fato de que pacientes com deficiências severas de FXII, HMWK e pré-calicreína não têm um distúrbio de sangramento. Em vez disso, o sistema de ativação de contato parece estar mais envolvido na inflamação.

Ensaios de Coagulação

[0016] Diversas técnicas, incluindo testes com base em coágulos, ensaios cromogênicos ou de cor, medições de química diretas e ELISAs, são usadas para teste de coagulação. Dentre essas técnicas, ensaios com base em coágulos e cromogênicos são usados mais frequentemente. Enquanto ensaios de coagulação fornecem uma avaliação global de função de coagulação, testes cromogênicos são projetados para medir o nível ou função de fatores específicos.

[0017] Ensaios com base em coágulos são frequentemente usados para avaliação de pacientes com anormalidades de sangramento suspeitas e para monitorar terapia anticoagulante. A maioria desses testes usa plasma citratado, que exige dezenas de minutos para preparação e tipicamente, exige de horas a dias para receber os resultados em um ambiente hospitalar. O ponto final para a maioria dos ensaios de coagulação é a formação de coágulos de fibrina.

[0018] Tempo de protrombina (PT) é realizado adicionando-se um reagente de tromboplastina, que contém fator de tecido (que pode ser recombinante em origem ou derivado de um extrato de cérebro, pulmão ou placenta) e cálcio, ao plasma e medindo-se o tempo de coagulação. O PT varia com o reagente e o coagulômetro, mas tipicamente varia entre 10 e 14 segundos. O PT é prolongado com deficiências de fatores VII, X e V, protrombina, ou fibrinogênio e por anticorpos direcionados contra esses fatores. Esse teste também é anormal em pacientes com inibidores da reação entre fibrinogênio e fibrina, que inclui altas doses de heparina e a presença de produtos de degradação de fibrina. Tipicamente, reagentes de PT contêm excesso de fosfolipídeo de modo que inibidores não específicos (isto é, anticoagulantes lúpicos), que reagem com fosfolipídeos aniônicos, não prolonguem o tempo de coagulação. O PT é mais frequentemente usado para monitorar terapia com varfarina. As medições de PT não são comparáveis entre dispositivos ou centros e a maioria das clínicas de varfarina desenvolve sua própria faixa de pacientes normais, que é não transferível e altamente específica para os reagentes de extrato presentes no ensaio específico usado.

[0019] O ensaio de Tempo de Tromboplastina Parcial (aPTT) ativado é realizado adicionando-se primeiro um ativador de superfície (por exemplo, caulim, celite, ácido elágico ou sílica) e fosfolipídeo diluído (por exemplo, cefalina) ao plasma citratado. No local de atendimento, o aPTT também pode ser medido em sangue total tipicamente com o uso de agentes de ativação química similares. O fosfolipídeo nesse ensaio é chamado tromboplastina parcial visto que o fator de tecido está ausente. Após a incubação permitir a ativação ideal de fatores de contato (fator XII, fator XI, pré-calicreína e cininogênio de alto peso molecular), o cálcio é, então, adicionado, e o tempo de coagulação é medido. As medições de aPTT não são comparáveis entre os dispositivos ou hospitais e a maioria dos laboratórios clínicos desenvolvem sua própria faixa de pacientes normais, que é não transferível e altamente específica para os reagentes de extrato presentes no ensaio específico usado.

[0020] Embora o tempo de coagulação varie de acordo com o reagente e o coagulômetro usados, o aPTT tipicamente varia entre 22 e 40 segundos. O aPTT pode ser prolongado com deficiências de fatores de contato; fatores IX, VIII, X ou V; protrombina; ou fibrinogênio. Inibidores de fator específicos, assim como inibidores não específicos, também podem prolongar o aPTT. Produtos de degradação de fibrina e anticoagulantes (por exemplo, heparina, inibidores de trombina diretos ou varfarina) também prolongam o aPTT, embora o aPTT seja menos sensível à varfarina que o PT.

[0021] O tempo de coagulação de trombina (TCT) é realizado adicionando-se excesso de trombina ao plasma. O TCT é prolongado em pacientes com baixos níveis de fibrinogênio ou desfibrinogenemia e naqueles com níveis de produto de degradação de fibrina elevados. Essas anormalidades são comumente observadas com coagulação intravascular disseminada. O TCT também é prolongado por heparina e inibidores de trombina diretos.

[0022] O tempo de coagulação ativado (ACT) é um teste de coagulação de sangue total no local de atendimento usado para monitorar terapia ou tratamento com alta dose de heparina com bivalirudina. A dose de heparina ou bivalirudina exigida nessas configurações está além da faixa que pode ser medida com o aPTT. Tipicamente, o sangue total é coletado em um tubo ou cartucho que contém um ativador de coagulação (por exemplo, celite, caulim ou partículas de vidro) e uma barra de agitação magnética, e o tempo que leva para o sangue coagular é, então, medido. O valor de referência para o ACT varia entre 70 e 180 segundos. A faixa desejável para anticoagulação depende da indicação e do método de teste usado. O ACT não se correlaciona bem com outros testes de coagulação.

[0023] Para o tempo de coagulação de ecarina (ECT), veneno da cobra Echis carinatus é usado para converter protrombina em meizotrombina, um intermediário de protrombina que é sensível à inibição por inibidores de trombina diretos. O ECT não pode ser usado para detectar estados de coagulação perturbada e é útil somente para monitoramento de fármacos terapêuticos. Esse ensaio é insensível à heparina visto que impedimento estérico impede que o complexo de heparina- antitrombina iniba a meizotrombina. Visto que a ecarina também ativa a protrombina não carboxilada encontrada no plasma de pacientes tratados com varfarina, os níveis de inibidores de trombina diretos podem ser ensaiados mesmo com tratamento com varfarina concomitante. Embora o ECT tenha sido usado em pesquisa pré-clínica, o teste tem ainda que ser padronizado e não está amplamente disponível.

[0024] Ensaios de antifator Xa são usados para medir níveis de heparina e heparina de baixo peso molecular (LMWH). Esses são ensaios cromogênicos que usam um substrato de fator Xa no qual um cromóforo foi ligado. O fator Xa cliva o substrato cromogênico, o que libera um composto colorido que pode ser detectado com um espectrofotômetro e é diretamente proporcional à quantidade de fator Xa presente. Quando uma quantidade conhecida de fator Xa for adicionada ao plasma que contém heparina (ou LMWH), a heparina melhora a inibição de fator Xa por antitrombina, o que rende menos fator Xa disponível para clivar o substrato. Correlacionando- se esse resultado com uma curva-padrão produzida com as quantidades conhecidas de heparina, pode-se calcular a concentração de heparina no plasma. O uso de ensaios de anti- Xa exige o conhecimento do anticoagulante que o paciente toma a fim de usar o calibrador apropriado e não pode ser usado para monitorar terapias com anticoagulante anti-IIa.

[0025] Os fármacos anticoagulantes em uso clínico incluem varfarina, heparinas (heparina não fracionada e LMWH) e inibidores de trombina diretos (bivalirudina, hirudina e argatrobano).

[0026] A varfarina é eficaz para prevenção primária e secundária de tromboebolismo venoso; para prevenção de eventos cardioembólicos em pacientes com fibrilação atrial ou válvulas cardíacas protéticas; para prevenção de derrame, infarto recorrente, ou morte cardiovascular em pacientes com infarto agudo do miocárdio; e para a prevenção primária de infarto agudo do miocárdio em homens de alto risco. Devido à variabilidade na resposta de anticoagulante à varfarina, que reflete variações genéticas no metabolismo e fatores ambientais, tais como medicamentos, dieta e enfermidade concomitante, o monitoramento de coagulação regular e o ajuste de dosagem são exigidos para manter a Razão Normalizada Internacional (INR) dentro do intervalo terapêutico. As heparinas são anticoagulantes indiretos que ativam antitrombina e promovem sua capacidade para inativar trombina e fator Xa. Para catalisar a inibição de trombina, a heparina se liga tanto à antitrombina por meio de uma sequência de pentassacarídeo de alta afinidade quanto à trombina. Em contrapartida, para promover a inibição de fator Xa, a heparina precisa somente se ligar à antitrombina por meio de sua sequência de pentassacarídeo. As moléculas de heparina que contêm <18 unidades de sacarídeo são muito curtas para se ligarem tanto à trombina quanto à antitrombina e, portanto, não podem catalisar a inibição de trombina. Entretanto, esses fragmentos de heparina mais curtos podem catalisar a inibição de fator Xa, desde que contenham a sequência de pentassacarídeo. A resposta de anticoagulante à heparina é imprevisível devido à ligação não específica variável a células endoteliais, monócitos e proteínas de plasma. Devido a essa resposta de anticoagulante variável, o monitoramento de coagulação é rotineiramente realizado quando a heparina for administrada em doses superiores à profilática. O aPTT é o teste mais frequentemente usado para monitorar heparina. Infelizmente, os reagentes de aPTT variam em sua responsividade à heparina, e o intervalo terapêutico de aPTT difere, dependendo da sensibilidade do reagente e do coagulômetro usado para o teste. O aPTT provou ser mais difícil de padronizar que o PT, e o intervalo terapêutico comumente citado de 1,5 a 2,5 vezes o valor de controle frequentemente conduz à administração sistemática de doses de heparina subterapêuticas. A evidência que sustenta o conceito de um intervalo terapêutico de aPTT que prevê eficácia e segurança (em relação ao sangramento) é um tanto tênue. Aproximadamente 25% dos pacientes exigem doses de heparina >35.000 U/d para obter um aPTT terapêutico e são chamados resistentes à heparina. A maioria desses pacientes têm níveis de heparina terapêuticos quando medidos com o ensaio de anti- Xa, e a discrepância entre os 2 testes é o resultado de altas concentrações de pró-coagulantes, tais como fibrinogênio e fator VIII, que encurtam o aPTT. Embora a resposta de aPTT seja linear com níveis de heparina dentro do intervalo terapêutico, o aPTT se torna imensurável com doses de heparina mais altas. Assim, um teste menos sensível de anticoagulação global, tal como o ACT, é usado para monitorar o nível de anticoagulação em pacientes submetidos a intervenções coronarianas percutâneas ou cirurgia de desvio aortocoronário.

[0027] A LMWH é derivada de heparina não fracionada por despolimerização química ou enzimática. A LMWH tem substituído gradualmente a heparina para a maioria de indicações. A LMWH é tipicamente administrada em doses fixas quando fornecida para propósito profilático ou em doses ajustadas ao peso quando fornecida para tratamento. Imprevistos no monitoramento de LMWH por níveis de antifator Xa incluem fraca comparabilidade entre ensaios cromogênicos de anti-Xa comercialmente disponíveis, diferenças em razões entre anti-Xa e anti-IIa dentre as várias preparações de LMWH e a importância de temporização de amostragem de sangue em relação à dosagem. Embora o aPTT possa ser prolongado com altas doses de LMWH, esse ensaio não é usado para monitoramento. Nenhum ensaio no local de atendimento clinicamente disponível até hoje está disponível para o monitoramento dos milhões de pacientes administrados com LMWH.

[0028] Os inibidores de trombina diretos se ligam diretamente à trombina e bloqueiam a interação de trombina com seus substratos. Três inibidores de trombina diretos parenterais foram licenciados para indicações limitadas na América do Norte. A hirudina e o argatrobano são aprovados para o tratamento de pacientes com trombocitopenia induzida por heparina, enquanto a bivalirudina é licenciada como uma alternativa à heparina em pacientes submetidos à intervenção coronariana percutânea (PCI). A hirudina e o argatrobano exigem monitoramento de rotina. O TCT é muito sensível a pequenas quantidades de hirudina e argatrobano para ser usado para esse propósito. Embora o ACT tenha sido usado para monitorar as doses mais altas de inibidores de trombina diretos exigidos em configurações interventivas, isso não fornecer uma resposta linear ideal em altas concentrações. O aPTT é recomendado para monitoramento terapêutico; entretanto, cada inibidor de trombina direto tem sua própria resposta à dose, e a sensibilidade do teste aos níveis de fármaco varia entre reagentes de aPTT. Quando a terapia com hirudina for monitorada com o aPTT, a dose é ajustada para manter um aPTT que é 1,5 a 2,5 vezes o controle, enquanto para argatrobano, o aPTT alvo é 1,5 a 3 vezes o controle (mas não excede 100 segundos). O aPTT parece menos útil em pacientes que exigem doses mais altas de inibidor de trombina direto em procedimentos de desvio cardiopulmonar, visto que esse teste se torna menos responsivo em concentrações de fármaco crescentes. O ECT parece ser útil tanto para baixas quanto para altas concentrações de inibidores de trombina diretos e é menos afetado por substâncias interferentes que o aPTT. Entretanto, conforme mencionado acima, não está rotineiramente disponível. A responsividade da INR a concentrações de fármaco diferentes difere com reagente de ensaio e com o tipo de inibidor de trombina direto. Essa característica complica a transição de pacientes com trombocitopenia induzida por heparina de argatrobano para antagonistas de vitamina K.

[0029] Conforme é evidente a partir do supracitado, a coagulação, e a inibição de coagulação, é um processo complexo. O tipo de anticoagulante pode fornecer resultados enganosos e perigosos caso determinado com o uso do ensaio de coagulação errado. Isso cria um cenário potencialmente desastroso quando um paciente anticoagulado chega a uma sala de emergência sem informações sobre os remédios que toma, assim como a condição que está sendo tratada. Algumas vezes é impossível aguardar por mais diagnósticos para determinar o anticoagulante ou o distúrbio que provoca sangramento prolongado. A necessidade de um teste rápido, preciso e universal para coagulação, especialmente um teste no local de atendimento (“POC”), é bem conhecida; entretanto, as opções são extremamente limitadas.

[0030] Portanto, é um objeto da presente invenção fornecer um teste rápido, preciso e universal para coagulação.

[0031] É um objetivo adicional da presente invenção fornecer um teste no local de atendimento para coagulação.

[0032] É, ainda, um objetivo adicional da presente invenção fornecer um teste que seja preciso, reproduzível, fácil de operar e que exija uma quantidade muito pequena de amostra.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0033] Um dispositivo de ensaio à base de chip microfluídico foi desenvolvido para medir propriedades físicas de um analito (em particular, sangue total ou derivados de sangue total). As tecnologias podem, em particular, ser aplicadas para medir tempos de coagulação de sangue total ou derivados de sangue, para determinar os efeitos de fármacos anticoagulantes sobre a cinética de formação de coágulo/coagulação, assim como para avaliar o efeito de agentes de reversão de anticoagulante. Essas tecnologias podem, adicionalmente, ser usadas para otimizar a dosagem de fármacos de anticoagulação e/ou seus agentes de reversão. O ensaio é independente da presença de anticoagulante, visto que a coagulação é ativada por exposição da amostra de sangue no dispositivo a uma superfície de vidro (ou outro material carregado negativamente, tal como silício oxidado), que ativa a rota intrínseca e pode ser ainda mais acelerado pela aplicação de fluxo de cisalhamento através da superfície de materiais de ativação. A ausência de agentes de ativação química e microambiente altamente controlado e reproduzível rende um ensaio de coagulação no local de atendimento universal.

[0034] A amostra é manuseada em um sistema microfluídico. O volume de amostra introduzido na câmara de teste está na faixa de nano, micro ou mililitros (mais preferencialmente, 1 a 10 microlitros). A amostra é introduzida no poço de coleta diretamente a partir de uma amostra de sangue ou do indivíduo (tal como, a partir de um bastão de dedo). Em uma modalidade, a amostra, tal como sangue ou plasma, é coletada e transferida para o microdispositivo aquecido imediatamente após a coleta por seringa em um tubo capilar ou tubo com topo vermelho sem aditivo. A coagulação nas amostras, de preferência em duplicata, é iniciada por exposição do sangue ou plasma à superfície de vidro dentro do dispositivo e a amostra exposta a meios para análise de coagulação. A amostra de sangue é, então, extraída do poço de coleta na câmara de teste passivamente por ação capilar ou com uma bomba, que induz à transparência e expõe a amostra de sangue à superfície de materiais de ativação, enquanto entrega uma quantidade geometricamente controlada da amostra de sangue na câmara de teste. O sistema microfluídico juntamente com eletrodos integrados, estruturas de aquecedor ou outras partes de sensores ou atuadores é projetado para ser descartável. O sistema microfluídico é inserido em um alojamento analítico reutilizável (referido no presente documento como um “leitor”) que é parte de um instrumento de análise, que conecta o sistema microfluídico e fornece interface fluídicas, elétricas, ópticas e térmicas para medir a coagulação e transmitir o tempo e as características da medição para um leitor, monitor ou gravador externo.

[0035] A coagulação é avaliada por uma mudança em viscosidade, transmissão óptica, impedância elétrica e/ou pressão. Na modalidade preferencial, a coagulação é detectada através de medição de uma impedância sanguínea através de eletrodos integrados e/ou através de medição de transmissão óptica com o uso de LEDs de infravermelho (IR) e fotodiodos, respectivamente. Uma estrutura resistiva de aquecedor/resfriador térmica integrada, tal como uma bomba de calor de estado sólido ou resfriador Peltier mantém a amostra de sangue a uma temperatura definida, mais preferencialmente, de aproximadamente 37 °C (temperatura corporal), e garante a repetitividade e comparabilidade de medições. À medida que o fibrinogênio se converte em fibrina, a absorbância de IR aumenta até atingir o ponto máximo de um modo mensurável. A determinação de tempo de coagulação de sangue total é feita em ou próximo ao pico de absorbância de IR. Após a conclusão de medições, o chip microfluídico que contém a amostra de sangue é removido do leitor e descartado.

[0036] O desenvolvimento de coagulação pode ser monitorado medindo-se a impedância elétrica. O desenvolvimento de fibrina aumenta a impedância elétrica até atingir o ponto máximo de um modo mensurável. Em ou próximo ao pico de impedância elétrica, a determinação de tempo de coagulação de sangue total é feita. O tempo de coagulação de sangue total pode ser medido por absorção de IR e impedância elétrica medida sozinha ou simultaneamente como uma base de comparação. As curvas de impedância elétrica e absorção de IR são essencialmente coincidentes, e fornecem confirmação por meio de modos de medição independentes.

[0037] O sistema microfluídico é fabricado através de aplicação de microtecnologias e processamento e ligação de pastilhas produzidas a partir de silício, vidro ou outros materiais adequados. O sistema microfluídico também pode ser fabricado através de meios alternativos, por exemplo, através de aplicação de tecnologias de litografia macia ou através de geração de partes de leitor (produzidas, por exemplo, a partir de plástico ou um material substancialmente opaco ao IR adequado diferente) que podem ser usadas sozinhas ou em combinação com chips micropadronizados para formar um sistema microfluídico. O sistema microfluídico tipicamente consiste em uma entrada, uma saída e uma ou mais câmaras que são conectadas através de canais, que variam em comprimento de dezenas de mícrons a milímetros, com alturas e profundidas na faixa de dezenas de mícrons a centenas de mícrons.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0038] A Figura 1 é um esquema da cascata de coagulação.

[0039] A Figura 2A é uma vista em corte transversal de uma modalidade do dispositivo microfluídico no qual sangue é pipetado em uma câmara, e o chip é, então, inserido na embalagem.

[0040] A Figura 2B é uma vista em corte transversal de uma modalidade do dispositivo microfluídico e que o sangue pode ser introduzido através do lado de câmara; “sipper” ressalta do leitor, similar à medição de glicose no sangue.

[0041] A Figura 3A é uma vista da versão aberta dos dois dispositivos de câmara de amostra.

[0042] A Figura 3B é uma vista da versão fechada dos dois dispositivos de câmara de amostra.

[0043] As Figuras 4A a 4H são vistas das câmaras que mostram as câmaras, canais de conexão, almofadas de contato elétrico e termistores.

[0044] A Figura 5 é uma vista em perspectiva a partir do topo do fundo do leitor de versão fechada.

[0045] A Figura 6 é uma vista em corte transversal do lado do fundo do leitor de versão fechada.

[0046] A Figura 7 é uma vista em perspectiva em corte transversal do topo do leitor de versão fechada que mostra o dispositivo de ensaio de amostra no lugar.

[0047] A Figura 8 é uma vista em perspectiva em corte transversal a partir do topo do topo do leitor de versão fechada.

[0048] A Figura 9A é uma vista em perspectiva em corte transversal a partir do topo da parte inferior do leitor de versão aberta.

[0049] A Figura 9B é uma vista em perspectiva em corte transversal a partir do lado da parte inferior do leitor de versão aberta.

[0050] A Figura 10A é uma vista em perspectiva em corte transversal a partir do lado e fundo do topo do leitor de versão aberta.

[0051] A Figura 10B é uma vista em perspectiva em corte transversal a partir do lado e topo do topo do leitor de versão aberta.

[0052] A Figura 11 é um esquema do sistema, que mostra uma caixa que contém as câmaras de ensaio descartáveis de uso único, o leitor e as conexões a um processador e monitor de computador.

[0053] As Figuras 12A a 12F são gráficos da impedância (12A, 12C e 12E) e da transmissão de infravermelho (12B, 12D, 12F) ao longo do tempo em minutos para controle sem anticoagulante, 300 ng de anticoagulante edoxabano/ml de sangue e 300 ng de edoxabano e ciraparantag (PER977; um agente de reversão de anticoagulante)/ml de sangue, respectivamente.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO I. Definições Microfluidos

[0054] Microfluidos é um campo altamente interdisciplinar, elaborado a partir de engenharia, física, química, bioquímica, micro/nanotecnologia e biotecnologia. Pequenos volumes de líquido, que variam de femto a mililitros são tipicamente manuseados em um sistema microfluídico. Os métodos para fabricação de um sistema microfluídico permitem tipicamente a integração de sensores e/ou atuadores, de modo que os líquidos possam ser transportados, manipulados e analisados de modo eficaz no interior do sistema microfluídico. As interfaces entre o sistema microfluídico e seu ambiente possibilitam a implantação de mecanismos externos para transporte, manipulação e análise.

Micro/Nanotecnologias

[0055] As micro/nanotecnologias são tipicamente usadas para fabricar microssistemas, que incluem sistemas microfluídicos. As micro/nanotecnologias possibilitam tipicamente a geração de estruturas com dimensões na faixa de micro ou nanômetro. Tais tecnologias podem se basear em tecnologias de processamento de pastilha de silício, originalmente desenvolvidas para fabricação de circuitos eletrônicos integrados.

Ação Capilar

[0056] Uma forma conveniente de carregar uma amostra líquida em um sistema microfluídico é por ação capilar. Uma porta de coleta de amostra é umedecida com a amostra e a amostra é extraída eficazmente nos canais hidrofílicos estreitos e nas câmaras do sistema microfluídico por forças capilares.

Anticoagulante

[0057] Um anticoagulante é uma substância que interfere na capacidade de o sangue coagular. Administrado como um fármaco terapêutico, um anticoagulante pode, por exemplo, ajudar a reduzir ou impedir a ocorrência de êmbolos ou trombos potencialmente ameaçadores a saúde e/ou vida.

Agente de reversão de anticoagulante

[0058] Um agente de reversão de anticoagulante pode ser administrado como um fármaco terapêutico a fim de reverter potencial ou completamente o efeito de um anticoagulante. A restauração da capacidade de o sangue coagular pode ser vital, por exemplo, um paciente que toma um anticoagulante e experimenta uma lesão severa pode ser tratado com um reagente de reversão para restauração de capacidade de coagulação do sangue e prevenção de perda excessiva de sangue.

Dispositivos “Abertos” e “Fechados”

[0059] Um dispositivo “aberto” tem um canal para o lado de fora a partir de uma câmara interior, o que permite o acesso direto de sangue à câmara. Um dispositivo “fechado” não tem canais exteriores, e é preenchido antes de ser vedado para o exterior exceto por pequenos orifícios associados aos sensores, eletrodos, LEDs e outros elementos utilizados na avaliação de coagulação dentro da câmara. A “versão aberta” do sistema microfluídico é projetada de modo que o chip possa ser inserido em sua primeira embalagem, ser aquecido, mas ainda estar acessível (aberto). Uma amostra pode ser carregada no sistema através de umedecimento da porta lateral, com o chip que já reside em sua embalagem. A amostra será extraída no chip por forças capilares.

[0060] A “versão fechada” do sistema microfluídico não será acessível para o usuário após ser colocado em sua embalagem. Uma amostra tem que ser carregada no sistema antes da colocação do chip em sua embalagem através de umedecimento ou pipetagem em uma das portas laterais traseiras.

II. Dispositivo:

[0061] As modalidades do chip microfluídico e seu leitor são mostradas nas Figuras 2 a 10, em que o sistema inclui ambas as partes refletidas pela Figura 11. Conforme indicado nas Figuras 2A e 2B, chips microfluídicos 10 são fabricados através de causticação a úmido anisotrópica de pastilhas de silício e oxidação térmica subsequente, causticação a úmido isotrópica de pastilhas PYREX (vidro de borossilicato transparente de baixa expansão térmica), deposição por pulverização catódica de filmes metálicos finos em ambas as pastilhas através de estênceis, ligação anódica de silício e pastilhas PYREX®, e separação subsequente de chips únicos por corte de pastilha.

[0062] Os chips microfluídicos podem ser fabricados por meios alternativos, com o uso de qualquer método que seja adequado para gerar estruturas microfluídicas e qualquer material carregado negativamente que seja adequado para ativar a cascata de coagulação de sangue.

[0063] As dimensões em corte transversal e geometrias das câmaras 12a e 12b e o canal 14 que conecta as câmaras podem ser modificadas, e a quantidade de câmaras pode ser variada. A razão entre superfície e volume influenciará, de modo geral, o tempo de coagulação. O acesso às câmaras é direto (“fechado”, Figura 2B), antes da vedação do dispositivo de câmara, ou por meio de um canal lateral 16 que permite o acesso a partir do exterior das microcâmaras.

[0064] Conforme mostrado pelas Figuras 3A e 3B, os chips são projetados para possibilitar: - O aquecimento através de estrutura de resistência posterior ou de aquecedor elétrico (no lado inferior de câmaras 12a e 12b) - Medição de temperatura para controle de aquecimento através do termistor de lado superior (externo) 18 - Detecção de coagulação através de medições de pressão de ar - Detecção de coagulação através de medição de impedância ao longo da amostra de sangue através de eletrodos embutidos 20a e almofadas de contato 20b - Detecção de coagulação através de medições ópticas

[0065] Conforme mostrado nas Figuras 4A a 4H, as estruturas de resistência 22 são depositadas atrás de uma pastilha de silício 24 (para formar estruturas resistivas de aquecimento 32, Figuras 4G, 4H), no lado frontal 26 da pastilha de silício (para formar eletrodos 20a, 20b para medições de impedância e termistores 18, respectivamente, no assoalho de cada câmara), e no lado frontal da pastilha PYREX® (para formar termistores 18 no topo de uma ou de ambas as câmaras 12a, 12b). O aquecedor e o termistor pode ser externo ao “chip”, e pode ser integrado na estrutura de leitor. Caso as paredes da cavidade na qual o chip é colocado sejam de massa significativamente maior que o chip, altamente termicamente condutivas e formem um círculo quase completo, então, a cavidade aproxima um “corpo negro” e o chip deve entrar em equilíbrio térmico com a cavidade. Caso o chip esteja em contato com a cavidade, ou proximamente separado, a constante de tempo de equilíbrio pode ser muito curta. Isso pode ser estabelecido por medição de pirômetro durante o desenvolvimento. Isso deve reduzir a complexidade da parte descartável do sistema e o custo. O canal de conexão 14 e a porta de entrada 36 podem ser causticadas com o uso de hidróxido de potássio (KOH) na pastilha de silício 26.

[0066] O dispositivo nas Figuras 2B, 3B (chamado de “dispositivo fechado”) tem duas portas de entrada 28a, 28b causticadas através da parte de silício 30. Uma amostra pode ser pipetada em uma das portas 28a, 28b antes do dispositivo 10 ser inserido em uma embalagem vedada. O dispositivo nas Figuras 2a, 3b tem uma porta de entrada 28b causticada através da parte de silício e uma porta de entrada 16, realizada como um canal causticado no PYREX® (chamado de “dispositivo aberto”). Nos casos de um substrato de silício, a estrutura de onda de superfície pode ser diretamente integrada no projeto microfluídico por técnicas de microfabricação bem conhecidas. Um chip de dispositivo aberto (Figuras 2A, 3A) pode ser inserido em uma embalagem vedada e/ou leitor primeiro, em que a borda com a porta de via lateral ressalta do leitor. O umedecimento da porta de via lateral 16 resultará, então, na amostra que é extraída na câmara 12a por ação capilar.

[0067] O sistema de controle de aquecedor/resfriador combinado e o termistor podem ser externos ao “chip”, e pode ser integrado na estrutura de leitor. Caso as paredes da cavidade na qual o chip é colocado sejam de massa significativamente maior que o chip, altamente termicamente condutivas e formem um círculo quase completo, então, a cavidade aproxima um “corpo negro” e o chip deve entrar em equilíbrio térmico com a cavidade. Caso o chip esteja em contato com a cavidade, ou proximamente separado, a constante de tempo de equilíbrio pode ser muito curta. Isso pode ser estabelecido por medição de pirômetro durante o desenvolvimento. Isso reduziria a complexidade da parte descartável do sistema e (com sorte) o custo.

[0068] Embalagens de Chip ou “leitores”, conforme mostrado nas Figuras 5 a 10, fornecem interfaces elétricas, ópticas e fluídicas para o chip. Um leitor consiste em uma parte inferior (Figuras 5, 6, 9A, 9B) e uma parte superior (Figuras 7, 8, 10A, 10B) que são fabricadas por impressão 3D de alta precisão, moldagem, usinagem ou outros processos de fabricação. Ambas as partes são unidas e prensadas uma contra à outra por pinos de ajuste de metal de travamento que se encaixam em orifícios 56. O leitor pode incluir meios para exibição, armazenamento de informações e uma capacidade de comunicações.

[0069] As Figuras 5 e 6 mostram a parte inferior de leitor 50 para o chip de dispositivo a partir de dois ângulos diferentes. Os canais 52a, 52b, localizados na reentrância 54, no interior do leitor, conectam as câmaras 2 e 1, respectivamente, às portas de entrada de chip. Em um lado do leitor, uma válvula solenoide (não mostrada) pode ser fixada ao leitor em extremidades de canal 58 para controlar a conexão entre o canal de leitor e um conector de tubo farpado que é aparafusado no fundo do leitor. No lado oposto, um sensor de pressão (não mostrado) pode ser fixado ao leitor em orifícios 60 para monitorar a pressão aplicada ao canal de leitor e à porta de entrada de chip. Cada porta de entrada 62a, 62b é controlada/monitorada por sua própria válvula solenoide/sensor de pressão presa em orifícios 70a, 70b, 70c e 70d. A parte inferior de leitor exibe uma reentrância 54 para o chip microfluídico. Pequenos orifícios verticais 64a, 64b retêm pinos do tipo pogo para entrar em contato com a estrutura de aquecedor no fundo do chip. Um orifício 66 no centro da parte de leitor retém um chip de LED IR em um leitor de lata de metal, que passa ao longo do trajeto de luz 68.

[0070] Os componentes IR podem ser moldados ou integrados em uma forma de “chipstrato”.

[0071] Embora mostrado como uma medição óptica de ponto único, uma medição óptica de múltiplos pontos pode ser usada.

[0072] As Figuras 7 e 8 mostram a parte superior de leitor 80 para o chip de dispositivo a partir de dois ângulos diferentes. O orifício grande (por exemplo, de 5 mm) 82 no centro retém um chip de fotodiodo IR (não mostrado) em um leitor de lata de metal que direciona a luz através do orifício 86. Três orifícios verticais pequenos 84 (por exemplo, de menos de um mm) retêm três pinos do tipo pogo (não mostrados) para entra em contato com três eletrodos para medições de impedância (um eletrodo de aterramento para ambas as câmaras e um contraeletrodo em cada câmara), de modo que as medições de impedância possam ser realizadas em ambas as câmaras. Dois outros orifícios verticais 88 retêm pinos do tipo pogo para entrar em contato com o termistor no topo do chip. Outras modalidades desses dispositivos são conhecidas e estão prontamente disponíveis para a mesma função. O LED IR e o fotodiodo são colocados de modo que os mesmos interroguem a região de centro de 1 mm de diâmetro de uma câmara.

[0073] O próprio leitor de chip é fixado à tampa de uma caixa de projeto 100 que contém conjunto de circuitos eletrônico, válvulas e bombas necessárias para realizar medições automáticas, conforme mostrado na Figura 11. A caixa de projeto 100 é conectada a um PC 102 em que medições são controladas por um programa LabView e um processador 110, e os resultados mostrados no monitor 104.

[0074] As Figuras 9A e 9B mostram a parte inferior de leitor 120 para o chip de dispositivo aberto a partir de dois ângulos diferentes. Orifícios de pino de ajuste 122 são usados para prender o dispositivo. Os canais 124 no interior do leitor conectam as câmaras 2 e 1, respectivamente, às portas de entrada de chip. Em um lado do leitor, uma válvula solenoide (não mostrada) pode ser fixada ao leitor em extremidades de canal para controlar a conexão entre o canal de leitor e um conector de tubo farpado que é aparafusado no fundo do leitor. No lado oposto, um sensor de pressão (não mostrado) pode ser fixado ao leitor em orifícios 126a, 126b para monitorar a pressão aplicada ao canal de leitor e à porta de entrada de chip. Cada porta de entrada é controlada/monitorada por sua própria válvula solenoide/sensor de pressão presa nos orifícios. A parte inferior de leitor exibe uma reentrância 128 para o chip microfluídico. Um orifício 130 no centro da parte de leitor retém um chip de LED IR em um leitor de lata de metal.

[0075] As Figuras 10A e 10B mostram a parte superior de leitor 140 para o chip de dispositivo aberto a partir de dois ângulos diferentes. O orifício grande (por exemplo, de 5 mm) 142 no centro retém um chip de fotodiodo IR (não mostrado) em um leitor de lata de metal que direciona a luz através do orifício 144. Três orifícios verticais pequenos 146 (por exemplo, de menos de um mm) retêm três pinos do tipo pogo (não mostrados) para entra em contato com três eletrodos para medições de impedância (um eletrodo de aterramento para ambas as câmaras e um contraeletrodo em cada câmara), de modo que as medições de impedância possam ser realizadas em ambas as câmaras. Dois outros orifícios verticais 148 retêm pinos do tipo pogo para entrar em contato com o termistor no topo do chip. O LED IR e o fotodiodo são colocados de modo que os mesmos interroguem a região de centro de 1 mm de diâmetro de uma câmara.

[0076] Embora descrito em referência à interrogação de ambas as câmaras com um feixe, é possível interrogar ambas as câmaras com o uso de feixes separados. Um feixe é mostrado para propósitos de ilustração apenas.

[0077] O leitor de chip é fixado à placa de tampa de uma caixa de projeto, conforme descrito acima, com o uso de orifícios de aparafusamento 150, conforme mostrado na Figura 11. A. Superfície para Ativação de Coagulação de Sangue

[0078] O sistema microfluídico é fabricado de modo que a amostra de sangue ou plasma introduzida esteja em contato com a superfície de vidro, a parte superior do chip microfluídico e/ou a superfície da parte inferior do chip microfluídico, formado de um material tal como PYREX® ou silício termicamente oxidado, tal como SiO2 amorfo, óxido de silício e nitreto de silício. O vidro serve para ativar a cascata de coagulação sem o uso de reagentes químicos ou biológicos adicionais. A ativação é alcançada através de mero contato da amostra com a superfície de vidro ou através de movimento ativo (por exemplo, através de um pulso de pressão de ar externamente aplicado) da amostra ao longo das superfícies de vidro no interior do sistema microfluídico.

[0079] O sistema microfluídico é fabricado de modo que a amostra de sangue e plasma introduzida esteja em contato com superfícies de vidro (ou outras superfícies carregadas negativamente), que servem para ativar a cascata de coagulação sem o uso de reagentes químicos ou biológicos adicionais. As superfícies de vidro são geradas através de pastilhas de vidro e pastilhas de silício oxidado, respectivamente, para fabricação de sistemas microfluídicos. Alternativamente, as superfícies de vidro podem ser realizadas através de uso de chips de vidro que são integrados em partes de leitor que formam um sistema microfluídico, através de deposição de vidro nas superfícies internas do sistema microfluídico (por exemplo, através de uso de produtos de vidro spin-on) ou através de integração de pequenos objetos com superfícies de vidro (por exemplo, microesferas de vidro) no interior do sistema microfluídico. Adicionalmente, as superfícies de vidro podem ser introduzidas pela oxidação de superfícies de silício.

B. Características Elétricas de Filmes Metálicos Finos Depositados

[0080] Os filmes metálicos finos depositados podem ser formados de camadas de adesão de cromo (aproximadamente 20 nm de espessura) e camadas superiores de ouro (aproximadamente 50 nm de espessura para eletrodos internos para medições de impedância, 100 nm de espessura para termistores e 150 nm de espessura para estruturas de aquecedor). Pinos do tipo pogo acionados por mola no leitor plástico foram usados para realizar contatos elétricos em todos os eletrodos de filme fino no chip microfluídico. Resistências típicas entre dois pinos conectados a cada extremidade de uma estrutura de teste de filme metálico, com comprimento aproximado de 2 mm e largura de 1 mm, são 1,8 Ohm, com pinos que entram em contato com filmes metálicos para estruturas de aquecedor, 2,7 Ohm, que entram em contato com filmes metálicos para termistores, e 22 Ohm, que entram em contato com filmes metálicos para eletrodos internos para medições de impedância. A resistência marcadamente mais alta entre pinos de eletrodo interno é provavelmente devido a uma camada de ouro mais fina e possivelmente degradação de contato durante a ligação anódica em aproximadamente 300 °C. As estruturas de aquecedor e os termistores são depositados após a ligação anódica.

[0081] Para a medição de coeficientes de temperatura de resistências de filmes metálicos finos depositados, foi usado um chip que exibiu estruturas de resistor/termistor em vez de eletrodos de circuito aberto para medições de impedância. O chip foi inserido em seu leitor e aquecido no interior de um forno. As resistências elétricas de aquecedor, termistor e resistores de eletrodo interno foram medidas em temperaturas diferentes e os coeficientes de temperatura de resistências α foram calculados: -filme fino de aquecedor : α = 0,0016 K-1 -filme fino de termistor : α = 0,00115 K-1 -filme fino de eletrodo interno: α = 0,000108 K-1.

C. Eletrodos Internos para Posicionamento de Amostra

[0082] Além das medições de impedância, os eletrodos integrados também podem ser usados para detectar a presença do analito, tal como fibrina, no sistema microfluídico e/ou para rastrear o movimento do analito, por exemplo, devido aos pulsos de pressão de ar externamente aplicados. Tal detecção e rastreamento podem ser usados para iniciar o procedimento de análise, uma vez que o analito é adicionado ao sistema microfluídico, para posicionar o analito em uma localização específica dentro do sistema microfluídico, e para mover o mesmo repetidamente para trás e para frente entre localizações definidas, respectivamente.

[0083] Embora exemplificado em referência às duas câmaras e dois eletrodos, múltiplos eletrodos podem ser usados para confirmar o preenchimento de múltiplas câmaras, no sítio de medição de coagulação ou em um ponto antes da câmara em que a coagulação é medida, tal como mais próximo à entrada.

[0084] O movimento repetido de sangue total ou plasma sanguíneo ao longo de superfícies de vidro pode ser aplicado para aumentar a ativação do sangue, para acelerar a coagulação de sangue e/ou para diminuir tempos de medição.

D. Integração de Estruturas de Filtro

[0085] Estruturas de filtro mecânicas podem ser integradas no chip microfluídico, de modo que somente plasma sanguíneo chegue nas câmaras de análise. Os filtros podem ser realizados como matriz de micropilares ou como microcanais causticados em silício ou vidro. Dessa forma, o plasma (sem o uso de um anticoagulante, tal como citrato de sódio ou EDTA) pode ser produzido in situ e muito rapidamente testado da mesma maneira que o sangue total, sem interferência dos glóbulos vermelhos na análise. As matrizes de micropilares podem ser dispostas em padrões de deslocamento para inibir o trânsito de glóbulos vermelhos, enquanto minimiza a probabilidade de “obstruir” uma fração excessiva do corte transversal de canal disponível.

E. Meios para Detecção de Coagulação

[0086] Uma variedade de modalidades pode ser aplicada para determinar tempos de coagulação de sangue.

Viscosidade

[0087] A viscosidade do sangue pode servir como uma medida para distinguir tempos de coagulação. Dois princípios gerais podem ser aplicados para render uma medida direta ou indireta para a viscosidade. A amostra pode ser movida através de um canal com geometria conhecida. A viscosidade pode ser medida rastreando-se a taxa de penetração através de um canal “longo” opticamente ou por múltiplos “pontos de verificação” de imageamento ou feixe ou eletricamente por múltiplos sensores de impedância de eletrodo. A viscosidade pode ser medida indiretamente, por exemplo, através de medição da distância que a amostra percorreu no interior de um canal durante um intervalo de tempo específico, do volume de amostra que foi deslocado durante um intervalo de tempo específico ou da mudança na força de acionamento durante um intervalo de tempo específico (por exemplo, caso a amostra seja movida por um volume pressurizado de ar capturado, a mudança em pressão de ar pode servir como uma medida indireta para o deslocamento de volume de amostra). Alternativamente, os objetos podem ser movidos através da amostra de sangue, por exemplo, acionados através de forças eletrostáticas ou magnéticas. O rastreamento do movimento de objeto pode render uma medida indireta para a viscosidade de amostra.

[0088] A viscosidade do analito pode ser detectada através de movimento do analito no interior do sistema microfluídico através de um volume de ar pressurizado aprisionado. O ar pode ser pressurizado, por exemplo, através de bombas de ar elétricas que são conectadas ao sistema microfluídico. O ar pressurizado pode ser aprisionado através de fechamento de válvulas solenoides conectadas ao sistema microfluídico. A pressão decrescente do ar aprisionado em uma porta de entrada do chip indica o movimento do analito. O conhecimento da geometria do sistema microfluídico e da magnitude da pressão aplicada permite o cálculo de viscosidade de analito e a detecção de mudanças de viscosidade (por exemplo, um aumento de viscosidade devido à coagulação em caso de sangue).

[0089] A detecção de coágulo por monitoramento de viscosidade envolve medir a pressão diferencial ao longo de uma entrada e saída no chip, conectadas às portas fluídicas no leitor (feitas à prova de ar/fluidos com o uso de vedações em anel o).

[0090] A viscosidade do analito pode ser detectada através de movimento do analito no interior do sistema microfluídico através de um volume de ar pressurizado aprisionado. O ar pode ser pressurizado, por exemplo, através de bombas de ar elétricas que são conectadas ao sistema microfluídico. O ar pressurizado pode ser aprisionado através de fechamento de válvulas solenoides conectadas ao sistema microfluídico. A pressão decrescente do ar aprisionado em uma porta de entrada do chip indica o movimento do analito. O conhecimento da geometria do sistema microfluídico e da magnitude da pressão aplicada permite o cálculo de viscosidade de analito e a detecção de mudanças de viscosidade (por exemplo, um aumento de viscosidade devido à coagulação em caso de sangue).

Impedância

[0091] A coagulação de uma amostra pode ser relacionada a sua impedância elétrica, ou sua resistência complexa quando uma corrente ou tensão elétrica for aplicada. A impedância elétrica resulta de resistências ôhmicas assim como de componentes capacitivos da amostra. A impedância elétrica pode, por exemplo, ser medida através de eletrodos que são diretamente integrados no chip microfluídico ou integrados no leitor que forma, em conjunto com outras partes, um sistema microfluídico. Os eletrodos podem estar parcialmente em contato direto com a amostra ou separados da amostra somente através de um isolante fino (com uma espessura que varia de nanômetros a centenas de micrômetros).

[0092] Os eletrodos e as linhas condutoras podem ser formados como filmes metálicos finos em padrão que são depositados em substratos que formam o sistema microfluídico. Os eletrodos e as linhas condutoras também podem ser realizados através de integração de folhas ou filmes metálicos em padrão que são inseridas e depostas entre partes de leitor. Caso as pastilhas semicondutoras sejam usadas para fabricar chips microfluídicos, o próprio material semicondutor pode conter eletrodos integrados fabricados por difusão, implantação, causticação, microusinagem ou qualquer combinação de técnicas apropriadas similares às técnicas usadas em circuito integrado ou outra produção de microdispositivo. Os eletrodos integrados podem ser usados para medir diretamente propriedades elétricas do analito (por exemplo, resistência, capacitância e impedância). Circuitos eletrônicos adequados também podem ser usados para traduzir mudanças de analito (e mudanças relacionadas em propriedades elétricas) em tensões, correntes, frequências ou outros parâmetros elétricos mensuráveis adequados. As partes também podem ser inseridas durante a construções por impressão 3D, ou integradas diretamente. Por exemplo, um elemento de aquecimento de resistor seria fabricado por um canal dopado em um substrato semicondutor (por implantação de feixe de íons, por exemplo).

[0093] A detecção de coágulo por monitoramento de impedância é efetuada inserindo-se o chip no leitor, com o contato entre almofadas de ouro (conectadas aos eletrodos no chip) e pinos do tipo pogo no leitor a partir do qual o sinal elétrico é lido por um medidor de LCR, por exemplo, ou qualquer outro sistema de medição apropriado.

[0094] Para a detecção de coagulação através de medição de impedâncias, uma amostra é carregada no chip, o chip é inserido em seu leitor e os pinos do tipo pogo que se conectam aos eletrodos de impedância internos conectados por meio de condutores de clipe Kelvin a um medidor de LCR QuadTech 1920. A magnitude e a fase da impedância complexa da amostra de sangue foram gravadas em intervalos de 15 segundos. As medições em 100 Hz, 1kHz, 10 kHz e 100 kHz mostraram picos de características ou platôs da magnitude ou da fase ou ambos. Os picos ou platôs indicaram uma medida para o tempo de coagulação.

[0095] Em referência às Figuras 3A e 3B, para medições de impedância, o medidor de LCR externo aplica uma tensão de CA (20 mV RMS) entre os dois eletrodos 20b, 20a em cada lado da câmara 12a, e mede a corrente elétrica entre os eletrodos. A magnitude e a fase de impedância são, então, computadas e a coagulação calculada.

Propriedades Ópticas

[0096] As propriedades ópticas da amostra podem estar relacionadas aos eventos de coagulação. A luz com comprimento de onda na faixa de 500 nm a 10.000 nm (preferencialmente 1.300 nm) pode ser usada para iluminar a amostra através do leitor microfluídico ou de chip. Os parâmetros a seguir podem ser usados para rastrear a coagulação: luz refletida, transmitida e espalhada. Caso uma fonte de luz coerente seja usada, a polarização pode ser usada como parâmetro adicional.

[0097] A detecção de coágulo por transmissão de IR é realizada inserindo-se o chip no leitor e medindo-se a transmissão de infravermelho ao longo da espessura do chip (através do vidro, câmara de preenchimento de fluido e silício subjacente). Isso é efetuado por meio de colocação de uma fonte de IR (LED) acima do chip e do detector de fotodiodo alinhado imediatamente abaixo.

[0098] Para detecção óptica de coágulo, o LED IR e o fotodiodo são inseridos em suas partes de leitor conforme descrito acima. Uma amostra de sangue é pipetada no chip e o chip colocado no leitor. A é continuamente iluminada com luz IR a 1.300 nm. Em intervalos de tempo de tipicamente 100 ms, a queda de tensão ao longo de um resistor de 1 MOhm provocada pela fotocorrente do fotodiodo foi gravada. As tensões tipicamente mediram diversos volts. A coagulação da amostra fez com que a luz transmitida e a fotocorrente variassem ao longo do tempo. Os picos de característica da curva de luz transmitida indicaram uma medida para o tempo de coagulação.

[0099] A medição de iluminação contínua é apresentada como uma simples ilustração. Técnicas de medição mais sofisticadas podem ser usadas. Por exemplo, caso o emissor de IR fosse iluminado durante 50% de duração, em uma taxa de repetição de 1 khz, e um detector síncrono fosse usado para processar a emissão de fotodetector, seguido por um período de integração de 1 segundo, a razão entre sinal e ruído no exemplo acima pode ser aprimorada em até trinta vezes. Além disso, a processamento de sinal ativo permitiria o processamento de sinais muito menores, o que permite uma terminação de impedância relativamente baixa do fotodetector, o que diminui o ruído intrínseco e cancela o desvio. A sensibilidade de ruído elétrico do ambiente poderia ser substancialmente reduzida.

Propriedades Acústicas

[00100] A medição de propagação de som na amostra ou ao longo da superfície de amostra pode servir como uma medida adicional para coagulação. Transdutores de ultrassom externos podem ser usados para medir o tempo que o ultrassom leva para percorrer através da amostra. Adicionalmente, os dispositivos de onda acústica de superfície podem ser usados para medir propriedades acústicas da amostra e para detectar a coagulação.

III. Métodos para Produzir Dispositivos

[00101] Além dos processos-padrão, tais como fotolitografia, tecnologias especiais, tais como ligação anódica ou causticação a úmido anisotrópica de hidróxido de potássio de pastilhas de silício, podem ser aplicadas para formar microssistemas. Além da litografia de luz ultravioleta padrão, técnicas, tais como erosão ou microablação de escrita de laser, litografia de feixe de elétrons ou fresagem de feixe de íon focada podem ser usadas para definir estruturas com dimensão em micro ou namômetro. A litografia macia é uma forma relacionada para fabricar sistemas microfluídicos e se baseia em geração de microestruturas ou - padrões, por exemplo, através de técnicas de litografia padrão, e uso subsequente desses padrões em processos de moldagem/fusão. Os materiais elastoméricos, tais como polidimetilsiloxano (PDMS), são tipicamente usados para geração de sistema microfluídico por litografia macia. Filmes estruturados gerados por litografia macia podem ser fixados uns aos outros ou a qualquer outro substrato estruturado ou não estruturado para formar sistemas microfluídicos complexos. Além disso, outras tecnologias, tais como perfuração, fresagem, modelagem ou impressão 3D, podem ser usadas sozinhas ou em combinação com outas micro/nanotecnologias para fabricar microssistemas.

IV. Coleta de Amostra Coleta de Sangue

[00102] Na maioria dos casos, indivíduos a serem testados se apresentarão em uma clínica ou um hospital, possivelmente com situação desconhecida para tratamento com anticoagulantes. O sangue pode ser obtido através do uso de uma seringa, uma lanceta ou diretamente de uma linha que contém sangue. Devido ao uso da trajetória de coagulação alternativa na qual a coagulação é ativada com o uso de uma superfície do tipo vidro, o sangue pode conter anticoagulantes, tais como varfarina, heparina, heparina de baixo peso molecular, inibidores de fator IIa, inibidores de fator Xa e outro inibidor de fator ou sangue prejudicado por fator.

[00103] A varfarina e as moléculas que contêm 4- hidroxicoumarina relacionadas diminuem a coagulação de sangue inibindo-se a redutase de epóxido de vitamina K, uma enzima que recicla a vitamina K1 oxidada para sua forma reduzida após ter participado na carboxilação de diversas proteínas de coagulação de sangue, principalmente protrombina e fator VII. A varfarina não antagoniza a ação de vitamina K1, mas, em vez disso, antagoniza a reciclagem de vitamina K1, depletando a vitamina K ativa. Assim, a ação farmacológica pode sempre ser revertida em vitamina K fresca. Quando administrada, esses fármacos não anticoagulam o sangue imediatamente. Em vez disso, o início de seu efeito exige cerca de um dia antes de os fatores de formação de coágulo ativos restantes terem tido tempo de desaparecer naturalmente no metabolismo, e a duração de ação de uma dose única de varfarina é de 2 a 5 dias. A reversão de efeito da varfarina quando for descontinuado ou a vitamina K1 for administrada, exige um tempo similar.

[00104] A heparina é um composto que ocorre no fígado e outros tecidos que inibe a coagulação de sangue. Um polissacarídeo que contém enxofre é usado como um anticoagulante no tratamento de trombose. Heparina de baixo peso molecular, um produto mais altamente processado, é útil visto que não exige monitoramento por parâmetro de coagulação de aPTT (tem níveis de plasma mais previsíveis) e tem menos efeitos colaterais. Entretanto, em situações de sangramento de emergência, a capacidade de monitorar a LMWH é uma necessidade clínica significativa não atendida, visto que nenhum ensaio no local de atendimento é clinicamente aceito para monitoramento de anticoagulante de LMWH.

[00105] Os fármacos, tais como rivaroxabano, apixabano e edoxabano, trabalham inibindo-se o fator Xa diretamente (diferentes das heparinas e fondaparinux, que trabalham por meio de ativação de antitrombina).

[00106] Outro tipo de anticoagulante é o inibidor de trombina direto. Membros atuais dessa classe incluem os fármacos bivalentes hirudina, lepirudina e bivalirudina; e os fármacos monovalentes argatrobano e dabigatrano.

[00107] A amostra pode ser testada como sangue ou como plasma. O plasma pode ser preparado por filtragem ou centrifugação. Adicionalmente, uma área de superfície de vidro adicional pode ser adicionada a um ou mais dos canais microfluídicos através da introdução de microesferas de vidro no canal com o uso de, por exemplo, um chip de profundidade dupla ou embalagem de microesfera no canal.

Outras Amostras Biológicas

[00108] O dispositivo pode ser usado com outros tipos de amostras que são ativadas com exposição ao vidro.

V. Métodos de Uso

[00109] As amostras são coletadas e administradas no dispositivo. Os meios para determinar a coagulação são iniciados à medida que a amostra é colocada no dispositivo. Os resultados são comparados aos resultados padrão para amostras não coaguladas, tipicamente a partir de plasma agrupado ou sangue agrupado, ou em referência ao tempo de coagulação em iniciação de tratamento, como no caso em que um indivíduo é administrado com anticoagulante, ou um terapêutico para neutralizar o anticoagulante e restaurar uma coagulação de sangue mais normal.

[00110] A presente invenção será adicionalmente compreendida em referência aos exemplos não limitativos a seguir.

Exemplo 1. Demonstração de Aquecimento em chip

[00111] Um chip foi usado para demonstrar o efeito da estrutura de aquecedor integrada (ou aquecedor/resfriador integrado; preferencialmente uma bomba de calor de estado sólido ou “resfriador Peltier”). Uma tensão de CC de 12 V foi aplicada ao resistor de aquecedor na parte de trás da parte de silício do chip microfluídico. As resistências de termistores foram medida no interior de cada câmara (termistores internos, na superfície de silício frontal) e em cima de cada câmara (termistores externos, em cima do PYREX®) antes da aplicação de uma tensão de aquecedor e durante o aquecimento. O aumento de temperaturas locais devido ao aquecimento foi calculado com o uso de resistências medidas e coeficientes de temperatura de resistências, conforme relatado mais cedo. A temperatura ambiente era de aproximadamente 27 °C. Os aumentos de temperatura média local após aproximadamente 2 min aquecimento não regulado foram: -termistores externos: ΔT = -252,85 °C (20,3 K) -termistores internos: ΔT = -249,35 °C (23,8 K).

Exemplo 2: Medição de Coagulação de Sangue Materiais e Métodos

[00112] O sangue foi colhido de um paciente com o uso de dispositivos de lança comercialmente disponíveis. 10 μl de sangue foram obtidos e pipetados em um tubo Eppendorf. Solução salina foi usada como uma solução tampão. A amostra de sangue foi misturada no tubo Eppendorf através de pipetagem para cima e para baixo cinco vezes com um dos seguintes reagentes: - 1 μl de solução tampão (chamada controle sham), - 1 μl de solução tampão que contém o anticoagulante edoxabano em uma concentração de 300 ng/ml, - 1 μl de solução tampão que contém o anticoagulante edoxabano e o agente de reversão de anticoagulante PER977, ambos em uma concentração de 300 ng/ml.

[00113] Edoxabano é um anticoagulante comercialmente disponível. PER977 (ciraparantag) é um fármaco de investigação que é projetado para reverter o efeito de edoxabano. Imediatamente após a mistura, 2,5 μl de cada amostra de sangue foi pipetada em um chip de dispositivo fechado. O chip foi inserido em seu leitor, e tanto as medições de luz IR quanto as medições de impedância foram imediatamente gravadas em temperatura ambiente (aproximadamente 27 °C). O aquecimento da amostra de sangue foi omitido.

[00114] Os resultados foram obtidos tanto por IR quanto por impedância de viscosidade.

Resultados

[00115] Conforme é evidente a partir das Figuras 12A a 12F, medições de IR (Figuras 12B, 12D e 12F) e medições de impedância (12A, 12C e 12E) correlacionam bem uma com as outras. Ambas as medições mostram para o controle sham um pico de característica em torno de 2 minutos que é indicativo do tempo de coagulação da amostra. A adição do anticoagulante edoxabano desloca esse pico para aproximadamente 4 minutos. Além do pico, as curvas de edoxabano mostram um local de característica mínimo em torno de 12 minutos. A adição do agente de reversão de anticoagulante PER977 a uma amostra de sangue que contém edoxabano desloca o pico em cada curva de volta para 2 minutos e suprime a ocorrência de um mínimo local em torno de 12 minutos. Essas medições indicam o efeito de atraso de coagulação de edoxabano e a reversão desse efeito através de administração adicional de PER977.

[00116] Modificações e variações dos dispositivos, sistemas e métodos de uso dos mesmos serão evidentes para os indivíduos versados na técnica a partir da descrição detalhada supracitada e se destinam a estar dentro do escopo das reivindicações anexas.

Claims (17)

1. DISPOSITIVO DE MICROENSAIO PARA A MEDIÇÃO DE COAGULAÇÃO EM UMA AMOSTRA DE SANGUE OU PLASMA DE UM INDIVÍDUO, sendo que o dispositivo é caracterizado por compreender um leitor (50, 80) adaptado para fornecer interfaces elétricas ou ópticas a um chip microfluídico fabricado (10) compreendendo material semicondutor que ativa a coagulação, em que o chip microfluídico (10) compreende uma entrada (16) para introduzir a amostra de sangue ou plasma no chip microfluídico, em que a entrada (16) está em comunicação com um ou mais microcanais (14) os um ou mais microcanais (14) compreendendo pelo menos uma superfície carregada de modo aniônico, em que a superfície carregada anionicamente não inclui agentes químicos que ativam a coagulação e em que a amostra de sangue ou plasma introduzida estará em contato com a superfície carregada anionicamente que serve para ativar a cascata de coagulação sem o uso de reagentes de coagulação químicos ou biológicos adicionais, sendo que cada microcanal (14) compreende uma câmara de teste (12a, 12b) na qual mudanças na impedância ou propriedades ópticas podem ser medidas, e uma saída (28b) em comunicação com a entrada (16) através dos um ou mais microcanais (14), em que o chip microfluídico (10) é inserido no leitor (50, 80), o leitor (50, 80) compreendendo: um detector que determina alterações na impedância ou nas propriedades ópticas da amostra na câmara de teste para medir o tempo de coagulação; um elemento de controle de temperatura; e em que o detector é configurado para emitir o tempo de coagulação medido determinado a partir da mudança em impedância ou propriedades ópticas, para um monitor (104) ou leitor externo.

2. DISPOSITIVO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo chip microfluídico (10) compreender um único microcanal (14).

3. DISPOSITIVO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo microchip microfluídico (10) ser fabricado através de causticação a úmido anisotrópica de pastilhas de silício e oxidação térmica subsequente, causticação a úmido isotrópica de pastilhas de vidro de borossilicato transparente de baixa expansão térmica, deposição por pulverização catódica de filmes metálicos finos sobre pastilhas através de estênceis, ligação anódica de silício e pastilhas de vidro de borossilicato transparente de baixa expansão térmica, e separação subsequente de chips únicos por corte de pastilha.

4. DISPOSITIVO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo detector compreender um LED infravermelho (IV) ou fotodiodo inserido nas partes de leitor para a medição de mudanças ópticas.

5. DISPOSITIVO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo microchip microfluídico (10) compreender ainda eletrodos (20a) ou filmes ou folhas metálicas com padrão.

6. DISPOSITIVO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo microchip microfluídico (10) compreender eletrodos (20a) que podem ser usados para medir diretamente a resistência, capacitância ou impedância.

7. DISPOSITIVO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo microchip microfluídico (10) compreender ainda um substrato semicondutor dopado fabricado em um elemento de aquecimento de resistor.

8. DISPOSITIVO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pela saída do leitor (50, 80) se comunicar com um monitor (104), exibição, ou armazenamento de informações.

9. DISPOSITIVO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por a pelo menos uma superfície carregada anionicamente do chip microfluídico compreender uma primeira superfície de vidro carregada anionicamente e uma segunda superfície carregada anionicamente de sílica termicamente oxidada.

10. DISPOSITIVO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelas propriedades ópticas da amostra de sangue ou plasma na câmara de teste (12a, 12b) poderem ser medidas por transmissão infravermelha através da espessura do chip microfluídico (10).

11. DISPOSITIVO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado por cada microcanal (14) do chip microfluídico (10) compreender uma câmara de teste (12a, 12b) na qual mudanças nas propriedades ópticas podem ser medidas.

12. MÉTODO PARA A MEDIÇÃO DE TEMPO DE COAGULAÇÃO, caracterizado por compreender a introdução de uma amostra no dispositivo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11.

13. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por compreender a inserção do dispositivo em um leitor (50, 80).

14. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 ou 13, caracterizado pela mudança nas propriedades ópticas da amostra ser medida medindo a transmissão de luz infravermelha através da câmara de teste (12a, 12b) do chip microfluídico (10).

15. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14, caracterizado pela transmissão através da amostra ser medida para determinar o tempo até o tempo de coagulação de pico.

16. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pela medição ser feita com luz entre 500 e 10.000 nm, de preferência, 1.300 nm.

17. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 16, caracterizado pela temperatura da amostra ser mantida em temperatura corporal.